JP2015533135A - ウイルス感染症および他の疾患の処置のためのピロロ［３，２−ｄ］ピリミジン誘導体 - Google Patents

Abstract

本発明は、ピロロ［３，２−ｄ］ピリミジン誘導体、その調製方法、医薬組成物、および疾患の処置および／または治療におけるそれらの使用に関する。

Description

本発明は、ピロロ［３，２−ｄ］ピリミジン誘導体、その調製方法、医薬組成物、および疾患の処置および／または治療におけるそれらの使用に関する。

本発明は、ピロロ−ピリミジン誘導体の使用、より具体的には、Ｔｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）の調節または活性化作用が関与する、ウイルス感染症、免疫障害または炎症性障害の処置におけるピロロ［３，２−ｄ］ピリミジン誘導体の使用に関する。Ｔｏｌｌ様受容体は、ロイシンに富む細胞外ドメイン、および保存領域を含有する細胞質の伸長を特徴とする主要な膜貫通タンパク質である。自然免疫系は、一定のタイプの免疫細胞の細胞表面上に発現するこのＴＬＲを介して病原体関連分子パターンを認識し得る。外来病原体を認識すると、サイトカインの産生および食細胞における共刺激分子の上方制御が活性化される。これにより、Ｔ細胞挙動が調節される。

大多数の哺乳類種には、１０〜１５種類のＴｏｌｌ様受容体がある。（単純にＴＬＲ１〜ＴＬＲ１３と命名された）１３種のＴＬＲが、ヒトおよびマウスでともに確認されており、これらの多くと同等の形態が、他の哺乳類種において見出されている。しかしながら、ヒトに見られるある特定のＴＬＲに相当するものが、全ての哺乳動物において存在するわけではない。例えば、ヒトにおけるＴＬＲ１０と類似したタンパク質をコードする遺伝子がマウスにおいて存在するが、過去のどこかの時点で、レトロウイルスによって損傷されたようである。一方、マウスは、ヒトにおいては示されないＴＬＲ１１、１２、および１３を発現する。他の哺乳動物は、ヒトに見られないＴＬＲを発現し得る。他の非哺乳類種は、トラフグに見られるＴＬＲ１４によって示されるような、哺乳動物とは異なるＴＬＲを有し得る。これにより、ヒト自然免疫のモデルとして実験動物を使用するプロセスが複雑になる恐れがある。

Ｔｏｌｌ様受容体に関する概説については、次の雑誌論文を参照されたい。Ｈｏｆｆｍａｎｎ，Ｊ．Ａ．，Ｎａｔｕｒｅ，４２６，ｐ３３−３８，２００３；Ａｋｉｒａ，Ｓ．，Ｔａｋｅｄａ，Ｋ．，ａｎｄ Ｋａｉｓｈｏ，Ｔ．，Ａｎｎｕａｌ Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，２１，ｐ３３５−３７６，２００３；Ｕｌｅｖｉｔｃｈ，Ｒ．Ｊ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ：Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，４，ｐ５１２−５２０，２００４。

国際公開第２０００００６５７７号パンフレットには複素環誘導体、国際公開第９８／０１４４８号パンフレットおよび国際公開第９９／２８３２１号パンフレットにはアデニン誘導体、および国際公開第２００９／０６７０８１号パンフレットにはピリミジンなど、Ｔｏｌｌ様受容体に対する活性を示す化合物が既に記載されている。

Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）の場合のように、一定のウイルス感染症の処置では、インターフェロン（ＩＦＮ−α）の定期的な注射を投与することができる（Ｆｒｉｅｄ ｅｔ．ａｌ．Ｐｅｇｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ−ａｌｆａ ｐｌｕｓ ｒｉｂａｖｉｒｉｎ ｆｏｒ ｃｈｒｏｎｉｃ ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｃ ｖｉｒｕｓ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ，Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ ２００２；３４７：９７５−８２）。経口投与可能な低分子ＩＦＮ誘導物質は、免疫原性の低下と投与の簡便性という利点を提供し得る。従って、新規なＩＦＮ誘導物質とは、ウイルス感染の処置に有効となり得る新種の薬物である。抗ウイルス効果を有する低分子ＩＦＮ誘導物質の文献中の例については、Ｄｅ Ｃｌｅｒｃｑ，Ｅ．；Ｄｅｓｃａｍｐｓ，Ｊ．；Ｄｅ Ｓｏｍｅｒ，Ｐ．Ｓｃｉｅｎｃｅ １９７８，２００，５６３−５６５を参照されたい。

インターフェロンαはまた、一定の種類のがんの処置において、他の薬物と組み合わせて患者に投与される（Ｅｕｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ（４６）ｐ２８４９−５７およびＣａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．１９９２（５２）ｐ．１０５６）。ＴＬＲ７／８アゴニストもまた、明白なＴｈ１反応を誘導する能力があるため、ワクチンアジュバントとして着目されている（Ｈｕｍ．Ｖａｃｃｉｎｅｓ，２００９（５），３８１−３９４）。

しかし、従来技術の化合物と比較して、選択性が好ましく、安全性プロファイルが改善されている新規なＴｏｌｌ様受容体調節剤が強く求められている。

本発明によって、式（Ｉ）の化合物、

およびその薬学的に許容できる塩、溶媒和物プロドラッグ、立体異性体または多形体を提供し、
Ｒ_１は、Ｈ、フッ素またはメチルであり、
Ｒ_２は、Ｈ、ハロゲンまたはＣ_１〜３アルキルであり、Ｒ_３は、アリールで任意選択的に置換されたＣ_１〜６アルキルであり、当該アリールは、アリールオキシ、ハロゲン、アリール、アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、ヘテロシクロアルキル、Ｃ_１〜６シクロアルキル、Ｃ_１〜６アルキル、カルボン酸、カルボン酸エステル、カルボン酸アミド、ニトリル、またはＣ_１〜６アルコキシから独立に選択される１つまたは複数の置換基で任意選択的にさらに置換されており、または、
Ｒ_３は、Ｃ_１〜６アルケン、Ｃ_３〜７シクロアルキルまたはＣ_３〜７ヘテロシクロアルキルで任意選択的に置換されたＣ_１〜６アルキルであり、または、
Ｒ_３は、Ｃ_１〜６アルコキシで任意選択的に置換されたＣ_１〜６アルキルであり、当該Ｃ_１〜６アルコキシは、アリールで任意選択的にさらに置換されており、
Ｒ_４は、ヒドロキシル、Ｃ_１〜６アルコキシ、Ｃ_１〜６アルキル、Ｃ_３〜７シクロアルキル、Ｃ_２〜６アルケニル、アリール、ヘテロアリールから独立に選択される１つまたは複数の置換基で任意選択的に置換されたＣ_１〜８アルキルであり、当該ヘテロアリールは、Ｃ_１〜６アルキルで任意選択的にさらに置換されており、当該Ｃ_３〜７シクロアルキルは、Ｃ_１〜６アルキルで任意選択的にさらに置換されているが、
ただし、２−アミノ−４−（Ｎ−ブチルアミノ）−５−（αメチルベンジル）ピロロ［３，２−ｄ］ピリミジンを除外することを条件とする。

好ましい化合物は、Ｒ_３がアリール（置換または非置換）で置換されたＣ_１〜３アルキル基であり、Ｒ_１、Ｒ_２およびＲ_４が上記のとおりである、式（Ｉ）のものである。

第２の実施形態では、Ｒ_３およびＲ_４がアリールで置換されたＣ_１〜３アルキルであり、当該アリールが上記のとおり任意選択的にさらに置換されている、式（Ｉ）の化合物である。

さらなる実施形態では、Ｒ_１が水素であり、Ｒ_２がフッ素であり、Ｒ_３およびＲ_４が上記のとおりである、式（Ｉ）のものである。

他の好ましい実施形態は、Ｒ_１がフッ素であり、Ｒ_２が水素であり、Ｒ_３およびＲ_４が上記のとおりである、式（Ｉ）のものである。

表Ｉおよび表ＩＩに挙げた、次の番号＃８９、９４、１０１、１４４、１５４、１５６、１７５、１９２、２０９、２１３および２１５の化合物は、本明細書に開示している本発明に係るそれらの特性のため、特に着目される。

式（Ｉ）の化合物およびその薬学的に許容できる塩、溶媒和物または多形体は、医薬品として、特に、Ｔｏｌｌ様受容体（特に、ＴＬＲ７および／またはＴＬＲ８）活性の調節剤としての活性を有する。

さらなる態様において、本発明は、式（Ｉ）の化合物またはその薬学的に許容できる塩、溶媒和物もしくは多形体を、１種または複数種の薬学的に許容できる賦形剤、希釈剤または担体とともに含む医薬組成物を提供する。

さらに、本発明に係る式（Ｉ）の化合物またはその薬学的に許容できる塩、溶媒和物もしくは多形体、または式（Ｉ）の前記化合物またはその薬学的に許容できる塩、溶媒和物もしくは多形体を含む医薬組成物は、薬剤として使用され得る。

本発明の別の態様は、式（Ｉ）の化合物またはその薬学的に許容できる塩、溶媒和物もしくは多形体、または式（Ｉ）の前記化合物またはその薬学的に許容できる塩、溶媒和物もしくは多形体を含む前記医薬組成物が、ＴＬＲ７および／またはＴＬＲ８の調節が関与するいずれの障害の処置にも相応に使用され得ることである。

「アルキル」という用語は、規定数の炭素原子を含有する直鎖状または分枝鎖状飽和脂肪族炭化水素を指す。

「ハロゲン」という用語は、フッ素、塩素、臭素またはヨウ素を指す。

「アルケニル」という用語は、少なくとも２つの炭素原子および少なくとも１つの炭素−炭素二重結合からなる上に定義されるアルキルを指す。

「シクロアルキル」という用語は、規定数の炭素原子を含有する炭素環を指す。

「アルコキシ」という用語は、例えば、メトキシ基またはエトキシ基のような、酸素に単結合されるアルキル（炭素と水素との鎖）基を指す。

「アリール」という用語は、Ｎ、ＯおよびＳから、特にＮおよびＯから選択される１つまたは２つのヘテロ原子を任意選択的に含む芳香環構造を意味する。前記芳香環構造は、５つ、６つまたは７つの環原子を有し得る。特に、前記芳香環構造は、５つまたは６つの環原子を有し得る。前記芳香環構造は、別のアリール環と縮合して、二環式構造（例として、以下に限定はしないが、キノリン、イソキノリン、キナゾリン、ベンゾオキサゾールを含む）を構成することもできる。

「アリールオキシ」という用語は、芳香環構造を指す。前記芳香族基は酸素に単結合される（例えばフェノキシ）。

「アルケン」という用語は、少なくとも１つの炭素−炭素二重結合を含有する規定数の炭素原子を含有する不飽和炭化水素鎖を指す。

「複素環」という用語は、飽和または部分的に飽和した分子を指し、テトラヒドロフラン、ジオキサンまたは他の環状エーテルを含む。窒素を含有する複素環としては、例えば、アゼチジン、モルホリン、ピペリジン、ピペラジン、ピロリジンなどが挙げられる。他の複素環としては、例えば、チオモルホリン、ジオキソリニル（ｄｉｏｘｏｌｉｎｙｌ）、および環状スルホンが挙げられる。

式（Ｉ）の化合物の薬学的に許容できる塩は、その酸付加塩および塩基塩を含む。好適な酸付加塩は、非毒性塩を形成する酸から形成される。好適な塩基塩は、非毒性塩を形成する塩基から形成される。

本発明の化合物はまた、非溶媒和および溶媒和形態で存在してもよい。「溶媒和物」という用語は、本発明の化合物と、１種または複数種の薬学的に許容できる溶媒分子、例えば、エタノールとを含む分子錯体を表すために、本明細書において使用される。

「多形体」という用語は、本発明の化合物が２つ以上の形態または結晶構造で存在する能力を指す。

本発明の化合物は、結晶性または非晶質生成物として投与され得る。それらは、沈殿、結晶化、凍結乾燥、噴霧乾燥、または蒸発乾燥などの方法によって、例えば、固体プラグ、粉末、またはフィルムとして得ることができる。それらは、単独でまたは本発明の１種または複数種の他の化合物と組み合わせて、または１種または複数種の他の薬物と組み合わせて投与され得る。一般に、それらは、１種または複数種の薬学的に許容できる賦形剤とともに製剤として投与されるであろう。「賦形剤」という用語は、本発明の化合物以外の任意の成分を表すために、本明細書において使用される。賦形剤の選択は、具体的な投与形態、溶解性および安定性に対する賦形剤の影響、および剤形の性質などの要因に大きく左右される。

本発明の化合物またはその任意のサブグループは、投与のために様々な医薬品形態へと製剤化され得る。適切な組成物として、薬物の全身投与のために通常使用される全組成物を挙げることができる。本発明の医薬組成物を調製するために、有効量の、活性成分としての特定の化合物を、任意選択的に付加塩形態で、薬学的に許容できる担体と組み合わせて緊密な混合物とする。この担体は、投与に所望される製剤の形態に応じて、非常に様々な形態をとり得る。これらの医薬組成物は、例えば、経口、経直腸、または経皮投与に好適な単一の剤形であるのが望ましい。例えば、経口剤形の組成物を調製する際に、懸濁剤、シロップ剤、エリキシル剤、乳剤および溶液剤などの経口液体製剤の場合には、例えば水、グリコール、油、アルコールなどの通常の医薬媒体のいずれかを使用することができ、または散剤、丸剤、カプセル剤および錠剤の場合には、デンプン、糖、カオリン、希釈剤、滑沢剤、結合剤、崩壊剤などの固体担体を使用することができる。投与が容易であるため、錠剤およびカプセル剤は最も有利な経口単位剤形となり、その場合、固体医薬担体が当然使用される。使用の直前に液体形態に変換され得る固形製剤も含まれる。経皮投与に好適な組成物においては、担体は、浸透促進剤および／または好適な湿潤剤を、任意選択的に、少ない割合の任意の性質の好適な添加剤と組み合わせて含み、これらの添加剤は、有意な有害作用を皮膚に及ぼすものではない。前記添加剤は、皮膚への投与を容易にすることができ、かつ／または所望の組成物の調製に有用となり得る。これらの組成物は、様々な方法で、例えば、経皮貼付剤として、スポットオン剤（ｓｐｏｔ−ｏｎ）として、軟膏剤として投与され得る。本発明の化合物はまた、この方法による投与のための当該技術分野において使用される方法および製剤を用いて、吸入または吹送によって投与され得る。したがって、一般に、本発明の化合物は、溶液剤、懸濁剤または乾燥散剤の形態で肺に投与され得る。

前述した医薬組成物を、投与を容易にし、投与量を均一にするために、単位剤形に製剤化することが特に有利である。本明細書で使用される単位剤形とは、単位投与量として好適な物理的に個別の単位を指し、各単位は、必要な医薬担体と共同して所望の治療効果を生じるよう計算された所定量の活性成分を含有する。そのような単位剤形の例としては、錠剤（分割錠剤またはコーティング錠剤を含む）、カプセル剤、丸剤、粉末パケット、オブラート、坐剤、注射液、または懸濁剤など、およびそれらを複数に分割したものがある。

感染症の処置の当業者は、以下に示される試験結果から有効量を決定することができるであろう。一般に、有効な一日当たりの量は、０．０１ｍｇ／ｋｇ〜５０ｍｇ／ｋｇ体重、より好ましくは０．１ｍｇ／ｋｇ〜１０ｍｇ／ｋｇ体重であろうと考えられる。必要な用量を２、３、４またはそれより多いサブ用量として、一日において適切な間隔で投与することが適切であり得る。前記サブ用量は、例えば、単位剤形当たり１〜１０００ｍｇ、特に、５〜２００ｍｇの活性成分を含有する単位剤形として製剤化され得る。

正確な投与量および投与頻度は、当業者に周知のように、使用される式（Ｉ）の特定の化合物、処置される特定の病態、処置される病態の重症度、特定の患者の年齢、体重および全身的な身体状態ならびに個体が摂取している可能性のある他の薬剤に応じて決まる。さらに、有効量は、処置される対象の応答に応じて、かつ／または本発明の化合物を処方する医師の評価に応じて、減少または増加させ得ることが明らかである。したがって、上記の有効量の範囲は指針に過ぎず、本発明の範囲または使用を、いかなる程度であれ限定することは意図されていない。

実験項
スキーム１。全体的な反応スキーム

スキーム１のタイプＡ化合物は、極性非プロトン性溶媒、例えばＤＭＦを使用して、臭化ベンジルでアルキル化することができる。ハロゲン化アルキルの中間体Ａとの反応には、より強い塩基（例えば炭酸セシウム）が必要であり、反応時間をより長くする、かつ／または温度を上げる必要がある可能性がある。中間体Ｂの塩素をアミンと置換してタイプＣ化合物を形成するには、アミノアルコールで見られるように、さらに加熱する、または反応時間を長くする必要があり得る（アミノアルコールの調製については、国際公開第２００９０６７０８１号パンフレットおよび国際公開第２００８１４７６９７号パンフレットを参照されたい）。中間体Ｂの塩素のアミンとの置換はまた、極性溶媒（例えば、ＤＭＦまたはアセトニトリル）中で室温にて進行し得る。ＢからＣへの反応を助けるために種々の塩基を使用することができ、その塩基には、以下に限定はしないが、トリエチルアミン、ジイソプロピルアミン、炭酸セシウム、炭酸カリウムまたは水素化ナトリウムが含まれる。上記の中間体Ｄが表す化合物のアジド基の還元はまた、水素雰囲気中Ｐｄ／Ｃで進行し得る。フッ素を含有する中間体Ｂ、ＣおよびＤは、非置換類似体と同様のプロトコルで置換することができ、このため、記載した反応スキームは両タイプの化合物に適用される。

中間体Ｂの調製

５０ｍＬバイアル中に、２，４−ジクロロ−５Ｈ−ピロロ［３，２−ｄ］ピリミジン［ＣＡＳ６３２００−５４−４］（１ｇ、５．３１９ｍｍｏｌ）、ＤＭＦ（１０ｍＬ）、ＤＩＰＥＡ（２．７５ｍＬ、１６ｍｍｏｌ）および臭化ベンジル（０．７ｍＬ、５．８５ｍｍｏｌ）を入れた。バイアルを密封し、室温で１６時間振盪した。溶媒を減圧留去した。粗製物をシリカゲルカラムクロマトグラフィーで、ヘプタンから酢酸エチルへの勾配を使用して精製した。最良の画分をプールし、溶媒を減圧留去してＢを得た。ＬＣ−ＭＳ（Ｍ＋Ｈ）ｍ／ｚ＝２７８

中間体Ｂ２の調製

磁気撹拌子を備えた５０ｍＬバイアル中に、Ａ（５０ｍｇ、０．２７ｍｍｏｌ）、無水ＤＭＦ（１ｍＬ）、炭酸セシウム（０．２５９ｇ、０．８ｍｍｏｌ）を、次いで２−ブロモエチルメチルエーテル（０．０３ｍＬ、０．２９ｍｍｏｌ）を入れた。フラスコを密封し、反応させて、７０℃で２時間撹拌した。溶媒を減圧留去した。粗製物をシリカゲルカラムクロマトグラフィーで、ヘプタンから酢酸エチルへの勾配を使用して精製した。最良の画分をプールし、溶媒を減圧留去してＢ２を得た。ＬＣ−ＭＳ（Ｍ＋Ｈ）ｍ／ｚ＝２４６

中間体Ｃの調製

磁気撹拌子を備えた５０ｍＬ丸底フラスコ中に、Ｂ（１．４ｇ、５．０３ｍｍｏｌ）、ｎ−ブチルアミン（０．５９ｍＬ、６．０４ｍｍｏｌ）および１，４−ジオキサン（５ｍＬ）を入れた。フラスコは還流冷却器を備えており、１００℃に加熱して１６時間撹拌した。室温まで冷却してから、溶媒を減圧留去した。粗製物をシリカゲルカラムクロマトグラフィーで、ヘプタンから酢酸エチルへの勾配を使用して精製した。最良の画分をプールし、溶媒を減圧留去してＣを得た。ＬＣ−ＭＳ（Ｍ＋Ｈ）ｍ／ｚ＝３１５

中間体Ｄの調製

磁気撹拌子を備えたガラスバイアル中に、Ｃ（１ｇ、３．１８ｍｍｏｌ）、アジ化ナトリウム（０．６２ｇ、９．５３ｍｍｏｌ）およびＮＭＰ：水（９：１、４ｍＬ）を入れた。ガラスバイアルを密封し、混合物を１７０℃に加熱して５時間撹拌した。室温まで冷却してから、混合物を酢酸エチル（２０ｍＬ）で希釈し、水（５×１５ｍＬ）で洗浄した。有機層を硫酸マグネシウムで脱水し、固体を濾過により除去し、濾液の溶媒を減圧留去した。粗製物をシリカゲルカラムクロマトグラフィーで、ヘプタンから酢酸エチルへの勾配を使用して精製した。最良の画分を合わせ、溶媒を減圧留去してＤを得た。ＬＣ−ＭＳ（Ｍ＋Ｈ）ｍ／ｚ＝３２２

１の調製

磁気撹拌子を備えたガラスバイアル中に、Ｄ（１００ｍｇ、０．３１１ｍｍｏｌ）、１，４−ジオキサン（４ｍＬ）、水（１ｍＬ）およびトリフェニルホスフィン（２４５ｍｇ、０．９３ｍｍｏｌ）を入れた。ガラスバイアルを密封し、混合物を１２０℃に加熱して４８時間撹拌した。室温まで冷却してから、溶媒を減圧留去した。粗製物をシリカゲルカラムクロマトグラフィーで、ジクロロメタンからジクロロメタン中１０％メタノールへの勾配を使用して精製した。最良の画分をプールし、溶媒を減圧留去して１を得た。ＬＣ−ＭＳ（Ｍ＋Ｈ）ｍ／ｚ＝２９６

８６の調製

磁気撹拌子を備えたガラスバイアル中に、１（１１０ｍｇ、０．３７２ｍｍｏｌ）、ニトロメタン（１．５ｍＬ）およびセレクトフルオル（１９８ｍｇ、０．５６ｍｍｏｌ）を入れた。ガラスバイアルを密封し、混合物を室温で１６時間撹拌した。溶媒を減圧留去した。粗製物を逆相クロマトグラフィーで精製した。最良の画分をプールし、溶媒を減圧留去して８６を得た。

中間体Ｅの調製

磁気撹拌子を備えたガラスバイアル中に、Ａ（６００ｍｇ、３．１９ｍｍｏｌ）、ニトロメタン（１０ｍＬ）およびセレクトフルオル（５．６７ｇ、１６ｍｍｏｌ）を入れた。ガラスバイアルを密封し、混合物を室温で４８時間撹拌した。ＮａＨＣＯ_３（飽和水溶液、１０ｍＬ）を添加し、酢酸エチル（３×１５ｍＬ）で抽出した。有機層をプールし、硫酸マグネシウムで脱水し、固体を濾過により除去し、濾液の溶媒を減圧留去して粗製物Ｅを得、これをそのまま次の工程で使用した。ＬＣ−ＭＳ（Ｍ＋Ｈ）ｍ／ｚ＝２０６

中間体Ｇの調製

工程１
中間体Ｆを、国際公開第２０１０００６０２５号パンフレット４４頁のスキーム３で化合物９を調製するために使用された方法に従って調製した。異なる点は、トリメチルアセチル基の代わりにアセチル基を使用したことである。

工程２。中間体Ｇの調製
磁気撹拌子を備えた５０ｍＬガラスバイアル中に、Ｆ（２００ｍｇ、０．９７ｍｍｏｌ）、無水ＤＭＦ（５ｍＬ）、ＤＢＵ（０．４３５ｍＬ、２．９１ｍｍｏｌ）およびＢＯＰ（５３６ｍｇ、１．２ｍｍｏｌ）を入れた。数分間攪拌すると、反応混合物は溶液になり、次いでｎ−ブチルアミン（０．４８ｍＬ、４．８５ｍｍｏｌ）を添加した。室温で１６時間撹拌し続ける。溶媒を減圧留去し、粗製物を逆相クロマトグラフィーで精製したＬＣ−ＭＳ（Ｍ＋Ｈ）ｍ／ｚ＝２６２

スキーム２。全体的な反応スキーム

基本手順。スキーム２のタイプＸ化合物は、光延条件を使用して、極性非プロトン性溶媒、例えばＴＨＦ中で、アルコールで官能化することができる。カルバミン酸メチルの開裂を、１，４−ジオキサン中で、塩基性条件にて実施して中間体Ｚを形成した。中間体Ｚの塩素の、アミンおよび塩基（例えばＮａＨ）との置換を、極性溶媒（例えばＮＭＰ）中で実施して式（Ｉ）の化合物を得た。

中間体Ｘの調製

３−アミノ−２−エトキシカルボニルピロール塩酸塩（２５．８ｇ、１３５．３ｍｍｏｌ）をジクロロメタンと飽和ＮａＨＣＯ_３との間で分配し、ＭｇＳＯ_４で脱水し、濾過し、蒸発させて乾燥した。残渣を１，３−ビス（メトキシカルボニル）−２−メチル−２−チオプソイド尿素（３２．１ｇ、１５６ｍｍｏｌ）および酢酸（３９ｍＬ、６７７ｍｍｏｌ）とともにメタノール（５００ｍＬ）に溶解し、室温で１時間撹拌した。沈殿物が現れ、撹拌を終夜継続した。ナトリウムメトキシド（７３．１ｇ、１３５３ｍｍｏｌ）を添加した。発熱が観察され、反応混合物を終夜撹拌した。反応混合物を、酢酸の添加によってｐＨ５にし、沈殿物を濾過して採り、水（２×３５０ｍＬ）、アセトニトリル（１×３５０ｍＬ）およびジイソプロピルエーテル（１×３５０ｍＬ）で研和した。得られたメチルＮ−（４−ヒドロキシ−５Ｈ−ピロロ［３，２−ｄ］ピリミジン−２−イル）カルバマートを乾燥器で乾燥した。

メチルＮ−（４−ヒドロキシ−５Ｈ−ピロロ［３，２−ｄ］ピリミジン−２−イル）カルバマート（２５ｇ、１２０ｍｍｏｌ）を、５００ｍＬ多口フラスコ中でアセトニトリル（３５０ｍＬ）に室温で懸濁させた。ＰＯＣｌ_３（２２．１ｍＬ、２３８．２ｍｍｏｌ）を添加し、反応混合物を７０℃に加熱しながらオーバーヘッド機械式攪拌機（ｏｖｅｒｈｅａｄ，ｍｅｃｈａｎｉｃａｌ ｓｔｉｒｒｅｒ）（３００ｒｐｍ）で撹拌した。ヒューニッヒ塩基（４１．４ｍＬ、２４０．２ｍｍｏｌ）をシリンジポンプにて流速０．２ｍＬ／分で滴加した。反応混合物を室温まで冷却し、撹拌した酢酸ナトリウム（７８．８ｇ、９６１ｍｍｏｌ）の水溶液（５００ｍＬ）に４５℃で注入した。有機物を蒸発させ、残留液体を撹拌し、氷浴で冷却した。形成した固体を濾過によって単離し、アセトニトリルで洗浄し、ジイソプロピルエーテルで研和して中間体Ｘを固体として得、これを真空乾燥した。

中間体Ｙの調製

中間体Ｘ（５ｇ、２２ｍｍｏｌ）と、２−ピリジンメタノール（２．６ｍＬ、２６．５ｍｍｏｌ）と、ポリスチレンが結合したトリフェニルホスフィン（１８．４ｇ、５５．２ｍｍｏｌ）との無水ＴＨＦ（１５３ｍＬ）懸濁液に、ＤＩＡＤ（６．９ｍＬ、３３ｍｍｏｌ）を室温で添加し、反応混合物を３０分間撹拌し、次いで減圧濃縮した。生成物を、シリカゲルカラムクロマトグラフィーで、勾配ジクロロメタン：メタノール１００：０から９０：１０への勾配を使用して精製した。生成物画分を回収し、減圧濃縮した。生成物をアセトニトリル中で再結晶化させ、濾過によって単離し、真空乾燥してＹを白色固体として得た。

中間体Ｚの調製

Ｙ（４．５ｇ、１４．２ｍｍｏｌ）を１００ｍＬ丸底フラスコ中で１，４−ジオキサン（６８ｍＬ）に溶解し、１Ｎ ＮａＯＨ（３４ｍＬ）を添加した。混合物を６０℃に５時間加熱した。混合物を冷却し、減圧濃縮した。残渣を水で処理し、沈殿物を濾過によって単離し、乾燥してＺを得た。生成物をそのまま次の工程で使用した。

Ｚ（１７５ｍｇ、０．６７ｍｍｏｌ）と、イソオキサゾール−３−イル−メチルアミン塩酸塩（１３６ｍｇ、１．０ｍｍｏｌ）と、ジイソプロピルエチルアミン（１７３ｍｇ、１．３ｍｍｏｌ）とを７ｍＬガラスバイアル中でＮＭＰ（２．４ｍＬ）に溶解した。混合物を１００℃で２時間撹拌し、次いで冷却し、真空濃縮した。それを分取ＨＰＬＣ（固定相：ＲＰ Ｖｙｄａｃ Ｄｅｎａｌｉ Ｃ１８−１０μｍ、２００ｇ、５ｃｍ）、移動相：０．２５％ＮＨ_４ＯＡｃの、水、メタノール溶液）で精製し、所望の画分を回収し、真空濃縮した。生成物をアセトニトリル中で研和し、濾過によって単離し、真空乾燥して１５５を白色固体として得た。

表１。式（Ｉ）の化合物および対応する分析データ
化合物を、実験項に記載した方法に従って調製した。^＊Ｒは、配置が不明でＲ配置で描いた純粋なエナンチオマーを示す。^＊Ｓは、配置が不明でＳ配置で描いた純粋なエナンチオマーを示す。

分析方法。
全ての化合物を、ＬＣ−ＭＳで、以下のＬＣ−ＭＳ法に従って特性化した。

方法Ａ。３５℃に保持したＰｈｅｎｏｍｅｎｅｘ Ｋｉｎｅｔｅｘ カラム（ＸＢ−Ｃ１８、５０×４．６ｍｍ Ｉ．Ｄ．２．６μｍ）を使用。ＭＳ検出：ＡＰＩ−ＥＳ正イオン化モード、質量範囲１００〜１２００。ＰＤＡ検出（λ＝１９０〜４００ｎｍ）。２μＬ注入で次の勾配を使用した。

方法Ｂ。逆相ＵＰＬＣ（超高速液体クロマトグラフィー）を、架橋エチルシロキサン／シリカハイブリッド（ＢＥＨ）Ｃ１８カラム（１．７μｍ、２．１×５０ｍｍ；Ｗａｔｅｒｓ Ａｃｑｕｉｔｙ）で、流速０．８ｍｌ／分で行った。２つの移動相（Ｈ_２Ｏ中１０ｍＭ酢酸アンモニウム／アセトニトリル９５／５；移動相Ｂ：アセトニトリル）を使用して、１．３分間で９５％Ａおよび５％Ｂから５％Ａおよび９５％Ｂへの勾配条件を実行し、０．７分間保持した。注入量０．７５μＬを使用した。コーン電圧は、正イオン化モードの場合３０Ｖ、負イオン化モードの場合３０Ｖとした。

方法Ｃ。分析を、Ｗａｔｅｒｓ ＸＴｅｒｒａ Ｃ１８カラム（１００×４．６ｍｍ Ｉ．Ｄ．３．５μｍ粒子）にて、４０℃、流速１．６ｍＬ／分で行った。勾配溶離は以下のように実施した。７．５分間、水／アセトニトリル９０：１０中酢酸アンモニウム（２５ｍＭ）溶液の１００％からアセトニトリル／メタノール５０：５０の混合物；１．０分間、生じた組成から１００％アセトニトリル；１．５分間、１００％アセトニトリル；３．０分間、１００％アセトニトリルから１００％から水／アセトニトリル９０：１０（２５ｍＭ）中酢酸アンモニウム（２５ｍＭ）溶液の１００％。標準的な注入量を３μＬとした。取得範囲はＵＶについて２００〜４００ｎｍに設定した。

方法Ｄ。ＬＣ測定を、バイナリポンプ、サンプルオーガナイザー、カラムヒーター（５５℃に設定）、ダイオードアレイ検出器（ＤＡＤ）および下記の各方法で明記するカラムを備えるＡｃｑｕｉｔｙ ＵＰＬＣ（Ｗａｔｅｒｓ）システムを使用して実施した。カラムからの流れを分割して、ＭＳスペクトロメーターに送った。ＭＳ検出器はエレクトロスプレーイオン源と共に構成した。質量スペクトルを、０．０２秒のデータ収集時間（ｄｗｅｌｌ ｔｉｍｅ）を使用し、０．１８秒で１００〜１０００の走査を行うことにより取得した。キャピラリーニードル電圧を３．５ｋＶとし、イオン源温度を１４０℃に維持した。窒素をネブライザーガスとして使用した。逆相ＵＰＬＣ（超高速液体クロマトグラフィー）を、架橋エチルシロキサン／シリカハイブリッド（ＢＥＨ）Ｃ１８カラム（１．７μｍ、２．１×５０ｍｍ；Ｗａｔｅｒｓ Ａｃｑｕｉｔｙ）で、流速０．８ｍｌ／分で行った。２つの移動相（Ｈ_２Ｏ中１０ｍＭ酢酸アンモニウム／アセトニトリル９５／５；移動相Ｂ：アセトニトリル）を使用して、１．３分間で９５％Ａおよび５％Ｂから５％Ａおよび９５％Ｂへの勾配条件を実行し、０．３分間保持した。注入量０．５μＬを使用した。コーン電圧は、正イオン化モードの場合１０Ｖ、負イオン化モードの場合２０Ｖとした。

式（Ｉ）の化合物の生物学的活性
生物学的アッセイの説明
ＴＬＲ７およびＴＬＲ８活性の評価
化合物がヒトＴＬＲ７および／またはＴＬＲ８を活性化する能力を、ＴＬＲ７またはＴＬＲ８発現ベクターおよびＮＦκＢ−ｌｕｃレポーター構築物で一過的にトランスフェクトされたＨＥＫ２９３細胞を使用して、細胞レポーターアッセイで評価した。

簡潔に述べると、ＨＥＫ２９３細胞を、培養培地（１０％ＦＣＳおよび２ｍＭグルタミンが補充されたＤＭＥＭ）中で成長させた。１０ｃｍ皿内での細胞のトランスフェクションのために、細胞をトリプシン−ＥＤＴＡで剥がし、ＣＭＶ−ＴＬＲ７またはＴＬＲ８プラスミド（７５０ｎｇ）と、ＮＦκＢ−ｌｕｃプラスミド（３７５ｎｇ）と、トランスフェクション試薬との混合物でトランスフェクトし、加湿した５％ＣＯ_２雰囲気中３７℃で終夜インキュベートした。次に、トランスフェクトされた細胞をトリプシン−ＥＤＴＡで剥がし、ＰＢＳ中で洗浄し、１．６７×１０^５個の細胞／ｍＬの密度で培地に再懸濁させた。次に、３０マイクロリットルの細胞を、４％ＤＭＳＯ中１０μＬの化合物が既に存在する、３８４ウェルプレートの各ウェル中に計量分配した。３７℃、５％ＣＯ_２で６時間インキュベートした後、１５μｌのＳｔｅａｄｙ Ｌｉｔｅ Ｐｌｕｓ基質（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）を各ウェルに添加することによって、ルシフェラーゼ活性を測定し、ＶｉｅｗＬｕｘ ｕｌｔｒａＨＴＳマイクロプレートイメージャー（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）で読み取りを実施した。４通りに実施した測定値から用量反応曲線を作成した。アッセイの標準偏差より少なくとも２倍高い効果を誘発する濃度として定義される最低有効濃度（ＬＥＣ）値を、各化合物について求めた。

３８４ウェルプレート中で、ＣＭＶ−ＴＬＲ７構築物のみ（１．６７×１０^５個の細胞／ｍＬ）でトランスフェクトされた、ウェル当たり３０μＬの細胞とともに、同様の希釈系列の化合物を使用して、化合物の毒性を、並行して決定した。ウェル当たり１５μＬのＡＴＰ ｌｉｔｅ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）を添加し、ＶｉｅｗＬｕｘ ｕｌｔｒａＨＴＳマイクロプレートイメージャー（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）で読み取ることによって、３７℃、５％ＣＯ_２で６時間インキュベートした後の細胞生存率を測定した。データをＣＣ_５０として報告した。

並行して、ＮＦκＢ−ｌｕｃレポーター構築物のみ（１．６７×１０^５個の細胞／ｍＬ）でトランスフェクトされた、ウェル当たり３０μＬの細胞とともに、同様の希釈系列の化合物（４％ＤＭＳＯ中１０μＬの化合物）を使用した。３７℃、５％ＣＯ_２で６時間インキュベートした後、１５μｌのＳｔｅａｄｙ Ｌｉｔｅ Ｐｌｕｓ基質（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）を各ウェルに添加することによって、ルシフェラーゼ活性を測定し、ＶｉｅｗＬｕｘ ｕｌｔｒａＨＴＳマイクロプレートイメージャー（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）で読み取りを実施した。カウンタースクリーンデータをＬＥＣとして報告した。

ＩＳＲＥプロモーターエレメントの活性化
ＰＢＭＣから調整培地によるインターフェロン刺激応答エレメント（ＩＳＲＥ）の活性化を測定することにより、化合物のＩＦＮ−Ｉ誘導能力も評価した。配列ＧＡＡＡＣＴＧＡＡＡＣＴのＩＳＲＥエレメントはＳＴＡＴ１−ＳＴＡＴ２−ＩＲＦ９転写因子に対する応答性が高く、それはＩＦＮ−Ｉがその受容体ＩＦＮＡＲ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，ＰＴ３３７２−５Ｗ）に結合すると活性化される。Ｃｌｏｎｔｅｃｈ製のプラスミドｐＩＳＲＥ−Ｌｕｃ（ｒｅｆ．６３１９１３）は、このＩＳＲＥエレメントを５コピー、その後、ホタルルシフェラーゼＯＲＦを含有する。ｐＩＳＲＥ−Ｌｕｃで安定トランスフェクションを行ったＨＥＫ２９３細胞株（ＨＥＫ−ＩＳＲＥｌｕｃ）を、調整ＰＢＭＣ細胞培養培地のプロファイルに合うように樹立した。

簡潔に述べると、標準的なＦｉｃｏｌｌ遠心分離プロトコルを使用して、少なくとも２供与体の軟膜からＰＢＭＣを調製した。単離されたＰＢＭＣを、１０％ヒトＡＢ血清が補充されたＲＰＭＩ培地に再懸濁させ、２×１０^５個の細胞／ウェルを、化合物（７０μＬの全体積）を含有する３８４ウェルプレート中に計量分配した。終夜インキュベートした後、３０μＬ中５×１０^３ＨＥＫ−ＩＳＲＥｌｕｃ細胞／ウェルの入った（前日に播種した）３８４ウェルプレートに上清１０μＬを移した。２４時間インキュベートした後、４０μＬ／ウェルのＳｔｅａｄｙ Ｌｉｔｅ Ｐｌｕｓ基質（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）を使用してルシフェラーゼ活性をアッセイすることによって、ＩＳＲＥエレメントの活性化を測定し、ＶｉｅｗＬｕｘ ｕｌｔｒａＨＴＳマイクロプレートイメージャー（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）で測定した。ＨＥＫ−ＩＳＲＥｌｕｃ細胞に対する各化合物の刺激活性をＬＥＣ値として報告したが、これはＰＢＭＣに適用するとアッセイの標準偏差を少なくとも２倍上回るルシフェラーゼ活性が得られる化合物濃度と定義された。ここで、ＬＥＣは、規定量のＰＢＭＣ培養培地の移入に対するＩＳＲＥ活性化の程度を示す。組み換えインターフェロンα−２ａ（Ｒｏｆｅｒｏｎ−Ａ）を標準対照化合物として使用した。

表２。式（Ｉ）の化合物の活性。上記のＨＥＫ２９３ＮＦ−ｋＢカウンタースクリーンアッセイにおいて、どの化合物にも活性は見られなかった（ＬＥＣ＞２５μＭ）。

Claims (7)

1. 式（Ｉ）の化合物
   
   （式中、
   Ｒ_１は、Ｈ、フッ素またはメチルであり、
   Ｒ_２は、Ｈ、ハロゲンまたはＣ_１〜３アルキルでありＲ_３は、アリールで任意選択的に置換されたＣ_１〜６アルキルであり、前記アリールは、アリールオキシ、ハロゲン、アリール、アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、Ｃ_１〜６アルキル、カルボン酸、カルボン酸エステル、カルボン酸アミド、ニトリル、またはＣ_１〜６アルコキシから独立に選択される１つまたは複数の置換基で任意選択的にさらに置換されており、または、
   Ｒ_３は、Ｃ_１〜６アルケン、Ｃ_３〜７シクロアルキルまたはＣ_３〜７ヘテロシクロアルキルで任意選択的に置換されたＣ_１〜６アルキルであり、または、
   Ｒ_３は、Ｃ_１〜６アルコキシで任意選択的に置換されたＣ_１〜６アルキルであり、前記Ｃ_１〜６アルコキシは、アリールで任意選択的にさらに置換されており、
   Ｒ_４は、ヒドロキシル、Ｃ_１〜６アルコキシ、Ｃ_１〜６アルキル、Ｃ_３〜７シクロアルキル、Ｃ_２〜６アルケニル、アリール、ヘテロアリールから独立に選択される１つまたは複数の置換基で任意選択的に置換されたＣ_１〜８アルキルであり、前記ヘテロアリールは、Ｃ_１〜６アルキルで任意選択的にさらに置換されており、前記Ｃ_３〜７シクロアルキルは、Ｃ_１〜６アルキルで任意選択的にさらに置換されているが、
   ただし、２−アミノ，４−（Ｎ−ブチルアミノ）−５−（αメチルベンジル）ピロロ［３，２−ｄ］ピリミジンを除外することを条件とする）
   およびその薬学的に許容できる塩、溶媒和物または多形体。
2. Ｒ_３がアリール（置換または非置換）で置換されたメチル基であり、Ｒ_１、Ｒ_２およびＲ_４が請求項１に記載のとおりである、請求項１に記載の式（Ｉ）の化合物。
3. Ｒ_３およびＲ_４がアリールで置換されたＣ_１〜３アルキルであり、前記アリールが請求項１に記載のとおり任意選択的にさらに置換されている、請求項１に記載の式（Ｉ）の化合物。
4. Ｒ_１がフッ素であり、Ｒ_２が水素であり、Ｒ_３およびＲ_４が請求項１に記載のとおりである、請求項１に記載の式（Ｉ）の化合物。
5. 請求項１に記載の式（Ｉ）の化合物またはその薬学的に許容できる塩、溶媒和物もしくは多形体を、１種または複数種の薬学的に許容できる賦形剤、希釈剤または担体とともに含む医薬組成物。
6. 薬剤として使用するための、請求項１に記載の式（Ｉ）の化合物またはその薬学的に許容できる塩、溶媒和物もしくは多形体、または式（Ｉ）の前記化合物またはその薬学的に許容できる塩、溶媒和物もしくは多形体を含む請求項５に記載の医薬組成物。
7. ＴＬＲ７および／またはＴＬＲ８の調節が関与するいずれの障害の処置にも使用するための、請求項１に記載の式（Ｉ）の化合物またはその薬学的に許容できる塩、溶媒和物もしくは多形体、または式（Ｉ）の前記化合物またはその薬学的に許容できる塩、溶媒和物もしくは多形体を含む請求項５に記載の医薬組成物。