DE102006011176B4

DE102006011176B4 - Verfahren und Vorrichtung zum räumlich hoch aufgelösten Abbilden einer mit einem Fluoreszenzfarbstoff markierten Struktur

Info

Publication number: DE102006011176B4
Application number: DE200610011176
Authority: DE
Inventors: Christian Dr. Eggeling; Arnold Giske; Stefan W. Prof. Dr. Hell
Original assignee: Max Planck Gesellschaft zur Foerderung der Wissenschaften eV
Current assignee: Max Planck Gesellschaft zur Foerderung der Wissenschaften eV
Priority date: 2006-03-10
Filing date: 2006-03-10
Publication date: 2008-01-24
Anticipated expiration: 2026-03-11
Also published as: DE102006011176A1

Abstract

Verfahren zum räumlich hochaufgelösten Abbilden einer mit einem Fluoreszenzfarbstoff markierten Struktur, wobei der Fluoreszenzfarbstoff innerhalb eines Bereichs wiederholt mit Anregungslicht zur Emission von Fluoreszenzlicht angeregt wird, indem er aus einem Grundzustand in einen angeregten fluoreszierenden Zustand überführt wird, und wobei Fluoreszenzlicht aus dem Bereich registriert wird, um eine räumliche Konzentrationsverteilung des Fluoreszenzfarbstoffs zu bestimmen, wobei der Fluoreszenzfarbstoff in dem Bereich vor einer Wiederholung seiner Anregung mit einem optischen Signal beaufschlagt wird, wodurch ein Verhältnis einer Ausbeute an Fluoreszenzlicht zu der Konzentration des Fluoreszenzfarbstoffs in dem Bereich bei der sich anschließenden Anregung des Fluoreszenzfarbstoffs erhöht wird, dadurch gekennzeichnet, dass das optische Signal (10) eine andere Wellenlänge als das Anregungslicht (6) aufweist und das Verhältnis der Ausbeute auf einen Wert stabilisiert, der gegenüber einem ohne das optische Signal abfallenden Wert erhöht ist, und dass die Struktur während des wiederholten Anregens mit dem Anregungslicht (6) auf einer reduzierten Temperatur von weniger als 0...

Description

TECHNISCHES GEBIET DER ERFINDUNG
Die Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zum räumlich hoch aufgelösten Abbilden einer mit einem Fluoreszenzfarbstoff markierten Struktur mit den Merkmalen des unabhängigen Patentanspruchs 1 so wie auf eine Vorrichtung zum räumlich hoch aufgelösten Abbilden einer mit einem Fluoreszenzfarbstoff markierten Struktur mit den Merkmalen des Oberbegriffs des unabhängigen Patentanspruchs 15.
Bei einem derartigen Verfahren und einer derartigen Vorrichtung geht es darum, eine räumliche Konzentrationsverteilung des Fluoreszenzfarbstoffs zu bestimmen. Diese räumliche Konzentrationsverteilung kann ein Bild der Struktur in unterschiedlichen lokalen Helligkeitsstufen sein, wobei die lokale Helligkeit der lokalen Konzentration des Fluoreszenzfarbstoffs entspricht. Die Konzentrationsverteilung über die Struktur kann aber auch qualitativ, d.h. in absoluten Konzentrationen oder relativen Konzentrationseinheiten bestimmt werden.
STAND DER TECHNIK
Es sind Fluoreszenzmikroskope bekannt, bei denen ein Fluoreszenzfarbstoff in einer Probe mit gepulstem Anregungslicht zur Emission von Fluoreszenzlicht angeregt wird, indem er aus einem Grundzustand in einen angeregten fluoreszierenden Zustand überführt wird. Dabei kann das gepulste Anregungslicht verwendet werden, um den Fluoreszenzfarbstoff in einem Teilbereich des Bereichs, indem er zunächst in einen angeregten fluoreszierenden Zustand überführt wurde, mit Abregungslicht wieder zurück in den Grundzustand überführen zu können, so dass das von dem Fluoreszenzfarbstoff spontan emittierte Fluoreszenzlicht anschließend nur aus dem verbliebenen Bereich stammen kann, in dem der Fluoreszenzfarbstoff nicht abgeregt wurde. Auf diese Weise wird die räumliche Auflösung bei der Registrierung des spontan emittierten Fluoreszenzlichts erhöht, wobei eine Unterschreitung der Berechnungsgrenze möglich ist. Diese Vorgehensweise ist als SIED(Stimulated Emission Depletion)-Fluoreszenzmikroskopie aus S.W. Hell, J. Wichmann: Opt. Lett. 19, 11 (1994) 780-782 bekannt.
Eine weitere Möglichkeit der Erhöhung der räumlichen Auflösung bei der Fluoreszenzmikroskopie besteht darin, den Fluoreszenzfarbstoff in einem Teilbereich des Bereichs, in dem er anschließend zur Emission von Fluoreszenzlicht angeregt wird, zuvor mit Überführungslicht in einen Dunkelzustand, beispielsweise in einen nicht fluoreszierenden Tripletzustand zu überführen. Auch dann kann das in Folge der Anregung registrierte Fluoreszenzlicht nur aus dem verbliebenen Bereich stammen, in dem sich der Fluoreszenzfarbstoff nicht in dem Tripletzustand befindet. Diese Vorgehensweise ist als GSD(Ground State Depletion)-Fluoreszenzmikroskopie aus S.W. Hell, M. Kroug: Appl. Phys. B 60, 5(1995)495-7 bekannt.
Beim wiederholten Anregen eines Fluoreszenzfarbstoffs mit Anregungslicht zur Emission von Fluoreszenzlicht tritt häufig eine über die Wiederholungen der Anregung stetig größer werdende Abnahme bei der Ausbeute an Fluoreszenzlicht auf. Diese Abnahme ist zum Teil reversibel, d.h. sie geht nach gewisser Zeit wieder zurück und ist somit nicht auf ein vollständiges Ausbleichen des Fluoreszenzfarbstoffs zurückzuführen. Aber auch das vollständige Ausbleichen eines Fluoreszenzfarbstoffs tritt bei höherer Frequenz seiner Anregung schon nach einer geringeren Gesamtausbeute an Fluoreszenzlicht auf, als wenn seine Anregung mit niedrigerer Frequenz erfolgt. Umgekehrt ist eine häufige Wiederholung der Anregung notwendig, um über einen begrenzten Messzeitraum, über den beispielsweise ein Fluoreszenzmikroskop stabil gehalten werden kann, genügend Fluoreszenzlicht zu registrieren, um hierüber beispielsweise die mit dem Fluoreszenzfarbstoff markierte Struktur erkennen zu können. Es muss in der Regel ein Kompromiss eingegangen werden, bei dem die Wiederholung des Anregens des Fluoreszenzfarbstoffs mit Anregungslicht zur Emission von Fluoreszenzlicht gerade so langsam erfolgt, dass von Wiederholung zu Wiederholung die Ausbeute an Fluoreszenzlicht nicht allzu sehr zurückgeht, während die Wiederholungen gleichzeitig so schnell erfolgen, dass in einem begrenzten Messzeitraum möglichst viel Fluoreszenzlicht registriert wird. Dabei wird eine Abnahme des Verhältnisses zwischen der Ausbeute an Fluoreszenzlicht und der vorliegenden Konzentration an Fluoreszenzfarbstoff über die Wiederholungen der Anregung des Fluoreszenzfarbstoffs hinweg in Kauf genommen.
Ein Verfahren mit den Merkmalen des Oberbegriffs des unabhängigen Patentanspruchs 1 und eine Vorrichtung mit den Merkmalen des Oberbegriffs des unabhängigen Patentanspruchs 11 sind aus Zhengxi Huang, et al.: Colloids and Surfaces A: Physiochem. Eng. Aspects 257-258, 203 (2005) bekann. Hier wird über Einzelmolekülfluoreszenzspektroskopie an einem Fluoreszenzfarbstoff berichtet, bei der eine Ausbeute an Fluoreszenzlicht von dem Fluoreszenzfarbstoff durch eine erhöhte Wiederholungsrate der Anregung und/oder eine hohe Intensität der Anregung erhöht ansteigt. Dies wird darauf zurückgeführt, dass unter den genannten Bedingungen die Wahrscheinlichkeit erhöht ist, dass der Fluoreszenzfarbstoff aus seinem nicht fluoreszierenden Tripletzustand in seinen fluoreszenzfähigen Singuletzustand zurückkehrt. Im Zusammenhang mit dieser Erklärung wird darauf verwiesen, dass es grundsätzlich bekannt ist, dass Fluoreszenzfarbstoff mit einem optischen Signal einer anderen Wellenlänge als derjenigen, die zu ihrer Anregung benötigt wird, aus ihrem Tripletzustand in ihren Singuletzustand zurückgebracht werden können. In der Veröffentlichung wird auch berichtet, dass die Vorgehensweise mit erhöhter Widerholungsrate und/oder erhöhter Intensität zu einem schnelleren Bleichen des Fluoreszenzfarbstoffs führt. Ein räumlich hochaufgelöstes Abbilden wird nur insoweit beschrieben, als dass bei dem bekannten Verfahren zum Erfassen des Fluoreszenzlichts von den einzelnen Molekülen des Fluoreszenzfarbstoffs ein konfokales Fluoreszenzlichtmikroskop eingesetzt wird. Damit wird nur die Verteilung der einzelnen Moleküle des Fluoreszenzfarbstoffs wiedergegeben, es liegt aber zumindest keine mit dem Fluoreszenzfarbstoff aktiv markierte Struktur vor.
AUFGABE DER ERFINDUNG
Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren und eine Vorrichtung zum räumlich hoch aufgelösten Abbilden einer mit einem Fluoreszenzfarbstoff markierten Struktur aufzuzeigen, bei denen trotz einer in kurzer Zeit erreichten hohen Ausbeute an Fluoreszenzlicht eine Proportionalität zwischen dem registrierten Fluoreszenzlicht und der Konzentration des Fluoreszenzfarbstoffs auch über viele Wiederholungen der Anregung des Fluoreszenzfarbstoffs nicht verloren geht.
LÖSUNG
Erfindungsgemäß wird diese Aufgabe durch ein Verfahren mit den Merkmalen des unabhängigen Patentanspruchs 1 und eine Vorrichtung mit den Merkmalen des unabhängigen Patentanspruchs 15 gelöst. Bevorzugte Ausführungsformen des neuen Verfahrens und der neuen Vorrichtung sind in den abhängigen Patentansprüchen beschrieben.
BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Bei dem neuen Verfahren zum räumlich hoch aufgelösten Abbilden einer mit einem Fluoreszenzfarbstoff markierten Struktur wird der Fluoreszenzfarbstoff in dem Bereich, in dem er wiederholt mit Anregungslicht zur Emission von Fluoreszenzlicht angeregt wird, vor einer Wiederholung seiner Anregung mit einem optischen Signal beaufschlagt. Dieses optische Signal weist eine andere Wellenlänge als das Anregungslicht auf und stabilisiert in dem Bereich ein Verhältnis einer Ausbeute an Fluoreszenzlicht zu der Konzentration des Fluoreszenzfarbstoffs bei der sich anschließenden Anregung des Fluoreszenzfarbstoffs. Die Stabilisierung erfolgt dabei auf einem Wert, der gegenüber einem ohne das optische Signal abfallenden Wert erhöht ist. Bei dem neuen Verfahren wird also neben dem Anregungslicht ein weiteres optisches Signal auf die mit dem Fluoreszenzfarbstoff markierte Struktur gerichtet, das weder den Fluoreszenzfarbstoff aus seinem Grundzustand in den angeregten fluoreszierenden Zustand überführt oder noch dazu vorgesehen ist, ihn aus seinem angeregten fluoreszierenden Zustand zurück in seinen Grundzustand zu versetzen, sondern das den Fluoreszenzfarbstoff bezüglich seiner in Folge seiner häufig wiederholten Anregung mit dem Anregungslicht reduzierten Fähigkeit zur Emission von Fluoreszenzlicht regeneriert. Dabei ist die Regeneration des Fluoreszenzfarbstoffs mit dem optischen Signal in einem ganz erheblichen Umfang möglich, so dass zumindest die Größenordnung der Ausbeute an Fluoreszenzlicht von dem Fluoreszenzfarbstoff auch bei sehr schnell wiederholter Anregung mit Anregungslicht zur Emission von Fluoreszenzlicht nicht verloren geht. In der Regel stabilisiert sich die auf die Konzentration des Fluoreszenzfarbstoffs bezogene Ausbeute an Fluoreszenzlicht binnen weniger Wiederholungen der Anregungen des Fluoreszenzfarbstoffs auf den bereits angesprochenen Wert, der gegenüber dem ohne das optische Signal immer weiter abfallenden Wert selbst zu Beginn der Wiederholungen schon deutlich erhöht ist.
Besondere Vorteile weist das neue Verfahren dadurch auf, dass die Struktur während des wiederholten Anregens mit dem Anregungslicht auf einer reduzierten Temperatur von weniger als 0 °C, vorzugsweise weniger als –20 °C, gehalten wird. Die grundsätzlichen Vorteile von Fluoreszenzmikroskopie bei tiefen Temperaturen, die ebenfalls die Reduzierung der Gefahr des Ausbleichens aufgrund von Anregungslicht und damit die Erhöhung der Ausbeute von Fluoreszenzlicht von dem Fluoreszenzfarbstoff betreffen, sind aus der EP 1 582 858 A1 bekannt. Es stellt sich jedoch heraus, dass bei reduzierten Temperaturen die temporäre Reduktion der Ausbeute an Fluoreszenzlicht von dem Fluoreszenzfarbstoff bei dessen hochfrequent wiederholten Anregung drastisch ansteigt. Dies scheint darauf zurückzuführen zu sein, dass bei jeder Anregung mit Anregungslicht ein Teil des Fluoreszenzfarbstoffs in einen Dunkelzustand gelangt, aus dem er bei reduzierten Temperaturen aufgrund fehlender thermischer Anregung rückführender Übergänge noch langsamer in seinen fluoreszenzfähigen Zustand zurückkehrt. Mit dem optischen Signal wird diese oder eine andere Rückkehrwahrscheinlichkeit des Fluoreszenzfarbstoffs in seinen fluoreszenzfähigen Zustand und damit seine erneute Anregbarkeit zur Emission von Fluoreszenzlicht deutlich erhöht. Die mit Fluoreszenzmikroskopie bei tiefen Temperaturen verbundenen Nachteile werden damit durch das neue Verfahren beseitigt, so dass ihre Vorteile erstmals voll nutzbar werden.
Das optische Signal, das zur Regenerierung des Fluoreszenzfarbstoffs verwendet werden kann, weist in der Regel eine größere Wellenlänge als das Anregungslicht auf. Damit ist es eindeutig nicht zur Anregung des Fluoreszenzfarbstoffs aus seinem Grundzustand in seinen angeregten fluoreszierenden Zustand in der Lage. Konkret kann das optische Signal bei Anregungslicht in einem Wellenlängenbereich von 440 bis 532 nm in einem Wellenlängenbereich von 600 bis 800 oder auch bis 900 nm liegen. Bei langwelligerem Anregungslicht von bis zu 650 nm verschiebt sich die untere Grenze des Wellenlängenbereichs des optischen Signals nach oben. Es ist weiter darauf zu achten, dass es durch das optische Signal auch zu keiner nennenswerten unerwünschten Mehrphotonenanregung von Fluoreszenzlicht kommt. Das optische Signal weist darüber hinaus typischerweise eine um so viel größere Wellenlänge oder geringere Intensität als das Anregungslicht auf, dass es auch zur Abregung des Fluoreszenzfarbstoffs durch stimulierte Emission nicht in der Lage ist. Dies ist dann von besonderer Bedeutung, wenn es zur zeitlichen Überlappung des Anregungslichts und des optischen Signals kommt. Die obere Grenze der Wellenlänge für das optische Signal, bei deren Überschreiten kein nutzbarer Effekt mehr auftritt, wird mit der Größenordnung der thermischen Anregung (3·kB·T) erreicht. Bei Raumtemperatur beträgt dieser Wert etwa 150 µm.
Eine solche zeitliche Überschneidung kann sich beispielsweise dann einstellen, wenn der Fluoreszenzfarbstoff in dem Bereich mit dem optischen Signal über mehrere Wiederholungen seiner Anregung hinweg kontinuierlich beaufschlagt wird, d.h. also beispielsweise mit einer kontinuierlichen Laserstrahlung, während das Anregungslicht von einem Pulslaser stammt. Angesichts der Tatsachen, dass das optische Signal die Anregung des Fluoreszenzfarbstoffs mit dem Anregungslicht zur Emission von Fluoreszenzlicht nicht stört und dass aufgrund der unterschiedlichen Wellenlängen auch eine Trennung des Fluoreszenzlichts von dem optischen Signal problemlos ist, ist diese vollständige zeitliche Überlappung des optischen Signals mit dem Anregungslicht und auch mit dem Zeitraum, in dem der Fluoreszenzfarbstoff das Fluoreszenzlicht emittiert, unbedenklich. Sie lässt vielmehr den Einsatz kostengünstiger Signalquellen für das optische Signal zu.
Ein Raum, über den das optische Signal hinweg auf die Probe aufgebracht wird, kann zudem größer sein als der Bereich, aus dem anschließend Fluoreszenzlicht registriert wird. Zumindest sollte das optische Signal den gesamten Raum abdecken, in dem der Fluoreszenzfarbstoff mit dem Anregungslicht beaufschlagt wird, unabhängig davon, aus welchem Bereich hiervon das Fluoreszenzlicht registriert wird. Hintergrund ist, dass das optische Signal nicht nur in Bezug auf die kurzzeitig abfallende Ausbeute an Fluoreszenzlicht von dem Fluoreszenzfarbstoff regenerierend auf den Fluoreszenzfarbstoff wirkt, sondern auch das Ausbleichen des Fluoreszenzfarbstoffs erheblich verzögert, d.h. die Gesamtausbeute des Fluoreszenzlichts von dem Fluoreszenzfarbstoff deutlich erhöht.
Ein Gebiet der Fluoreszenzmikroskopie, auf dem die Anwendung des neuen Verfahrens ebenfalls mit besonders großen Vorteilen verbunden ist, ist die STED-Fluoreszenzmikroskopie, bei der vor dem Registrieren des Fluoreszenzlichts der Fluoreszenzfarbstoff in einem Teilbereich des Bereichs, aus dem das Fluoreszenzlicht grundsätzlich registriert wird, mit Abregungslicht aus dem angeregten Zustand zurück in den Grundzustand abgeregt wird. Bei dieser Anwendung des neuen Verfahrens kann die Wellenlänge des optischen Signals, das zur Regenerierung des Fluoreszenzfarbstoffs verwendet wird, auch größer als die Wellenlänge des Abregungslichts sein. Das optische Signal stört dann nicht die selektive Abregung des Fluoreszenzfarbstoffs in den Teilbereichen des Bereichs, aus dem das Fluoreszenzlicht registriert wird, um die räumliche Auflösung beim Registrieren des Fluoreszenzlichts zu erhöhen. Es ist aber auch möglich, Licht mit der Wellenlänge des Abregungslichts als das optische Signal zu verwenden, soweit dieses die erfindungsgemäße Regenerierungsfunktion erfüllt, was auch bei üblichen Wellenlängen des Abregungslichts bei der STED-Fluoreszenzmikroskopie praktisch der Fall sein kann. Das optische Signal unterscheidet sich aber auch in diesem Fall von dem Abregungslicht und zwar durch eine andere räumliche und vorzugsweise auch eine andere zeitliche Verteilung. So deckt das optische Signal gerade den Rest des Bereichs ab, der von dem Teilbereich des Abregungslichts ausgelassen wird, und dies erfolgt vorzugsweise vor der Anregung des Fluoreszenzlichts anstatt in dem Zeitraum von der Anregung bis zu der spontanen Emission des Fluoreszenzlichts, in dem das Abregungslicht aufgebracht wird.
Konkret kann Licht, das von einer gemeinsamen Lichtquelle für das optische Signal und das Abregungslicht kommt, welche mit derselben Frequenz gepulst wird, wie eine Anregungslichtquelle für das Anregungslicht, auf zwei optische Pfade unterschiedlicher Länge aufgeteilt werden. Der eine optische Pfad richtet das optische Signal mit breiter räumlicher Verteilung und vergleichsweise geringer Intensität vor dem (bis während des) Anregungslicht(s) auf die Struktur, um den Fluoreszenzfarbstoff zu regenerieren; und der andere optische Pfad richtet das Abregungslicht (während des bis) nach dem Anregungslicht(s) mit hoher Intensität in einen Teilbereich des beobachteten Bereichs, um dort den angeregten Fluoreszenzfarbstoff durch stimulierte Emission wieder abzuregen.
Bei der STED-Fluoreszenzmikroskopie ist die Anwendung des neuen Verfahrens deshalb mit besonderen Vorteilen verbunden, weil der Fluoreszenzfarbstoff bei der STED-Fluoreszenzmikroskopie in den Teilbereichen, in denen er mit dem Abregungslicht aus dem angeregten Zustand zurück in den Grundzustand abgeregt wird, sowohl durch das Anregungslicht als auch das Abregungslicht beansprucht wird, ohne dass er, wenn er nicht gerade in den nicht abgeregten verbleibenden Rest des Bereichs fällt, Fluoreszenzlicht emittiert, das registriert wird. D.h., der Fluoreszenzfarbstoff wird möglicherweise vielfach angeregt und abgeregt, bis er beim Abscannen der jeweiligen Probe in den verbleibenden Bereich fällt, aus dem verbleibendes spontan emittiertes Fluoreszenzlicht registriert wird. Ohne die Regeneration des Fluoreszenzfarbstoffs mit dem optischen Signal nach dem neuen Verfahren kann dann der Fluoreszenzfarbstoff bereits erheblich bezüglich der Ausbeute an Fluoreszenzlicht geschwächt oder gar vollständig ausgebleicht sein. Konkret verbessert die Anwendung des neuen Verfahrens bei der STED-Fluoreszenzmikroskopie in ganz erheblichem Maße das Signalverhältnis zwischen dem Restfluoreszenzlicht, das aus dem mit dem Abregungslicht beaufschlagten Teilbereich des jeweils beobachteten Bereichs spontan emittiert wird, und dem spontan emittierten Fluoreszenzlicht aus dem interessierenden Rest des Bereichs, der nicht mit Abregungslicht beaufschlagt wird. Dieser vorteilhafte Effekt ist auch darauf zurückzuführen, dass das optische Signal die Abregungseffizienz des Abregungslichts verbessert, indem es durch die Regeneration des Fluoreszenzfarbstoffs verhindert, dass das Abregungslicht diese Regeneration bewirkt und dadurch verbraucht wird, so dass es nicht mehr für die Abregung des Fluoreszenzfarbstoffs zur Verfügung steht.
Ein weiteres Gebiet der Fluoreszenzmikroskopie, auf dem die Anwendung des neuen Verfahrens mit besonders großen Vorteilen verbunden ist, ist die GSD-Fluoreszenzmikroskopie, bei der vor dem Anregen des Fluoreszenzlichts der Fluoreszenzfarbstoff in einem Teilbereich des Bereichs mit Überführungslicht in einen Dunkelzustand überführt wird, aus dem heraus er nicht zur Emission von Fluoreszenzlicht anregbar ist. Das erfindungsgemäße optische Signal bringt den Fluoreszenzfarbstoff aus seinem Dunkelzustand definiert in seinen Grundzustand zurück, so dass beispielsweise eine Scanngeschwindigkeit beim Abscannen einer Probe nicht von einer spontanen Rückkehrrate abhängig ist, mit der der Fluoreszenzfarbstoff in der Umgebung des jeweils letzten Messpunkts aus seinem Dunkelzustand in seinen fluoreszenzfähigen Grundzustand zurückkehrt. Diese Rückkehrrate kann insbesondere bei tiefen Temperaturen sehr klein sein. Bei der erfindungsgemäßen GSD-Fluoreszenzmikroskopie ist die Wellenlänge des optischen Signals in aller Regel größer als die Wellenlänge des Überführungslichts ist. Auch bei der Anwendung des neuen Verfahrens bei der GSD-Fluoreszenzmikroskopie kommt es zu einer erheblichen Verbesserung, d.h. Verkleinerung des Signalverhältnisses zwischen dem Restfluoreszenzlicht, das aus dem mit dem Überführungs licht beaufschlagten Teilbereich des jeweils beobachteten Bereichs spontan emittiert wird, und dem spontan emittierten Fluoreszenzlicht aus dem interessierenden Rest des beobachteten Bereichs, der nicht mit Überführungslicht beaufschlagt wird.
Wie in der Fluoreszenzmikroskopie üblich, kann das von dem Fluoreszenzfarbstoff spontan emittierte Fluoreszenzlicht auch bei dem neuen Verfahren aufgrund seiner Wellenlänge abgetrennt werden. Die zusätzliche Abtrennung des zum Regenerieren des Fluoreszenzfarbstoffs verwendeten optischen Signals ist aufgrund seiner im Vergleich zu allen anderen auftretenden Wellenlängen typischerweise deutlich größeren Wellenlänge problemlos möglich.
Es ist denkbar, dass das optische Signal bei dem neuen Verfahren nicht nur dann, wenn es bei der GSD-Fluoreszenzmikroskopie angewandt wird, im Wesentlichen dadurch wirkt, dass es den Fluoreszenzfarbstoff aus einem Tripletzustand zurück in einen Singuletzustand überführt, wobei der Grundzustand des Fluoreszenzfarbstoffs ein Singuletgrundzustand und der angeregte Zustand ein angeregter Singuletzustand ist.
Konkret kann die Wirkungsweise des neuen Verfahrens darin zu sehen sein, dass das optische Signal den Fluoreszenzfarbstoff aus einem unteren Tripletzustand in einen höheren Tripletzustand anregt, aus dem heraus eine hohe Übergangswahrscheinlichkeit zurück in den Singuletzustand besteht. Dass solche Übergänge bei einem fluoreszierenden Molekül mit einem optischen Signal ausgelöst werden können, um das Molekül aus einem Tripletzustand, der ein Dunkelzustand des Moleküls ist, zurück in seinen fluoreszenzfähigen Singuletzustand zu bringen, ist z. B. aus S. Reindl, A. Penzkofer: Chemical Physics 211, 431 (1996) für Farbstoffe allgemein bekannt und wird im Bereich der Einzelmolekülfluoreszenzspektroskopie zur Verbesserung der Signalausbeute genutzt (siehe z. B. Zhengxi Huang, et al.: Colloids and Surfaces A: Physiochem. Eng. Aspects 257-258, 203 (2005)). Die Anwendung dieser Kenntnisse zur Signalverbesserung bei der Bestimmung einer räumlichen Konzentrationsverteilung eines Fluoreszenzfarbstoffs ist jedoch bislang nicht erfolgt und die damit erzielbaren Vorteile beim Signalverhältnis zwischen dem Restfluoreszenzlicht aus dem unterdrückten Teilbereich und aus dem interessierenden Rest des beobachteten Bereichs sind absolut überraschend.
Die Details und bevorzugten Ausführungsformen der neuen Vorrichtung sind im Wesentlichen bereits unmittelbar oder mittelbar zusammen mit dem neuen Verfahren erläutert worden.
Insbesondere bevorzugt ist es, wenn die neue Vorrichtung ein SIED- oder GSD-Fluoreszenzscanningmikroskop ist, das eine Kühleinrichtung zum Absenken der Temperatur der mit dem Fluoreszenzfarbstoff markierten Struktur aufweist. In jedem Fall weist die neue Vorrichtung als Besonderheit eine zusätzliche Signalquelle zur Abgabe eines optischen Signals auf den Fluoreszenzfarbstoff auf, bei deren Einschalten während einer sich wiederholenden Anregung des Fluoreszenzfarbstoffs das Verhältnis der Ausbeute an Fluoreszenzlicht zu der Konzentration der Fluoreszenzfarbstoffs erhöht und über mehrere Wiederholungen der Anregung des Fluoreszenzfarbstoffs mit dem Anregungslicht hinweg auf einen derart erhöhten Wert stabilisiert. Bei einem STED-Fluoreszenzscanningmikroskop kann die Signalquelle für das optische Signal dieselbe Lichtquelle aufweisen wie eine Abregungslichtquelle für das Abregungslicht.
Vorteilhafte Weiterbildungen der Erfindung ergeben sich aus den Patentansprüchen, der Beschreibung und den Zeichnungen. Die in der Beschreibungseinleitung genannten Vorteile von Merkmalen und von Kombinationen mehrerer Merkmale sind lediglich beispielhaft und können alternativ oder kumulativ zur Wirkung kommen, ohne dass die Vorteile zwingend von erfindungsgemäßen Ausführungsformen erzielt werden müssen. Weitere Merkmale sind den Zeichnungen – insbesondere den dargestellten Geometrien und den relativen Abmessungen mehrerer Bauteile zueinander sowie deren relativer Anordnung und Wirkverbindung – zu entnehmen. Die Kombination von Merkmalen unterschiedlicher Ausführungsformen der Erfindung oder von Merkmalen unterschiedlicher Patentansprüche ist ebenfalls abweichend von den gewählten Rückbeziehungen der Patentansprüche möglich und wird hiermit angeregt. Dies betrifft auch solche Merkmale, die in separaten Zeichnungen dargestellt sind oder bei deren Beschreibung genannt werden. Diese Merkmale können auch mit Merkmalen unterschiedlicher Patentansprüche kombiniert werden. Ebenso können in den Patentansprüchen aufgeführte Merkmale für weitere Ausführungsformen der Erfindung entfallen.
KURZBESCHREIBUNG DER FIGUREN
Im Folgenden wird die Erfindung anhand in den Figuren dargestellter bevorzugter Ausführungsbeispiele weiter erläutert und beschrieben.
1 zeigt einen möglichen Aufbau der neuen Vorrichtung (ohne Wiedergabe ihrer Kühleinrichtung).
2 zeigt die zeitlichen Verläufe der Intensitäten von Anregungslicht, Abregungslicht, Fluoreszenzlicht und eines optischen Signals bei der Vorrichtung gemäß 1.
3 zeigt die räumliche Verteilung der Signale, deren zeitlicher Verlauf in 2 dargestellt ist.
4 zeigt Energiezustände eines Fluoreszenzfarbstoffs bei seiner Anregung zur spontanen Emission von Fluoreszenzlicht unter Anwendung des neuen Verfahrens.
5 zeigt weiter aufgegliederte Energiezustände des Fluoreszenzfarbstoffs, die dieser bei STED-Fluoreszenzmikroskopie unter Anwendung des neuen Verfahrens annimmt.
6 zeigt den zeitlichen Verlauf eines Verhältnisses einer Ausbeute an Fluoreszenzlicht zu der Konzentration des fluoreszierenden Fluoreszenzfarbstoffs bei wiederholter Anregung des Fluoreszenzfarbstoffs.
7 zeigt die Ausbeute an Fluoreszenzlicht von Fluoreszenzfarbstoff, der über begrenzte Zeiträume von 50 ms mit gepulstem Anregungslicht beaufschlagt wird, wobei der Fluoreszenzfarbstoff in jeder zweiten Pause zwischen zwei 50 ms-Zeiträumen mit dem erfindungsgemäßen optischen Signal beaufschlagt wird.
8 zeigt die Ausbeute von Fluoreszenzlicht von Fluoreszenzfarbstoff, der während seiner Beaufschlagung mit gepulstem Anregungslicht vorübergehend auch mit Abregungslicht beaufschlagt wird, wobei rechts in 8 zusätzlich das erfindungsgemäße optische Signal auf die Probe zugeschaltet ist; und
9 zeigt eine weitere mögliche Verteilung der Intensitäten des Anregungslichts, des Abregungslichts, des Fluoreszenzlichts und des optischen Signals bei der der Durchführung einer Ausführungsform des neuen Verfahrens.
FIGURENBESCHREIBUNG
Die in 1 skizzierte Vorrichtung dient zur Untersuchung einer Probe 1 in der eine als solche nicht wiedergegebene Struktur mit einem Fluoreszenzfarbstoff markiert ist. Auf die Probe 1 werden mit der Vorrichtung verschiedene optische Signale durch ein Objektiv 2 gerichtet, und das Objektiv 2 dient auch dazu, Fluoreszenzlicht 3 von der Probe mit einem Detektor 4 zu registrieren. Der Detektor 4 kann ein konfokal zu dem Brennpunkt des Objektivs 2 angeordneter Detektor sein, um die räumliche Grundauflösung bei der Registrierung des Fluoreszenzlichts 3 von der Probe 1 hoch zu setzen. Mit einer Anregungslichtquelle 5 wird Anregungslicht 6 auf die Probe 1 gerichtet, um den Fluoreszenzfarbstoff aus einem Grundzustand in einen angeregten Zustand anzuregen, aus dem heraus er spontan das Fluoreszenzlicht 3 emittiert. Mit einer Abregungslichtquelle 7 wird Abregungslicht 8 auf die Probe 1 gerichtet, um den Fluoreszenzfarbstoff in einem Teilbereich des Bereichs, aus dem der Detektor 4 das Fluoreszenzlicht 3 registriert, wieder abzuregen, um so die räumliche Auflösung beim Registrieren des Fluoreszenzlichts 3 noch weiter zu erhöhen. Die Anregungslichtquelle 5 und die Abregungslichtquelle 7 sind miteinander synchronisierte Pulslichtquellen. Eine weitere Signalquelle 9, die ein optisches Signal 10 auf die Probe 1 richtet, kann ebenfalls eine gepulste Lichtquelle aber auch eine Dauerstrichlichtquelle sein. Das optische Signal 10 dient dazu, den Fluoreszenzfarbstoff in der Probe 1 gegenüber einer Abnahme einer Ausbeute an Fluoreszenzlicht 3 zu regenerieren, die ohne das optische Signal bei wiederholter Anregung des Fluoreszenzfarbstoffs mit dem Anregungslicht 6 insbesondere unter gleichzeitiger Beaufschlagung mit dem Abregungslicht 8 auftritt. Zudem führt das optische Signal 10 zu einer Verbesserung der Abregungseffizienz durch das Abregungslicht 8, indem es einer ebenfalls mögliche Regenerierung des Fluoreszenzfarbstoffs durch das Abregungslicht 8 und einem damit einhergehenden Verbrauch des Abregungslichts 8 für etwas anderes als die beabsichtigte Abregung des Fluoreszenzfarbstoffs, vorgreift. In 1 angedeutete Strahlteiler 11 dienen dazu, die optischen Wege der Signal 3, 6, 8 und 10 zusammenzuführen bzw. wieder voneinander zu trennen. Die verschiedenen Signale 3, 6, 8 und 10 müssen jedoch nicht alle aus einer Richtung auf die Probe 1 gerichtet bzw. von der Probe 1 aufgefangen werden; insbesondere das optische Signal 10, das nicht in demselben Maße wie die anderen Signale fokussiert bzw. auf deren Fokuspunkt abgestimmt werden muss, kann auch auf einem anderen optischen Pfad zu der Probe 1 gelangen. Alternativ können die Abregungslichtquelle 7 und die Signalquelle 9 auch auf einer gemeinsamen Lichtquelle aufbauen, an die sich zwei unterschiedliche optische Pfade anschließen. Pfeile 12 und 13 deuten an, dass die Probe 1 mit den optischen Signalen 6, 8 und 10 abgescannt wird, um die Probe 1 bzw. die darin befindliche, mit dem Fluoreszenzfarbstoff markierte Struktur punktweise bezüglich der vorhandenen Konzentration des Fluoreszenzfarbstoffs zu vermessen.
2 zeigt eine mögliche zeitliche Abfolge der einzelnen Signale 3, 6, 8 und 10 bei der Vorrichtung gemäß 1. Dabei handelt es sich hier nur um eine prinzipielle Darstellung, die keinen Anspruch auf Detailgenauigkeit erhebt. An einen Puls des Anregungslichts 6 schließt sich mit teilweiser Überlappung ein Puls des Abregungslichts 8 an, wobei diese beiden Signale unterschiedliche räumliche Verteilungen aufweisen. Aus dem nicht von dem Abregungslicht 8 erfassten Bereich, der von dem Detektor 4 gemäß 1 erfasst wird, wird das in Folge der Anregung des Fluoreszenzfarbstoffs spontan emittierte Fluoreszenzlicht 3 registriert. Das optische Signal 10 zur Regenerierung des Fluoreszenzfarbstoffs kann (a) ebenfalls gepulst sein und beispielsweise jeweils vor dem Anregungslicht 6 auf den Fluoreszenzfarbstoff einwirken, oder (b) kontinuierlich auf die Probe 1 gemäß 1 gerichtet werden. Auch im Fall (a) eines gepulsten optischen Signals 10 kann eine zeitliche Überlappung mit dem Anregungslicht 6 und/oder dem Abregungslicht 8 und/oder dem Fluoreszenzlicht 3 gegeben sein.
3 skizziert einen Teil der Probe 1 mit Blickrichtung von dem Objektiv 2 auf die Probe 1 gemäß 1. Das Anregungslicht 6 wird über ein von einer punktierten Linie umschlossenes Gebiet hinweg auf die Probe 1 gerichtet. Der Detektor 4 erfasst Fluoreszenzlicht aus einem hiervon eingeschlossenen, durch eine gestrichelte Linie begrenzten Bereich 14. Fluoreszenzlicht 3 wird dabei aber nur aus einem Messbereich 15 registriert, der von einem Doghnutförmigen Gebiet ausgelassen wird, in dem das Abregungslicht 8 auf die Probe 1 gerichtet wird. Das Abregungslicht 8 erfasst neben einem Teilbereich des Bereichs 14 auch daran angrenzende Teile des Gebiets, in dem das Anregungslicht 6 auf die Probe 1 fällt. Das optische Signal 10 fällt über den gesamten hier wiedergegebenen Raum auf die Probe 1. Bei ihm besteht von allen Signalen die geringste, d.h. gar keine Notwendigkeit einer Lokalisierung.
4 skizziert Energiezustände eines Fluoreszenzfarbstoffs, wobei die links wiedergegebenen S-Zustände die Singuletzustände und die rechts wiedergegebenen T-Zustände die Tripletzustände des Fluoreszenzfarbstoffs sind. Durch das Anregungslicht 6 gelangt der Fluoreszenzfarbstoff aus seinem Grundzustand S₀ in den angeregten Singuletzustand S₁, aus dem heraus er spontan das Fluoreszenzlicht 3 emittiert. Teilweise gelangt der Fluoreszenzfarbstoff jedoch aus seinem Zustand S₁ durch einen Übergang 16 in seinen untersten Tripletzustand T₁. Bei dem Tripletzustand T handelt es sich um einen Dunkelzustand, d.h., solange sich der Fluoreszenzfarbstoff in diesem Zustand befindet, kann er weder Fluoreszenzlicht 3 emittieren noch zur Emission von Fluoreszenzlicht mit dem Anregungslicht 6 angeregt werden. Vielmehr besteht die Gefahr, dass er durch Anregung mit dem Anregungslicht 6 aus seinem untersten Tripletzustand T₁ in einen hier nicht dargestellten höheren Tripletzustand gelangt, was zu einem Ausbleichen des Farbstoffs führt. Aus seinem Tripletzustand T₁ kann der Fluoreszenzfarbstoff über einen Übergang 17 zwar zurück in seinen Grundzustand S₀ gelangen; die Übergangswahrscheinlichkeit des Übergangs 17 ist jedoch insbesondere bei tiefen Temperaturen sehr klein, so dass sich bei wiederholter Anregung des Fluoreszenzfarbstoffs durch das Anregungslicht 6 auch bei einer nur kleinen Übergangswahrscheinlichkeit des Übergangs 16 zunehmende Anteile des Fluoreszenzfarbstoffs in dem Tripletzustand T₁ befinden und somit kein Fluoreszenzlicht 3 liefern können. Mit dem optischen Signal 10 wird der in seinem Tripletzustand T₁ befindliche Fluoreszenzfarbstoff in einen höheren Tripletzustand T_N angeregt, aus dem heraus er mit einer hohen Übergangswahrscheinlichkeit über einen Übergang 18 in einen höheren Singuletzustand S_N gelangt, aus dem heraus er dann mit einer ebenfalls hohen Übergangswahrscheinlichkeit über einen Übergang 19 in den Zustand S₁ oder direkt in den Zustand S₀ zurückgelangt und so wieder für die Anregung von Fluoreszenzlicht 3 zur Verfügung steht.
5 ist gegenüber 4 insoweit erweitert, als dass die Auffächerung der Zustände S₀ und S₁ in Vibrationsunterzustände wiedergegeben ist. Hier ist entsprechend auch dargestellt, dass der mit dem Anregungslicht 6 aus seinem Grundzustand angeregte Fluoreszenzfarbstoff zunächst in einen höheren Unterzustand des Zustands S₁ gelangt und erst durch einen Übergang 20 in den untersten Unterzustand des Zustand S₁. Aus diesem heraus kann er dann mit dem Anregungslicht 8 räumlich selektiv wieder in einen Unterzustand des Grundzustands S₀ zurückgebracht werden, wobei eine spektrale Trennbarkeit des Anregungslichts 6 des Fluoreszenzlichts 3 und des Abregungslichts 8 bzw. der hierdurch stimulierten Emission gegeben ist, weil diese Signale in der hier verwendeten Reihenfolge zunehmende Wellenlängen aufweisen. Das Abregungslicht 8 ist aber grundsätzlich auch geeignet, den Fluoreszenzfarbstoff aus seinem Tripletzustand T₁ über den höheren Tripletzustand T'_N zurück in seinen Singulettzustand S zu bringen (Übergang 18') oder ihn aus seinem Tripletzustand T heraus zu bleichen. Der Verbrauch des Abregungslichts 8 für den Übergang 18' und das Bleichen des Fluoreszenzfarbstoffs aus seinem Tripletzustand T heraus wird auch hier durch das optische Signal 10. bzw. die durch dieses bewirkte Rückführung des Fluoreszenzfarbstoffs aus seinem Tripletzustand T in seinen Singuletzustand S effektiv verhindert. Dadurch, dass die sich aufbauende Besetzung des Tripletzustands mit dem optischen Signal 10 kontinuierlich abgebaut wird, stellt sich ein Gleichgewicht mit einer nur kleinen mittleren Besetzung des Tripletzustands ein.
Während die Erfindung anhand der Figuren hier bislang ausschließlich in Bezug auf die STED-Fluoreszenzmikroskopie beschrieben wurde, ist ihre Anwendung auch bei der GSD-Fluoreszenzmikroskopie mit großen Vorteilen verbunden. Bei der GSD-Fluoreszenzmikroskopie würde, statt dass Abregungslichts 8 nach dem bzw. schon während des Anregungslichts 6 auf die Probe 1 gerichtet wird, in demselben Teilbereich des Bereichs 14 und zwar schon vor dem Anregungslicht 6 Überführungslicht auf die Probe 1 gerichtet, um den Fluoreszenzfarbstoff außerhalb des Messbereichs 15 aus seinem fluoreszenzfähigen Grundzustand S₀ gezielt in seinen nicht-fluoreszenzfähigen Tripletzustand T₁ zu überführen. Das optische Signal 10 dient auch dabei zur gezielten Rückführung des Fluoreszenzfarbstoffs aus seinem Tripletzustand T in seinen Singuletzustand S, was hier insbesondere bei jeder Verlagerung des Messbereichs 15, wie sie beim Scannen der Probe 1 erfolgt, zu einer erheblichen Vergrößerung des Anteils des Fluoreszenzfarbstoffs führt, der sich in dem fluoreszenzfähigen Singuletzustand S befindet.
In 6 ist die resultierende Auswirkung des erfindungsgemäßen optischen Signals 10 auf die relative Ausbeute, d.h. das Verhältnis einer Ausbeute A an Fluoreszenzlicht zu der Konzentration K des fluoreszierenden Fluoreszenzfarbstoffs aufgetragen. Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren stabilisiert sich dieses Verhältnis A/K sehr schnell auf einen Wert 20, der wie hier nur etwas gegenüber dem maximalen Verhältnis M reduziert ist oder gar dessen Niveau erreicht. Ohne das optische Signal 10 zeigt das Verhältnis A/K einen stark abfallenden Wert 21, insbesondere dann, wenn die Wiederholungen der Anregung des Fluoreszenzfarbstoffs sehr schnell aufeinander folgen, so dass dieser aufgrund der geringen Übergangswahrscheinlichkeit des Übergangs 17 gemäß den 4 und 5 nicht in dem nötigen Umfang von allein aus einem Tripletzustand T in seinen Singuletzustand S zurückkehrt.
7 zeigt die Ausbeute an Fluoreszenzlicht 3 von einem Fluoreszenzfarbstoff aufgetragen in relativen Einheiten über der Zeit in ms. Das Fluoreszenzlicht 3 wird durch das Anregungslicht 6 angeregt, wobei das Anregungslicht 6 in Form hier nicht aufgelöster Einzelpulse einer Frequenz von 80 MHz über Zeiträume von jeweils 50 ms auf den Fluoreszenzfarbstoff gerichtet wird. Danach ist 50 ms Pause, bis die Probe erneut mit Anregungslicht 6 beaufschlagt wird. In jeder zweiten Pause wird der Fluoreszenzfarbstoff für etwa 20 ms kontinuierlich mit dem optischen Signal 10 beaufschlagt. Hierdurch wird der Fluoreszenzfarbstoff in erheblichem Maße regeneriert, wie sich an den Ausbeuten an Fluoreszenzlicht 3 bei den ersten darauf folgenden Pulsen des Anregungslichts 6 ablesen lässt. Bezogen auf diese ersten Pulse liegt die Steigerung der Ausbeute an Fluoreszenzlicht bei mehr als 100 %.
8 zeigt im linken Teil die Ausbeute an Fluoreszenzlicht 3 von Fluoreszenzfarbstoff, der ab dem Zeitpunkt 50 ms mit demselben gepulsten Anregungslicht 6 wie in 7 beaufschlagt wird. Hier wird der Fluoreszenzfarbstoff zusätzlich während Zeiträumen von jeweils 100 ms mit 100 ms Pause mit dem gepulsten und mit dem Anregungslicht 6 gemäß 2 synchronisierten Abregungslicht 8 beaufschlagt. Erwartungsgemäß geht dabei die Ausbeute an Fluoreszenzlicht 3 von dem Fluoreszenzfarbstoff zurück. Das optische Signal 10 ist in dem linken Teil von 8 aus. Im rechten Teil von 8 wird das optische Signal 10 etwas später als das gepulste Anregungssignal 6 eingeschaltet, was sofort zu einer Erhöhung der Ausbeute an Fluoreszenzlicht führt und wodurch insbesondere das Verhältnis zwischen der Ausbeute an Fluoreszenzlicht bei gleichzeitig einfallendem Abregungslicht 8 und der Ausbeute an Fluoreszenzlicht ohne Abregungslicht 8 deutlich erhöht wird. Die Ausbeute an Fluoreszenzlicht mit Abregungslicht 8 entspricht der Ausbeute an Fluoreszenzlicht aus den Teilen des Bereichs 14 gemäß 3 außerhalb des Messbereichs 15, während die Ausbeute an Fluoreszenzlicht 3 ohne das Abregungssignal 8 der Ausbeute an Fluoreszenzlicht aus dem Messbereich 15 entspricht. Je kleiner das genannte Verhältnis ist, desto dominanter ist das registrierte Fluoreszenzlicht 3 aus dem Messbereich 15 gegenüber dem Rest des Bereichs 14 und desto höher ist die erzielte räumliche Auflösung beim Erfassen einer mit dem Fluoreszenzfarbstoff markierten Struktur in der Probe 1.
9 zeigt eine weitere mögliche räumliche Verteilung der Intensitäten des Anregungslichts 6, des Abregungslichts 8, des Fluoreszenzlichts 3 und des optischen Signals 10. Die Probe 1 wird gleichmäßig mit dem Anregungslicht 6 beleuchtet. Mit dem Abregungslicht 8 werden Interferenzstreifen erzeugt, so dass eine sinusförmige Modulation der Intensitätsverteilung des Abregungslichts 8 entsteht. Durch das Abregen der Fluoreszenz entsteht ein Streifenmuster die dem Fluoreszenzlicht 3. Dieses Muster wird von dem Objektiv 2 auf den Detektor 4, z. B. eine CCD-Kamera, abgebildet, wobei 9 oberhalb des Detektor 4 die Intensitätsverteilung 3' des Fluoreszenzlichts 3 auf der CCD-Kamera wiedergibt. Ist der seitliche Abstand der Streifen des Fluoreszenzlichts auf der Kamera größer als 0.5·λ_FI/NA, wobei λ_FI die Wellenlänge des Fluoreszenzlichts 3 ist, so können die Streifen eindeutig voneinander getrennt werden. Um eine höhere Abregungseffizienz mit dem Abregungslicht 8 zu erreichen, wird die Probe 1 mit dem Überführungslicht 10 ebenso wie mit dem Anregungslicht 6 gleichmäßig beaufschlagt.

1: Probe
2: Objektiv
3: Fluoreszenzlicht
4: Detektor
5: Anregungslichtquelle
6: Anregungslicht
7: Abregungslichtquelle
8: Abregungslicht
9: Signalquelle
10: optisches Signal
11: Strahlteiler
12: Pfeil
13: Pfeil
14: Bereich
15: Messbereich
16: Übergang
17: Übergang
18: Übergang
19: Übergang
20: Wert
21: Wert

Claims

Verfahren zum räumlich hochaufgelösten Abbilden einer mit einem Fluoreszenzfarbstoff markierten Struktur, wobei der Fluoreszenzfarbstoff innerhalb eines Bereichs wiederholt mit Anregungslicht zur Emission von Fluoreszenzlicht angeregt wird, indem er aus einem Grundzustand in einen angeregten fluoreszierenden Zustand überführt wird, und wobei Fluoreszenzlicht aus dem Bereich registriert wird, um eine räumliche Konzentrationsverteilung des Fluoreszenzfarbstoffs zu bestimmen, wobei der Fluoreszenzfarbstoff in dem Bereich vor einer Wiederholung seiner Anregung mit einem optischen Signal beaufschlagt wird, wodurch ein Verhältnis einer Ausbeute an Fluoreszenzlicht zu der Konzentration des Fluoreszenzfarbstoffs in dem Bereich bei der sich anschließenden Anregung des Fluoreszenzfarbstoffs erhöht wird, dadurch gekennzeichnet, dass das optische Signal (10) eine andere Wellenlänge als das Anregungslicht (6) aufweist und das Verhältnis der Ausbeute auf einen Wert stabilisiert, der gegenüber einem ohne das optische Signal abfallenden Wert erhöht ist, und dass die Struktur während des wiederholten Anregens mit dem Anregungslicht (6) auf einer reduzierten Temperatur von weniger als 0 °C gehalten wird.
Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das optische Signal (10) gegenüber dem Anregungslicht (6) eine größere Wellenlänge aufweist.
Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass der Bereich (14) mit dem optischen Signal (10) über mehrere Wiederholungen der Anregung mit dem Anregungslicht (6) hinweg kontinuierlich beaufschlagt wird.
verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass das optische Signal (10) über einen Raum hinweg aufgebracht wird, der größer ist als der Bereich (14), aus dem anschließend Fluoreszenzlicht (3) registriert wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass die Struktur während des wiederholten Anregens mit dem Anregungslicht (6) auf einer reduzierten Temperatur von weniger als –20 °C gehalten wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass vor dem Registrieren des Fluoreszenzlichts (3) der Fluoreszenzfarbstoff in einem Teilbereich des Bereichs (14) mit Abregungslicht (8) aus dem angeregten Zustand zurück in den Grundzustand abgeregt wird.
Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass die Wellenlänge des optischen Signals (10) größer als die Wellenlänge des Abregungslichts (8) ist.
Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass das optische Signal (10) und das Abregungslicht (8) dieselbe Wellenlänge aber eine andere räumliche und/oder zeitliche Verteilung aufweisen.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass vor dem Anregen des Fluoreszenzlichts (3) der Fluoreszenzfarbstoff in einem Teilbereich des Bereichs Bereichs (14) mit Überführungslicht (8) in einen Dunkelzustand überführt wird, aus dem heraus er nicht zur Emission von Fluoreszenzlicht anregbar ist, und dass das optische Signal (10) den Fluoreszenzfarbstoff zurück in seinen Grundzustand bringt.
Verfahren nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, dass die Wellenlänge des optischen Signals (10) größer als die Wellenlänge des Überführungslichts (8) ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 6 bis 10, dadurch gekennzeichnet, dass die Struktur mit dem Teilbereich abgescannt wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 11, dadurch gekennzeichnet, dass das Fluoreszenzlicht (3) von jedem auf die Struktur aufgebrachten Licht (6, 8, 10) aufgrund seiner Wellenlänge abgetrennt wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 12, dadurch gekennzeichnet, dass das optische Signal (10) den Fluoreszenzfarbstoff aus einem Tripletzustand (T) zurück in seinen Singuletzustand (S) überführt, wobei der Grundzustand ein Singuletgrundzustand und der angeregte Zustand ein angeregter Singuletzustand ist.
Verfahren nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, dass das optische Signal (10) den Fluoreszenzfarbstoff aus einem unteren Tripletzustand (T₁) über einen höheren Tripletzustand (T_M) zurück in den Singuletzustand (S) bringt.
Vorrichtung zum räumlich hochaufgelösten Abbilden einer mit einem Fluoreszenzfarbstoff markierten Struktur, mit einer Anregungslichtquelle zum wiederholten Anregen des Fluoreszenzfarbstoffs mit Anregungslicht zur Emission von Fluoreszenzlicht innerhalb eines Bereichs, in dem der Fluoreszenzfarbstoff aus einem Grundzustand in einen angeregten fluoreszierenden Zustand überführt wird, und mit Mitteln zum Registrieren von Fluoreszenzlicht aus dem Bereich, um eine räumliche Konzentrationsverteilung des Fluoreszenzfarbstoffs zu bestimmen, wobei eine Signalquelle zur Abgabe eines optischen Signals auf den Fluoreszenzfarbstoff vorgesehen ist, um den Fluoreszenzfarbstoff vor einer Wiederholung seiner Anregung mit dem optischen Signal zu beaufschlagen, wobei das optische Signal ein Verhältnis einer Ausbeute an Fluoreszenzlicht zu der Konzentration des Fluoreszenzfarbstoffs in dem Bereich bei der sich anschließenden Anregung des Fluoreszenzfarbstoffs erhöht, dadurch gekennzeichnet, dass das optische Signal (10) eine andere Wellenlänge aufweist als das Anregungslicht (6) und das Verhältnis der Ausbeute auf einen Wert stabilisiert, der gegenüber einem ohne das optische Signal (10) abfallenden Wert erhöht ist, und dass eine Kühleinrichtung zum Absenken der Temperatur der Struktur vorgesehen ist.
Vorrichtung nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, dass sie ein STED-Fluoreszenzscanningmikroskop ist.
Vorrichtung nach Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, dass neben der Signalquelle (9) für das optische Signal (10) eine Abregungslichtquelle (7) für Abregungslicht (8) vorgesehen ist, wobei die Wellenlänge des optischen Signals (10) größer als die Wellenlänge des Abregungslichts (8) ist.
Vorrichtung nach Anspruch 17, dadurch gekennzeichnet, dass die Signalquelle (9) für das optische Signal (10) und eine Abregungslichtquelle (7) für Abregungslicht (8) eine gemeinsame Lichtquelle aufweisen.
Vorrichtung nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, dass sie ein GSD-Fluoreszenzscanningmikroskop ist.