JP2012504252A - 構造化照明を備えた顕微鏡法のための改良された方法および装置 - Google Patents
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Abstract
Description
有利な実施形態は、従属請求項に記載される。
本発明の中心は、問題のある試料であっても最終画像において可能な限り最高の解像度に達するために、個別画像内に含まれる生データを最適化することにある。このような最適化は、本発明に基づいて、異なる方法で達成される。
本発明に基づく方法は比較的時間がかかるので、撮像中に測定中止基準をテストしたり、測定しながら表示したり、または測定中止基準を満足したときに撮像を中止する、または少なくとも簡略化することが有利である。簡略化としては、たとえば、中間画像または個別画像によるフィードバックに基づいて、励起時に十分なレベルの非線形性が達成されないと計算された場合、SPEM法の測定中に純粋なSIM法の測定に切り替えることができる。
抑制光は、1または数MW/cm2のエネルギー密度で使用するのが有用である。これまでに実施された実験およびシミュレーションは、有効な抑制には、抑制放射のこのように高い強度値が必要であることを示している。このような強度はライン状の照明によって達成されるのが好ましい。
本発明に基づいてさらに、少なくとも1つの参照画像に基づいて、個別画像の光学的収差の範囲を計算し、そして最終画像を再構成する前に、計算された範囲に対応して個別画像を計算によって修正することによっても、再構成の精度、したがって達成可能な解像度を改善できることが確認された。ここでも、まさに構造化の結果として生じる画像特性を、修正のために利用し得ることが有利である。
その際、ライン照明の強度は、撮影しているカメラのダイナミック・レンジを完全に制御するように適合されるのが有利であり、その際、強度は行毎に記憶される。高いダイナミック・レンジは、高い信号雑音比、したがって高い達成可能な解像度を意味する。
以下、例示的実施形態に関して本発明を詳細に説明する。
図1は、本発明に基づいて改良されたSIM法およびSPEM法を使用することができる、広視野蛍光顕微鏡法用の例示的構成のビーム経路を模式図で示す。試料2が、位置決め可能な試料ホルダ3上に、顕微鏡対物レンズ5の前方に取り付けられている。本明細書にその開示内容を全面的に援用する独国特許出願公開第102007047466号明細書に基づく、位相構造を有するマスクが、たとえば試料2の上部または内部に構造化された光分布を生じるために、構造化モジュール7として、顕微鏡対物レンズOLの瞳9近傍またはこれと共役な平面内に配置されている。構造化モジュール7のマスクはアクチュエータ17によって可動であり、ここではマスクを回転させるためのステップモータまたはリニア駆動部であり得る。ここでは、ステップモータは直接、またはギアもしくはその他の機械ユニットを介して間接的に駆動することができる。撮像部19、たとえばLCDが、時間・空間的光モジュレータとして、結像レンズTLBによって生成され試料面に共役な中間画像面ZB内にある。光源LQは素子19を照明するが、この光源LQはたとえばレーザ、LED、高圧水銀灯または従来の白熱灯とすることができる。オプションでコリメーション光学系27を追加的に設けることもできる。光源LQは、単色のものであってもよく、または複数の波長を同時に、または時間的に順次に放出するものでもよい。本発明の好ましい実施形態では、構造化モジュール7の位相マスクが、対物レンズの瞳9内またはその近傍にある。多くの顕微鏡対物レンズにおいては、瞳には直接アクセスできないという構造的な制約がある。しかしながら、この場合は自由にアクセスできる中間画像面にリレー光学系(英語:relay optics)によって中間結像を行うことができ、この中間画像面の近傍に構造化モジュール7の位相マスクを配置することができる。位相マスク7が瞳面からどれだけ離れているかに応じて、個々の回折次数の直径は瞳面に対する間隔とともに拡大される。撮像部19により、光源LQから放出された光は、一方では、時間的に蛍光励起のためのパルス・シーケンスに分割され、他方では、光軸を横切って二次元的にピクセルに分割され得る。さらに、結像レンズTLDの後方には、空間解像性検出野32、たとえばCCDが撮像用カメラとして設けられている。ここで説明した蛍光検出用構成においては、蛍光光から励起光を分離するためのメイン・カラースプリッタ33、ならびに発光フィルタEFが設けられている。
3 試料ホルダ
5 顕微鏡対物レンズ
7 構造化モジュール
9 瞳
17 アクチュエータ
19 撮像部
20 コリメーション光学系
21 顕微鏡対物レンズ
22 試料
23 レーザ
24 光弁
25 減衰部
26 ファイバ・カップラ
27 結像レンズ
28 フィルタ
29 二色性ビームスプリッタ
30 走査ミラー
31 アパチャ
32 検出野
33 メイン・ビームスプリッタ
34 制御ユニット
D 検出モジュール
MI 顕微鏡
L 照明モジュール
S 走査モジュール
LQ 光源
OL 顕微鏡対物レンズ
G 回析格子
M モジュレータ
TLB 照明側結像レンズ
TLD 検出側結像レンズ
ZB 中間画像面
EF 発光フィルタ
DMD デジタル顕微鏡野
SLM 空間光モジュレータ
SM_P 瞳面のファイバベース構造化モジュール
Claims (39)
- 顕微鏡を使用して、蛍光色素で標識された試料を高解像度で結像するための方法であって、
該試料が複数の位相において、構造化及びパルス化された励起光によって順次照明され、該試料から放出された蛍光光が、位相毎に、各々構造化された個別画像において受光されることにより、複数の該個別画像から最終画像が高解像度で再構成される方法において、
少なくとも1つの照明パラメータおよび少なくとも1つの撮像パラメータのうちの少なくとも一方、特に、照明の波長、照明のパルス・シーケンス、撮像の波長領域、撮像の露光時間、および撮像の強さのうち少なくとも1つの値について、最適調整が決定されることを特徴とする方法。 - 前記パラメータの前記最適調整が、前記個別画像に基づく、追加的な中間画像に基づく、または蛍光光の小部分を脱結合するポイント検出器の信号に基づくフィードバックによって、かつ該パラメータの変動によって決定される、請求項1に記載の方法。
- 前記パラメータの変動が、前記励起光の、本質的に一定な平均強度において行われる、請求項2に記載の方法。
- 前記パラメータの前記最適調整を決定するために、照明および撮像のシミュレーションが実行される、請求項1に記載の方法。
- 前記調整時に、中間画像、個別画像、または最終画像内で、最大の信号雑音比または少なくとも1つの所定の信号雑音比が生じる場合に、調整が最適であると決定される、請求項1乃至4のいずれか1項に記載の方法。
- 前記最適調整を決定する際に、さらなる最適化標的の所定の重み付けが、信号雑音比のための重み付けと並んで考慮される、請求項5に記載の方法。
- 前記蛍光光が、前記個別画像を撮像する際の繰り返し周波数にほぼ対応する繰り返し周波数で中間画像において受光されることを特徴とする、請求項2乃至6のいずれか1項に記載の方法。
- 前記蛍光光の中間画像における前記受光が、前記個別画像の前記撮像時より顕著に高い繰り返し周波数で行われることを特徴とする、請求項2乃至6のいずれか1項に記載の方法。
- 前記中間画像に基づいて、撮像部により、パルス・シーケンスが局部的に、特にピクセルごとに変動する、請求項8に記載の方法。
- 同一の撮像部を用いて前記励起光が構造化される、請求項9に記載の方法。
- 前記個別画像が、前記最終画像の再構成前に、前記パルス・シーケンスの変動に応じてその強度が修正されることを特徴とする請求項1乃至10のいずれか1項に記載の方法。
- 前記撮像中に計測中止基準がテストされ、該計測中止基準が満たされた場合に、該撮像が終了または簡略化される、請求項1乃至11のいずれか1項に記載の方法。
- 計測中止基準として、変調コントラストが所定のコントラスト閾値より小であるかどうか、または試料の移動距離が所定の移動閾値より大であるかどうかがテストされる、請求項12に記載の方法。
- パラメータの最適調整を決定するために、前記顕微鏡の対物レンズの液浸液に対する屈折率ミスマッチのない、100nmより薄い均質なマルチカラー色素フィルムの形態か、または200〜500nmの大きさのマルチカラー・ビーズを含むテスト試料の形態のテスト・プレパラートが使用される、請求項1乃至13のいずれか1項に記載の方法。
- 顕微鏡を使用して、蛍光色素で標識された試料を高解像度で結像するための方法であって、
該試料が複数の位相において、構造化及びパルス化された励起光によって順次照明され、該試料から放出された蛍光光が、位相毎に、各々構造化された個別画像において受光されることにより、複数の該個別画像から最終画像が高解像度で再構成される方法において、
該照明が、該蛍光光の(特に最低の)三重項状態からより高い三重項状態へと励起が減じるようなパルス・シーケンスで行われる、方法。 - 前記パルス・シーケンスが、前記励起光のパルス間に1マイクロ秒以上の励起ポーズを有することを特徴とする請求項15に記載の方法。
- 顕微鏡を使用して、蛍光色素で標識された試料を高解像度で結像するための方法であって、
該試料が複数の位相において、構造化及びパルス化された励起光によって順次照明され、該試料から放出された蛍光光が、位相毎に、各々構造化された個別画像において受光されることにより、複数の該個別画像から最終画像が高解像度で再構成される、特に請求項1乃至16のいずれか1項に記載の方法において、
前記蛍光色素の(特に最低の)三重項状態を空乏化するために、該試料が追加的に抑制光によって照明されること特徴とする方法。 - 前記抑制光が、前記励起光と同様の方法で構造化されることを特徴とする請求項17に記載の方法。
- 抑制光が、1MW/cm2以上のエネルギー密度で使用されることを特徴とする請求項17または18に記載の方法。
- 顕微鏡を使用して、蛍光色素で標識された試料を高解像度に結像するための方法であって、
該試料が複数の位相において、構造化及びパルス化された励起光によって順次照明され、かつ、該試料から放射された蛍光光が、位相毎に、各々構造化された個別画像において受光されることにより、複数の該個別画像から最終画像が高解像度で再構成される、特に請求項1乃至19のいずれか1項に記載の方法において、
中間画像が撮像され、該中間画像に基づいて、照明によって生じる前記蛍光色素の退色範囲が決定されるとともに、前記最終画像の再構成前に、前記個別画像が決定された範囲に応じて計算により修正される、方法。 - 前記個別画像の撮像前に前記中間画像が、または2枚の個別画像の間にそれぞれ1枚の中間画像が撮像され、前記試料が構造化され、または一様に照明される、請求項20に記載の方法。
- 前記中間画像が、前記個別画像よりも高い繰り返し周波数で撮像され、前記蛍光光の強度低下による退色がピクセルごとに決定される、請求項20または21に記載の方法。
- 前記退色の前記計算による修正が、フーリエ空間内で行われる、請求項20乃至22のいずれか1項に記載の方法。
- 顕微鏡を使用して、蛍光色素で標識された試料を高解像度で結像するための方法であって、
該試料が複数の位相において、構造化及びパルス化された励起光によって順次照明され、該試料から放出された蛍光光が、位相毎に、各々構造化された個別画像において受光されることにより、複数の該個別画像から最終画像が高解像度で再構成される、特に請求項1乃至23のいずれか1項に記載の方法において、
少なくとも1つの参照画像に基づいて、前記個別画像の光学収差の範囲が決定され、前記最終画像の再構成前に、前記個別画像が決定された範囲に応じて計算により修正される、方法。 - 前記収差の範囲が、構造化パターンの歪み、特に変形および空間的位相変化のうちの少なくとも一方に基づいて決定される、請求項24記載の方法。
- 前記参照画像の撮像用に、前記個別画像の撮像用よりも小さい構造化空間周波数を有する参照励起光が使用される、請求項24または25に記載の方法。
- 前記励起光の構造化が、3次元回折次数を用いて行われ、3つすべての回折次数の干渉の空間周波数をわずかに上回る空間周波数をフィルタリングすることによって前記参照画像が決定されることを特徴とする請求項24乃至26のいずれか1項に記載の方法。
- 蛍光励起が、励起強度と蛍光強度が非線形の関係となるように実行されることを特徴とする請求項1乃至27のいずれか1項に記載の方法。
- 光切り替え可能な蛍光色素が使用され、pH値および試料の固定のうちの少なくとも一方が、前記蛍光光の切り替えコントラストについて最適化される、請求項28に記載の方法。
- 前記個別画像の撮像用の前記照明が、局部的に、特にピクセルごとに変動する、請求項29に記載の方法。
- 前記構造化が、その変調周波数を何倍かした周波数でもなお前記顕微鏡の顕微鏡対物レンズの透過領域内に含まれるような低い変調周波数によって実行され、前記試料内における高調波の振幅が、決定され、パラメータの最適調整用、特に照明の波長、照明のパルス・シーケンス、撮像の波長領域、撮像の露光時間、および撮像の強さのうち少なくとも1つの値の最適調整用の基準として使用される、請求項29に記載の方法。
- 顕微鏡を使用して、蛍光色素で標識された試料を高解像度で結像する方法であって、
該試料が複数の位相において、構造化及びパルス化された励起光によって順次、励起強度と蛍光強度との間に非線形の関係が生じるように照明され、該試料から放出された蛍光光が、位相毎に、各々構造化された個別画像において受光されることにより、該個別画像から、該非線形の関係を考慮した上でより高解像度の最終画像が再構成可能である請求項1乃至31のいずれか1項に記載の方法において、
該試料に含まれる、励起された蛍光色素と化学的に反応可能な遊離基が、該蛍光色素および該試料のうちの少なくとも一方の周囲から化学的に除去される、方法。 - 前記遊離基を除去するために、前記遊離基が酵素によって解放されることを特徴とする請求項32に記載の方法。
- 前記試料が、構造化されたライン照明によって励起される、請求項1乃至33のいずれか1項に記載の方法。
- 前記ライン照明の強度が、撮影するカメラのダイナミック・レンジが十分にレベル調整されるように適合され、該強度が行ごとに記憶される、請求項34に記載の方法。
- 前記蛍光光が共焦点で検出される、請求項1乃至35のいずれか1項に記載の方法。
- 請求項1乃至36のいずれか1項に記載の方法請求項を実施するために設けられたコンピュータ・プログラム。
- 請求項1乃至36のいずれか1項に記載の方法請求項を実施するために設けられた制御ユニット。
- 請求項38に記載の制御ユニットを備えた顕微鏡、特にレーザ走査顕微鏡。
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