JP2009077680A - クレアチニンアミドヒドロラーゼの比活性を向上させる方法 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】シュードモナス・プチダ由来クレアチニンアミドヒドロラーゼのアミノ酸配列の43位、あるいはそれと同等の位置のアミノ酸を他のアミノ酸に置換することを特徴とするクレアチニンアミドヒドロラーゼの比活性を向上させる方法。
【選択図】なし
Description
Journal of Biochemistry,Vol.86,1109-1117(1979) Chemical and Pharmaceutical Bulletin,Vol.34,No.1,269-274(1986)
しかし、これらの改変体は比活性が低く、臨床診断薬中では高濃度のタンパク質を添加しなければならないという欠点があった。そこで、本発明者らはさらに、これらの改変体の比活性を向上させる方法を検討した。
その結果、本発明者らは、改変体を基にさらに43位のアミノ酸をアスパラギン酸又はグルタミン酸に置換することにより、比活性が向上した改変体を創出することに成功した。
[項1]
配列表の配列番号1〜6からなる群より選ばれる少なくとも1つに記載されるアミノ酸配列の43位、あるいはそれと同等の位置のアミノ酸をアスパラギン酸又はグルタミン酸に置換することを特徴とするクレアチニンアミドヒドロラーゼの比活性を向上させる方法。
[項2]
項1に記載される方法で製造したクレアチニンアミドヒドロラーゼ改変体。
[項3]
項2に記載されるクレアチニンアミドヒドロラーゼ改変体をコードする遺伝子。
[項4]
項3に記載の遺伝子を含むベクター。
[項5]
項4に記載のベクターで形質転換された形質転換体。
[項6]
項5に記載の形質転換体を培養し、該培養物からクレアチニンアミドヒドロラーゼを採取することを特徴とするクレアチニンアミドヒドロラーゼ改変体の製造法。
[項7]
項6に記載されるクレアチニンアミドヒドロラーゼ改変体を含むクレアチニン測定用試薬。
[項8]
項6に記載されるクレアチニンアミドヒドロラーゼ改変体を用いるクレアチニン測定方法。
[項9]
配列表の配列番号1〜6からなる群より選ばれる少なくとも1つに記載されるアミノ酸配列の43位、あるいはそれと同等の位置のアミノ酸をアスパラギン酸又はグルタミン酸に置換することを特徴とする、比活性が向上したクレアチニンアミドヒドロラーゼの製造方法。
また、そのような方法で製造したクレアチニンアミドヒドロラーゼ改変体、すなわち、配列表の配列番号1〜6からなる群より選ばれる少なくとも1つに記載されるアミノ酸配列の43位、あるいはそれと同等の位置のアミノ酸がアスパラギン酸又はグルタミン酸に置換され、かつ、クレアチニンアミドヒドロラーゼ活性を有するクレアチニンアミドヒドロラーゼ改変体である。
また、多重変異体については、同様の原則によって表記したものをプラス(+)でつなげて表記する。例えば、「G179S+N43D」は、179位のG(Gly)をS(Ser)、43位のN(Asn)をA(Asp)に置換すること又は置換した改変体を意味する。
具体的には例えば、シュードモナス・プチダ(PS−7)株に由来するものが挙げられ、そのアミノ酸配列は配列番号1、当該アミノ酸配列をコードする遺伝子は配列番号7でそれぞれ示される。これらはいずれも特許第2527035号公報に記載されている。
なお、配列番号1において、アミノ酸の表記は、メチオニンを1として番号付けされて
いる。
具体的には例えば、シュードモナス・プチダ(PS−7)株に由来するクレアチニンアミドヒドロラーゼのアミノ酸配列のうち179位のグリシンをセリンに置換したものや、175位のアスパラギン酸をグルタミン、かつ179位のグリシンをセリンに置換したもの、175位のアスパラギン酸をリシン、かつ179位のグリシンをセリンに置換したもの、175位のアスパラギン酸をセリン、かつ179位のグリシンをセリンに置換したもの、175位のアスパラギン酸をヒスチジン、かつ179位のグリシンをセリンに置換したものが挙げられる。これらのアミノ酸配列はそれぞれ配列番号2〜6が示される。また、それらをコードする遺伝子の典型的な態様が、それぞれ配列番号8〜12で示される。
Journal of Molecular Biology,Vol337,399-416(2004) Journal of Molecular Biology,Vol332,287-301(2004)
さらに、本発明の改変型クレアチニンアミドヒドロラーゼは、クレアチニンに対する作用性が本質的に維持される限り、クレアチニンアミドヒドロラーゼにヒスチジンタグなどのタグを結合または挿入させた態様、クレアチニンアミドヒドロラーゼの少なくとも一方の末端に他のペプチドや他の蛋白質(たとえばストレプトアビジンやシトクロム)を融合させた態様、糖鎖や他の化合物により化学修飾された態様、クレアチニンアミドヒドロラーゼ分子内および/または分子間でジスルフィド結合などにより架橋されたものやリンカーペプチドなどを介して連結されたもの等の態様を含みうる。あるいは、いくつかの由来の野生型クレアチニンアミドヒドロラーゼの断片を組み合わせて構成したものを含みうる。
本発明の改変型クレアチニンアミドヒドロラーゼをコードする遺伝子は、例えば、微生物など種々の起源(由来)より得られる野生型クレアチニンアミドヒドロラーゼをコードする遺伝子を含むDNA断片を改変することにより得ることができる。具体的には、例えばアルカリゲネス・フェカリス(Alcaligenes faecalis)、アースロバクター・エスピー(Arthrobacter sp.)、フラボバクテリウム・エスピー(Flavobacterium sp.)、コリネバクテリウム・ウレアファシエンス(Corinebacterium ureafaciens)、コリネバクテリウム・クレアチノボランス(Corinebacterium creatinovorans)、マイクロコッカス・ルテウス(Micrococcus luteus)、シュードモナス・プチダ(Pseudomonas putida)等の細菌を挙げることができる。
本発明の改変型クレアチニンアミドヒドロラーゼをコードする遺伝子は、好ましくは、配列番号7〜12に記載の塩基配列と相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつクレアチニンアミドヒドロラーゼ活性を有するタンパク質をコードするDNAである。
クター、さらには該ベクターで形質転換された形質転換体を含む。
作製された改変タンパク質の遺伝情報を有するDNAは、プラスミドと連結された状態にて宿主微生物中に移入され、改変タンパク質を生産する形質転換体となる。
ベクターとしてプラスミドを用いる場合、例えば、エシェリヒア・コリー(Escherichia coli)を宿主微生物とする場合にはpBluescript,pUC18などが使用できる。宿主微生物としては、例えば、エシェリヒア・コリー W3110、エシェリヒア・コリーC600、エシェリヒア・コリーJM109、エシェリヒア・コリーDH5αなどが利用できる。宿主微生物に組換えベクターを移入する方法としては、例えば宿主微生物がエシェリヒア属に属する微生物の場合には、カルシウムイオンの存在下で組換えDNAの移入を行なう方法などを採用することができ、更にエレクトロポレーション法を用いても良い。更には、市販のコンピテントセル(例えば、コンピテントハイJM109;東洋紡績製)を用いても良い。
シェリヒア・コリを宿主微生物とする場合には、pBR322、pUC19 、pBluescript などが例示される。
ience ,第214巻,1205(1981)に記載されたジデオキシ法により解読した。また、クレアチニンアミドヒドロラーゼのアミノ酸配列は上記のように決定された塩基配列より推定した。
のはGOODの緩衝液であり、なかでも、PIPES、MESもしくはMOPS緩衝液が特に好ましい。また、グルタミン酸、グルタミン、リジン等のアミノ酸類、さらに血清アルブミン等を添加することによりクレアチニンアミドヒドロラーゼをより安定化することができる。
Deletion Kit;Stratagene製,QuickChange Site Directed Mutagenesis Kit;Stratagene製など)の使用、或いはポリメラーゼ連鎖反応法(PCR)の利用が挙げられる。
それらの形態は特に制約されないが、クレアチニン測定用組成物、および/または、クレアチニン測定としての形態をとりうる。
本発明へのそれらの添加物の配合法は特に制限されるものではない。例えばクレアチニンアミドヒドロラーゼを含む緩衝液に安定化剤を配合する方法、安定化剤を含む緩衝液にクレアチニンアミドヒドロラーゼを配合する方法、あるいはクレアチニンアミドヒドロラーゼと安定化剤を緩衝液に同時に配合する方法などが挙げられる。
使用できるアルブミンとしては、牛血清アルブミン(BSA)、卵白アルブミン(OVA)などが挙げられる。特にBSAが好ましい。該アルブミンの含有量は、好ましくは1〜80%(重量比)、より好ましくは5〜70%(重量比)の範囲で使用される。
宿主由来のタンパク質成分以外のタンパク質成分としては、例えばBSA等の生体由来物質が挙げられる。
このような構成にすることにより、クレアチニン測定系における非特異反応が低減する可能性が考えられる。
また、粉末組成物において、緩衝剤の含有量(W/W)は、1.0%〜50%であることが望ましい。
後述の実施例にも記載されているように、本願発明の改変型クレアチニンアミドヒドロラーゼでは比活性が改変前のクレアチニンアミドヒドロラーゼに対して著しく向上している。このことは、例えば、臨床サンプルにおけるクレアチニン測定においてクレアチニンアミドヒドロラーゼ量を著しく低下させることができ、低コスト化が見込める。
さらには、本願発明は、クレアチニンアミドヒドロラーゼを用いる測定系において、上記のいずれかに記載のアミノ酸変異を行ったクレアチニンアミドヒドロラーゼを含有することを含む、測定の反応性が向上したクレアチニン測定用試薬組成物を、製造する方法である。
実施例1 改変型クレアチニンアミドヒドロラーゼ遺伝子の作製
特許第2527035号、および、Biosci.Biotech.Biochem.,5
9巻7号、1331−1332ページ(1995)に記載の方法を参照してシュードモナス・プチダPS−7株の染色体DNAを調製し、次いで、該株由来のクレアチニンアミドヒドロラーゼ遺伝子を含む発現プラスミドpCNH5−13を調製した。
野生型クレアチニンアミドヒドロラーゼの発現プラスミドpCNH5−13は、ベクターpBluescript SK(-)のマルチクローニング部位にシュードモナス・プチダPS−7株由来のクレアチニンアミドヒドロラーゼをコードする構造遺伝子を挿入しているものである。その塩基配列は配列表の配列番号4に、また該塩基配列から推定されるクレアチニンアミドヒドロラーゼのアミノ酸配列は配列表の配列番号1に示される。
次に、pCNH5−13と変異導入部位のアミノ酸をコードするトリプレットを中央に含む40mer程度の合成オリゴヌクレオチドを基に、QuickChangeTMSite−Directed Mutagenesis Kit(STRATAGENE製)を用いて、そのプロトコールに従って変異処理操作を行い、43位においてアミノ酸置換をランダムに変異導入した変異ライブラリーを作製した。そして、比活性の変化を指標にスクリーニングして得られた候補株の塩基配列を決定して、配列番号1記載のアミノ酸配列の43番目のアスパラギンがアスパラギン酸に置換された変異型クレアチニンアミドヒドロラーゼをコードする組換えプラスミド(pCNH−N43D)を取得した。
その他上記と同様に、ライブラリー作製、スクリーニングを実施し、比活性が向上した変異型クレアチニンアミドヒドロラーゼをコードする組換えプラスミドを取得した。
各組み換えプラスミドでエシェリヒアコリーDH5αのコンピテントセルを形質転換し、該形質転換体をそれぞれ取得した。
5mlのCNH生産培地(1%ポリペプトン、2%酵母エキス、1%塩化ナトリウム、5mM塩化マンガン)を試験管に分注し、121℃、20分間オートクレーブを行い、放冷後別途無菌濾過したアンピシリンを100μl/mlになるように添加した。この培地に100μl/mlのアンピシリンを含むLB寒天培地で予め37℃、16時間培養したエシェリヒアコリーDH5α(pCNH−N43D)のシングルコロニーを接種し、37℃で22時間通気攪拌培養した。
上記菌体を遠心分離により集菌し、20mMリン酸カリウム緩衝液(pH7.8)に懸濁した後、超音波処理により破砕し、更に遠心分離を行い、上清液を粗酵素液として得た。また、この変異体をN43Dと命名した。その他上記と同様に、粗酵素液を得た。
比較例として、pCNH5−13によるエシェリヒアコリーDH5α形質転換体について、上記方法と同様にして、改変前の粗酵素液を取得した。
比較例2として、pCNH−G179SによるエシェリヒアコリーDH5α形質転換体について、上記方法と同様にして、粗酵素液を取得した。
比較例3として、pCNH−G179S+D175QによるエシェリヒアコリーDH5α形質転換体について、上記方法と同様にして、粗酵素液を取得した。
比較例4として、pCNH−G179S+D175KによるエシェリヒアコリーDH5α形質転換体について、上記方法と同様にして、粗酵素液を取得した。
比較例5として、pCNH−G179S+D175SによるエシェリヒアコリーDH5α形質転換体について、上記方法と同様にして、粗酵素液を取得した。
比較例6として、pCNH−G179S+D175HによるエシェリヒアコリーDH5α形質転換体について、上記方法と同様にして、粗酵素液を取得した。
実施例2で取得した変異型クレアチニンアミドヒドロラーゼおよび比較例1で取得した各種クレアチニンアミドヒドロラーゼをそれぞれ、20mMリン酸カリウム緩衝液(pH7.8)中に加え、それを2分割して片方にfinal 5mMとなるようにEDTA・3Naを添加し、もう片方には何も添加せずに60℃で20分間処理を行った。後述する活性測定法によりクレアチニンアミドヒドロラーゼを測定し、(キレート剤添加ありの活性)/(キレート剤添加なしの活性)×100をキレート剤耐性(%)とした。
また、比活性(U/OD660)は実施例2で取得した各種クレアチニンアミドヒドロラーゼの活性値(U/mL)/超音波破砕前の菌体濁度(OD660)にて算出した。
特許文献3ではシュードモナス・プチダ(PS−7)由来のクレアチニンアミドヒドロラーゼの比活性は1905U/mgと記載されているが、比較例1では同一のものであるにもかかわらず比活性は53U/OD660である。これは、精製度が異なるからであり、実施例中では同一精製度のもので比較している。
その結果を表1に示す。表1から判るように本発明のクレアチニンアミドヒドロラーゼ改変体は改変前と比べて比活性が向上していることが確認された。また、キレート剤耐性も向上している。
実施例2で取得した変異型クレアチニンアミドヒドロラーゼおよび比較例2で取得した各種クレアチニンアミドヒドロラーゼをそれぞれ、20mMリン酸カリウム緩衝液(pH7.8)中に加え、それを2分割して片方にfinal 2.5mMとなるようにEDTA・3Naを添加し、もう片方には何も添加せずに50℃で20分間処理を行った。後述する活性測定法によりクレアチニンアミドヒドロラーゼを測定し、(キレート剤添加ありの活性)/(キレート剤添加なしの活性)×100をキレート剤耐性(%)とした。
また、比活性(U/OD660)は実施例2で取得した各種クレアチニンアミドヒドロラーゼの活性値(U/mL)/超音波破砕前の菌体濁度(OD660)にて算出した。
その結果を表2に示す。表2からわかるように本発明のクレアチニンアミドヒドロラーゼ改変体は改変前と比べて比活性が向上していることが確認された。さらに比較例1の野生型と比較するとKm値が低下していることがわかる。
実施例2で取得した変異型クレアチニンアミドヒドロラーゼおよび比較例3〜6で取得した各種クレアチニンアミドヒドロラーゼをそれぞれ、20mMリン酸カリウム緩衝液(pH7.8)中に加え、それを2分割して片方にfinal 2.5mMとなるようにEDTA・3Naを添加し、もう片方には何も添加せずに50℃で20分間処理を行った。後述する活性測定法によりクレアチニンアミドヒドロラーゼを測定し、(キレート剤添加ありの活性)/(キレート剤添加なしの活性)×100をキレート剤耐性(%)とした。
また、比活性を測定するために実施例2および比較例3〜6で取得した粗精製液をさらに精製している。まず、5%ポリエチレンイミンを対液0.5%添加し、室温で30分放置した後、遠心分離し上清を回収した。次に0.65飽和の硫酸アンモニウムを添加し、室温で30分放置した後、遠心分離し沈澱を回収、20mM リン酸カリウム緩衝液pH7.8で再溶解した精製酵素標品の活性値と280nmの吸光度を測定し、比活性(U/A280)を求めた。
その結果を表3に示す。表中のNo.1〜4は比較例3〜6である。No.1と5、2と6、3と7、4と8の比活性を比較するとN43Dのアミノ酸置換により比活性が上がっていることがわかる。また、キレート剤耐性も向上している。
酵素溶液は酵素標品をあらかじめ氷冷した50mMリン酸緩衝液pH7.5で溶解し、分析直前に1.8〜2.4U/mLに希釈する。
試験管に0.1M クレアチン溶液(50mMリン酸緩衝液pH7.5で溶解)を1.0mLとり、37℃約5分予備加温する。次に酵素溶液を0.1mL加える。37℃で正確に反応させた後、直ちに反応液0.1mLをとり、あらかじめ準備した0.5N NaOH溶液2.0mLに入れる。1.0% ピクリン酸溶液を1.0mL加え、25℃で20分間放置後520nmにおける吸光度(ODtest)を測定する。盲検は0.1M クレアチン溶液(50mMリン酸緩衝液pH7.5で溶解)を1.0mLに酵素希釈液を添加後直ちに反応液の0.1mLをとり、あらかじめ準備した0.5N NaOH溶液2.0mLに入れる。1.0% ピクリン酸溶液を1.0mL加え、25℃で20分間放置後520nmにおける吸光度(ODblank)を測定する。
U/mL=ΔOD(ODtest−ODblank)×7.33×希釈倍率
<R1>
0.58M HEPES pH8
0.005% 4アミノアンチピリン
0.015% フェノール
60U/mlクレアチンアミジノヒドロラーゼ
12U/ml ザルコシンオキシダーゼ
6U/ml ペルオキシダーゼ
<R2 (final 55mM)>
0.25M クレアチニン
0.27N HCl
<R2 (final 11mM)>
0.05M クレアチニン
0.27N HCl
R1:200μlに、R2:60μl及び酵素液10μlを加え、37℃で10分間反応させ、505nmの吸光度変化をHITACHI7060型自動分析装置を用いて測定した。
Claims (9)
- 配列表の配列番号1〜6からなる群より選ばれる少なくとも1つに記載されるアミノ酸配列の43位、あるいはそれと同等の位置のアミノ酸をアスパラギン酸又はグルタミン酸に置換することを特徴とするクレアチニンアミドヒドロラーゼの比活性を向上させる方法。
- 請求項1に記載される方法で製造したクレアチニンアミドヒドロラーゼ改変体。
- 請求項2に記載されるクレアチニンアミドヒドロラーゼ改変体をコードする遺伝子。
- 請求項3に記載の遺伝子を含むベクター。
- 請求項4に記載のベクターで形質転換された形質転換体。
- 請求項5に記載の形質転換体を培養し、該培養物からクレアチニンアミドヒドロラーゼを採取することを特徴とするクレアチニンアミドヒドロラーゼ改変体の製造法。
- 請求項6に記載されるクレアチニンアミドヒドロラーゼ改変体を含むクレアチニン測定用試薬。
- 請求項6に記載されるクレアチニンアミドヒドロラーゼ改変体を用いるクレアチニン測定方法。
- 配列表の配列番号1〜6からなる群より選ばれる少なくとも1つに記載されるアミノ酸配列の43位、あるいはそれと同等の位置のアミノ酸をアスパラギン酸又はグルタミン酸に置換することを特徴とする、比活性が向上したクレアチニンアミドヒドロラーゼの製造方法。
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