JP2017538768A - Ｅｒｋ阻害剤としてのチエノ［２，３−ｃ］ピロール−４−オン誘導体 - Google Patents

Abstract

本発明は、細胞外シグナル調節キナーゼ（ＥＲＫ）の活性を阻害し、癌の治療に有用であり得るチエノ［２，３−ｃ］ピロール−４−オン化合物を提供する。【選択図】なし

Description

本発明は、細胞外シグナル調節キナーゼ（ＥＲＫ）の活性を阻害し、癌を治療するのに有用であり得るチエノ［２，３−ｃ］ピロール−４−オン化合物またはその薬学的に許容可能な塩、およびその化合物を含む医薬組成物に関する。

ＥＲＫ／ＭＡＰＫ経路は細胞増殖に重要であり、多くの腫瘍において活性化されることが頻繁に観察される。ＥＲＫ／１／２の上流であるＲＡＳ遺伝子は、大腸癌、黒色腫、非小細胞肺癌ならびに***および膵臓腫瘍を含むいくつかの癌において変異される。高いＲＡＳ活性は多くのヒト腫瘍において上昇したＥＲＫ活性を伴う。研究によりまた、ＥＲＫはＲＡＳシグナル伝達の重要な構成要素であることが示されている。これらの観察により、広範囲のヒト腫瘍における抗癌治療の開発に関してＥＲＫ１／２シグナル伝達経路が魅力的であることが支持される。

ＥＲＫ阻害剤は当該分野において公知であり、例えば特許文献１を参照のこと。さらに、他のアミノピリミジン化合物が当該分野において公知であり、例えば特許文献２を参照のこと。より特には癌を治療するための代替のＥＲＫ阻害剤を提供する必要性が存在したままである。したがって、本発明は、癌を治療するのに有用であり得るＥＲＫ１／２阻害剤を提供する。

国際公開第２０１３１３０９７６号 国際公開第２０１０／０２２１２１号

本発明は、以下の式の化合物：

（式中、
Ｒ^１は、

であり、
Ｒ^２およびＲ^３は独立してメチルであるか、またはＲ^２およびＲ^３は一緒になってシクロプロピルを形成してもよく、
Ｒ^４は、水素、メチル、クロロ、フルオロ、またはトリフルオロメチルであり、
Ｒ^５は、

である）
またはその薬学的に許容可能な塩である。

本発明はまた、以下の式の化合物：

（式中、
Ｒ^１は、

であり、
Ｒ^２およびＲ^３は独立してメチルであるか、またはＲ^２およびＲ^３は一緒になってシクロプロピルを形成してもよく、
Ｒ^４は、水素、メチル、クロロ、フルオロ、またはトリフルオロメチルであり、
Ｒ^５は、

である）
またはその薬学的に許容可能な塩を提供する。

本発明はまた、Ｒ^２およびＲ^３がメチルである式Ｉの化合物についての実施形態を提供する。

本発明はまた、Ｒ^４が水素である式Ｉの化合物についての別の実施形態を提供する。

本発明はまた、Ｒ^１が

である式Ｉの化合物についてのさらに別の実施形態を提供する。

本発明はまた、Ｒ^５が

である式Ｉの化合物についてのなおさらなる実施形態を提供する。

好ましくは、本発明は、６，６−ジメチル−２−｛２−［（１−メチル−１Ｈ−ピラゾール−５−イル）アミノ］ピリミジン−４−イル｝−５−［２−（モルホリン−４−イル）エチル］−５，６−ジヒドロ−４Ｈ−チエノ［２，３−ｃ］ピロール−４−オンである化合物、またはその薬学的に許容可能な塩を提供する。

特定の実施形態として、本発明は、６，６−ジメチル−２−｛２−［（１−メチル−１Ｈ−ピラゾール−５−イル）アミノ］ピリミジン−４−イル｝−５−［２−（モルホリン−４−イル）エチル］−５，６−ジヒドロ−４Ｈ−チエノ［２，３−ｃ］ピロール−４−オンである化合物を提供する。

本発明は、６，６−ジメチル−２−｛２−［（１−メチル−１Ｈ−ピラゾール−５−イル）アミノ］ピリミジン−４−イル｝−５−［２−（モルホリン−４−イル）エチル］−５，６−ジヒドロ−４Ｈ−チエノ［２，３−ｃ］ピロール−４−オン、またはその薬学的に許容可能な塩、および薬学的に許容可能な担体、希釈剤または賦形剤を含む医薬組成物を提供する。本発明は、６，６−ジメチル−２−｛２−［（１−メチル−１Ｈ−ピラゾール−５−イル）アミノ］ピリミジン−４−イル｝−５−［２−（モルホリン−４−イル）エチル］−５，６−ジヒドロ−４Ｈ−チエノ［２，３−ｃ］ピロール−４−オン、および薬学的に許容可能な担体、希釈剤、または賦形剤を含む医薬組成物を提供する。

本発明は、有効量の６，６−ジメチル−２−｛２−［（１−メチル−１Ｈ−ピラゾール−５−イル）アミノ］ピリミジン−４−イル｝−５−［２−（モルホリン−４−イル）エチル］−５，６−ジヒドロ−４Ｈ−チエノ［２，３−ｃ］ピロール−４−オン、またはその薬学的に許容可能な塩を、それを必要とする患者に投与することを含む、癌を治療する方法を提供する。本発明は、有効量の６，６−ジメチル−２−｛２−［（１−メチル−１Ｈ−ピラゾール−５−イル）アミノ］ピリミジン−４−イル｝−５−［２−（モルホリン−４−イル）エチル］−５，６−ジヒドロ−４Ｈ−チエノ［２，３−ｃ］ピロール−４−オンを、それを必要とする患者に投与することを含む、癌を治療する方法を提供する。

本発明は、療法に使用するための、６，６−ジメチル−２−｛２−［（１−メチル−１Ｈ−ピラゾール−５−イル）アミノ］ピリミジン−４−イル｝−５−［２−（モルホリン−４−イル）エチル］−５，６−ジヒドロ−４Ｈ−チエノ［２，３−ｃ］ピロール−４−オン、またはその薬学的に許容可能な塩を提供する。本発明は、癌の治療に使用するための、６，６−ジメチル−２−｛２−［（１−メチル−１Ｈ−ピラゾール−５−イル）アミノ］ピリミジン−４−イル｝−５−［２−（モルホリン−４−イル）エチル］−５，６−ジヒドロ−４Ｈ−チエノ［２，３−ｃ］ピロール−４−オン、またはその薬学的に許容可能な塩を提供する。本発明は、医薬組成物が６，６−ジメチル−２−｛２−［（１−メチル−１Ｈ−ピラゾール−５−イル）アミノ］ピリミジン−４−イル｝−５−［２−（モルホリン−４−イル）エチル］−５，６−ジヒドロ−４Ｈ−チエノ［２，３−ｃ］ピロール−４−オン、またはその薬学的に許容可能な塩を含む、癌を治療するのに使用するための医薬組成物を提供する。

本発明はまた、療法に使用するための、６，６−ジメチル−２−｛２−［（１−メチル−１Ｈ−ピラゾール−５−イル）アミノ］ピリミジン−４−イル｝−５−［２−（モルホリン−４−イル）エチル］−５，６−ジヒドロ−４Ｈ−チエノ［２，３−ｃ］ピロール−４−オンを提供する。本発明は、癌の治療に使用するための６，６−ジメチル−２−｛２−［（１−メチル−１Ｈ−ピラゾール−５−イル）アミノ］ピリミジン−４−イル｝−５−［２−（モルホリン−４−イル）エチル］−５，６−ジヒドロ−４Ｈ−チエノ［２，３−ｃ］ピロール−４−オンを提供する。本発明は、医薬組成物が６，６−ジメチル−２−｛２−［（１−メチル−１Ｈ−ピラゾール−５−イル）アミノ］ピリミジン−４−イル｝−５−［２−（モルホリン−４−イル）エチル］−５，６−ジヒドロ−４Ｈ−チエノ［２，３−ｃ］ピロール−４−オンを含む、癌を治療するのに使用するための医薬組成物を提供する。

本発明は、癌の治療のための医薬の製造における、６，６−ジメチル−２−｛２−［（１−メチル−１Ｈ−ピラゾール−５−イル）アミノ］ピリミジン−４−イル｝−５−［２−（モルホリン−４−イル）エチル］−５，６−ジヒドロ−４Ｈ−チエノ［２，３−ｃ］ピロール−４−オン、またはその薬学的に許容可能な塩の使用を提供する。本発明はまた、癌の治療のための医薬の製造における６，６−ジメチル−２−｛２−［（１−メチル−１Ｈ−ピラゾール−５−イル）アミノ］ピリミジン−４−イル｝−５−［２−（モルホリン−４−イル）エチル］−５，６−ジヒドロ−４Ｈ−チエノ［２，３−ｃ］ピロール−４−オンの使用も提供する。

本発明は、結晶形態の６，６−ジメチル−２−｛２−［（１−メチル−１Ｈ−ピラゾール−５−イル）アミノ］ピリミジン−４−イル｝−５−［２−（モルホリン−４−イル）エチル］−５，６−ジヒドロ−４Ｈ−チエノ［２，３−ｃ］ピロール−４−オンを提供する。本発明はまた、２θ±０．２°において、１５．５°、１７．１°、１８．０°、２０．２°、２１．５°および２２．１°からなる群から選択されるピークの１つ以上と組み合わせて１９．３°で生じる特性ピークを有するＸ線粉末回折パターンにより特徴付けられる結晶形態の６，６−ジメチル−２−｛２−［（１−メチル−１Ｈ−ピラゾール−５−イル）アミノ］ピリミジン−４−イル｝−５−［２−（モルホリン−４−イル）エチル］−５，６−ジヒドロ−４Ｈ−チエノ［２，３−ｃ］ピロール−４−オンを提供する。

さらに、本発明は、癌が、黒色腫、大腸癌、膵癌、および非小細胞肺癌からなる群から選択される、本明細書に記載される方法および使用の好ましい実施形態を提供する。好ましい癌は、大腸癌、膵癌、および非小細胞肺癌である。

本発明はまた、癌の治療における１種以上の化学療法剤と組み合わせた同時、別々または連続的に投与に使用するための、６，６−ジメチル−２−｛２−［（１−メチル−１Ｈ−ピラゾール−５−イル）アミノ］ピリミジン−４−イル｝−５−［２−（モルホリン−４−イル）エチル］−５，６−ジヒドロ−４Ｈ−チエノ［２，３−ｃ］ピロール−４−オン、またはその薬学的に許容可能な塩を提供する。このような組み合わせのための好ましい化学療法剤は、ｐａｎ−ＲＡＦ阻害化合物、より特には１−（３，３−ジメチルブチル）−３−（２−フルオロ−４−メチル−５−（７−メチル−２−（メチルアミノ）ピリド［２，３−ｄ］ピリミジン−６−イル）フェニル）尿素）、ＣＤＫ４／６阻害化合物、より特にはパルボシクリブ、リボシクリブ、または［５−（４−エチル−ピペラジン−１−イルメチル）−ピリジン−２−イル］−［５−フルオロ−４−（７−フルオロ−３−イソプロピル−２−メチル−３Ｈ−ベンゾイミダゾール−５−イル）−ピリミジン−２−イル］−アミン、もしくはそれらの薬学的に許容可能な塩、または抗ＶＥＧＦＲ２抗体、より特にはラムシルマブである。このような組み合わせのためのさらなる好ましい化学療法剤は、ＴＧＦ−ベータ受容体キナーゼ阻害化合物、より特にはガルニセルチブ（国際公開第２００４／０４８３８２を参照のこと）、ＡＬＫ−５キナーゼ阻害剤、より特にはＥＷ−７１９７、ＭＥＫ阻害化合物、より特にはコビメチニブもしくはトラメチニブ、またはＮｏｔｃｈ阻害化合物、より特には４，４，４−トリフルオロ−Ｎ−［（１Ｓ）−２−［［（７Ｓ）−５−（２−ヒドロキシエチル）−６−オキソ−７Ｈ−ピリド［２，３−ｄ］［３］ベンザゼピン−７−イル］アミノ］−１−メチル−２−オキソ−エチル］ブタンアミド（国際公開第２０１３／０１６０８１を参照のこと）である。このような組み合わせのためのさらなる追加の好ましい化学療法剤はＰＤ−Ｌ１（プログラム死−リガンド１）阻害剤またはＰＤ−１（プログラム死１）阻害剤である。

本発明は好ましくは、以下の置換基を有する式Ｉの化合物を含む：
ａ）Ｒ１は

であり、
ｂ）Ｒ２はメチルであり、
ｃ）Ｒ３はメチルであり、
ｄ）Ｒ４は水素であり、または
ｅ）Ｒ５は

である。

より好ましくは、本発明は、以下の置換基の組み合わせを有する式Ｉの化合物を含む：
ａ）Ｒ^２およびＲ^３はメチルであり、
ｂ）Ｒ^２はメチルであり、Ｒ^３はメチルであり、Ｒ^４は水素であり、
ｃ）Ｒ^１は

であり、Ｒ^５は

であり、
ｄ）Ｒ^２はメチルであり、Ｒ^３はメチルであり、Ｒ^４は水素であり、Ｒ^１は

であり、
ｅ）Ｒ^２はメチルであり、Ｒ^３はメチルであり、Ｒ^４は水素であり、Ｒ^５は

であり、または
ｆ）Ｒ^２はメチルであり、Ｒ^３はメチルであり、Ｒ^４は水素であり、Ｒ^１は

であり、Ｒ^５は

である。

上記および本発明の記述全体にわたって使用される場合、以下の用語は、別段の指示がない限り、以下の意味を有すると理解されるものとする。

「薬学的に許容可能な担体、希釈剤、または賦形剤」は、哺乳動物、例えば、ヒトへの生物学的活性剤の送達のために当該技術分野において一般的に認められた媒体である。

「薬学的に許容可能な塩」または「１つの薬学的に許容可能な塩」とは、比較的非毒性の、本発明の化合物の無機および有機の塩を指す。

「有効量」は、研究者、獣医師、医師または他の臨床医によって求められている組織、器官、動物、哺乳動物またはヒトへの生物学的もしくは医学的反応または所望の治療効果を誘発するであろう、本発明の化合物、またはその薬学的に許容可能な塩、あるいは本発明の化合物、またはその薬学的に許容可能な塩を含有する医薬組成物の量を意味する。

「治療」、「治療する」、「治療すること」および同類の用語は、障害の進行を遅らせるまたは逆転させることを含むことが意図される。これらの用語は、たとえ障害または状態が実際に解消されないおよび障害または状態の進行自体が遅くならないもしくは逆転しないとしても、障害または状態の１種または複数の症状を軽減する、改善する、弱める、解消する、または減少することも含む。

本発明の化合物は塩を形成できることは当業者により理解されるであろう。本発明の化合物は塩基性複素環を含有し、したがって複数の無機および有機酸のいずれかと反応して薬学的に許容可能な酸付加塩を形成する。このような薬学的に許容可能な酸付加塩およびそれらを調製するための一般的な方法は当該分野において周知である。例えば、Ｐ．Ｓｔａｈｌら、ＨＡＮＤＢＯＯＫ ＯＦ ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬ ＳＡＬＴＳ：ＰＲＯＰＥＲＴＩＥＳ，ＳＥＬＥＣＴＩＯＮ ＡＮＤ ＵＳＥ、（ＶＣＨＡ／Ｗｉｌｅｙ−ＶＣＨ、２００８）；Ｓ．Ｍ．Ｂｅｒｇｅら、「Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓａｌｔｓ」、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｖｏｌ ６６、Ｎｏ．１、１９７７年１月を参照のこと。

本発明の化合物は、好ましくは、様々な経路によって投与される医薬組成物として製剤化される。好ましくは、このような組成物は経口投与用である。このような医薬組成物およびそれらを調製するための方法は、当該分野において周知である。例えば、ＲＥＭＩＮＧＴＯＮ：ＴＨＥ ＳＣＩＥＮＣＥ ＡＮＤ ＰＲＡＣＴＩＣＥ ＯＦ ＰＨＡＲＭＡＣＹ（Ａ．Ｇｅｎｎａｒｏら、第２１版、Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．、２００５）を参照のこと。

本発明の化合物は概して広範な投薬範囲にわたって効果的である。例えば、１日当たりの投薬量は、通常、１日に約１〜２０００ｍｇの範囲内である。好ましくは、このような用量は、１日に５０〜１０００ｍｇの範囲内である。より好ましくは、このような用量は１日に１２５〜４００ｍｇの範囲内である。一部の場合、上述の範囲の下限値未満の投薬レベルが十分以上であってもよく、一方、他の場合、さらに多くの用量が利用されてもよく、したがって上記の投薬範囲は本発明の範囲を限定することを決して意図していない。実際に投与される化合物の量は、治療される状態、選択される投与経路、投与される実際の１つまたは複数の化合物、個々の患者の年齢、体重および反応、ならびに患者の症状の重症度を含む、関連状況を考慮して、医師により決定されることは理解されるであろう。

当業者は、本発明の特定の化合物が少なくとも１つのキラル中心を含有することを理解するであろう。本発明は、全ての個々のエナンチオマーまたはジアステレオマー、ならびにラセミ体を含む前記化合物のエナンチオマーとジアステレオマーの混合物を意図する。少なくとも１つのキラル中心を含有する本発明の化合物は単一のエナンチオマーまたはジアステレオマーとして存在することが好ましい。単一のエナンチオマーまたはジアステレオマーは、キラル試薬で開始して、または立体選択的もしくは立体特異的合成技術によって調製され得る。あるいは、単一のエナンチオマーまたはジアステレオマーは、標準的なキラルクロマトグラフまたは結晶化技術によって混合物から単離されてもよい。

化合物名において「異性体１」の指定は、本発明の対応する中間体または化合物が、エナンチオマーの対の混合物がキラルクロマトグラフィーにより分離される場合、２つの溶出しているエナンチオマーのうちの１番目であることを表す。化合物名において「異性体２」の指定は、本発明の対応する中間体または化合物が、エナンチオマーの対の混合物がキラルクロマトグラフィーにより分離される場合、２つの溶出しているエナンチオマーのうちの２番目であることを表す。

本発明の化合物は、当該分野において周知で理解されている合成法に従って調製され得る。これらの反応の工程についての適切な反応条件は当該分野において周知であり、溶媒および共試薬の適切な置換は当業者の範囲内である。同様に、合成中間体は、必要または所望の場合、様々な周知の技術によって単離および／または精製され得ること、ならびに高い頻度で、ほとんどまたは全く精製せずに後の合成工程において様々な中間体を直接使用できることは当業者により理解されるであろう。さらに、当業者は、一部の状況において、部分が導入される順序は重要ではないことを理解するであろう。本発明の化合物を生成するのに必要とされる工程の特定の順序は、熟練の化学者によって十分に理解されるように、合成される特定の化合物、出発化合物、および置換部分の相対的傾向に依存する。他に示されない限り、全ての置換基は以前に定義されている通りであり、全ての試薬は当該分野において周知であり、理解されている。

本明細書で使用される場合、以下の用語は示した意味を有する：「ＡＣＮ」はアセトニトリルを指し；「ＤＣＭ」はジクロロメタンを指し；「ＤＭＦ」はＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミドを指し；「ＤＭＳＯ」はジメチルスルホキシドを指し；「ＤＴＴ」はジチオスレイトールを指し；「ＥＤＴＡ」はエチレンジアミン四酢酸を指し；「ＥＧＴＡ」はエチレングリコール四酢酸を指し；「ＥＬＩＳＡ」は酵素結合免疫吸着測定法を指し；「ＥｔＯＡｃ」は酢酸エチルを指し；「ＥｔＯＨ」はエタノールを指し；「ＦＢＳ」はウシ胎仔血清を指し；「ＨＢＳＳ」はハンクス平衡塩溶液を指し；「ＩＣ_５０」は半数阻害濃度を指し；「ＩＶＴＩ」はインビボ標的阻害を指し；「ＭＳ」は質量分析を指し；「ＭｅＯＨ」はメタノールを指し；「ＮＭＲ」は核磁気共鳴を指し；「ＰＢＳＴ」はＴｗｅｅｎ−２０を含有するリン酸緩衝生理食塩水を指し；「ＴＨＦ」はテトラヒドロフランを指し；「ＵＶＷ」は紫外線波長を指し、「ＸＲＤ」はＸ線回折を指す。

反対に示さない限り、本明細書に例示される化合物は、ＡＣＤＬＡＢＳまたはＡｃｃｅｌｒｙｓ Ｄｒａｗ ４．１のいずれかを使用して命名され、番号付けされる。

本発明の化合物は以下のスキームに例示されるように合成され得、ここでＲ^１、Ｒ^２、Ｒ^３、Ｒ^４およびＲ^５は以前に定義されている通りである。

スキーム１：式Ｉの化合物の合成
スキーム１は式Ｉの化合物の一般的合成を例示する。化合物１は周知の芳香族置換またはカップリング反応条件下で適切に置換された化合物２と反応して、式Ｉの化合物が得られる。より具体的には、化合物１は、水素化ナトリウム、イソプロピルマグネシウムクロリド、炭酸セシウム、炭酸カリウムまたはｔｅｒｔ−ブトキシドなどの適切な塩基の存在下で高温で化合物２と反応する。任意に、１，４−ジオキサンまたはｔｅｒｔ−ブチルアルコールなどの適切な溶媒中への、４，５−ビス（ジフェニルホスフィノ）−９，９−ジメチルキサンテンまたは２−（ジ−ｔｅｒｔ−ブチルホスフィノ）−２’，４’，６’−トリイソプロピル−３，６−ジメトキシ−１，１’−ビフェニルなどの適切なリガンド剤、および酢酸パラジウム（ＩＩ）、トリス（ジベンジリデンアセトン）ジパラジウム（０）またはクロロ［２−（ジ−ｔｅｒｔ−ブチルホスフィノ）−２’，４’，６’−トリイソプロピル−１，１’−ビフェニル］［２−（２−アミノエチル）フェニル）］パラジウム（ＩＩ）などの適切な触媒の導入もまた、式Ｉの化合物を得ることができる。

スキーム２：Ｒ^５が３−メトキシ−１Ｈ−ピラゾール−４−イルまたは３−シクロプロピル−１Ｈ−ピラゾール−４−イルである場合の式Ｉの化合物の合成
スキーム２は、Ｒ^５が３−メトキシ−１Ｈ−ピラゾール−４−イルまたは３−シクロプロピル−１Ｈ−ピラゾール−４−イルである場合の式Ｉの化合物の合成を例示する。以前に記載されている周知のカップリング反応条件下で、化合物１を、ｔｅｒｔ−ブチルオキシカルボニルなどの適切な窒素保護基を有する適切に置換されたピラゾールアミンである、化合物３と反応させて化合物４を得る。１，４−ジオキサンまたはＭｅＯＨなどの適切な溶媒中で、化合物４を、塩化水素またはトリフルオロ酢酸などの適切な窒素脱保護剤とさらに反応させて、Ｒ^５が３−メトキシ−１Ｈ−ピラゾール−４−イルまたは３−シクロプロピル−１Ｈ−ピラゾール−４−イルである式Ｉの化合物を得る。

スキーム３：式Ｉの化合物の代替合成
スキーム３は、式Ｉの化合物の代替合成を例示する。ＤＭＦなどの適切な溶媒中の水素化ナトリウムなどの適切な塩基の存在下で、化合物５を（２−ブロモエトキシ）−ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシランと反応させて化合物６を得る。次いで以前に記載されている周知のカップリング反応条件下で、化合物６を適切に置換された化合物２（Ｒ^５−ＮＨ_２）と反応させて化合物７を得る。化合物７をＴＨＦと水の混合物などの適切な溶媒中の酢酸などの適切な脱保護剤と反応させて化合物８を得る。トリエチルアミンなどの適切な塩基の存在下で、化合物８をＤＭＦなどの適切な溶媒中のメタンスルホニルクロリドとさらに反応させて化合物９を得る。化合物９をＡＣＮなどの適切な溶媒中の適切なアミンと反応させて式Ｉの化合物を得る。

スキーム４：化合物Ｉの合成
スキーム４は化合物１を合成するための方法を例示する。化合物１０をＡＣＮなどの適切な溶媒中のＮ−ブロモスクシンイミドなどの適切な臭素化剤と反応させて化合物１１を得る。化合物１１を水素化ナトリウムまたは水酸化ナトリウムなどの適切な塩基、および４−（２−クロロエチル）モルホリンなどの適切なＮ−アルキル化剤と反応させて化合物１２を得る。高温下で、化合物１２を、１，４−ジオキサンなどの適切な溶媒中のビス（ピナコラト）ジボロン、酢酸カリウムなどの適切な塩基、および（１，１’−ビス（ジフェニルホスフィノ）フェロセン）パラジウム（ＩＩ）クロリドなどの適切な触媒と反応させて化合物１３を得る。高温下で、化合物１３を、１，４−ジオキサンと水の混合物などの適切な溶媒中の２，４−ジクロロ−５−メチルピリミジンなどの適切に置換されたピリミジン化合物、炭酸カリウムなどの適切な塩基、テトラキス（トリフェニルホスフィン）パラジウムなどの適切な触媒と反応させて化合物１を得る。

スキーム５：化合物１の代替合成
スキーム５は化合物１を合成するための代替方法を例示する。Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミンなどの適切な塩基の存在下で、化合物１１をＡＣＮなどの適切な溶媒中のジ−ｔｅｒｔ−ブチルジカーボネートなどの適切な窒素保護剤と反応させて化合物１４を得る。以前に記載されている周知のカップリング反応条件下で、化合物１４をビス（ピナコラト）ジボロンと反応させて化合物１５を得る。以前に記載されている周知のカップリング反応条件下で、化合物１５を適切に置換されたピリミジン化合物と反応させて化合物１６を得る。化合物１６をＤＣＭまたは１，４−ジオキサンなどの適切な溶媒中のトリフルオロ酢酸または塩化水素などの適切な脱保護剤で脱保護させて化合物１７を得る。水素化ナトリウムなどの適切な塩基の存在下で、化合物１７をＮ−メチルピロリドンなどの適切な溶媒中の４−（２−ブロモエチル）モルホリンなどの適切なアルキル化剤と反応させて化合物１を得る。

調製例１
６，６−ジメチルチエノ［２，３−ｃ］フラン−４−オン

２０Ｌの３つ口フラスコ中で、ＴＨＦ（９７５０ｍＬ）中の３−チオフェンカルボン酸（２５０ｇ、１．９５ｍｏｌ）の溶液を−７０℃に冷却する。この溶液に、温度を−５５℃未満に維持しながら、ｎ−ブチルリチウム（ヘキサン中に２．５Ｍ、１８７２ｍＬ、４．６８ｍｏｌ）をゆっくり加える。反応混合物を−７０℃にて１時間撹拌する。アセトン（１８７ｍＬ、２．５５ｍｏｌ）を−７０℃にてゆっくり加える。反応混合物を０℃に加温し、０℃で３時間撹拌する。得られた溶液に、４ＭのＨＣｌ（１５００ｍＬ）を０℃にて加え、反応混合物を室温に加温する。得られた混合物を一晩撹拌する。反応混合物を珪藻土パッドで濾過し、パッドをトルエン（３×５００ｍＬ）で洗浄する。減圧下で濾液を濃縮する。得られた粗残渣をトルエン（３７５０ｍＬ）および水（２５０ｍＬ）に溶解し、ｐ−トルエンスルホン酸（１００．１ｇ、０．５２６ｍｏｌ）を室温にて加える。反応混合物を１００℃にて１６時間還流する。反応物を室温に冷却し、５０℃にて減圧下で濃縮する。得られた残渣を水に溶解し、ＥｔＯＡｃ（２×１０Ｌ）で抽出する。有機層を飽和炭酸水素ナトリウム水溶液および水で洗浄する。有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過し、５０℃にて減圧下で濾液を濃縮して、茶色の粘性のある液体として標題化合物２００ｇ（６１％）を得る。ＭＳ（ｍ／ｚ）：１６９（Ｍ＋１）。

調製例２
６，６−ジメチル−５Ｈ−チエノ［２，３−ｃ］ピロール−４−オン

水酸化アンモニウム（１０００ｍｌ）中の６，６−ジメチルチエノ［２，３−ｃ］フラン−４−オン（１５０ｇ、０．８９１ｍｏｌ）の溶液を５Ｌのオートクレーブに入れる。密閉した環境で、反応混合物を注意深く２００℃の温度にし、２００℃で４時間撹拌する。４時間後、反応混合物を室温に冷却し、アンモニアガスを放出する。反応混合物をＤＣＭ（３×７５０ｍＬ）で抽出する。有機層を水（１×７５０ｍＬ）で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過し、濾液を５０℃にて減圧下で濃縮して、標題化合物１００ｇ（６７％）を得る。ＭＳ（ｍ／ｚ）：１６８（Ｍ＋１）。

調製例３
メチル２−ブロモチオフェン−３−カルボキシレート

ＭｅＯＨ（１００ｍＬ）中の２−ブロモ−３−チオフェンカルボン酸（１０．１ｇ、４９ｍｍｏｌ）の溶液を硫酸（２．５ｍＬ、４５ｍｍｏｌ）で処理する。反応物を一晩加熱還流する。混合物を減圧下で濃縮して有機溶媒を除去し、得られた混合物を氷冷水に注ぐ。***液をＥｔＯＡｃで抽出する。合わせた有機抽出物を水で、続いて飽和炭酸水素ナトリウム水溶液で洗浄する。有機溶液を無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過し、濾液を減圧下で濃縮して、標題化合物１０．７７ｇ（１００％）を得る。^１Ｈ ＮＭＲ（４００．１５ＭＨｚ、ＤＭＳＯ−ｄ６）δ７．６５（ｄ、Ｊ＝６Ｈｚ、１Ｈ）、７．３４（ｄ、Ｊ＝６Ｈｚ、１Ｈ）、３．７８（ｓ、３Ｈ）。

調製例４
メチル２−シアノチオフェン−３−カルボキシレート

Ｎ−メチルピロリドン（１３０ｍＬ）中のメチル２−ブロモチオフェン−３−カルボキシレート（２８ｇ、１２８ｍｍｏｌ）およびシアン化銅（１５ｇ、１６７ｍｍｏｌ）の混合物を１２０℃で一晩加熱する。反応物を室温に冷却し、ＥｔＯＡｃで希釈する。有機溶液を飽和ＮａＣｌで洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過し、濾液を減圧下で濃縮する。ヘキサン中の２５％ＥｔＯＡｃで溶出するシリカゲルカラムクロマトグラフィーにより残渣を精製して、標題化合物１５．２ｇ（７１％）を得る。^１Ｈ ＮＭＲ（４００．１５ＭＨｚ、ＤＭＳＯ−ｄ６）δ８．１０（ｄ、Ｊ＝５Ｈｚ、１Ｈ）、７．５８（ｄ、Ｊ＝５Ｈｚ、１Ｈ）、３．８６（ｓ、３Ｈ）。

調製例５
スピロ［５Ｈ−チエノ［２，３−ｃ］ピロール−６，１’−シクロプロパン］−４−オン

ジエチルエーテル（３３０ｍＬ）中のメチル２−シアノチオフェン−３−カルボキシレート（１３．７ｇ、７９ｍｍｏｌ）およびチタンテトラ（イソプロポキシド）（２４．８ｇ、８７．４ｍｍｏｌ）の−７０℃の溶液を、エチルマグネシウムブロミド（ジエチルエーテル中３Ｍ、５８ｍＬ、１７５ｍｍｏｌ）の溶液で処理する。反応混合物を６０分間撹拌する。冷却浴を取り外し、混合物を１時間かけてゆっくりと室温に加温する。三フッ化ホウ素エーテラート（２２．６ｍＬ、１５９ｍｍｏｌ）を加え、混合物をさらに１時間撹拌する。反応物を１Ｎの塩酸（２４０ｍＬ）でクエンチし、一晩撹拌する。有機層を分離し、追加のエーテルで水層を逆抽出する。有機抽出物を合わせ、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液および飽和ＮａＣｌで洗浄する。有機溶液を無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過し、濾液を減圧下で濃縮する。残渣をＣ１８カラム（カラム：２７５ｇ；移動相：Ａ）水中の０．１０％ギ酸、Ｂ）ＡＣＮ中の０．１０％ギ酸；勾配：５〜３５％Ｂ；流速：８０ｍＬ／分）でのＨＰＬＣによって精製して、標題化合物１．０２ｇ（３５％）を得る。^１Ｈ ＮＭＲ（４００．１５ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）δ８．４３（ｂｓ，１Ｈ），７．５３（ｄ，Ｊ＝５Ｈｚ、１Ｈ），７．１２（ｄ，Ｊ＝５Ｈｚ，１Ｈ），１．５１（ｍ，２Ｈ），１．３８（ｍ，２Ｈ）。

調製例６
２−ブロモ−６，６−ジメチル−５Ｈ−チエノ［２，３−ｃ］ピロール−４−オン

６，６−ジメチル−５Ｈ−チエノ［２，３−ｃ］ピロール−４−オン（８３５ｇ、４．９９ｍｏｌ）を含有する２０ＬのフラスコにＡＣＮ（１００００ｍＬ）を加え、溶液を１０℃に冷却する。反応混合物にＮ−ブロモスクシンイミド（４４４．４ｇ、２．４９ｍｏｌ）を４等分して加え、２５℃にて６時間撹拌する。反応混合物を減圧下で濃縮し、得られた化合物を水中でスラリーにし、ＥｔＯＡｃ（３×４．１Ｌ）で抽出する。合わせた有機抽出物を水（３×４．１Ｌ）および飽和ＮａＣｌ（４．１Ｌ）で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過する。追加のバッチと合わせるために有機溶液を保存する。

上記と同じプロセスを使用して、６５０ｇおよび８３５ｇそれぞれの６，６−ジメチル−５Ｈ−チエノ［２，３−ｃ］ピロール−４−オンで開始する２つのさらなるバッチを調製する。全ての３回の実施から有機溶液を合わせ、５０℃にて減圧下で濃縮して、茶色の粘着性物質として２−ブロモ−６，６−ジメチル−５Ｈ−チエノ［２，３−ｃ］ピロール−４−オンを得る。得られた生成物をジエチルエーテル／ヘキサン（２：１ｖ／ｖ）中でスラリーにし、濾過して標題化合物１５４２ｇ（４５％）を得る。ＭＳ（ｍ／ｚ）：２４６／２４８（Ｍ＋１／Ｍ＋３）。

以下の化合物を本質的に調製例６の方法によって調製する。

調製例８
４−（２−ブロモエチル）モルホリン臭化水素酸塩

ＤＣＭ（２．４４Ｌ）中のトリフェニルホスフィンジブロミド（１２４ｇ、２９３ｍｍｏｌ）の溶液を、２５℃未満の反応温度を維持しながら、ＤＣＭ（６０ｍＬ）中の４−モルホリンエタノール（３２ｇ、２４４ｍｍｏｌ）の溶液で１時間にわたって滴下して処理する。混合物を室温にて一晩撹拌する。試薬を適切にスケーリングして４−モルホリンエタノール（１０ｇ、７６ｍｍｏｌ）で開始する上記のさらなる反応を行う。反応混合物を合わせ、真空濾過により固体を回収して標題化合物７６．７ｇ（８４％）を得る。^１Ｈ ＮＭＲ（３９９．８ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）δ４．０５（ｍ，２Ｈ），３．８４（ｍ，２Ｈ），３．７８（ｔ，Ｊ＝７Ｈｚ，１Ｈ），３．６７（ｔ，Ｊ＝７Ｈｚ，２Ｈ），３．５６（ｍ，２Ｈ），３．２６（ｍ，２Ｈ）。

調製例９
ｔｅｒｔ−ブチル２−ブロモ−６，６−ジメチル−４−オキソ−チエノ［２，３−ｃ］ピロール−５−カルボキシレート

合成方法１：
ＡＣＮ（４８１ｍＬ）中の２−ブロモ−６，６−ジメチル−５Ｈ−チエノ［２，３−ｃ］ピロール−４−オン（２５ｇ、１０２ｍｍｏｌ）、４−ジメチルアミノピリジン（１．２５ｇ、１０ｍｍｏｌ）およびＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（２４ｍＬ、１３８ｍｍｏｌ）の溶液をジ−ｔｅｒｔ−ブチルジカーボネート（３５ｇ、１６２ｍｍｏｌ）で処理する。混合物を室温にて一晩撹拌する。混合物を減圧下で濃縮する。混合物をヘキサンで希釈し、混合物をシリカゲルパッドで濾過し、パッドをヘキサンで、続いてヘキサン中の２０％ＤＣＭで溶出する。濾液を濃縮して乾燥させて、橙色の油状物として標題化合物３６．５ｇ（９３％）を得る。^１Ｈ ＮＭＲ（３９９．８ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ７．１９（ｓ，１Ｈ），１．７４（ｓ，６Ｈ），１．５８（ｓ，９Ｈ）。

合成方法２：
ＡＣＮ（２Ｌ）中の２−ブロモ−６，６−ジメチル−５Ｈ−チエノ［２，３−ｃ］ピロール−４−オン（２００ｇ、８１３ｍｍｏｌ）、Ｎ，Ｎ−ジメチルピリジン−４−アミン（９．９３ｇ、８１ｍｍｏｌ）およびジ−ｔｅｒｔ−ブチルジカーボネート（２６６ｇ、１２１９ｍｍｏｌ）の溶液を、Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（２１３ｍＬ、１２１９ｍｍｏｌ）で滴下して処理する。混合物を室温にて４時間撹拌する。反応物を３０℃で２時間加熱する。混合物を室温に冷却し、一晩撹拌する。混合物を減圧下で濃縮する。混合物をＥｔＯＡｃで希釈し、得られた有機溶液を水（３００ｍＬ）、次いで飽和ＮａＣｌ（３００ｍＬ）で２回洗浄する。有機溶液を無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過し、濾液を減圧下で濃縮する。残渣を、ヘキサン中の０〜２０％のＥｔＯＡｃの勾配で溶出するシリカゲルパッド上で精製して標題化合物２５３ｇ（９０％）を得る。ＭＳ（ｍ／ｚ）：２９０／２９２（Ｍ−イソブテン＋１／Ｍ−イソブテン＋３）。^１Ｈ ＮＭＲ（３９９．８ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ７．１９（ｓ，１Ｈ），１．７４（ｓ，６Ｈ），１．５８（ｓ，９Ｈ）。

調製例１０
ｔｅｒｔ−ブチル６，６−ジメチル−４−オキソ−２−（４，４，５，５−テトラメチル−１，３，２−ジオキサボロラン−２−イル）チエノ［２，３−ｃ］ピロール−５−カルボキシレート

１，４−ジオキサン（１．６Ｌ）中のｔｅｒｔ−ブチル２−ブロモ−６，６−ジメチル−４−オキソ−チエノ［２，３−ｃ］ピロール−５−カルボキシレート（１１４ｇ、３２９ｍｍｏｌ）、ビス（ピナコラト）ジボロン（１２５ｇ、４９４ｍｍｏｌ）および酢酸カリウム（９７ｇ、９８８ｍｍｏｌ）の混合物を窒素で１０分間脱気する。（１，１’−ビス（ジフェニルホスフィノ）フェロセン）パラジウム（ＩＩ）クロリド（５．３８ｇ、６．６ｍｍｏｌ）を加え、混合物を９０℃にて４時間加熱する。反応物を室温に冷却し、ＣＥＬＩＴＥ（登録商標）パッドで濾過する。濾液を濃縮し、次いで残渣をヘキサン中の１０％ＥｔＯＡｃで処理する。真空濾過により沈殿物を回収して標題化合物６５．８ｇ（４０％）を得る。ＭＳ（ｍ／ｚ）：３３８（Ｍ−イソブテン＋１）。

調製例１１
ｔｅｒｔ−ブチル２−（２−クロロピリミジン−４−イル）−６，６−ジメチル−４−オキソ−チエノ［２，３−ｃ］ピロール−５−カルボキシレート

合成方法１：
１，４−ジオキサン（５２０ｍＬ）中のｔｅｒｔ−ブチル２−ブロモ−６，６−ジメチル−４−オキソ−チエノ［２，３−ｃ］ピロール−５−カルボキシレート（３６ｇ、１０４ｍｍｏｌ）、ビス（ピナコラト）ジボロン（５９．８ｇ、２３５ｍｍｏｌ）および酢酸カリウム（３３．２ｇ、３３８ｍｍｏｌ）の混合物を窒素で１０分間脱気する。（１，１’−ビス（ジフェニルホスフィノ）フェロセン）パラジウム（ＩＩ）クロリド（４．４５ｇ、５．５ｍｍｏｌ）を加え、混合物を９０℃で加熱する。混合物を９０℃にて２時間加熱する。反応物を室温に冷却し、３時間撹拌する。２，４−ジクロロピリミジン（２２ｇ、１４５ｍｍｏｌ）、続いて炭酸カリウム（２０．４ｇ、１４７ｍｍｏｌ）の水溶液（８３ｍＬ）を加える。得られた混合物を窒素で１０分間脱気する。テトラキス（トリフェニルホスフィン）パラジウム（１．５９ｇ、１．３８ｍｍｏｌ）を加え、混合物を９０℃で２時間加熱する。混合物を室温に冷却し、ＣＥＬＩＴＥ（登録商標）のパッドで濾過する。濾液を３部の水、および１部の飽和ＮａＣｌで洗浄する。有機物を減圧下で濃縮する。残渣を、ＤＣＭ中の０〜２５％のＥｔＯＡｃの勾配で溶出するシリカゲルカラムクロマトグラフィーにより精製して標題化合物１１ｇ（５９％）を得る。ＭＳ（ｍ／ｚ）：３２４（Ｍ−イソブテン＋１）。

合成方法２
１，４−ジオキサン（１００ｍＬ）中のｔｅｒｔ−ブチル６，６−ジメチル−４−オキソ−２−（４，４，５，５−テトラメチル−１，３，２−ジオキサボロラン−２−イル）チエノ［２，３−ｃ］ピロール−５−カルボキシレート（１１．７ｇ、３０ｍｍｏｌ）、２，４−ジクロロピリミジン（１３ｇ、８９ｍｍｏｌ）、炭酸カリウム（２０．４ｇ、１４７ｍｍｏｌ）および水（５０ｍＬ）の混合物を窒素で１０分間脱気する。テトラキス（トリフェニルホスフィン）パラジウム（２．５８ｇ、２．２ｍｍｏｌ）を加え、混合物を８７℃で１．５時間加熱する。混合物を室温に冷却する。混合物をＥｔＯＡｃ（１Ｌ）で希釈し、得られた溶液を水および飽和ＮａＣｌで洗浄する。有機溶液を無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過し、濾液を減圧下で濃縮する。残渣をヘキサン（２００ｍＬ）中の３０％のＥｔＯＡｃで処理し、得られた沈殿物を真空濾過により回収して標題化合物７．６ｇ（６７％）を得る。ＭＳ（ｍ／ｚ）：３２４（Ｍ−イソブテン＋１）。

調製例１２
２−（２−クロロピリミジン−４−イル）−６，６−ジメチル−５Ｈ−チエノ［２，３−ｃ］ピロール−４−オン

ＤＣＭ（２５ｍＬ）中のｔｅｒｔ−ブチル２−（２−クロロピリミジン−４−イル）−６，６−ジメチル−４−オキソ−チエノ［２，３−ｃ］ピロール−５−カルボキシレート（６．３６ｇ、１６．７ｍｍｏｌ）およびトリフルオロ酢酸（２５ｍＬ）の混合物を室温にて２時間撹拌する。混合物を減圧下で濃縮し、残渣をＤＣＭで希釈する。混合物を飽和炭酸水素ナトリウム水溶液で分配し、二相エマルションから固体を回収する。固体をエーテルで洗浄し、５０℃にて一晩真空下で乾燥させて標題化合物４．６５ｇ（９９％）を得る。ＭＳ（ｍ／ｚ）：２８０（Ｍ＋１）。

調製例１３
２−（２−クロロピリミジン−４−イル）−６，６−ジメチル−５Ｈ−チエノ［２，３−ｃ］ピロール−４−オン塩酸塩

１，４−ジオキサン（５８５ｍＬ）中のｔｅｒｔ−ブチル２−（２−クロロピリミジン−４−イル）−６，６−ジメチル−４−オキソ−チエノ［２，３−ｃ］ピロール−５−カルボキシレート（６６．７ｇ、１７６ｍｍｏｌ）および塩化水素（１，４−ジオキサン中に４Ｍ、２６３ｍＬ、１０５４ｍｍｏｌ）の溶液を３０℃にて５時間加熱する。加熱要素を取り外し、混合物を室温にて一晩撹拌する。ヘキサン（８００ｍＬ）を反応混合物にゆっくりと加える。得られたスラリーを１０分間撹拌し、真空濾過により固体を回収する。固体を真空下で乾燥させて標題化合物５６ｇ（１００％）を得る。ＭＳ（ｍ／ｚ）：２８０（Ｍ＋１）。

調製例１４
２−ブロモ−６，６−ジメチル−５−（２−モルホリノエチル）チエノ［２，３−ｃ］ピロール−４−オン

水酸化ナトリウム（１６０ｇ、４ｍｏｌ）を水（２５０ｍＬ）に加え、透明な溶液が生成するまで混合物を撹拌する。１，４−ジオキサン（２Ｌ）、続いて２−ブロモ−６，６−ジメチル−５Ｈ−チエノ［２，３−ｃ］ピロール−４−オン（２１５ｇ、８７４ｍｍｏｌ）、テトラブチルアンモニウムヨージド（３００ｇ、８１２ｍｍｏｌ）および４−（２−クロロエチル）モルホリン塩酸塩（３００ｇ、１５６４ｍｍｏｌ）を加える。混合物を８０℃にて１時間加熱する。反応混合物を室温に冷却する。反応物を水（２Ｌ）で希釈し、混合物をＥｔＯＡｃ（３×２Ｌ）で抽出する。合わせた有機抽出物を無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過し、濾液を減圧下で濃縮する。ＤＣＭ（２Ｌ）およびヘキサン（２Ｌ）を加え、得られた有機溶液を飽和ＮａＣｌ（２×１Ｌ）で洗浄する。有機溶液を減圧下で最小体積に濃縮する。固体を濾去して標題化合物１８０ｇ（５７％）を得る。ＭＳ（ｍ／ｚ）：３５９／３６１（Ｍ＋１／Ｍ＋３）。

調製例１５
２−ブロモ−５−［２−［ｔｅｒｔ−ブチル（ジメチル）シリル］オキシエチル］−６，６−ジメチル−チエノ［２，３−ｃ］ピロール−４−オン

ＤＭＦ（２０３ｍＬ）中の水素化ナトリウム（鉱油中に６０ｗｔ％、３．９ｇ、９７．５ｍｍｏｌ）の懸濁液を、０℃にて２−ブロモ−６，６−ジメチル−５Ｈ−チエノ［２，３−ｃ］ピロール−４−オン（２０ｇ、８１．３ｍｍｏｌ）、続いて（２−ブロモエトキシ）−ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシラン（２３．３ｇ、９７．５ｍｍｏｌ）で処理する。反応物を０℃にて１時間撹拌する。氷浴を取り外し、反応混合物を一晩撹拌する。反応混合物を飽和塩化アンモニウム水溶液でクエンチし、ＥｔＯＡｃで抽出する。有機溶液を飽和ＮａＣｌで洗浄する。有機溶液を無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過し、濾液を減圧下で濃縮する。ヘキサン中の２０％ＥｔＯＡｃで溶出するシリカゲルカラムクロマトグラフィーによって残渣を精製して標題化合物２６ｇ（７９％）を得る。ＭＳ（ｍ／ｚ）：４０４／４０６（Ｍ＋１／Ｍ＋３）。

以下の化合物を本質的に調製例１５の方法によって調製する。

調製例１７
２−（２−クロロ−５−メチル−ピリミジン−４−イル）−６，６−ジメチル−５−（２−モルホリノエチル）チエノ［２，３−ｃ］ピロール−４−オン

１，４−ジオキサン（８０ｍＬ）中の２−ブロモ−６，６−ジメチル−５−（２−モルホリノエチル）チエノ［２，３−ｃ］ピロール−４−オン（５．７６ｇ、１６ｍｍｏｌ）、ビス（ピナコラト）ジボロン（４．８８ｇ、１９．２ｍｍｏｌ）および酢酸カリウム（４．８６ｇ、４８ｍｍｏｌ）の混合物を窒素で２０分間脱気する。（１，１’−ビス（ジフェニルホスフィノ）フェロセン）パラジウム（ＩＩ）クロリド（６６８ｍｇ、０．８０ｍｍｏｌ）を加え、混合物を９０℃にて一晩加熱する。反応物を室温に冷却し、濾液を濃縮し、次いで残渣をＥｔＯＡｃで処理する。沈殿物を真空濾過により回収する。固体（３．７ｇ）に２，４−ジクロロ−５−メチルピリミジン（１．５ｇ、９．１ｍｍｏｌ）、１，４−ジオキサン（５０ｍＬ）、炭酸カリウム（３．８ｇ、２７ｍｍｏｌ）および水（３３ｍＬ）を加える。得られた混合物を窒素で２０分間脱気する。テトラキス（トリフェニルホスフィン）パラジウム（７９０ｍｇ、０．６８ｍｍｏｌ）を加え、混合物を９０℃で２時間加熱する。混合物を室温に冷却し、ＥｔＯＡｃで希釈する。有機溶液を飽和ＮａＣｌで洗浄する。有機溶液を無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過し、濾液を減圧下で濃縮する。残渣を、ＥｔＯＡｃ中の０〜１０％ＭｅＯＨの勾配で溶出するシリカゲルカラムクロマトグラフィーにより精製して標題化合物１．８２ｇ（１９％）を得る。ＭＳ（ｍ／ｚ）：４０７（Ｍ＋１）。

以下の化合物を本質的に調製例１７の方法によって調製する。

調製例２４
２−（２−クロロピリミジン−４−イル）−６，６−ジメチル−５−（２−モルホリノエチル）チエノ［２，３−ｃ］ピロール−４−オン

合成方法１：
１，４−ジオキサン（１Ｌ）中の２−ブロモ−６，６−ジメチル−５−（２−モルホリノエチル）チエノ［２，３−ｃ］ピロール−４−オン（２００ｇ、５５７ｍｍｏｌ）、ビス（ピナコラト）ジボロン（２００ｇ、７８８ｍｍｏｌ）および酢酸カリウム（２００ｇ、２０３８ｍｍｏｌ）の混合物を窒素で１５分間脱気する。（１，１’−ビス（ジフェニルホスフィノ）フェロセン）パラジウム（ＩＩ）クロリド（２０ｇ、２７ｍｍｏｌ）を加え、混合物を９０℃で加熱する。混合物を９０℃にて１時間加熱する。反応物を５０℃に冷却し、炭酸カリウム（２５０ｇ、１８０９ｍｍｏｌ）、２，４−ジクロロピリミジン（２３０ｇ、１５４３ｍｍｏｌ）および水（３００ｍＬ）を加える。混合物を９０℃にて１時間加熱する。混合物を３５℃に冷却し、水（７００ｍＬ）を加える。反応混合物をＤＣＭ（２Ｌ）で抽出する。水溶液をＤＣＭ（５００ｍＬ）で逆抽出する。合わせた有機溶液を無水硫酸マグネシウムで乾燥させ、濾過し、濾液を減圧下で濃縮する。残渣をヘキサン（２Ｌ）中の１０％ＥｔＯＡｃで希釈し、１時間撹拌する。母液をデカントし、固体をヘキサン（５００ｍＬ）でリンスする。固体をＤＣＭ（３００ｍＬ）に溶解し、ヘキサン（２Ｌ）をゆっくりと加える。得られた固体を真空濾過により回収し、乾燥させて標題化合物１５０ｇ（６５％）を得る。ＭＳ（ｍ／ｚ）：３９３（Ｍ＋１）。

合成方法２：
Ｎ−メチルピロリドン（２１１ｍＬ）中の２−（２−クロロピリミジン−４−イル）−６，６−ジメチル−５Ｈ−チエノ［２，３−ｃ］ピロール−４−オン塩酸塩（１０ｇ、３２ｍｍｏｌ）およびテトラブチルアンモニウムヨージド（１．１７ｇ、３．１６ｍｍｏｌ）の混合物を、氷水浴を使用して０℃に冷却する。水素化ナトリウム（鉱油中に６０ｗｔ％、５．０６ｇ、１２６．５ｍｍｏｌ）を少しずつ加える。混合物を０℃にて１０分間撹拌し、次いで４−（２−ブロモエチル）モルホリン臭化水素酸塩（１３．９ｇ、５０．６ｍｍｏｌ）を加える。氷浴を取り除き、混合物を１時間撹拌する。反応混合物を飽和塩化アンモニウム水溶液でクエンチし、混合物を水（１Ｌ）で希釈する。混合物を酢酸イソプロピル（４×７００ｍＬ）で抽出する。合わせた有機抽出物を無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過し、濾液を減圧下で濃縮する。ヘキサン中の２０％ＥｔＯＡｃを加え、混合物を１時間撹拌する。固体を真空濾過により回収し、乾燥させて標題化合物８．６ｇ（６９％）を得る。ＭＳ（ｍ／ｚ）：３９３（Ｍ＋１）。

合成方法３：
ＤＭＦ（１４ｍＬ）中の２−（２−クロロピリミジン−４−イル）−６，６−ジメチル−５Ｈ−チエノ［２，３−ｃ］ピロール−４−オン（５００ｍｇ、１．４ｍｍｏｌ）の溶液を水素化ナトリウム（鉱油中に６０ｗｔ％、１２９ｍｇ、３．２ｍｍｏｌ）で処理する。混合物を１０分間撹拌し、次いで４−（２−ブロモエチル）モルホリン塩酸塩（４１２ｍｇ、１．８ｍｍｏｌ）を加える。反応混合物を室温にて一晩撹拌する。混合物を０℃に冷却し、４−（２−ブロモエチル）モルホリン塩酸塩（１６５ｍｇ、０．７ｍｍｏｌ）、続いて水素化ナトリウム（鉱油中に６０ｗｔ％、１４ｍｇ、０．４ｍｍｏｌ）を加える。氷浴を取り除き、混合物を室温にて一晩撹拌する。水素化ナトリウム（鉱油中に６０ｗｔ％、１４ｍｇ、０．４ｍｍｏｌ）を加え、得られた混合物を室温にて５時間撹拌する。混合物を水で希釈し、ＥｔＯＡｃで抽出する。有機抽出物を５％の塩化リチウム水溶液で洗浄する。有機溶液を減圧下で濃縮する。残渣を、ＤＣＭ中の０〜１０％ＭｅＯＨの勾配で溶出するシリカゲルカラムクロマトグラフィーによって精製して標題化合物５２４ｍｇ（９３％）を得る。ＭＳ（ｍ／ｚ）：３９３（Ｍ＋１）。

調製例２５
５−［２−［ｔｅｒｔ−ブチル（ジメチル）シリル］オキシエチル］−６，６−ジメチル−２−［２−［（２−メチルピラゾール−３−イル）アミノ］ピリミジン−４−イル］チエノ［２，３−ｃ］ピロール−４−オン

５−［２−［ｔｅｒｔ−ブチル（ジメチル）シリル］オキシエチル］−２−（２−クロロピリミジン−４−イル）−６，６−ジメチル−チエノ［２，３−ｃ］ピロール−４−オン（６ｇ、１３．７ｍｍｏｌ）、２−メチルピラゾール−３−アミン（１．６０ｇ、１６．４ｍｍｏｌ）、炭酸セシウム（８．９２ｇ、２７．４ｍｍｏｌ）、４，５−ビス（ジフェニルホスフィノ）−９，９−ジメチルキサンテン（７９０ｍｇ、１．３７ｍｍｏｌ）および１，４−ジオキサン（１５０ｍＬ）の混合物を窒素で１０分間脱気する。酢酸パラジウム（ＩＩ）（６１０ｍｇ、２．７４ｍｍｏｌ）を加え、混合物を９０℃にて２．５時間加熱する。混合物を室温に冷却し、混合物を室温にて一晩撹拌する。反応混合物をＤＣＭ中の１０％ＭｅＯＨで希釈し、混合物を１５分間撹拌する。混合物をＣＥＬＩＴＥ（登録商標）で濾過し、固体をＤＣＭ中の１０％ＭｅＯＨで洗浄する。濾液を減圧下で濃縮する。残渣を、ＤＣＭ中の６０〜１００％ＥｔＯＡｃの勾配で溶出するシリカゲルカラムクロマトグラフィーにより精製して標題化合物５．７３ｇ（８４％）を得る。ＭＳ（ｍ／ｚ）：４９９（Ｍ＋１）。

調製例２６
２−ブロモ−５−（２−ヒドロキシエチル）−６，６−ジメチル−チエノ［２，３−ｃ］ピロール−４−オン

ＴＨＦ（４０ｍＬ）中の２−ブロモ−５−［２−［ｔｅｒｔ−ブチル（ジメチル）シリル］オキシエチル］−６，６−ジメチル−チエノ［２，３−ｃ］ピロール−４−オン（２６ｇ、６４ｍｍｏｌ）を酢酸（１２０ｍＬ）および水（４０ｍＬ）で処理する。混合物を室温にて一晩撹拌する。反応混合物を減圧下で濃縮する。残渣をＥｔＯＡｃで希釈し、得られた溶液を飽和炭酸水素ナトリウム水溶液、続いて飽和ＮａＣｌで洗浄する。有機溶液を無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過し、濾液を濃縮して標題化合物１８．９７ｇ（１００％）を得る。ＭＳ（ｍ／ｚ）：２９０／２９２（Ｍ＋１／Ｍ＋３）。

以下の化合物を本質的に調製例２６の方法によって調製する。

調製例２８
２−（２−ブロモ−６，６−ジメチル−４−オキソ−チエノ［２，３−ｃ］ピロール−５−イル）エチルメタンスルホネート

ＤＣＭ（３００ｍＬ）中の２−ブロモ−５−（２−ヒドロキシエチル）−６，６−ジメチル−チエノ［２，３−ｃ］ピロール−４−オン（１８．９７ｇ、６５．４ｍｍｏｌ）の溶液を０℃に冷却する。混合物をトリエチルアミン（１３．７ｍＬ、９８．１ｍｍｏｌ）およびメタンスルホニルクロリド（８．２４ｇ、７１．９ｍｍｏｌ）で処理する。混合物を０℃にて２時間撹拌する。溶液を水および飽和ＮａＣｌで洗浄する。有機溶液を無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過し、濾液を減圧下で濃縮する。残渣をＥｔＯＡｃで溶出するシリカゲルカラムクロマトグラフィーによって精製して標題化合物２３．８ｇ（９９％）を得る。ＭＳ（ｍ／ｚ）：３６８／３７０（Ｍ＋１／Ｍ＋３）。

以下の化合物を本質的に調製例２８の方法によって調製する。

調製例３０
３−エチル−４−ニトロ−１Ｈ−ピラゾール

３−エチル−１Ｈ−ピラゾール（１ｇ、１０．４ｍｍｏｌ）を硫酸（５ｍＬ）に溶解し、混合物を−５℃に冷却する。次いで硝酸カリウム（１．１６ｇ、１１．４ｍｍｏｌ）を混合物に少しずつ加える。混合物を室温にゆっくり加温しながらそれを一晩撹拌する。混合物を０℃に冷却し、ｐＨが約１０になるまで水酸化アンモニウムでゆっくりクエンチする。得られた固体を真空濾過により回収し、少量の水で洗浄する。濾液を０℃に冷却し、次いで真空濾過により濾液から固体を回収し、少量の水で洗浄する。固体を合わせ、ＤＣＭに溶解する。有機溶液を無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過し、濾液を減圧下で濃縮する。ジエチルエーテルで１回共蒸発させて標題化合物１．３４ｇ（９１％）を得る。ＭＳ（ｍ／ｚ）：１４０（Ｍ−１）。

調製例３１
ｔｅｒｔ−ブチル３−メトキシ−４−ニトロ−ピラゾール−１−カルボキシレート

ＤＣＭ（３００ｍＬ）中の５−メトキシ−４−ニトロ−１Ｈ−ピラゾール（３ｇ、２１ｍｍｏｌ）、ジ−ｔｅｒｔ−ブチル−ジカーボネート（６．９ｇ、３１．６ｍｍｏｌ）および４−ジメチルアミノピリジン（１．２８ｇ、１０．５ｍｍｏｌ）の懸濁液をトリエチルアミン（５．８５ｍＬ、４２ｍｍｏｌ）で処理し、混合物を室温にて一晩撹拌する。反応混合物を減圧下で濃縮する。残渣を、ヘキサン中の１〜１０％ＥｔＯＡｃの勾配で溶出するシリカゲルカラムクロマトグラフィーによって精製して標題化合物３．４８ｇ（６８％）を得る。^１Ｈ ＮＭＲ（３９９．８ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ_６）δ９．１０（ｓ，１Ｈ），３．９８（ｓ，３Ｈ），１．５６（ｓ，９Ｈ）。

調製例３２
３−エチル−１Ｈ−ピラゾール−４−アミン

ＥｔＯＨ（２１ｍＬ）中のパラジウム（炭素上５ｗｔ％、４５０ｍｇ、０．２１ｍｍｏｌ）の懸濁液を３−エチル−４−ニトロ−１Ｈ−ピラゾール（３００ｍｇ、２．１３ｍｍｏｌ）で処理する。得られた混合物を水素雰囲気下で６．５時間撹拌する。反応混合物をＣＥＬＩＴＥ（登録商標）で濾過し、固体をさらなるＥｔＯＨでリンスする。濾液を減圧下で濃縮して標題化合物２４０ｇ（９９％）を得る。^１Ｈ ＮＭＲ（４００．１ＭＨｚ，ＣＤ_３ＣＮ）δ７．０２（ｓ，１Ｈ），２．５４（ｑ，Ｊ＝７Ｈｚ，３Ｈ），１．１７（ｔ，Ｊ＝７Ｈｚ，９Ｈ）。

以下の化合物を本質的に調製例３２の方法によって調製する。

調製例３４
ｔｅｒｔ−ブチルＮ−（２−シクロプロピルピラゾール−３−イル）カルバメート

ＴＨＦ（３５ｍＬ）中の２−シクロプロピルピラゾール−３−カルボン酸（４ｇ、２６ｍｍｏｌ）の溶液を０℃に冷却し、次いでトリエチルアミン（５．５ｍＬ、３９ｍｍｏｌ）、続いてジフェニルリン酸アジド（８．５ｍＬ、３９ｍｍｏｌ）を加える。混合物を、反応温度を室温にゆっくり加温しながら４時間撹拌する。ｔｅｒｔ−ブチルアルコール（４．９９ｍＬ）を加え、混合物を７０℃にて１８時間加熱する。反応混合物を減圧下で濃縮する。残渣を、ＤＣＭ中の０〜２０％のＭｅＯＨの勾配で溶出するシリカゲルカラムクロマトグラフィーによって精製して標題化合物５．３９ｇ（９２％）を得る。ＭＳ（ｍ／ｚ）：２２４（Ｍ＋１）。

調製例３５
２−シクロプロピルピラゾール−３−アミン

ＤＣＭ（１２ｍＬ）中のｔｅｒｔ−ブチルＮ−（２−シクロプロピルピラゾール−３−イル）カルバメート（５．３９ｇ、２４ｍｍｏｌ）の溶液をトリフルオロ酢酸（１６ｍＬ、２１３ｍｍｏｌ）で処理する。溶液を室温にて１時間撹拌する。反応混合物を減圧下で濃縮する。残渣をＤＣＭに溶解し、水相のｐＨが７超で存続するまで飽和炭酸水素ナトリウム水溶液で処理する。相を分離し、有機相を無水硫酸ナトリウムで乾燥させる。混合物を濾過し、濾液を減圧下で濃縮する。水相を減圧下で濃縮する。残渣を有機相および水相から合わせ、逆相カラムクロマトグラフィー（カラム：１３０ｇ Ｃ１８；移動相：Ａ）水、Ｂ）ＡＣＮ；勾配：０〜２０％Ｂ）によって精製する。画分を濃縮し、残渣をＤＣＭ中の２５％ＭｅＯＨに溶解する。混合物を濾過し、濾液を減圧下で濃縮する。残渣をＥｔＯＡｃに溶解し、水を加える。層を分離し、水層をＥｔＯＡｃ（８×１００ｍＬ）で逆抽出する。合わせた有機抽出物を減圧下で濃縮して標題化合物２．２７ｇ（７６％）を得る。^１Ｈ ＮＭＲ（４００．１ＭＨｚ，ＣＤ_３ＣＮ）δ７．０２（ｄ，Ｊ＝２Ｈｚ，１Ｈ），５．３３（ｄ，Ｊ＝２Ｈｚ，１Ｈ），４．２８（ｂｓ，２Ｈ），３．１０（ｍ，１Ｈ），０．９６（ｍ，４Ｈ）。

調製例３６
２−（ジベンジルアミノ）エタノール

ＡＣＮ（３５ｍＬ）中の２−（ベンジルアミノ）エタノール（０．９５ｍＬ、６．６ｍｍｏｌ）の混合物を炭酸カリウム（１．８３ｇ、１３．２ｍｍｏｌ）、続いて臭化ベンジル（１．１８ｍＬ、９．８９ｍｍｏｌ）で処理する。反応混合物を８０℃にて１．５時間加熱する。反応物を室温に冷却し、混合物を濾過する。濾液を減圧下で濃縮し、残渣を、ヘキサン中の０〜３０％ＥｔＯＡｃの勾配で溶出するシリカゲルカラムクロマトグラフィーによって精製して標題化合物１．７ｇ（１００％）を得る。ＭＳ（ｍ／ｚ）：２４２（Ｍ＋１）。

調製例３７
２−［２−（ジベンジルアミノ）エトキシ］−２，２−ジフルオロ−酢酸

ＴＨＦ（１２ｍＬ）中の２−（ジベンジルアミノ）エタノール（１．５ｇ、６．２ｍｍｏｌ）およびナトリウムクロロ−２，２−ジフルオロ−酢酸（９５０ｍｇ、６．１９ｍｍｏｌ）の溶液を、０℃にて水素化ナトリウム（鉱油中に６０ｗｔ％、５００ｍｇ、１２．５ｍｍｏｌ）で処理する。反応混合物を一晩加熱還流する。さらなる水素化ナトリウム（鉱油中に６０ｗｔ％、１２０ｍｇ、３ｍｍｏｌ）を反応混合物に加え、さらに１時間加熱を継続する。反応物を室温に冷却し、水で希釈する。混合物をジエチルエーテルで抽出する。層を分離し、水層を６Ｎの塩酸でｐＨ６に調整する。水溶液をＥｔＯＡｃで抽出する。全ての有機溶液を合わせ、無水硫酸ナトリウムで乾燥させる。混合物を濾過し、濾液を減圧下で濃縮して標題化合物１．０３ｇ（４９％）を得る。ＭＳ（ｍ／ｚ）：３３６（Ｍ＋１）。

調製例３８
メチル２−［２−（ジベンジルアミノ）エトキシ］−２，２−ジフルオロ−アセテート

トルエン（９ｍＬ）およびＭｅＯＨ（２ｍＬ）中の２−［２−（ジベンジルアミノ）エトキシ］−２，２−ジフルオロ−酢酸（１００ｍｇ、０．２９８ｍｍｏｌ）の溶液を、（トリメチルシリル）ジアゾメタン（ヘキサン中に２Ｍ、０．１６ｍＬ、０．３２ｍｍｏｌ）を滴下して処理する。混合物を室温にて１５分間撹拌する。反応物を酢酸（０．１ｍＬ）でクエンチし、反応混合物を減圧下で濃縮して標題化合物１０２ｍｇ（９８％）を得る。ＭＳ（ｍ／ｚ）：３５０（Ｍ＋１）。

調製例３９
４−ベンジル−２，２−ジフルオロ−モルホリン−３−オン

ＥｔＯＨ（１５ｍＬ）中のパラジウム（炭素上１０％、５０ｍｇ、０．１４１ｍｍｏｌ）の懸濁液を、ＥｔＯＨ（１５ｍＬ）中のメチル２−［２−（ジベンジルアミノ）エトキシ］−２，２−ジフルオロ−アセテート（４８５ｍｇ、１．３９ｍｍｏｌ）で処理する。反応混合物を水素雰囲気（バルーン）下で室温にて一晩撹拌する。反応混合物をＣＥＬＩＴＥ（登録商標）で濾過し、濾液を減圧下で濃縮して標題化合物２９４ｍｇ（９３％）を得る。ＭＳ（ｍ／ｚ）：２２８（Ｍ＋１）。

調製例４０
４−ベンジル−２，２−ジフルオロ−モルホリン

ＴＨＦ（１３ｍＬ）中の４−ベンジル−２，２−ジフルオロ−モルホリン−３−オン（２９０ｍｇ、１．２８ｍｍｏｌ）の溶液をボロンジメチルスルフィド錯体（ＴＨＦ中に２Ｍ、３．０６ｍＬ、６．１２ｍｍｏｌ）で処理する。反応混合物を５５℃にて３．５時間加熱し、次いで熱を除去し、撹拌を一晩継続する。反応混合物をさらに２時間５５℃で加熱する。反応混合物を室温に冷却し、塩酸（６Ｎ、３．０６ｍＬ、１８．４ｍｍｏｌ）を滴下して加えることによってクエンチする。反応混合物を１００℃にて１時間加熱する。混合物を室温に冷却し、減圧下で濃縮する。混合物を水で希釈し、２Ｎの水酸化ナトリウムでｐＨを１２に調整する。混合物をＥｔＯＡｃで抽出する。有機抽出物を無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過し、濾液を減圧下で濃縮して標題化合物１２０ｍｇ（４４％）を得る。ＭＳ（ｍ／ｚ）：２１４（Ｍ＋１）。

調製例４１
２−ブロモ−６，６−ジメチル−５−［２−（５−オキサ−８−アザスピロ［２．６］ノナン−８−イル）エチル］チエノ［２，３−ｃ］ピロール−４−オン

ＤＭＦ（３３ｍＬ）中の２−（２−ブロモ−６，６−ジメチル−４−オキソ−チエノ［２，３−ｃ］ピロール−５−イル）エチルメタンスルホネート（２．７６ｇ、６．９ｍｍｏｌ）および５−オキサ−８−アザスピロ［２．６］ノナン（２．１８ｇ、１６．３ｍｍｏｌ）の混合物を８０℃にて一晩加熱する。混合物を室温に冷却し、ＥｔＯＡｃで希釈する。有機溶液を飽和ＮａＣｌ（３×３０ｍＬ）で洗浄する。有機溶液を無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過し、濾液を減圧下で濃縮する。残渣を、逆相カラムクロマトグラフィー（カラム：１００ｇ金Ｃ１８；移動相：Ａ）水中の０．１％ギ酸、Ｂ）ＡＣＮ中の０．１％ギ酸；勾配：５分間５％Ｂ、２０分にわたって５％〜５０％Ｂ；流速：５３ｍＬ／分）によって精製して標題化合物３．６ｇ（８５％）を得る。ＭＳ（ｍ／ｚ）：３９９／４０１（Ｍ＋１／Ｍ＋３）。

調製例４２
ｔｅｒｔ−ブチル４−［［４−［６，６−ジメチル−５−（２−モルホリノエチル）−４−オキソ−チエノ［２，３−ｃ］ピロール−２−イル］−５−メチル−ピリミジン−２−イル］アミノ］−３−メトキシ−ピラゾール−１−カルボキシレート

２−（２−クロロ−５−メチル−ピリミジン−４−イル）−６，６−ジメチル−５−（２−モルホリノエチル）チエノ［２，３−ｃ］ピロール−４−オン（２５０ｍｇ、０．６１ｍｍｏｌ）、ｔｅｒｔ−ブチル４−アミノ−３−メトキシ−ピラゾール−１−カルボキシレート（１５７ｍｇ、０．７４ｍｍｏｌ）、炭酸セシウム（３００ｍｇ、０．９２ｍｍｏｌ）、４，５−ビス（ジフェニルホスフィノ）−９，９−ジメチルキサンテン（７１ｍｇ、０．１２ｍｍｏｌ）および１，４−ジオキサン（６．４ｍＬ）の混合物を１５分間窒素で脱気する。酢酸パラジウム（ＩＩ）（１４ｍｇ、０．０６１４ｍｍｏｌ）を加え、混合物を１１０℃にて一晩加熱する。混合物を室温に冷却し、ＥｔＯＡｃで希釈する。有機溶液を飽和ＮａＣｌで洗浄する。有機溶液を無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過し、濾液を減圧下で濃縮する。残渣をＣ１８カラム（カラム：１５０ｇ；移動相：Ａ）水中の０．１０％ギ酸、Ｂ）ＡＣＮ中の０．１０％ギ酸；勾配：１０〜５０％Ｂ；流速：６０ｍＬ／分）でのＨＰＬＣにより精製して標題化合物１０１ｍｇ（２８％）を得る。ＭＳ（ｍ／ｚ）：５８４（Ｍ＋１）。

以下の化合物を本質的に調製例４２の方法によって調製する。

実施例１
６，６−ジメチル−２−｛２−［（１−メチル−１Ｈ−ピラゾール−５−イル）アミノ］ピリミジン−４−イル｝−５−［２−（モルホリン−４−イル）エチル］−５，６−ジヒドロ−４Ｈ−チエノ［２，３−ｃ］ピロール−４−オン

合成方法１：
２−メチルピラゾール−３−アミン（７５ｇ、７７２ｍｍｏｌ）を、Ｎ−メチルピロリドン（５００ｍＬ）中の水素化ナトリウム（鉱油中に６０ｗｔ％、３０ｇ、７５０ｍｍｏｌ）の懸濁液にゆっくり加える。得られた混合物を９０分間撹拌する。Ｎ−メチルピロリドン（２００ｍＬ）中の２−（２−クロロピリミジン−４−イル）−６，６−ジメチル−５−（２−モルホリノエチル）チエノ［２，３−ｃ］ピロール−４−オン（１４５ｇ、３６９ｍｍｏｌ）の溶液を加える。発熱反応物を室温に冷却し、反応物を水（３Ｌ）に注ぐ。濃塩酸（２００ｍＬ）でｐＨを約３に調整する。混合物をＤＣＭ（４×２Ｌ）で抽出する。５Ｍの水酸化ナトリウムを使用して水層を中和する。この水溶液をＤＣＭ（２×２Ｌ）で抽出する。これらの有機抽出物を合わせ、水（２Ｌ）で洗浄する。有機物を無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過し、濾液を減圧下で濃縮する。残渣を、ＤＣＭ（２Ｌ）、ＤＣＭ（２Ｌ）中の２．５％ＥｔＯＨ、ＤＣＭ（２Ｌ）中の５％ＥｔＯＨ、ＤＣＭ（２Ｌ）中の７．５％ＥｔＯＨおよび最後にＤＣＭ（１０Ｌ）中の１０％ＥｔＯＨで連続的に溶出するシリカゲルプラグ（２ｋｇ）で精製する。適切な画分を減圧下で濃縮する。ＥｔＯＡｃ（１Ｌ）を加え、減圧下で濃縮する。ＥｔＯＡｃ（１Ｌ）を加え、減圧下で濃縮する。ＥｔＯＡｃ（５００ｍＬ）およびヘキサン（５００ｍＬ）を加える。固体を真空濾過により回収し、固体をヘキサン（５００ｍＬ）で洗浄する。固体を５０℃にて真空下で乾燥させて、標題化合物６５．７ｇ（３９％）を得る。ＭＳ（ｍ／ｚ）：４５４（Ｍ＋１）。

合成方法２：
２−（２−クロロピリミジン−４−イル）−６，６−ジメチル−５−（２−モルホリノエチル）チエノ［２，３−ｃ］ピロール−４−オン（２０．８ｇ、５２．９ｍｍｏｌ）、２−メチルピラゾール−３−アミン（５．７ｇ、５８．２ｍｍｏｌ）、炭酸セシウム（３７．９ｇ、１１６．５ｍｍｏｌ）、４，５−ビス（ジフェニルホスフィノ）−９，９−ジメチルキサンテン（２．６ｇ、４．５ｍｍｏｌ）および１，４−ジオキサン（５２９ｍＬ）の混合物を窒素で１０分間脱気する。トリス（ジベンジリデンアセトン）ジパラジウム（０）（２．４ｇ、２．６ｍｍｏｌ）を加え、混合物を８５℃で４時間加熱する。混合物を室温に冷却し、混合物を濾紙で濾過する。濾液を減圧下で濃縮する。８ｇの２−（２−クロロピリミジン−４−イル）−６，６−ジメチル−５−（２−モルホリノエチル）チエノ［２，３−ｃ］ピロール−４−オンで出発する反応を繰り返し、２つの残渣を合わせる。残渣を、（ＤＣＭ中の１０％ＥｔＯＡｃ）中の５〜２５％ＭｅＯＨの勾配で溶出するシリカゲルカラムクロマトグラフィー（３３０ｇ）により精製する。画分をプールし、減圧下で濃縮する。残渣を、ＤＣＭ中の１０％ＥｔＯＡｃ中の５〜２５％ＭｅＯＨの勾配で溶出するシリカゲルカラムクロマトグラフィー（３３０ｇ）により再精製する。画分をプールし、減圧下で濃縮する。残渣をＤＣＭ（４００ｍＬ）に溶解し、次いでアセトン（１Ｌ）を加える。混合物を減圧下で約７００ｍＬまでゆっくり濃縮する。固体を真空濾過により回収して標題化合物１４．８ｇ（４８％）を得る。ＭＳ（ｍ／ｚ）：４５４（Ｍ＋１）。

合成方法３：
２−（２−クロロピリミジン−４−イル）−６，６−ジメチル−５−（２−モルホリノエチル）チエノ［２，３−ｃ］ピロール−４−オン（２５０ｍｇ、０．６４ｍｍｏｌ）、２−メチルピラゾール−３−アミン（１２４ｍｇ、１．３ｍｍｏｌ）、炭酸セシウム（６２２ｍｇ、１．９ｍｍｏｌ）、４，５−ビス（ジフェニルホスフィノ）−９，９−ジメチルキサンテン（５５ｍｇ、０．０９５ｍｍｏｌ）および１，４−ジオキサン（６．４ｍＬ）の混合物を窒素で１５分間脱気する。酢酸パラジウム（ＩＩ）（１４．３ｍｇ、０．０６３６ｍｍｏｌ）を加え、混合物を９０℃にて一晩加熱する。混合物を室温に冷却し、混合物を濾紙で濾過する。固体をＤＣＭ中の１０％ＭｅＯＨで洗浄する。濾液を減圧下で濃縮する。反応を繰り返し、２つの残渣を合わせる。残渣を、水中の１０ｍＭ炭酸アンモニウム（ｐＨ１０）中の９〜２８％ＡＣＮの８５ｍＬ／分の勾配で溶出するＣ１８カラム（３０×７５ｍｍ、５ｕｍ、ｘｂｒｉｄｇｅ ＯＤＢ）でのＨＰＬＣによって精製する。画分をプールし、減圧下で濃縮してＡＣＮを除去する。水溶液を凍結乾燥して標題化合物１００ｍｇ（１８％）を得る。ＭＳ（ｍ／ｚ）：４５４（Ｍ＋１）。

以下の化合物を本質的に実施例１の合成方法３によって調製する。

実施例２０
４−［（４−｛６，６−ジメチル−５−［２−（モルホリン−４−イル）エチル］−４−オキソ−５，６−ジヒドロ−４Ｈ−チエノ［２，３−ｃ］ピロール−２−イル｝ピリミジン−２−イル）アミノ］−１Ｈ−ピラゾール−５−カルボニトリル

２−（２−クロロピリミジン−４−イル）−６，６−ジメチル−５−（２−モルホリノエチル）チエノ［２，３−ｃ］ピロール−４−オン（３５０ｍｇ、０．８９ｍｍｏｌ）、４−アミノ−１Ｈ−ピラゾール−５−カルボニトリル（１１６ｍｇ、１．０７ｍｍｏｌ）、炭酸カリウム（３２０ｍｇ、２．３２ｍｍｏｌ）、２−（ジ−ｔｅｒｔ−ブチルホスフィノ）−２’，４’６’−トリイソプロピル−３，６−ジメトキシ−１，１’−ビフェニル（８７ｍｇ、０．１８ｍｍｏｌ）、ｔｅｒｔ−ブチルアルコール（２．３ｍＬ）および酢酸（１滴）の溶液を９０℃にて２時間加熱する。混合物を室温に冷却する。混合物をＤＣＭ中の１０％ＭｅＯＨで希釈し、溶液を上部に少量のシリカゲルを含むＣＥＬＩＴＥ（登録商標）カラムで濾過する。カラムをＤＣＭ中の１０％ＭｅＯＨで洗浄し、濾液を減圧下で濃縮する。残渣を逆相カラムクロマトグラフィー（カラム：Ｃ１８、２７５ｇの金；移動相：Ａ）５％ＭｅＯＨを含む水中の１０ｍＭ重炭酸アンモニウム、Ｂ）ＡＣＮ；勾配：５分間１０％Ｂ、２５分にわたって４０％Ｂの勾配；流速：１２５ｍＬ／分）によって精製して標題化合物２４０ｍｇ（５８％）を得る。ＭＳ（ｍ／ｚ）：４６５（Ｍ＋１）。

以下の化合物を本質的に実施例２０の方法によって調製する。

実施例２２
６，６−ジメチル−２−｛２−［（５−メチル−１Ｈ−ピラゾール−４−イル）アミノ］ピリミジン−４−イル｝−５−［２−（モルホリン−４−イル）エチル］−５，６−ジヒドロ−４Ｈ−チエノ［２，３−ｃ］ピロール−４−オン

２−（２−クロロピリミジン−４−イル）−６，６−ジメチル−５−（２−モルホリノエチル）チエノ［２，３−ｃ］ピロール−４−オン（２３０ｍｇ、０．５９ｍｍｏｌ）、３−メチル−１Ｈ−ピラゾール−４−アミン（１４２ｍｇ、０．７３ｍｍｏｌ）、クロロ［２−（ジ−ｔｅｒｔ−ブチルホスフィノ）−２’，４’，６’−トリイソプロピル−１，１’−ビフェニル］［２−（２−アミノエチル）フェニル］パラジウム（ＩＩ）（８ｍｇ、０．０１２ｍｍｏｌ）、２−ジ−ｔｅｒｔ−ブチルホスフィノ−２’，４’，６’−トリイソプロピルビフェニル（５ｍｇ、０．０１２ｍｍｏｌ）およびナトリウムｔｅｒｔ−ブトキシド（１１８ｍｇ、１．２ｍｍｏｌ）の混合物を窒素で３回パージする。ｔｅｒｔ−ブチルアルコール（２ｍＬ）を加え、反応物を密閉し、混合物を室温にて１．５時間撹拌する。反応混合物をＥｔＯＡｃで処理し、混合物を一晩撹拌する。減圧下で濃縮する。残渣をＥｔＯＡｃに溶解し、有機溶液を飽和塩化アンモニウム水溶液で洗浄する。水層をＥｔＯＡｃで２回逆抽出する。合わせた有機抽出物を無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過し、濾液を減圧下で濃縮する。残渣を、ＤＣＭ中の０〜１０％ＭｅＯＨの勾配で溶出するシリカゲルカラムクロマトグラフィーによって精製して標題化合物１６４ｍｇ（６２％）を得る。ＭＳ（ｍ／ｚ）：４５４（Ｍ＋１）。

以下の化合物を本質的に実施例２２の方法によって調製する。

実施例２５
６，６−ジメチル−２−｛２−［（１−メチル−１Ｈ−ピラゾール−５−イル）アミノ］ピリミジン−４−イル｝−５−［２−（チオモルホリン−４−イル）エチル］−５，６−ジヒドロ−４Ｈ−チエノ［２，３−ｃ］ピロール−４−オン

ＡＣＮ（２ｍＬ）中の２−［６，６−ジメチル−２−［２−［（２−メチルピラゾール−３−イル）アミノ］ピリミジン−４−イル］−４−オキソ−チエノ［２，３−ｃ］ピロール−５−イル］エチルメタンスルホネート（２６０ｍｇ、０．５６ｍｍｏｌ）、チオモルホリン（１１６ｍｇ、１．１２ｍｍｏｌ）およびトリエチルアミン（０．１８ｍＬ、０．３８ｍｍｏｌ）の混合物を６０℃にて一晩加熱する。混合物を室温に冷却し、溶液をＣＥＬＩＴＥ（登録商標）で濾過する。固体をＤＣＭ中の１０％ＭｅＯＨで洗浄し、濾液を減圧下で濃縮する。残渣を、逆相カラムクロマトグラフィー（カラム：Ｃ１８、２７５ｇの金；移動相：Ａ）水中の５％ＭｅＯＨ中の１０ｍＭアンモニア、Ｂ）ＡＣＮ；勾配：５分間１０％Ｂ、２５分にわたって１０〜６５％Ｂの勾配；流速：２００ｍＬ／分）によって精製して標題化合物１７０ｍｇ（６４％）を得る。ＭＳ（ｍ／ｚ）：４７０（Ｍ＋１）。

以下の化合物を本質的に実施例２５の方法によって調製する。

実施例３２
５−［２−（２，２−ジフルオロモルホリン−４−イル）エチル］−６，６−ジメチル−２−｛２−［（１−メチル−１Ｈ−ピラゾール−５−イル）アミノ］ピリミジン−４−イル｝−５，６−ジヒドロ−４Ｈ−チエノ［２，３−ｃ］ピロール−４−オン

ＥｔＯＡｃ（５ｍＬ）中の水酸化パラジウム（炭素上２０％、６３ｍｇ、０．０９ｍｍｏｌ）の懸濁液をＥｔＯＡｃ（５ｍＬ）中の４−ベンジル−２，２−ジフルオロ−モルホリン（９５ｍｇ、０．４５ｍｍｏｌ）で処理する。反応混合物を水素雰囲気（バルーン）下で室温にて５時間撹拌する。反応混合物をＣＥＬＩＴＥ（登録商標）で濾過し、濾液を単離する。濾液に、トリエチルアミン（０．１１ｍＬ、０．７９ｍｍｏｌ）および２−［６，６−ジメチル−２−［２−［（２−メチルピラゾール−３−イル）アミノ］ピリミジン−４−イル］−４−オキソ−チエノ［２，３−ｃ］ピロール−５−イル］エチルメタンスルホネート（３０６ｍｇ、０．６６ｍｍｏｌ）を加える。混合物を８０℃にて１時間加熱する。ＡＣＮ（１５ｍＬ）を加え、混合物を８０℃にて２日間加熱する。反応混合物を室温に冷却し、減圧下で濃縮する。残渣を、ＥｔＯＡｃ中の０〜１０％ＭｅＯＨの勾配で溶出するシリカゲルカラムクロマトグラフィーによって精製する。画分を減圧下で濃縮する。残渣を、ヘキサン中の５０〜１００％ＥｔＯＡｃの勾配、続いてＥｔＯＡｃ中の０〜１０％ＭｅＯＨの第２の勾配で溶出するシリカゲルカラムクロマトグラフィーによって再精製して標題化合物４７ｍｇ（３０％）を得る。ＭＳ（ｍ／ｚ）：４９０（Ｍ＋１）。

実施例３３
５−［２−（６，６−ジフルオロ−１，４−オキサゼパン−４−イル）エチル］−６，６−ジメチル−２−｛２−［（１−メチル−１Ｈ−ピラゾール−５−イル）アミノ］ピリミジン−４−イル｝−５，６−ジヒドロ−４Ｈ−チエノ［２，３−ｃ］ピロール−４−オン

６，６−ジフルオロ−１，４−オキサゼパン塩酸塩（２００ｍｇ、０．１５ｍｍｏｌ）をＤＣＭ（５ｍＬ）中の炭酸塩樹脂（３モル当量）で処理する。樹脂懸濁液を１時間回転させる。濾過により固体を除去し、濾液をｐ−トルエンスルホン酸（２５０ｍｇ、１．４５ｍｍｏｌ）で処理する。得られた混合物を２時間撹拌し、次いで混合物を減圧下で濃縮する。ＡＣＮ（２ｍＬ）および２−［６，６−ジメチル−２−［２−［（２−メチルピラゾール−３−イル）アミノ］ピリミジン−４−イル］−４−オキソ−チエノ［２，３−ｃ］ピロール−５−イル］エチルメタンスルホネート（２００ｍｇ、０．４３ｍｍｏｌ）を加える。得られた溶液をトリエチルアミン（０．１５ｍＬ、１．０８ｍｍｏｌ）で処理する。反応容器を密封し、混合物を８０℃にて３時間加熱する。室温に冷却し、反応混合物を濃縮する。残渣を逆相カラムクロマトグラフィー（カラム：５０ｇのＣ−１８；移動相：Ａ）水中の０．１％ＴＦＡ、Ｂ）ＡＣＮ中の０．１％ＴＦＡ；勾配１０〜８０％Ｂ）によって精製する。生成物を含有する画分を濃縮する。残渣をＤＣＭに溶解し、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液で洗浄する。有機溶液を無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過し、濾液を減圧下で濃縮する。残渣を逆相カラムクロマトグラフィー（カラム：１５ｇの金Ｃ−１８；移動相：Ａ）１０％ＭｅＯＨを含む水中の１０ｍＭ炭酸アンモニウム、Ｂ）ＡＣＮ；勾配１０〜８０％Ｂ）により精製して、標題化合物１６ｍｇ（７％）を得る。ＭＳ（ｍ／ｚ）：５０４（Ｍ＋１）。

実施例３４
５−｛２−［シクロプロピル（メチル）アミノ］エチル｝−６，６−ジメチル−２−｛２−［（１−メチル−１Ｈ−ピラゾール−５−イル）アミノ］ピリミジン−４−イル｝−５，６−ジヒドロ−４Ｈ−チエノ［２，３−ｃ］ピロール−４−オン

ＤＭＦ（１．７ｍＬ）中の２−［６，６−ジメチル−２−［２−［（２−メチルピラゾール−３−イル）アミノ］ピリミジン−４−イル］−４−オキソ−チエノ［２，３−ｃ］ピロール−５−イル］エチルメタンスルホネート（７０ｍｇ、０．１６ｍｍｏｌ）およびＮ−メチルシクロプロパンアミン（７７ｍｇ、１．０８ｍｍｏｌ）の溶液を９０℃にて一晩加熱する。混合物を室温に冷却する。溶液を逆相カラムクロマトグラフィー（カラム：１００ｇの金Ｃ−１８；移動相：Ａ）水中の０．１％ギ酸、Ｂ）０．１％ギ酸 ＡＣＮ；勾配：５分間５％Ｂ、２５分にわたって６５％Ｂの勾配；流速：６０ｍＬ／分）によって精製して標題化合物７０ｍｇ（３７％）を得る。ＭＳ（ｍ／ｚ）：４３８（Ｍ＋１）。

以下の化合物を本質的に実施例３４の方法によって調製する。

実施例３６
２−｛２−［（３−メトキシ−１Ｈ−ピラゾール−４−イル）アミノ］−５−メチルピリミジン−４−イル｝−６，６−ジメチル−５−［２−（モルホリン−４−イル）エチル］−５，６−ジヒドロ−４Ｈ−チエノ［２，３−ｃ］ピロール−４−オン塩酸塩

ＭｅＯＨ（２０ｍＬ）中のｔｅｒｔ−ブチル４−［［４−［６，６−ジメチル−５−（２−モルホリノエチル）−４−オキソ−チエノ［２，３−ｃ］ピロール−２−イル］−５−メチル−ピリミジン−２−イル］アミノ］−３−メトキシ−ピラゾール−１−カルボキシレート（１０１ｍｇ、０．１７３ｍｍｏｌ）および塩化水素（１，４−ジオキサン中に４．０Ｍ、２ｍＬ、８ｍｍｏｌ）の溶液を室温にて１２時間撹拌する。混合物を濃縮乾固して標題化合物８０ｍｇ（８９％）を得る。ＭＳ（ｍ／ｚ）：４８４（Ｍ＋１）。

以下の化合物を本質的に実施例３６の方法によって調製する。

実施例４０
６，６−ジメチル−２−｛２−［（１−メチル−１Ｈ−ピラゾール−５−イル）アミノ］ピリミジン−４−イル｝−５−｛２−［２−オキサ−５−アザビシクロ［４．１．０］ヘプタ−５−イル］エチル｝−５，６−ジヒドロ−４Ｈ−チエノ［２，３−ｃ］ピロール−４−オン、異性体２

６，６−ジメチル−２−｛２−［（１−メチル−１Ｈ−ピラゾール−５−イル）アミノ］ピリミジン−４−イル｝−５−［２−（２−オキサ−５−アザビシクロ［４．１．０］ヘプタ−５−イル）エチル］−５，６−ジヒドロ−４Ｈ−チエノ［２，３−ｃ］ピロール−４−オン（実施例３０）を、キラルカラムクロマトグラフィー（カラム：Ｌｕｘ Ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ−４ ２１．２×２５０ｍｍ；移動相：４０％イソプロピルアルコール（０．２％イソプロピルアミン）／ＣＯ_２）；溶出時間：１１分）によって精製して標題化合物２４ｍｇ（３４％）を得る。ＭＳ（ｍ／ｚ）：４６６（Ｍ＋１）。

Ｘ線粉末回折
結晶性固体のＸＲＤパターンを、３５ｋＶおよび５０ｍＡで作動する、ＣｕＫａ源（λ＝１．５４０６０Å）およびＶａｎｔｅｃ検出器を備えたＢｒｕｋｅｒ Ｄ４ ＥｎｄｅａｖｏｒＸ線粉末回折装置上で得る。試料を、２θでの４〜４０°で、２θでのステップサイズ０．００９°および走査速度０．５秒／ステップを用い、ならびに０．６ｍｍの発散、５．２８ｍｍの固定抗散乱、および９．５ｍｍの検出器スリットを用いて走査する。乾燥粉末を石英試料ホルダに詰めて、滑面をスライドガラスを使用して得る。結晶形回折パターンを周囲温度および相対湿度で得る。結晶学技術分野において周知なのは、任意の所与の結晶形に関して、回折ピークの相対強度が、結晶形態および晶癖などの因子から生じる優先配向に起因して異なる可能性があることである。優先配向の効果が存在する場所では、ピーク強度が変化するが、多形体の特徴的ピーク位置は変化しない。さらに、任意の所与の結晶形に関して、ピーク角度位置が若干変化する場合があるということも結晶学技術分野では周知である。例えば、試料を解析する温度もしくは湿度の変動、試料変位、または内部標準の存在もしくは非存在に起因して、ピーク位置はシフト可能である。この場合、２θでの±０．２のピーク位置変動は、示される結晶形の明白な同定を妨げることなく、これらの潜在的変動を考慮にいれることにする。結晶形の確認は、区別可能なピーク（°２θ単位での）、典型的にはより顕著なピークの任意の特有の組み合わせに基づいてなされ得る。周囲温度および相対湿度で得られる結晶形回折パターンを、８．８５３および２６．７７４°２θでのＮＩＳＴ６７５標準ピークに基づいて調整する。

実施例１、結晶形１のＸ線粉末回折
６，６−ジメチル−２−｛２−［（１−メチル−１Ｈ−ピラゾール−５−イル）アミノ］ピリミジン−４−イル｝−５−［２−（モルホリン−４−イル）エチル］−５，６−ジヒドロ−４Ｈ−チエノ［２，３−ｃ］ピロール−４−オン（結晶形１）
６，６−ジメチル−２−｛２−［（１−メチル−１Ｈ−ピラゾール−５イル）アミノ］ピリミジン−４−イル｝−５−［２−（モルホリン−４−イル）エチル］−５，６−ジヒドロ−４Ｈ−チエノ［２，３−ｃ］ピロール−４−オン（１０３ｍｇ）をＡＣＮ（１ｍＬ）および水（１ｍＬ）の溶液に加え、混合物を７０℃にて１０分間加熱する。溶液を濾過し、一晩室温に冷却する。水（２ｍＬ）を５時間にわたって溶液にゆっくり加える。固体を真空濾過により回収し、水で洗浄する。固体を空気乾燥させて標題化合物９４ｍｇ（９２％）を得る。

実施例１の結晶形１の調製した試料を、ＣｕＫａ放射線を使用してＸＲＤパターンによって、以下の表１に記載される回折ピーク（２θ値）を有し、特に、０．２°の回折角に対する許容誤差で、１５．５、１７．１、１８．０、２０．２、２１．５および２２．１°からなる群から選択されるピークの１つ以上と共に１９．３°でのピークを有すると特徴付ける。

いくつかの系統の証拠により、腫瘍発生、成長および進行に関与するプロセスが、癌細胞における１つ以上のシグナル伝達経路の活性化によって媒介されることが示される。マイトジェン活性化プロテインキナーゼ（ＭＡＰＫ）経路は細胞増殖および生存の重要な調節因子である。ＥＲＫはこの経路の下流メンバーであり、ＥＧＦＲ、ＦＧＦＲ、ＰＤＧＦＲ、ＶＥＧＦＲなどの活性化受容体チロシンキナーゼ（ＲＴＫ）からの細胞外シグナルの伝達において中心的役割を果たす。この経路は、ＲＡＦ、ＭＥＫおよびＥＲＫ（細胞外シグナル調節キナーゼ）キナーゼからなる３つの段階的キナーゼカスケードであり、この経路の活性化はＲＡＳ、低分子ＧＴＰａｓｅの活性化により開始する。ＲＡＳの活性化により、ＲＡＦの動員、セリン／トレオニンキナーゼおよびその活性化が生じる。次いで活性化したＲＡＦはリン酸化し、ＭＲＫ１／２を活性化し、それは次にリン酸化し、ＥＲＫ１／２を活性化する。活性化すると、ＥＲＫ１／２は、細胞増殖、成長、生存およびＥＭＴ（上皮から間葉の変化）に関与するいくつかの下流の細胞質および核標的物をリン酸化する。

ＲＡＳ／ＭＡＰＫ経路は細胞増殖についての最も重要な経路の１つであり、この経路は全てのヒト癌の約３０％において頻繁に活性化されると考えられる。構成的ＭＡＰＫ経路活性化は、ＲＡＳ、ＢＲＡＦ、ＭＥＫ１における変異の活性化、腫瘍抑制因子ＮＦ１の損失または変異によって媒介される上流活性化、ＲＴＫの増幅またはリガンド媒介活性化に起因し得る。３つ全てのＲＡＳファミリー遺伝子（ＫＲＡＳ、ＮＲＡＳおよびＨＲＡＳ）は、最も一般的にはコドン１２、１３および６１における一点変異の結果として、大腸癌、黒色腫、肺癌および膵癌を含む、いくつかの癌において体細胞変異することが示されている。これらの変異は、増加したＥＲＫ１／２活性および成長シグナル伝達を伴うＲＡＳの構成的活性化を引き起こす。ＫＲＡＳのコドン１２、１３および６１における変異は、ＥＧＦＲを阻害する化合物およびモノクローナル抗体に耐性を与える。ＫＲＡＳ変異は、肺癌の３０％、膵癌の９０％、胃癌の１０％および大腸癌の５０％において見出される。ＮＲＡＳ変異は黒色腫の約１０〜２５％において検出された。さらに、ＲＡＳ変異（ＨＲＡＳ、ＫＲＡＳおよびＮＲＡＳ）は甲状腺癌の約５５〜６０％において識別されている。ＢＲＡＦにおける体細胞点突然変異は、ヒト腫瘍の約８％、最も頻繁には黒色腫（６０％）、大腸癌（１０％）および甲状腺癌（５０％）において発生する。黒色腫において、全てのＢＲＡＦ変異はキナーゼドメイン内であるように見え、単一置換（Ｔ→Ａ、Ｖ６００Ｅ）は変異の８０％を占める。ＢＲＡＦ変異は、まれな例外として、ＲＡＳ変異との相互排他的パターンにおいて見出され、これらの遺伝子変化は共通の下流エフェクターを活性化することが示唆される。

生物学的アッセイ
以下のアッセイは、本発明の例示的な化合物がＥＲＫ１およびＥＲＫ２キナーゼ活性の阻害剤であることを実証している。以下のアッセイの結果はまた、本発明の例示的な化合物が癌細胞におけるＥＲＫシグナル伝達を阻害することを実証している。さらに、実施例１の化合物は、癌の特定の異種移植腫瘍モデルにおけるＥＲＫ経路標的阻害を実証している。さらに、実施例１の化合物は癌の特定の異種移植腫瘍モデルにおける腫瘍成長を阻害する。

ＥＲＫ１キナーゼアッセイ
このアッセイの目的は、ＥＲＫ１キナーゼ活性を阻害する化合物の能力を測定することである。ＴＲ−ＦＲＥＴアッセイを使用してインビトロでＥＲＫ１キナーゼアッセイを実施する。３８４ウェルＰＲＯＸＩＰＬＡＴＥ（商標）（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ、＃ＧＲＮ６２６０）において、５μＬのＥＲＫ１酵素（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、＃ＰＲ５２５４Ｂ、最終濃度１００ｎｇ／ｍＬ）と基質ＧＦＰ−ＡＴＦ２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、＃ＰＶ４４４５、最終濃度０．２μＭ）、キナーゼ緩衝液（５０ｍＭのＨｅｐｅｓ ｐＨ７．４、５ｍＭのＭｇＣｌ_２、０．１ｍＭのＥＧＴＡ、０．０１％のＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、１ｍＭのＤＴＴ）中で調製した５μＬのＡＴＰ溶液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、＃ＰＶ３２２７、最終濃度１０μＭ）およびＤＭＳＯ溶液中の２．５μＬの試験化合物（最終４％、ｖ／ｖ）を加えることによって反応（１２．５μＬ）を開始する。反応混合物を室温にて６０分間インキュベートする。ＴＲ−ＦＲＥＴ希釈緩衝液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、＃ＰＶ３５７４）中の１２．５μＬの停止緩衝液（１０ｍＭのＥＤＴＡ、２ｎＭのＴｂ−抗ｐＡＴＦ２（ｐＴｈｒ７１）抗体、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、＃ＰＶ４４４８）を加えることによって反応を停止させる。プレートを室温にてさらに６０分間インキュベートし、励起波長３４０ｎｍにてＥＮＶＩＳＩＯＮ（登録商標）（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）プレートリーダーで読み取る。ＧＦＰアクセプター放出シグナル（５２０ｎｍにて）をＴｂドナー放出シグナル（４９５ｎｍにて）で割ることによってＴＲ−ＦＲＥＴ比を算出する。オンプレートＭａｘ（ＤＭＳＯ対照）およびＭｉｎ（酵素添加なし）対照ウェルＴＲ−ＦＲＥＴ比データに対して化合物処理したウェルを使用して阻害パーセントを算出する｛阻害％＝１００−［（試験化合物−中央値Ｍｉｎ）／（中央値Ｍａｘ−中央値Ｍｉｎ）×１００］｝。１：３の希釈スキームを使用して１０の濃度（２０μＭ〜０．００１μＭ）にて全ての化合物を試験する。ＡＣＴＩＶＩＴＹＢＡＳＥ（登録商標）７．３（ＩＤ Ｂｕｓｉｎｅｓｓ Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ Ｌｉｍｉｔｅｄ）を使用して阻害パーセントおよび１０点濃度データを４−パラメーター非線形ロジスティック式（式２０５）に適合することによってＡｂｓ＿ＩＣ_５０値を導く。

本発明の範囲内の例示した化合物を実質的に上記のようにこのアッセイにおいて試験する。このアッセイの結果は、例示した化合物の全てが、０．１５μＭ未満のＩＣ_５０値でＥＲＫ１キナーゼ活性を阻害することを実証している。例えば、実施例１の化合物は４．８６ｎＭ（±０．２０、ｎ＝７）のＩＣ_５０値を有する。

ＥＲＫ２キナーゼアッセイ
このアッセイの目的は、ＥＲＫ２キナーゼ活性を阻害する化合物の能力を測定することである。ＴＲ−ＦＲＥＴアッセイを使用してインビトロでＥＲＫ２キナーゼアッセイを実施する。３８４ウェルＰＲＯＸＩＰＬＡＴＥ（商標）（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ、＃ＧＲＮ６２６０）において、５μＬのＥＲＫ２酵素（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、＃ＰＶ３５９５Ｂ、最終濃度５０ｎｇ／ｍＬ）と基質ＧＦＰ−ＡＴＦ２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、＃ＰＶ４４４５、最終濃度０．２μＭ）、キナーゼ緩衝液（５０ｍＭのＨｅｐｅｓ ｐＨ７．４、５ｍＭのＭｇＣｌ_２、０．１ｍＭのＥＧＴＡ、０．０１％のＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、１ｍＭのＤＴＴ）中で調製した５μＬのＡＴＰ溶液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、＃ＰＶ３２２７、最終濃度１０μＭ）およびＤＭＳＯ溶液中の２．５μＬの試験化合物（最終４％、ｖ／ｖ）を加えることによって全ての反応（１２．５μＬ）を開始する。反応物を室温にて６０分間インキュベートする。ＴＲ−ＦＲＥＴ希釈緩衝液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、＃ＰＶ３５７４）中の１２．５μＬの停止緩衝液（１０ｍＭのＥＤＴＡ、２ｎＭのＴｂ−抗ｐＡＴＦ２（ｐＴｈｒ７１）抗体、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、＃ＰＶ４４４８）を加えることによって反応を停止させる。プレートを室温にてさらに６０分間インキュベートし、励起波長３４０ｎｍにてＥＮＶＩＳＩＯＮ（登録商標）（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）プレートリーダーで読み取る。ＧＦＰアクセプター放出シグナル（５２０ｎｍにて）をＴｂドナー放出シグナル（４９５ｎｍにて）で割ることによってＴＲ−ＦＲＥＴ比を算出する。オンプレートＭａｘ（ＤＭＳＯ対照）およびＭｉｎ（酵素添加なし）対照ウェルＴＲ−ＦＲＥＴ比データに対して化合物ウェルを使用して阻害パーセントを算出する｛阻害％＝１００−［（試験化合物−中央値Ｍｉｎ）／（中央値Ｍａｘ−中央値Ｍｉｎ）×１００］｝。１：３希釈スキームを使用して１０の濃度（２０μＭ〜０．００１μＭ）で全ての化合物を試験する。ＡＣＴＩＶＩＴＹＢＡＳＥ７．３（ＩＤ Ｂｕｓｉｎｅｓｓ Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ Ｌｉｍｉｔｅｄ）を使用して阻害パーセントおよび１０点濃度データを４−パラメーター非線形ロジスティック式（式２０５）に適合することによってＡｂｓ＿ＩＣ_５０値を導く。

本発明の範囲内の例示した化合物を実質的に上記のようにこのアッセイにおいて試験する。このアッセイの結果は、例示した化合物の全てが、０．１５μＭ未満のＩＣ_５０値でＥＲＫ２キナーゼ活性を阻害することを実証している。例えば、実施例１の化合物は５．２４ｎＭ（±０．２４、ｎ＝７）のＩＣ_５０値を有する。

ＥＲＫ１／２細胞機構アッセイ（ｐＲＳＫ１アルファスクリーンアッセイ）
このアッセイの目的は、インビトロで癌細胞におけるＥＲＫシグナル伝達を阻害する化合物の能力を測定することである。ＨＣＴ１１６大腸癌細胞株（ＡＴＣＣ、＃ＣＣＬ−２４７）を使用してｐＲＳＫ１アルファスクリーンアッセイを実施する。Ｔ−１５０フラスコ内で５％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）（Ｇｉｂｃｏ、＃１６０００−０４４）を含有するダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）（Ｈｙｃｌｏｎｅ、＃ＳＨ３００２２）成長培地中でＨＣＴ１１６細胞を慣用的に培養し、３７℃にて５％ＣＯ_２インキュベーター内でインキュベートする。細胞がコンフルエントになると細胞を採取し、「アッセイの準備ができた凍結細胞」として１×１０ｅ^７細胞／ｍＬにて凍結培地中で凍結させ、液体窒素中で保存する。アッセイを実施するために、９６ウェル組織培養プレートに４０，０００ＨＣＴ１１６細胞／ウェルを播種し、５％ＣＯ_２インキュベーター内で３７℃にて一晩インキュベートする。２０μＭの最も高い濃度で開始して１０の濃度で化合物を試験し、０．５％（ｖ／ｖ）の最終ＤＭＳＯ濃度で１：３希釈スキーム（２０μＭ〜０．００１μＭ）を利用する。２０μＬの無血清成長培地中に化合物を加え、３７℃にて２時間インキュベートする。成長培地を取り除き、１×ｈｏｌｔプロテアーゼおよびリン酸塩阻害剤カクテル［Ｔｈｅｒｍｏ、＃７８４４１］を含有する５０μＬの１×溶解緩衝液［Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、＃９８０３］を各ウェルに加え、振盪器で室温にて１０分間インキュベートする。各ウェルからの４μＬの細胞溶解物を３８４ウェルアッセイプレート［Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ、＃６００６２８０］におけるそれぞれのウェルに移し、５μＬの反応混合物［２０００部の１×アッセイ緩衝液（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ、＃Ａ１０００）、１部のビオチン−ＲＳＫ１抗体（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ、＃ｓｃ−２３１−Ｂ−Ｇ）、４部のｐＲＳＫ１抗体（Ａｂｃａｍ、＃ａｂ３２４１３）、３５部のアクセプタービーズ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ、＃６７６０６１７Ｒ）］を加える。プレートをホイルプレートシール（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ、＃５３８６１９）で密閉し、室温にて２時間インキュベートする。２μＬのドナービーズ［２０部の１×アッセイ緩衝液、１部のドナービーズ］を各ウェルに加え、プレートを透明なプレートシール（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、＃４３１１９７１）で密閉し、暗所で室温にて２時間インキュベートする。ＥＮＶＩＳＩＯＮ（登録商標）（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）プレートリーダーでプレートを読み取ることによって各ウェルにおける蛍光強度を測定する。ＡＣＴＩＶＩＴＹＢＡＳＥ（登録商標）７．３（ＩＤ Ｂｕｓｉｎｅｓｓ Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ Ｌｉｍｉｔｅｄ）を使用してｐＲＳＫ１阻害パーセント［阻害％＝１００−［（試験化合物−中央値Ｍｉｎ）／（中央値Ｍａｘ−中央値Ｍｉｎ）×１００］および１０点濃度データを４−パラメーター非線形ロジスティック式（Ａｂａｓｅ式２０５）に適合することによってＲｅｌ ＩＣ_５０値を導く。

本発明の範囲内の例示した化合物を実質的に上記のようにこのアッセイにおいて試験する。このアッセイの結果は、例示した化合物の全てが、腫瘍細胞において３μＭ未満のＩＣ_５０値でＥＲＫ基質（ＲＳＫ）リン酸化を阻害することを実証している。例えば、実施例１の化合物は０．４２９μＭ（±０．１７３、ｎ＝８）のＩＣ_５０値を有する。

インビボでの標的阻害（ＩＶＴＩ）アッセイ（ｐＲＳＫ１ ＥＬＩＳＡアッセイ）
このアッセイの目的は、動物モデルにおけるＥＲＫ１／２基質リン酸化を阻害する試験化合物の能力を測定することである。Ｈａｒｌａｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓからのメスの無胸腺ヌードマウス（２２〜２５ｇ）に、２００μＬの１：１のハンクス平衡塩溶液（ＨＢＳＳ）＋マトリゲル溶液中の５×１０ｅ^６のＨＣＴ１１６大腸癌細胞（ＡＴＣＣ、＃ＣＣＬ−２４７）を右脇腹領域の皮下に移植する。移植の７日後に開始して１週間に２回、腫瘍成長および体重を測定する。腫瘍サイズが３００〜５００ｍｍ^３に到達したとき、動物を無作為化し、５匹の動物の群に分類する。化合物特異的ビヒクル中の適切な用量の化合物またはビヒクル単独（ビヒクル：１％ＨＥＣ／０．２５％Ｔｗｅｅｎ８０／０．０５％消泡剤）のいずれかを動物に経口投与し、投与後、所望の時間間隔で腫瘍および血液を採取する。イソフルラン麻酔と頸椎脱臼を使用して動物を屠殺する。腫瘍を急速冷凍し、ＥＬＩＳＡアッセイによってｐＲＳＫ１レベルを処理するまで−８０℃で保存する。ＥＤＴＡチューブ内に血液を回収し、血漿を沈殿させ、９６ウェルプレート内で−８０℃にて凍結する。標準的な方法を使用して化合物曝露を測定する。

液体窒素中で腫瘍を粉砕し、冷室（４℃）でＦａｓｔＰｒｅｐ−２４（商標）細胞破壊器（ＭＰ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ）においてマトリクスＤビーズ（ＭＰ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ、＃６９１３−５００）を使用して、１×ｈａｌｔプロテアーゼおよびリン酸塩阻害剤カクテル（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、＃０８６１２８１）、１ｍＭのフッ化フェニルメタンスルホニル（ＰＭＳＦ）（Ｓｉｇｍａ、＃９３４８２−５０ＭＬ−Ｆ）および１μＭのメタバナジン酸ナトリウム（Ｓｉｇｍａ、＃５９００８８）を含有する１×溶解緩衝液（ＭＳＤ、＃Ｒ６０ＴＸ−３）中に溶解する。４℃、１４０００ｒｐｍにて２０分間回転させた後、腫瘍溶解物を新たなチューブに移す。Ｐｉｅｒｃｅ ＢＣＡタンパク質アッセイキット（カタログ番号２３２２５、Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して腫瘍または細胞溶解物のタンパク質濃度を測定する。このキットは、３つの主な成分−（１）０．１Ｍの水酸化ナトリウム中に炭酸ナトリウム、炭酸水素ナトリウム、ビシンコニン酸および酒石酸ナトリウムを含有するＢＣＡ試薬Ａ、（２）４％の硫酸銅を含有するＢＣＡ試薬Ｂ、ならびに（３）０．９％の生理食塩水および０．０５％のアジ化ナトリウム中で２ｍｇ／ｍＬを含有するアルブミン標準アンプルを含む。９６ウェルプレート中に、二連ウェルにおいて２５μＬで２０〜２０００ｕｇ／ｍＬの濃度範囲のウシ血清アルブミンタンパク質標準物を加えて標準曲線を生成する。２５μＬの１×ＰＢＳ中で希釈した細胞または腫瘍溶解物を二連試験ウェルに加える。２％の試薬Ｂを試薬Ａに加える（２ｍＬのＢ＋９８ｍＬのＡ）ことによって作業ＢＣＡ試薬を調製し、ウェルを混合し、２００μＬを各試料または標準物に加える。ウェルを混合し、プレートを覆い、３７℃にて３０分間インキュベートする。プレートを室温に冷却し、５６２ｎｍにおいてまたは５６２ｎｍ付近で吸光度をプレートリーダー（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ製のＥｎｖｉｓｉｏｎプレートリーダー）で測定する。ブランク標準複製物の平均５６２ｎｍ吸光測定値を全ての他の個々の標準および未知（細胞または腫瘍溶解物）試料複製物の５６２ｎｍ測定値から差し引く。各々のウシ血清アルブミン標準物についての平均ブランク補正５６２ｎｍ測定値をその濃度（μｇ／ｍＬ）に対してプロットすることによって標準曲線を作成する。標準曲線を使用して、各々の未知の試料のタンパク質濃度をＭｉｃｒｏｓｏｆｔ Ｅｘｃｅｌでの曲線適合対数を使用して決定する。−８０℃にて腫瘍溶解物を凍結させたままにする。一度凍結解凍した腫瘍溶解物を使用して、サンドイッチＥＬＩＳＡによってｐＲＳＫ１発現を測定する。

９６ウェルプレート（Ｔｈｅｒｍｏ、＃１５０４２）を４℃にて一晩、４０ｎｇのＲＳＫ１ヤギ抗体（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ、＃ｓｃ−２３１−Ｇ）でコーティングし、室温にて１時間、次いで４℃にて一晩インキュベートする。３００μＬのＰＢＳＴ（０．０５％のＴｗｅｅｎ−２０を含有する１×リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ））で３回プレートを洗浄し、１００μＬ／ウェルの遮断緩衝液（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、＃３７５３２）で遮断し、室温にて２時間インキュベートする。３００μＬのＰＢＳＴでプレートを３回洗浄し、２０μｇの腫瘍溶解物を各ウェルに移し、４℃にて一晩インキュベートする。３００μＬのＰＢＳＴでプレートを３回洗浄し、１００μＬのｐＲＳＫ１（Ｔ３５９／Ｓ３６３）ウサギ抗体（遮断緩衝液中で１：１０００希釈）と室温にて１時間インキュベートする。３００μＬのＰＢＳＴでプレートを３回洗浄し、１００μＬの抗ウサギＨＲＰコンジュゲート二次抗体（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ ＵＫ、＃ＮＡ９３４Ｖ；遮断緩衝液中で１：１００００希釈）とインキュベートする。室温にて１時間インキュベートする。３００μＬのＰＢＳＴでプレートを３回洗浄し、１００μＬのＳＵＰＥＲＳＩＧＮＡＬ（登録商標）ＥＬＩＳＡ Ｆｅｍｔｏ最大感度基質（Ｔｈｅｒｍｏ、＃３７０７５）を加え、振盪器で１分間インキュベートする。ＥＮＶＩＳＩＯＮ（登録商標）プレートリーダーを使用して発光シグナルを決定する。ビヒクル単独で処理した動物由来の腫瘍溶解物を１００％とみなすことによって各腫瘍溶解物においてｐＲＳＫ１レベルを決定する。各試料を二連で分析し、計算のために平均数を使用する。ＥｘｃｅｌおよびＸＬ Ｆｉｔを使用してＴＥＤ_５０を算出する。

本発明の範囲内である化合物を実質的に上記のようにこのアッセイにおいて試験する。このアッセイの結果は、実施例１の化合物が腫瘍異種移植モデルにおいてＲＳＫ１リン酸化を阻害することを実証している。例えば、実施例１の化合物は１６ｍｇ／ｋｇのＴＥＤ_５０値を有する。

異種移植腫瘍モデル
このアッセイの目的は、試験化合物投与に反応する腫瘍体積の減少を測定することである。培養物中でヒト大腸癌細胞ＨＣＴ１１６（ＡＴＣＣ、＃ＣＣＬ−２４７）を増殖させ、採取し、２００μＬの１：１のＨＢＳＳ＋マトリゲル溶液中の５×１０ｅ^６細胞を、メスの無胸腺ヌードマウス（２２〜２５ｇ、Ｈａｒｌａｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）の後部右脇腹に皮下注射する。培養物中でヒト膵癌細胞ＭＩＡ ＰＡＣＡ−２（ＡＴＣＣ、＃ＣＲＬ−１４２０）またはヒト非小細胞肺癌細胞ＣＡＬＵ−６（ＡＴＣＣ、＃ＨＴＢ−５６）またはヒト大腸癌細胞ＣＯＬＯ−２０５（ＡＴＣＣ、＃ＣＣＬ−２２２）を増殖させ、採取し、２００μＬの１：１のＨＢＳＳ＋マトリゲル溶液中の５×１０ｅ^６細胞を、メスの無胸腺ヌードマウス（２２〜２５ｇ、Ｈａｒｌａｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）の後部右脇腹に皮下注射する。移植の７日後に開始して１週間に２回、腫瘍成長および体重を測定する。腫瘍サイズが２００〜４００ｍｍ^３に到達したとき、動物を無作為化し、８〜１０匹の動物の群に分類する。適切なビヒクル（ビヒクル：１％ＨＥＣ／０．２５％Ｔｗｅｅｎ ８０／０．０５％消泡剤）中に試験化合物を調製し、１４〜２１日間、経口強制投与する。腫瘍反応を、処置過程の間、１週間に２回実施する腫瘍体積測定によって決定する。体重を毒性の一般的尺度とみなす。

本発明の範囲内である化合物を実質的に上記のようにこのアッセイにおいて試験する。実施例１の化合物は以下の表２に提供されるようなデルタＴ／Ｃ％値を有することが見出される。これらの結果は、実施例１の化合物が、ＨＣＴ１１６、ＭＩＡ ＰＡＣＡ−２、ＣＡＬＵ−６およびＣＯＬＯ−２０５を含む、いくつかのヒト癌異種移植モデルにおいて有意な抗腫瘍活性を実証していることを示す。

インビボでの併用研究
腫瘍の不均一性に起因して、併用療法は、効果的な療法のため、または獲得耐性を克服するために特定の種類の癌治療において不可欠である。標的療法の併用は、癌の遅延または停止においてもより効果的である可能性を有すると仮定される。これに関して、実施例１の化合物を、ｐａｎ−ＲＡＦ阻害化合物（国際公開第２０１３／１３４２４３号、１−（３，３−ジメチルブチル）−３−（２−フルオロ−４−メチル−５−（７−メチル−２−（メチルアミノ）ピリド［２，３−ｄ］ピリミジン−６−イル）フェニル）尿素を参照のこと、本明細書以下において「ｐａｎ−ＲＡＦ阻害化合物」）、ＣＤＫ４／６阻害化合物（国際公開第２０１０／０７５０７４、［５−（４−エチル−ピペラジン−１−イルメチル）−ピリジン−２−イル］−［５−フルオロ−４−（７−フルオロ−３−イソプロピル−２−メチル−３Ｈ−ベンゾイミダゾール−５−イル）−ピリミジン−２−イル］−アミン、またはその薬学的に許容可能な塩を参照のこと、本明細書以下において「ＣＤＫ４／６阻害化合物」）、またはＤＣ１０１（例えば、Ｗｉｔｔｅ Ｌ．ら、Ｃａｎｃｅｒ Ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ Ｒｅｖ．、１７、１５５−１６１、１９９８、抗ＶＥＧＦＲ２ Ａｂに対してマウスにおける代用物として実験において使用され得るマウスＶＥＧＦＲ２に対するラットモノクローナル抗体、好ましくはラムシルマブ（Ｃｙｒａｍｚａ（登録商標）、ＩＭＣ−１１２１ｂ、ＣＡＳ登録番号９４７６８７−１３−０としても知られている、国際公開第２００３／０７５８４０号を参照のこと）を参照のこと）と併用した腫瘍成長阻害について試験する。より具体的には、実施例１の化合物を、ＨＣＴ１１６、ＫＲＡＳ変異大腸癌異種移植モデルにおいてｐａｎ−ＲＡＦ阻害化合物またはＣＤＫ４／６阻害化合物のいずれかと併用して試験する。また、実施例１の化合物を、ＮＣＩ−Ｈ４４１、Ａ５４９およびＮＣＩ−Ｈ２１２２、ＫＲＡＳ変異非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）異種移植モデルにおいてＣＤＫ４／６阻害化合物またはＤＣ１０１のいずれかと併用して試験する。

ＨＣＴ１１６併用有効性研究を無胸腺ヌードラットにおいて行う。培養物中でヒト大腸癌細胞ＨＣＴ１１６（ＡＴＣＣ、＃ＣＣＬ−２４７）を増殖させ、採取し、２００μＬの１：１のＨＢＳＳ＋マトリゲル溶液中の５×１０ｅ^６細胞を、メスのＮＩＨヌードラット（１２０〜１４５ｇｍ、Ｔａｃｏｎｉｃ Ｆａｒｍｓ）の後部右脇腹に皮下注射する。移植の７日後に開始して１週間に２回、腫瘍成長および体重を測定する。平均腫瘍サイズが２００〜３００ｍｍ^３に到達したとき、動物を無作為化し、５〜７匹の動物の群に分類する。適切なビヒクル（以下を参照のこと）中に試験化合物を調製し、２１〜２８日間、強制経口投与する。腫瘍反応を、処置過程の間、１週間に２回実施する、腫瘍体積測定によって決定する。この研究において使用したビヒクルは１％ＨＥＣ（ヒドロキシエチルセルロース）／０．２５％Ｔｗｅｅｎ（登録商標）８０／０．０５％消泡剤である。実施例１の化合物およびｐａｎ−ＲＡＦ阻害化合物を１％ＨＥＣ／０．２５％Ｔｗｅｅｎ（登録商標）８０／０．０５％消泡剤中で製剤化する。ＣＤＫ４／６阻害化合物を、２５ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ２中の１％のＨＥＣ中で製剤化する。１０ｍｐｋおよび２０ｍｐｋのＱＤでの実施例１の化合物の投与は、それぞれ５２％および６４％の腫瘍成長阻害の単剤活性を生じる（表３）。対照的に、１０ｍｐｋおよび２０ｍｐｋのＢＩＤでのｐａｎ−ＲＡＦ阻害化合物の投与は、それぞれ２９％および６８％の単剤活性を生じる。全ての処置は、１０ｍｐｋのＢＩＤでのｐａｎ−ＲＡＦ阻害化合物を除いてビヒクル対照から統計的に有意である（ｐ＜０．０５）。１０ｍｐｋのＢＩＤでのｐａｎ−ＲＡＦ阻害化合物と併用した１０ｍｐｋのＱＤでの実施例１の投与は９４％の腫瘍成長阻害（ｐ＜０．００１）を生じ、併用結果はＢｌｉｓｓ Ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｃｅ法によって算出して「相乗的」である（表３）。この併用は有意な体重損失がないので許容可能であるように見える。２０ｍｐｋのＢＩＤでのｐａｎ−ＲＡＦ阻害化合物と併用した１０ｍｐｋのＱＤでの実施例１の化合物の投与もまた、有意（ｐ＜０．０５）な腫瘍成長阻害（９５％）を生じ、併用結果はＢｌｉｓｓ Ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｃｅ法によって算出して「付加」である（表３）。この併用は有意な体重損失がないので許容可能であるように見える。同じ研究において、２０ｍｐｋのＱＤでのＣＤＫ４／６阻害化合物と併用した１０ｍｐｋのＱＤでの実施例１の化合物の投与は９８％の腫瘍成長阻害を生じるのに対して、実施例１の化合物およびＣＤＫ４／６阻害化合物の単剤効果はそれぞれ５２％および７６％の腫瘍成長阻害である。これらの２つの薬剤の併用はＢｌｉｓｓ Ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｃｅ法によって算出して統計的に有意な「付加」結果を示す（表３）。この併用は有意な体重損失がないので許容可能であるように見える。これらの結果は、ｐａｎ−ＲＡＦ阻害化合物またはＣＤＫ４／６阻害化合物のいずれかとの実施例１の化合物の併用が、ＫＲＡＳ変異大腸癌を有する患者に、より大きな利点を提供できることを示唆している。

併用効果をまた、ＳＣＩＤマウスにおけるＡ５４９（ＫＲＡＳ＿Ｇ１２Ｓ）ならびに無胸腺ヌードマウスにおけるＮＣＩ−Ｈ４４１（ＫＲＡＳ＿Ｇ１２Ｖ）およびＮＣＩ−Ｈ２１２２（ＫＲＡＳ＿Ｇ１２Ｃ）を含む、３つのＫＲＡＳ変異ＮＳＣＬＣ異種移植モデルにおいて試験する。培養物中でヒト非小細胞肺癌細胞ＮＣＩ−Ｈ４４１（ＡＴＣＣ、＃ＣＲＬ−５８０７）およびＮＣＩ−Ｈ２１２２（ＡＴＣＣ、＃ＣＲＬ−５９８５）を増殖させ、採取し、２００μＬの１：１のＨＢＳＳ＋マトリゲル溶液中の５×１０ｅ^６細胞を、メスの無胸腺ヌードマウス（２０〜２２ｇｍ、Ｈａｒｌａｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）の後部右脇腹に皮下注射する。培養物中でヒト非小細胞肺癌細胞Ａ５４９（ＡＴＣＣ、＃ＣＣ１−１８５）を増殖させ、採取し、２００μＬの１：１のＨＢＳＳ＋マトリゲル溶液中の５×１０ｅ^６細胞を、メスのＣＢ−１７ ＳＣＩＤマウス（１８〜２０ｇｍ、Ｔａｃｏｎｉｃ Ｆａｒｍｓ）の後部右脇腹に皮下注射する。全ての細胞株について、移植の７日後に開始して１週間に２回、腫瘍成長および体重を測定する。平均腫瘍サイズが２００〜３００ｍｍ^３に到達したとき、動物を無作為化し、５〜７匹の動物の群に分類する。適切なビヒクル（以下を参照のこと）中に試験化合物を調製し、２１〜２８日間、強制経口（実施例１の化合物およびＣＤＫ４／６阻害化合物）または腹腔内（ＤＣ１０１）投与する。腫瘍反応を、処置過程の間、１週間に２回実施する腫瘍体積測定によって決定する。これらの研究において使用したビヒクルは、１％ＨＥＣ／０．２５％Ｔｗｅｅｎ（登録商標）８０／０．０５％消泡剤である。実施例１の化合物は、１％ＨＥＣ／０．２５％Ｔｗｅｅｎ（登録商標）８０／０．０５％消泡剤中で製剤化し、ＣＤＫ４／６阻害化合物は、２５ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ２中の１％ＨＥＣ中で製剤化する。５０ｍｐｋでの単剤としての実施例１の化合物の投与は、ＮＣＩ−Ｈ２１２２およびＡ５４９腫瘍のそれぞれにおいて４１％および９１％の腫瘍成長阻害を生じ、ＮＣＩ−Ｈ４４１腫瘍において１０１％の腫瘍成長阻害（すなわち、１％の腫瘍退縮）を導く。５０ｍｐｋでの単剤としてのＣＤＫ４／６阻害化合物の投与は、ＮＣＩ−Ｈ２１２２、Ａ５４９およびＮＣＩ−Ｈ４４１モデルのそれぞれにおいて５３％、５１％および８１％の腫瘍成長阻害を生じる。また、実施例１の化合物（５０ｍｐｋ）とＣＤＫ４／６阻害化合物（５０ｍｐｋ）の併用は、Ａ５４９およびＮＣＩ−Ｈ４４１腫瘍のそれぞれにおいて１５１％（すなわち５１％退縮）および１４７％（すなわち４７％退縮）の腫瘍成長阻害、ならびにＮＣＩ−Ｈ２１２２腫瘍において８２％の腫瘍成長阻害を生じる。３つ全ての腫瘍モデルにおける併用結果は、Ｂｌｉｓｓ Ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｃｅ法によって算出して「付加」である（表４）。概して、全ての処置は、有意な体重損失がないことによって示されるようにこれらの研究において許容可能であるように見える。同じＮＣＩ−Ｈ４４１異種移植モデルにおいて、リン酸緩衝液中のＤＣ１０１もまた、単剤として、または５０ｍｐｋ、ＱＤでの実施例１の化合物と併用して１週間に２回（ＢＩＷ）で２８日間、腹腔内に投与する。２０ｍｐｋ、ＢＩＷでのＤＣ１０１の投与は、１０２％の腫瘍成長阻害（すなわち２％退縮）の単剤活性を生じる。５０ｍｐｋ、ＱＤでの実施例１の化合物と、２０ｍｐｋ、ＢＩＷでのＤＣ１０１の併用は、１４６％の腫瘍成長阻害（すなわち４６％退縮）を生じる。この併用結果は、Ｂｌｉｓｓ Ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｃｅ法によって算出して「付加」である（表４）。この併用は、有意な体重損失がないので許容可能であるように見える。これらの結果は、実施例１の化合物と、ＣＤＫ４／６阻害化合物または抗ＶＥＧＦＲ２抗体のいずれかとの併用が、ＫＲＡＳ変異を有する非小細胞肺癌患者に、より大きな利点を提供できることを示唆している。

本発明は、以下の態様を含む。
［１］
以下の式の化合物：

（式中、
Ｒ ^１ は、

であり、
Ｒ ^２ およびＲ ^３ はメチルであるか、またはＲ ^２ およびＲ ^３ は一緒になってシクロプロピルを形成してもよく、
Ｒ ^４ は、水素、メチル、クロロ、フルオロまたはトリフルオロメチルであり、
Ｒ ^５ は、

である）
またはその薬学的に許容可能な塩。
［２］
Ｒ ^２ およびＲ ^３ は独立してメチルである、［１］に記載の化合物または塩。
［３］
Ｒ ^４ は水素である、［２］に記載の化合物または塩。
［４］
Ｒ ^１ は、

である、［３］に記載の化合物または塩。
［５］
Ｒ ^５ は、

である、［３］に記載の化合物または塩。
［６］
６，６−ジメチル−２−｛２−［（１−メチル−１Ｈ−ピラゾール−５−イル）アミノ］ピリミジン−４−イル｝−５−［２−（モルホリン−４−イル）エチル］−５，６−ジヒドロ−４Ｈ−チエノ［２，３−ｃ］ピロール−４−オンである、［４］に記載の化合物または塩。
［７］
６，６−ジメチル−２−｛２−［（１−メチル−１Ｈ−ピラゾール−５−イル）アミノ］ピリミジン−４−イル｝−５−［２−（モルホリン−４−イル）エチル］−５，６−ジヒドロ−４Ｈ−チエノ［２，３−ｃ］ピロール−４−オンである、［６］に記載の化合物。
［８］
［１］〜［７］のいずれか一項に記載の化合物または塩と、薬学的に許容可能な担体、希釈剤、または賦形剤とを含む、医薬組成物。
［９］
有効量の［１］〜［７］のいずれか一項に記載の化合物または塩を、それを必要とする患者に投与することを含む、癌を治療する方法。
［１０］
前記癌は、黒色腫、大腸癌、膵癌、および非小細胞肺癌からなる群から選択される、［９］に記載の方法。
［１１］
前記癌は、大腸癌である、［１０］に記載の方法。
［１２］
前記癌は、膵癌である、［１０］に記載の方法。
［１３］
前記癌は、非小細胞肺癌である、［１０］に記載の方法。
［１４］
療法に使用するための［１］〜［７］のいずれか一項に記載の化合物または塩。
［１５］
癌の治療に使用するための［１］〜［７］のいずれか一項に記載の化合物または塩。
［１６］
前記癌は、黒色腫、大腸癌、膵癌、および非小細胞肺癌からなる群から選択される、［１５］に記載の使用のための化合物または塩。
［１７］
前記癌は、大腸癌である、［１６］に記載の使用のための化合物または塩。
［１８］
前記癌は、膵癌である、［１６］に記載の使用のための化合物または塩。
［１９］
前記癌は、非小細胞肺癌である、［１６］に記載の使用のための化合物または塩。

Claims (19)

1. 以下の式の化合物：
   
   （式中、
   Ｒ^１は、
   
   であり、
   Ｒ^２およびＲ^３はメチルであるか、またはＲ^２およびＲ^３は一緒になってシクロプロピルを形成してもよく、
   Ｒ^４は、水素、メチル、クロロ、フルオロまたはトリフルオロメチルであり、
   Ｒ^５は、
   
   である）
   またはその薬学的に許容可能な塩。
2. Ｒ^２およびＲ^３は独立してメチルである、請求項１に記載の化合物または塩。
3. Ｒ^４は水素である、請求項２に記載の化合物または塩。
4. Ｒ^１は、
   
   である、請求項３に記載の化合物または塩。
5. Ｒ^５は、
   
   である、請求項３に記載の化合物または塩。
6. ６，６−ジメチル−２−｛２−［（１−メチル−１Ｈ−ピラゾール−５−イル）アミノ］ピリミジン−４−イル｝−５−［２−（モルホリン−４−イル）エチル］−５，６−ジヒドロ−４Ｈ−チエノ［２，３−ｃ］ピロール−４−オンである、請求項４に記載の化合物または塩。
7. ６，６−ジメチル−２−｛２−［（１−メチル−１Ｈ−ピラゾール−５−イル）アミノ］ピリミジン−４−イル｝−５−［２−（モルホリン−４−イル）エチル］−５，６−ジヒドロ−４Ｈ−チエノ［２，３−ｃ］ピロール−４−オンである、請求項６に記載の化合物。
8. 請求項１〜７のいずれか一項に記載の化合物または塩と、薬学的に許容可能な担体、希釈剤、または賦形剤とを含む、医薬組成物。
9. 有効量の請求項１〜７のいずれか一項に記載の化合物または塩を、それを必要とする患者に投与することを含む、癌を治療する方法。
10. 前記癌は、黒色腫、大腸癌、膵癌、および非小細胞肺癌からなる群から選択される、請求項９に記載の方法。
11. 前記癌は、大腸癌である、請求項１０に記載の方法。
12. 前記癌は、膵癌である、請求項１０に記載の方法。
13. 前記癌は、非小細胞肺癌である、請求項１０に記載の方法。
14. 療法に使用するための請求項１〜７のいずれか一項に記載の化合物または塩。
15. 癌の治療に使用するための請求項１〜７のいずれか一項に記載の化合物または塩。
16. 前記癌は、黒色腫、大腸癌、膵癌、および非小細胞肺癌からなる群から選択される、請求項１５に記載の使用のための化合物または塩。
17. 前記癌は、大腸癌である、請求項１６に記載の使用のための化合物または塩。
18. 前記癌は、膵癌である、請求項１６に記載の使用のための化合物または塩。
19. 前記癌は、非小細胞肺癌である、請求項１６に記載の使用のための化合物または塩。