JP3731073B2 - 顕微鏡装置 - Google Patents
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Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、顕微鏡装置に係り、特に、光学断層像の厚さを調節可能な顕微鏡装置に関する。
【０００２】
【従来の技術】
一般に、蛍光顕微鏡は、医学や生物学をはじめその他の分野において生物組織や細胞において蛍光標識を施したたんぱく質や遺伝子等を検出する目的で広く用いられている。特に近年では、複数の蛍光色素で染色した試料や複数の蛍光タンパク質を発現させた試料を観察する多重蛍光検出が、遺伝子の解析や、細胞内構造の解明に威力を発揮している。
【０００３】
特に、蛍光顕微鏡のなかでもレーザー共焦点顕微鏡は、通常の顕微鏡と異なり焦点があった部分のみの蛍光を検出し、焦点が外れた部分からの蛍光や散乱光を検出器の前に配置したピンホールによって除去して画像を形成するので、焦点があった部分のみの像（光学断層像）を得ることができ、コントラストが高い画像を得ることができる。
【０００４】
また、近年市販されているレーザー顕微鏡としては、円盤上に異なる径のピンホールを複数配置したものが検出器の前に搭載され、それを回転させることによりピンホール径を選択できるようになっているものや、ピンホール径を可変絞りにしてピンホール径を可変選択できる機構を有するものがある。したがって、ユーザーは、観察中の試料の状態や形状、また、試料内の蛍光色素の量あるいは蛍光タンパク質の発現量に応じて最適なピンホール径を選択し、自由にその光学断層像の厚さを調整している。
【０００５】
また、光学断層像を得る他の手段として縞投影法が特許３０６６８７４号公報（特許文献１）に開示されている。この縞投影法では、光源から出射した光束を格子等に照射し格子等を透過した周期的な明暗のパターンで試料を照明し、試料をカメラで撮像する。周期的な明暗のパターンの位相を複数変えて撮像した複数の画像を演算することにより、周期的なパターンを除去するとともに、所望な位置における光学断層像が得られる。
【０００６】
【特許文献１】
特許３０６６８７４号公報
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
しかしながら、特許文献１に開示された方法では、明暗のパターンを生成する手段として、格子等を用いるため投影に使用される格子間隔によって周期的なパターンの間隔が固定されてしまう。このため、試料を観察中に試料の状態や形状、また、試料内の蛍光色素の量あるいは蛍光タンパク質の発現量に応じて自由に光学断層像の厚さを調整することができない。これに対して、パターンの間隔が異なる複数の格子等を予め用意しておくことも考えられるが、格子等を取り替えるごとに光学系の再調整が必要であるため、試料観察中に格子等を迅速に取り替えることは困難である。また、明暗のパターンの位相を変えるには、格子等を移動させることによって行っているが、この場合、格子を移動させるときの移動距離の誤差によって位相シフトの誤差が生じ、最終的に得られる光学断層像が劣化してしまうという問題点もある。
【０００８】
そこで、本発明の目的は、上記従来技術の有する問題を解消し、試料の観察中においても光学断層像の厚さを所望な値に迅速に設定可能な顕微鏡装置を提供することである。
【０００９】
【課題を解決するための手段】
上記目的を達成するために、本発明の顕微鏡装置は、制御電気信号を生成する制御手段と、光源から出射した光束が照射される照射面を有し、前記制御電気信号を受け前記照射面の反射特性または透過特性を前記制御電気信号で指定される空間的周波数で空間的変調可能な空間的変調手段と、前記空間的変調手段によって空間的変調された光束を試料に照射する照射光学手段と、前記照射光学手段によって照射され前記試料から生じる信号光からなる信号画像を検出する画像検出手段と、前記制御手段によって前記空間的周波数に係る異なる少なくとも３個の位相を設定し、各々の前記位相毎に前記画像検出手段によって検出した前記信号画像を互いに演算し光学断層像を求める演算手段と、を備え、前記制御手段は、前記空間的変調手段の前記照射面を複数の領域に分割し、分割した各々の領域毎に個別的に前記空間的周波数を設定可能であることを特徴とする。
【００１０】
また、前記制御手段は、前記空間的周波数を設定することにより前記光学断層像の厚さを設定可能であることを特徴とする。
【００１２】
また、前記照射面の分割された前記複数の領域の各々は、前記光学断層像の厚さを個別的に設定することを求める前記試料の分割された観察領域に対応していることを特徴とする。
【００１３】
また、前記照射面の分割された前記複数の領域の各々に対応する前記信号画像を一つのモニター面で観察可能なモニター手段を備えていることを特徴とする。
【００１４】
また、前記照射面の分割された前記複数の領域の各々に対応する前記信号画像を一つのモニター面で観察可能なモニター手段を備えていることを特徴とする。
【００１５】
また、前記空間的変調手段は、前記照射面が多数のマイクロミラーが配列されてなるデジタルマイクロミラーデバイスであることを特徴とする。
【００１６】
また、前記空間的変調手段は、前記照射面が多数の液晶セルが配列されてなる液晶デバイスであることを特徴とする。
【００１７】
また、前記空間的変調手段は、前記制御電気信号を受け前記照射面の反射特性または透過特性を正弦波状に空間的変調可能であることを特徴とする。
【００１８】
また、前記信号光は、反射光、透過光あるいは蛍光のいずれかであることを特徴とする。
【００１９】
上述の発明において、空間的変調手段は制御電気信号によって照射面の反射特性または透過特性を指定される空間的周波数で空間的変調可能であるので、試料の観察中においても光学断層像の厚さを所望な値に迅速に設定することができる。
【００２０】
また、制御手段による制御電気信号によって空間的変調手段の空間的周波数を設定することにより容易に光学断層像の厚さを所望な値に設定することができる。
【００２１】
また、空間的変調手段の照射面を複数の領域に分割し、分割した各々の領域毎に個別的に空間的周波数を設定可能であるので、試料の観察領域に適した光学断層像の厚さを個別的に設定することが可能になる。
【００２２】
また、光学断層像の厚さが個別的に設定された複数の信号画面を必要に応じて一つのモニター面で見ることが可能になる。
【００２３】
【発明の実施の形態】
以下に図面を参照して、本発明の実施の形態について説明する。
【００２４】
まず図１を参照して本発明の第１の実施の形態について説明する。図１において、光源１は試料１２を照明するためのものであり、水銀ランプ、キセノンランプ、発光ダイオード等の白色光源が用いられる。そして、光源１から出射した光は、コレクタレンズ2に入射される。このコレクタレンズ２は、光源１からの光を平行光束に変換するものである。コレクタレンズ２から出射した平行光束の光軸上には、シャッター３、拡散板４、レンズ５、平面鏡６が配置されている。シャッター３は、その開閉により試料１２に光を照射するか否かを選択するものである。拡散板４は、入射した光を拡散させ、デジタルマイクロミラーデバイス（ＤＭＤ）７を照明するときの照明ムラを低減するためのものである。レンズ５は、光がＤＭＤ７に入射する前に一度光を収束させ、ＤＭＤ７上で発散光とすることでＤＭＤ７を照明したときにＤＭＤ７の周期的な構造によって発生する回折パターンの発生を除去するためのものである。ＤＭＤの構成および機能に関しては後述する。平面鏡６は、ＤＭＤ７で反射した光が試料を最も強く照明できるようにＤＭＤ７に入射する光源１からの入射角を調整するためのものである。
【００２５】
ＤＭＤ７で反射した光は顕微鏡本体に導入される。ＤＭＤ７の法線上にレンズ８、励起フィルタ９、ダイクロイックミラー１０が配置されている。レンズ８はＤＭＤ７の各マイクロミラーで反射した光を平行光束に変換するためのものであり、ＤＭＤ７はレンズ８の前側焦点位置に配置されている。励起フィルタ９は、光源１からの光のうち、所定の波長域のみを透過させる機能を有している。ダイクロイックミラー１０は、入射した光のうち所定の波長域を反射しそれ以外を透過させるものである。ダイクロイックミラー１０で反射した光は、対物レンズ１１を通過して試料１２を照明する。試料１２は、図示していないステージに載せられており、光軸方向に微動させることができる。後述するようにＤＭＤ７に形成されるパターンの空間的周期に対応して光学断層像の厚さが定まり、一般的に、空間的周期が短いほどすなわち空間的周波数が高いほど、光学断層像の厚さが薄くなる。ここで、光学断層像の厚さとは、信号光が一体的に検出される厚さ範囲に関するのであり、いわゆる焦点深度に相当するものである。
【００２６】
ステージ上の試料１２を光軸方向に微動させ、パターンの空間的周期に対応する光学断層像の厚さに対応する位置毎で撮像することにより、試料１２の複数の光学断層像が得られる。複数の光学断層像から立体的な像を形成することも可能である。また、ステージ上の試料１２を光軸方向に微動させ所望の位置に固定し、試料１２に対する刺激条件等を変えながらその位置における光学断層像の時間的変化に係る情報を得ることも可能である。
【００２７】
顕微鏡本体の観察光路には、対物レンズ１１、ダイクロイックミラー１０、蛍光フィルタ１３、結像レンズ１４、ＣＣＤカメラ１５が配置されている。試料１２で発した蛍光は、対物レンズ１１を通過して平行光束に変換されたあと、ダイクロイックミラー１０を通過し、蛍光フィルタ１３で所定の波長域が選択的に透過された後、結像レンズ１４によりＣＣＤカメラ１５の撮像面上に結像し撮像される。
【００２８】
ＣＣＤカメラ１５からの出力信号はコンピュータ１６に内蔵されている記憶手段としてのフレームグラバ（不図示）に取り込まれる。フレームグラバで取り込まれた画像をもとに後述する演算が行われ、演算結果がモニター４０に表示されるとともに、コンピュータ内のメモリに格納される。
【００２９】
シャッター３は制御器１７によりその開閉が制御され、また、制御器１７はコンピュータ１６からの信号により開閉の指示がされる。ＤＭＤ７内の各マイクロミラーは制御器１８からの電気信号によりその傾きが制御され、コンピュータ１６上で形成されたパターンの信号は制御器１８に送られ、その信号に応じてＤＭＤ７上そのパターンが形成される。また、シャッターの開閉と、ＤＭＤ７のパターンの変更と、ＣＣＤカメラ１５の撮像は同期して行うことができるようになっている。
【００３０】
ここで、ＤＭＤ７について説明する。
ＤＭＤ７は２次元上に配置された複数の微小なミラー（マイクロミラー）で構成され、これらの複数の微小なミラーによってＤＭＤ７の照射面７ａが形成されている。各マイクロミラーはそれぞれ独立に制御器１８からの電気信号１８ａによってＤＭＤ７素子の法線に対して傾きを２通りに切り替えることができるようになっている。なお、本発明では、光源１から導かれた光を次にくる光学素子、たとえば図１の場合レンズ８の方向に光を導くことができるようにマイクロミラーの角度を電気的にセットした場合をオンの状態といい、導かれない角度にセットした場合をオフの状態ということにする。そして、オンの状態では、光は顕微鏡本体に導入され、試料１２が照明される。一方、オフの状態では、光は最終的に顕微鏡に導入されず、試料１２は照明されない。また、各マイクロミラーは、パルス幅変調により単位時間あたりのオン状態の時間とオフ状態の時間の比を制御することにより、試料１２に照射する強度を変化させることができる。したがって、ＤＭＤ７を構成する全てのマイクロミラーごとに、そのオン状態、オフ状態、およびオン状態とオフ状態の比を制御することにより、光源１から導かれた光のＤＭＤ７上の強度分布に、ＤＭＤ７によって空間的に変調をかけることができる。単位時間あたりのオン状態とオフ状態の比を制御することを組み合わせることにより、例えば正弦波状の空間的変調が可能になる。また、ＤＭＤ７はレンズ８と対物レンズ１１とで構成されるレンズ系に対して試料１２の共役位置に配置されているため、ＤＭＤ７で空間変調がかけられた光源１からの光の強度分布は、試料１２面上に縮小投影されて照明される。
【００３１】
次に、このように構成した実施の形態の動作を説明する。
いま、光源１を点灯すると、光源１から発した光は、コレクタレンズ２により平行光束に変換され、拡散板４で拡散された後、レンズ５を通り、平面鏡６で反射された後、ＤＭＤ７を照明する。
【００３２】
ＤＭＤ７に入射した光は、ＤＭＤ７上に形成されたパターンに応じてその光強度分布が空間的に変調された後、レンズ８を通り、励起フィルタ９を通り、ダイクロイックミラー１０で反射され、対物レンズ１１を通して試料１２に空間的変調された光束として照射される。試料１２では、この照射された光の強度分布に応じてその内の蛍光物質が励起され蛍光を発する。発した蛍光は対物レンズ１１を通り、ダイクロイックミラー１０、蛍光フィルタ１３、結像レンズ１４を通過し、ＣＣＤカメラ１５で撮像される。撮像された画像はコンピュータ１６内のフレームグラバに取り込まれる。
【００３３】
光学断層像の演算は以下の手順にしたがって実行される。
以下では、１次元の周期的な強度分布をもつパターンを用いる場合を説明する。まず、試料１２に照射すべき１次元の周期的な強度分布を持つパターン（例えば、正弦波）をコンピュータ１６において生成する。生成されたパターンの信号を制御器１８に送信すると、制御器１８では受信したパターン信号に応じてＤＭＤ７上の各マイクロミラーをオン状態、オフ状態を制御すべき信号を演算し、それをＤＭＤ７に送信する。ＤＭＤ７はその信号に応じて各マイクロミラーのオン状態、オフ状態を決定してＤＭＤ７上にパターンを形成する。ここで、コンピュータ１６からの信号によりシャッター３を開放すると、光源１からの光束はＤＭＤ７上に形成されたパターンに応じて空間に変調され、コンピュータ１６で送信したパターンと同じパターンをもつ光強度分布を有するようになる。さらに、この光強度分布のパターンを有する光束で試料１２が照明され、照射された光束によって試料１２内に蛍光が発生し、発生した試料１２内の蛍光像をＣＣＤで撮像する。この撮像された画像を第１の画像とする。
【００３４】
次に、先に生成した１次元の周期的な強度分布の位相を９０度ずらした第2のパターンをコンピュータ１６で作成し、同様にして、このパターンを試料１２に照射し、照射された光によって発生した試料１２内の蛍光像をＣＣＤ１５で撮像する。この撮像された画像を第２の画像とする。さらに、一番最初の１次元の周期的な強度分布の位相を１８０度ずらした第３のパターンをコンピュータ１６で作成し、同様に、このパターンを試料１２に照射し、照射された光によって発生した試料１２内の蛍光像をＣＣＤ１５で撮像する。この撮像された画像を第３の画像とする。第１、第２、第３の画像の輝度分布をそれぞれＩ０、Ｉ９０、Ｉ１８０と記すことにすると、コンピュータ１６内によって、
【数１】
の演算を行うことによって、光学断層像が得られる。
【００３５】
また、
【数２】
の演算を行うことによって、光学断層像でない像、すなわち通常の顕微鏡像とが得られる。このようにして得られた、光学断層像と光学断層像でない像（通常の顕微鏡像）はコンピュータ１６内のメモリに記憶されるとともにモニター４０に表示される。
【００３６】
上記において１次元の周期的な強度分布をもつパターンの周期を可変することができる。パターンの空間的周期を与える空間的周波数を変えることはコンピュータ１６上で容易に指定できる。得られた光学断層像を見て、その厚さが厚いようであれば、１次元の周期的な強度分布をもつパターンの周期を短くして、上記と同様な過程を繰り返すことにより新たな光学断層像（前の光学的断層像より厚い段像像）を得ることができる。このようにして、最適な厚さの光学断層像を得ることができる。
【００３７】
なお、上記では位相シフトが９０°の場合を述べたが、位相シフトを１２０度にしても良い。この場合は、上記と同様な過程を経て得られた、第１の画像（位相シフトが０度の画像）をＩ０、第２の画像（位相シフトが１２０度の画像）をＩ１２０、第３の画像（位相シフトが２４０度の画像）をＩ２４０とすれば、光学断層像は、
【数３】
を用いて計算され、通常の顕微鏡像は、
【数４】
で計算される。
【００３８】
また、上記以外に位相シフト量が既知であれば任意量の位相シフトを行っても良い。ただし、少なくとも３つの異なる位相シフト量によって得られた画像を用いる必要がある。
【００３９】
また、上記では１次元の周期的な強度分布をもつパターンを用いた場合を説明したが、これ以外に２次元の周期的な強度分布を持つパターン、例えば、市松模様のようなパターンを用いて位相シフトを行っても良い。
【００４０】
上述のように、試料１２に投影すべき照明パターンをコンピュータ１６上で容易に指定することができるので、試料１２の観察中においてもその試料１２の状態や蛍光量に応じて、自由にかつ迅速に光学断層像の厚さを可変設定することができる。
【００４１】
さらに、ＤＭＤ７の各マイクロミラーは２次元的に等間隔に高精度で配置されているので、例えばグレーティング等を移動させて位相シフトを行う場合に比べて、移動量の誤差に伴う位相シフト量の誤差が発生せず、確実に所望の位相シフトを与えることができるといった利点がある。
【００４２】
また、ＤＭＤ７を使えば試料１２に照射すべきパターンの形状のみならず、その２次元的な強度分布も容易に調整することができるので試料１２にとって最適な強度分布を選択することができるといった利点がある。
【００４３】
また、光源１に白色光源を用い、励起フィルタ９、ダイクロイックミラー１０、蛍光フィルタ１３を適当に変えることにより任意の波長領域の信号を抽出でき、あらゆる蛍光色素や蛍光タンパク質に対応することができ、レーザー走査型顕微鏡の場合のように励起光の波長が特定波長のレーザーに制約されずに光学断層像が得られるといった利点もある。
【００４４】
なお、図１に示すＤＭＤ７は空間光変調器の一例であり、ＤＭＤ７の代わりに反射型液晶デバイスを用いてもよく、この場合においても蛍光あるいは反射光を検出し光学断層像を得ることができる。
【００４５】
以下、上述の本発明の適用例について説明する。
以下に説明する適用例は、深度応答の測定に関するものである。この深度の大きさが光学断層像の厚さに相当する。
まず、本発明を適用した顕微鏡の性能を確認するために深度応答を測定した。試料１２には蛍光薄膜を用いた。この蛍光薄膜は、カバーガラスの表面にローダミン６Ｇとポリメチルアクリレートの混合物をスピンコートしたものであり、厚さは約５０ｎｍである。励起フィルタ９には、中心波長４７５ｎｍ、透過波長幅４０ｎｍの励起フィルタを用いた。ダイクロイックミラー１０には、波長５０５ｎｍ以下を反射し、５０５ｎｍ以上を反射するダイクロイックミラーを用いた。蛍光フィルタ１３には、中心波長５３５ｎｍ、透過波長幅４５ｎｍの蛍光フィルタを用いた。対物レンズ１１には倍率が４０倍、開口数１．３５の油浸対物レンズを用いた。この蛍光薄膜をステージにのせ、光軸方向に移動させながら、各ステージ位置で計算された光学切断像の強度を測定した。
【００４６】
図２に深度応答を測定した結果を示す。また、同様な実験を投影する縞の間隔を変えて行った。図２には、一例として、縞の一周期をＤＭＤ７素子上において８、１６、３２マイクロミラーになるようにした。これらの値は試料面において照射される縞の周期が、２．５μｍ、４．９μｍ、９．８μｍにそれぞれ相当する。図２に示されているように、ＤＭＤ７素子上の空間的周期を大きくすると、深度応答の半値全幅が広くなる、すなわち、光学断層像の厚さが厚くなる。これにより、ＤＭＤ７素子上の空間的周期を変えることにより所望の厚さの光学断層像を得ることが可能であることがわかる。
【００４７】
次に、ＤＭＤ７上の縞の周期と深度応答の半値全幅の関係を調べた。図３にＤＭＤ７上の縞の周期と深度応答の半値全幅の関係を示す。上記と同様な実験を縞の周期を変えて深度応答を測定し、得られた深度応答からその半値全幅を求め、それと縞の周期との関係を調べた。図３により、縞の周期を大きくすると、深度応答の半値全幅、すなわち光学断層像の厚さが線形に変化することが確かめられた。これにより、投影する縞の周期を変えることにより確実に深度応答の半値全幅、すなわち、光学切片の厚さを自由にかつ確実に変えることができる。
【００４８】
次に、図６及び図７を参照して、試料１２の観察する場所に依存して分割し、分割した領域毎に光学断層像の厚さＤを設定する複数分割光学断層像について説明する。
図６において、神経細胞５０は細胞体５１と細胞体５１の両側に樹状突起５２とを有する。神経細胞５０を細胞体５１を占める領域Ａと樹状突起５２を示す両側の領域Ｂ、領域Ｃとに分割して考える。領域Ａは細胞体５１を観察する上で光学断層像の厚さをＤ１と小さく設定することが好ましく、領域Ｂは樹脂突起５２が中程度の深さで屈曲しているので光学断層像の厚さをＤ２とやや厚くすることが好ましく、領域Ｃは樹脂突起５２が大きな深さで屈曲しているので光学断層像の厚さをＤ３と大きく設定することが好ましい。
【００４９】
このためには、図７に示すように、ＤＭＤ７素子上を、領域Ａ、領域Ｂ及び領域Ｃに対応する領域ａ、領域ｂ及び領域ｃに分割し、ＤＭＤ７の領域ａ、領域ｂ及び領域ｃの各々の空間的周期を独立に設定し、光学断層像の厚さＤがＤ１、Ｄ２及びＤ３になるようにすればよい。領域Ａ、領域Ｂ及び領域Ｃの光学断層像は一つの共通のモニター４０上で同時に表示される。
【００５０】
上述のように、空間光変調器としてのＤＭＤ７を制御器１８で複数の領域毎に異なる空間的周期を設定することにより、試料１２の観察個所に応じた適正な光学断層像の厚さを設定することができ、１つの画面上で試料１２の複数の観察個所を同時に観察することが可能になる。
【００５１】
次に、本発明の第２の実施の形態について説明する。
図４は本発明による第２の実施の形態の概略構成を示す図でもので、図１と同一部分には同一符号を付してその詳しい説明は省略する。
【００５２】
第２実施例の顕微鏡は、空間光変調器として、透過型の空間光変調器、具体的に例えば、透過型液晶デバイス７１等を用いて構成されている。
【００５３】
この場合、光源１とダイクロイックミラー１０を結ぶ光軸上にコレクタレンズ２、シャッター３、拡散板４、レンズ５、液晶デバイス７１、レンズ８、励起フィルタ９が配置されている。液晶デバイス７は２次元上に配置された複数の液晶の画素から構成されており、これらの複数の液晶画素によって照射面７１ａが形成されている。各画素はそれぞれ独立に制御器１８からの電気信号によってその画素の透過率を変えることができる。したがって、液晶デバイス７１を構成する全ての画素ごとに、その透過率を独立に変えることによって光源１から導かれた光の液晶デバイス７１の強度分布に、液晶デバイス７１によって空間的な変調をかけることができる。また、液晶デバイス７１で空間変調がかけられた光源１からの光の強度分布は、試料１２面上に縮小投影されて照明される。
【００５４】
このように上記第２の実施の形態においては、光源１からの光をパターンを自由に変えることができる液晶デバイス７１によって空間的に強度分布を変調するようにしたので、上記第１の実施の形態と同様な効果を奏する。
【００５５】
次に、本発明の第３の実施の形態について説明する。
図５は本発明による第３の実施の形態の概略構成を示す図でもので、図１と同一部分には同一符号を付してその詳しい説明は省略する。
【００５６】
この場合、ＤＭＤ７で反射した光は顕微鏡本体に導入される。ＤＭＤ７の法線上にレンズ８、励起フィルタ９、平面鏡１９が配置されている。平面鏡１９で反射した光は、対物レンズ２０を通過して試料１２を照明する。
【００５７】
顕微鏡本体の観察光路には、対物レンズ１１、蛍光フィルタ１３、結像レンズ１４、ＣＣＤカメラ１５が配置されている。試料で発した蛍光は、対物レンズ１１を通過して平行光束に変換されたあと、蛍光フィルタ１３で所定の波長域が選択的に透過した後、結像レンズ１４によりＣＣＤカメラ１５の撮像面上に結像し撮像される。
【００５８】
対物レンズ２０、対物レンズ１１の双方あるいはいずれかの一方は、光軸方法に微動させることができるようになっており、対物レンズ２０の焦点位置と対物レンズ１１の焦点位置は予め一致させるように調整しておく。
【００５９】
このように構成にすれば、光源１を点灯すると、光源１から発した光は、コレクタレンズ２により平行光束に変換され、拡散板４で拡散された後、レンズ５と通り、平面鏡６で反射された後、ＤＭＤ７を照明する。
【００６０】
ＤＭＤ７に入射した光は、ＤＭＤ７上に形成されたパターンに応じてその光強度分布が変調された後、レンズ８を通り、励起フィルタ９を通り、平面鏡１９で反射され、対物レンズ２０を通して試料１２に照射される。試料１２では、この照射された光の強度分布に応じてその内の蛍光物質が励起され蛍光を発する。発した蛍光は対物レンズ１１を通り、蛍光フィルタ１３、結像レンズ１４を通過し、ＣＣＤカメラ１５で撮像される。撮像された画像はコンピュータ１６内のフレームグラバに取り込まれる。
【００６１】
従って、このように上記第３の実施の形態においては、光源１からの光をパターンを自由に変えることができるＤＭＤ９によって空間的に強度分布を変調するようにして試料１２を照明し、試料１２からの蛍光をＣＣＤカメラ１５で撮像するようにしたので、第１の実施の形態と同様な効果を奏する。
【００６２】
さらに、ダイクロイックミラーを用いる必要がないので、そのダイクロイックミラーの反射および透過特性に左右されないため、励起フィルタ９および蛍光フィルタ１３の選択の自由度が大幅に増加するという利点がある。
【００６３】
また、高価なダイクロイックミラーを用いる必要がないため、価格的にも安価となる。
【００６４】
【発明の効果】
以上説明したように、本発明の構成によれば、制御電気信号によって照射面の反射特性または透過特性を指定される空間的周波数で空間的変調可能であるので、試料の観察中においても光学断層像の厚さを所望な値に迅速に設定することができる。
【００６５】
また、空間的変調手段の照射面を複数の領域に分割し、分割した各々の領域毎に個別的に空間的周波数を設定可能であるので、試料の観察領域に適した光学断層像の厚さを個別的に設定することが可能になる。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の第1の実施の形態の概略構成を示す図である。
【図２】第１の実施の形態における深度応答を示す図である。
【図３】第１の実施の形態における投影すべき縞の周期と深度応答の半値幅の関係を示す図である。
【図４】本発明の第２の実施の形態の概略構成を示す図である。
【図５】本発明の第３の実施の形態の概略構成を示す図である。
【図６】光学断層像の厚さを個別的に設定することを求める試料の分割された観察領域の断面を模式的に示す図。
【図７】試料の分割された観察領域に対応して複数の領域に分割されたＤＭＤの照射面を示す図。
【符号の説明】
１ 光源
２ レンズ
３ シャッター
４ 拡散板
５ レンズ
６ 平面鏡
７ ＤＭＤ
７ａ ＤＭＤの照射面
８ レンズ
９ 励起フィルタ
１０ ダイクロイックミラー
１１ 対物レンズ
１２ 試料
１３ 蛍光フィルタ
１４ 結像レンズ
１５ ＣＣＤカメラ
１６ コンピュータ
１７ 制御器
１８ 制御器
１８ａ 電気信号
１９ 平面鏡
２０ 対物レンズ
４０ モニター
５０ 神経細胞
５１ 細胞体
５２ 樹状突起
７１ 液晶デバイス
７１ａ 液晶デバイスの照射面
【発明の属する技術分野】
本発明は、顕微鏡装置に係り、特に、光学断層像の厚さを調節可能な顕微鏡装置に関する。
【０００２】
【従来の技術】
一般に、蛍光顕微鏡は、医学や生物学をはじめその他の分野において生物組織や細胞において蛍光標識を施したたんぱく質や遺伝子等を検出する目的で広く用いられている。特に近年では、複数の蛍光色素で染色した試料や複数の蛍光タンパク質を発現させた試料を観察する多重蛍光検出が、遺伝子の解析や、細胞内構造の解明に威力を発揮している。
【０００３】
特に、蛍光顕微鏡のなかでもレーザー共焦点顕微鏡は、通常の顕微鏡と異なり焦点があった部分のみの蛍光を検出し、焦点が外れた部分からの蛍光や散乱光を検出器の前に配置したピンホールによって除去して画像を形成するので、焦点があった部分のみの像（光学断層像）を得ることができ、コントラストが高い画像を得ることができる。
【０００４】
また、近年市販されているレーザー顕微鏡としては、円盤上に異なる径のピンホールを複数配置したものが検出器の前に搭載され、それを回転させることによりピンホール径を選択できるようになっているものや、ピンホール径を可変絞りにしてピンホール径を可変選択できる機構を有するものがある。したがって、ユーザーは、観察中の試料の状態や形状、また、試料内の蛍光色素の量あるいは蛍光タンパク質の発現量に応じて最適なピンホール径を選択し、自由にその光学断層像の厚さを調整している。
【０００５】
また、光学断層像を得る他の手段として縞投影法が特許３０６６８７４号公報（特許文献１）に開示されている。この縞投影法では、光源から出射した光束を格子等に照射し格子等を透過した周期的な明暗のパターンで試料を照明し、試料をカメラで撮像する。周期的な明暗のパターンの位相を複数変えて撮像した複数の画像を演算することにより、周期的なパターンを除去するとともに、所望な位置における光学断層像が得られる。
【０００６】
【特許文献１】
特許３０６６８７４号公報
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
しかしながら、特許文献１に開示された方法では、明暗のパターンを生成する手段として、格子等を用いるため投影に使用される格子間隔によって周期的なパターンの間隔が固定されてしまう。このため、試料を観察中に試料の状態や形状、また、試料内の蛍光色素の量あるいは蛍光タンパク質の発現量に応じて自由に光学断層像の厚さを調整することができない。これに対して、パターンの間隔が異なる複数の格子等を予め用意しておくことも考えられるが、格子等を取り替えるごとに光学系の再調整が必要であるため、試料観察中に格子等を迅速に取り替えることは困難である。また、明暗のパターンの位相を変えるには、格子等を移動させることによって行っているが、この場合、格子を移動させるときの移動距離の誤差によって位相シフトの誤差が生じ、最終的に得られる光学断層像が劣化してしまうという問題点もある。
【０００８】
そこで、本発明の目的は、上記従来技術の有する問題を解消し、試料の観察中においても光学断層像の厚さを所望な値に迅速に設定可能な顕微鏡装置を提供することである。
【０００９】
【課題を解決するための手段】
上記目的を達成するために、本発明の顕微鏡装置は、制御電気信号を生成する制御手段と、光源から出射した光束が照射される照射面を有し、前記制御電気信号を受け前記照射面の反射特性または透過特性を前記制御電気信号で指定される空間的周波数で空間的変調可能な空間的変調手段と、前記空間的変調手段によって空間的変調された光束を試料に照射する照射光学手段と、前記照射光学手段によって照射され前記試料から生じる信号光からなる信号画像を検出する画像検出手段と、前記制御手段によって前記空間的周波数に係る異なる少なくとも３個の位相を設定し、各々の前記位相毎に前記画像検出手段によって検出した前記信号画像を互いに演算し光学断層像を求める演算手段と、を備え、前記制御手段は、前記空間的変調手段の前記照射面を複数の領域に分割し、分割した各々の領域毎に個別的に前記空間的周波数を設定可能であることを特徴とする。
【００１０】
また、前記制御手段は、前記空間的周波数を設定することにより前記光学断層像の厚さを設定可能であることを特徴とする。
【００１２】
また、前記照射面の分割された前記複数の領域の各々は、前記光学断層像の厚さを個別的に設定することを求める前記試料の分割された観察領域に対応していることを特徴とする。
【００１３】
また、前記照射面の分割された前記複数の領域の各々に対応する前記信号画像を一つのモニター面で観察可能なモニター手段を備えていることを特徴とする。
【００１４】
また、前記照射面の分割された前記複数の領域の各々に対応する前記信号画像を一つのモニター面で観察可能なモニター手段を備えていることを特徴とする。
【００１５】
また、前記空間的変調手段は、前記照射面が多数のマイクロミラーが配列されてなるデジタルマイクロミラーデバイスであることを特徴とする。
【００１６】
また、前記空間的変調手段は、前記照射面が多数の液晶セルが配列されてなる液晶デバイスであることを特徴とする。
【００１７】
また、前記空間的変調手段は、前記制御電気信号を受け前記照射面の反射特性または透過特性を正弦波状に空間的変調可能であることを特徴とする。
【００１８】
また、前記信号光は、反射光、透過光あるいは蛍光のいずれかであることを特徴とする。
【００１９】
上述の発明において、空間的変調手段は制御電気信号によって照射面の反射特性または透過特性を指定される空間的周波数で空間的変調可能であるので、試料の観察中においても光学断層像の厚さを所望な値に迅速に設定することができる。
【００２０】
また、制御手段による制御電気信号によって空間的変調手段の空間的周波数を設定することにより容易に光学断層像の厚さを所望な値に設定することができる。
【００２１】
また、空間的変調手段の照射面を複数の領域に分割し、分割した各々の領域毎に個別的に空間的周波数を設定可能であるので、試料の観察領域に適した光学断層像の厚さを個別的に設定することが可能になる。
【００２２】
また、光学断層像の厚さが個別的に設定された複数の信号画面を必要に応じて一つのモニター面で見ることが可能になる。
【００２３】
【発明の実施の形態】
以下に図面を参照して、本発明の実施の形態について説明する。
【００２４】
まず図１を参照して本発明の第１の実施の形態について説明する。図１において、光源１は試料１２を照明するためのものであり、水銀ランプ、キセノンランプ、発光ダイオード等の白色光源が用いられる。そして、光源１から出射した光は、コレクタレンズ2に入射される。このコレクタレンズ２は、光源１からの光を平行光束に変換するものである。コレクタレンズ２から出射した平行光束の光軸上には、シャッター３、拡散板４、レンズ５、平面鏡６が配置されている。シャッター３は、その開閉により試料１２に光を照射するか否かを選択するものである。拡散板４は、入射した光を拡散させ、デジタルマイクロミラーデバイス（ＤＭＤ）７を照明するときの照明ムラを低減するためのものである。レンズ５は、光がＤＭＤ７に入射する前に一度光を収束させ、ＤＭＤ７上で発散光とすることでＤＭＤ７を照明したときにＤＭＤ７の周期的な構造によって発生する回折パターンの発生を除去するためのものである。ＤＭＤの構成および機能に関しては後述する。平面鏡６は、ＤＭＤ７で反射した光が試料を最も強く照明できるようにＤＭＤ７に入射する光源１からの入射角を調整するためのものである。
【００２５】
ＤＭＤ７で反射した光は顕微鏡本体に導入される。ＤＭＤ７の法線上にレンズ８、励起フィルタ９、ダイクロイックミラー１０が配置されている。レンズ８はＤＭＤ７の各マイクロミラーで反射した光を平行光束に変換するためのものであり、ＤＭＤ７はレンズ８の前側焦点位置に配置されている。励起フィルタ９は、光源１からの光のうち、所定の波長域のみを透過させる機能を有している。ダイクロイックミラー１０は、入射した光のうち所定の波長域を反射しそれ以外を透過させるものである。ダイクロイックミラー１０で反射した光は、対物レンズ１１を通過して試料１２を照明する。試料１２は、図示していないステージに載せられており、光軸方向に微動させることができる。後述するようにＤＭＤ７に形成されるパターンの空間的周期に対応して光学断層像の厚さが定まり、一般的に、空間的周期が短いほどすなわち空間的周波数が高いほど、光学断層像の厚さが薄くなる。ここで、光学断層像の厚さとは、信号光が一体的に検出される厚さ範囲に関するのであり、いわゆる焦点深度に相当するものである。
【００２６】
ステージ上の試料１２を光軸方向に微動させ、パターンの空間的周期に対応する光学断層像の厚さに対応する位置毎で撮像することにより、試料１２の複数の光学断層像が得られる。複数の光学断層像から立体的な像を形成することも可能である。また、ステージ上の試料１２を光軸方向に微動させ所望の位置に固定し、試料１２に対する刺激条件等を変えながらその位置における光学断層像の時間的変化に係る情報を得ることも可能である。
【００２７】
顕微鏡本体の観察光路には、対物レンズ１１、ダイクロイックミラー１０、蛍光フィルタ１３、結像レンズ１４、ＣＣＤカメラ１５が配置されている。試料１２で発した蛍光は、対物レンズ１１を通過して平行光束に変換されたあと、ダイクロイックミラー１０を通過し、蛍光フィルタ１３で所定の波長域が選択的に透過された後、結像レンズ１４によりＣＣＤカメラ１５の撮像面上に結像し撮像される。
【００２８】
ＣＣＤカメラ１５からの出力信号はコンピュータ１６に内蔵されている記憶手段としてのフレームグラバ（不図示）に取り込まれる。フレームグラバで取り込まれた画像をもとに後述する演算が行われ、演算結果がモニター４０に表示されるとともに、コンピュータ内のメモリに格納される。
【００２９】
シャッター３は制御器１７によりその開閉が制御され、また、制御器１７はコンピュータ１６からの信号により開閉の指示がされる。ＤＭＤ７内の各マイクロミラーは制御器１８からの電気信号によりその傾きが制御され、コンピュータ１６上で形成されたパターンの信号は制御器１８に送られ、その信号に応じてＤＭＤ７上そのパターンが形成される。また、シャッターの開閉と、ＤＭＤ７のパターンの変更と、ＣＣＤカメラ１５の撮像は同期して行うことができるようになっている。
【００３０】
ここで、ＤＭＤ７について説明する。
ＤＭＤ７は２次元上に配置された複数の微小なミラー（マイクロミラー）で構成され、これらの複数の微小なミラーによってＤＭＤ７の照射面７ａが形成されている。各マイクロミラーはそれぞれ独立に制御器１８からの電気信号１８ａによってＤＭＤ７素子の法線に対して傾きを２通りに切り替えることができるようになっている。なお、本発明では、光源１から導かれた光を次にくる光学素子、たとえば図１の場合レンズ８の方向に光を導くことができるようにマイクロミラーの角度を電気的にセットした場合をオンの状態といい、導かれない角度にセットした場合をオフの状態ということにする。そして、オンの状態では、光は顕微鏡本体に導入され、試料１２が照明される。一方、オフの状態では、光は最終的に顕微鏡に導入されず、試料１２は照明されない。また、各マイクロミラーは、パルス幅変調により単位時間あたりのオン状態の時間とオフ状態の時間の比を制御することにより、試料１２に照射する強度を変化させることができる。したがって、ＤＭＤ７を構成する全てのマイクロミラーごとに、そのオン状態、オフ状態、およびオン状態とオフ状態の比を制御することにより、光源１から導かれた光のＤＭＤ７上の強度分布に、ＤＭＤ７によって空間的に変調をかけることができる。単位時間あたりのオン状態とオフ状態の比を制御することを組み合わせることにより、例えば正弦波状の空間的変調が可能になる。また、ＤＭＤ７はレンズ８と対物レンズ１１とで構成されるレンズ系に対して試料１２の共役位置に配置されているため、ＤＭＤ７で空間変調がかけられた光源１からの光の強度分布は、試料１２面上に縮小投影されて照明される。
【００３１】
次に、このように構成した実施の形態の動作を説明する。
いま、光源１を点灯すると、光源１から発した光は、コレクタレンズ２により平行光束に変換され、拡散板４で拡散された後、レンズ５を通り、平面鏡６で反射された後、ＤＭＤ７を照明する。
【００３２】
ＤＭＤ７に入射した光は、ＤＭＤ７上に形成されたパターンに応じてその光強度分布が空間的に変調された後、レンズ８を通り、励起フィルタ９を通り、ダイクロイックミラー１０で反射され、対物レンズ１１を通して試料１２に空間的変調された光束として照射される。試料１２では、この照射された光の強度分布に応じてその内の蛍光物質が励起され蛍光を発する。発した蛍光は対物レンズ１１を通り、ダイクロイックミラー１０、蛍光フィルタ１３、結像レンズ１４を通過し、ＣＣＤカメラ１５で撮像される。撮像された画像はコンピュータ１６内のフレームグラバに取り込まれる。
【００３３】
光学断層像の演算は以下の手順にしたがって実行される。
以下では、１次元の周期的な強度分布をもつパターンを用いる場合を説明する。まず、試料１２に照射すべき１次元の周期的な強度分布を持つパターン（例えば、正弦波）をコンピュータ１６において生成する。生成されたパターンの信号を制御器１８に送信すると、制御器１８では受信したパターン信号に応じてＤＭＤ７上の各マイクロミラーをオン状態、オフ状態を制御すべき信号を演算し、それをＤＭＤ７に送信する。ＤＭＤ７はその信号に応じて各マイクロミラーのオン状態、オフ状態を決定してＤＭＤ７上にパターンを形成する。ここで、コンピュータ１６からの信号によりシャッター３を開放すると、光源１からの光束はＤＭＤ７上に形成されたパターンに応じて空間に変調され、コンピュータ１６で送信したパターンと同じパターンをもつ光強度分布を有するようになる。さらに、この光強度分布のパターンを有する光束で試料１２が照明され、照射された光束によって試料１２内に蛍光が発生し、発生した試料１２内の蛍光像をＣＣＤで撮像する。この撮像された画像を第１の画像とする。
【００３４】
次に、先に生成した１次元の周期的な強度分布の位相を９０度ずらした第2のパターンをコンピュータ１６で作成し、同様にして、このパターンを試料１２に照射し、照射された光によって発生した試料１２内の蛍光像をＣＣＤ１５で撮像する。この撮像された画像を第２の画像とする。さらに、一番最初の１次元の周期的な強度分布の位相を１８０度ずらした第３のパターンをコンピュータ１６で作成し、同様に、このパターンを試料１２に照射し、照射された光によって発生した試料１２内の蛍光像をＣＣＤ１５で撮像する。この撮像された画像を第３の画像とする。第１、第２、第３の画像の輝度分布をそれぞれＩ０、Ｉ９０、Ｉ１８０と記すことにすると、コンピュータ１６内によって、
【数１】
【００３５】
また、
【数２】
【００３６】
上記において１次元の周期的な強度分布をもつパターンの周期を可変することができる。パターンの空間的周期を与える空間的周波数を変えることはコンピュータ１６上で容易に指定できる。得られた光学断層像を見て、その厚さが厚いようであれば、１次元の周期的な強度分布をもつパターンの周期を短くして、上記と同様な過程を繰り返すことにより新たな光学断層像（前の光学的断層像より厚い段像像）を得ることができる。このようにして、最適な厚さの光学断層像を得ることができる。
【００３７】
なお、上記では位相シフトが９０°の場合を述べたが、位相シフトを１２０度にしても良い。この場合は、上記と同様な過程を経て得られた、第１の画像（位相シフトが０度の画像）をＩ０、第２の画像（位相シフトが１２０度の画像）をＩ１２０、第３の画像（位相シフトが２４０度の画像）をＩ２４０とすれば、光学断層像は、
【数３】
【数４】
【００３８】
また、上記以外に位相シフト量が既知であれば任意量の位相シフトを行っても良い。ただし、少なくとも３つの異なる位相シフト量によって得られた画像を用いる必要がある。
【００３９】
また、上記では１次元の周期的な強度分布をもつパターンを用いた場合を説明したが、これ以外に２次元の周期的な強度分布を持つパターン、例えば、市松模様のようなパターンを用いて位相シフトを行っても良い。
【００４０】
上述のように、試料１２に投影すべき照明パターンをコンピュータ１６上で容易に指定することができるので、試料１２の観察中においてもその試料１２の状態や蛍光量に応じて、自由にかつ迅速に光学断層像の厚さを可変設定することができる。
【００４１】
さらに、ＤＭＤ７の各マイクロミラーは２次元的に等間隔に高精度で配置されているので、例えばグレーティング等を移動させて位相シフトを行う場合に比べて、移動量の誤差に伴う位相シフト量の誤差が発生せず、確実に所望の位相シフトを与えることができるといった利点がある。
【００４２】
また、ＤＭＤ７を使えば試料１２に照射すべきパターンの形状のみならず、その２次元的な強度分布も容易に調整することができるので試料１２にとって最適な強度分布を選択することができるといった利点がある。
【００４３】
また、光源１に白色光源を用い、励起フィルタ９、ダイクロイックミラー１０、蛍光フィルタ１３を適当に変えることにより任意の波長領域の信号を抽出でき、あらゆる蛍光色素や蛍光タンパク質に対応することができ、レーザー走査型顕微鏡の場合のように励起光の波長が特定波長のレーザーに制約されずに光学断層像が得られるといった利点もある。
【００４４】
なお、図１に示すＤＭＤ７は空間光変調器の一例であり、ＤＭＤ７の代わりに反射型液晶デバイスを用いてもよく、この場合においても蛍光あるいは反射光を検出し光学断層像を得ることができる。
【００４５】
以下、上述の本発明の適用例について説明する。
以下に説明する適用例は、深度応答の測定に関するものである。この深度の大きさが光学断層像の厚さに相当する。
まず、本発明を適用した顕微鏡の性能を確認するために深度応答を測定した。試料１２には蛍光薄膜を用いた。この蛍光薄膜は、カバーガラスの表面にローダミン６Ｇとポリメチルアクリレートの混合物をスピンコートしたものであり、厚さは約５０ｎｍである。励起フィルタ９には、中心波長４７５ｎｍ、透過波長幅４０ｎｍの励起フィルタを用いた。ダイクロイックミラー１０には、波長５０５ｎｍ以下を反射し、５０５ｎｍ以上を反射するダイクロイックミラーを用いた。蛍光フィルタ１３には、中心波長５３５ｎｍ、透過波長幅４５ｎｍの蛍光フィルタを用いた。対物レンズ１１には倍率が４０倍、開口数１．３５の油浸対物レンズを用いた。この蛍光薄膜をステージにのせ、光軸方向に移動させながら、各ステージ位置で計算された光学切断像の強度を測定した。
【００４６】
図２に深度応答を測定した結果を示す。また、同様な実験を投影する縞の間隔を変えて行った。図２には、一例として、縞の一周期をＤＭＤ７素子上において８、１６、３２マイクロミラーになるようにした。これらの値は試料面において照射される縞の周期が、２．５μｍ、４．９μｍ、９．８μｍにそれぞれ相当する。図２に示されているように、ＤＭＤ７素子上の空間的周期を大きくすると、深度応答の半値全幅が広くなる、すなわち、光学断層像の厚さが厚くなる。これにより、ＤＭＤ７素子上の空間的周期を変えることにより所望の厚さの光学断層像を得ることが可能であることがわかる。
【００４７】
次に、ＤＭＤ７上の縞の周期と深度応答の半値全幅の関係を調べた。図３にＤＭＤ７上の縞の周期と深度応答の半値全幅の関係を示す。上記と同様な実験を縞の周期を変えて深度応答を測定し、得られた深度応答からその半値全幅を求め、それと縞の周期との関係を調べた。図３により、縞の周期を大きくすると、深度応答の半値全幅、すなわち光学断層像の厚さが線形に変化することが確かめられた。これにより、投影する縞の周期を変えることにより確実に深度応答の半値全幅、すなわち、光学切片の厚さを自由にかつ確実に変えることができる。
【００４８】
次に、図６及び図７を参照して、試料１２の観察する場所に依存して分割し、分割した領域毎に光学断層像の厚さＤを設定する複数分割光学断層像について説明する。
図６において、神経細胞５０は細胞体５１と細胞体５１の両側に樹状突起５２とを有する。神経細胞５０を細胞体５１を占める領域Ａと樹状突起５２を示す両側の領域Ｂ、領域Ｃとに分割して考える。領域Ａは細胞体５１を観察する上で光学断層像の厚さをＤ１と小さく設定することが好ましく、領域Ｂは樹脂突起５２が中程度の深さで屈曲しているので光学断層像の厚さをＤ２とやや厚くすることが好ましく、領域Ｃは樹脂突起５２が大きな深さで屈曲しているので光学断層像の厚さをＤ３と大きく設定することが好ましい。
【００４９】
このためには、図７に示すように、ＤＭＤ７素子上を、領域Ａ、領域Ｂ及び領域Ｃに対応する領域ａ、領域ｂ及び領域ｃに分割し、ＤＭＤ７の領域ａ、領域ｂ及び領域ｃの各々の空間的周期を独立に設定し、光学断層像の厚さＤがＤ１、Ｄ２及びＤ３になるようにすればよい。領域Ａ、領域Ｂ及び領域Ｃの光学断層像は一つの共通のモニター４０上で同時に表示される。
【００５０】
上述のように、空間光変調器としてのＤＭＤ７を制御器１８で複数の領域毎に異なる空間的周期を設定することにより、試料１２の観察個所に応じた適正な光学断層像の厚さを設定することができ、１つの画面上で試料１２の複数の観察個所を同時に観察することが可能になる。
【００５１】
次に、本発明の第２の実施の形態について説明する。
図４は本発明による第２の実施の形態の概略構成を示す図でもので、図１と同一部分には同一符号を付してその詳しい説明は省略する。
【００５２】
第２実施例の顕微鏡は、空間光変調器として、透過型の空間光変調器、具体的に例えば、透過型液晶デバイス７１等を用いて構成されている。
【００５３】
この場合、光源１とダイクロイックミラー１０を結ぶ光軸上にコレクタレンズ２、シャッター３、拡散板４、レンズ５、液晶デバイス７１、レンズ８、励起フィルタ９が配置されている。液晶デバイス７は２次元上に配置された複数の液晶の画素から構成されており、これらの複数の液晶画素によって照射面７１ａが形成されている。各画素はそれぞれ独立に制御器１８からの電気信号によってその画素の透過率を変えることができる。したがって、液晶デバイス７１を構成する全ての画素ごとに、その透過率を独立に変えることによって光源１から導かれた光の液晶デバイス７１の強度分布に、液晶デバイス７１によって空間的な変調をかけることができる。また、液晶デバイス７１で空間変調がかけられた光源１からの光の強度分布は、試料１２面上に縮小投影されて照明される。
【００５４】
このように上記第２の実施の形態においては、光源１からの光をパターンを自由に変えることができる液晶デバイス７１によって空間的に強度分布を変調するようにしたので、上記第１の実施の形態と同様な効果を奏する。
【００５５】
次に、本発明の第３の実施の形態について説明する。
図５は本発明による第３の実施の形態の概略構成を示す図でもので、図１と同一部分には同一符号を付してその詳しい説明は省略する。
【００５６】
この場合、ＤＭＤ７で反射した光は顕微鏡本体に導入される。ＤＭＤ７の法線上にレンズ８、励起フィルタ９、平面鏡１９が配置されている。平面鏡１９で反射した光は、対物レンズ２０を通過して試料１２を照明する。
【００５７】
顕微鏡本体の観察光路には、対物レンズ１１、蛍光フィルタ１３、結像レンズ１４、ＣＣＤカメラ１５が配置されている。試料で発した蛍光は、対物レンズ１１を通過して平行光束に変換されたあと、蛍光フィルタ１３で所定の波長域が選択的に透過した後、結像レンズ１４によりＣＣＤカメラ１５の撮像面上に結像し撮像される。
【００５８】
対物レンズ２０、対物レンズ１１の双方あるいはいずれかの一方は、光軸方法に微動させることができるようになっており、対物レンズ２０の焦点位置と対物レンズ１１の焦点位置は予め一致させるように調整しておく。
【００５９】
このように構成にすれば、光源１を点灯すると、光源１から発した光は、コレクタレンズ２により平行光束に変換され、拡散板４で拡散された後、レンズ５と通り、平面鏡６で反射された後、ＤＭＤ７を照明する。
【００６０】
ＤＭＤ７に入射した光は、ＤＭＤ７上に形成されたパターンに応じてその光強度分布が変調された後、レンズ８を通り、励起フィルタ９を通り、平面鏡１９で反射され、対物レンズ２０を通して試料１２に照射される。試料１２では、この照射された光の強度分布に応じてその内の蛍光物質が励起され蛍光を発する。発した蛍光は対物レンズ１１を通り、蛍光フィルタ１３、結像レンズ１４を通過し、ＣＣＤカメラ１５で撮像される。撮像された画像はコンピュータ１６内のフレームグラバに取り込まれる。
【００６１】
従って、このように上記第３の実施の形態においては、光源１からの光をパターンを自由に変えることができるＤＭＤ９によって空間的に強度分布を変調するようにして試料１２を照明し、試料１２からの蛍光をＣＣＤカメラ１５で撮像するようにしたので、第１の実施の形態と同様な効果を奏する。
【００６２】
さらに、ダイクロイックミラーを用いる必要がないので、そのダイクロイックミラーの反射および透過特性に左右されないため、励起フィルタ９および蛍光フィルタ１３の選択の自由度が大幅に増加するという利点がある。
【００６３】
また、高価なダイクロイックミラーを用いる必要がないため、価格的にも安価となる。
【００６４】
【発明の効果】
以上説明したように、本発明の構成によれば、制御電気信号によって照射面の反射特性または透過特性を指定される空間的周波数で空間的変調可能であるので、試料の観察中においても光学断層像の厚さを所望な値に迅速に設定することができる。
【００６５】
また、空間的変調手段の照射面を複数の領域に分割し、分割した各々の領域毎に個別的に空間的周波数を設定可能であるので、試料の観察領域に適した光学断層像の厚さを個別的に設定することが可能になる。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の第1の実施の形態の概略構成を示す図である。
【図２】第１の実施の形態における深度応答を示す図である。
【図３】第１の実施の形態における投影すべき縞の周期と深度応答の半値幅の関係を示す図である。
【図４】本発明の第２の実施の形態の概略構成を示す図である。
【図５】本発明の第３の実施の形態の概略構成を示す図である。
【図６】光学断層像の厚さを個別的に設定することを求める試料の分割された観察領域の断面を模式的に示す図。
【図７】試料の分割された観察領域に対応して複数の領域に分割されたＤＭＤの照射面を示す図。
【符号の説明】
１ 光源
２ レンズ
３ シャッター
４ 拡散板
５ レンズ
６ 平面鏡
７ ＤＭＤ
７ａ ＤＭＤの照射面
８ レンズ
９ 励起フィルタ
１０ ダイクロイックミラー
１１ 対物レンズ
１２ 試料
１３ 蛍光フィルタ
１４ 結像レンズ
１５ ＣＣＤカメラ
１６ コンピュータ
１７ 制御器
１８ 制御器
１８ａ 電気信号
１９ 平面鏡
２０ 対物レンズ
４０ モニター
５０ 神経細胞
５１ 細胞体
５２ 樹状突起
７１ 液晶デバイス
７１ａ 液晶デバイスの照射面
Claims (8)
- 制御電気信号を生成する制御手段と、
光源から出射した光束が照射される照射面を有し、前記制御電気信号を受け前記照射面の反射特性または透過特性を前記制御電気信号で指定される空間的周波数で空間的変調可能な空間的変調手段と、
前記空間的変調手段によって空間的変調された光束を試料に照射する照射光学手段と、
前記照射光学手段によって照射され前記試料から生じる信号光からなる信号画像を検出する画像検出手段と、
前記制御手段によって前記空間的周波数に係る異なる少なくとも３個の位相を設定し、各々の前記位相毎に前記画像検出手段によって検出した前記信号画像を互いに演算し光学断層像を求める演算手段と、
を備え、
前記制御手段は、前記空間的変調手段の前記照射面を複数の領域に分割し、分割した各々の領域毎に個別的に前記空間的周波数を設定可能である
ことを特徴とする顕微鏡装置。 - 前記制御手段は、前記空間的周波数を設定することにより前記光学断層像の厚さを設定可能である
ことを特徴とする請求項１に記載の顕微鏡装置。 - 前記照射面の分割された前記複数の領域の各々は、前記光学断層像の厚さを個別的に設定することを求める前記試料の分割された観察領域に対応している
ことを特徴とする請求項１に記載の顕微鏡装置。 - 前記照射面の分割された前記複数の領域の各々に対応する前記信号画像を一つのモニター面で観察可能なモニター手段を備えている
ことを特徴とする請求項１に記載の顕微鏡装置。 - 前記空間的変調手段は、前記照射面が多数のマイクロミラーが配列されてなるデジタルマイクロミラーデバイスである
ことを特徴とする請求項１に記載の顕微鏡装置。 - 前記空間的変調手段は、前記照射面が多数の液晶セルが配列されてなる液晶デバイスである
ことを特徴とする請求項１に記載の顕微鏡装置。 - 前記空間的変調手段は、前記制御電気信号を受け前記照射面の反射特性または透過特性を正弦波状に空間的変調可能である
ことを特徴とする請求項１に記載の顕微鏡装置。 - 前記信号光は、反射光、透過光あるいは蛍光のいずれかである
ことを特徴とする請求項１に記載の顕微鏡装置。
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