JP2007233370A - 試料を高い空間分解能で検査するための方法および顕微鏡 - Google Patents

Abstract

【課題】コンパクトで簡単な構造で安価に迅速な試料走査が可能な方法およびレーザ走査型蛍光顕微鏡を提供すること。
【解決手段】検査される試料（１）が、第１状態（Ｚ１、Ａ）から第２状態（Ｚ２、Ｂ）へと繰返し遷移可能な物質を含み、第１状態（Ｚ１、Ａ）及び第２状態（Ｚ２、Ｂ）が少なくとも１つの光学的性質で互いに相違しており、記録される試料領域（Ｐ）内で物質がまず第１状態（Ｚ１、Ａ）に移されるステップ、光学信号（４）によって第２状態（Ｚ２、Ｂ）が誘導され、記録される試料領域（Ｐ）内で、空間的に限定された部分領域が適切に残されるステップを含むものが、少なくとも１つの強度零地点（５）及び側方に隣接する最大強度（９）を備えた横断面プロフィルを有する焦線（１０）の態様で光学信号（４）が提供される。
【選択図】図３

Description

本発明は、試料を高い空間分解能で検査するための方法および顕微鏡、特に、レーザ走査型蛍光顕微鏡であって、検査される試料が、第１状態から第２状態へと繰返し遷移可能な物質を含み、第１状態及び第２状態が少なくとも１つの光学的性質で互いに相違しており、記録される試料領域内で物質がまず第１状態に移されるステップ、光学信号によって第２状態が誘導されて、記録される試料領域内で、空間的に限定された部分領域が明確に除外されるステップを含むものに関する。

冒頭に指摘した種類の方法および顕微鏡は、実務において公知である。
基本的にアッベの法則によれば、結像光学法の空間分解能には、回折限界によって理論的限界があり、回折限界は、使用される光の波長に依存している。
しかしながら、ここで問題とする方法および顕微鏡によれば、アッベにより公知の理論的回折限界を超えて改善される空間分解能が達成できる。

公知の方法ではこのため、検査されるべき試料内に、第１状態から第２状態へと繰返し遷移可能な物質が提供され、第１状態及び第２状態は少なくとも１つの光学的性質で互いに相違している。
多くの公知の方法では、第１状態が蛍光性状態（fluorescence-capable state）（以下「Ａ状態」という）、第２状態が非蛍光性状態（nonfluorescence-capable state）（以
下「Ｂ状態」という）である。
記録される試料領域内で物質が切換信号によって蛍光性状態Ａに移された後、記録される試料領域の空間的に限定された部分領域内で光学信号によってＢ状態が誘導され、それとともに蛍光分子の蛍光抑制がもたらされる。
この場合、蛍光抑制の物理的プロセスは、多様なもので有り得る。
例えば、事前に励起された状態からの誘導放出、または蛍光分子内の光学的に誘導された構造変化が知られている。

明白なのは、試料体積内で光学信号によって誘導される第１状態から第２状態への遷移が大きな領域では飽和し、すなわち、完全に生じ、試料体積の少なくとも１つの部分領域では、光切換信号を明確にそこに照射されないことによって、そうした遷移が生じないことである。
この効果は、光学信号の強度零地点を生成することによって達成することができる。
零地点とその近傍では第２状態（一般に非蛍光状態Ｂ）への遷移が起きず、第１状態（一般に蛍光状態Ａ）が維持される。
光学信号によるＡ→Ｂ遷移の飽和は、記録される試料領域の照射領域において強度零地点に近接する周囲でＢ状態への（ほぼ）完全な遷移をもたらす。
飽和へ導くプロセスが強ければ強いほど、すなわち、零地点周囲領域に光学信号によって加えられるエネルギーが多ければ多いほど、蛍光性状態Ａもしくは一般に「発光性（luminous）」状態にある蛍光分子を有する領域は一層小さくなる。
この領域は、零地点の近傍における飽和度に基づいて原則として任意に小さくすることができる。
従って、加えられる光学信号の、回折限界に基づいて可能な最小領域よりもはるかに任意に小さいＡ状態領域にマークを付けることができる。
その後、例えば、試験信号の照射によってＡ状態領域が読取られると、回折限界が許容するよりも小さくすることのできる限定された領域から（蛍光）測定信号が生じる。
試料が前記のように逐一走査されると、回折理論により許容される分解能よりも良好な
分解能で画像が得られる。

２つの状態の間の相違として蛍光性／非蛍光性の光学的性質が用いられる前記種類の方法は、例えば、特許文献１および特許文献２により公知である。
これらの方法では、光学信号によって蛍光分子がＡ（蛍光性）状態からＢ（非蛍光性）状態に移され、Ａ→Ｂ遷移で飽和が達成される。
蛍光性状態Ａのまま残る試料領域は、照射される光学信号の零地点を有する最小強度からそれぞれ生じる。
最小強度は、干渉パターンの一部である。
そして、試料の走査は、光学信号の最小強度を変位させることによって行われ、変位は、干渉光線の移相によって引き起こされる。
独国特許出願公開第１０３２５４５９号明細書 独国特許出願公開第１０３２５４６０号明細書

公知の方法では、干渉光線が局所的な点状の最小強度を有する干渉パターンを形成する欠点がある。
その結果、試料の走査は、少なくとも二次元での点状の走査作業を必要とし、そのことから走査作業がきわめて時間を要するものとなる。

そこで、本発明の目的は、コンパクトなデザインであるとともに簡単な構造で安価な手段によって迅速な試料走査が可能な、冒頭に指摘した種類の方法および顕微鏡を明示することである。

本発明によれば、この目的は、請求項１の特徴を有する方法によって達成される。
それによれば、本発明の方法は、少なくとも１つの強度零地点及び側方に隣接する最大強度を備えた横断面プロフィルを有する焦線（focal line）の態様で光学信号が提供されるように構成されかつ展開される。

前記本発明の目的は、さらに、請求項２５の特徴を有する顕微鏡によって達成される。
それによれば、この顕微鏡は、少なくとも１つの強度零地点及び側方に隣接する最大強度を備えた横断面プロフィルを有する焦線の態様で光学信号が提供可能であるように構成されかつ展開される。

本発明に関連してまず認識されたのは、公知の高分解能結像法の撮像速度が異なった分野への応用、例えば、生物試料のリアルタイムな顕微鏡の使用では十分でないことであった。
次に、本発明によれば、（基本的に任意の幅の）細いラインに沿って第２状態を誘導できるとき、点状走査と比較して、著しく迅速なライン状走査が可能であることが認識された。
本発明によれば、このため、焦線の態様で光学信号が提供され、焦線は（基本的に任意の幅の）細いラインに沿って（第１状態を維持するための）少なくとも１つの強度零地点及び（第２状態を飽和状態に誘導するための）側方に隣接する最大強度を備えた横断面プロフィルを有する。

本発明に係る方法および顕微鏡は、第１及び第２状態がきわめて長命かまたは時間的に永続して安定してさえいる点を併せて利用することができる。
この場合、第１状態から第２状態への遷移の飽和のために、飽和に不可欠な光信号エネ
ルギーが入射される比較的長い時間を選択することができる。
これにより、遷移飽和に関する局部的な強度はわずかな量に選択することができる。
とりわけ、光学信号の放射源から得られる全体のエネルギーは、試料空間内の大部分の空間領域に分布し、複数の強度零地点または拡張された零地点が生成される。
１つだけの点状零地点の周囲への信号全部の適用と比較して、１つ又は複数の零地点の周囲に生じる低い局部強度にもかかわらず、飽和は達成することができる。
これは、零地点の周囲ですべての分子が最終的に第２状態となるまで、信号が十分に長く照射されるようにするだけである。
これは、短命な状態（例えば、ＳＴＥＤ法では蛍光性状態Ａの通常の寿命が〜１ｎｓである）の場合と決定的に異なっている。
短命な状態の場合、飽和に不可欠なエネルギーが（Ａ→Ｂの遷移速度よりも著しく速い）短時間のうちに照射されねばならず、放射源の総出力は１つの（またはせいぜい若干数の）局部零地点を生成するだけにすぎない。
安定状態（例えばフォトクロミック（photochromic）染料）または長命状態（例えばＧＳＤ法におけるトリプレットシステム（triplet system）への遷移；ＧＳＤ＝Ground State Depletion＝基底状態の減衰）の場合では、安価な市販のレーザシステムの出力を広い領域に分布させて、複数の点状の強度零地点（＞＞１０）または強度のない完全なストライプ領域を試料内に生成することができ、その近傍では前もって飽和を達成できることを具体的なシステムで証明されるであろう。
これは、多数の点状の零地点または零地点ラインで試料が同時に走査されるとき並行撮像を可能とし、そして、信号が各零地点について同時に検出器によって分離して検出される。
こうして古典的な回折限界以下の分解能を有する顕微鏡を構成することができ、その撮像速度は、ＳＴＥＤに基づく方法の範囲内であり、単一の局部零地点を有するシステムと比較して著しく高まっている。

具体的な実施形態としては、顕微鏡の対物レンズの瞳（pupil）と共役な瞳面（pupil plane）に、まず照明ライン（illmination line）を生成する光学部品を顕微鏡に合体することによって焦線が発生される。
さらに、焦線の横断面プロフィルを生成するのに適した位相変調（phase modulation）を瞳ライン（pupil line）に沿って実現する位相変調素子が設けられている。

位相変調の間に、瞳ラインに沿って１つまたは複数の位相飛躍（phase jump）が導入されるようにすることができる。
位相飛躍を瞳中心に導入することが特に好ましい。
この位相飛躍は、ラインの半分が、波連（wave train）の半分だけ遅延するように波連の半分の長さに一致する長さに選択されれば、さらに有利である。
こうして、強度零地点及び側方に隣接する最大強度とからなる横断面プロフィルを有する焦線が焦点面に発生する。
選択的に、複数の位相飛躍を瞳ラインに沿って波連の半分ごとに導入することも可能であり、その結果、ライン全体の半分、すなわち瞳によって放射される光量の半分が、他方の半分と比較して同じように波連の半分だけ遅延している。

構造的に簡単な設計に関しては、瞳の中間像に配置される液体ベースの空間的位相変調器によって瞳ラインに沿う位相変調が実現される。
選択的に、位相遅延する光学被膜（optical coating）を備えた光学部品の付加が考え
られる。
基本的に、誘電体被膜（dielectric coatings）を備えた基板、液晶ベースの位相変調
器、または色消し位相フィルタ等の、あらゆる位相遅延素子を利用することができる。
理想的には、位相遅延性を有する光学素子が瞳面内またはその近傍に配置されている。

構造的に簡単な設計に関しては、シリンドリカルレンズ（cylindrical lens）、または、パウエルレンズ（Powell lens）を有する照明光源の照明光線を集束することによって
、瞳ラインが生成されるようにすることができる。
選択的に、スリット絞りを瞳面に結像することによって瞳ラインは生成することができる。ホログラフィック素子（holographic element）の利用も考えられる。

アクロゲートフィルタ（Achrogate filter）によって瞳ラインが光路に合せられるようにすれば、特に有利である。
その場合、好ましくは、フィルタ上の例えば誘電体被膜のような付加的な位相遅延膜によって瞳ラインに沿う位相変調を実現することができよう。

特に、コンパクトなデザインに関しては、瞳ラインを生成するための光学部品及び位相変調素子がユニットとして照明光路内に配置しておくことができる。
高い柔軟性を持たせることに関しては、瞳ラインを生成するための光学部品及び位相変調素子は、それぞれ個別ユニットとして照明光路の異なる位置に配置しておくこともできる。

顕微鏡の対物レンズの瞳のコヒーレントなライン状照明（coherent linear illumination）を確保するために、光学信号を生成するための照明光源はレーザ光源として構成されるのが好ましい。

減偏光効果が最大限に排除されるように、光学信号の光が瞳ラインに対して垂直に偏光されるようにすれば、特に有利である。

特に、好ましい実施形態としては、焦線は、異なる空間方向で順次生成される。
これは、例えば、互いに直角に向いた空間方向とすることができる。
同様に、記録される試料体積全体が各空間方向で順次走査されるようにすることができる。
その後、記録された個別の像は、数学的に組み合わされて１つの全体像とすることができ、これにより、１つ以上の方向で分解能向上が実現される。

第１状態から第２状態への移行が多光子吸収によって実現されるようにすることができる。
選択的にまたは付加的に、試料から出射する測定信号は、多光子励起によって読み取られる。
このような構成は、特殊な応用のとき、例えば、試料の漂白の防止を目的とする場合に提案される。

別の好ましい実施例として、第１状態を読取るために光学信号および試験信号は、それぞれパルス光源によって生成される。
その際、パルス光源の同期化が有利となる。

光学信号を生成するための照明光源は、少なくとも１つの別の光源と組合せておくことができ、別の光源は、試料から出射する測定信号を読取るのに、および／または第１状態を誘導するための切換信号を生成するのに利用することができよう。
特に、別の光源は、試料を全体的にまたは部分的に照射することができ、その場合、ライン状照射が好ましい。

さらに、光切換信号の焦線は、別の線と空間的に重ねることができよう。
そして、空間的な重なりは、試料から出射する測定信号を読取るために光学信号の焦線の強度零地点がラインの最大値と空間的に重なっているように選択される。
この場合、用途に応じて、各ラインに対して専用の走査機構、好ましくは走査ミラーを割り当てることができ、また、複数のラインに対して１つの走査機構で一緒に走査されるようにすることができる。

像生成時において速度上の利点を最大限利用するために、走査方向は、理想的には、瞳ラインの各設定方向に調整される。
さらに有利には、試料から出射する測定信号のライン検出は、ライン検出器を用いて実行することができる。
ライン検出器は、例えばＣＣＤラインとして構成することができる。
ＥＭＣＣＤまたはＡＰＤ（アバランシェフォトダイオード；Avalanche Photodiode）の利用も同様に考えられる。

光軸に沿っても分解能を向上させることに関しては、検出器のラインは、好ましくは、焦線と共焦点となるように配置されている。
具体的には、検出器のラインは、検出方向において走査機構の下流側（走査後検出（descanned detection））または走査機構の上流側（走査前検出（nondescanned detection
））に配置しておくことができる。

上述した顕微鏡は、少なくとも１つの光学的性質で互いに相違するさまざまな分子状態の間で染料分子を光誘導遷移させるために利用すれば、特に有利である。
顕微鏡は、例えば、Trans-Cis異性化物の諸状態間で遷移を誘導しまたはフォトクロミ
ック染料を切換えるのに利用することができる。
さらに、ＧＳＤ（基低状態の減衰）法では、染料分子をそのトリプレット状態において遷移させるための利用が可能である。
最後に、ＳＴＥＤ法の実施が提案される。

ところで、本発明の構成を有利な仕方で構成しかつ展開するさまざまな可能性がある。
そのため、従属請求項を参照し、試料を高い空間分解能で検査するための本発明に係る方法および本発明に係る顕微鏡の実施形態について、以下の説明を参照されたい。
図面に基づく好ましい実施形態の説明と関連し、本発明の構成に関する好ましい諸構成および諸展開もまた全般に説明される。

図１は、回折による分解能限界を越えて試料を高い空間分解能で検査するのに利用される照明過程のサイクルに関する概略を示す。
図１（ａ）によれば、まず、記録される試料領域Ｐ全体に、試料１内に付与されているとともに第１状態Ｚ１から第２状態Ｚ２へと繰り返し遷移可能な物質が切換信号２によって第１状態Ｚ１に移される。
第１状態Ｚ１及び第２状態Ｚ２は、少なくとも１つの光学的性質で互いに相違している。 具体的に示される実施例では、第１状態Ｚ１は、蛍光状態Ａであり、第２状態Ｚ２は、非蛍光状態Ｂである。
試料１内に付与される物質は、具体的に示される実施例では、フォトクロミック物質であり、その分子は、第１波長の光である切換信号２の照射によって蛍光性状態Ａに移される。
これは、理想的には、先行技術により知られているように、試料領域Ｐ内で切換信号２の単一の照明ラインで対物レンズ３を通して照明することによって行われる。
選択的に、試料１は、試料領域Ｐ全体を照射されてもよい。

基底状態の減衰（Ground State Depletion、ＧＳＤ）のとき、蛍光性（シングレット）状態への遷移は、ふつう自発的に起きる。
そのため、こうした場合、光切換信号の照射は不要である。
一般的に、１〜１００μｓ（一部ではそれより若干長い）の待機時間を考慮すればよいだけである。

次の、すなわち、図１（ｂ）に示すステップ（ｂ）では、別の波長の光、いわゆる光学信号４が、記録される試料領域Ｐに加えられる。
これは、明確な強度零地点５を有する二重線９の態様で生じる。
光学信号４は、光学信号４の光で照明されたすべての領域６においてＡ→Ｂ遷移を飽和誘導する。換言するなら、強度零地点５の近傍の狭く限定された物質領域がＡ状態のまま残る。
このＡ状態のまま残る物質領域は、回折限界の構造よりもはるかに小さくすることができる。
Ａ状態のまま残る領域のサイズは、最小強度５の特性に、したがってＡ→Ｂ遷移の達成される飽和度に基づいて専ら決定される。

図１（ｃ）には、Ａ状態の読取り状態が略示されている。
この目的のため、図１（ｂ）で処理されて物質がＡ状態のまま残った領域が記録されるように、光試験信号７は、記録される試料領域Ｐに照射される。
試験信号７は、好ましくは、同様にライン状に照射される。
この場合、最大値を有する単一のラインが生成され、この最大値は光学信号４の強度零地点５と空間的に重ねられる。
その結果、検出も、好ましくはライン状に、例えばＣＣＤラインの態様の共焦点に配置されるライン検出器によって行うことができる。

図１（ａ）〜（ｃ）に示したサイクルが繰返され、ラインパターンは、繰返しのたびに多少変位されていく。
こうして、記録される試料領域Ｐ全体を回折より細分化された範囲内の分解能で結像することができる。

図２が示しているのは、Ａ状態を読取るための照明光の個別のライン構成の生成、すなわち、最大値を有する単一ラインの生成であり、この最大値は（上で述べたように）光学信号４の本発明に係る焦線１０の強度零地点５と重ねることができる。
図２（ａ）によれば、照明光は、適当な光学素子１１を通して焦点面ＦＥと共役な面ＦＥ’内にライン状に結像される。
結像レンズ１２は、照明ラインを、照明光が試料１に集束されるのを助ける対物レンズ１３の瞳面ＰＥにコヒーレントに集束されるのに用いられている。
図示した照明ラインは、ｘ方向に延びている。
その結果、図２（ｂ）に示すように、瞳ＰＥは点対称でｙ方向にライン状で照射される（瞳ライン１４）。
図２（ｃ）に示すように、対物レンズ１３の焦点面ＦＥに同様にライン状の光構成が生成され、この光構成は、ｘ方向において瞳ライン１４に垂直であり（焦線１５）、焦点面ＦＥと共役な面ＦＥ’にラインの像を構成している。
焦線１５の横断面は、瞳ライン１４が瞳直径全体にわたるとき、回折限界の広がりを有している。
そして、焦線１５の横断面の広がりは、回折により限定されて、回折により限定された点光源（エアリーの円盤）の広がりよりも約１．４倍大きい。

図２において略示した光学素子１１は、さまざまな態様で実現することができる。
ＦＥ’または瞳ＰＥのライン状照明は、例えば、スリット絞りを結像することによって、またはシリンドリカルレンズまたはパウエルレンズで拡げられた照明光源を集束することによって達成することができる。
パウエルレンズの使用は、生成されるライン状の光構成が特別均質な光分布を持つという利点を提供する。
別の変更例は、ライン状にのみ反射するビームスプリッターを介した照明であり、このビームスプリッターは、瞳面ＰＥと共役な顕微鏡面に配置されている。
試料１のライン状照明をｘ方向に生成（図２（ｃ））するうえで決定的なのは、基本的にｙ方向での瞳ＰＥのコヒーレントなライン状照明のみである（図２（ｂ））。

図３は、横断面で中央の零地点５及び側方の限定的な最大値９を有する本発明に係る焦線１０の生成に関する実施例を示している。
このため、瞳ライン１４に沿って光学信号４の位相変調が実現される。
図３（ａ）には、瞳ＰＥのライン状照射が示されている。
瞳ライン１４の一方の半分は、瞳ライン１４の他方の半分に対して波連の半分だけ遅延されるように、瞳ライン１４に沿って瞳中心に半波長の位相飛躍が導入される。
そのことが、図３（ａ）では異なるハッチング領域で示されている。
この位相変調の結果、図３（ｂ）に示すように、中央の強度零地点５を有する二重線９が焦点面ＦＥに生成される。
別の位相変調も、このような中央の最小値を有する構成を基本的にもたらすことができる。
瞳ライン１４の５０％が波連の半分だけ遅延する特性を有するそれぞれの点対称の位相変調は、横断面プロフィル内に中央の最小値を有するとともに瞳ライン１４に対して直角に整列した焦線１０を生成している。
しかしながら、この場合焦線１０の横断面は、さらに複雑となり、それとともに一般にさらに多くの最大値及び最小値を含む。

図３（ａ）に矢印で示されているように、光は、瞳ライン１４に垂直に、すなわち、ｘ方向に偏光されている。
こうして、理論的な接線方向成分を有する偏光ベクトルのみが入射瞳１４に生成する。
後続の光学素子を通過するときこれらの偏光ベクトルは、ｚ方向、すなわち、光線方向で、例えば、（瞳に関連して）半径方向成分を有する偏光ベクトルよりもはるかに弱く減偏光する。

図４は、本発明に係る顕微鏡の一実施例を示している。
図４（ａ）に示す実施形態では、放射源１６のコヒーレントな照明光が適当な光学素子１１によって顕微鏡の中間像面ＺＢ３にライン状に集束される。
この場合、そのラインは、ｘ方向に延びている。
ライン状の光構成を実現するための光学素子１１は、シリンドリカルレンズ１７として構成されている。
中間像ＺＢ３は、レンズ１８を介して、顕微鏡の対物レンズ１３の瞳Ｐ１と共役な瞳面Ｐ２に結像され、そこで、光分布は、ｙ方向でライン状に延びる。

ストライプ状の反射膜ＲＳを有するビームスプリッター１９が顕微鏡の瞳面Ｐ３に配置されている。
ビームスプリッター１９は、ラインＲＳの領域でのみ反射し、瞳面Ｐ３全体を照射するとともに後方で検出される測定信号８はほぼ完全に透過される。

瞳Ｐ３は、光学素子２０、１８によってＹ走査機構２１に結像され、この走査機構は、ｙ方向で撮像するためにビームを走査することができる。
この走査機構は、同様に瞳面Ｐ２内に配置されている。
別の結像は、走査用接眼レンズ２２を介して中間像ＺＢ１に行われ、そこで再びｘ方向に光のストライプが生成する。
この光のストライプは、チューブレンズ２３及び対物レンズ１３を介して試料空間内の焦点面ＦＥに結像される。
この場合、ビームスプリッター１９が配置される瞳面Ｐ３と同様に、ｙ方向にライン状光分布が対物レンズ１３の瞳Ｐ１に生成する。
（回折により限定される）照明ストライプが、中間像面ＺＢ３と同様に、焦点面ＦＥに生成する。

中央の強度零地点５及び側方の最大強度９を有する本発明に係る焦線１０を生成するために、瞳ライン１４に沿って位相変調が行われる。
図示された実施例では、このため、光の位相を波連の半分だけ遅延させる位相遅延構造ＰＶをビームスプリッター１９の一部に備えることによって、図示の瞳Ｐ３に位相飛躍が導入される。
図４（ｂ）に示すように、ここでは、透明に構成される被膜ＰＶは、瞳直径全体にわたって延びる反射膜ＲＳの一方の半分を覆う。
その膜の屈折率のために、被膜ＰＶを通過するとき光は、被覆されていない個所（つまり空気）を通過する光に対して遅延される。
被膜ＰＶは、例えば、フッ化マグネシウムまたは二酸化ケイ素等の誘電体から作成することができ、反射膜ＲＳ上に蒸着することができる。
液晶膜に基づく構造も考えられる。

別の結像レンズ（ここには図示せず）で生成することのできる別の瞳面内に位相遅延素子を挿入することが選択的に行われる。
その場合、この別の瞳面に、誘電体被膜を備えた基板、液晶ベースの位相変調器、または色消し位相フィルタ等の、位相遅延素子を配置することができよう。
上述の位相遅延性を有する光学素子を導入することがすべてであり、この光学素子は、理想的には、瞳面にまたはその近傍に配置されている。

検出光（一般に蛍光）は、測定信号８として、対物レンズ１３、チューブレンズ２３、走査用接眼レンズ２２、走査機構２１（走査後検出）、レンズ１８及び２０、スペクトルフィルタリングするためのフィルタ２４、検出器レンズ２５によって、共焦点に配置されるライン検出器２６に結像される。
走査前検出も考えられ、その際検出器２６は、スキャナ２１と対物レンズ１３との間に配置されよう。

図５は、本発明に係る顕微鏡の別の実施形態を示しており、その構成は、図４に示す顕微鏡の構成に概念的に類似している。
見易くする理由から光路は、図示されていない。
ライン状に照射される瞳面Ｐ３（ｙ方向の瞳ライン１４）に、（空間的な）ビームスプリッターおよび位相遅延素子として同時に機能するビームスプリッター１９は、（図４の構成とは異なり）配置されていない。
むしろ、両方の機能が分離され、ビームスプリッター１９が専ら空間的ビームスプリッターとして機能するのに対して、位相遅延は、付加的に導入される位相遅延光学素子２７によって行われる。
瞳Ｐ３またはその近傍に同様に配置される位相遅延光学素子２７は、空間的に構成された透明な位相遅延被膜ＰＶ（誘電体）を備えた基板とすることができる。
図５（ｂ）では、光学素子２７が円形に構成されており、負のｙ方向にある半円が位相遅延被膜ＰＶを備えている。
さらに、液晶ベースの位相変調器または色消し位相フィルタ、可動微小鏡列（arrays with movable micromirrors）または別の変形可能な鏡を有する列が考えられる。
照明光と検出光とを分離するためのビームスプリッター１９として利用されるのは、例えば、カットオフフィルタ（edge filter）の態様の従来のダイクロイックビームスプリ
ッター２８である。
位相遅延光学素子２７は、ダイクロイックビームスプリッター２８の下流側に設けられている。

本発明に係る方法および本発明に係る顕微鏡のさらに有利な諸構成に関しては、繰返しを避けるために明細書の全体的部分と添付した特許請求の範囲とを参照されたい。

最後に、以上述べた実施例は、特許請求の範囲に記載された本発明の構成を解説するのに役立つにすぎず、本発明の構成を本実施形態に限定するものではない。

試料を高い空間分解能で検査するための方法の照明過程サイクルを示す概略図。 単一の最大強度を備えた横断面プロフィルを有する焦線の生成を示す概略図。 少なくとも１つの強度零地点及び側方に隣接する最大強度を備えた横断面プロフィルを有する焦線の本発明に係る生成を示す概略図。 本発明に係る顕微鏡の第１実施例の構成を示す概略図。 本発明に係る顕微鏡の第２実施例の構成を示す概略図。

符号の説明

１ ・・・試料
２ ・・・切換信号
３ ・・・対物レンズ
４ ・・・光学信号
５ ・・・強度零地点
６ ・・・領域
７ ・・・試験信号
８ ・・・測定信号
１０ ・・・焦線
１１ ・・・光学素子
１２ ・・・結像レンズ
１３ ・・・対物レンズ
１４ ・・・瞳ライン
１５ ・・・焦線
１６ ・・・放射源
１７ ・・・シリンドリカルレンズ
１８ ・・・レンズ
１９ ・・・ビームスプリッター
２０ ・・・光学素子
２１ ・・・ｙスキャナ
２２ ・・・走査用接眼レンズ
２３ ・・・チューブレンズ
２４ ・・・フィルタ
２５ ・・・検出器レンズ
２６ ・・・ライン検出器
２７ ・・・光学素子
２８ ・・・ビームスプリッター
Ａ ・・・蛍光性状態
Ｂ ・・・非蛍光状態
ＦＥ ・・・焦点面
Ｐ ・・・試料領域
Ｐ１〜Ｐ３ ・・・瞳面
ＰＥ ・・・瞳
ＲＳ ・・・反射膜
ＰＶ ・・・被膜
Ｚ１ ・・・第１状態
Ｚ２ ・・・第２状態
ＺＢ１ ・・・中間像
ＺＢ３ ・・・中間像面

Claims (43)

1. 試料を高い空間分解能で検査するための方法であって、検査される試料（１）が、第１状態（Ｚ１、Ａ）から第２状態（Ｚ２、Ｂ）へと繰返し遷移可能な物質を含み、第１状態（Ｚ１、Ａ）及び第２状態（Ｚ２、Ｂ）が少なくとも１つの光学的性質で互いに相違しており、記録される試料領域（Ｐ）内で物質がまず第１状態（Ｚ１、Ａ）に移されるステップ、光学信号（４）によって第２状態（Ｚ２、Ｂ）が誘導されて、記録される試料領域（Ｐ）内で、空間的に限定された部分領域が明確に除外されるステップを含むものにおいて、
   前記光学信号（４）が、少なくとも１つの強度零地点（５）及び側方に隣接する最大強度（９）を備えた横断面プロフィルを有する焦線（１０）の態様で提供されることを特徴とする方法。
2. 前記試料（１）が対物レンズ（３、１３）によって照明され、前記焦線（１０）が、対物レンズ（３、１３）の瞳（Ｐ１）と共役な瞳面（Ｐ３）内のライン状照射（瞳ライン（１４））によって、かつ、瞳ライン（１４）に沿う適当な位相変調によって生成されることを特徴とする請求項１に記載の方法。
3. 前記瞳ライン（１４）に沿って少なくとも１つの位相飛躍が導入されるように、前記位相変調が行われることを特徴とする請求項２に記載の方法。
4. 前記位相飛躍が、瞳中心に導入されることを特徴とする請求項３に記載の方法。
5. 前記導入された位相飛躍が、波連の半分の長さに一致することを特徴とする請求項４に記載の方法。
6. 前記複数の位相飛躍が、前記瞳ライン（１４）に沿って波連の半分ごとに導入されることを特徴とする請求項２に記載の方法。
7. 前記瞳ライン（１４）に沿う位相変調が、瞳（Ｐ１）の中間像に配置される液体ベースの空間的位相変調器によって実現されていることを特徴とする請求項２乃至請求項６のいずれか１項に記載の方法。
8. 前記瞳ライン（１４）に沿う位相変調が、位相遅延光学被膜（ＰＶ）を備えるとともに瞳（Ｐ１）の中間像に配置される光学部品（１９、２７）によって実現されることを特徴とする請求項２乃至請求項６のいずれか１項に記載の方法。
9. 前記瞳ライン（１４）に沿う位相変調が、前記瞳（Ｐ１）の中間像に配置される光学部品によって実現され、該光学部品がまず全反射による位相飛躍を発生させるとともに引き続いて金属膜での反射を発生させることを特徴とする請求項２乃至請求項６のいずれか１項に記載の方法。
10. 前記瞳ライン（１４）に沿う位相変調が、前記瞳（Ｐ１）の中間像に配置される光学素子によって実現され、該光学素子が変形可能および／または移動可能な少なくとも１つのミラーおよび／またはミラー素子を有していることを特徴とする請求項２乃至請求項６のいずれか１項に記載の方法。
11. 前記瞳ライン（１４）が、シリンドリカルレンズ（１７）またはパウエルレンズを有する照明光源の照明光線を集束することによって生成されていることを特徴とする請求項２乃至請求項１０のいずれか１項に記載の方法。
12. 前記瞳ライン（１４）が、スリット絞りを瞳面に結像することによって生成されることを特徴とする請求項２乃至請求項１０のいずれか１項に記載の方法。
13. 前記瞳ライン（１４）が、ホログラフィック素子によって生成されることを特徴とする請求項２乃至請求項１０のいずれか１項に記載の方法。
14. 前記瞳ライン（１４）が、アクロゲートフィルタによって光路に合わせられていることを特徴とする請求項２乃至請求項１０のいずれか１項に記載の方法。
15. 前記瞳ライン（１４）に沿う位相変調が、前記アクロゲートフィルタ上の付加的な位相遅延層によって実現されていることを特徴とする請求項１４に記載の方法。
16. 前記光学信号（４）を提供するための照明光源としてレーザが使用されていることを特徴とする請求項１乃至請求項１５のいずれか１項に記載の方法。
17. 前記光学信号（４）の光が、前記瞳ライン（１４）に対して垂直に偏光されることを特徴とする請求項２乃至請求項１６のいずれか１項に記載の方法。
18. 前記焦線（１０）が、異なる空間方向に順次生成されることを特徴とする請求項１乃至請求項１７のいずれか１項に記載の方法。
19. 前記記録される試料領域（Ｐ）が、前記焦線（１０）の各空間方向に応じてそれぞれ数回走査されることを特徴とする請求項１８に記載の方法。
20. 個別の像が、数学的に組み合わされて１つの全体像とされていることを特徴とする請求項１９に記載の方法。
21. 前記第１状態（Ｚ１、Ａ）から第２状態（Ｚ２、Ｂ）への移行が、多光子吸収によって実現されることを特徴とする請求項１乃至請求項２０のいずれか１項に記載の方法。
22. 前記試料（１）から出射する測定信号（８）が、多光子励起によって読み取られることを特徴とする請求項１乃至請求項２１のいずれか１項に記載の方法。
23. 前記光学信号（４）および試験信号（７）が、前記第１状態（Ｚ１、Ａ）を読取るためにパルス光源によって生成されていることを特徴とする請求項１乃至請求項２２のいずれか１項に記載の方法。
24. 前記パルス光源が、同期化されることを特徴とする請求項２３に記載の方法。
25. 試料を高い空間分解能で検査するための請求項１乃至請求項２４のいずれか１項に記載の方法を実施するための顕微鏡、特にレーザ走査型蛍光顕微鏡であって、
    検査されるべき試料（１）が、第１状態（Ｚ１、Ａ）から第２状態（Ｚ２、Ｂ）へと繰返し遷移可能な物質を含み、第１状態（Ｚ１、Ａ）及び第２状態（Ｚ２、Ｂ）が少なくとも１つの光学的性質で互いに相違しており、記録される試料領域（Ｐ）内で物質がまず第１状態（Ｚ１、Ａ）に移されるステップ、光学信号（４）によって第２状態（Ｚ２、Ｂ）が誘導されて、前記記録される試料領域（Ｐ）内で、空間的に限定された部分領域が明確に除外されるステップを含むものにおいて、
    前記光学信号（４）が、少なくとも１つの強度零地点（５）及び側方に隣接する最大強度（９）を備えた横断面プロフィルを有する焦線（１０）の態様で提供可能であることを
    特徴とする顕微鏡。
26. 顕微鏡の対物レンズ（３、１３）の瞳（Ｐ１）と共役な瞳面（Ｐ３）に照明線を生成するための光学部材（１１）を備えていることを特徴とする請求項２５に記載の顕微鏡。
27. 前記瞳ライン（１４）の位相変調によって前記焦線（１０）の横断面プロフィルを生成するための位相変調素子（１９、２７）を備えていることを特徴とする請求項２６に記載の顕微鏡。
28. 前記瞳ライン（１４）を生成するための前記光学部材（１１）及び位相変調素子（１９、２７）が、ユニットとして構成されていることを特徴とする請求項２６または請求項２７に記載の顕微鏡。
29. 前記瞳ライン（１４）を生成するための光学部材（１１）及び位相変調素子（１９、２７）が、それぞれ個別ユニットとして照明光路内に配置されていることを特徴とする請求項２７または請求項２８に記載の顕微鏡。
30. 前記位相変調素子（１９、２７）が、瞳（Ｐ１）の中間像に配置される液体ベースの空間的位相変調器として、または位相遅延誘電体被膜（ＰＶ）を備えた光学部材として構成されていることを特徴とする請求項２７乃至請求項２９のいずれか１項に記載の顕微鏡。
31. 前記瞳ライン（１４）を生成するための前記光学部材（１１）が、シリンドリカルレンズ（１７）および／またはパワーレンズおよび／またはホログラフィック素子として構成されていることを特徴とする請求項２６乃至請求項３０のいずれか１項に記載の顕微鏡。
32. 前記光学信号（４）を生成するための照明光源が、レーザとして構成されていることを特徴とする請求項２５乃至請求項３１のいずれか１項に記載の顕微鏡。
33. 前記光学信号（４）を生成するための照明光源が、試料（１）から出射する測定信号（８）を読取りまたは第１状態（Ｚ１、Ａ）を誘導するために少なくとも１つの別の光源と組合せられていることを特徴とする請求項２５乃至請求項３２のいずれか１項に記載の顕微鏡。
34. 前記別の光源が、試料（１）の全体または部分的に、好ましくは、ライン状に照明することを特徴とする請求項３３に記載の顕微鏡。
35. 前記光学信号（４）の焦線（１０）が、別の線と空間的に重なっていることを特徴とする請求項２５乃至請求項３４のいずれか１項に記載の顕微鏡。
36. 前記光学信号（４）の焦線（１０）の強度零地点（５）が、試料（１）から出射する測定信号（８）を読取るためにライン（１５）の最大値と空間的に重なっていることを特徴とする請求項３５に記載の顕微鏡。
37. 各ライン（１０、１５）が、走査機構（２１）、好ましくは、走査ミラーの態様のものに割り当てられていることを特徴とする請求項３５または請求項３６に記載の顕微鏡。
38. 走査方向が、瞳ライン（１４）の延びる方向と一致していることを特徴とする請求項３７に記載の顕微鏡。
39. 試料（１）から出射する測定信号（８）のライン検出のためのライン検出器（２６）を
    備えていることを特徴とする請求項２５乃至請求項３８のいずれか１項に記載の顕微鏡。
40. 前記ライン検出器（２６）が、ＣＣＤライン、ＥＭＣＣＤまたはＡＰＤとして構成されていることを特徴とする請求項３９に記載の顕微鏡。
41. 前記ライン検出器（２６）が、前記焦線（１０）と共焦点で配置されていることを特徴とする請求項３９または請求項４０に記載の顕微鏡。
42. 前記ライン検出器（２６）が、検出方向において前記走査機構（２１）の下流側または前記走査機構（２１）の上流側に配置されていることを特徴とする請求項３９乃至請求項４１のいずれか１項に記載の顕微鏡。
43. 少なくとも１つの光学的性質で互いに相違するさまざまな分子状態の間で染料分子を光誘導遷移させることへの、請求項２５乃至請求項４２のいずれか１項に記載の顕微鏡の使用。

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