DE102017109645A1 - Lichtmikroskop und Verfahren zum Bereitstellen von strukturiertem Beleuchtungslicht - Google Patents

Abstract

Ein Lichtmikroskop umfasst: eine Einrichtung zur strukturierten Beleuchtung, welche einen Wellenleiterchip zum Bereitstellen von strukturierter Beleuchtung umfasst; eine Eingangsauswahlvorrichtung zum variablen Leiten von Licht zu einem von mehreren Eingängen des Wellenleiterchips; wobei der Wellenleiterchip außerdem einen Lichtleitpfad hinter jedem der Eingänge umfasst; wobei sich jeder Lichtleitpfad in mehrere Pfadabschnitte teilt; und wobei jeder Pfadabschnitt zu einem Ausgang des Wellenleiterchips führt. Die Ausgänge des Wellenleiterchips können in einer Pupillenebene des Lichtmikroskops angeordnet sein und eine Austrittsrichtung von Licht aus den Ausgängen ist quer zu einer Ebene, die durch den Wellenleiterchip definiert wird. Ein Verfahren zum Bereitstellen von strukturiertem Beleuchtungslicht unter Verwendung des Lichtmikroskops wird auch beschrieben.

Description

• Die vorliegende Offenbarung betrifft ein Lichtmikroskop mit den Merkmalen des Oberbegriffs des Anspruchs 1. Das Lichtmikroskop ist dazu eingerichtet, Licht einer Lichtquelle in strukturierte Beleuchtung umzuwandeln.
• Die vorliegende Offenbarung betrifft außerdem ein Verfahren zum Bereitstellen von strukturiertem Beleuchtungslicht mit den Merkmalen des Oberbegriffs des Anspruchs 17.
• Die Mikroskopie mit strukturierter Beleuchtung (SIM, englisch: Structured Illumination Microscopy) ist eine etablierte Technik zum Untersuchen einer Probe mit besonders hoher Auflösung. Allgemein kann als strukturierte Beleuchtung eine beliebige Lichtverteilung angesehen werden, welche über einen Querschnitt inhomogen ist. Beispielsweise kann eine strukturierte Beleuchtung eine oder mehrere Streifen, ein Gittermuster oder bloß einen Fleck mit ungleichförmigem Intensitätsprofil umfassen. Diese Muster werden in einer Probenebene erzeugt.
• Wenn mehrere Bilder mit unterschiedlichen Mustern strukturierter Beleuchtung aufgezeichnet werden, ist es möglich, aus diesen Bildern ein Bild mit erhöhter Auflösung zu berechnen. Typischerweise werden neun oder mehr Bilder (welche als Rohbilder oder als ein Frame bezeichnet werden) aufgenommen, aus welchen ein hochauflösendes Bild berechnet wird. Diese Rohbilder unterscheiden sich in der Rotationsausrichtung der strukturierten Beleuchtung und in einer Phasenänderung der strukturierten Beleuchtung. Die erhöhte Auflösung kann besser sein als eine Beugungsgrenze oder das Abbe-Limit für die verwendeten Wellenlängen. Es ist allgemein zweckdienlich, wenn die verschiedenen Muster strukturierter Beleuchtung gleich, aber zueinander gedreht sind.
• In dem Kontext dieser Offenbarung ist eine strukturierte Beleuchtung nicht auf die etablierte SIM-Technik beschränkt, sondern kann auch für verwandte Techniken verwendet werden, wie zum Beispiel Synthetic Aperture Imaging, wobei andere Muster strukturierter Beleuchtung zur Probenuntersuchung eingesetzt werden können.
• Bei vielen herkömmlichen Herangehensweisen wird ein strukturiertes Element in einer Zwischenbildebene angeordnet. Das strukturierte Element kann beispielsweise ein Gitter sein. Dieses Gittermuster wird daher in die Probenebene abgebildet. Zum Aufzeichnen verschiedener Bilder kann das strukturierte Element gedreht werden. Alternativ kann ein Bildfelddreher in den Strahlengang eingeführt und/oder kann gedreht werden. Es ist auch möglich, verschieden orientierte Muster in der Probenebene zu erzeugen, indem mehrere verschiedene strukturierte Elemente verwendet werden, welche abwechselnd in den Strahlengang eingeführt werden. Diese Herangehensweisen erfordern Drehungen oder Bewegungen von verhältnismäßig großen und schweren Komponenten, wie zum Beispiel von dem strukturierten Element oder einem Bildfelddreher. Solche Bewegungen stellen erhebliche Geschwindigkeitsbeschränkungen dar.
• Eine vorteilhafte Lösung zum Verringern des Zeitbedarfs beim Aufnehmen mehrerer Bilder ist von der Anmelderin in DE 10 2007 047 466 A1 und in DE 10 2012 020 877 A1 beschrieben. Jede dieser Anmeldungen offenbart eine Optikanordnung, bei welcher eine strukturierte Beleuchtung nicht erzeugt wird, indem ein strukturiertes Element in einer Zwischenbildebene angeordnet würde. Stattdessen wird ein Punktlichtmuster oder Lichtfleckmuster in einer Fokusebene erzeugt. Dieses Muster in der Fokusebene führt über eine Fourier-Transformation zu einem anderen strukturierten Muster in der Probenebene. Daher kann ein Punktlichtmuster zu einem Streifen- oder Gittermuster führen, wie es von einem Gitter in einer Zwischenbildebene erzeugt würde.
• In DE 10 2007 047 466 A1 werden die verschiedenen Punktmuster durch optische Fasern erzeugt, welche Licht über Mikrolinsen oder weitere optische Elemente in die Pupillenebene führen. Abhängig davon, welche optischen Fasern beleuchtet werden, können verschiedene Punktmuster in der Pupillenebene erzeugt werden.
• Ein gattungsgemäßes Lichtmikroskop, wie auch in DE 10 2012 020 877 A1 beschrieben, umfasst:
• - eine Einrichtung zur strukturierten Beleuchtung, welche aus auftreffendem Licht eine strukturierte Beleuchtung bereitstellt, wobei die Einrichtung zur strukturierten Beleuchtung einen Wellenleiterchip mit mehreren Eingängen umfasst;
• - eine Eingangsauswahlvorrichtung zum variablen Leiten von Licht zu einem der Eingänge;
• - wobei der Wellenleiterchip außerdem jeweils einen Lichtleitpfad hinter jedem der Eingänge umfasst, wobei jeder Lichtleitpfad sich in mehrere Pfadabschnitte teilt, und wobei jeder Pfadabschnitt zu einem Ausgang des Wellenleiterchips führt.
• Ein gattungsgemäßes Verfahren zum Bereitstellen von strukturiertem Beleuchtungslicht in einem Lichtmikroskop umfasst die folgenden Schritte:
• - Leiten von Licht einer Lichtquelle zu einer Eingangsauswahlvorrichtung;
• - variables Leiten von Licht mittels der Eingangsauswahlvorrichtung zu einem von mehreren Eingängen eines Wellenleiterchips, welcher eingerichtet ist zum Bereitstellen von strukturierter Beleuchtung aus auftreffendem Licht;
• - wobei der Wellenleiterchip außerdem jeweils einen Lichtleitpfad hinter jedem der Eingänge umfasst, wobei jeder Lichtleitpfad sich in mehrere Pfadabschnitte teilt; und wobei jeder Pfadabschnitt zu jeweils einem Ausgang des Wellenleiterchips führt.
• Bei einem gattungsgemäßen Lichtmikroskop wird also als ein strukturiertes optisches Element nicht ein Gitter oder ein anderes strukturiertes Element in einer Zwischenbildebene verwendet. Stattdessen wird ein Wellenleiterchip verwendet: solch ein Chip umfasst ein Substrat, beispielsweise Quarzglas, in welchem Lichtleitpfade oder Pfadabschnitte gebildet sind. Ein Material von solchen Pfaden hat einen anderen Brechungsindex als das umgebende Substrat. Dies kann beispielsweise erreicht werden, indem das Substrat an Bereichen, in welchen die Pfade gebildet sein sollen, dotiert wird.
• Mit der eingangs genannten Auswahlvorrichtung können die verschiedenen Eingänge einer nach dem anderen beleuchtet werden. Indem jeder Lichtleitpfad sich in mehrere Pfadabschnitte teilt, ist es möglich, kohärentes Licht durch mehrere Ausgänge (welche zu demselben Eingang gehören), gleichzeitig zu strahlen. Das Aufteilen von Licht aus einem Pfad in die Pfadabschnitte erfordert nicht irgendein (bewegbares) Schaltelement in oder an dem Wellenleiterchip. Ein Pfadabschnitt kann daher definiert sein als einer von mehreren Pfaden in dem Wellenleiterchip, welche mit einem Lichtleitpfad verbunden sind. Licht, welches sich in diesem Lichtleitpfad ausbreitet, wird sich auf die genannten mehreren Pfade aufteilen, welche daher als Pfadabschnitte bezeichnet werden.
• DE 10 2012 020 877 A1 verwendet optische Fasern, welche mit den Ausgängen verbunden sind, um Licht zu einer Pupillenebene zu leiten. Die Enden der optischen Fasern sind in der Pupillenebene in einem gewünschten Punktmuster angeordnet. Dieses Punktmuster wird zu dem gewünschten Muster strukturierter Beleuchtung in der Bildebene gewandelt.
• Bekannte Techniken zum Erzeugen von Punktmustern in einer Pupillenebene erfordern jedoch einen anspruchsvollen und kostenintensiven Aufbau: der Einsatz von optischen Fasern, deren Enden in der Pupillenebene angeordnet sind, stellt hohe Anforderungen an die Positioniergenauigkeit, wobei die Langzeitstabilität ein Problem darstellen kann. Außerdem müssen Schwankungen in den Faserlängen aufgrund der Kohärenzlänge des Laserlichts minimal sein.
• Es kann daher als eine Aufgabe der Erfindung angesehen werden, ein Lichtmikroskop und ein Verfahren zum Bereitstellen von strukturiertem Beleuchtungslicht anzugeben, welche eine möglichst hohe Stabilität bieten, bei gleichzeitig verringerter Komplexität im Aufbau.
• Diese Aufgabe wird gelöst durch das Lichtmikroskop mit den Merkmalen des Anspruchs 1 sowie durch das Verfahren mit den Merkmalen des Anspruchs 17. Varianten des Lichtmikroskops und des Verfahrens sind in den abhängigen Ansprüchen und der folgenden Beschreibung angegeben.
• Gemäß der Erfindung ist das oben beschriebene gattungsgemäße Lichtmikroskop dadurch gekennzeichnet, dass eine Austrittsrichtung von Licht aus den Ausgängen quer steht zur einer Ebene, die durch den Wellenleiterchip definiert wird. Dies ermöglicht, die Ausgänge an genau denjenigen Positionen zu bilden, welche für ein bestimmtes Punktmuster in oder nahe einer Pupillenebene gewünscht sind. Es ist daher nicht notwendig, ein Lichtmuster, welches die Ausgänge verlässt, umzuordnen: DE 10 2012 020 877 A1 schlägt vor, hinter den Ausgängen optische Fasern zu benutzen, um Licht zu einer Pupillenebene zu leiten und ein Lichtmuster umzuordnen, das heißt die Enden der optischen Fasern (welche nicht dem Wellenleiterchip zugewandt sind) definieren das Lichtmuster in der Pupillenebene. Durch die vorliegende Erfindung wird es überflüssig, solche optischen Fasern zu verwenden, und daher werden alle Probleme vermieden, die mit einem korrekten Anordnen, der Genauigkeit und der Langzeitstabilität solch einer Anordnung an optischen Fasern verbunden sind. Stattdessen ermöglicht es die vorliegende Erfindung, den Wellenleiterchip so zu positionieren, dass dessen Ausgänge an einer Pupillenebene des Lichtmikroskops angeordnet sind. Eine wesentliche Eigenschaft ist es, Licht quer zu einer Ebene, die durch den Wellenleiterchip definiert ist, auszukoppeln. Diese Ebene kann als aufgespannt durch die zwei längeren Seiten/Kanten des Wellenleiterchips angesehen werden, welche auch als Länge und Breite bezeichnet werden können, was bedeutet, dass Licht in eine Höhenrichtung des Wellenleiterchips ausgekoppelt wird. Alternativ kann die Ebene definiert sein als aufgespannt durch die Richtungen der Lichtleitpfade und der Pfadabschnitte. Die Ebene kann vorzugsweise parallel zu einer Pupillenebene sein.
• In anderen Worten ist eine Auskoppelrichtung von Licht quer zu einer Richtung der jeweiligen Lichtleitpfade/Pfadabschnitte, das heißt quer zu einer Ebene, die durch diese Pfade aufgespannt wird. Im Gegensatz zu Ausführungen des Stands der Technik, bei denen Lichtstrahlen den Wellenleiterchip an einer von dessen kleineren Seitenflächen verlassen, stellt die Erfindung einen Wellenleiterchip bereit, bei dem Licht an der größten Seite austritt, das heißt an der oben definierten Ebene. Die Auskoppelrichtung oder Austrittsrichtung ist quer zu dieser Ebene, was beliebige schräge Winkel umfasst und insbesondere senkrecht bedeuten kann, in welchem Falle die Ebene, die durch den Wellenleiterchip definiert ist, exakt in und parallel zu der Pupillenebene sein kann. Die Lichtleitpfade und die Pfadabschnitte können sich ebenfalls in oder parallel zu einer Pupillenebene des Lichtmikroskops erstrecken. Die schrägen Winkel können verstanden werden als beliebige Winkel zwischen 0° und 80° zu einer Normalen der Fläche oder irgendwelche Winkel zwischen 0° und 70° zu der Normalen der Ebene.
• Das oben beschriebene gattungsgemäße Verfahren ist dadurch gekennzeichnet, dass Licht die Ausgänge in einer Austrittsrichtung verlässt, welche quer zu einer Ebene steht, die durch den Wellenleiterchip definiert ist.
• Es kann bevorzugt sein, die Ausgänge des Wellenleiterchips an oder in der Region einer Pupillenebene des Lichtmikroskops anzuordnen. Ein Anordnen des Wellenleiterchips in der Region einer Pupillenebene kann so verstanden werden, dass die Pupillenebene die Ebene des Wellenleiterchips schneidet oder dass alternativ eine Entfernung von der Pupillenebene zu dem Wellenleiterchip kleiner ist als die größte Entfernung zwischen Lichtstrahlen, die den Wellenleiterchip durch dessen Ausgänge verlassen.
• Bei den Lösungen des Stands der Technik wird Licht an einer dünnen Seite des Wellenleiterchips ausgekoppelt, das heißt an einer Seite, die durch die Höhe und die Länge oder durch die Höhe und die Breite definiert wird. In dieser Weise ist es nicht möglich, die Ausgänge in einem geeigneten Muster für eine Pupillenebene zu bilden, womit ein Umordnen durch optische Fasern oder andere optische Elemente erforderlich ist.
• Ein Eingang des Wellenleiterchips kann angesehen werden als ein Bereich, an dem Licht in den Chip eingekoppelt wird. Eine optische Faser kann vorgesehen sein zum Leiten von Licht zu dem Eingang. Für jeden Eingang kann eine jeweilige optische Faser vorgesehen sein. Innerhalb des Wellenleiterchips grenzt jeder Eingang an einem Lichtleitpfad an oder ist mit einem solchen direkt verbunden. Der Eingang kann auch als eine Eintrittsfläche eines Lichtleitpfads an einer Außenseite des Wellenleiterchips angesehen werden.
• Die Eingangsauswahlvorrichtung kann eine beliebige Vorrichtung sein, welche dazu eingerichtet ist, Licht variabel auf verschiedene Strahlgänge zu leiten, welche zu den verschiedenen Eingängen führen. Die Eingangsauswahlvorrichtung kann insbesondere einen variablen Lichtablenker umfassen, beispielsweise einen Scanner zum Leiten von Licht auf einen der Eingänge. Beispielsweise kann der Scanner einen oder mehrere bewegbare Spiegel umfassen, beispielsweise Galvanometerspiegel oder ein mikroelektromechanisches System (MEMS). Ein Scanner bietet erhebliche Geschwindigkeitsvorteile, da der Scanner erheblich schneller sein kann als Bewegungen großen Komponenten, beispielsweise beim Bewegen eines Gitters, das in einer Zwischenbildebene angeordnet ist. Die Eingangsauswahlvorrichtung kann auch verschiedene Arten von Lichtablenkern umfassen, beispielsweise eine oder mehrere akustisch schaltbare Vorrichtungen, beispielsweise einen akustooptischen Deflektor. Im Allgemeinen kann auch ein variables Blockieren von Strahlengängen oder ein Ablenken von Licht abhängig von der Lichtpolarisation für die Eingangsauswahlvorrichtung verwendet werden.
• Jeder Ausgang kann so gestaltet sein, dass er Licht aus dem Wellenleiterchip heraus reflektiert. Zu diesem Zweck kann jeder Ausgang eine Schnittstelle umfassen, durch die Licht aus dem Wellenleiterchip durch totale interne Reflexion (TIR) abgelenkt wird. Die Schnittstelle kann als ein Außenflächenbereich des Wellenleiterchips angesehen werden und kann auch als ein TIR-Spiegel bezeichnet werden. Ein Substrat des Wellenleiterchips kann so geformt sein, dass ein geeigneter Winkel relativ zu einem Pfadabschnitt gebildet wird, um eine totale interne Reflexion zu bewirken. Die Schnittstelle kann durch eine Vertiefung oder eine Rille in dem Substrat gebildet sein. Die Vertiefung kann durch einen fokussierten lonenstrahl oder durch einen anderen lithographischen Vorgang erzeugt werden, wie später detaillierter beschrieben.
• Alternativ kann jeder Ausgang eine Schnittstelle zum Ablenken von Licht heraus aus dem Wellenleiterchip umfassen, wobei die Schnittstelle einen Spiegel umfasst. In diesem Fall kann jeweils eine Vertiefung in dem Substrat an jedem Pfadabschnitt gebildet sein und diese Vertiefung kann mit einem Spiegel versehen sein, um Licht von dem jeweiligen Pfadabschnitt aus dem Wellenleiterchip heraus zu reflektieren. Die Schnittstelle/der Spiegel kann so geformt sein, dass Licht nicht direkt aus dem Wellenleiterchip heraus reflektiert wird, sondern zunächst das Substrat durchquert und den Wellenleiterchip an einer Seite verlässt, welche der Schnittstelle/dem Spiegel gegenüberliegt.
• Jede Schnittstelle, das heißt die Oberfläche, an welcher Licht von den Pfadabschnitten reflektiert wird, kann in einem Winkel zwischen 20° und 70° gebildet sein, oder zwischen 40° und 50° zu der Ebene des Wellenleiterchips. Dies gewährleistet eine im Wesentlichen senkrechte Auskoppel- oder Austrittsrichtung relativ zu der genannten Ebene oder zumindest einen Winkel zu einer Normalen der Wellenleiterchipebene, welcher genügend klein ist, so dass Licht, welches den Wellenleiterchip verlässt, nicht eine folgende Linse oder andere optische Komponente verfehlt.
• Anstelle einer reflektierenden Oberfläche (Schnittstelle) zum Umlenken eines Lichtstrahls von einem Pfadabschnitt in die Austrittsrichtung können die Pfadabschnitte auch jeweils eine gebogene Form haben. Die gebogene Form kann eine Kurve von 90° bilden oder allgemeiner zwischen 80° und 100°. Auch in dieser Weise ist eine Auskoppelrichtung im Wesentlichen senkrecht zu der Ebene, die durch die Lichtleitpfade/durch den Wellenleiterchip aufgespannt wird. Als ein Vorteil werden weniger zusätzliche Herstellungsschritte zum Bereitstellen der Auskoppelrichtung benötigt, verglichen mit den obigen Ausführungen. Die Abmessungen des Wellenleiterchips müssen jedoch ausreichend groß sein, um die gebogene Form oder die Kurve zu ermöglichen.
• Um die Ausgänge in einem gewünschten Muster zu formen, kann es notwendig sein, die Pfadabschnitte so zu bilden, dass zumindest einige Pfadabschnitte, welche zu verschiedenen Eingängen oder zu demselben Eingang gehören, sich gegenseitig schneiden/durchkreuzen. Es kann bevorzugt sein, dass einige oder alle der sich schneidenden Pfadabschnitte einander in einem Winkel schneiden, der zwischen 80° und 100° oder 90° oder größer als 90° oder 95° ist. Da es nicht vollständig vermieden werden kann, dass ein kleiner Anteil von Licht an einer Kreuzung von einem ersten Pfadabschnitt in einen zweiten Pfadabschnitt übergeht, gewährt ein Winkel von größer als 90°, dass Licht eher in die Rückwärtsrichtung in dem zweiten Pfadabschnitt gestreut wird und nicht in die Vorwärtsrichtung in den zweiten Pfadabschnitt gestreut wird; hierbei bezeichnet die Vorwärtsrichtung die Richtung zu dem jeweiligen Ausgang hin.
• Kreuzungen können alternativ vermieden werden, wenn Pfadabschnitte in drei Dimensionen gebildet werden, das heißt in verschiedenen Höhenebenen. Es ist möglich, solche Lichtleitpfade und Pfadabschnitte durch beispielsweise 2-Photonen-Absorption-Laserschreiben zu erzeugen, wobei das absorbierende Material/Substrat so geändert wird, dass sich dessen Brechungsindex ändert.
• Die Ausgänge, die zu demselben Eingang gehören, formen ein Punkt- oder Fleckmuster. Dieses Punktmuster in der Pupillenebene führt zu einem strukturierten Muster, beispielsweise Streifen, in der Probenebene. Der Wellenleiterchip kann drei oder mehr Eingänge umfassen, welchen jeweils Ausgänge zugeordnet sind, die ein jeweiliges Punktmuster formen. Diese Punktmuster können zueinander gleich oder identisch, aber zueinander gedreht sein. In dieser Weise kann eine Mikroskopie mit strukturierter Beleuchtung erzeugt werden, deren Auflösung in alle Richtungen erhöht ist. Die Punktmuster können zueinander identisch sein, wenn sie um einen gemeinsamen Mittelpunkt rotiert werden, welcher der optischen Achse des Mikroskops entsprechen kann. Der Mittelpunkt kann mit einem geometrischen Mittelpunkt der Punktmuster zusammenfallen.
• Die Punkte von jedem Punktmuster können geometrisch den Beugungsordnungen eines Gitters entsprechen, welches in einer Zwischenbildebene angeordnet ist. Ein zentraler Punkt entspricht der 0. Beugungsordnung. Zwei weitere Punkte, welche einander relativ zum zentralen Punkt direkt gegenüberliegen, entsprechen der 1. und der - 1. Beugungsordnung. Ein Punktmuster kann aus diesen drei Punkten bestehen oder nur aus Punkten, welche der 1. und der -1. Beugungsordnung entsprechen oder kann zusätzliche Punkte umfassen, welche weiteren Beugungsordnungen entsprechen. Es kann bevorzugt sein, dass die Punkte, die der 1. und der -1. Beugungsordnung entsprechen, eine größere Intensität haben als der zentrale Punkt, welcher der 0. Beugungsordnung entspricht.
• Ein Teiler teilt jeden Lichtleitpfad in zwei oder mehr Pfadabschnitte. Zwei oder mehr aufeinanderfolgende Teiler können vorgesehen sein, um das gewünschte Punktmuster zu erzeugen. Ein Teiler kann als ein sich weitender Bereich gebildet sein, welcher zu den Pfadabschnitten führt; Licht von dem Lichtleitpfad wird daher aufgeweitet und auf die Pfadabschnitte verteilt. Die Intensitäten in den einzelnen Pfadabschnitten können voneinander verschieden sein, insbesondere wie oben zu einem Punkt beschrieben, welcher der 0. Beugungsordnung entspricht, verglichen mit den anderen Punkten, welche anderen Beugungsordnungen entsprechen.
• Eine wichtige Eigenschaft ist die Wellenlängenabhängigkeit: Ein Pfadabschnitt sollte eine gewünschte Intensitätsverteilung unabhängig von der Wellenlänge des Lichts bereitstellen. Je länger die Wellenlänge ist, desto größer ist jedoch der Intensitätsanteil, der an einem Teiler zu den äußeren Pfadabschnitten geleitet wird. Zudem ist die Effizienz, mit welcher Licht an einen Teiler in einen Pfadabschnitt eingekoppelt wird, für die äußeren Pfadabschnitte kleiner. Daher können sich diese beiden Effekte teilweise kompensieren und die Wellenlängenabhängigkeit verkleinern. Damit diese Kompensation besonders wirkungsvoll ist, ist es bevorzugt, wenn jeder Lichtleitpfad mit einem Teiler verbunden ist, welcher in dem Wellenleiterchip gebildet und dazu eingerichtet ist, den Lichtleitpfad in vier Teile zu teilen, und wobei drei von diesen Teilen drei Pfadabschnitte darstellen und einer von diesen Teilen Licht so wegführt, dass Licht von diesem Teil nicht eine Probe beleuchtet. Eine solche Gestaltung ermöglicht es, dass zwei Pfadabschnitte die gleiche Intensität haben und dass ein Pfadabschnitt eine niedrigere Intensität hat, wobei eine Wellenlängenabhängigkeit verringert ist. Der vierte Teil, welcher nicht zum Beleuchten einer Probe verwendet wird, kann Licht gegen eine Wand oder einen anderen Absorber lenken oder in eine andere Richtung als die oben beschriebenen Ausgänge.
• Der Pfadabschnitt, der nicht zum Beleuchten einer Probe verwendet wird, kann Licht zu einem Photodetektor leiten. Signale von dem Photodetektor können insbesondere verwendet werden, um das Einkoppeln von Licht an den Eingängen des Wellenleiterchips zu überprüfen.
• Alternativ ist der Pfadabschnitt, welcher nicht zum Beleuchten einer Probe verwendet wird, mit einem Interferometer mit Phasenschieber (Phasenshifter) verbunden, zum Beispiel mit einem Mach-Zehnder-Interferometer, welche in dem Wellenleiterchip integriert sind. Diese Phasenschieber können identisch wie die anderen Phasenschieber in dem Wellenleiterchip gesteuert werden, beispielsweise kann eine gemeinsame Phasenschiebereinstellung für alle Phasenschieber vorgenommen werden, beispielsweise eine bestimmte Temperaturänderung. Das Interferometer misst die Phasenänderung, die durch diese Phasenschiebereinstellung verursacht wird. Ein Messwert des Interferometers ermöglicht es daher, eine Einstellung der Phasenschieber zu überprüfen und so anzupassen, dass eine gewünschte Phasenverschiebung erreicht wird.
• Licht eines Punktmusters, das heißt Licht von den Ausgängen, die zu demselben Eingang gehören, erzeugt ein Interferenzmuster in der Probenebene. Hierbei ist die Polarisation des Lichts wichtig. Ein Punktmuster kann drei oder mehr Punkte in einer Reihe umfassen, welche insbesondere einer -1., einer 0. und einer 1. Beugungsordnung eines Gitters in einer Zwischenbildebene entsprechen. Vorzugsweise ist Licht linear polarisiert in einer Richtung senkrecht zu der Reihe, in welcher die Punkte eines Punktmusters angeordnet sind.
• Es kann jedoch sein, dass die Effizienz der Teiler am höchsten ist, wenn die Polarisation von auftreffendem Licht innerhalb der Ebene liegt, die durch die Lichtleitpfade aufgespannt wird.
• Es kann daher bevorzugt sein, eine Polarisationseinrichtung (welche auch als Eingangspolarisationseinrichtung bezeichnet wird) vor dem Wellenleiterchip bereitzustellen, welche bewirkt, dass Licht, welches auf die Eingänge und damit auf die Teiler trifft, eine gewünschte Polarisation hat, insbesondere transversale magnetische Moden mit einer Polarisationsrichtung des elektrischen Felds innerhalb der Ebene, die durch die Lichtleitpfade aufgespannt wird.
• Grundsätzlich kann aber auch eine transversale elektrische Mode stattdessen benutzt werden. Für transversale magnetische Moden kann es bevorzugt sein, dass die Polarisationsrichtung nach den Teilern um 90° gedreht wird oder allgemeiner um einen Winkel gedreht wird, der zwischen 70° und 110° liegt. Hierzu kann eine Polarisationseinrichtung (welche auch als Ausgangspolarisationseinrichtung bezeichnet wird) verwendet werden, auf welche Licht von den Pfadabschnitten oder von den Ausgängen trifft. Die Ausgangspolarisationseinrichtung ist dazu eingerichtet, eine Polarisationsrichtung von auftreffendem Licht um den oben genannten Winkel zu drehen.
• Die Ausgangspolarisationseinrichtung kann insbesondere zwei Halbwellenplatten umfassen, welche hintereinander und relativ zueinander um 45° gedreht angeordnet sind. In dieser Weise wird die Polarisationsrichtung unabhängig von der vorherigen Polarisationsorientierung um 90° gedreht.
• Eine Halbwellenplatte oder Lambda/2-Platte ist eine Verzögerungsplatte, welche die Polarisationsrichtung von linear polarisiertem auftreffendem Licht dreht. Der Drehwinkel hängt von der Orientierung der Halbwellenplatte ab. Die Orientierung (welche im Folgenden als Rotationsachse bezeichnet wird) kann durch die schnelle Achse eines Kristalls, welcher die Halbwellenplatte bildet, definiert sein. Der Winkel von 45° zwischen den Halbwellenplatten gibt an, dass die schnellen Achsen der beiden Halbwellenplatten in einem Winkel von 45° zueinander stehen. Die Platten sind parallel zueinander, aber um 45° gedreht.
• Die oben beschriebenen Halbwellenplatten sind so angeordnet, dass Licht von allen Ausgängen auf diese Platten trifft. Es ist im Gegensatz aber auch möglich, polarisationsbeeinflussende Mittel individuell für jeden Ausgang zu verwenden. Beispielsweise kann an jedem Ausgang eine jeweilige Halbwellenplatte mit dem Substrat verbunden werden. Das heißt, die Anzahl an Halbwellenplatten kann der Anzahl an Ausgängen entsprechen. Die Halbwellenplatten, welche zu Ausgängen desselben Eingangs gehören, können die gleiche Orientierung (ihrer schnellen Achsen) haben und können eine andere Orientierung als solche Halbwellenplatten haben, die zu Ausgängen eines anderen Eingangs gehören. Mit solchen lokalen Halbwellenplatten muss Licht von jedem Ausgang nur eine und nicht zwei Halbwellenplatten durchqueren, um eine gewünschte Polarisationsrichtung einzustellen. Als ein wesentlicher Vorteil dieser Ausführungsform sind bereits alle notwendigen Komponenten für die Polarisationsdrehung auf einem einzigen Wellenleiterchip enthalten. Dies verringert erheblich die Anzahl bewegbarer Komponenten, welche auszurichten sind und führt zu einer reduzierten Gesamtgröße, was hochrelevant bei Anwendungen sein kann, in denen der verfügbare Raum stark begrenzt ist.
• Eine ähnliche Wirkung kann erreicht werden, wenn jeder Ausgang einen ersten Spiegel und einen zweiten Spiegel umfasst, welche an einem Substrat des Wellenleiterchips angeordnet sind, und die Spiegel so gestaltet sind, dass sie eine Polarisationsrichtung von auftreffendem Licht drehen, vorzugsweise um 90°. Das Spiegelpaar kann so angeordnet sein, dass es ein Mikroperiskop bildet: Der erste Spiegel kann Licht innerhalb der Ebene des Wellenleiterchips umlenken. Der zweite Spiegel kann sodann das Licht aus dieser Ebene heraus umlenken, insbesondere in einer senkrechten Richtung zu dieser Ebene. Der zweite Spiegel hat damit zwei Funktionen, nämlich das Auskoppeln von auftreffendem Licht und das Drehen der Polarisationsrichtung.
• Das Lichtmikroskop kann auch dazu gestaltet sein, eine TIR-Beleuchtung (Beleuchtung für totale interne Reflexion) bereitzustellen. Bei einer TIR-Beleuchtung trifft ein Lichtstrahl unter einem sehr spitzen Winkel auf eine Probenoberfläche (oder auf eine Deckglasoberfläche an der Probe); hierbei ist der Winkel so, dass der Lichtstrahl an der Oberfläche totalreflektiert wird. Fluorophore in der Probe können durch eine evaneszente Welle des TIR-Beleuchtungsstrahls angeregt werden. In einer Pupillenebene befindet sich ein solcher Lichtstrahl für die TIR-Beleuchtung in einem äußeren Bereich, welcher stärker von der optischen Achse entfernt ist. Zum Bereitstellen einer TIR-Beleuchtung umfasst der Wellenleiterchip einen oder mehrere zusätzliche Eingänge, welche jeweils mit einem zusätzlichen Lichtleitpfad verbunden sind, welcher zu einem jeweiligen zusätzlichen Ausgang führt (der hier als ein TIR-Ausgang bezeichnet wird). Die Ausgänge, die für die strukturierte Beleuchtung vorgesehen sind, definieren einen geometrischen Mittelpunkt und jeder TIR-Ausgang ist weiter entfernt von dem geometrischen Mittelpunkt als irgendeiner der Ausgänge für die strukturierte Beleuchtung.
• Zusätzlich oder alternativ können Lichtstrahlen von den oben beschriebenen Ausgängen auch in der folgenden Weise für eine TIR-Beleuchtung genutzt werden: eine Zoom-Anordnung kann hinter den Ausgängen angeordnet sein, das heißt zwischen den Ausgängen und der Probenebene. Eine Steuereinheit ist vorgesehen und dazu gestaltet, einen Steuerbefehl zu empfangen, welcher anzeigt, ob eine strukturierte Beleuchtung oder eine Beleuchtung für totale interne Reflexion gewünscht ist. Die Steuereinheit ist außerdem dazu gestaltet, eine größere Vergrößerung mit der Zoom-Anordnung einzustellen, wenn die Beleuchtung für totale interne Reflexion gewünscht ist. In einer Pupillenebene bedeutet die größere Vergrößerung, dass ein Lichtfleck weiter von einer zentralen oder optischen Achse entfernt ist. Die Zoom-Anordnung kann auch als eine Zoom-Linse bezeichnet werden; sie kann mehrere einzelne Linsen oder Spiegel umfassen.
• Die oben beschriebenen Punktmuster umfassen mehrere Punkte in einer Linie. Solche Muster sind geeignet für die gut etablierte SIM-Technik. Abgewandelte Mikroskopietechniken mögen andere Punktmuster erfordern. Der Wellenleiterchip kann daher Ausgänge haben (welche zu demselben Eingang gehören), die in anderen Mustern als in einer geraden Linie angeordnet sind, zusätzlich oder als eine Alternative zu dem oben beschriebenen Punktmuster der Ausgänge. Insbesondere können solche anderen Punktmuster für die Technik des Synthetic Aperture Imaging bevorzugt sein.
• Die Mikroskopie mit strukturierter Beleuchtung erfordert ein Aufnehmen von mehreren (Roh-)Bildern einer Probe mit unterschiedlichen Phasen der strukturierten Beleuchtung. Diese Rohbilder mit unterschiedlichen Phasen werden dann verwendet, um ein Bild mit erhöhter Auflösung zu berechnen. Im Allgemeinen können ein oder mehrere Phasenschieber hinter dem Wellenleiterchip angeordnet sein. Beispielsweise kann nahe einer Zwischenbildebene der Phasenschieber eine phasenschiebende Wellenplatte sein, welche mit einem Scanner, der über ein Galvanometer angetrieben wird, bewegt werden kann, um das strukturierte Beleuchtungsmuster auf der Probe zu verschieben; wenn alternativ Phasenschieber nahe einer Pupillenebene angeordnet sind, können die Phasenschieber dazu eingerichtet sein, eine Lichtphase individuell für jede Beugungsordnung zu schieben. Solche Gestaltungen erfordern jedoch einen recht hohen apparativen Aufwand. Es kann daher bevorzugt sein, solche Phasenschieber zu ersetzen durch verstellbare Phasenschieber in oder an dem Wellenleiterchip. Diese integrierten einstellbaren Phasenschieber können mit den Pfadabschnitten verbunden sein oder neben diesen angeordnet sein, um eine Phasenverschiebung von Licht, welches sich durch den jeweiligen Pfadabschnitt ausbreitet, variabel einzustellen. Solche Phasenschieber sind dazu eingerichtet, eine Lichtausbreitung in dem jeweiligen Pfadabschnitt zu beeinflussen, beispielsweise durch Verändern einer Temperatur, einer Dehnung, eines Drucks, einer Verformung oder einer Position des Pfadabschnitts. Einige oder sämtliche der Pfadabschnitte können mit einem jeweiligen Phasenschieber ausgestattet sein. Bei einem Beispiel teilt ein Teiler (englisch: splitter) einen Lichtleitpfad in drei Pfadabschnitte, wobei zwei Pfadabschnitte der 1. und der -1. Beugungsordnung entsprechen und eine größere Lichtintensität empfangen als der übrige Pfadabschnitt, welcher der nullten Beugungsordnung entspricht. Insbesondere in diesem Fall kann es vorgesehen sein, dass nur die zwei Pfadabschnitte, welche eine größere Lichtintensität als der übrige Pfadabschnitt empfangen, mit einem einstellbaren Phasenschieber ausgestattet sind. Ein einstellbarer Phasenschieber kann beispielsweise ein thermo-elektrischer Phasenschieber sein. Er kann an dem Substrat neben einem Pfadabschnitt angebracht sein und dazu gestaltet sein, eine Temperaturänderung an oder in dem jeweiligen Pfadabschnitt zu erzeugen, was wiederum die Lichtausbreitung im Pfadabschnitt beeinflusst und die Phase ändert.
• Alternativ oder zusätzlich können piezo-elektrische Phasenschieber verwendet werden. Ein piezo-elektrischer Phasenschieber kann Kristalle oder andere Elemente, beispielsweise piezo-elektrische dünne Filme wie etwa Aluminiumnitrid und Blei-Zirkonat-Titanat, umfassen, welche an einer Oberseite und einer Unterseite des Substrats des Wellenleiterchips angebracht sind, neben einem der Pfadabschnitte. Der piezo-elektrische Phasenschieber ist dazu fähig, eine Belastung auf das Substrat und den zwischen den Kristallen befindlichen Pfadabschnitt auszuüben. Dies beeinflusst die Lichtausbreitung und die Phase von Licht, welches sich durch diesen Pfadabschnitt ausbreitet. Piezo-elektrische Phasenschieber können verglichen mit anderen Phasenschiebern besonders schnell sein.
• Die Erfindung umfasst weiterhin ein Verfahren zum Herstellen eines Lichtmikroskops, wie es in dieser Offenbarung beschrieben ist. Das Verfahren umfasst insbesondere die Bearbeitung des Substrats des Wellenleiterchips zum Bilden der Lichtleitpfade, der Pfadabschnitte und der Vertiefungen, an welchen die Schnittstellen zum Reflektieren von Licht gebildet sind. Genauigkeit ist beim Herstellen dieser Elemente von höchster Bedeutung. Bei einer bevorzugten Variante des Verfahrens werden einige oder alle dieser Elemente durch einen fokussierten lonenstrahl (FIB) hergestellt. Der Strahl kann das Substrat so beeinflussen, dass sich dessen Brechungsindex ändert, wodurch die Lichtleitpfade und die Pfadabschnitte gebildet werden. Insbesondere bei höherer Intensität kann FIB verwendet werden, um Substratmaterial mit hoher Genauigkeit zu entfernen, womit die Vertiefungen gebildet werden und möglicherweise auch die Schnittstelle für totale interne Reflexion.
• Als eine Alternative zu FIB kann eine Zwei-Photonen-Polymerisation verwendet werden, in welchem Fall ein Lichtstrahl auf das Substrat gerichtet wird, oder insbesondere auf ein Loch im Substrat, welches mit beispielsweise einem Monomer gefüllt ist, welches verändert wird, wenn zwei Photonen zusammen absorbiert werden. In einem weiteren Schritt ermöglicht ein chemisches Entwickeln oder Ätzen Bereiche zu entfernen, welche nicht durch die Zwei-Photonen-Absorption beeinflusst wurden (oder abhängig vom Substrat, Bereiche, welche durch die Zwei-Photonen-Absorption beeinflusst wurden).
• Allgemein können auch andere lithographische Prozesse verwendet werden, in welchen eine Schicht des Substrats unter Verwendung einer Maske beleuchtet wird und wobei danach beleuchtete oder nicht-beleuchtete Bereiche entfernt werden, beispielsweise durch Ätzen. Solche lithographischen Prozesse mögen jedoch nicht die erforderliche Genauigkeit bieten, welche durch FIB oder möglicherweise mit Zwei-Photonen-Absorptionstechniken erreicht werden.
• Für FIB ist es bevorzugt, Zielmarken an dem Substrat zu erzeugen, welche sodann dabei helfen, den fokussierten lonenstrahl auf die gewünschten Bereiche zu lenken. Beispielsweise können Zielmarken neben einem Bereich verwendet werden, in welchem eine Vertiefung mit einer TIR-Oberfläche erzeugt werden soll. Die Zielmarken verbleiben nach der FIB-Bearbeitung an dem Substrat.
• Das Lichtmikroskop kann auch eine Lichtquelle und optische Elemente umfassen, welche zum Lenken von Licht der Lichtquelle über den Scanner zu dem Wellenleiterchip angeordnet sind. Das Mikroskop kann auch optische Elemente umfassen, welche zwischen dem Wellenleiterchip und einer Probenebene angeordnet sind, wobei die optischen Elemente dazu eingerichtet sind, eine Pupillenebene an einem Ort des Wellenleiterchips zu erzeugen und in der Probenebene ein Interferenzmuster aus dem Licht zu erzeugen, welches durch die Ausgänge austritt, um eine strukturierte Beleuchtung in der Probenebene bereitzustellen.
• Merkmale, die mit Bezug auf das Lichtmikroskop beschrieben wurden können auch als Varianten der erfindungsgemäßen Verfahren angesehen werden, und umgekehrt.
• In dieser Beschreibung angegebene Zahlenwerte, beispielsweise Werte von Winkeln, können als exakt die angegebenen Werte aufgefasst werden oder können in alternativen Ausführungsformen einen Wertebereich mit 10% oder 20% Abweichung von dem angegebenen Wert umfassen. Gleichermaßen können die Ausdrücke „parallel“ und „senkrecht“ so verstanden werden, dass sie Winkelbereiche von minus 10° bis plus 10° beziehungsweise von 80° bis 100° umfassen.
• Weitere Eigenschaften und Merkmale der Erfindung werden mit Bezug auf die beigefügten Figuren beschrieben.
• 1 zeigt schematisch eine Ausführungsform eines Lichtmikroskops mit einer optischen Anordnung gemäß der Erfindung;
• 2 zeigt schematisch eine Ausführungsform der optischen Anordnung aus 1;
• 3 zeigt schematisch eine beispielhafte Gestaltung eines Teils der optischen Anordnung der 1 oder 2;
• 4 zeigt schematisch eine weitere Ausführungsform einer optischen Anordnung eines Lichtmikroskops gemäß der Erfindung;
• 5 zeigt schematisch die Positionen und Polarisationsrichtungen von Lichtstrahlen an oder hinter dem Wellenleiterchip des erfindungsgemäßen Lichtmikroskops;
• 6 zeigt schematisch eine weitere beispielhafte Gestaltung eines Teils der optischen Anordnung der 1 oder 2.
• Gleiche Komponenten sind in allen Figuren mit denselben Bezugszeichen versehen.
• 1 zeigt schematisch eine Ausführungsform eines erfindungsgemäßen Lichtmikroskops 1, welches eine optische Anordnung 95 umfasst.
• Das Mikroskop 1 umfasst eine Lichtquelle 4, welche Licht 5 aussendet, welches über eine Eingangsauswahlvorrichtung 8 zu verschiedenen Eingängen eines Wellenleiterchips 90 der optischen Anordnung 95 geleitet werden kann. Der Wellenleiterchip 90 stellt eine Strukturierung von dem Licht bereit, so dass Licht, welches den Wellenleiterchip 90 verlässt, für die Mikroskopie mit strukturierter Beleuchtung (SIM), einer hochauflösenden Mikroskopietechnik, geeignet ist. Die Eingangsauswahlvorrichtung 8 kann auch als Teil der optischen Anordnung 95 angesehen werden.
• Bei dem dargestellten Beispiel wird die Eingangsauswahlvorrichtung 8 durch einen Scanner 8 mit einem drehbaren Spiegel gebildet. In der folgenden Beschreibung kann jedoch der Scanner 8 auch ersetzt werden durch andere Varianten einer Eingangsauswahlvorrichtung, wie sie an anderer Stelle in dieser Offenbarung beschrieben ist.
• Die Lichtquelle 4 kann, wie in 1 angegeben, mehrere Laser umfassen. Zwischen der Lichtquelle 4 und dem Scanner 8 ist optional eine Mehrzahl von optischen Komponenten vorgesehen: auf die Lichtquelle 4 folgend können mehrere teildurchlässige Spiegel 6 verwendet werden, um die Strahlengänge von allen Lasern auf einen gemeinsamen Strahlengang zu vereinen. Außerdem können optional ein akustooptischer einstellbarer Filter (AOTF) 7 und Linsen 23 oder ein Strahlaufweiter 23 vorgesehen sein. Der Scanner 8 ist dazu eingerichtet, auftreffendes Licht 5 variabel in verschiedene Richtungen abzulenken. Hierzu kann der Scanner 8 einen oder mehrere drehbare Spiegel oder andere bewegbare optische Elemente umfassen. Diese ermöglichen ein schnelles Umschalten. Ein schneller Scanner 8 kann auch dadurch realisiert werden, dass eine Brechzahl eines Mediums durch akustische Wellen, welche durch das Medium geleitet werden, verändert wird.
• Von dem Scanner 8 abgelenktes Licht 5 kann zu dem Wellenleiterchip 90 geleitet werden. Abhängig von der Ablenkrichtung des Scanners 8 können verschiedene Eingänge des Wellenleiterchips 90 ausgewählt werden. 1 zeigt als eine optionale Gestaltung mehrere optische Fasern 11.1, 11.2 und 11.3, welche Licht von dem Scanner 8 zu den verschiedenen Eingängen des Wellenleiterchips 90 führen.
• Die Gestaltung des Wellenleiterchips 90 wird nachstehend detaillierter beschrieben. Jeder Eingang des Wellenleiterchips 90 führt zu mehreren Ausgängen, die in einem Punktmuster angeordnet sind. Licht, das über einen Eingang eintritt, verlässt daher den Wellenleiterchip 90 in einem Punktmuster. Das Punktmuster besteht aus kohärenten Lichtstrahlbündeln. Diese sind daher geeignet, in einer Probenebene 20 zu interferieren, womit ein Interferenzmuster erzeugt wird, welches als strukturierte Beleuchtung verwendet wird. Da jeder Eingang des Wellenleiterchips 90 mit verschiedenen Ausgängen verbunden ist, ist es möglich, zwischen verschiedenen Punktmustern zu wählen.
• Als eine wichtige Eigenschaft der Erfindung sind die Ausgänge des Wellenleiterchips 90 in einer Pupillenebene angeordnet. Daher führt ein Punktmuster in der Pupillenebene zu einem strukturierten Muster von beispielsweise Streifen in der Probenebene 20. Verschiedene Punktmuster in der Pupillenebene führen zu verschiedenen strukturierten Mustern in der Probenebene, wie es für die Mikroskopie mit strukturierter Beleuchtung erforderlich ist.
• Strukturiertes Licht 15, welches den Wellenleiterchip 90 verlässt, wird über verschiedene optische Komponenten zu der Probenebene 20 geführt, welche ein optisches Element 18, beispielsweise eine Tubuslinse oder eine Zoom-Anordnung 18, und ein Objektiv 19 neben weiteren Komponenten umfassen können.
• Wie in 1 gezeigt, kann das Mikroskop 1 auch einen bewegbaren Deflektor 27 umfassen, welcher zwischen dem Scanner 8 und dem optischen Wellenleiterchip 90 angeordnet ist. Abhängig von einer Position des Deflektors 27 wird Licht entweder zu dem Wellenleiterchip 90 geleitet oder wird um den Wellenleiterchip 90 herum direkt zu der Probenebene 20 geleitet. In der in 1 dargestellten Position ist der bewegbare Deflektor 27 so angeordnet, dass er Licht 5 von dem Scanner 8 zu den optischen Fasern 11.1, 11.2, 11.3 lenkt, welche zu den Eingängen des Wellenleiterchips 90 führen. Wenn der bewegbare Deflektor 27 aus dem Strahlengang herausbewegt wird, breitet sich das Licht 5 von dem Scanner 8 direkt zu dem optischen Element 18 oder dem Objektiv 19 aus.
• Der Deflektor 27 kann zwei reflektierende Oberflächen 9 und 16 umfassen, welche miteinander starr verbunden sind. Die reflektierende Oberfläche 9 reflektiert Licht von dem Scanner 8 zu einer der optischen Fasern 11.1, 11.2, 11.3. Die reflektierende Oberfläche 16 reflektiert Licht 15 von den Ausgängen des Wellenleiterchips 90 zu dem optischen Element 18 und dem Objektiv 19.
• Von der Probe kommendes Licht wird mit einem Detektor oder einer Kamera 28 detektiert. Beispielsweise kann zwischen dem Objektiv 90 und dem Deflektor 27 oder zwischen dem Deflektor 27 und den Ausgängen des Wellenleiterchips 90 ein (dichroitischer) Strahlteiler 24 verwendet werden, um von der Probe kommendes Licht zu dem Detektor/der Kamera 28 zu leiten (und nicht zu dem Wellenleiterchip 90). Ein weiterer Detektor 22 kann für einen Laser-Scanning-Vorgang vorgesehen sein, in welchem der Deflektor 27 so angeordnet ist, dass sich Licht 5 nicht über den Wellenleiterchip 90 ausbreitet. Vor dem Detektor 22 und der Kamera 28 können optional jeweils Linsen und Filter 26 verwendet werden. Bei einem Laser-Scanning-Vorgang können Beleuchtungslicht und Probenlicht einen gemeinsamen Strahlengang über das Objektiv 19 teilen und können mit einem teildurchlässigen Spiegel 10 getrennt werden, beispielsweise ein dichroitischer Strahlteiler 10, welcher Licht abhängig von der Wellenlänge durchlässt oder reflektiert.
• Eine Steuereinheit 21 kann dazu eingerichtet sein, den Scanner 8, den Detektor 22 und/oder eine Bewegung des bewegbaren Deflektors 27 zu steuern.
• Das Mikroskop 1 kann außerdem thermo-elektrische oder piezo-elektrische Phasenschieber umfassen, welche vorzugsweise in den Wellenleiterchip 90 integriert sind. Die Phasenschieber schieben einstellbar eine Phase von Licht, was zum Aufnehmen mehrerer Bilder mit strukturierter Beleuchtung in derselben Orientierung aber mit verschiedener Phase erforderlich ist. Beispielsweise kann der Wellenleiterchip 90 eine thermo-elektrische Einheit oder elektrische Heizelemente neben den Pfadabschnitten umfassen, um die Temperatur der Pfadabschnitte zu variieren. In dieser Weise kann die Phase von Licht, welches durch die einzelnen Pfadabschnitte verläuft, verändert werden.
• Mit Bezug auf 2 ist das Design eines beispielhaften Wellenleiterchips 90 gezeigt und wird weiter beschrieben.
• Der Wellenleiterchip 90 umfasst ein Substrat 70, welches beispielsweise Quarzglas sein kann. Innerhalb des Substrats 70 sind Pfade gebildet, welche einen anderen Brechungsindex als das Substrat 70 haben. Es ist dadurch möglich, Licht entlang dieser Pfade zu leiten. Der Wellenleiterchip 90 umfasst mehrere Eingänge 31, 41, 51, welche jeweils mit einem jeweiligen Pfad verbunden sind, welche im Folgenden als Lichtleitpfade 32, 42, 52 bezeichnet werden. Optische Fasern 11.1, 11.2, 11.3 können verwendet werden, um Licht zu den verschiedenen Eingängen 31, 41, 51 zu leiten. Abhängig von einem Zustand des Scanners 8 ist es daher möglich, auswählbar einen der Eingänge 31, 41, 51 zu beleuchten. Die optischen Fasern können entfallen, wenn der Scanner so angeordnet ist, dass er Licht direkt auf einen der Eingänge 31, 41, 51 leitet.
• Jeder Lichtleitpfad 32, 42, 52 führt zu einem jeweiligen Teiler 33, 43, 53, welcher den Lichtleitpfad 32, 42, 52 in mehrere Teile aufspaltet, welche als Pfadabschnitte 34 bis 36, 44 bis 46, 54 bis 56 bezeichnet werden. Jeder Pfadabschnitt führt zu einem jeweiligen Ausgang 37 bis 39, 47 bis 49, 57 bis 59, wo Licht den Wellenleiterchip 90 verlässt.
• In dem dargestellten Beispiel gibt es einen ersten, zweiten und dritten Eingang 31, 41, 51. Die Ausgänge 37 bis 39, die mit dem ersten Eingang 31 verbunden sind, bilden ein erstes Punktmuster; die Ausgänge 47 bis 49, die mit dem zweiten Eingang 41 verbunden sind, bilden ein zweites Punktmuster; und die Ausgänge 57 bis 59, die mit dem dritten Eingang 51 verbunden sind, bilden ein drittes Punktmuster.
• Der Wellenleiterchip 90 definiert eine Ebene P, welche in oder parallel zu einer Pupillenebene angeordnet ist. In anderen Worten spannen die (Haupt-)Richtungen der Lichtleitpfade 32, 42, 52 eine Ebene P auf, welche parallel zu der Pupillenebene steht und in dem Bereich von der Pupillenebene oder in der Pupillenebene angeordnet ist. Alle Ausgänge 37 bis 39, 47 bis 49 bis 57 bis 59 sind somit in dem Bereich oder in der Pupillenebene angeordnet.
• Ein Punktmuster in der Pupillenebene entspricht räumlich den Strahlbündeln von verschiedenen Beugungsordnungen eines Gitters, welches in einer Zwischenbildebene angeordnet ist. In herkömmlichen Aufbauten wird solch ein Gitter verwendet, um eine strukturierte Beleuchtung bereitzustellen. An einem Gitter gebeugtes Licht formt mehrere Strahlteile, die den verschiedenen Beugungsordnungen entsprechen. Die Beugungsordnungen umfassen insbesondere eine nullte Beugungsordnung, welche ein mittiger Strahlteil ist, und eine minuserste und erste Beugungsordnung. In einer Pupillenebene können diese nullte, minuserste und erste Beugungsordnung drei Punkte entlang einer Linie bilden. Die Ausgänge 37 bis 39, 47 bis 49, 57 bis 59 sind nun so angeordnet, dass sie ein Punktmuster in der Pupillenebene erzeugen. Zum leichteren Verständnis wird im Folgenden allein auf die Ausgänge 37 bis 39 eingegangen. Ein mittiger oder zentraler Ausgang 38 ist an einem Mittelpunkt angeordnet, welcher sich an oder in dem Bereich einer optischen Achse des Lichtmikroskops befinden kann. Dieser mittige Ausgang 38 stellt einen Lichtfleck oder Lichtpunkt bereit, welcher einer nullten Beugungsordnung eines Gitters in einer Zwischenbildebene entspricht. Die anderen zwei Ausgänge 37 und 39 sind einander gegenüberliegend mit Bezug auf den mittigen Ausgang 38 angeordnet und entsprechen der -1. beziehungsweise der 1. Beugungsordnung.
• Lichtanteile von diesen Ausgängen 37 bis 39 interferieren in der Probenebene. Für einen besonders guten Kontrast in solch einem Interferenzmuster sind die relativen Lichtintensitäten der Ausgänge 37 bis 39 wichtig. Vorzugsweise ist der Teiler 33 so gestaltet, dass die Intensität in dem mittleren Ausgang 38 niedriger ist als bei den übrigen Ausgängen 37, 39. Zum Beispiel kann die Intensität in dem mittleren Ausgang 38 zwischen 2% und 25% liegen oder zwischen 8% und 20% der Lichtintensität, die den Teiler 33 erreicht. Die übrige Lichtintensität wird in gleichen Teilen auf die zwei übrigen Ausgänge 37, 39 verteilt.
• Die obige Beschreibung zu den Ausgängen 37 bis 39 und den damit verbundenen Komponenten trifft auch auf die Ausgänge 47 bis 49 und 57 bis 59 zu.
• Diese Gruppen an Ausgängen 37 bis 39, 47 bis 49 und 57 bis 59 unterscheiden sich in der Anordnung ihrer Punktmuster. Jedes Punktmuster kann durch Punkte in einer Linie gebildet sein; die Linie von verschiedenen Gruppen an Ausgängen 37 bis 39, 47 bis 49 und 57 bis 59 sind jedoch relativ zueinander gedreht. In anderen Worten ist jeder Eingang 31, 41, 51 mit einem zentralen Ausgang 38, 48, 58 verbunden, welche nebeneinander in einem zentralen Bereich gebildet sind, welcher einer optischen Achse des Mikroskops entspricht. Die übrigen Ausgänge 37, 39, 47, 49, 57, 59 sind auf einem kreisförmigen Band um diese zentrale Region herum angeordnet. Da die mittigen Ausgänge 38, 48, 58 bloß nebeneinander sind und nicht an exakt derselben Position sein können, sind die übrigen Ausgänge 37, 39, 47, 49, 57, 59 vorzugsweise nicht auf exakt einem Kreis angeordnet, sondern vielmehr auf einem kreisförmigen Band, wobei die Ausgänge 37 und 39 denselben Abstand zum Ausgang 38 haben und gleichermaßen die Ausgänge 47 und 49 denselben Abstand zum Ausgang 48 haben und die Ausgänge 57 und 59 denselben Abstand zum Ausgang 58 haben.
• Verschiedene Punktmuster, die relativ zueinander gedreht sind, entsprechen in der Probenebene strukturierten Mustern, welche relativ zueinander gedreht sind, so wie es für die Mikroskopie mit strukturierter Beleuchtung erforderlich ist.
• Ein wesentliches Merkmal des oben beschriebenen Wellenleiterchips 90 liegt darin, dass alle Ausgänge in einer gemeinsamen Ebene P angeordnet sind, welche in oder an einer Pupillenebene liegt. Dies wird erreicht, indem Licht aus dem Wellenleiterchip 90 unter einem Winkel relativ zu den Richtungen der Lichtleitpfade 32, 42, 52 ausgekoppelt wird. Der Winkel kann insbesondere beliebige Werte haben, die von 0 verschieden sind, wobei es bevorzugt sein kann, dass der Winkel zu der Ebene P ungefähr 90° ist (das heißt parallel zu einer Normalen der Ebene P ist) oder allgemeiner zwischen 20° und 90° ist.
• Dies wird weiter mit Bezug auf 3 erläutert, welche schematisch Details des Wellenleiterchips 90 aus 2 zeigt. 2 ist eine Querschnittsansicht des Wellenleiterchips 90 und somit ist diese Ansicht senkrecht zu der Ansicht aus 2.
• 3 zeigt das Substrat 70, in welchem der Pfadabschnitt 34 gebildet ist. Der Pfadabschnitt 34 führt zu dem Ausgang 37. Zum Umlenken und Auskoppeln von Licht ist eine Vertiefung 72 in dem Substrat 70 vorgesehen. Die Vertiefung 72 kann als Teil des Ausgangs 37 angesehen werden und bildet eine Oberfläche 71 oder Schnittstelle 71, welche an dem Pfadabschnitt 34 angrenzt. Licht aus dem Pfadabschnitt 34 wird daher an der Schnittstelle 71 abgelenkt. Bei dem dargestellten Beispiel steht die Oberfläche 71 unter solch einem Winkel relativ zu dem Pfadabschnitt 34, dass Licht innerhalb des Wellenleiterchips 90 durch totale interne Reflexion reflektiert wird. Reflektiertes Licht verläuft daher durch den Wellenleiterchip 90 und verlässt den Wellenleiterchip 90 an einer Seite gegenüberliegend zur Vertiefung 72 und gegenüberliegend zur Schnittstelle 71. Ein Reflexionswinkel an der Schnittstelle 71 ist ungefähr 90°. 3 zeigt in gestrichelten Linien einen aufgeweiteten Lichtstrahl, wobei eine zentrale gestrichelte Linie 95 des aufgefächerten/aufgeweiteten Lichtstrahls eine Ausgangsrichtung 75 des Lichts angibt. Die Ausgangsrichtung steht in einem Winkel von 90° zur Ebene des Wellenleiterchips; diese Ebene erstreckt sich entlang dem Pfadabschnitt 34 und in die Zeichenebene von 3 hinein. Ein Bereich, in welchem Licht, das von der Schnittstelle 71 reflektiert wird, den Wellenleiterchip 90 verlässt, wird als ein Ausgang 37 bezeichnet. Solch ein Bereich kann einfach eine Schnittstelle zwischen dem Substrat 70 und einem umgebenden Medium, typischerweise Luft, sein.
• Die Oberfläche 71 kann auch als ein TIR-(Totale Interne Reflexion)-Mikrospiegel bezeichnet werden. Ist die Oberfläche 71 eine Schnittstelle zwischen Luft und dem Substrat/dem jeweiligen Pfadabschnitt, so dringt ein evaneszentes Lichtfeld in die Luft ein. Für typischerweise verwendete Lichtwellenlängen kann dieses evaneszente Feld beispielsweise ungefähr 100 nm betragen. Aufgrund von Wechselwirkungen mit Luftmolekülen kann das evaneszente Feld zu einer Beeinträchtigung der Oberfläche 71 führen. Um solche Nachteile zu vermeiden, kann die Oberfläche 71 beschichtet sein (beispielsweise mit einem Metall oder dichroitisch beschichtet), damit Wechselwirkungen eines evaneszenten Feldes mit Luft vermieden werden. Alternativ kann die Vertiefung 72 mit einer Abdeckung versehen und mit einem Schutzgas wie beispielsweise Argon gefüllt sein. Die Oberfläche 71 kontaktiert dann das Schutzgas, welches nicht mit dem evaneszenten Feld wechselwirkt.
• An Stelle von totaler interner Reflexion ist es auch möglich, einen Spiegel an der Oberfläche 71 zu verwenden.
• Bei anderen Varianten der Erfindung kann die Oberfläche/Schnittstelle 71 unter einem anderen Winkel gebildet sein, um eine von 90° abweichende Ausgangsrichtung zu bewirken.
• Die reflektierende Schnittstelle 71 ist an einer Seite des Substrats so gebildet, dass reflektiertes Licht durch das Substrat läuft, bevor es den Wellenleiterchip 90 an einer Seite gegenüberliegend zur Schnittstelle 71 verlässt. Nach der Reflexion an der Schnittstelle 71 weitet sich ein Lichtstrahl auf und verlässt daher den Wellenleiterchip 90 mit einem größeren Querschnitt verglichen mit einem Fall, in welchem der Lichtstrahl den Wellenleiterchip 90 an der Schnittstelle 71 verlassen würde, ohne vorher das Substrat zu durchqueren. Durch den größeren Querschnitt ist eine Spitzenintensität über den Querschnitt verringert. Diese reduzierte Spitzenintensität stellt sicher, dass keine Schäden an der Oberfläche, an welcher das Licht den Wellenleiter verlässt, entstehen. Vorteilhafterweise sind daher keine weiteren Elemente (wie zum Beispiel Endkappen, die an optischen Fasern verwendet werden) notwendig, um Licht aus dem Wellenleiterchip herauszukoppeln. Stattdessen kann Licht einfach aus dem Substrat austreten, ohne dass weitere Elemente erforderlich wären.
• Die Anordnung der Schnittstelle oder des Spiegels 71, so dass reflektiertes Licht durch den Wellenleiterchip 90 geleitet wird, hat weitere Vorteile: zusätzliche optische Elemente, wie zum Beispiel eine Mikrolinse oder eine Halbwellenplatte, können direkt an dem Ausgang (das heißt, an dem Ort des Substrats, wo reflektiertes Licht austritt) angebracht werden. Solch eine effiziente Anordnung und Befestigung von Mikrolinsen oder anderen Komponenten wäre nicht möglich, wenn Licht den Wellenleiterchip an der Seite der Schnittstelle/des Spiegels 71 verlassen würde.
• Die übrigen Pfadabschnitte und übrigen Ausgänge können gleich gebildet sein wie in 3 gezeigt.
• Während 2 eine Ausführungsform zeigt, bei der ein jeder Teiler 33, 43, 53 einkommendes Licht auf drei Pfadabschnitte aufteilt, sind andere Teilerausführungen mit zusätzlichen Pfadabschnitten möglich; die obige Beschreibung trifft auch auf solche Fälle zu, wobei die zusätzlichen Ausgänge in derselben Linie wie die drei oben beschriebenen Ausgänge angeordnet sein können, oder alternativ in einem anderen Muster.
• Eine weitere Ausführungsform eines Wellenleiterchips 90 eines erfindungsgemäßen Lichtmikroskops ist in 4 gezeigt. Dieser Wellenleiterchip 90 kann alle der in 2 gezeigten Komponenten umfassen, wobei zusätzliche Merkmale vorhanden sind in der Gestaltung der Teiler 33, 43, 53 und zusätzliche Eingänge 62, 72, 82 vorhanden sind für eine TIR-Beleuchtung, das heißt einer Beleuchtung, die zum Untersuchen einer Probe durch totale interne Reflexion von Licht an einer Probenoberfläche geeignet ist.
• Die Merkmale der Gestaltung des Teilers und der Eingänge für die TIR-Beleuchtung sind unabhängig voneinander und daher kann die optische Anordnung aus 2 zusätzlich mit der Gestaltung des Teilers aus 4 und/oder den Merkmalen für die TIR-Beleuchtung, welche mit Bezug auf 4 beschrieben werden, versehen sein.
• Die in 4 verwendeten Teiler 33, 43, 53 teilen Licht in vier Pfadabschnitte 30, 34 bis 36; 40, 44 bis 46 und 50, 54 bis 56. Zum leichteren Verständnis bezieht sich die folgende Beschreibung auf den Teiler 33 und dessen Pfadabschnitte 30, 34 bis 36. Die übrigen Teiler 43, 53 und ihre Pfadabschnitte können jedoch gleichermaßen gebildet sein.
• Nur drei der vier Pfadabschnitte 34 bis 36 führen zu Ausgängen, wie sie mit Bezug auf 2 beschrieben wurden. Der jeweils übrige Pfadabschnitt 30 wird nicht zum Beleuchten einer Probe verwendet. Stattdessen kann er zu einem äußeren Bereich führen, welcher weiter von der optischen Achse entfernt ist und Licht zu einem Absorber leitet oder streut (beispielsweise zu einem Gehäuse der optischen Anordnung). Jeder Teiler 33 ist so aufgebaut, dass zwei seiner Pfadabschnitte 34, 36 eine gleiche Lichtintensität erhalten, welche größer ist als die Lichtintensität in den anderen zwei Pfadabschnitten 30, 35. Diese Pfadabschnitte 30, 35 können wiederum die gleiche Intensität erhalten. Die Pfadabschnitte 34, 36 können zentral in dem Teiler 33 angeordnet sein, während die übrigen zwei Pfadabschnitte 30, 35 weiter außen in dem Teiler 33 angeordnet sind. Eine solche Gestaltung mit einem ungenutzten Pfadabschnitt (das heißt einem Pfadabschnitt, welcher nicht zum Beleuchten der Probe verwendet wird) bietet Vorteile dahingehend, dass die Intensitätsverteilung auf die Pfadabschnitte weniger stark von einer Wellenlänge des Lichts abhängt. Dies ist detaillierter in der allgemeinen Beschreibung dieser Erfindung erläutert.
• Der übrige Pfadabschnitt 30, welcher nicht zum Beleuchten einer Probe verwendet wird, kann für andere Zwecke genutzt werden. Er kann Licht zu einem Photodetektor führen, zum Beispiel indem er zu einem äußeren Bereich der Pupillenebene führt und von dort Licht zu einem Photodetektor auskoppelt. Signale von dem Photodetektor können verwendet werden, um das Einkoppeln von Licht an den Eingängen des Wellenleiterchips zu überwachen und zu steuern. Beispielsweise kann abhängig von einem Signal des Photodetektors ein Element, welches mit dem Eingang verbunden ist (beispielsweise eine Position einer optischen Faser, die zu diesem Eingang führt) eingestellt werden.
• Alternativ ist der übrige Pfadabschnitt 30, welcher nicht zum Beleuchten einer Probe verwendet wird, mit einem Interferometer verbunden, welches einen Phasenschieber umfasst, beispielsweise ein Mach-Zehnder-Interferometer. Der Phasenschieber und vorzugsweise das Interferometer sind integral in dem Wellenleiterchip gebildet. Der Phasenschieber kann identisch zu den übrigen Phasenschiebern im Wellenleiterchip gesteuert werden, beispielsweise kann eine gleiche Temperaturänderung in allen Phasenschiebern induziert werden. Das Interferometer misst die Phasenänderung, die durch diese Temperaturänderung hervorgerufen wird. Daher ermöglicht ein Messwert des Interferometers, eine Steuerung der Phasenschieber zu korrigieren, um eine gewünschte Phasenänderung zu erreichen. Dies kann in einer Regelung (Feedback-Schleife) umgesetzt werden.
• Bei weiteren Ausführungsformen ist der übrige Pfadabschnitt 30, welcher nicht zum Beleuchten einer Probe verwendet wird, mit einer Lichtquelle verbunden. Beispielsweise kann eine LED an dem Wellenleiterchip an einem Endbereich des Pfadabschnitts 30 befestigt sein. Licht von der Lichtquelle durchläuft den Pfadabschnitt 30 zu dem Teiler 33. Das Licht breitet sich weiter von dem Teiler 33 durch den Lichtleitpfad 32 aus und verlässt den Wellenleiterchip an dem Eingang 31. Nach Durchlaufen der optischen Faser 11.1 kann das Licht mit beispielsweise einem Photodetektor gemessen werden und kann verwendet werden, um den Strahl oder die Kolimierung einzustellen.
• Andere übrige Pfadabschnitte 40, 50, welche nicht zum Beleuchten einer Probe verwendet werden, können gleichermaßen oder alternativ mit einer Lichtquelle versehen sein und können verwendet werden wie oben zum Pfadabschnitt 30 beschrieben.
• An Stelle von vier Pfadabschnitten kann eine andere gerade Anzahl verwendet werden, wobei in jedem Fall ein Pfadabschnitt nicht zum Beleuchten der Probe verwendet wird.
• Wenn einer der äußeren Pfadabschnitte 35 eine niedrigere Intensität erhält, sollte dieser Pfadabschnitt zu einem mittigen Bereich führen, welcher einer nullten Beugungsordnung eines in einer Zwischenbildebene angeordneten Gitters entspricht. Dies mag ein Durchkreuzen oder Schneiden eines anderen Pfadabschnitts 36 erfordern.
• Außerdem kann es sein, dass sich Pfadabschnitte 36, 46 von verschiedenen Teilern 33, 43 schneiden. Vorzugsweise beträgt ein Kreuzungswinkel (definiert für die Teile der Pfadabschnitte 36, 46, welche von der Kreuzung zu ihrem jeweiligen Ausgang verlaufen) zwischen 80° und 120° oder insbesondere gleich oder größer 90°. In dieser Weise ist ein Übersprechen zwischen den Pfadabschnitten 36, 46 gering. Ein Winkel größer als 90° bedeutet, dass ein Lichtanteil vom Pfadabschnitt 36, welcher in den Pfadabschnitt 46 eintritt, eher rückwärts verläuft und nicht zu dem Ausgang des Pfadabschnitts 46 hin; daher beeinträchtigt er nicht oder nur kaum das erzeugte Punktmuster. Wie an anderer Stelle in dieser Offenbarung erläutert, können solche Durchkreuzungen vermieden werden durch ein dreidimensionales Design der Lichtleitpfade oder der Pfadabschnitte. Bei einem solchen Design sind die Lichtleitpfade oder Pfadabschnitte nicht auf eine Ebene beschränkt sondern erstrecken sich auch in eine Richtung quer zu dieser Ebene.
• Der Wellenleiterchip 90 aus 4 umfasst weiterhin zusätzliche Eingänge 61 bis 63, welche für eine TIR-Beleuchtung verwendet werden, und welche daher auch als TIR-Eingänge 61 bis 63 bezeichnet werden. Jeder TIR-Eingang 61 bis 63 ist mit einem jeweiligen TIR-Ausgang 67 bis 69 über einen jeweiligen Lichtleitpfad 64 bis 66 verbunden. In der Pupillenebene sind die TIR-Ausgänge 67 bis 69 weiter außen (das heißt weiter von einer optischen Achse entfernt) als die Ausgänge 37 bis 39, 47 bis 49, 57 bis 59 für eine strukturierte Beleuchtung angeordnet.
• Eine jeweilige optische Faser kann zu jedem der TIR-Eingänge 61 bis 63 führen, so dass der Scanner 8 einen der Eingänge 31, 41, 51,61, 62, 63 auswählen kann.
• Während 4 eine Ausführungsform mit drei TIR-Eingängen 61 bis 63 zeigt, kann dieses Design auch allgemeiner auf einen oder mehrere TIR-Eingänge zutreffen.
• Die Effizienz von jedem Teiler hängt von der Polarisation von einkommendem Licht ab. Vorzugsweise ist das Licht linear polarisiert in einer Richtung, in welcher die Teilung erfolgt (wie durch die Pfeile in den 2 und 4 dargestellt). SIM erfordert jedoch eine Polarisation, welche vorzugsweise senkrecht zu dieser Orientierung steht. Es ist daher vorteilhaft, die Polarisation des Lichts hinter den Teilern zu drehen.
• Dies wird näher mit Bezug auf 5 erläutert, welche im linken Teil die drei Punktmuster zeigt. Ein erstes Punktmuster umfasst die Lichtpunkte 81, 82, 83 in einer Pupillenebene, welche den Ausgängen 37 bis 39 entsprechen. Ein zweites Punktmuster umfasst die Lichtpunkte 84 bis 86, welche den Ausgängen 47 bis 49 entsprechen. Ein drittes Punktmuster schließlich umfasst die Lichtpunkte 87 bis 89, welche den Ausgängen 57 bis 59 entsprechen.
• Die Polarisationsrichtung von jedem Lichtpunkt 81 bis 89 ist durch einen Pfeil gekennzeichnet.
• Zwei Halbwellenplatten können zum Drehen der Polarisationsrichtung um stets 90° verwendet werden. Solche Halbwellenplatten 25 sind in 1 zwischen dem Wellenleiterchip 90 und der Probenebene 20 gezeigt. Vorzugsweise sind die Halbwellenplatten 25 direkt an den Ausgängen des Wellenleiterchips 90 angeordnet. In dieser Weise genügen kleinere Querschnitte der Platten 25. Die Halbwellenplatten 25 sind vorzugsweise Achromaten. Die Polarisationsrichtungen der Lichtpunkte/Lichtflecken 81 bis 89 vor und hinter der ersten Halbwellenplatte sind in dem mittleren Bereich von 5 durch Pfeile dargestellt. Dieser mittlere Bereich kennzeichnet auch die Orientierung der schnellen Achse 96 der ersten Halbwellenplatte. Es ist zu beachten, dass nur der Winkel zwischen den Achsen der zwei Halbwellenplatten wichtig ist, aber nicht ihre absolute Ausrichtung. Der rechte Teil von 5 zeigt die Polarisationsrichtungen der Lichtflecken 81 bis 89 vor und hinter der zweiten Halbwellenplatte. Angegeben ist auch die schnelle Achse 97 der zweiten Halbwellenplatte. Wie in dem rechten Teil von 5 dargestellt, ist die Polarisationsrichtung von jedem Lichtpunkt um 90° gedreht und steht nun senkrecht zu einer Linie, welche die Punkte 81 bis 83 desselben Punktmusters miteinander verbindet.
• Eine oder beide der Halbwellenplatten können auch ersetzt werden durch andere Mittel, welche eine Polarisationsdrehung von 90° bewirken. Mit Bezug auf 3 kann die Oberfläche von dem Substrat an jedem Ausgang 37 mit einer Struktur versehen sein oder bearbeitet sein, um eine Struktur aufzuweisen, welche als eine Halbwellenplatte wirkt, womit eine Halbwellenplatte ersetzt wird.
• Jeder Pfadabschnitt kann auch zu zwei aufeinander folgenden verspiegelten Schnittstellen führen, bevor Licht den Wellenleiterchip verlässt. Ein solches Beispiel ist in 6 gezeigt, welche schematisch eine Perspektivansicht eines Wellenleiterchips 90 darstellt.
• Ein Pfadabschnitt 34 führt zu zwei aufeinander folgenden verspiegelten Flächen 73 und 71. Diese sind in der Form eines Periskops angeordnet und werden auch als ein Mikroperiskop bezeichnet. Die erste verspiegelte Fläche 73 lenkt Licht vom Pfadabschnitt 34 innerhalb des Wellenleiterchips um und/oder innerhalb der Ebene des Wellenleiterchips, zu der zweiten verspiegelten Fläche 71. Die zweite verspiegelte Fläche 71 lenkt Licht in die Ausgangsrichtung 75 aus dem Wellenleiterchip 90 heraus um. Eine Polarisationsrichtung von Licht in dem Pfadabschnitt 34 und vor den verspiegelten Flächen 71, 73 ist mit einem Pfeil 76 angegeben. Wie dargestellt kann diese Polarisationsrichtung in der Ebene des Wellenleiterchips liegen. Reflexionen an den Oberflächen 73, 71 beeinflussen die Polarisation so, dass eine Polarisationsrichtung 77 von Licht, das den Wellenleiterchip 90 verlassen hat, gedreht ist, vorzugsweise um 90°.
• Zusätzlich zu den beschriebenen Lichtleitpfaden kann ein weiterer Lichtleitpfad vorgesehen sein, welcher nicht mit einem der Eingänge 31, 41, 51 des Wellenleiterchips verbunden ist. Dieser weitere Lichtleitpfad kann einen Eingang haben, der mit einer weiteren Lichtquelle gekoppelt ist, beispielsweise mit einer LED, die mit dem Wellenleiterchip an dem Eingang des weiteren Lichtleitpfads verbunden ist. Der weitere Lichtleitpfad hat einen Ausgang, der sich neben einem der Eingänge 31, 41, 51 befindet. Beispielsweise kann eine Entfernung zwischen dem Ausgang des weiteren Lichtleitpfads und einem der Eingänge 31, 41, 51 kleiner sein als der Durchmesser des (weiteren) Lichtleitpfads. Insbesondere kann eine Auskoppelrichtung des Ausgangs des weiteren Lichtleitpfads parallel sein zu einer Einkoppelrichtung der Eingänge 31, 41, 51. Dies kann erreicht werden, indem der weitere Lichtleitpfad in seinem Endabschnitt zu seinem Ausgang parallel ist zu den Abschnitten der Lichtleitpfade 32, 42, 52 an ihren Eingängen 31, 41, 51. Licht, das den Ausgang des weiteren Lichtleitpfades verlässt, kann mit einem weiteren Lichtdetektor gemessen und/oder für eine Strahlanpassung oder eine Kolimationsanpassung verwendet werden.
• Das erfindungsgemäße Design bietet eine verbesserte Stabilität und Genauigkeit, da die Ausgänge des Wellenleiterchips und damit die Punktmuster in der Pupillenebene eine vorgegebene Anordnung haben und keine optischen Komponenten notwendig sind, um Licht von dem Wellenleiterchip zu einer Pupillenebene zu lenken, welche mit der Zeit justiert werden müssten oder in ihrer Ausrichtung schlechter würden. Insbesondere sind zu diesem Zweck keine optischen Fasern erforderlich und daher werden Kohärenzprobleme vermieden, welche bei unterschiedlichen Längen von optischen Fasern auftreten. Als eine Folge können günstigere Laser als Lichtquellen verwendet werden. Eine besonders hohe Genauigkeit wird mit einem Aufbau erreicht, welcher eine verhältnismäßig kleine Anzahl an Komponenten erfordert.
• Ein Hauptvorteil des erfindungsgemäßen Lichtmikroskops liegt darin, dass viele Funktionen in einem einzigen Wellenleiterchip integriert werden können. Dies führt nicht nur zu Raumersparnissen, sondern vermeidet auch Probleme des Ausrichtens von einzelnen bewegbaren Komponenten. Beispielsweise werden optische Fasern hinter dem Wellenleiterchip überflüssig. Auch Phasenschieber und/oder Polarisationsrotationsmittel können in dem Wellenleiterchip integriert werden, wobei die Polarisationsrotationsmittel durch ein Spiegelpaar in der Form von Mikroperiskopen gebildet sein können oder durch eine Halbwellenplatte, die jeweils an den Ausgängen angeordnet ist.
• Bezugszeichenliste

1

Lichtmikroskop

4

Lichtquelle

5

Licht

6

Spiegel zum Kombinieren der Strahlpfade

7

AOTF

8

Scanner

9, 16

reflektierende Oberflächen des bewegbaren Deflektors

10

dichroitischer Strahlteiler

11.1, 11.2, 11.3

optische Fasern

15

strukturiertes Licht, das den Wellenleiterchip verlässt

18

Zoom-Anordnung

19

Objektiv

20

Probenebene

21

Steuereinheit

22

Detektor

23

Linsen

24

dichroitischer Strahlteiler

25

Ausgangspolarisationseinheit mit Halbwellenplatten

26

Filter

27

bewegbarer Deflektor

28

Kamera

30, 40, 50

Pfadabschnitte, die nicht zum Beleuchten einer Probe verwendet werden

31, 41, 51

Eingänge des Wellenleiterchips

32, 42, 52

Lichtleitpfad

33, 43, 53

in Wellenleiterchip gebildeter Teiler

34, 35, 36; 44, 45, 46; 54, 55, 56

Pfadabschnitte des Wellenleiterchips

37, 38, 39; 47, 48, 49; 57, 58, 59

Ausgänge des Wellenleiterchips

61,62,63

zusätzliche Eingänge

64, 65, 66

zusätzlicher Lichtleitpfad

67, 68, 69

TIR-Ausgang

70

Substrat des Wellenleiterchips

71

Schnittstelle zum Ablenken von Licht aus dem Wellenleiterchip heraus

72

Vertiefung in dem Substrat des Wellenleiterchips

73

Schnittstelle zum Ablenken von Licht innerhalb des Wellenleiterchips

75

Austrittsrichtung von Licht aus den Ausgängen

76

Polarisationsrichtung von Licht innerhalb des Wellenleiterchips

77

Polarisationsrichtung von Licht, das aus dem Wellenleiterchip ausgekoppelt ist

81 bis 89

Lichtpunkte in einer Pupillenebene

90

Wellenleiterchip

95

optische Anordnung

96, 97

schnelle Achsen der Halbwellenplatten

P

durch den Wellenleiterchip definierte Ebene.

• ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
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• Zitierte Patentliteratur
• DE 102007047466 A1 [0007, 0008]
• DE 102012020877 A1 [0007, 0009, 0013, 0017]

Claims (18)

1. Lichtmikroskop, umfassend: - eine Einrichtung zur strukturierten Beleuchtung, welche aus auftreffendem Licht eine strukturierte Beleuchtung bereitstellt, wobei die Einrichtung zur strukturierten Beleuchtung einen Wellenleiterchip (90) mit mehreren Eingängen (31, 41, 51) umfasst; - eine Eingangsauswahlvorrichtung (8) zum variablen Leiten von Licht zu einem der Eingänge (31, 41, 51); - wobei der Wellenleiterchip (90) außerdem jeweils einen Lichtleitpfad (32, 42, 52) hinter jedem der Eingänge (31, 41, 51) umfasst, wobei jeder Lichtleitpfad (32, 42, 52) sich in mehrere Pfadabschnitte (34, 35, 36; 44, 45, 46; 54, 55, 56) teilt, und wobei jeder Pfadabschnitt (34, 35, 36; 44, 45, 46; 54, 55, 56) zu einem Ausgang (37, 38, 39, 47, 48, 49, 57, 58, 59) des Wellenleiterchips (90) führt; dadurch gekennzeichnet, dass eine Austrittsrichtung (75) von Licht aus den Ausgängen (37, 38, 39, 47, 48, 49, 57, 58, 59) quer zu einer Ebene (P) steht, welche durch den Wellenleiterchip (90) definiert wird.
2. Lichtmikroskop nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Lichtleitpfade (32, 42, 52) und die Pfadabschnitte (34, 35, 36; 44, 45, 46; 54, 55, 56) sich in oder parallel zu einer Pupillenebene des Lichtmikroskops erstrecken.
3. Lichtmikroskop nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass jeder Ausgang (37, 38, 39, 47, 48, 49, 57, 58, 59) des Wellenleiterchips (90) eine Schnittstelle (71) umfasst, welche gestaltet ist zum Umlenken von Licht raus aus dem Wellenleiterchip (90) durch totale interne Reflexion.
4. Lichtmikroskop nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass jeder Ausgang (37, 38, 39, 47, 48, 49, 57, 58, 59) des Wellenleiterchips (90) jeweils eine Schnittstelle (71) zum Umlenken von Licht raus aus dem Wellenleiterchip (90) umfasst, wobei jede Schnittstelle (71) einen Spiegel umfasst.
5. Lichtmikroskop nach Anspruch 3 oder 4, dadurch gekennzeichnet, dass jede Schnittstelle (71) einen Winkel zwischen 20° und 70° zu der Ebene (P) des Wellenleiterchips (90) bildet.
6. Lichtmikroskop nach einem der Ansprüche 3 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass die Schnittstelle (71) durch eine Vertiefung im Wellenleiterchip (90) gebildet ist.
7. Lichtmikroskop nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass die Pfadabschnitte (34, 35, 36; 44, 45, 46; 54, 55, 56) so geformt sind, dass sich zumindest einige (36, 46) der Pfadabschnitte (34, 35, 36; 44, 45, 46; 54, 55, 56), welche zu verschiedenen Eingängen (31, 41) gehören, schneiden; und dass sich die schneidenden Pfadabschnitte (36, 46) unter einem Winkel zwischen 70° und 120° schneiden.
8. Lichtmikroskop nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, dass die Ausgänge (37, 38, 39) des Wellenleiterchips (90), welche zu demselben Eingang (31) gehören, jeweils ein Punktmuster bilden und dass die Punktmuster zueinander gleich, aber zueinander gedreht sind.
9. Lichtmikroskop nach einem der Ansprüche 1 bis 8, welches außerdem eine Eingangspolarisationseinrichtung umfasst, welche dazu gestaltet ist, Licht so zu polarisieren, dass dessen Polarisationsrichtung in der Ebene (P) des Wellenleiterchips (90) bei Auftreffen auf die Eingänge (31, 41, 51) des Wellenleiterchips (90) liegt.
10. Lichtmikroskop nach einem der Ansprüche 1 bis 9, welches außerdem eine Ausgangspolarisationseinrichtung (25) umfasst, auf welche Licht von den Ausgängen (37, 38, 39, 47, 48, 49, 57, 58, 59) des Wellenleiterchips (90) trifft, wobei die Ausgangspolarisationseinrichtung (25) dazu eingerichtet ist, eine Polarisationsrichtung von auftreffendem Licht um 90° zu drehen, insbesondere indem die Ausgangspolarisationseinrichtung (25) zwei Halbwellenplatten umfasst, welche hintereinander und zueinander um 45° gedreht angeordnet sind.
11. Lichtmikroskop nach einem der Ansprüche 1 bis 10, dadurch gekennzeichnet, dass jeder Ausgang (37, 38, 39, 47, 48, 49, 57, 58, 59) des Wellenleiterchips (90) zwei Spiegel umfasst, welche an einem Substrat (70) des Wellenleiterchips (90) angeordnet sind, wobei die Spiegel so gestaltet sind, dass sie eine Polarisationsrichtung von auftreffendem Licht um 90° drehen.
12. Lichtmikroskop nach einem der Ansprüche 1 bis 11, dadurch gekennzeichnet, dass der Wellenleiterchip (90) einstellbare Phasenschieber an einigen oder allen der Pfadabschnitte (34, 35, 36; 44, 45, 46; 54, 55, 56) umfasst, insbesondere piezoelektrische oder thermoelektrische Phasenschieber, zum variablen Einstellen einer Phasenänderung von Licht des jeweiligen Pfadabschnitts (34, 35, 36; 44, 45, 46; 54, 55, 56).
13. Lichtmikroskop nach einem der Ansprüche 1 bis 12, dadurch gekennzeichnet, dass zum Bereitstellen einer TIR-Beleuchtung der Wellenleiterchip (90) einen oder mehrere zusätzliche Eingänge (61, 62, 63) umfasst, welche jeweils mit einem zusätzlichen Lichtleitpfad (64, 65, 66) verbunden sind, welche zu einem jeweiligen TIR-Ausgang (67, 68, 69) des Wellenleiterchips (90) führen, wobei die Ausgänge (37, 38, 39, 47, 48, 49, 57, 58, 59) des Wellenleiterchips (90) einen geometrischen Mittelpunkt definieren und wobei jeder TIR-Ausgang (67, 68, 69) weiter weg ist von dem geometrischen Mittelpunkt, als irgendeiner der Ausgänge (37, 38, 39, 47, 48, 49, 57, 58, 59) des Wellenleiterchips (90).
14. Lichtmikroskop nach einem der Ansprüche 1 bis 13, welches außerdem umfasst: eine Zoomanordnung (18), welche hinter den Ausgängen (37, 38, 39, 47, 48, 49, 57, 58, 59) des Wellenleiterchips (90) angeordnet ist, eine Steuereinheit, die gestaltet ist zum Empfangen eines Steuerbefehls, welcher angibt, ob eine strukturiere Beleuchtung oder eine Beleuchtung für totale interne Reflexion gewünscht ist, wobei die Steuereinheit dazu eingerichtet ist, mit der Zoomanordnung (18) eine größere Vergrößerung einzustellen, wenn die Beleuchtung für totale interne Reflexion gewünscht ist.
15. Lichtmikroskop nach einem der Ansprüche 1 bis 14, welches außerdem umfasst: optische Elemente (19), welche zwischen dem Wellenleiterchip (90) und einer Probenebene (20) angeordnet und eingerichtet sind zum: - Erzeugen einer Pupillenebene an einem Ort des Wellenleiterchips (90), wobei die Ausgänge (37, 38, 39, 47, 48, 49, 57, 58, 59) des Wellenleiterchips (90) insbesondere an der Pupillenebene angeordnet sind, und - Erzeugen eines Interferenzmusters in der Probenebene (20) aus dem Licht, welches die Ausgänge (37, 38, 39, 47, 48, 49, 57, 58, 59) des Wellenleiterchips (90) verlässt, zum Bereitstellen einer strukturierten Beleuchtung in der Probenebene (20).
16. Lichtmikroskop nach einem der Ansprüche 1 bis 15, dadurch gekennzeichnet, dass jeder Lichtleitpfad (32, 42, 52) jeweils mit einem Teiler (33, 43, 53) verbunden ist, welcher in dem Wellenleiterchip (90) gebildet ist und eingerichtet ist zum Teilen des jeweiligen Lichtleitpfads (32, 42, 52) in jeweils vier Teile, wobei drei dieser Teile drei Pfadabschnitte (34, 35, 36; 44, 45, 46; 54, 55, 56) darstellen, und einer (30, 40, 50) dieser Teile Licht so wegführt, dass Licht aus diesem Teil (30, 40, 50) nicht eine Probe beleuchtet.
17. Verfahren zum Bereitstellen von strukturiertem Beleuchtungslicht in einem Lichtmikroskop, wobei das Verfahren zumindest die folgenden Schritte umfasst: - Leiten von Licht (5) einer Lichtquelle (4) zu einer Eingangsauswahlvorrichtung (8); - variables Leiten von Licht mittels der Eingangsauswahlvorrichtung (8) zu einem von mehreren Eingängen (31, 41, 51) eines Wellenleiterchips (90), welcher eingerichtet ist zum Bereitstellen von strukturierter Beleuchtung aus auftreffendem Licht (5); - wobei der Wellenleiterchip (90) außerdem jeweils einen Lichtleitpfad (32, 42, 52) hinter jedem der Eingänge (31, 41, 51) umfasst, wobei jeder Lichtleitpfad (32, 42, 52) sich in mehrere Pfadabschnitte (34, 35, 36; 44, 45, 46; 54, 55, 56) teilt; und wobei jeder Pfadabschnitt (34, 35, 36; 44, 45, 46; 54, 55, 56) zu jeweils einem Ausgang (37, 38, 39, 47, 48, 49, 57, 58, 59) des Wellenleiterchips (90) führt; dadurch gekennzeichnet, - dass Licht die Ausgänge (37, 38, 39, 47, 48, 49, 57, 58, 59) des Wellenleiterchips (90) in eine Austrittsrichtung (75) verlässt, welche quer zu einer Ebene (P) steht, die durch den Wellenleiterchip (90) definiert wird.
18. Verfahren nach Anspruch 17, wobei die Ausgänge (37, 38, 39, 47, 48, 49, 57, 58, 59) des Wellenleiterchips (90) an oder in der Region einer Pupillenebene des Lichtmikroskops angeordnet werden.

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