CN104515759B - 非线性结构光照明显微成像方法及*** - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种非线性结构光照明显微成像方法，其包括以下步骤：1)在所述数字微镜阵列上加载计算全息图；2)产生满足正弦分布的用于激活荧光蛋白的第一空间结构光场，第一空间结构光场照射到样品表面，使部分蛋白从暗态转换到亮态；3)第二空间结构光场照射样品，使处于亮态的荧光蛋白发荧光，并收集荧光，在光电探测器中成像；4)重复第2)和3)步骤，采集多个空间频率，每个方向采集多个初始位相，得到多张原始图像，并根据GPU加速算法重构超分辨图像。同时，本发明还公开了一种非线性结构光照明显微成像***。本发明具有***成像分辨率较高、高抗荧光漂泊、低光毒性、成像速度快的优点。

Description

非线性结构光照明显微成像方法及***

技术领域

本发明涉及生物成像领域，具体涉及一种非线性结构光照明显微成像方法及***。

背景技术

生物成像是涉及多学科交叉的生命科学前沿领域，通过在分子-细胞-组织-活体等不同层次上实时、动态地“看”到活细胞的相互作用来研究生物学功能的各种成像尖端技术已成为当今生命科学重大成果产生的突破口。

传统的光学显微镜受到光学衍射极限的限制，其衍射光斑(艾里斑)的大小约为光源波长与显微镜物镜数值孔径比值的一半，一般最高的成像分辨率在200-300nm左右，无法直接观察一些重要分子如基因、结构蛋白、免疫蛋白、RNA及其复合物、活性因子等是如何在细胞内得到表达、如何组成细胞的基本结构体系，如何调节细胞的主要生命活动，如细胞增殖、细胞分化、细胞凋亡与细胞信号传递等。反映这些体系性质的特征尺度都在纳米的量级。电子显微镜(EM)能够达到纳米数量级的分辨率，能够对细胞内部囊泡、线粒体等细胞器的定位，但是由于缺乏相应的探针标记，不适合定位单个蛋白质分子。电子显微镜样品需要固定，同时电子束的照射也会使生物样品受到辐照损伤，因此不适合进行活细胞动态变化的观察。

分辨率达到亚微米甚至纳米分辨率的超分辨光学显微技术能够克服传统光学显微镜和电子显微镜的缺陷，突破衍射极限，实现在细胞水平上的超分辨成像能力。

超分辨光学显微技术主要包括三大类：1、基于荧光单分子定位的光敏定位显微技术(photo-activated localization microscopy，简称PALM)和随机光学重构显微技术(stochastic optical reconstructionmicroscopy，简称STORM)；2、通过改变点扩散函数的受激发射损耗显微技术(stimulated emission depletion，简称STED)；3、使用结构光照明激发荧光的结构照明显微技术(structured illumination microscopy，简称SIM)。

PALM/STORM的成像原理相同，都是利用荧光分子的随机逐个激发发射荧光光子，通过点扩散函数数字化获得其中心位置，从而突破光波衍射现象对成像分辨率的限制。尽管PALM/STORM采用面探测成像，但每次只对少量荧光分子成像，需要反复激活-淬灭荧光分子进行成像，要获得一幅完整的细胞超分辨图像，一般需要采集1万张图像，数据量大，成像时间很长，这使得实验大多数在固定的细胞上完成，无法进行活细胞研究。

STED成像过程中，用一束激发光使荧光物质发光，同时用另外的高能量脉冲激光器发射一束重叠的、环型的、波长较长的激光将第一束光斑中大部分的荧光物质通过受激发射损耗过程淬灭，从而减少荧光光点的衍射面积，显著地提高了显微镜的分辨率。然而由于STED需要采用高强度激光(50-70纳米分辨率时所需峰值功率为400～800MW/cm2，5.8纳米分辨率时所需激光功率密度达到GW/cm2量级)，高功率激光容易造成生物组织损伤，极大地制约了STED的应用范围。

SIM利用调制光源照明样品，照明光和荧光在频域发生混频、移频，将原本不可分辨的高分辨率信息编码入荧光图像中，结合计算解码快速傅立叶变换获取高分辨率信息。然而由于照明光场本身也同样受到***衍射极限的限制，理论上SIM最大可将分辨率提高约一倍，横向分辨率达到约100-150nm。2005年Gustafsson.etal.[PNAS，102：13801(2005)]提出一种非线性结构光照明超分辨成像方法(NL-SIM)，利用荧光分子的饱和非线性特性，可获取样品的高频信息，理论上可实现任意高分辨率的荧光成像，然而为了实现饱和非线性荧光发射，需要很高的激发光功率密度，容易造成生物组织损伤，同时由于NL-SIM需要采集数倍于SIM的数据才能重构出一张超分辨图像，成像速度慢，这些问题限制了NL-SIM在生物医学领域的实际应用。

发明内容

为了解决上述技术问题，本发明提供了一种非线性结构光照明显微成像方法及***，其通过低功率密度的空间结构光场激活荧光标记样品，再使用与激活光场相位的空间结构光场激发荧光并采集成像，可使实现3倍光学截止频率成像，成像横向分辨率达到60纳米，***具有良好的机械稳定，其中Z向漂移低于5纳米/小时，图像采集速度达到100Hz，能够实现对活细胞超分辨成像。

为了达到上述目的，本发明的技术方案如下：

非线性结构光照明显微成像方法，其包括以下步骤：

1)令数字微镜阵列工作在锁定模式，在数字微镜阵列上加载计算全息图，计算全息图的透过率函数为：其中γ表示调制度，k₀表示空间频率，表示初始相位；

2)令空间均匀分布的第一激光照射到数字微镜阵列上，第一激光被数字显微镜阵列上的全息光栅衍射到各个级次，各个级次的光在透镜构成的***的傅立叶面滤波后，选择其中的一对正负一级衍射光，一对正负一级衍射光依次通过透镜和显微物镜，照射到样品表面，使正负一级衍射光在样品的蛋白表面发生干涉，产生满足正弦分布的用于激活荧光蛋白的第一空间结构光场，第一空间结构光场照射到样品表面，使部分蛋白从暗态转换到亮态；

3)使用波长大于第2)步中的第一激光的第二激光来重复步骤2)，得到满足正弦分布的用于激发荧光蛋白的第二空间结构光场，使用第二空间结构光场照射样品，使处于亮态的荧光蛋白发荧光，并收集荧光，在光电探测器中成像；

4)改变数字微阵列上加载的计算全息图，重复第2)和3)步骤，采集多个空间频率，每个方向采集多个初始位相，得到多张原始图像，最后用GPU加速算法，根据的多张原始图像重构超分辨图像。

优选地，在步骤4)中，在采用GPU加速算法根据多张原始图像重构超分辨图像之前还包括步骤：判断全部光栅是否均已加载并成像：若否，返回步骤2)；若是，判断多个波长窗口是否均已成像：若否，仍然返回步骤2)；若是，关闭数字显微镜阵列，停止采集图像，GPU加速重构图像。

优选地，在上述的步骤2)中，透镜构成的***为4F***，各个级次的光在4F***的傅立叶面进行滤波。

优选地，上述的第一空间结构光场和第二空间结构光场具有相同的位相。

优选地，上述的一对正负一级衍射光为一对相干光束对。

非线性结构光照明显微成像***，其包括：

光源***(1)，其包括至少两个波长不同的激光器(11、12)、至少两个中性滤波片(15、16)、至少两个半波片(19、110)、至少两个二向色镜(113、114)、声光可调滤波器(117)、光纤耦合器(118)和高频振动台(119)，激光器(11、12)中至少有一个作为激活光源，至少有另一个作为激发光源，作为激活光源的激光器发出的激光和从作为激发光源的激光器发出的激光，分别依次通过中性滤波片(15、16)、半波片(19、110)、二向色镜(113、114)、声光可调滤波器(117)、光纤耦合器(118)和高频振动台(119)，最终得到在同一根光纤中传播的至少一束激活光束和至少一束激发光束；

衍射***(2)，至少一束激活光束和至少一束激发光束分别依次经过衍射***中沿光路依次放置的光纤耦合器(21)、透镜(22)、反射镜(23)、数字微镜阵列(24)、透镜(25)、强度掩模(26)、透镜(27)、反射镜(28)和透镜(29)，每束光均得到一对对应的正负一级衍射光；

成像***(3)，衍射***(2)产生的激活光束对应的第一正负一级衍射光和激发光束对应的第二正负一级衍射光依次通过成像***(3)中的二向色镜(31)和显微物镜(32)，并照射到样品表面，使第一正负一级衍射光和第二正负一级衍射光分别在样品蛋白表面发生干涉，产生空间结构光场，其中第一正负一级衍射光产生至少一个满足正弦分布的用于激活荧光蛋白的第一空间结构光场，第二正负一级衍射光产生至少一个满足正弦分布的用于激发荧光蛋白的第二空间结构光场，第一空间结构光场和第二空间结构光场使样品发射荧光，且发射的荧光被物镜(32)收集，通过二向色镜(31)、二向色镜(34)、干涉滤光片(35)，经管透镜(36)在光电探测器的探测面上多次成像，最终通过成像***(3)中的GPU加速数据处理子***采用GPU加速算法，根据多张光电探测器采集的原始图像重构荧光样品的超分辨图像。

优选地，上述的GPU加速数据处理子***包括数据采集卡、图形工作站和图形处理显卡，GPU加速数据处理子***从光电探测器采集的原始数据，通过GPU加速算法，重构出样品的超分辨显微图像。

优选地，上述的非线性结构光照明显微成像***还包括电子看控制***，用于实现声光可调滤波器(117)、数字微镜阵列(24)和光电探测器的同步触发。

优选地，上述的光源***(1)放置在一个气浮防震实验平台，衍射***(2)和成像***(3)放置在另一个气浮防震实验平台，两个气浮防震实验平台之间通过带标准FC转接口的多模光纤跳线连接，并将多模光纤跳线的一部分固定在震动台上，在成像过程中持续随机震动。

优选地，上述的第一正负一级衍射光和第二正负一级衍射光为一对相干光束对。

本发明的有益效果在于：

1)***成像分辨率较传统SIM有显著提高；本发明通过第一步采用结构光激活荧光样品，第二步使用与激活光场同相位的结构光场激发荧光，这种两步结构光激活-激发成像方法，使得***最大有效空间频率达到传统光学截止频率的三倍，理论上成像分辨率最大可提高三倍，而传统的SIM成像方法采用一步结构光激发直接成像，理论上最大有效空间频率仅能达到截止频率的两倍，成像分辨率也仅能提高两倍；

2)高抗荧光漂泊、低光毒性，本发明使用的激活光场与激发光场均为低功率密度光场(典型值为W/cm2)，远低于传统的NL-SIM以及STED(典型值为MW/cm2)，较低的功率密度减弱激光对荧光分子的漂白作用，利于延长荧光发射时间，同时可避免对细胞或生物组织造成损伤，降低光毒性，这对于生物医学显微成像具有重要意义；

3)成像速度快，可实现对活细胞超分辨成像；本发明构建了基于数字微镜阵列(digital micro-mirror device，简称DMD)的结构光场产生光路，在DMD上显示计算全息图，其透过率函数可表示为：其中γ表示调制度，k₀表示空间频率(决定衍射的方向和衍射角的大小)，表示初始相位(决定结构光场的强度分布)t，设计一组具有不同空间频率和初始位相的计算全息图，可获得一组具有不同相对位相差的衍射光场。空间均匀分布的激光照射到DMD上，被全息光栅衍射到各个级次，通过4f***，在傅立叶面滤波，选择其中的正负1级衍射光，并通过ITRF透镜和显微物镜的组合，使正负一级衍射光在样品表面发生干涉，产生满足正弦分布的空间结构光场；值得指出的是，在专利CN102540446A及其他相关专利中涉及采用DMD产生结构光场时，大都通过成像***将DMD直接成像到样品表面，理论上其产生的条纹分布不是严格满足正弦分布，且有效空间频率较低。而本发明设置的基于DMD全息光栅衍射光干涉的方式产生的结构光场严格满足正弦分布，且可实现更高的空间频率，理论上可达到***的光学截止频率(采用TIRF照明)，DMD工作在像素锁定模式，切换速度高于1KHz，同时采用高速科研级SCOMS相机，其最高帧频同样达到1KHz，使得本发明***总体采图速度高于100Hz，可满足活细胞成像需求。

附图说明

图1为本发明的非线性结构光照明显微成像方法的流程示意图。

图2为本发明的非线性结构光照明显微成像***的结构示意图。

图3为本发明的非线性结构光照明显微成像方法及***中所涉及的图像重构算法的示意图。

具体实施方式

下面结合附图详细说明本发明的优选实施方式。

图1为一种非线性结构光照明超分辨荧光成像方法的流程图。为了描述方便，在本实施例中，激活光特指波长为405nm的连续固体激光器，激发光特指波长为488nm连续固体激光器，两束激光的输出功率在0至100mW之间可调。

为了达到本发明的目的，如图1和3所示，在本发明的非线性结构光照明显微成像方法的一些实施方式中，其包括步骤：

步骤S101：用激发光均匀照明样品，通过SCOMS采集传统宽场照明成像图，通过移动载物台，选择需要超分辨成像的区域；

步骤S102：计算机自动锁焦；

步骤S103：调高激发光功率，使荧光蛋白分子全部处于暗态，不发射荧光；

步骤S104：控制***修改AOTF的工作频率，只允许激活光透过AOTF，进而照射到DMD上，在DMD上加载一幅计算全息图，计算全息图的强度透过率函数为：其中γ表示调制度，k₀表示空间频率(决定衍射的方向和衍射角的大小)，表示初始相位(决定结构光场的强度分布)；激活光首先被计算全息图衍射到各个级次，随后被放置在DMD之后的一个由两个透镜组成的4f***收集，在4f***的傅里叶面上，通过一个强度掩模选频，只允许正负一级衍射光通过，从这个4f***出射之后，再经过一个由TIRF透镜和显微物镜组成的4f***，样品表面发生干涉，产生余弦分布的周期照明光场，激活光照射2ms之后，令AOTF切断激活光；

步骤S105，控制***调整AOTF的工作频率，只允许激发光通过AOTF，并照射到DMD上，激发光经计算全息图衍射之后，在样品表面产生余弦分布的周期照明光场，使在步骤S104中被激活的荧光蛋白分子发射荧光，此时荧光光强分布表示为：

其中S(r)表示样品荧光蛋白分子空间分布函数，表示激活光的空间频率，表示激发光的空间频率，可以看出在I(r)中包含空间频率为的成分，在同一显微成像***中其中k_C表示***的光学截至频率，因此该成像***最大可以实现3倍光学截至频率的超分辨成像。同时触发SCOMS采集数据，并将数据存储在图形工作站的内存之中，激发光照射2ms之后结束数据采集，AOTF切断激发光；

步骤S106：判断是否完成9个条纹方向的激发光的成像，9个条纹方向对应9个不同的k₀取值，9个条纹方向的激发光的方位角与x轴方向的夹角分别为2Nπ/9，其中N＝0，1，2，..，8，每个条纹方向的激发光的初始位相对应7个不同的取值，分别为Mπ/7，其中M＝0，1，2，...，6，共采集63幅原始图像；如果未采集到63幅原始图像，则回到步骤S103；如果采集到63幅原始图像，则进行步骤S107；

步骤S107：在图形工作站上，通过GPU加速非线性结构光照明图像处理算法，通过所述63幅原始图像重构样品的超分辨荧光图像，算法结构如图3所示；所述激活光与激发光的波长可根据开关蛋白的吸收-发射光谱特性经行更换，也可以设置两束波长不同的激发光，对采用两种开关蛋白标记的生物样品经行双色成像。

其中，步骤S103中，样品表面的部分蛋白从暗态转换到亮态，暗态即不能被激光激发并发射荧光的空间构型，亮态即可以被激光激发并发射荧光的空间构型。正负遗迹衍射光依次通过的透镜和显微物镜中，透镜可以采用ITRF透镜。

为了达到本发明的目的，如图2和3所示，在本发明的非线性结构光照明显微成像***的一些实施方式中，其包括：

光源***1，其包括两个或更多个波长不同的激光器11、12、两个或更多个中性滤波片15、16、两个或更多个半波片19、110、两个或更多个二向色镜113、114、声光可调滤波器(AOTF)117、光纤耦合器118和高频振动台119，高频振动台119在成像过程中以5KHz频率持续振动，消除激光的空间相干性，使照明光场空间均匀。不同波长的激光器11、12中有一个作为激活光源，另一个作为激发光源，从作为激活光源的激光器发出的激光和从作为激发光源的激光器发出的激光，分别依次通过中性滤波片15、16、半波片19、110、二向色镜113、114、声光可调滤波器(AOTF)117、光纤耦合器118和高频振动台119，最终得到在同一根光纤中传播的一束激活光束和一束激发光束；

衍射***2，光源***1产生的一束激活光束和一束激发光束分别依次经过衍射***2中沿光路依次放置的光纤耦合器21、透镜22、反射镜23、数字微镜阵列DMD 24、透镜25、强度掩模26、透镜27、反射镜28和TIRF透镜29，每束光均得到一对对应的正负一级衍射光，其中，正负一级衍射光均为一对相干光束对；

成像***3，衍射***2产生的激活光束对应的正负一级衍射光、激发光束对应的正负一级衍射光，依次通过成像***3中的二向色镜31和显微物镜32(100x，NA1.49，oil)，照射到样品表面，样品固定在三维精密电动载物台33，使正负一级衍射光分别在样品蛋白表面发生干涉，产生空间结构光场，其中，一束激活光束对应的正负一级衍射光产生一个满足正弦分布的用于激活荧光蛋白的空间结构光场，一束激发光束对应的正负一级衍射光产生一个满足正弦分布的用于激发荧光蛋白的空间结构光场，该空间结构光场结构光场使样品发射荧光，且发射的荧光被物镜32收集，通过二向色镜31，二向色镜34，干涉滤光片35，经管透镜36在光电探测器探测面上多次成像，最终通过成像***3中的GPU加速数据处理子***采用GPU加速算法，根据多张光电探测器采集的原始图像重构荧光样品的超分辨图像。

其中，上述的GPU加速数据处理子***包括数据采集卡、图形工作站和图形处理显卡，GPU加速数据处理子***从光电探测器采集的原始数据，通过GPU加速算法，重构出样品的超分辨显微图像。

优选地，上述的非线性结构光照明显微成像***还包括电子看控制***，该电子看控制***可以包括单片机和开关电源用于实现声光可调滤波器(117)、数字微镜阵列(24)和光电探测器的同步触发。

上述的光源***(1)放置在一个气浮防震实验平台，衍射***(2)和成像***(3)放置在另一个气浮防震实验平台，两个气浮防震实验平台之间通过带标准FC转接口的多模光纤跳线连接，并将多模光纤跳线的一部分固定在5KHz震动台上，在成像过程中持续随机震动。

对于光源***的光源子***，其用于激活荧光蛋白的光源，可以是波长为405nm的连续固体激光器，也可以是其他波长的激光器或LED光源(波长选择取决于实验采用的荧光蛋白的类型)。

本发明的***用于激发荧光蛋白发射荧光的激发光源可以是488nm、514nm、561nm、647nm连续输出固体激光器，也可以是其他波长的激光器，如图2所示，***中最多可以同时设置4路激光器11，12，13，14，每增加一路激光器，例如13，14，需相应地增加中性滤光片17，18，半波片111，112，二向色镜115，116。

如图2所示，成像***至少包括1个SCMOS 1光电探测器，此处光电探测器也可以是EMCCD，并且根据荧光标记蛋白的不同，最多可以设置4个SCMOS光电探测器，每增加一路SCMOS探测光路，例如SCMOS2，需相应增加二向色镜38，干涉滤光片39，管透镜(Tube Lens)310。

光源***1中用于激活荧光蛋白的光源，可以是波长为405nm的连续固体激光器，也根据实验采用的荧光蛋白的类型选择其他波长的激光器。

以上所述的仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明创造构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。

Claims (9)

1.非线性结构光照明显微成像方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)令数字微镜阵列工作在锁定模式，在所述数字微镜阵列上加载计算全息图，所述计算全息图的透过率函数为：其中γ表示调制度，k₀表示空间频率，表示初始位相，r表示透过率；

2)令空间均匀分布的第一激光照射到所述数字微镜阵列上，所述第一激光被所述数字微镜阵列上的全息光栅衍射到各个级次，所述各个级次的光在透镜构成的***的傅立叶面滤波后，选择其中的一对正负一级衍射光，所述一对正负一级衍射光依次通过透镜和显微物镜，照射到样品表面，使所述正负一级衍射光在样品的蛋白表面发生干涉，产生满足正弦分布的用于激活荧光蛋白的第一空间结构光场，所述第一空间结构光场照射到样品表面，使部分蛋白从暗态转换到亮态；

3)使用波长大于第2)步中的所述第一激光的第二激光来重复步骤2)，得到满足正弦分布的用于激发荧光蛋白的第二空间结构光场，使用所述第二空间结构光场照射样品，使处于亮态的荧光蛋白发荧光，并收集荧光，在光电探测器中成像；

4)改变所述数字微镜阵列上加载的所述计算全息图，重复第2)和3)步骤，采集多个空间频率，每个条纹方向采集多个初始位相，得到多张原始图像，最后用GPU加速算法，根据所述的多张原始图像重构超分辨图像。

2.根据权利要求1所述的非线性结构光照明显微成像方法，其特征在于，在所述步骤4)中，在采用所述GPU加速算法根据所述多张原始图像重构超分辨图像之前还包括步骤：判断全部光栅是否均已加载并成像：若否，返回步骤2)；若是，判断多个波长窗口是否均已成像：若否，仍然返回步骤2)；若是，关闭所述数字微镜阵列，停止采集图像，GPU加速重构图像。

3.根据权利要求1所述的非线性结构光照明显微成像方法，其特征在于，在所述步骤2)中，所述透镜构成的***为4F***，所述各个级次的光在所述4F***的傅立叶面进行滤波。

4.根据权利要求1所述的非线性结构光照明显微成像方法，其特征在于，所述第一空间结构光场和所述第二空间结构光场具有相同的位相。

5.根据权利要求1所述的非线性结构光照明显微成像方法，其特征在于，所述一对正负一级衍射光为一对相干光束对。

6.非线性结构光照明显微成像***，其特征在于，包括：

光源***(1)，其包括至少两个波长不同的激光器(11、12)、至少两个中性滤波片(15、16)、至少两个半波片(19、110)、至少两个二向色镜(113、114)、声光可调滤波器(117)、光纤耦合器(118)和高频振动台(119)，所述激光器(11、12)中至少有一个作为激活光源，至少有另一个作为激发光源，作为激活光源的激光器发出的激光和从作为激发光源的激光器发出的激光，分别依次通过所述中性滤波片(15、16)、所述半波片(19、110)、所述二向色镜(113、114)、所述声光可调滤波器(117)、所述光纤耦合器(118)和所述高频振动台(119)，最终得到在同一根光纤中传播的至少一束激活光束和至少一束激发光束；

衍射***(2)，所述至少一束激活光束和所述至少一束激发光束分别依次经过衍射***中沿光路依次放置的光纤耦合器(21)、第一透镜(22)、数字微镜阵列(24)、第一反射镜(23)、第二透镜(25)、强度掩模(26)、第三透镜(27)、第二反射镜(28)和第四透镜(29)，每束光均得到一对对应的正负一级衍射光；

成像***(3)，所述衍射***(2)产生的激活光束对应的第一正负一级衍射光和激发光束对应的第二正负一级衍射光依次通过成像***(3)中的第一二向色镜(31)和显微物镜(32)，并照射到样品表面，使所述第一正负一级衍射光和第二正负一级衍射光分别在样品蛋白表面发生干涉，产生空间结构光场，其中所述第一正负一级衍射光产生至少一个满足正弦分布的用于激活荧光蛋白的第一空间结构光场，所述第二正负一级衍射光产生至少一个满足正弦分布的用于激发荧光蛋白的第二空间结构光场，所述第一空间结构光场和第二空间结构光场使样品发射荧光，且发射的荧光被物镜(32)收集，通过第一二向色镜(31)、第二二向色镜(34)、干涉滤光片(35)，经管透镜(36)在光电探测器的探测面上多次成像，最终通过成像***(3)中的GPU加速数据处理子***采用GPU加速算法，根据多张光电探测器采集的原始图像重构荧光样品的超分辨图像。

7.根据权利要求6所述的非线性结构光照明显微成像***，其特征在于，所述GPU加速数据处理子***包括数据采集卡、图形工作站和图形处理显卡，所述GPU加速数据处理子***从光电探测器采集的原始数据，通过GPU加速算法，重构出样品的超分辨显微图像。

8.根据权利要求6所述的非线性结构光照明显微成像***，其特征在于，还包括电子控制***，用于实现所述声光可调滤波器(117)、数字微镜阵列(24)和光电探测器的同步触发。

9.根据权利要求6所述的非线性结构光照明显微成像***，其特征在于，所述光源***(1)放置在一个气浮防震实验平台，所述衍射***(2)和所述成像***(3)放置在另一个气浮防震实验平台，两个气浮防震实验平台之间通过带标准FC转接口的多模光纤跳线连接，并将所述多模光纤跳线的一部分固定在震动台上，在成像过程中持续随机震动。