JP2012504252A5

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Publication number: JP2012504252A5
Application number: JP2011528231A
Authority: JP
Filing date: 2009-09-22
Publication date: 2012-11-08
Anticipated expiration: 2029-09-22

Claims

顕微鏡を使用して、蛍光色素で標識された試料を高解像度で結像するための方法であって、
該試料が複数の位相において、構造化及びパルス化された励起光によって順次照明され、該試料から放出された蛍光光が、位相毎に、各々構造化された個別画像において受光されることにより、複数の該個別画像から最終画像が高解像度で再構成される方法において、
少なくとも１つの照明パラメータおよび少なくとも１つの撮像パラメータのうちの少なくとも一方について、最適調整が決定されることを特徴とする方法。
前記パラメータの前記最適調整が、前記個別画像に基づく、追加的な中間画像に基づく、または蛍光光の小部分を脱結合するポイント検出器の信号に基づくフィードバックによって、かつ該パラメータの変動によって決定される、請求項１に記載の方法。
前記パラメータの変動が、前記励起光の、本質的に一定な平均強度において行われる、請求項２に記載の方法。
前記パラメータの前記最適調整を決定するために、照明および撮像のシミュレーションが実行される、請求項１に記載の方法。
前記調整時に、中間画像、個別画像、または最終画像内で、最大の信号雑音比または少なくとも１つの所定の信号雑音比が生じる場合に、調整が最適であると決定される、請求項１乃至４のいずれか１項に記載の方法。
前記最適調整を決定する際に、さらなる最適化標的の所定の重み付けが、信号雑音比のための重み付けと並んで考慮される、請求項５に記載の方法。
前記蛍光光が、前記個別画像を撮像する際の繰り返し周波数に対応する繰り返し周波数で中間画像において受光されることを特徴とする、請求項２乃至６のいずれか１項に記載の方法。
前記蛍光光の中間画像における前記受光が、前記個別画像の前記撮像時より顕著に高い繰り返し周波数で行われることを特徴とする、請求項２乃至６のいずれか１項に記載の方法。
前記中間画像に基づいて、撮像部により、パルス・シーケンスが局部的に変動する、請求項８に記載の方法。
同一の撮像部を用いて前記励起光が構造化される、請求項９に記載の方法。
前記個別画像が、前記最終画像の再構成前に、パルス・シーケンスの変動に応じてその強度が修正されることを特徴とする請求項１乃至１０のいずれか１項に記載の方法。
前記撮像中に計測中止基準がテストされ、該計測中止基準が満たされた場合に、該撮像が終了または簡略化される、請求項１乃至１１のいずれか１項に記載の方法。
計測中止基準として、変調コントラストが所定のコントラスト閾値より小であるかどう
か、または試料の移動距離が所定の移動閾値より大であるかどうかがテストされる、請求項１２に記載の方法。
パラメータの最適調整を決定するために、前記顕微鏡の対物レンズの液浸液に対する屈折率ミスマッチのない、１００ｎｍより薄い均質なマルチカラー色素フィルムの形態か、または２００〜５００ｎｍの大きさのマルチカラー・ビーズを含むテスト試料の形態のテスト・プレパラートが使用される、請求項１乃至１３のいずれか１項に記載の方法。
前記パルス・シーケンスがピクセルごとに変動する、請求項９乃至１４のいずれか１項に記載の方法。
前記最適調整は、照明の波長、照明のパルス・シーケンス、撮像の波長領域、撮像の露光時間、および撮像の強さのうち少なくとも１つの値について決定される、請求項１乃至１５のいずれか１項に記載の方法。
顕微鏡を使用して、蛍光色素で標識された試料を高解像度で結像するための方法であって、
該試料が複数の位相において、構造化及びパルス化された励起光によって順次照明され、該試料から放出された蛍光光が、位相毎に、各々構造化された個別画像において受光されることにより、複数の該個別画像から最終画像が高解像度で再構成される方法において、
該照明が、該蛍光色素の三重項状態からより高い三重項状態への励起が低減されるようなパルス・シーケンスで行われる、方法。
前記パルス・シーケンスが、前記励起光のパルス間に１マイクロ秒以上の励起ポーズを有することを特徴とする請求項１７に記載の方法。
前記照明が、蛍光色素の最低の三重項状態からより高い三重項状態への励起が低減されるようなパルス・シーケンスで行われる、請求項１７または１８に記載の方法。
顕微鏡を使用して、蛍光色素で標識された試料を高解像度で結像するための方法であって、
該試料が複数の位相において、構造化及びパルス化された励起光によって順次照明され、該試料から放出された蛍光光が、位相毎に、各々構造化された個別画像において受光されることにより、複数の該個別画像から最終画像が高解像度で再構成される、方法において、
前記蛍光色素の三重項状態を空乏化するために、該試料が追加的に抑制光によって照明されること特徴とする方法。
前記抑制光が、前記励起光と同様の方法で構造化されることを特徴とする請求項２０に記載の方法。
抑制光が、１ＭＷ／ｃｍ^２以上のエネルギー密度で使用されることを特徴とする請求項２０または２１に記載の方法。
前記蛍光色素の最低の三重項状態を空乏化するために、該試料が追加的に抑制光によって照明される、請求項２０乃至２２のいずれか１項に記載の方法。
顕微鏡を使用して、蛍光色素で標識された試料を高解像度に結像するための方法であって、
該試料が複数の位相において、構造化及びパルス化された励起光によって順次照明され、かつ、該試料から放射された蛍光光が、位相毎に、各々構造化された個別画像において受光されることにより、複数の該個別画像から最終画像が高解像度で再構成される、方法において、
中間画像が撮像され、該中間画像に基づいて、照明によって生じる前記蛍光色素の退色範囲が決定されるとともに、前記最終画像の再構成前に、前記個別画像が決定された範囲に応じて計算により修正される、方法。
前記個別画像の撮像前に前記中間画像が、または２枚の個別画像の間にそれぞれ１枚の中間画像が撮像され、前記試料が構造化され、または一様に照明される、請求項２４に記載の方法。
前記中間画像が、前記個別画像よりも高い繰り返し周波数で撮像され、前記蛍光光の強
度低下による退色がピクセルごとに決定される、請求項２４または２５に記載の方法。
前記退色の前記計算による修正が、フーリエ空間内で行われる、請求項２４乃至２６のいずれか１項に記載の方法。
顕微鏡を使用して、蛍光色素で標識された試料を高解像度で結像するための方法であって、
該試料が複数の位相において、構造化及びパルス化された励起光によって順次照明され、該試料から放出された蛍光光が、位相毎に、各々構造化された個別画像において受光されることにより、複数の該個別画像から最終画像が高解像度で再構成される、方法において、
少なくとも１つの参照画像に基づいて、前記個別画像の光学収差の範囲が決定され、前記最終画像の再構成前に、前記個別画像が決定された範囲に応じて計算により修正される、方法。
前記収差の範囲が、構造化パターンの歪みに基づいて決定される、請求項２８に記載の方法。
前記参照画像の撮像用に、前記個別画像の撮像用よりも小さい構造化空間周波数を有する参照励起光が使用される、請求項２８または２９に記載の方法。
前記励起光の構造化が、３次元回折次数を用いて行われ、３つすべての回折次数の干渉の空間周波数をわずかに上回る空間周波数をフィルタリングすることによって前記参照画像が決定されることを特徴とする請求項２８乃至３０のいずれか１項に記載の方法。
前記収差の範囲が、構造化パターンの変形および空間的位相変化のうちの少なくとも一方に基づいて決定される、請求項２９乃至３１のいずれか１項に記載の方法。
蛍光励起が、励起強度と蛍光強度が非線形の関係となるように実行されることを特徴とする請求項１乃至３２のいずれか１項に記載の方法。
光切り替え可能な蛍光色素が使用され、ｐＨ値および試料の固定のうちの少なくとも一方が、前記蛍光光の切り替えコントラストについて最適化される、請求項３３に記載の方法。
前記個別画像の撮像用の前記照明が、局部的に変動する、請求項３４に記載の方法。
前記個別画像の撮像用の前記照明が、ピクセルごとに変動する、請求項３５に記載の方法。
前記構造化が、その変調周波数を何倍かした周波数でもなお前記顕微鏡の顕微鏡対物レンズの透過領域内に含まれるような低い変調周波数によって実行され、前記試料内における高調波の振幅が、決定され、パラメータの最適調整用の基準として使用される、請求項３４に記載の方法。
前記試料内における高調波の振幅が、照明の波長、照明のパルス・シーケンス、撮像の波長領域、撮像の露光時間、および撮像の強さのうち少なくとも１つの値の最適調整用の基準として使用される、請求項３７に記載の方法。
顕微鏡を使用して、蛍光色素で標識された試料を高解像度で結像する方法であって、
該試料が複数の位相において、構造化及びパルス化された励起光によって順次、励起強度と蛍光強度との間に非線形の関係が生じるように照明され、該試料から放出された蛍光光が、位相毎に、各々構造化された個別画像において受光されることにより、該個別画像から、該非線形の関係を考慮した上でより高解像度の最終画像が再構成可能である、方法において、
該試料に含まれる、励起された蛍光色素と化学的に反応可能な遊離基が、該蛍光色素および該試料のうちの少なくとも一方の周囲から化学的に除去される、方法。
前記遊離基を除去するために、前記遊離基が酵素によって解放されることを特徴とする請求項３９に記載の方法。
前記試料が、構造化されたライン照明によって励起される、請求項１乃至４０のいずれか１項に記載の方法。
前記ライン照明の強度が、撮影するカメラのダイナミック・レンジが十分にレベル調整されるように適合され、該強度が行ごとに記憶される、請求項４１に記載の方法。
前記蛍光光が共焦点で検出される、請求項１乃至４２のいずれか１項に記載の方法。
請求項１乃至４３のいずれか１項に記載の請求項を実施するために設けられたコンピュータ・プログラム。
請求項１乃至４３のいずれか１項に記載の請求項を実施するために設けられた制御ユニット。
請求項４５に記載の制御ユニットを備えた顕微鏡。
前記顕微鏡は、レーザ走査顕微鏡である、請求項４６に記載の顕微鏡。