IT201600097811A1

IT201600097811A1 - Metodo di analisi di informazioni spaziali e temporali di campioni mediante microscopia ottica

Info

Publication number: IT201600097811A1
Application number: IT102016000097811A
Authority: IT
Inventors: Francesco Difato; Monica Moroni; Gemma Palazzolo; Alessandro Soloperto
Original assignee: Fondazione St Italiano Tecnologia
Priority date: 2016-09-29
Filing date: 2016-09-29
Publication date: 2018-03-29
Also published as: EP3520074B1; US10776955B2; WO2018060806A1; US20190251706A1; EP3520074A1

Description

“Metodo di analisi di informazioni spaziali e temporali di campioni mediante microscopia ottica”

TESTO DELLA DESCRIZIONE

La presente invenzione ha per oggetto un metodo di analisi di informazioni spaziali e temporali di campioni mediante microscopia ottica.

Nel campo della microscopia ottica è nota la necessità di esaminare campioni anche di sostanziale spessore, ad esempio campioni biologici. All’interno del campione biologico sono tipicamente presenti regioni di interesse, come ad esempio cellule specifiche. Tali regioni di interesse possono manifestare, soprattutto nel caso di campioni biologici vivi, variazioni nel tempo delle proprie caratteristiche ottiche, corrispondenti a specifici comportamenti del campione, la cui rilevazione è di interesse per un’analisi biologica del campione stesso. In questi casi, la microscopia ottica deve essere in grado di rilevare sia le informazioni spaziali delle regioni di interesse, ossia dove queste siano disposte all’interno dello spazio tridimensionale di esame del campione, sia le informazioni temporali, ossia l’andamento nel tempo delle caratteristiche ottiche delle regioni di interesse.

In questo campo tecnico il documento “Instantaneous three-dimensional sensing using spatial light modulator illumination with extended depth of field imaging” (Sean Quirin, Darcy S. Peterka, and Rafael Yuste - Optics express 2013) descrive la rilevazione di informazioni spaziali e temporali sul campione mediante una scansione a profondità di campo estesa. Tuttavia le informazioni spaziali sono codificate sulla base della particolare configurazione del cammino di eccitazione, che sfrutta un sistema a due fotoni. Pertanto, le informazioni spaziali vengono perse quando si adottano altre architetture di eccitazione. Il documento descrive l’uso di una maschera di fase micro-fabbricata che fornisce una modulazione di fase fissa del cammino di rilevazione per avere una profondità di campo estesa. Ciò significa che la profondità di campo estesa non può essere modificata in ampiezza, una volta che la maschera di fase è stata realizzata e inserita. In altre parole, questa configurazione non permette di scegliere l'estensione della profondità di campo. La maschera di fase inoltre induce aberrazioni nelle immagini, che richiedono tecniche di deconvoluzione per eliminare gli artefatti. Infine, la modalità di acquisizione con profondità di campo estesa adottata non include la raccolta di informazioni spaziali del campione nella direzione assiale.

Nel medesimo campo tecnico anche il documento “Rapid 3D light-sheet microscopy with a tunable lens” (Fahrbach et al. Optics express 2013) descrive una analisi di informazioni spaziali e temporali di campioni mediante microscopia ottica. Il documento illustra un metodo di utilizzo di una lente liquida con fuoco elettricamente regolabile per effettuare una modulazione dinamica di fase nel cammino di ricezione. Tali lenti sono attualmente note e disponibili in commercio e consentono, mediante l’applicazione di un segnale elettrico di comando, di controllare la curvatura del liquido e quindi di variare la lunghezza focale. Ciò permette di mettere a fuoco un piano arbitrario entro un campione tridimensionale senza muovere alcuna parte meccanica del sistema, e quindi di effettuare senza inerzia una scansione assiale molto veloce del piano di fuoco rilevato. Il documento tuttavia non descrive la possibilità di effettuare una acquisizione di immagini a profondità di campo estesa e la metodologia è pertanto limitata nella frequenza di scansione.

Da quanto sopra è evidente che esista attualmente un’esigenza non risolta dai metodi noti allo stato dell’arte di effettuare un metodo di microscopia ottica che consenta di ottenere e analizzare in modo efficace informazioni spaziali e temporali di campioni, con elevata frequenza di scansione, con la possibilità di impostare la profondità di esame nel campione, e che non richieda modificazioni dell’architettura del sistema ottico utilizzato.

Questi scopi sono perseguiti dalla presente invenzione, che ha per oggetto un metodo di analisi di informazioni spaziali e temporali di campioni mediante microscopia ottica comprendente i seguenti passi:

a) scelta di un campo di vista in un campione; b) scansione del campione in direzione assiale mediante applicazione di un segnale elettrico di comando avente una prima frequenza ad una lente liquida elettricamente regolabile posta nel cammino di rilevazione, effettuando una acquisizione sequenziale, ad una prima frequenza di acquisizione maggiore della prima frequenza del segnale elettrico, di una pila di immagini poste su differenti piani di focalizzazione; c) elaborazione della pila di immagini per l’identificazione della posizione di una o più regioni di interesse nello spazio tridimensionale in esame del campione;

d) scansione del campione in direzione assiale mediante ulteriore applicazione del segnale elettrico avente una seconda frequenza alla lente regolabile, effettuando una acquisizione sequenziale, ad una seconda frequenza di acquisizione minore della seconda frequenza del segnale elettrico, di una serie temporale di immagini a profondità di campo estesa;

e) calcolo della media dell’intensità di ciascuna regione di interesse per ciascuna immagine della serie temporale.

Il metodo prevede quindi l’utilizzo di una lente liquida elettricamente regolabile inserita nella configurazione ottica di ricezione di un microscopio, per effettuare senza inerzia una scansione assiale molto veloce del piano di fuoco, ottenendo velocità irraggiungibili da metodi che prevedono una movimentazione motorizzata di componenti del microscopio come ad esempio l’obiettivo o il tavolino del microscopio. Il metodo permette di controllare mediante il segnale elettrico di comando la velocità e la profondità di scansione assiale. Ciò è effettuato con una modulazione della lunghezza focale della lente, e quindi con una modulazione di fase del cammino ottico di ricezione.

Una volta che è stata effettuata la scelta del campo di vista nel campione di cui al passo a), il passo b) prevede una scansione assiale lenta, in cui viene acquisita da un sensore fotosensibile una immagine per ogni piano focalizzato, ottenendo in questo modo una pila assiale, cosiddetta z-stack, di immagini del campione. La pila di immagini viene quindi elaborata nel passo c) per estrarre le informazioni spaziali del campione. I passi b) e c) consentono quindi di monitorare la configurazione spaziale del campione e di estrarre la posizione tridimensionale delle caratteristiche entro il campione.

Dopo che le informazioni spaziali sono state ottenute, il metodo prevede al passo d) una scansione assiale veloce, in modo da raccogliere i segnali ottici da tutti i piani scansiti, proiettandoli in un’unica immagine. Si ottiene in questo modo una profondità di campo estesa dell’obiettivo del microscopio, raccogliendo segnali da tutti i piani scansiti, e quindi generando una proiezione assiale del campione, per acquisire in ogni singola immagine della serie tutte le caratteristiche comprese entro la porzione assiale in esame del campione. Il calcolo della media dell’intensità di ciascuna regione di interesse per ciascuna immagine della serie temporale di cui al passo e) consente di generare un time-lapse per seguire le fluttuazioni di segnale associate con le caratteristiche distribuite nello spazio tridimensionale entro la profondità di campo estesa acquisita.

Il metodo ha numerosi vantaggi tecnici. La velocità di scansione assiale del campione può essere impostata grazie alla modulazione di fase dinamica. Ciò permette di lavorare in due possibili configurazioni: la scansione assiale lenta e la scansione assiale veloce. Il termine lento e veloce sono riferiti alla frequenza di acquisizione del sensore fotosensibile. Le due configurazioni lavorano sinergicamente per rilevare sia le informazioni spaziali sia le informazioni temporali dal campione. Inoltre, la porzione di campione interessata dalla scansione può essere definita arbitrariamente, così come l’estensione della profondità di campo, grazie alla modulazione dinamica di fase del cammino ottico di rilevamento effettuata dalla lente regolabile e ad una acquisizione di immagini sincronizzata da parte del sensore fotosensibile. Infine, non è necessario cambiare l'architettura del sistema per passare da una configurazione all’altra, grazie alla modulazione di fase dinamica consentita dalla lente regolabile.

In una forma esecutiva, il passo c) comprende i seguenti passi:

c1) proiezione della pila di immagini in un’unica immagine combinata;

c2) identificazione nell’immagine combinata di una o più regioni di interesse;

c3) calcolo della media dell’intensità in ciascuna regione di interesse in ciascuna immagine della pila e individuazione del massimo valore di intensità media per ciascuna regione di interesse.

Ciò consente di individuare dapprima la posizione delle regioni di interesse nelle direzioni ortogonali alla direzione assiale, e successivamente la loro localizzazione in direzione assiale.

Secondo un esempio esecutivo, il passo b) è preceduto da un passo di calibrazione comprendente i seguenti passi:

a1) applicazione del segnale elettrico alla lente regolabile, il quale segnale elettrico è tale per cui viene effettuata una scansione di una sequenza di piani focali;

a2) visualizzazione della sequenza di piani focali da parte di un utente;

a3) scelta da parte dell’utente dei piani focali limite della scansione;

a4) impostazione dei corrispondenti valori limite di tensione del segnale elettrico.

Il passo di calibrazione permette di impostare la porzione di campione in esame in direzione assiale. Ciò è ottenuto variando il segnale elettrico di comando applicato alla lente regolabile e contestualmente visualizzando il campione, in modo tale per cui è possibile scegliere e impostare la tensione massima e minima da applicare alla lente regolabile, e quindi i piani focali limite della scansione.

Secondo un perfezionamento è prevista la generazione di un fattore di conversione tra i valori di tensione del segnale elettrico e i corrispondenti piani focali della sequenza, in modo tale per cui il passo c3) è seguito dai seguenti passi:

c4) associazione per ciascuna regione di interesse del massimo valore di intensità media ad un corrispondente valore di tensione del segnale elettrico;

c5) individuazione per ciascuna regione di interesse del piano focale corrispondente al massimo valore di intensità media mediante applicazione del fattore di conversione al valore di tensione del segnale elettrico associato.

Preferibilmente la generazione del fattore di conversione è effettuata nel passo di calibrazione.

In questo modo è possibile identificare il valore di tensione del segnale elettrico corrispondente al piano di scansione in cui la regione di interesse ha intensità media massima, e convertire tale valore di tensione nella coordinata spaziale assiale moltiplicando per il fattore di conversione calcolato.

Secondo un esempio esecutivo, nel passo b) la distanza tra i piani focali corrispondenti alle immagini della pila è definita dalla profondità di esame del campione e dal numero di acquisizioni effettuate durante un’intera scansione del campione, il quale numero di acquisizioni è definito mediante l’impostazione rispettivamente della frequenza del segnale elettrico e della frequenza di acquisizione.

Secondo un ulteriore esempio esecutivo, la proiezione della pila di immagini in un’unica immagine combinata avviene mediante elaborazione via software della pila di immagini.

Secondo un ulteriore esempio esecutivo, l’identificazione di una o più regioni di interesse nell’immagine combinata avviene mediante binarizzazione dell’immagine combinata secondo una soglia predefinita.

L’analisi dell’immagine combinata al passo c1) e binarizzata secondo la soglia predefinita rende pertanto possibile l’identificazione delle coordinate spaziali perpendicolari alla direzione assiale delle regioni di interesse. Ciò, in combinazione con l’identificazione delle coordinate spaziali lungo la direzione assiale sopra descritta, permette di identificare con precisione la posizione di ciascuna regione di interesse nello spazio tridimensionale in esame.

In un ulteriore esempio esecutivo, nel passo d) la frequenza di acquisizione è maggiore o uguale al doppio della frequenza del segnale elettrico.

In questo modo il piano focale si sposta tra i piani limiti ad una frequenza maggiore della frequenza di acquisizione tale che il sensore fotosensibile sostanzialmente integra in un’unica immagine le informazioni di tutti i piani, in quella che può essere descritta come una proiezione dei massimi della porzione tridimensionale in esame del campione eseguita mediante hardware.

In una forma esecutiva, la durata dell’acquisizione al passo d) è impostata mediante i seguenti passi:

d1) impostazione della frequenza del segnale elettrico;

d2) impostazione della frequenza di acquisizione; d3) definizione del numero di immagini a profondità di campo estesa della serie temporale.

In questo modo è possibile decidere il numero di immagini da acquisire per comporre la serie temporale per definire la durata dell’acquisizione time-lapse.

Secondo un esempio esecutivo, la procedura di microscopia ottica è del tipo a fluorescenza.

La microscopia ottica a fluorescenza utilizza il fenomeno della fluorescenza, ossia la capacità di emettere luce da parte di un materiale che ha assorbito luce, in alternativa o in combinazione ai fenomeni di riflessione e assorbimento, per studiare le proprietà del materiale in esame. Il metodo può essere tuttavia applicato ad altri tipi di microscopia ottica, ad esempio a luce trasmessa.

Secondo un esempio esecutivo, la procedura di microscopia ottica è del tipo ad ampio campo. In questo tipo di procedura tutto il campione viene illuminato nello spazio tridimensionale contemporaneamente. In questo caso, il metodo consente di mantenere immodificata la configurazione del cammino di eccitazione del sistema ad ampio campo, e richiede solo piccole variazioni al cammino di ricezione. Il metodo si può applicare tuttavia ad ulteriori configurazioni come la microscopia confocale a illuminazione standard o a due fotoni implementata da maschere di fase o modulatori spaziali di luce, microscopia a illuminazione a singolo piano o a illuminazione strutturata, microscopia a illuminazione obliqua.

Queste ed altre caratteristiche e vantaggi della presente invenzione risulteranno più chiaramente dalla seguente descrizione di alcuni esempi esecutivi non limitativi illustrati nei disegni allegati in cui: la fig. 1 illustra una scansione lenta;

la fig. 2 illustra una scansione veloce;

la fig. 3 illustra la dipendenza del piano focale dal segnale elettrico di comando;

la fig. 4 illustra il segnale elettrico di comando;

la fig. 5 illustra una pila di immagini ottenuta con scansione lenta;

la fig. 6 illustra l’identificazione della posizione delle regioni di interesse in direzione assiale;

la fig. 7 illustra la posizione identificata delle regioni di interesse nello spazio tridimensionale in esame nel campione;

la fig. 8 illustra l’andamento nel tempo dell’intensità media di due distinte regioni di interesse;

la fig. 9 illustra un possibile dispositivo per l’attuazione del metodo.

Il metodo oggetto della presente invenzione utilizza una lente liquida con fuoco elettricamente regolabile per effettuare una modulazione dinamica di fase nel cammino di ricezione di un dispositivo di microscopia ottico, preferibilmente con architettura ad ampio campo.

Un esempio esecutivo preferito del dispositivo è illustrato in figura 9. Il dispositivo in figura è un microscopio invertito ad ampio campo a fluorescenza, ma il metodo può essere implementato anche con un microscopio in configurazione dritta. Il dispositivo comprende una sorgente luminosa di eccitazione 34, preferibilmente una lampada a xenon, la cui luce di eccitazione è raccolta da una lente 33 e riflessa verso un obiettivo 31 da uno specchio dicroico 32. L’obiettivo 31 riceve la luce di fluorescenza generata dal campione 4, la quale è separata dalla luce di eccitazione dallo specchio dicroico 32. La luce di fluorescenza quindi è inviata al sensore fotosensibile 39 mediante un telescopio composto di due lenti convesse semplici 35 e 37, dette lenti relè, essendo la lente regolabile 36 posizionata nel piano focale comune delle lenti relè 35 e 37. La presenza delle lenti relè 35 e 37 permette di non introdurre deformazioni dell’immagine al variare del piano focale. In questo modo infatti la magnificazione del sistema non cambia al variare del piano acquisito. È possibile prevedere una configurazione senza lenti relè 35 e 37, in cui è però necessaria una successiva elaborazione dell’immagine via software. È presente un filtro di emissione 38, che elimina la luce riflessa dal campione, interposto tra il telescopio e il sensore 39. Il dispositivo comprende inoltre una unità di comando della lente regolabile, non illustrata in figura, la quale unità di comando è configurata in modo tale per cui genera un segnale elettrico con frequenza minore della frequenza di acquisizione, per l’acquisizione sequenziale di una pila di immagini poste su differenti piani di focalizzazione, oppure genera un segnale elettrico con frequenza maggiore della frequenza di acquisizione, per l’acquisizione sequenziale di una serie temporale di immagini a profondità di campo estesa.

In tale esempio esecutivo preferito, la lente regolabile ha una lunghezza focale variabile tra 40 e 140 mm e può essere modulata da un segnale elettrico di comando con una larghezza di banda temporale di 1 KHz.

Variando la lunghezza focale della lente regolabile 36, si modifica la funzione di trasferimento ottica del cammino di ricezione e quindi è possibile effettuare una scansione del piano focale dell’obiettivo 31 nella direzione assiale del campione 4, come illustrato dai diversi fasci di luce visibili in figura 9.

Esiste una relazione lineare tra il segnale elettrico di comando applicato, e lo spostamento del piano focale all'interno del campione 4, come illustrato in figura 3, in cui le ascisse indicano l’intensità di tensione del segnale elettrico in Volt e le ordinate indicano lo spostamento del piano focale in mm.

È possibile controllare la velocità dello spostamento del piano focale variando la frequenza del segnale di comando della lente regolabile, e l'estensione dello spostamento complessivo impostando i valori limite di tensione che possono essere assunti<dal segnale elettrico:>

dove sono il punto di inizio e di fine dello spostamento del piano focale, che possono essere scelti arbitrariamente impostando i valori limite di massima e minima tensione del segnale elettrico di comando. Il segnale elettrico di comando è visibile in figura 4, in cui è visualizzato un grafico con il tempo in ascissa e la tensione del segnale in ordinata, ed è preferibilmente un’onda a dente di sega compresa tra i valori limite di tensione . I valori di possono essere scelti arbitrariamente, ad esempio

Il metodo è attuabile da un dispositivo di microscopia comprendente un sensore fotosensibile. Tale sensore è preferibilmente un sensore bidimensionale configurato per la ricezione di una matrice di pixel, come ad esempio una CCD 39.

L'acquisizione delle immagini da parte del sensore fotosensibile 39 è sincronizzata con lo spostamento assiale prodotto dalla lente regolabile 36, al fine di operare in due condizioni.

Nella prima condizione viene variata lentamente la lunghezza focale della lente regolabile per raccogliere una pluralità di immagini durante la scansione assiale lenta del campione 4, e ottenere una serie di immagini impilate in una z-stack 5. Questa condizione è illustrata in figura 1, in cui il campione 4 in esame presenta regioni di interesse, in particolare cellule 1, nel caso in figura neuroni. In questa configurazione, la frequenza di acquisizione o frame rate del sensore fotosensibile 39 è più rapida del segnale elettrico di comando della lente regolabile 36. Spostando il piano focale 2 in direzione assiale dalla posizione assiale corrispondente al piano limite 20 alla posizione assiale corrispondente al piano limite 21 con una velocità e acquisendo contestualmente immagini con frequenza viene acquisito un numero di immagini

durante tutta l'escursione assiale (tra p0 e p1) del campione 4. Considerando la relazione lineare tra il segnale di comando e lo spostamento del piano focale 2, è possibile determinare la dimensione della distanza<assiale tra immagini della pila acquisita:>

Durante la scansione lenta il segnale di comando potrebbe al limite essere costituito unicamente da una rampa di tensione da Vantaggiosamente,<invece, il segnale viene fatto oscillare più volte tra>durante l’acquisizione, e le immaginiacquisite relative ai medesimi piani focali vengono mediate tra loro per avere un maggiore rapporto segnale rumore.

Nella seconda condizione la lunghezza focale della lente regolabile 36 viene variata velocemente per eseguire continuamente avanti e indietro tra i piani focali limite la scansione assiale veloce del campione 4. In questa configurazione, il segnale di comando della lente regolabile 36 è molto più veloce della frequenza di acquisizione del sensore fotosensibile 39. La scansione assiale deve essere almeno 2 volte più veloce della frequenza di acquisizione, in modo da effettuare una scansione dell’intera porzione assiale del campione durante l’acquisizione di una singola immagine con il sensore, e quindi permette di raccogliere contemporaneamente i segnali ottici provenienti dai piani scansiti e di proiettarli in un’unica immagine acquisita. In questo modo viene estesa la profondità di campo del microscopio. La figura 2 illustra questa seconda condizione, in cui il campione 4 è scansito velocemente in direzione assiale mediante lo spostamento del piano focale 2 tra i piani limite 20 e 21. L'estensione della profondità di campo può essere scelta arbitrariamente impostando la tensione iniziale e la tensione finale del segnale inviato alla lente regolabile 36, alle quali corrispondono rispettivamente la posizione assiale corrispondente al piano limite 20 e la posizione assiale corrispondente al piano limite 21 della<scansione assiale:>

Nella scansione lenta di cui al passo b) vengono utilizzate una prima frequenza del segnale elettrico e una prima frequenza di acquisizione, mentre nella scansione veloce di cui al passo d) vengono utilizzate una seconda frequenza del segnale elettrico e una seconda frequenza di acquisizione. Per ottenere alternativamente le diverse configurazioni di scansione lenta e scansione veloce è necessario rispettivamente che la prima frequenza di acquisizione sia maggiore della prima frequenza del segnale elettrico e che la seconda frequenza di acquisizione sia minore della seconda frequenza del segnale elettrico. Per fare ciò è possibile mantenere costante la frequenza di acquisizione sia nella scansione lenta sia nella scansione veloce e variare unicamente la frequenza del segnale elettrico nelle due configurazioni oppure viceversa mantenere costante la frequenza del segnale elettrico sia nella scansione lenta sia nella scansione veloce e variare unicamente la frequenza di acquisizione nelle due configurazioni. In un esempio esecutivo preferito si agisce nelle due configurazioni su entrambe le frequenze, in modo tale per cui la prima e la seconda frequenza del segnale elettrico sono diverse tra loro così come la prima e la seconda frequenza di acquisizione.

Un esempio esecutivo di protocollo di attuazione del metodo oggetto della presente invenzione è descritto nel dettaglio in seguito:

1. Posizionamento del campione 4 sul tavolino del microscopio 30.

2. Attivazione della sorgente di luce di eccitazione 34 per eccitare le molecole fluorescenti all’interno del campione 4.

3. Scelta di un campo di vista (vedi passo a) nella direzione x, y muovendo il tavolino del microscopio 30, con la lente regolabile 36 impostata in una posizione focale fissa, ossia con un segnale elettrico di comando impostato costante.

4. Mantenimento della posizione x, y del campione 4 scelta al passo 3, e scansione del campione 4 in direzione assiale variando lentamente la tensione applicata alla lente regolabile 36. La tensione alla lente regolabile 36 può essere variata con un tipo qualsiasi di forma d’onda, o manualmente da un generatore di tensione. In questo passo, lo scopo è quello di monitorare il campione 4 nella direzione<assiale, per scegliere ed impostare la tensione massima>e minima da applicare alla lente regolabile 36,e quindi effettuare una scansione della porzione scelta di campione 4 nella direzione assiale (vedi passi a1, a2, a3, a4).

5. Una volta che sono state scelte la posizione del campione 4 (x,y) e l’estensione assiale di scansione (z) mediante impostazione di

acquisizione di una pila di immagini 5 dalla CCD (vedi passo b). Una tensione a forma d’onda periodica è applicata alla lente regolabile 36, per eseguire una scansione avanti e indietro del campione 4 tra le posizioni limite che sono le posizioni scelte al passo 4 e corrispondenti rispettivamente a

In questa configurazione, la frequenza del segnale inviato alla lente regolabile 36 è minore della<frequenza di acquisizione della CCD 39. Il rapporto>definisce il numero N di immagini acquisitenella pila 5 durante la scansione assiale del campione 4. La distanza tra immagini successive della pila acquisita 5 è definita come Durante questa fase il segnale elettrico di comando alla lente regolabile 37 e l’acquisizione di immagini sono sincronizzate. La pila 5 di immagini acquisite è visibile in figura 5.

6. Elaborazione della pila 5 per definire la posizione x, y, z delle caratteristiche di interesse 50 all’interno della porzione di campione in esame, come illustrato in figura 7.

6.1 Proiezione della pila 5 in un’unica immagine bidimensionale via software (vedi passo c). La proiezione in direzione assiale può essere una proiezione di massimi, media, slice-sum, o di deviazione standard. L’obiettivo è ottenere il contrasto migliore nell’immagine di proiezione. È possibile eventualmente implementare una deconvoluzione della pila prima di produrre l’immagine di proiezione per migliorare il contrasto.

6.2 Binarizzazione dell’immagine combinata di proiezione mediante una soglia, in modo da identificare automaticamente le regioni di interesse (vedi passo c), ed estrarre le coordinate x, y delle regioni di interesse 50 nel campo.

6.3 Calcolo dell’intensità media all’interno delle regioni di interesse 50 identificate al passo 6.2 per ciascuna immagine della pila 5.

6.4 Identificazione, per ciascuna regione di interesse 50, dell’immagine della pila 5 alla quale corrisponde il massimo valore di media di intensità (vedi passo c3). Un grafico dell’andamento dell’intensità media al variare della profondità assiale è illustrato in figura 6, dove è visibile un punto di massimo 60, corrispondente ad una regione di interesse 50.

6.5 Conversione del valore del segnale di comando della lente regolabile identificato come corrispondente a ciascuna immagine con intensità media massima della regione di interesse 50 in una coordinata spaziale assiale (vedi passi c1 e c2). La conversione è effettuata moltiplicando il valore del segnale di comando per il fattore di conversione ottenuto dalla calibrazione, che lega il segnale di tensione allo spostamento del piano focale. Si ottiene pertanto la posizione x, y, z di ciascuna regione di interesse 50 identificata, come visibile in figura 7.

7. Osservazione delle fluttuazioni di segnale delle regioni di interesse 50, mediante attuazione di un’acquisizione in time-lapse di immagini in configurazione di profondità di campo estesa. La<posizione x, y fissata al punto 1 e i valori di tensione>fissati al punto 2 sono mantenuti. In questaconfigurazione, la frequenza del segnale è impostata ad un valore maggiore rispetto alla frequenza di acquisizione di immagine deve essere almeno il doppio di per effettuare una scansione dell’intera porzione assiale del campione 4 all’interno di una singola acquisizione di immagine e quindi integrare i segnali derivanti dalle regioni di interesse in una immagine della CCD 39 (vedi passo e).

8. Una volta impostata la frequenza del segnale, impostazione del numero di immagini da acquisire con la CCD 39 nella sequenza temporale per definire la durata temporale dell’acquisizione di immagini time-lapse.

9. Dopo l’acquisizione di immagini time-lapse, calcolo dell’intensità media all’interno delle regioni di interesse 50 per ciascuna immagine della sequenza temporale, per estrarre le fluttuazioni di segnale nel tempo 7, come illustrato in figura 8.

Il metodo fin qui descritto mira quindi a definire l’estensione della profondità di campo, ad identificare la posizione x, y, z delle caratteristiche di interesse, e a seguire le fluttuazioni del segnale in funzione del tempo delle caratteristiche individuate. Pertanto, il metodo permette di eseguire acquisizioni di immagini con profondità di campo estesa su un volume del campione definito arbitrariamente, con informazioni codificate della posizione assiale delle caratteristiche all'interno del campo di vista.

Il metodo può essere efficacemente utilizzato per individuare la posizione di cellule neuronali 1 transfettate con un sensore di fluorescenza al calcio geneticamente codificato (eventualmente possono essere utilizzate altre sonde fluorescenti, come ad esempio sonde sensibili al potenziale di membrane cellulare, o alla concentrazione intracellulare di altri ioni. La sonda inoltre può essere geneticamente codificata nelle cellule tramite trasfezione o infezione virale, oppure si possono utilizzare marcatori sintetici introdotti nelle cellule). Una volta individuata la posizione delle cellule, è possibile osservare le fluttuazioni di fluorescenza associate a variazioni di concentrazione del calcio intracellulare di ciascuna delle cellule all’interno della rete tridimensionale, le quali fluttuazioni sono associate all’attività elettrofisiologica delle cellule.

Il sistema può essere provvisto di una interfaccia utente per automatizzare l’analisi di immagine e l’estrazione dei dati.

Claims

RIVENDICAZIONI 1. Metodo di analisi di informazioni spaziali e temporali di campioni mediante microscopia ottica, caratterizzato dal fatto che comprende i seguenti passi: a) scelta di un campo di vista in un campione; b) scansione del campione in direzione assiale mediante applicazione di un segnale elettrico di comando avente una prima frequenza ad una lente liquida elettricamente regolabile posta nel cammino di rilevazione, effettuando una acquisizione sequenziale, ad una prima frequenza di acquisizione maggiore della prima frequenza del segnale elettrico, di una pila di immagini poste su differenti piani di focalizzazione; c) elaborazione della pila di immagini per l’identificazione della posizione di una o più regioni di interesse nello spazio tridimensionale in esame del campione; d) scansione del campione in direzione assiale mediante ulteriore applicazione del segnale elettrico avente una seconda frequenza alla lente regolabile, effettuando una acquisizione sequenziale, ad una seconda frequenza di acquisizione minore della seconda frequenza del segnale elettrico, di una serie temporale di immagini a profondità di campo estesa; e) calcolo della media dell’intensità di ciascuna regione di interesse per ciascuna immagine della serie temporale.
2. Metodo secondo la rivendicazione 1, in cui il passo c) comprende i seguenti passi: c1) proiezione della pila di immagini in un’unica immagine combinata; c2) identificazione nell’immagine combinata di una o più regioni di interesse; c3) calcolo della media dell’intensità in ciascuna regione di interesse in ciascuna immagine della pila e individuazione del massimo valore di intensità media per ciascuna regione di interesse.
3. Metodo secondo la rivendicazione 1 o 2, in cui il passo b) è preceduto da un passo di calibrazione comprendente i seguenti passi: a1) applicazione del segnale elettrico alla lente regolabile, il quale segnale elettrico è tale per cui viene effettuata una scansione di una sequenza di piani focali; a2) visualizzazione della sequenza di piani focali da parte di un utente; a3) scelta da parte dell’utente dei piani focali limite della scansione; a4) impostazione dei corrispondenti valori limite di tensione del segnale elettrico.
4. Metodo secondo la rivendicazione 2 o 3, in cui è prevista la generazione di un fattore di conversione tra i valori di tensione del segnale elettrico e i corrispondenti piani focali della sequenza, in modo tale per cui il passo c3) è seguito dai seguenti passi: c4) associazione per ciascuna regione di interesse del massimo valore di intensità media ad un corrispondente valore di tensione del segnale elettrico; c5) individuazione per ciascuna regione di interesse del piano focale corrispondente al massimo valore di intensità media mediante applicazione del fattore di conversione al valore di tensione del segnale elettrico associato.
5. Metodo secondo una o più delle precedenti rivendicazioni da 2 a 4, in cui la proiezione della pila di immagini in un’unica immagine combinata avviene mediante elaborazione via software della pila di immagini.
6. Metodo secondo una o più delle precedenti rivendicazioni da 2 a 5, in cui l’identificazione di una o più regioni di interesse nell’immagine combinata avviene mediante binarizzazione dell’immagine combinata secondo una soglia predefinita.
7. Metodo secondo una o più delle precedenti rivendicazioni, in cui nel passo d) la frequenza di acquisizione è maggiore o uguale al doppio della frequenza del segnale elettrico.
8. Metodo secondo una o più delle precedenti rivendicazioni, in cui la durata dell’acquisizione al passo d) è impostata mediante i seguenti passi: d1) impostazione della seconda frequenza del segnale elettrico; d2) impostazione della seconda frequenza di acquisizione; d3) definizione del numero di immagini a profondità di campo estesa della serie temporale.
9. Metodo secondo una o più delle precedenti rivendicazioni, in cui la procedura di microscopia ottica è del tipo a fluorescenza.
10. Metodo secondo una o più delle precedenti rivendicazioni, in cui la procedura di microscopia ottica è del tipo ad ampio campo.