CN113568294B - 一种全息光镊融合结构光照明显微***和方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提出了一种全息光镊融合结构光照明显微***和方法，属于光学显微***技术领域，其包括全息光镊微操控***和结构光照明显微***，全息光镊微操控***包括激光发生装置、光扩束单元和光调制单元，光扩束单元包括沿激光发生装置的光出射方向依次设置的第一透镜和第二透镜，光调制单元包括沿第二透镜的光出射方向设置的光空间光调制器以及沿光空间光调制器的光出射方向依次设置的第三透镜、第四透镜、第一双色镜和物镜，结构光照明显微***包括照明光源以及沿照明光源的光出射方向依次设置的结构光产生器、第二双色镜、第五透镜、第一双色镜和物镜。

Description

一种全息光镊融合结构光照明显微***和方法
技术领域
本发明属于光学显微***技术领域，涉及光学显微成像和光学捕获技术，具体为一种全息光镊融合结构光照明显微***和方法。
背景技术
与电子显微镜相比，光学显微镜虽然分辨率相对较低，却是研究活体生物样品的最佳显微工具，特别是近年来超分辨光学成像技术快速发展将光学显微镜的分辨率从几百纳米提高到了几纳米。因此，光学显微镜是目前生物、医学等学科领域中研究微观结构、揭示生命过程、诊断病理的重要工具。目前主流的超分辨光学成像技术主要分为两大类：一类是基于单分子定位技术的超分辨显微成像方法，其以光激活定位显微技术(PALM)和随机光学重构显微技术(STORM)为代表；另一类是基于点扩展函数调制的超分辨显微成像方法，其以受激发射损耗显微技术(STED)和结构照明显微技术(SIM)为代表。有别于其它超高分辨率荧光显微镜，结构光照明显微是一次性全视场快速成像技术，可以实现超分辨成像以及三维光切片成像，空间分辨率可以提高到15-50nm左右。SIM是目前成像速度最快的宽场超分辨成像技术，可以实现亚毫秒量级的时间分辨率和大的视场范围。特别需要强调的是SIM不需要特殊的荧光蛋白，而且激发光强小，不易产生光漂白和光毒性，成像视场大，特别适用于活细胞成像应用。然而，现有的超分辨显微成像设备和三维成像设备对样品的空间位置稳定性要求很高，通常需要将样品化学固定或粘附在盖玻片上，导致样品结构容易被破坏，还降低了成像信噪比，因此，现有的超分辨显微成像设备和三维成像设备不适宜用在流体溶液中的生物样品观察，流体溶液中的生物样品由于布朗运动的影响会导致成像分辨率的明显降低，特别是对于需要长时间拍摄的技术，例如STORM、PALM、三维光切片显微成像。利用超分辨显微成像和三维成像来研究具有鞭毛可快速运动的细菌等样品面临着更大的困难，目前的超分辨显微成像技术都无法直接对溶液中的快速运动的活细胞成像。因此，如何在微流环境中实现活细胞的超分辨和三维成像以及是一个亟待解决的科学问题。
发明内容
针对上述现有技术中无法实现流体溶液中生物样品的超分辨和三维成像光学显微的问题，本发明提出了一种全息光镊融合结构光照明显微***和方法，其是通过光镊固定溶液中游动的细胞、大分子等微粒，利用空间光调制器调制入射光波前，在物镜焦区得到预期的光场以对微粒进行捕获与操纵，实现流体溶液中生物样品的超分辨和三维显微成像。全息光镊利用空间光调制器调制入射激光波前，可以产生任意排列分布的点光阱阵列同时捕获多个微粒。将全息光镊与高速超分辨结构光照明显微结合，通过光场调控技术构建特殊三维强度分布的光阱阵列，捕获液体中的多个生物细胞，优化光阱的力学参数使细胞受力平衡，将会实现对液体中游动的多个生物细胞的稳定捕获和结构光照明显微成像，从而实现对快速运动的活细胞成像。其具体技术方案如下：
一种全息光镊融合结构光照明显微***，包括全息光镊微操控***，所述全息光镊微操控***包括激光发生装置、光扩束单元和光调制单元，所述光扩束单元包括沿激光发生装置的光出射方向依次设置的第一透镜和第二透镜，所述光调制单元包括沿第二透镜的光出射方向设置的光空间光调制器以及沿光空间光调制器的光出射方向依次设置的第三透镜、第四透镜、第一双色镜和物镜。
进一步限定，所述全息光镊微操控***还包括第一反射镜、第二反射镜、第三反射镜和样品池，所述样品池设置在物镜的焦面上，所述第一反射镜和第二反射镜自前往后依次设置在第一透镜和第二透镜之间，所述第三反射镜设置在第三透镜和第四透镜之间。
进一步限定，所述全息光镊微操控***还包括样品池，所述样品池设置在物镜的焦面上。
进一步限定，所述全息光镊融合结构光照明显微***还包括结构光照明***，所述结构光照明***包括照明光源以及沿照明光源的光出射方向依次设置的结构光产生器、第二双色镜和第五透镜，所述第一双色镜和物镜自前往后依次设置在经过第五透镜的光出射方向上。
进一步限定，所述全息光镊融合结构光照明显微***还包括相机，所述物镜的出射光依次经过第一双色镜、第五透镜和第二双色镜进入相机。
进一步限定，所述第一透镜的法线与第一反射镜的法线之间的夹角为45°，所述第一反射镜的法线与第二反射镜的法线之间的夹角为47°～50°，所述第三透镜的法线与第三反射镜的法线之间的夹角为47°～50°，所述第三反射镜的法线与第四透镜的法线之间的夹角为47°～50°。
进一步限定，所述第一双色镜的入射光方向与出射光方向垂直，所述第二双色镜的入射光方向与出射光方向垂直。
进一步限定，所述第一透镜与第二透镜共焦，所述空间光调制器位于第三透镜的焦面上，所述第三透镜与第四透镜共焦，所述物镜的入瞳位于第四透镜的焦面上，所述物镜位于第五透镜的焦面上，所述结构光产生器位于第五透镜的焦面上，所述相机位于第五透镜的焦面上；所述空间光调制器是振幅型空间光调制器或相位型空间光调制器；所述照明光源是相干光源或非相干光源；所述结构光产生器是朗奇光栅、正弦光栅、数字微镜器件或液晶空间光调制器。
基于上述一种全息光镊融合结构光照明显微***实现全息光镊融合结构光照明显微方法，包括以下步骤：
1)产生平行激光束，平行激光束被调制后聚焦产生光阱阵列，控制光阱阵列的光场分布及位置，通过光阱阵列对应的不同分布及不同位置的光场对样品中的不同分布及不同位置的多个微粒进行捕获与操纵；
2)产生携带条纹信息的结构光，携带条纹信息的结构光依次经过反射、准直形成高空间频率的结构光，高空间频率的结构光照射样品中被捕获和操纵的不同分布及不同位置的多个微粒，使被捕获和操纵的不同分布及不同位置的多个微粒发射出荧光信号，荧光信号形成图像被收集。
进一步限定：
所述步骤1)具体为：激光发生装置发出的线偏振光依次经过第一透镜、第一反射镜、第二反射镜和第二透镜产生与空间光调制器匹配的平行激光束，平行激光束入射至空间光调制器上进行调制，调制后的平行激光束依次经过第三透镜、第三反射镜、第四透镜和第一双色镜，被第一双色镜中继到物镜的入瞳，同时平行激光束在物镜的焦平面上聚焦产生光阱阵列，控制光阱阵列的光场分布及位置，通过光阱阵列对应的不同分布及不同位置的光场对样品中的不同分布及不同位置的多个微粒进行捕获与操纵；
所述步骤2)具体为：照明光源产生的照明光经过结构光产生器调控后形成携带条纹信息的结构光，通过结构光产生器上加载的全息图，旋转携带条纹信息的结构光依次经过第二双色镜、第五透镜和第一双色镜反射、准直后投影至物镜的焦平面上形成高空间频率的结构光，高空间频率的结构光照射样品池，使样品池中被不同分布及不同位置的光场捕获和操纵的多个微粒发射出荧光信号，该荧光信号被物镜收集；物镜收集到的荧光信号依次经过第一双色镜、第五透镜和第二双色镜形成图像，相机对图像进行收集。
进一步限定，所述物镜焦平面上的光阱阵列满足：
Figure BDA0003166632280000031
其中，Efocus是目标光阱阵列，
Figure BDA0003166632280000032
表示物镜入瞳处光场分布的傅里叶变换，k0是真空中的波数，λ0是真空中的波长，i表示复数虚部，f是透镜焦距，(x，y，z)是焦场坐标，x方向的空间频率fx＝x/λ0f，y方向的空间频率fy＝y/λ0f。根据傅里叶变换得到公式：
Figure BDA0003166632280000041
其中，Emod表示被空间光调制器调制前后位于物镜入瞳处的光场分布，通过改变加载至空间光调制器的全息图控制光阱阵列的光场分布和位置，进而通过不同分布及不同位置光阱阵列的光场对样品池中的多个微粒进行捕获与操纵；
所述相机收集结构光超分辨成像图像和结构光照明光切片成像：
其中，结构光照明超分辨成像的图像收集过程为：
1.1)采取相移的方式改变携带条纹信息的结构光的条纹初相位得到三个不同的初相位
Figure BDA0003166632280000042
和
Figure BDA0003166632280000043
由相机(17)收集的图像D1、D2和D3按照以下公式计算：
Figure BDA0003166632280000044
其中，
Figure BDA0003166632280000045
和
Figure BDA0003166632280000046
分别表示在三个初相位
Figure BDA0003166632280000047
下相机(17)收集到的图像强度D1、D2和D3做傅里叶变换得到的频率域分布，m表示调制深度，i表示复数虚部，
Figure BDA0003166632280000048
Figure BDA0003166632280000049
表和
Figure BDA00031666322800000410
分别表示在三个初相位
Figure BDA00031666322800000411
结构光照明下的样品结构分布的傅里叶变换，k表示频率坐标的变量，k0为结构条纹的空间频率，OTF(k)是***PSF的傅里叶变换；
通过公式(3)计算
Figure BDA00031666322800000412
和
Figure BDA00031666322800000413
通过合成频谱并求空间域分布得到一个方向的图像；
1.2)通过旋转结构光产生器上加载的全息图，改变携带条纹信息的结构光的条纹方向，重复步骤1.1)得到另外一个方向的图像；
1.3)多次重复步骤1.1)和1.2)收集多个方向的图像，将多个方向的图像的频谱合成得到扩大的频谱分布，通过傅里叶变换得到二维超分辨图像；
结构光照明光切片成像的图像收集过程为：
使用三步相移光场，通过切片算法分离像面信息与非像面信息，得到切片图像；具体步骤为：
2.1)设定正弦条纹结构光场的初相位
Figure BDA00031666322800000414
和
Figure BDA00031666322800000415
分别照明样品，并使用相机采集各个初相位的图像Ι1、Ι2和Ι3；
2.2)建立坐标系，光学显微***的光轴定义为Z轴，与光轴垂直的平面为X-Y平面，通过下列公式(3)计算出纵向位置z处的宽场光切片图Iz(x,y)：
Figure BDA0003166632280000051
与现有技术相比，本发明的有益效果在于：
1、本发明一种全息光镊融合结构光照明显微***，其全息光镊微操控***包括激光发生装置、光扩束单元和光调制单元，光扩束单元包括第一透镜、第一反射镜、第二反射镜和第二透镜，光调制单元包括空间光调制器、第三透镜、第三反射镜、第四透镜、第一双色镜和物镜，激光发生装置发出的线偏振光依次经过第一透镜、第一反射镜、第二反射镜和第二透镜扩束准直后形成与空间光调制器匹配的平行激光束，该平行激光束进入空间光调制器进行调制，调制后的平行激光束依次经过第三透镜、第三反射镜、第四透镜和第一双色镜，被第一双色镜中继到物镜的入瞳，同时激光束在物镜的焦平面上聚焦产生任意排列分布的光阱阵列，对样品池中的多个微粒进行捕获与操纵，可以同时独立操控多个微粒的位置和姿态，将溶液中游动的细胞、大分子等微粒固定；结构光照明超分辨***包括照明光源、结构光产生器、第二双色镜和第五透镜，照明光源产生的照明光经过结构光产生器形成携带条纹信息的结构光，携带条纹信息的结构光依次经过第二双色镜第五透镜和第一双色镜后投影至物镜的焦平面上形成高空间频率的结构光，高空间频率的结构光照射样品池上使样品池中的微粒发射出荧光信号被物镜收集，物镜收集到样品池中的微粒发射出的荧光信号后依次经过第一双色镜、第五透镜和第二双色镜，由相机进行图像收集，对样品进行切片和超分辨成像即可实现对样品的三维超分辨成像，以实现对流体中多个微粒的三维空间操控和三维超分辨成像。
2、本发明将基于空间光场调控的全息光镊与结构光照明显微成像结合，建立了新的三维光学操控和三维光学显微超分辨成像平台，其具有全息光镊微操控、光切片成像、超分辨成像三个功能，可以满足对于围观样品的多功能操控、切片成像和超分辨成像研究。
3、全息光镊具有无损操控特点，可以将微粒长时间固定在光阱中，因此本***可以实现对微粒的长时间三维超分辨成像跟踪研究，可以对流体中多个微粒同时实现超分辨成像，利用全息光镊对样品的姿态控制，可以对样品的任一方向实现超分辨成像。同时依据光镊的无损操控特点，可以实现对样品的长时间超分辨成像研究，特别适合于生物***。
4、本发明的全息光镊融合结构光照明显微***能够实现对样品的任意姿态进行控制和成像，对于形状为棒状的细胞在聚焦的高斯光阱中很容易产生旋转和抖动，非常不利于显微成像，但是采用空间光场调控技术可同时产生多个点光斑，通过控制光斑的位置作用与棒状细胞的两端，进一步改变两端光斑的三维空间位置，可以操控细胞的两端移动，从而改变其取向。点光斑的高精度控制可以保证样品的高精度取向控制，实现任意姿态样品的成像。对于一些特殊的样品形状，可以通过复振幅调控算法构建特殊光阱，例如线状光阱来控制细胞姿态，使细胞的长轴方向分别沿光轴方向或者垂直于光轴方向。通过对细胞姿态的控制可以对细胞的横向结构和轴向结构进行超分辨成像分析。
5、本发明的全息光镊融合结构光照明显微***能够实现对样品同时长时间成像，光镊通常使用近红外波段激光，对于水溶液和生物样品都是处于低吸收窗口，因此对于生物样品是无损的。基于这个特点，光镊可以长时间固定样品，因此利用光镊可以实现对水溶液中生物样品的长时间跟踪成像。而全息光镊利用空间光调制器调制入射光波前，可以产生任意排列分布的光阱阵列同时捕获多个微粒。将全息光镊与高速超分辨SIM结合，通过光场调控技术构建特殊三维强度分布的光阱阵列，捕获液体中的多个生物细胞，优化光阱的力学参数使细胞受力平衡，将会实现对液体中游动的多个生物细胞稳定捕获。同时基于***的超分辨功能，可以同时对多个细胞进行单细胞超分辨成像分析。基于光镊的无损特性，可将细胞长时间固定在光阱中，在光阱中的细胞将保持在像面上，因此可以实现多个细胞的长时间跟踪研究。如果没有光镊作用，由于扩散作用在流体中的细胞等微观粒子将会离焦，直至完全离开像面，因此传统超分辨成像***难以实现对细胞的长时间成像跟踪研究。本***还可以应用在微流芯片环境中进行，可以在超分辨成像之后对活细胞进行分选和收集，进行DNA测序等其他生物学后续研究，为活细胞的实时动态观测提供一种全新的技术手段。
附图说明
图1为本发明全息光镊融合结构光照明显微***的结构示意图；
图2为利用光阱阵列捕获E.coli细胞及其控制姿态；其中，(a)为5×5的轴向拉长的条形光阱阵列；(b)为条形光阱沿轴向固定E.coli细胞；(c)为5×5的横向的条形光阱阵列；(d)为条形光阱沿横向固定E.coli细胞；
其中，1-激光器，2-第一透镜，3-第一反射镜，4-第二反射镜，5-第二透镜，6-空间光调制器，7-第三透镜，8-第三反射镜，9-第四透镜，10-第一双色镜，11-物镜，12-样品池，13-照明光源，14-结构光产生器，15-第二双色镜，16-第五透镜，17-相机。
具体实施方式
下面结合附图及实施例对本发明的技术方案进行进一步地解释说明，但本发明并不限于以下说明的实施方式。
参见图1，本发明一种全息光镊融合结构光照明显微***，其包括全息光镊微操控***，全息光镊微操控***包括激光发生装置、光扩束单元和光调制单元，光扩束单元包括第一透镜2、第一反射镜3、第二反射镜4和第二透镜5，第一透镜2、第一反射镜3、第二反射镜4和第二透镜5沿激光发生装置的光出射方向依次设置，光调制单元包括空间光调制器6、第三透镜7、第三反射镜8、第四透镜9、第一双色镜10和物镜11，空间光调制器6设置在第二透镜5的光出射方向，第三透镜7、第三反射镜8、第四透镜9、第一双色镜10和物镜11依次设置在空间光调制器6的光出射方向上。激光发生装置为激光器1。
全息光镊微操控***还包括样品池12，样品池12设置在物镜11的焦面上。
上述全息光镊融合结构光照明显微***还包括结构光照明***，结构光照明***包括照明光源13、结构光产生器14、第二双色镜15和第五透镜16，结构光产生器14、第二双色镜15、第五透镜16、第一双色镜10和物镜11沿照明光源13的光出射方向依次设置。
上述全息光镊融合结构光照明显微***还包括相机17，物镜11的出射光依次经过第一双色镜10、第五透镜16和第二双色镜15进入相机17。
第一透镜2的法线与第一反射镜3的法线之间的夹角为45°，第一反射镜3的法线与第二反射镜4的法线之间的夹角为47°～50°，第三透镜7的法线与第三反射镜8的法线之间的夹角为47°～50°，第三反射镜8的法线与第四透镜9的法线之间的夹角为47°～50°。
优选的第一透镜2的法线与第一反射镜3的法线之间的夹角为45°，第一反射镜3的法线与第二反射镜4的法线之间的夹角为48°，第三透镜7的法线与第三反射镜8的法线之间的夹角为48°，第三反射镜8的法线与第四透镜9的法线之间的夹角为48°。
第一双色镜10的入射光方向与出射光方向垂直，第二双色镜15的入射光方向与出射光方向垂直。
第一透镜2与第二透镜5共焦，第一透镜2与第二透镜5构成扩束器，激光器1的输出激光束扩束成光斑直径与空间光调制器6液晶面板尺寸相匹配的平行激光束；空间光调制器6位于第三透镜7的焦面上，第三透镜7与第四透镜9共焦，第三透镜7与第四透镜9共同组成4f***，空间光调制器6调制后的平行激光束被第三透镜7与第四透镜9组成的4f***经第一双色镜10中继到物镜11的入瞳；物镜11的入瞳位于第四透镜9的焦面上，物镜11位于第五透镜16的焦面上，结构光产生器14位于第五透镜16的焦面上，相机17位于第五透镜16的焦面上；空间光调制器6是振幅型空间光调制器或相位型空间光调制器；照明光源13为相干光源或非相干光源；结构光产生器14为朗奇光栅、正弦光栅、数字微镜器件DMD或液晶空间光调制器；第二双色镜15反射照明光源13发出的光束，投射到样品池12上使样品池12内的微粒发射出的荧光信号；相机17为灰度相机或彩色相机；物镜11为高数值孔径物镜。
基于上述种全息光镊融合结构光照明显微***实现全息光镊融合结构光照明显微方法，其包括以下步骤:
1)激光器1发射出的线偏振光依次经过第一透镜2、第一反射镜3、第二反射镜4和第二透镜5扩束、准直后产生与空间光调制器6的液晶面板尺寸相匹配的平行激光束，该平行激光束入射至空间光调制器6上进行调制，调制后的平行激光束依次经过第三透镜7、第三反射镜8、第四透镜9和第一双色镜10，被第三透镜7和第四透镜9组成的4f***经第一双色镜10中继到物镜11的入瞳，同时激光束在物镜11的焦平面上聚焦产生光阱阵列，控制光阱的光场分布及位置，通过光阱阵列对应的不同分布及不同位置的光场对样品中的不同分布及不同位置的多个微粒进行捕获与操纵；即将溶液中游动的细胞、大分子等微粒固定，实现对微粒的长时间三维成像跟踪研究；
2)照明光源13产生的照明光照射结构光产生器14表面，经结构光产生器14调控后形成携带条纹信息的结构光，通过旋转结构光产生器14上加载的全息图，携带条纹信息的结构光依次经过第二双色镜15、第五透镜16和第一双色镜10后由物镜11投影至物镜11的焦平面，形成高空间频率的结构光，高空间频率的结构光照射样品池12，使样品池12中被不同分布及不同位置的光场捕获和操纵的多个微粒发射出荧光信号，该荧光信号被物镜11收集；物镜11收集到的荧光信号依次经过第一双色镜10、第五透镜16和第二双色镜15形成图像，相机17对图像进行收集。
上述步骤1)中物镜11焦平面上的光阱阵列满足：
Figure BDA0003166632280000081
其中，Efocus是目标光阱阵列，
Figure BDA0003166632280000082
表示物镜入瞳处光场分布的傅里叶变换，k0是真空中的波数，λ0是真空中的波长，i表示复数虚部，f是透镜焦距，(x，y，z)是焦场坐标，x方向的空间频率fx＝x/λ0f，y方向的空间频率fy＝y/λ0f；根据傅里叶变换得到公式：
Figure BDA0003166632280000083
其中，Emod表示被空间光调制器6调制前后位于物镜11入瞳处的光场分布，通过改变加载至空间光调制器6的全息图控制光阱阵列的光场分布和位置，进而通过不同分布及不同位置光阱阵列的光场对样品池12中的多个微粒进行捕获与操纵。
相机17收集结构光超分辨成像图像和结构光照明光切片成像，
其中，结构光照明超分辨成像的图像收集过程为：
1.1)采用相移的方式改变携带条纹信息结构光的条纹的初相位得到三个不同的初相位
Figure BDA0003166632280000091
和
Figure BDA0003166632280000092
由相机17收集的图像D1、D2和D3按照以下公式计算：
Figure BDA0003166632280000093
其中，
Figure BDA0003166632280000094
和
Figure BDA0003166632280000095
分别表示在三个初相位
Figure BDA0003166632280000096
下相机(17)得到的图像强度D1、D2和D3做傅里叶变换得到的频率域分布，m表示调制深度，i表示复数虚部，
Figure BDA0003166632280000097
Figure BDA0003166632280000098
表和
Figure BDA0003166632280000099
分别表示在三个初相位
Figure BDA00031666322800000910
结构光照明下的样品结构分布的傅里叶变换，k表示频率坐标的变量，k0为结构条纹的空间频率，OTF(k)是***PSF的傅里叶变换；
通过公式(3)计算
Figure BDA00031666322800000911
和
Figure BDA00031666322800000912
通过合成频谱并求空间域分布得到一个方向的图像；
1.2)通过旋转结构光产生器14上加载的全息图，改变携带条纹信息的结构光的条纹方向，重复步骤1.1)得到另外一个方向的图像；
1.3)多次重复步骤1.1)和1.2)得到多个方向的图像，将多个方向的图像的频谱合成得到扩大的频谱分布，通过傅里叶变换得到二维或三维超分辨图像；
例如：2.1.1)建立坐标系，在某一方向，如x方向，把正弦条纹结构光场的初相位
Figure BDA00031666322800000913
依次设定为0°、120°、240°，通过步骤2)的方式进行照明并对样品池12中的微粒发射出荧光信号通过物镜11进行收集，并使用相机17同步采集三幅图像，依次对应记录为D1、D2和D3，根据公式(3)求解
Figure BDA00031666322800000914
和
Figure BDA00031666322800000915
重复1.2)将结构光场条纹方向分别旋转120°和240°，中部重复步骤2.1.1)，分别求出对应的旋转120°得到的
Figure BDA00031666322800000916
和
Figure BDA00031666322800000917
和旋转240°得到的
Figure BDA00031666322800000918
和
Figure BDA00031666322800000919
重复1.3)将三个方向的频谱合成得到扩大的频谱分布，做傅里叶变换得到二维超分辨图像。
结构光照明光切片成像的图像收集过程为：
使用三步相移光场，通过切片算法有效分离像面信息与非像面信息，得到切片图像；具体步骤为：
2.1)设定正弦条纹结构光场的初相位
Figure BDA0003166632280000101
和
Figure BDA0003166632280000102
分别为0°、120°、240°，分别照明样品，并使用相机采集各个初相位的图像Ι1、Ι2和Ι3；
2.2)建立坐标系，光学显微***的光轴定义为Z轴，与光轴垂直的平面为X-Y平面，通过下列公式(3)计算出纵向位置z处的宽场光切片图Iz(x,y)：
Figure BDA0003166632280000103
上述超分辨图像与切片图像是两个并列的成像模式；超分辨图像的分辨率高，更清楚；切片图像是三维图像。
以捕获多个大肠杆菌(E.coli)细胞的并行操控实现超分辨成像为例，说明本发明的具体实施过程，采取四个步骤：
3.1)首先利用非迭代算法在细胞所在位置实时地产生光阱将细胞固定并有序排列，所调控的光阱光场分布满足公式(1)。
3.2)在将特定数量的细胞捕获并有序排列后，使用迭代算法产生与细胞所在位置相一致的条形光阱阵列来控制细胞的取向。由于E.coli的形态是棒状的(3微米*0.5微米)，采用条形光阱来控制E.coli细胞的取向。为此，本发明设计了与其形态基本一致的条形光阱，如图2b和2d所示。利用这样的条形光阱可以将细胞沿轴向(Z)或者横向(X，Y)固定，如图2a和2c所示是利用迭代算法所产生的分布为5×5的轴向和横向拉长的条形光阱阵列。利用这样的光阱阵列可以并行捕获和操控多个E.coli细胞，还可以改变条形光阱的长轴方向，从而精密操控被捕获生物细胞的三维空间位置姿态和旋转角度。
3.3)重复2.1)实现对这25个细胞某一特定姿态下的超分辨成像。
3.4)改变加载到空间光调制器上的全息图，控制细胞的姿态，重复3.1)～3.3)，实现对细胞任意姿态的超分辨成像。
每次成像25个细胞为例(每次成像时间<1s)，本发明的时间分辨率不仅比光镊-STORM技术高两到三个数量级，而且本发明可以结合微流控技术进行后续的包括DNA测序等其他生物学实验研究。

Claims (9)

1.一种全息光镊融合结构光照明显微***，其特征在于，包括全息光镊微操控***，所述全息光镊微操控***包括激光发生装置、光扩束单元和光调制单元，所述光扩束单元包括沿激光发生装置的光出射方向依次设置的第一透镜(2)和第二透镜(5)，所述光调制单元包括沿第二透镜(5)的光出射方向设置的空间光调制器(6)以及沿空间光调制器(6)的光出射方向依次设置的第三透镜(7)、第四透镜(9)、第一双色镜(10)和物镜(11)；
所述全息光镊融合结构光照明显微***还包括结构光照明***，所述结构光照明***包括照明光源(13)以及沿照明光源(13)的光出射方向依次设置的结构光产生器(14)、第二双色镜(15)和第五透镜(16)，所述第一双色镜(10)和物镜(11)自前往后依次设置在经过第五透镜(16)的光出射方向上。
2.如权利要求1所述的一种全息光镊融合结构光照明显微***，其特征在于，所述全息光镊微操控***还包括第一反射镜(3)、第二反射镜(4)、第三反射镜(8)和样品池(12)，所述样品池(12)设置在物镜(11)的焦面上，所述第一反射镜(3)和第二反射镜(4)自前往后依次设置在第一透镜(2)和第二透镜(5)之间，所述第三反射镜(8)设置在第三透镜(7)和第四透镜(9)之间。
3.如权利要求2所述的一种全息光镊融合结构光照明显微***，其特征在于，所述全息光镊融合结构光照明显微***还包括相机(17)，所述物镜(11)的出射光依次经过第一双色镜(10)、第五透镜(16)和第二双色镜(15)进入相机(17)。
4.如权利要求3所述的一种全息光镊融合结构光照明显微***，其特征在于，所述第一透镜(2)的法线与第一反射镜(3)的法线之间的夹角为45°，所述第一反射镜(3)的法线与第二反射镜(4)的法线之间的夹角为47°～50°，所述第二透镜(5)的法线与第三反射镜(4)的法线之间的夹角为47°～50°，所述第三透镜(7)的法线与第三反射镜(8)的法线之间的夹角为47～50°，所述第三反射镜(8)的法线与第四透镜(9)的法线之间的夹角为47°～50°。
5.如权利要求4所述的一种全息光镊融合结构光照明显微***，其特征在于，所述第一双色镜(10)的入射光方向与出射光方向垂直，所述第二双色镜(15)的入射光方向与出射光方向垂直。
6.如权利要求5所述的一种全息光镊融合结构光照明显微***，其特征在于，所述第一透镜(2)与第二透镜(5)共焦，所述空间光调制器(6)位于第三透镜(7)的焦面上，所述第三透镜(7)与第四透镜(9)共焦，所述物镜(11)的入瞳位于第四透镜(9)的焦面上，所述物镜(11)位于第五透镜(16)的焦面上，所述结构光产生器(14)位于第五透镜(16)的焦面上，所述相机(17)位于第五透镜(16)的焦面上；所述空间光调制器(6)是振幅型空间光调制器或相位型空间光调制器；所述照明光源(13)是相干光源或非相干光源；所述结构光产生器(14)是朗奇光栅、正弦光栅、数字微镜器件或液晶空间光调制器。
7.基于权利要求6所述的一种全息光镊融合结构光照明显微***实现全息光镊融合结构光照明显微方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)产生平行激光束，平行激光束被调制后聚焦产生光阱阵列，控制光阱阵列的光场分布及位置，通过光阱阵列对应的不同分布及不同位置的光场对样品中的不同分布及不同位置的多个微粒进行捕获与操纵；
2)产生携带条纹信息的结构光，携带条纹信息的结构光依次经过反射、准直形成高空间频率的结构光，高空间频率的结构光照射样品中被捕获和操纵的不同分布及不同位置的多个微粒，使被捕获和操纵的不同分布及不同位置的多个微粒发射出荧光信号，荧光信号形成图像被收集。
8.如权利要求7所述的全息光镊融合结构光照明显微方法，其特征在于，
所述步骤1)具体为：激光发生装置发出的线偏振光依次经过第一透镜(2)、第一反射镜(3)、第二反射镜(4)和第二透镜(5)产生与空间光调制器(6)匹配的平行激光束，平行激光束入射至空间光调制器(6)上进行调制，调制后的平行激光束依次经过第三透镜(7)、第三反射镜(8)、第四透镜(9)和第一双色镜(10)，被第一双色镜(10)中继到物镜(11)的入瞳，同时平行激光束在物镜(11)的焦平面上聚焦产生光阱阵列，控制光阱阵列的光场分布及位置，通过光阱阵列对应的不同分布及不同位置的光场对样品中的不同分布及不同位置的多个微粒进行捕获与操纵；
所述步骤2)具体为：照明光源(13)产生的照明光经过结构光产生器(14)调控后形成携带条纹信息的结构光，通过旋转结构光产生器(14)，携带条纹信息的结构光依次经过第二双色镜(15)、第五透镜(16)和第一双色镜(10)反射、准直后投影至物镜(11)的焦平面上形成高空间频率的结构光，高空间频率的结构光照射样品池(12)，使样品池(12)中被不同分布及不同位置的光场捕获和操纵的多个微粒发射出荧光信号，该荧光信号被物镜(11)收集；物镜(11)收集到的荧光信号依次经过第一双色镜(10)、第五透镜(16)和第二双色镜(15)形成图像，相机(17)对图像进行收集。
9.如权利要求8所述的全息光镊融合结构光照明显微方法，其特征在于，所述物镜(11)焦平面上的光阱阵列满足：
Figure FDA0003572289770000031
其中，Efocus是目标光阱阵列，
Figure FDA0003572289770000032
表示物镜入瞳处光场分布的傅里叶变换，k0是真空中的波数，λ0是真空中的波长，i表示复数虚部，f是透镜焦距，(x，y，z)是焦场坐标，x方向的空间频率fx＝x/λ0f，y方向的空间频率fy＝y/λ0f；根据傅里叶变换得到公式：
Figure FDA0003572289770000033
其中，Emod表示被空间光调制器(6)调制前后位于物镜(11)入瞳处的光场分布，通过改变加载至空间光调制器(6)的全息图控制光阱阵列的光场分布和位置，进而通过不同分布及不同位置光阱阵列的光场对样品池(12)中的多个微粒进行捕获与操纵；
所述相机(17)收集结构光超分辨成像图像和结构光照明光切片成像，
其中，结构光照明超分辨成像的图像收集过程为：
1.1)采取相移的方式改变携带条纹信息的结构光的条纹初相位得到三个不同的初相位
Figure FDA0003572289770000034
和
Figure FDA0003572289770000035
由相机(17)收集的图像D1、D2和D3按照以下公式计算：
Figure FDA0003572289770000036
其中，
Figure FDA0003572289770000037
和
Figure FDA0003572289770000038
分别表示在三个初相位
Figure FDA0003572289770000039
下相机(17)收集到的图像强度D1、D2和D3做傅里叶变换得到的频率域分布，m表示调制深度，i表示复数虚部，
Figure FDA00035722897700000310
Figure FDA00035722897700000311
表和
Figure FDA00035722897700000312
分别表示在三个初相位
Figure FDA00035722897700000313
结构光照明下的样品结构分布的傅里叶变换，k表示频率坐标的变量，k0为结构条纹的空间频率，OTF(k)是***PSF的傅里叶变换；
通过公式(3)计算
Figure FDA00035722897700000314
和
Figure FDA00035722897700000315
通过合成频谱并求空间域分布得到一个方向的图像；
1.2)通过旋转结构光产生器(14)上加载的全息图，改变携带条纹信息的结构光的条纹方向，重复步骤1.1)得到另外一个方向的图像；
1.3)多次重复步骤1.1)和1.2)收集多个方向的图像，将多个方向的图像的频谱合成得到扩大的频谱分布，通过傅里叶变换得到二维超分辨图像；
结构光照明光切片成像的图像收集过程为：
使用三步相移光场，通过切片算法分离像面信息与非像面信息，得到切片图像；具体步骤为：
2.1)设定正弦条纹结构光场的初相位
Figure FDA0003572289770000041
和
Figure FDA0003572289770000042
分别照明样品，并使用相机采集各个初相位的图像Ι1、Ι2和Ι3；
2.2)建立坐标系，光学显微***的光轴定义为Z轴，与光轴垂直的平面为X-Y平面，通过下列公式(4 )计算出纵向位置z处的宽场光切片图Iz(x,y)：
Figure FDA0003572289770000043
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