KR101183720B1 - 슈도모나스 플루오레센스에서의 포유류 단백질의 발현 - Google Patents

슈도모나스 플루오레센스에서의 포유류 단백질의 발현 Download PDF

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다우 글로벌 테크놀로지스 엘엘씨
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Abstract

본 발명은 슈도모나드(Pseudomonad), 특히 슈도모나스 플루오레센스(Pseudomonas fluorescens) 유기체에서의 발현에 의한 재조합 포유류 단백질의 개선된 제조 방법에 관한 것이다. 이 방법은 유사한 환경에서 대장균과 같은 공지된 발현 시스템에 비해, 포유류 단백질, 특히 인간 또는 인간 유래 단백질의 제조를 개선시킨다. 단리된 포유류 단백질, 특히 인간 단백질의 개선된 제조 방법이 제공된다.
슈도모나드, 슈도모나스 플루오레센스, 재조합 포유류 단백질, 재조합 인간 펩티드, 발현 시스템, 발현 증가

Description

슈도모나스 플루오레센스에서의 포유류 단백질의 발현 {EXPRESSION OF MAMMALIAN PROTEINS IN PSEUDOMONAS FLUORESCENS}
본 출원은 발명의 명칭이 "Expression of Mammalian Proteins in Pseudomonas fluorescens"이고 2004년 4월 22일 출원된 미국 가출원 제60/564,798호, 및 발명의 명칭이 "Protein Expression Systems"이고 2004년 1월 16일 출원된 미국 가출원 제60/537,148호를 우선권으로 청구한다.
본 발명은 슈도모나드(Pseudomonad), 특히 슈도모나스 플루오레센스(Pseudomonas fluorescens) 유기체에서의 발현에 의한 재조합 포유류 단백질의 개선된 제조 방법에 관한 것이다. 이 방법은 공지된 발현 시스템에 비해 포유류 단백질의 발현을 개선시킨다.
전세계적으로 3억 2천 5백만을 초과하는 인구가 미국 식품 의약품 안전청 (FDA: Food and Drug Administration)이 허가한 155 종을 초과하는 생명공학 의약 및 백신의 도움을 받고 있다. 또한, 370 종을 초과하는 생명공학 의약 제품 및 백신이 각종 암, 알츠하이머 질환, 심장 질환, 당뇨병, 다발성 경화증, AIDS 및 관절염을 포함하여 200 종을 초과하는 질환을 표적으로 하여 현재 임상 시험 중이다. 고전적인 화학 합성을 통해 제조되는 전통적인 소형 분자 치료제와는 달리, 단백질은 일반적으로 살아 있는 세포 내에서 비효율적으로 및 고비용으로 제조된다. 고비용 및 복잡성으로 인해, 단백질을 기재로 하는 치료제에 대한 제작 능력이 부족하다.
제품을 제조하기 위해 미생물 세포를 사용하는 것은 역사가 매우 길다. 1897년에 Buchner는 효모로부터 추출된 효소가 당을 알코올로 전환시키는데 효과적이라는 것을 발견하였고, 이는 미생물을 사용한 주요 산업용 화학물질의 제조에 이르렀다. 1940년대에는 발효에 의한 페니실린의 대규모 제조가 달성되었다. 1970년대 초반에는 외래 유전자를 박테리아 내로 삽입하기 위한 기술이 최초로 개발되었다. 상업적으로 실용적인 재조합 포유류 단백질의 박테리아성 제조는 인간 인슐린의 제조에서 최초로 활용되었다 (Goeddel 등, 1979a; Wong, 1997). 현재 발효 및 세포 배양이 알코올, 항생제, 생화학약품 및 치료 단백질의 대부분의 산업적 제조의 기초가 된다. 그러나, 치료적으로 유용한 단백질의 개발 및 제작은, 대부분, 이러한 외인성 단백질을 발현시키기 위해 사용되는 현행의 유기체의 제한으로 인해 방해되고 있다.
원핵생물 대 진핵생물 단백질 발현
박테리아 발현 시스템이 재조합 진핵생물 단백질을 제조하는데 종종 사용되지만, 산출된 단백질은 전형적으로 이의 원형(原形) 대응부와 현저하게 상이하다. 일반적으로, 대장균 발현 시스템에서 진핵생물의 2차 및 3차 구조물을 재생시키는 것은 난제(難題)이다. 동시에, 현재의 진핵생물 발현 시스템은 재조합 진핵생물 단백질의 2차 및 3차 구조물을 더 잘 형성할 수 있지만, 다량으로 재조합 단백질을 제조하는 이러한 시스템의 능력은 한정된다.
후번역 변형은 원핵생물과 진핵생물 단백질 발현 간의 가장 현저한 차이를 나타낸다. 원핵생물 (즉, 박테리아)은 매우 단순한 세포 구조를 갖고 막에 결합된 세포기관이 없다. 진핵생물에서는, 단백질이 초기에 제조된 후 종종 변형된다. 이러한 변형은, 많은 경우에, 펩티드를 기능적인 형태로 전환시키는데 필요하다. 따라서, 현존하는 박테리아 발현 시스템이 정확한 1차 구조를 갖는 단백질을 제조하는 경우에도, 단백질이 후번역적으로 변형되지 않을 수 있고, 따라서 종종 기능적이지 않다. 통상적인 변형에는 이황화물 결합 형성, 글리코실화, 아세틸화, 아실화, 인산화, 및 감마-카르복실화가 포함되고, 이들 모두는 단백질 폴딩(folding) 및 생물학적 활성을 조절할 수 있다. 박테리아 발현 시스템은 일반적으로 진핵생물 단백질을 정확하게 글리코실화, 아세틸화, 아실화, 인산화 또는 감마-카르복실화시키지 않는다.
박테리아, 예컨대 대장균은 이황화물 결합을 형성할 수 있지만, 생물학적 활성에 요구되는 구성에 부정확하게 결합이 종종 형성되며, 따라서, 활성인 진핵생물 단백질을 제조하기 위해 변성 및 리폴딩(refolding)이 일반적으로 요구된다. 다른 단백질의 폴딩을 용이하게 하는 분자 샤페론(chaperone) 단백질이 원핵생물과 진핵생물 모두에 존재한다. 이같은 샤페론의 부재 시, 폴딩되지 않은 또는 부분적으로 폴딩된 폴리펩티드 사슬이 세포 내에서 불안정하여, 종종 부정확하게 폴딩되거나 불용성 복합물로 응집된다. 샤페론의 결합은 이러한 폴딩되지 않은 폴리 펩티드를 안정화시킴으로써, 부정확한 폴딩 또는 응집을 방지하고, 폴리펩티드 사슬이 이의 정확한 형상으로 폴딩되도록 한다. 그러나, 샤페론은 각각의 세포 유형에서 상이하고, 세포외 조건을 기초로 상이하게 발현될 수 있다.
현행 발현 시스템의 문제
대장균은 가장 널리 그리고 일상적으로 사용되는 단백질 발현 시스템이다. 대장균에서의 발현은 저렴하고, 빠르며, 잘 특징화되어 있다. 또한, 규모 증진 및 수확이 가능하고, cGMP 제조가 잘 구축되어 있다. 그러나, 대장균을 사용하는 것은 상당히 제한이 있고, 이는 종종, 특히 재조합 포유류 단백질을 발현하는 경우, 극복하기 어려운 것으로 입증되었다.
상기 기술된 제한과 함께, 대장균에서 재조합 유전자 생성물이 고수준으로 발현된 결과로 종종 당해 단백질이 잘못 폴딩되고, 이어서 세포성 프로테아제(protease)에 의해 분해되거나, 봉입체(inclusion body)로 알려진 생물학적으로 불활성인 응집물 내로 침착된다. 봉입체 내에서 발견된 단백질은 전형적으로 반드시 추출되어야 하고 활성을 위해 복원되어야 해서, 공정에 시간 및 지출을 부가한다. 전형적인 복원 방법에는 농축된 변성제에 응집물을 용해시키려는 것 및 이어서 희석에 의해 변성제를 제거하는 것이 수반된다. 봉입체 형성에 수반되는 것으로 제안된 일부 인자들에는 단백질의 높은 국소 농도; 이황화 결합의 형성을 방지하는 세포질 내의 환원 환경 (대장균 세포질은 고수준의 글루타티온을 갖는다); 단백질 용해도를 증가시킬 수 있는, 후번역 변형의 결여; 생체내 폴딩에 수반되는 샤페론 및 기타 효소와의 부적절한 상호작용; 이황화물 또는 기타 공유 결합에 의 한 분자간 가교결합; 및 한정된 용해도로 인한 폴딩 중간체들의 증가된 응집이 포함된다. 가장 통상적으로 봉입체의 형성에 이르게 하는 것은 아마도 이러한 인자들의 조합, 뿐만 아니라 샤페론의 제한된 이용가능성일 것이다.
효모 발현 시스템, 예컨대 사카로마이세스 세레비지아에(Saccharomyces cerevisiae) 또는 피키아 파스토리스(Pichia pastoris) 또한 단백질을 제조하는데 통상적으로 사용된다. 이러한 시스템은 잘 특징화되어 있고, 양호한 발현 수준을 제공하며, 다른 진핵생물 발현 시스템과 비교하여 비교적 빠르고 저렴하다. 그러나, 효모는 제한된 후번역 단백질 변형만을 달성할 수 있고, 단백질이 리폴딩을 필요로 할 수 있으며, 세포벽의 특징으로 인해 단백질의 수확이 문제가 될 수 있다.
곤충 세포 발현 시스템 또한 단백질 발현 시스템으로서 매력적이지만, 고비용이고 대안적인 것으로 나타났다. 일반적으로 후번역적으로 변형된, 정확하게 폴딩된 단백질이 때때로 제조될 수 있고, 세포외 발현이 달성되었다. 그러나, 이는 박테리아 및 효모만큼 빠르지 않고, 규모 증진이 일반적으로 난제이다.
포유류 세포 발현 시스템, 예컨대 중국 햄스터 난소(Chinese hamster ovary) 세포가 복합 단백질 발현에 종종 사용된다. 일반적으로 이러한 시스템에서는 적절한 후번역 변형과 함께 정확하게 폴딩된 단백질이 제조되고, 단백질이 세포외적으로 발현될 수 있다. 그러나, 이러한 시스템은 매우 고비용이고, 규모 증진이 느리며 종종 실행가능하지 않고, 단백질 수율이 다른 어떤 시스템보다 낮다.
슈모모나스 플루오레센스
슈도모나스 플루오레센스는 토양, 물 및 식물 표면 환경을 콜로니화하는 일 군의 통상적인 비병원성 사물(死物) 기생생물을 포함한다. 슈도모나스 플루오레센스는 산업용 및 농업용 비포유류 단백질의 제조를 위해 상업용으로 사용되는 것을 포함하여, 농업 및 산업 공정에서 널리 사용된다. 슈도모나스 플루오레센스로부터 유래된 비포유류 효소는 환경 오염을 감소시키기 위해, 세제 첨가물로서, 그리고 입체선택적 가수분해를 위해 사용되어 왔다. Mycogen은 1980년대 중반에 슈도모나스 플루오레센스에서 재조합 박테리아 단백질을 발현시키기 시작하였고, 슈도모나스 플루오레센스에서의 바실루스 투린지엔시스(Bacillus thuringiensis) 독소의 발현에 대한 최초의 특허 출원을 1985년 1월 22일에 출원하였다 ("Cellular encapsulation of biological pesticides"). 1985년과 2004년 사이에, Mycogen (나중에는 다우 아그로 사이언시즈(Dow Agro Sciences)), 뿐만 아니라 다른 회사들은 구충제, 살충제 및 살선충제 독소의 제조, 뿐만 아니라 특정 독소 서열 및 이들의 발현을 증강시키기 위한 유전적 조작에 대한 특허 출원에서의 슈도모나스 플루오레센스의 농업적 용도에 자본을 투자하였다. 슈도모나스 플루오레센스에서의 재조합 박테리아 단백질의 발현에 관한 특허 출원의 예로는 미국 특허 제3,844,893호; 제3,878,093호, 제4,169,010호; 제5,292,507호; 제5,558,862호; 제5,559,015호; 제5,610,044호; 제5,622,846호; 제5,643,774호; 제5,662,898호; 제5,677,127호; 제5,686,282호; 제3,844,893호; 제3,878,093호; 제4,169,010호; 제5,232,840호; 제5,292,507호; 제5,558,862호; 제5,559,015호; 제5,610,044호; 제5,622,846호; 제5,643,774호; 제5,662,898호; 제5,677,127호; 제5,686,282호; 제5,686,283호; 제5,698,425호; 제5,710,031호; 제5,728,574호; 제5,731,280호; 제5,741,663 호; 제5,756,087호; 제5,766,926호; 제5,824,472호; 제5,869,038호; 제5,891,688호; 제5,952,208호; 제5,955,348호; 제6,051,383호; 제6,117,670호; 제6,184,440호; 제6,194,194호; 제6,268,549호; 제6,277,625호; 제6,329,172호; 제6,447,770호; 뿐만 아니라 PCT 공보 제WO00/15761호; 제WO00/29604호; 제WO01/27258호; 제WO02/068660호; 제WO02/14551호; 제WO02/16940호; 제WO03/089455호; 제WO04/006657호; 제WO04/011628호; 제WO87/05937호; 제WO87/05938호; 제WO95/03395호; 제WO98/24919호; 제WO99/09834호; 및 제WO99/53035호가 포함된다.
2003년 10월 8일에 다우 아그로사이언시즈는 발명의 명칭이 "Amended Recombinant Cells (ARCs) for the Production and Delivery of Antiviral Agents, Adjuvants and Vaccine Accelerants"인 PCT 공보 제04/087864호를 출원하였다. 이 출원에는 케모카인 또는 사이토카인을 코딩하는 1개 이상의 이종 유전자를 포함할 수 있는 재조합 세포, 및 면역 응답을 가속화시키기 위해 이같은 세포를 숙주에 투여하는 것이 기술되어 있다. 이 출원에는 슈도모나스 플루오레센스에서의 소 인터페론-α 및 인터페론-γ 제조가 설명되어 있다.
다우 글로벌 테크놀로지스(Dow Global Technologies)는 재조합 단백질을 제조하기 위한 슈도모나스 플루오레센스의 용도의 분야에 여러 계류중인 특허 출원을 현재 갖고 있다. 발명의 명칭이 "Over-Expression of Extremozyme Genes in Pseudomonas and Closely Related Bacteria"이고 2003년 2월 13일에 출원된 다우 글로벌 테크놀로지스의 PCT 출원 제WO03/068926호에는 슈도모나드, 특히 슈도모나스 플루오레센스가 극한효소(extremozyme) 효소의 제조를 위한 숙주 세포로 사용될 수 있는 발현 시스템이 기술되어 있다. 이러한 효소들은 전형적으로 고대의 것이고, 원핵생물, 진균류, 효모, 지의(地衣), 원생생물 및 원생동물문, 조류 및 이끼, 완보류동물 및 어류가 포함되는 진핵생물에서 발견된다. 이 특허에는 효소가 특정 극한(extremophilic) 진균류 및 효모에서 유래될 수 있지만, 전형적으로 극한 박테리아로부터 유래된다는 것이 개시되어 있다.
2003년 4월 22일 출원되고 발명의 명칭이 "Low-Cost Production of Peptides"인 다우 글로벌 테크놀로지스의 PCT 공보 제WO03/089455호에는 슈도모나드, 특히 슈도모나스 플루오레센스에서 콘카타머성(concatameric) 전구체로서 소형 펩티드, 주로 항미생물성 펩티드를 제조하는 방법이 기술되어 있다.
발명의 명칭이 "Benzoate and Antranilate Inducible Promoters"인 다우 글로벌 테크놀로지스의 PCT 공보 제WO04/005221호는 슈도모나스 플루오레센스로부터의 신규 벤조에이트- 또는 안트라닐레이트-유도성 프로모터, 뿐만 아니라 신규 직렬(tandom) 프로모터, 이의 변형체 및 개선된 돌연변이체를 제공하고, 이들은 상업적인 원핵생물성 발효 시스템에 유용하다.
Monsanto Co.의 미국 특허 제5,232,840호에는 원핵생물 세포에서 특정 단백질의 발현을 증가시키기 위한 신규 리보좀 결합 부위의 용도가 기술되어 있다. 한 예에서, 대장균, 슈도모나스 플루오레센스, 및 슈도모나스 푸티다(Pseudomonas putida)가 포함되는 여러 유기체에서 돼지 성장 호르몬을 발현시키기 위해 세포가 사용된다. 데이타는 대장균과 비교했을 때 성장 호르몬의 발현에서 슈도모나스 플루오레센스가 덜 효율적인 것을 나타낸다. 반면에, 박테리아성 단백질을 발현 시킬 때는, 슈도모나스 플루오레센스가 필적하는 조건 하에 대장균보다 단백질 제조에서 훨씬 더 효과적이다. 실제로, 이러한 특허에 기술된 슈도모나스 플루오레센스 세포는 박테리아에서 유래된 β-갈락토시다아제를 대장균보다 수배 더 많이 제조한다 (표 4를 표 1 및 2와 비교할 것).
상업적으로 관심있는 단백질의 제조에서 진보가 이루어졌지만, 재조합 포유류 단백질, 특히 인간 단백질의 용량 및 제조 수준을 개선시키는 것이 여전히 강하게 요구된다.
따라서, 본 발명의 목표는 치료적 용도를 위해 단리 및 정제될 수 있는 재조합 포유류 단백질, 특히 인간 단백질의 제조 방법, 및 이러한 방법을 성취할 수 있는 세포를 제공하는 것이다.
본 발명의 추가적인 목표는 복합 포유류 단백질이 포함되는, 활성 재조합 포유류 단백질의 개선된 제조 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 추가적인 목표는 고수준의 재조합 포유류 단백질, 특히 인간 단백질의 개선된 제조 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 추가적인 목표는 가용성 또는 불용성 재조합 포유류 단백질의 높은 발현 수준을 제공하는 형질전환된 유기체를 제공하는 것이다.
발명의 개요
슈도모나스 플루오레센스가 재조합 단백질, 특히 재조합 포유류 단백질, 예컨대 재조합 인간 단백질의 제조용으로 우수한 유기체라는 것이 발견되었다. 이러한 발견을 기초로, 본 발명은 슈도모나스 플루오레센스에서의 재조합 포유류 또 는 포유류-유래 단백질의 제조 방법을 제공한다. 또한, 본 발명은 재조합 인간 단백질을 포함하여 재조합 포유류 단백질을 제조하도록 형질전환된 슈도모나스 플루오레센스를 제공한다.
한 실시양태에서, 본 발명은 필적하는 조건 하에 대장균 유기체에서보다 발효 반응 리터 당 또는 세포 당 더 높은 수준 또는 농도로 단백질이 제조되는 슈도모나스 플루오레센스 유기체에서의 포유류 단백질의 제조 방법을 제공한다. 또다른 실시양태에서, 본 발명은 재조합 대장균 유기체의 상응하는 배치(batch)보다 리터 당 더 많은 양의 단백질을 제조하는 배치 배양으로 슈도모나스 플루오레센스 유기체에서 포유류 단백질을 제조하는 방법을 제공한다.
필적하는 조건 또는 실질적으로 필적하는 조건은 상이한 유기체에서 동일한 작동적으로 연결된 전사 프로모터 및 리보좀 결합 부위를 사용하고, 동일한 초기 유도 조건을 사용하여 재조합 단백질을 발현시키는 것을 특히 지칭한다. 필적하는 조건은 동일한 벡터, 및 인핸서 서열, 종결 서열 및 기원 또는 복제 서열이 포함되지만 이에 한정되지 않는 관련 조절 요소를 사용하는 것을 추가로 포함할 수 있다. 필적하는 조건은 동일한 전체 부피의 세포 발효 반응을 또한 포함할 수 있다. 필적하는 조건은 반응 리터 당 전체 세포의 동일한 농도를 또한 포함할 수 있다. 한 실시양태에서, 필적하는 조건은 유사하거나 동일한 총 유도 시간 (측정 전)을 또한 포함할 수 있다. 그러나, 또다른 실시양태에서, 유도 시간은 유기체에 따라 다를 수 있다. 구체적으로, 슈도모나스 플루오레센스는 단백질 제조를 감소시키지 않으면서 대장균에 비해 성장 시간에 대한 용량이 증가되어서, 대장균 세포가 대부분 휴지(休止)된 시점에서 슈도모나스 플루오레센스에서는 단백질 제조가 측정될 수 있다. 필적하는 조건을 측정하는 한가지 방식은 전체 세포 단백질 당 재조합 단백질의 백분율을 비교하는 것이다. 또한 필적하는 조건은 동일한 성장 배지를 필요로 하지 않는다. 배지는 개별적인 유기체에 대한 최적의 제조를 확실하게 하기 위해 조정될 수 있다.
또다른 실시양태에서, 본 발명은 슈도모나스 플루오레센스 유기체에서 단백질을 제조하고 제조된 단백질을 단리하는 것에 의한 재조합 포유류 단백질의 제조 방법을 제공한다. 한 하위-실시양태에서, 이 방법은 단백질을 실질적으로 정제하는 것을 포함한다. 한 실시양태에서, 단백질은 인간 단백질로부터 유래되거나, 또는 인간화된 것이다.
본 발명은 적어도 하기의 실시양태에서의 슈도모나스 플루오레센스의 용도를 또한 제공한다:
(i) 전체 세포 단백질의 1 내지 75 ％ (％ tcp(total cell protein)) 사이, 특히 약 5 ％ tcp 초과, 10 ％ tcp 초과, 15 ％ tcp 이상, 20 ％ tcp 이상 범위로 세포 내에 존재하는, 인간 단백질이 포함되는 재조합 포유류 단백질의 제조;
(ii) 세포의 세포질에 가용성이고 1 내지 75 ％ tcp 사이, 특히 약 5 ％ tcp 초과, 10 ％ tcp 초과, 15 ％ tcp 이상, 20 ％ tcp 이상 범위로 세포질 내에 존재하는, 인간 단백질이 포함되는 재조합 포유류 단백질의 제조;
(iii) 1 내지 75 ％ tcp 사이, 특히 약 5 ％ tcp 초과, 10 ％ tcp 초과, 15 ％ tcp 이상, 20 ％ tcp 이상 범위로의, 세포의 세포질에 불용성인, 인간 단백질이 포함되는 재조합 포유류 단백질의 제조;
(iv) 1 내지 75 ％ tcp 사이, 특히 약 5 ％ tcp 초과, 10 ％ tcp 초과, 15 ％ tcp 이상, 20 ％ tcp 이상 범위로의, 세포의 주변세포질에 가용성인, 인간 단백질이 포함되는 재조합 포유류 단백질의 제조;
(v) 1 내지 75 ％ tcp 사이, 특히 약 5 ％ tcp 초과, 10 ％ tcp 초과, 15 ％ tcp 이상, 20 ％ tcp 이상 범위로의, 주변세포질에 불용성인, 인간 단백질이 포함되는 재조합 포유류 단백질의 제조;
(vi) 40 g/ℓ 이상의 세포 밀도에서 성장되었을 때, 1 내지 75 ％ tcp 사이, 특히 약 5 ％ tcp 초과, 10 ％ tcp 초과, 15 ％ tcp 이상, 20 ％ tcp 이상 범위로의, 세포에서의 인간 단백질이 포함되는 재조합 포유류 단백질의 제조;
(vii) 활성 형태로 세포 내에 존재하는, 인간 단백질이 포함되는 재조합 포유류 단백질의 제조;
(viii) 활성 형태의, 인간 단백질이 포함되는 다중-서브유닛 재조합 포유류 단백질의 제조;
(ix) 단리 및 정제되는, 인간 단백질이 포함되는 재조합 포유류 단백질의 제조; 및
(x) 복원되는, 인간 단백질이 포함되는 재조합 포유류 단백질의 제조.
한 실시양태에서, 재조합 포유류 단백질은 다중-서브유닛 단백질, 혈액 캐리어 단백질, 효소, 전장 항체, 항체 단편, 또는 전사 인자로 구성되는 군으로부터 선택된다.
또다른 실시양태에서, 본 발명에는 하기의 것들이 포함된다:
(i) 실질적으로 상응하는 조건 하에 성장되었을 때 상응하는 대장균 유기체보다 더 높은 수준 또는 농도로 인간 단백질이 포함되는 재조합 포유류 단백질을 제조하도록 형질전환된 슈도모나스 플루오레센스 유기체;
(ii) 1 내지 75 ％ tcp 사이, 특히 약 5 ％ tcp 초과, 10 ％ tcp 초과, 15 ％ tcp 이상, 20 ％ tcp 이상 범위로 세포 내에 존재하는 인간 단백질 및 펩티드가 포함되는 재조합 포유류 단백질 및 펩티드를 제조하도록 형질전환된 슈도모나스 플루오레센스 유기체;
(iii) 활성 형태로 세포 내에 존재하는, 인간 단백질이 포함되는 재조합 포유류 단백질을 제조하도록 형질전환된 슈도모나스 플루오레센스 유기체;
(iv) 1 내지 75 ％ tcp 사이, 특히 약 5 ％ tcp 초과, 10 ％ tcp 초과, 15 ％ tcp 이상, 20 ％ tcp 이상 범위로 세포의 세포질에 가용성인, 인간 단백질이 포함되는 재조합 포유류 단백질을 제조하도록 형질전환된 슈도모나스 플루오레센스 유기체;
(v) 1 내지 75 ％ tcp 사이, 특히 약 5 ％ tcp 초과, 10 ％ tcp 초과, 15 ％ tcp 이상, 20 ％ tcp 이상 범위로 세포의 세포질에 불용성인, 인간 단백질이 포함되는 재조합 포유류 단백질을 제조하도록 형질전환된 슈도모나스 플루오레센스 유기체;
(vi) 1 내지 75 ％ tcp 사이, 특히 약 5 ％ tcp 초과, 10 ％ tcp 초과, 15 ％ tcp 이상, 20 ％ tcp 이상 범위로 세포의 주변세포질에 가용성인, 인간 단백질 이 포함되는 재조합 포유류 단백질을 제조하도록 형질전환된 슈도모나스 플루오레센스 유기체;
(vii) 1 내지 75 ％ tcp 사이, 특히 약 5 ％ tcp 초과, 10 ％ tcp 초과, 15 ％ tcp 이상, 20 ％ tcp 이상 범위로 세포의 주변세포질에 불용성인, 인간 단백질이 포함되는 재조합 포유류 단백질을 제조하도록 형질전환된 슈도모나스 플루오레센스 유기체;
(viii) 인간 단백질이 포함되는 다중-서브유닛 재조합 포유류 단백질을 제조하도록 형질전환된 슈도모나스 플루오레센스 유기체;
(ix) 활성 형태로 세포 내에 존재하는 인간 단백질이 포함되는 다중-서브유닛 재조합 포유류 단백질을 제조하도록 형질전환된 슈도모나스 플루오레센스 유기체.
별법 실시양태에서, 슈도모나스 유기체, 및 플루오레센스 이외의 밀접하게 관련된 박테리아가, 하기에 더욱 상세하게 기술되는 바와 같이, 본 발명에서 숙주 세포로 사용된다. 한 실시양태에서, 숙주 세포는 슈도모나스 속, 특히 비병원성 슈도모나스 종으로부터 일반적으로 선택될 것이다. 마찬가지로, 균주 MB 101, 또는 1개 이상의 Lac 억제인자(repressor) 단백질-코딩 lacI 트랜스진(transgene)의 숙주 세포에서 발현가능한 복사본이 1개 이상 삽입되도록 변형된 균주, 예컨대 MB214 및 MB217이 포함되지만 이에 한정되지 않는, 본 발명의 원하는 목표를 완수하는 임의의 슈도모나스 플루오레센스 균주가 사용될 수 있다. 또한 선택적으로 슈도모나스 유기체는 성능, 프로세싱(processing) 또는 기타 특징을 개선하기 위해 1개 이상의 유전자가 부가 또는 결실되도록 유전적으로 변형될 수 있다.
한 실시양태에서, 슈도모나스 유기체는 다중-서브유닛 단백질, 혈액 캐리어 단백질, 효소, 전장 항체, 항체 단편 또는 전사 인자로 구성되는 군으로부터 선택되는 재조합 포유류 단백질을 코딩하는 핵산으로 형질전환된다. 한 실시양태에서, 슈도모나스 플루오레센스 유기체는 다중-서브유닛 단백질, 혈액 캐리어 단백질, 효소, 전장 항체, 항체 단편 또는 전사 인자로 구성되는 군으로부터 선택되는 재조합 포유류 단백질을 발현한다.
발현된 재조합 포유류 또는 인간 단백질은 전형적으로 질량이 약 1 kD 이상, 약 100, 200, 300, 400 또는 500 kD 이하이고, 종종 약 1O kD 내지 약 100 kD 사이이고, 일반적으로 약 30 kD을 초과한다.
도 1은 시판되는 표준물에 필적하는 활성을 나타내는, 슈도모나스 플루오레센스 샘플의 가용성 분획으로부터 정제된 hu-γ-IFN을 나타내는 그래프이다.
도 2는 슈도모나스 플루오레센스 및 대장균에서의 정제된 Gal13의 활성을 나타내는 ELISA의 도면이다.
도 3은 인간 성장 호르몬 발현 구축물을 나타낸다. 천연 분비 신호 서열이 결여된 인간 성장 호르몬의 아미노산 서열이 A에 제시된다. 슈도모나스 플루오레센스 (pDOW2400) 및 대장균 (412-001.hGH)에서의 발현을 위한 플라스미드 구축물이 B에 제시된다.
도 4는 슈도모나스 플루오레센스 및 대장균에서 발현된 hGH의 가용성 및 불 용성 분획의 SDS-PAGE 분석도이다. 유도 후의 시간이 I0, I24, I48, 0 또는 3으로 표시된다. 큰 화살표는 21 kDa hGH 단백질의 위치를 가리킨다.
도 5는 대장균 대 슈도모나스 플루오레센스 세포에서의 γ-IFN 발현의 SDS-PAGE 분석을 나타낸다. 유도 후 0, 3, 24 및 48 시간 (I0 등)에 취해진 샘플의 가용성 (S) 및 불용성 (I) 분획을 리졸빙시켰다(resolved). 대장균이 발현한 γ-IFN은 패널 A에 제시되고, 슈도모나스 플루오레센스가 발현한 γ-IFN은 패널 B에 제시된다. 5 ㎕의 A575-20 샘플을 10 ％ Bis-Tris NuPAGE 겔 상에 로딩하고, 1× MES에 리졸빙시켰다. 화살표는 재조합 단백질의 위치를 가리킨다. 웨스턴 분석이 패널 C (대장균) 및 D (슈도모나스 플루오레센스)에 제시된다.
도 6은 pMYC1803의 SpeI 및 XhoI 부위에서 BuiBui 독소 유전자가 BGI 유전자로 대체된 것을 나타낸다.
도 7은 삽입된 DNA의 서열분석에서 확인된 바와 같이, 선택된 모든 형질전환체가 원하는 인터페론 삽입물을 갖는다는 것을 나타낸다.
도 8은 포스페이트 결합 단백질-gal2 단쇄 항체 융합 단백질에 대한 뉴클레오티드 서열을 나타낸다.
도 9는 포스페이트 결합 단백질-gal2 단쇄 항체 융합 단백질에 대한 아미노산 서열을 나타낸다.
도 10은 포스페이트 결합 단백질-인간 성장 호르몬 융합 단백질에 대한 뉴클레오티드 서열을 나타낸다.
도 11은 포스페이트 결합 단백질-인간 성장 호르몬 융합 단백질에 대한 아미 노산 서열을 나타낸다.
재조합 포유류 단백질의 제조 방법
본 발명은 재조합 포유류 단백질을 제조하는, 방법 및 형질전환된 슈도모나스 플루오레센스 유기체를 제공한다.
한 실시양태에서, 본 발명은 슈도모나스 플루오레센스 유기체에서 단백질을 제조하고 제조된 단백질을 단리하는 것에 의한 재조합 포유류 단백질의 제조 방법을 제공한다. 친화 크로마토그래피, 이온-교환 크로마토그래피, 항체 친화력, 크기-배제, 또는 단백질로부터 세포 잔해물의 실질적인 부분을 제거하는 임의의 다른 방법이 포함되지만 이에 한정되지 않는 당업계에 공지된 기술에 의해 단백질을 발현 후 단리할 수 있다. 한 하위-실시양태에서, 이 방법은 실질적으로 정제된 단백질을 제공한다. 단리된 단백질은 단백질이 유래된 천연 단백질의 활성과 유사한 활성을 갖는다. 단백질은 천연 단백질의 상태 또는 형상과 흡사하게 정확하게 폴딩된 상태 또는 형상으로 단리될 수 있거나, 또는 이를 정확하게 폴딩된 형상으로 바꾸기 위해 추가로 복원 또는 변형될 수 있다. 한 하위-실시양태에서, 단백질은 인간 단백질로부터 유래되거나, 또는 인간화된 것이다. 전형적으로, "인간화된" 단백질은 인간에서 유래된 단백질 서열로 부분적으로 구성된 키메라성 포유류-유형 단백질이다. 인간화는 항체 제조에서 특히 유용하고, 인간화된 항체의 개발은, 예를 들어 미국 특허 제6,800,738호에 광범위하게 기술되어 있다.
한 실시양태에서, 숙주 세포에 의한 단백질의 발현에 이어서 단백질이 단리된다. 또다른 실시양태에서, 단백질 또는 펩티드가 정제된다. 별법 실시양태에서, 단백질의 단리 후에 단백질이 정제된다. 선택적으로, 단리된 또는 정제된 단백질은 활성 단백질의 제조를 위해 복원 또는 리폴딩될 수 있다.
또다른 실시양태에서, 본 발명은 단백질이 대장균 유기체에서보다 높은 수준 또는 농도로 제조되는, 슈도모나스 플루오레센스 유기체에서의 포유류 단백질의 제조 방법을 제공한다. 포유류 단백질의 고수준 제조를 위한 슈도모나스 플루오레센스 유기체의 적절성은 종래 기술에서 이러한 유기체에서 이같은 단백질을 제조하는 것을 성공하지 못했던 것을 기초로 할 때 뜻밖이었다. 본 발명가들은 이러한 유기체가 실제로는 포유류 단백질을 고수준으로 제조할 수 있고 상응하는 분석법에서 테스트하였을 때 대장균보다 더 높은 수율 또는 더 높은 수준으로 단백질을 전형적으로 발현한다는 것을 발견하였다. 또다른 실시양태에서, 본 발명은 재조합 대장균 유기체의 상응하는 배치보다 리터 당 더 많은 양의 단백질이 제조되는 배치 배양으로 슈도모나스 플루오레센스 유기체에서 포유류 단백질을 제조하는 방법을 제공한다.
일부 실시양태에서, 슈도모나스 플루오레센스에서 활성 형태의 인간 단백질이 포함되는 재조합 포유류 다중-서브유닛 단백질을 제조하는 것; 슈도모나스 플루오레센스에서 트랜스페린 및 알부민과 같은 인간 혈액 캐리어 단백질이 포함되는 재조합 포유류 혈액 캐리어 단백질을 제조하는 것; 슈도모나스 플루오레센스에서 활성 형태의 재조합 포유류 효소가 포함되는 재조합 포유류 효소를 제조하는 것; 슈도모나스 플루오레센스에서 단쇄 항체 및 Fab 단편이 포함되는 항체 및 항체 단편을 제조하는 것; 및 슈도모나스 플루오레센스에서 인간이 포함되는 포유류의 재조합 전사 인자를 제조하는 것이 포함되는 방법들이 제공된다.
한 실시양태에서, 재조합 포유류 단백질은 다합체로서, 또는 콘카타머성 전구체로, 예를 들어, 직렬 연결된 2개 이상의 소형 펩티드 (1-15 개의 아미노산) 단위의 형태로 제조된다. 별법 실시양태에서, 재조합 포유류 단백질은 다합체로서 또는 콘카타머성 전구체로 제조되지 않고, 대신 단쇄 폴리펩티드로서 제조된다.
생체분자의 스크리닝( screening )
본 발명의 별도의 실시양태는 원하는 활성 또는 성질을 나타내는 하나 이상의 생체분자를 동정하기 위한 포유류 생체분자의 라이브러리의 스크리닝 방법에서 슈도모나스 플루오레센스 유기체를 제공한다. 테스트하기를 원하는, 다수의 포유류에서 유래된 핵산으로 슈도모나스 플루오레센스 세포가 형질전환되어, 형질전환된 숙주 세포의 라이브러리가 제조될 수 있다. 발현 시, 핵산의 적어도 일부가 코딩하는 폴리펩티드가 세포질 내에 또는 세포로부터의 회수 후에 테스트용으로 제조된다. 테스트가 수행될 수 있는 활성 및 성질의 예로는 하기의 것들이 포함된다: 폴리펩티드 발현 수준; 폴리펩티드 안정성; 및 생체촉매성 활성 및 성질. 생체촉매성 활성 및 성질의 예시적인 예로는 하기의 것들이 포함된다: 효소 활성; 단백질 상호작용/결합; 단백질 안정화; 기질 사용; 생성물 형성; 반응 조건, 예컨대 pH, 염도, 또는 반응 온도; 소정의 촉매화된 반응에 대한 생체촉매성 파라메터, 예컨대 Km 및 Vmax; 및 안정성 거동, 예컨대 열안정성 및 생체촉매 반감기. 수득된 테스트 결과를 사용하여 추가적인 개발을 위해 라이브러리 구성원(들)을 선택할 수 있다.
단백질 발현
본 발명의 주요 양상은 슈도모나스 플루오레센스 유기체에서의 발현에 의한 전체 세포 단백질의 1 내지 75 ％ (％tcp) 사이 범위의 고수준의 재조합 포유류 단백질, 예를 들어 인간 단백질의 발현이다. 발현된 단백질은 슈도모나스 플루오레센스 세포에서 가용성 또는 불용성일 수 있다. 이같은 고수준의 가용성 또는 불용성 재조합 포유류 단백질은 종전의 공지된 포유류 단백질 발현 시스템에 비해 개선된 것일 수 있다. 특히, 대규모의 발효 반응에서 고수준의 회수된 포유류 단백질은 공지된 기술로는 전형적으로 가능하지 않다.
한 실시양태에서, 본 발명은 대장균 발현 시스템에서 발견되는 것을 초과하는 포유류 단백질의 발현 수준을 제공한다. 한 실시양태에서, 각 세포 내의 재조합 단백질의 농도는 비교 분석법에서 대장균에서 발견되는 것보다 높다. 한 실시양태에서, 슈도모나스 플루오레센스 발현 시스템 내에서 측정된 전체 세포 단백질과 비교된 재조합 단백질의 수준은 대장균에서 발현된 동일한 재조합 단백질의 수준보다 더 높다. 또다른 실시양태에서, 본 명세서에 기술된 슈도모나스 플루오레센스 발현 시스템에서의 가용성 단백질의 수준 또는 양은 필적하는 대장균 발현 시스템에서의 가용성 재조합 단백질의 수준 또는 양보다 더 높다. 또다른 실시양태에서, 활성 단백질의 총량은 대장균 발현 시스템으로부터 유래된 양보다 더 높다. 별도의 실시양태에서, 슈도모나스 플루오레센스 발현 시스템에서 측정된 전체 세포 단백질과 비교된 재조합 활성 단백질의 수준은 대장균에서 발현된 동일한 재조합 단백질의 수준보다 더 높다. 한 실시양태에서, 슈도모나스 플루오레센스에서 발현된 단백질의 수준, 농도 또는 양은 필적하는 분석법에서 대장균에서 발현된 재조합 단백질의 수준, 농도 또는 양의 2× 이상, 3× 이상, 4× 이상, 5× 이상, 6× 이상, 7× 이상, 8× 이상, 9× 이상, 1O× 이상의 수준이다.
발현 시스템으로서의 슈도모나스 플루오레센스의 이점 중 하나는 세포가 이들의 단백질 제조 용량에 부정적으로 영향을 미치지 않으면서 대규모 배양물로 성장할 수 있다는 것이다. 이러한 용량은 다른 박테리아 시스템, 예컨대 대장균에서 발견되는 것을 초과한다. 또다른 실시양태에서, 이 방법은 재조합 단백질이 대장균 배치 배양에서보다 슈도모나스 플루오레센스에서 더 높은 전체 수준으로 제조되는 배치 배양으로 포유류 단백질을 제조하는 것을 포함한다. 또다른 실시양태에서, 본 발명은 재조합 대장균 유기체의 상응하는 배치보다 리터 당 더 많은 양의 단백질이 제조되는 배치 배양으로 슈도모나스 플루오레센스 유기체에서 포유류 단백질을 제조하는 방법을 제공한다.
일반적으로 본 발명은 전체 세포 단백질 (tcp)의 1-75 ％의 가용성 또는 불용성 재조합 포유류 단백질인 발현 수준을 제공하는, 방법 및 형질전환된 슈도모나스 플루오레센스를 제공한다. 세포 내에서 발현된 재조합 포유류 단백질은 활성 형태로 발현될 수 있다. 다른 실시양태에서, 슈도모나스 플루오레센스는 적어도 1, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 40, 50, 55, 60, 65, 70, 또는 75 ％ tcp의 재조합 포유류 단백질을 제공한다..
이러한 단백질들은 가용성일 수 있고, 가용성인 경우 제조되는 동안 세포의 세포질 또는 주변세포질 내에 존재할 수 있다. 가용성 단백질은 압력에 의한 세포막의 파열 (즉, "프렌치(French)" 프레스(Press) 방법)이 포함되지만 이에 한정되지는 않는 방법에 의해, 또는 세포막의 라이소자임(losozyme) 분해에 의해 세포로부터 쉽게 방출될 수 있다. 세제, 예컨대 비이온성 세제를 사용하여 세포를 또한 전형적으로 용균시킬 수 있다. 가용성인 단백질은 완충액의 성분, 예컨대 완충액 pH, 염 농도 또는 부가적인 단백질 성분 (예를 들어, 다중-서브유닛 복합물인 경우)을 조정함으로써 추가적으로 안정화될 수 있다. 가용성 단백질은, 예를 들어, 원심분리 및/또는 크로마토그래피 예컨대 크기 배제, 음이온 또는 양이온 교환 또는 친화 크로마토그래피에 의해 다른 단백질 및 세포 잔해물로부터 단리 또는 정제될 수 있다.
단백질은 또한 불용성일 수 있다. 불용성 단백질은 전형적으로 세포질 내에서 봉입체로서 발견되지만, 종종 주변세포질에서도 발견된다. 모든 불용성 단백질이 봉입체이지는 않고, 막 응집물에서, 소형 단백질 응집물로서, 또는 세포질 또는 주변세포질 내의 임의의 다른 불용성 형태로 또한 발견될 수 있다. 예를 들어, 환원제 예컨대 요소 또는 구아니딘 히드로클로라이드를 사용하여, 불용성 단백질을 전형적으로 복원시킬 수 있다. 불용성 단백질 또는 단백질 응집물은, 예를 들어, 원심분리 및/또는 크로마토그래피 예컨대 크기 배제 크로마토그래피에 의해 단리할 수 있다. 예를 들어, [Vinogradov 등 (2003) Anal Biochem . 15;320(2):234-8]에 기술된 바와 같이 마이셀 또는 리버스 마이셀(riverse micelle)을 사용하여 응집물을 가용화시킴으로써, 불용성 응집물 내의 단백질을 전형적으로 분리할 수 있다.
특정 실시양태에서, 슈도모나스 숙주 세포는, 무기염 배지에서 성장했을 때 (즉, 약 4 ℃ 내지 약 55 ℃ (경계 포함)의 온도 범위 내에서), 재조합 포유류 펩티드, 폴리펩티드, 단백질 또는 이들의 단편 발현 수준이 1 ％ tcp 이상이고, 세포 밀도가 40 g/ℓ 이상일 수 있다. 특정 실시양태에서, 10 ℓ 이상의 발효 규모로 무기염 배지에서 성장했을 때 (즉, 약 4 ℃ 내지 약 55 ℃ (경계 포함)의 온도 범위내에서), 발현 시스템은 재조합 포유류 단백질이 포함되는 재조합 단백질 또는 펩티드 발현 수준이 5 ％ tcp 이상이고 세포 밀도가 40 g/ℓ 이상일 것이다.
발현 수준은 당업계에 공지된 표준 기술을 사용하여 측정할 수 있다. 한 실시양태에서, 단백질의 양 (g 단위)을 소정의 샘플 내의 전체 세포 단백질의 g 단위의 양과 비교한다. 또다른 실시양태에서, 측정은 리터 당 재조합 단백질의 수준이다. 또다른 실시양태에서, 수준 또는 양을 공지된 표준물, 예컨대 BSA 대조물과 비교하여 측정할 수 있다. 예를 들어, 정제된 단백질의 흡광을 분석함으로써, 단백질에 대한 마커의 친화력 (예컨대 항체 친화력)을 측정하고 이를 공지된 표준물과 비교함으로써, 또는 공지된 표준물 (예컨대 공지된 양의 정제된 활성 단백질)과 비교하여 활성 수준을 측정함으로써, 재조합 단백질의 수준 또는 양을 측정할 수 있다.
특정 상황에서, 슈도모나스 플루오레센스 박테리아가 발현 숙주 세포로 사용된 경우, 활성 가용성 형태의 이황화물-결합-함유 표적 폴리펩티드를 회수하기 위해 추가적인 이황화물-결합-촉진 조건 또는 작용제가 필요하지 않는다는 것이 발견되었다. 따라서, 한 실시양태에서, 트랜스제닉(transgenic) 펩티드, 폴리펩티드, 단백질, 또는 단편이 이의 천연 상태에서 1개 이상의 분자내 이황화물 결합을 함유한다. 다른 실시양태에서, 단백질은 이의 천연 상태에서 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18 또는 20개 이상에 달하는 이황화물 결합을 함유할 수 있다.
일부 실시양태에서, 단백질은 정제 또는 단리 전에 제조되는 동안 세포의 주변세포질 내에서 발현 또는 발견된다. 단백질은 적절한 분비 신호 서열에 융합됨으로써 주변세포질 내로 분비될 수 있다. 한 실시양태에서, 신호 서열은 슈도모나스 플루오레센스 게놈에 천연인 신호 서열이다. 특정 실시양태에서, 신호 서열은 포스페이트 결합 단백질, Lys-Arg-Orn 결합 단백질 (LAObp 또는 KRObp) 분비 신호 펩티드, 외부막 포린 E (OpreE: Outer Membrane Porin E) 분비 신호 펩티드, 아주린(azurin) 분비 신호 펩티드, 철(III) 결합 단백질 (Fe(III)bp) 분리 신호 펩티드, 또는 지질단백질 B (LprB) 분비 신호 펩티드이다.
한 실시양태에서, 재조합 펩티드, 폴리펩티드, 단백질 또는 이들의 단편은 이의 활성 상태에서 폴딩된 분자내 형상을 갖는다. 전형적으로 슈도모나스 플루오레센스는 정확하게 폴딩된 형상으로 포유류 단백질을 더욱 효율적으로 제조한다. 한 실시양태에서, 발현된 트랜스제닉 펩티드, 폴리펩티드, 단백질 또는 이들의 단편 생성물의 50 ％ 초과분이 세포질 또는 주변세포질 내에 가용성 활성 형태 또는 불용성이지만 복원가능한 형태의 단일 펩티드, 폴리펩티드, 단백질 또는 이들의 단편으로서 제조될 수 있다. 또다른 실시양태에서 발현된 단백질의 약 60 ％, 70 ％, 75 ％, 80 ％, 85 ％, 90 ％, 95 ％가 활성 형태로 수득되거나, 활성 형태로 복원될 수 있다.
정의
본 명세서 전반에서, 용어 "단백질"은 임의의 아미노산 콘카타머 또는 중합체를 포함하도록 사용된다. 용어 "폴리펩티드", "펩티드" 및 "단백질"은 상호교환적으로 사용되고, 1개 이상의 아미노산 잔기가 상응하는 천연 발생 아미노산의 인공적인 화학적 유사체인 아미노산 중합체, 뿐만 아니라 천연 발생 아미노산 중합체를 포함한다.
용어 "단리된"은 세포 내에서 천연 상태로 발견될 때 일반적으로 동반되는 다른 물질 성분, 예를 들어, 다른 세포 성분이 실질적으로 또는 본질적으로 없는 핵산, 단백질 또는 펩티드를 지칭한다.
용어 "정제된" 또는 "실질적으로 정제된"은 단백질이 다른 세포 성분으로부터 분리되고, 이 단백질과의 천연 복합물에 존재하지 않는 세포 내에서 발견되는 다른 단백질 및 펩티드로부터 분리된 것을 의미하도록 사용된다. 특정 실시양태에서, 정제된 단백질의 순도는 FDA에 의해 허가된 또는 표준 cGMP 가이드라인에 규정된 바와 같이 사용되는 치료 또는 수의학용으로 허가된 것인다.
용어 "％ 전체 세포 단백질" ("tcp")은 총계적인 세포 단백질의 백분율로서의 숙주 세포 내 단백질의 양을 의미한다. 별법으로, 이 용어는 세포에 의해 발현된 소정의 단백질의 상대적인 양을 나타내는 전체 세포 단백질의 분획의 크기를 의미한다.
용어 "작동적으로 부착된"은 코딩 서열과 관련하여 숙주 세포의 작용에서 및 작용에 의해 조절 요소가 코딩 서열의 발현을 지시할 수 있도록 하는 배열로 전사 및 임의의 번역 조절 요소가 코딩 서열에 공유결합적으로 부착된 임의의 구성을 지칭한다.
본원에서 사용된 용어 "포유동물"은 인간, 또는 돼지(porcine), 양(ovine), 소(bovine), 설치류, 유제류, 새끼돼지(pig), 돼지(swine), 면양(sheep), 새끼양(lamp), 염소, 축우(cattle), 사슴, 노새, 말, 원숭이, 영장류, 개, 고양이, 래트, 및 마우스가 포함되지만 이에 한정되지 않는 비인간 포유동물이 포함되는 포유류 강에 속하는 임의의 동물을 포함 또는 가리키도록 의도된다.
본원에서 사용된 용어 "재조합 포유류 단백질" 또는 펩티드는 천연 포유류 단백질 서열로부터 유래된, 또는 천연 포유류 핵산 서열로부터 유래 또는 생성된 단백질을 포함하도록 의도된다. 이같은 재조합 단백질은 천연 포유류 mRNA에 실질적으로 상응하는 핵산 서열 또는 실질적으로 상응하는 cDNA, 또는 이의 단편으로부터 제조될 수 있다. 서열은 당업계에 공지된 바와 같은 특정 숙주 세포 코돈 용법을 기초로 적절히 조정될 수 있다.
2개의 핵산 또는 폴리펩티드의 관계에서의 문구 "실질적으로 상응하는"은 당업계에 공지된 알고리즘을 사용하여 측정시, 단백질 도메인에 걸쳐 최대로 일치되도록 정렬될 때 50 ％ 이상, 60 ％ 이상, 70 ％ 이상, 80 ％ 이상, 90 ％ 이상의 동일성을 갖는 2 개의 서열 내의 잔기를 지칭한다. 비교를 위한 서열의 최적 정렬은, 예를 들어, 당업계에 공지된 알고리즘에 의해 (예를 들어, [Smith & Waterman (1981) Adv . Appl . Math . 2:482]; [Needleman & Wunsch (1970) J. Mol . Biol. 48:443]; [Pearson & Lipman (1988) Proc . Nat'l . Acad . Sci . USA 85:2444]; [Altschul 등 (1990) J. Mol . Biol . 215:403-410 (BLAST)]), 이러한 알고리즘의 컴퓨터화된 실행에 의해 (GAP, BESTFIT, FASTA, 및 TFASTA [Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, Wis.]), 또는 검열에 의해 수행할 수 있다. BLAST 분석을 실행하기 위한 소프트웨어는 [National Center for Biotechnology Information (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)]를 통해 공개적으로 입수가능하다.
용어 "단편"은 뉴클레오티드, 단백질 또는 펩티드 서열의 일부 또는 부분적인 서열을 의미한다.
본원에서 사용된 용어 "가용성"은 생리적인 조건 하에 완충액 내에서 10-30 분 동안 회전되었을 때 약 5,000× 내지 20,000× 사이의 중력에서의 원심분리에 의해 단백질이 침전되지 않는 것을 의미한다. 가용성 단백질은 봉입체 또는 다른 침전된 덩어리의 일부가 아니다.
본원에서 사용된 용어 "불용성"은 생리적인 조건 하에 완충액 내에서 10-30 분 동안 회전되었을 때 5,000× 내지 20,000× 사이의 중력에서의 원심분리에 의해 단백질이 침전될 수 있는 것을 의미한다. 불용성 단백질은 봉입체 또는 다른 침전된 덩어리의 일부일 수 있다.
용어 "봉입체"는 단백질의 응집물이 격리되어 있는 세포 내에 함유된 임의의 세포내 물체를 포함하도록 의도된다.
본원에서 사용된 용어 "상동성"은 i) 소정의 원형 단백질의 서열과 70 ％ 이상, 75 ％ 이상, 80 ％ 이상, 85 ％ 이상, 90 ％ 이상, 95 ％ 이상, 또는 98 ％ 이상 유사한 아미노산 서열을 갖고, 원형 단백질의 원하는 기능이 유지된 단백질, 또는 ii) 소정의 핵산의 서열과 70 ％ 이상, 75 ％ 이상, 80 ％ 이상, 5 ％ 이상, 90 ％ 이상, 95 ％ 이상, 또는 98 ％ 이상 유사한 서열을 갖고, 원형 핵산 서열의 원하는 기능이 유지된 핵산을 의미한다. 본 발명 및 명세서의 모든 실시양태에서, 임의의 개시된 단백질, 펩티드 또는 핵산은 원하는 기능이 유지된, 상동성이거나 실질적으로 상동성인 단백질, 펩티드 또는 핵산으로 치환될 수 있다. 본 발명 및 명세서의 모든 실시양태에서, 임의의 핵산이 개시되는 경우, 개시된 핵산에 혼성화하는 모든 핵산을 본 발명이 또한 포함하는 것으로 가정되어야 한다.
한 비제한적인 실시양태에서, 상동성 폴리펩티드의 동일하지 않은 아미노산 서열은 표 1에 제시된 15 종의 보존성 또는 반-보존성 군 중 임의의 것의 구성원인 아미노산일 수 있다.
유사 아미노산 치환 군
보존성 군 (8) 반-보존성 군 (7)
Arg, Lys Arg, lys, His
Asp, Glu Asn, Asp, Glu, Gln
Asn, Gln
Ile, Leu, Val Ile, Leu, Val, Met, Phe
Ala, Gly Ala, Gly, Pro, Ser, Thr
Ser, Thr Ser, Thr, Tyr
Phe, Tyr Phe, Typ, Tyr
Cys (비-시스틴), Ser Cys (비-시스틴), Ser, Thr
제조된 포유류 단백질의 유형
일반적으로, 재조합 포유류 단백질은 아미노산 서열이 공지된 임의의 포유류 단백질, 또는 아미노산 서열이 추론된 임의의 추정 포유류 또는 포유류-유래 단백질일 수 있다. 단백질은 다중-서브유닛 단백질, 혈액 캐리어 단백질, 효소, 전장 항체, 항체 단편, 또는 전사 인자로 구성되는 군으로부터 선택될 수 있다.
단백질의 아미노산 서열은 원하는 품질에 조정되도록, 예컨대 특정 유형의 상호작용을 확실하게 하도록 변경될 수 있다. 예를 들어, 면역반응성이 감소되도록, 또는 포유동물과 같은 유기체에서 흡수를 증가시키거나, 배출을 감소시키거나, 생물학적이용가능성을 증강시키도록 서열이 조정될 수 있다. 따라서 단백질의 아미노산 서열은 특정 후번역 변형 또는 단백질 형상을 확실히 하기 위해 조정될 수 있다.
한 실시양태에서, 포유류 단백질은 케모카인 또는 사이토카인이다. 또다른 실시양태에서, 포유류 단백질은 하기의 단백질들 중 하나이다: IL-1, IL-1α, IL-1β, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12, IL-12엘라스티(elasti), IL-13, IL-15, IL-16, IL-18, IL-18BPa, IL-23, IL-24, VIP, 에리트로포이에틴, GM-CSF, G-CSF, M-CSF, 혈소판 유래 성장 인자 (PDGF), MSF, FLT-3 리간드, EGF, 섬유아세포 성장 인자 (FGF; 예를 들어, aFGF (FGF-1), bFGF (FGF-2), FGF-3, FGF-4, FGF-5, FGF-6, 또는 FGF-7), 인슐린형 성장 인자 (예를 들어, IGF-1, IGF-2); 종양 괴사 인자 (예를 들어, TNF, 림포톡신), 신경 성장 인자 (예를 들어, NGF), 혈관 내피 성장 인자 (VEGF); 인터페론 (예를 들어, IFN-α, IFN-β, IFN-γ); 백혈병 저해 인자 (LIF); 섬모체 신경영양 인자 (CNTF); 옹코스타틴(oncostatin) M; 줄기 세포 인자 (SCF); 형질전환 성장 인자 (예를 들어, TGF-α, TGF-β1, TGF-β1, TGF-β1); TNF 상과(上科) (예를 들어, LIGHT/TNFSF14, STALL-1/TNFSF13B (BLy5, BAFF, THANK), TNF알파/TNFSF2 및 TWEAK/TNFSF12); 또는 케모카인 (BCA-1/BLC-1, BRAK/Kec, CXCL16, CXCR3, ENA-78/LIX, 에오탁신(Eotaxin)-1, 에오탁신-2/MPIF-2, 엑소두스(Exodus)-2/SLC, 프랙탈카인(Fractalkine)/뉴로탁틴(Neurotactin), GRO알파/MGSA, HCC-1, I-TAC, 림포탁틴(Lymphotactin)/ATAC/SCM, MCP-1/MCAF, MCP-3, MCP-4, MDC/STCP-1/ABCD-1, MIP-1α, MIP-1β, MIP-2α/GROβ, MIP-3α/엑소두스/LARC, MIP-3α/엑소두스-3/ELC, MIP-4/PARC/DC-CK1, PF-4, RANTES, SDF1α, TARC, 또는 TECK).
별법으로, 단백질은 케모카인 또는 사이토카인이 아니다. 또다른 실시양태에서, 포유류 단백질은 하기의 단백질들 중 하나가 아니다: IL-1, IL-1α, IL-1β, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12, IL-12엘라스티, IL-13, IL-15, IL-16, IL-18, IL-18BPa, IL-23, IL-24, VIP, 에리트로포이에틴, GM-CSF, G-CSF, M-CSF, 혈소판 유래 성장 인자 (PDGF), MSF, FLT-3 리간드, EGF, 섬유아세포 성장 인자 (FGF; 예를 들어, aFGF (FGF-1), bFGF (FGF-2), FGF-3, FGF-4, FGF-5, FGF-6, 또는 FGF-7), 인슐린형 성장 인자 (예를 들어, IGF-1, IGF-2); 종양 괴사 인자 (예를 들어, TNF, 림포톡신), 신경 성장 인자 (예를 들어, NGF), 혈관 내피 성장 인자 (VEGF); 인터페론 (예를 들어, IFN-α, IFN-β, IFN-γ); 백혈병 저해 인자 (LIF); 섬모체 신경영양 인자 (CNTF); 옹코스타틴 M; 줄기 세포 인자 (SCF); 형질전환 성장 인자 (예를 들어, TGF-α, TGF-β1, TGF-β1, TGF-β1); TNF 상과 (예를 들어, LIGHT/TNFSF14, STALL-1/TNFSF13B (BLy5, BAFF, THANK), TNF알파/TNFSF2 및 TWEAK/TNFSF12); 또는 케모카인 (BCA-1/BLC-1, BRAK/Kec, CXCL16, CXCR3, ENA-78/LIX, 에오탁신-1, 에오탁신-2/MPIF-2, 엑소두스-2/SLC, 프랙탈카인/뉴로탁틴, GRO알파/MGSA, HCC-1, I-TAC, 림포탁틴/ATAC/SCM, MCP-1/MCAF, MCP-3, MCP-4, MDC/STCP-1/ABCD-1, MIP-1α, MIP-1β, MIP-2α/GROβ, MIP-3α/엑소두스/LARC, MIP-3α/엑소두스-3/ELC, MIP-4/PARC/DC-CK1, PF-4, RANTES, SDF1α, TARC, 또는 TECK). 한 실시양태에서, 단백질은 돼지 단백질, 특히 돼지 성장 인자가 아니다.
본 명세서의 추가적인 실시양태로서, 재조합 포유류 단백질, 이들의 단편 또는 기타 유도체, 또는 이들의 유사체는 항체일 수 있다. 이러한 항체는, 예를 들어, 폴리클로날 또는 모노클로날 항체일 수 있다. 본 발명의 이러한 양상에는 인간화된 키메라성 단쇄 항체, 뿐만 아니라 Fab 단편, 또는 Fab 발현 라이브러리의 생성물이 또한 포함된다.
다중-서브유닛 단백질의 제조
본 발명의 한 실시양태에서, 슈도모나스 종의 숙주 세포에 의한 재조합 포유류 다중-서브유닛 단백질의 제조가 제공된다. 또다른 실시양태에서, 재조합 포유류 다중-서브유닛 단백질을 발현하도록 형질전환된 슈도모나스 종의 숙주 세포가 제공된다. 한 실시양태에서, 재조합 포유류 또는 인간 단백질을 포함하는 다중서브유닛 단백질이 슈도모나스 숙주 세포에서 발현된다. 한 실시양태에서, 숙주 세포에 의한 다중-서브유닛 단백질의 발현에 이어서 다중-서브유닛 단백질이 단리된다. 또다른 실시양태에서, 다중-서브유닛 단백질 또는 펩티드가 정제된다. 정제 또는 단리 전에 세포에 의해 단백질이 조립될 수 있거나, 또는 추가적인 조립이 단리 또는 정제 동안 또는 후에 착수될 수 있다. 선택적으로, 단백질 또는 이의 임의의 부분이 복원 또는 리폴딩되어 활성 단백질이 제조될 수 있다.
임의의 다양한 벡터 및 발현 시스템을 사용하여 다중-서브유닛 단백질을 숙주 세포 내에서 발현시킬 수 있다. 다중-서브유닛은, 선택적으로 상이한 프로모터에 작동적으로 연결되어, 선택적으로 다시스트론성(polycistronic) 서열 내에, 단일 벡터 상에 위치할 수 있다. 각각의 서브유닛은 또한 상이한 벡터 상에 존재할 수 있다. 다중 벡터가 사용될 수 있다. 각각의 서브유닛은 1 개 이상의 선택 마커의 제어 하에 있을 수 있다. 주변세포질 분비 신호 서열, 내부 리보좀 진입 부위, 활성화제 서열, 프로모터 및 종결 신호가 포함되는 조절 요소가 벡터 상에 포함될 수 있다.
한 실시양태에서, 2004년 11월 19일 출원된 다우 글로벌 테크놀로지스의 미국 출원 제10/994,138호에 개시된 바와 같은 영양요구성 선택 마커를 갖는 발현 시스템을 사용하여 다중서브유닛 단백질이 슈도모나스에서 발현되고, 이때 서브유닛을 코딩하는 각각의 핵산의 제어는 영양요구성 선택 마커의 제어 하에 있게 된다. 발현될 수 있는 다중서브유닛 단백질에는 동가동의(homomeric) 및 이가동의(heteromeric) 단백질이 포함된다. 다중서브유닛 단백질은 2 개 이상의 서브유닛을 포함할 수 있고, 이들은 동일하거나 상이할 수 있다. 예를 들어, 단백질은 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 개 이상의 서브유닛을 포함하는 동가동의 단백질일 수 있다. 또한 단백질은 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 개 이상의 서브유닛을 포함하는 이가동의 단백질일 수 있다.
예시적인 다중서브유닛 포유류 단백질로는 이온 채널 수용체가 포함되는 수용체; 신호전달 단백질 예컨대 키나제, GTP분해효소(GTPase), ATP분해효소(ATPase); 막통과 단백질; 콘드로이틴이 포함되는 세포외 매트릭스 단백질; 콜라겐; MHC 단백질, 전장 항체 및 항체 단편이 포함되는 면역조절제; RNA 중합효소 및 DNA 중합효소가 포함되는 효소; 및 막 단백질이 포함된다.
혈액 단백질의 제조
본 발명의 한 실시양태에서, 재조합 포유류 혈액 단백질의 제조가 제공된다. 한 실시양태에서, 숙주 세포에 의한 혈액 단백질의 발현에 이어서 혈액 단백질이 단리된다. 또다른 실시양태에서, 혈액 단백질이 정제된다. 또다른 실시양태에서, 혈액 단백질의 단리 후에, 혈액 단백질이 정제된다. 선택적으로, 활성 단백질을 제조하기 위해 단백질이 복원 또는 리폴딩될 수 있다. 일바적으로, 본 발명의 재조합 혈액 단백질은 적절한 숙주 세포, 예컨대 슈도모나스 플루오레센스 숙주 세포를 혈액 단백질을 코딩하는 핵산 구축물로 형질전환시키고, 형질전환된 숙주 세포를 발현에 적절한 조건 하에 배양하고, 선택적으로, 세포에 의해 발현된 재조합 혈액 단백질을 단리, 또는 단리 및 정제함으로써 제조된다.
또다른 실시양태에서, 재조합 포유류 혈액 단백질을 발현하도록 당해 혈액 단백질의 발현을 위한 적절한 유전자 및 조절 요소를 함유하는 벡터로 형질전환된 슈도모나스 종의 숙주 세포가 제공된다.
발현될 수 있는 혈액 단백질로는 하기의 것들이 포함되지만, 이에 한정되지는 않는다: 캐리어 단백질, 예컨대 인간 알부민 (서열 1, 표 2) 및 소 알부민이 포함되는 알부민; 인간 트랜스페린 (서열 2, 표 2), 소 트랜스페린, 래트 트랜스페린, 재조합 트랜스페린, 재조합 트랜스페린 반(半)-분자, 성질이 변경된 재조합 트랜스페린 반-분자가 포함되는 트랜스페린; 합토글로빈; 피브리노겐 및 기타 응고 인자; 보체 성분; 면역글로불린; 효소 저해제; 안지오텐신 및 브라디키닌과 같은 물질의 전구체; 인슐린; 엔도텔린; 알파, 베타 및 감마-글로불린이 포함되는 글로불린; 및 포유동물의 혈액에서 주로 발견되는 기타 유형의 단백질, 펩티드 및 이들의 단편. 인간 혈청 알부민 (Lawn, L. M. 등 (1981) Nucleic Acids Research 9:22;pp 6103-6114) 및 인간 혈청 트랜스페린 (Yang, F. 등 (1984) Proc . Natl . Acad . Sci . USA 81;pp. 2752-2756)에 대한 아미노산 서열을 포함하여, 수많은 혈액 단백질에 대한 아미노산 서열이 보고되어 있다 ([S. S. Baldwin (1993) Comp . Biochem Physiol . 106b:203-218] 참조).
특정 실시양태에서, 슈도모나스 플루오레센스 숙주 세포를 알부민의 발현을 위한 핵산 서열(들) 및 조절 요소를 함유하는 발현 벡터로 형질전환시키고, 숙주 세포를 알부민의 발현에 적절한 조건 하에 배양하고, 슈도모나스 플루오레센스에 의해 발현된 알부민을 회수하는 것을 포함하는, 슈도모나스 플루오레센스에서의 알부민의 제조가 제공된다. 이러한 실시양태에 따르면, 발현된 알부민은 인간 알부민, 소 알부민, 토끼 알부민, 닭 알부민, 래트 알부민, 및 마우스 알부민으로 구성되는 군으로부터 선택된다. 또다른 실시양태에서, 알부민은 포유류 또는 비포유류 기원일 수 있는, 치료상 활성인 폴리펩티드에 융합될 수 있다.
또다른 특정 실시양태에서, 슈도모나스 플루오레센스 숙주 세포를 트랜스페린의 발현을 위한 핵산 및 조절 요소를 함유하는 발현 벡터로 형질전환시키고, 숙주 세포를 트랜스페린의 발현에 적절한 조건 하에 배양하는 것을 포함하는, 슈도모나스 플루오레센스에서의 트랜스페린의 제조가 제공된다. 또다른 실시양태에서, 트랜스페린의 발현에 이어서 단백질이 단리된다. 추가적인 실시양태에서, 단리 후에 트랜스페린이 정제될 수 있다. 발현된 트랜스페린은 인간 혈청 트랜스페린, 글리코실화 인간 트랜스페린, 비글리코실화 인간 트랜스페린, 인간 트랜스페린의 N-말단 반-분자, 소 트랜스페린, 래트 트랜스페린, 마우스 트랜스페린, 영장류 트랜스페린, 재조합 트랜스페린, 재조합 트랜스페린 반-분자, 성질이 변경된 재조합 트랜스페린 반-분자, 트랜스페린 폴리뉴클레오티드, 트랜스페린 폴리펩티드에 의해 코딩되는 트랜스페린 폴리펩티드, 트랜스페린 폴리펩티드, 트랜스페린 항체, 트랜스페린 단편, 및 치료상 활성인 폴리펩티드에 융합된 트랜스페린으로 구성되는 군으로부터 선택된다.
또다른 특정 실시양태에서, 슈도모나스 플루오레센스 숙주 세포를 글로불린의 발현을 위한 핵산 및 조절 요소를 함유하는 발현 벡터로 형질전환시키고, 숙주 세포를 글로불린의 발현에 적절한 조건 하에 배양하고, 선택적으로 단백질을 단리하는 것을 포함하는, 슈도모나스 플루오레센스에서의 글로불린의 제조가 제공된다. 추가적인 실시양태에서, 발현 후에, 글로불린이 숙주 세포로부터 단리 및 정제된다. 발현된 글로불린은 인간 글로불린, 소 글로불린, 토끼 글로불린, 래트 글로불린, 마우스 글로불린, 양 글로불린, 원숭이 글로불린, 스테로이드-결합 글로불린, 및 치료상 활성인 폴리펩티드에 융합된 글로불린으로 구성된 군으로부터 선택된다.
추가적인 실시양태에서, 슈도모나스 플루오레센스 숙주 세포를 인슐린의 발현을 위한 핵산 및 조절 요소를 함유하는 발현 벡터로 형질전환시키고, 숙주 세포를 인슐린의 발현에 적절한 조건 하에 배양하고, 선택적으로 단백질을 단리하는 것을 포함하는, 슈도모나스 플루오레센스에서의 인슐린의 제조가 제공된다. 추가적인 실시양태에서, 숙주 세포에 의한 인슐린의 제조 후에, 인슐린이 단리 및 정제될 수 있다. 발현된 인슐린은 인간 인슐린, 소 인슐린, 마우스 인슐린, 래트 인슐린, 돼지 인슐린, 원숭이 인슐린, 및 치료상 활성인 폴리펩티드에 융합된 인슐린으로 구성된 군으로부터 선택된다. 인간 인슐린 유전자에 대한 접근 번호는 J00265이고, 합성 인간 인슐린 유전자에 대한 접근 번호는 J02547이다.
재조합 혈액 단백질의 제조를 위한 전장 DNA, 또는 혈액 단백질 또는 이의 일부분의 아미노-말단 또는 카르복시-말단 로브(lobe)를 코딩하는 말단절단 DNA는 입수가능한 공급원으로부터 수득할 수 있거나, 공지된 서열에 따라 표준 절차에 의해 합성할 수 있다.
Figure 112006050327557-pct00001
효소의 제조
본 발명의 한 실시양태에서, 슈도모나스 플루오레센스 종의 숙주 세포에 의한 재조합 포유류 효소 또는 보조인자(co-factor)의 제조가 제공된다. 또다른 실시양태에서, 재조합 포유류 효소 또는 보조인자를 발현하도록 형질전환된 슈도모나스 종의 숙주 세포가 제공된다.
이러한 실시양태에서 발현되는 효소 및 보조인자로는 알돌라아제, 아민 산화효소, 아미노산 산화효소, 아스파르타아제, B12 의존성 효소, 카브복시펩티다아제, 카르복시에스테라아제, 카르복실라아제, 케모트립신, CoA 요구 효소, 시아노히드린 합성효소, 시스타티온 합성효소, 데카르복실라아제, 탈수소효소, 알코올 탈수소효소, 디히드라타아제, 디아포라아제, 디옥시게나아제, 에노에이트 환원효소, 에폭시드 히드라아제, 푸머라아제, 갈락토스 산화효소, 글루코스 이성화효소, 글루코스 산화효소, 글리코실트랜스페라아제, 메틸트랜스페라아제, 니트릴 히드라아제, 뉴클레오시드 인산화효소, 산화환원효소, 옥시니틸라아제, 펩티다아제, 글리코실트랜스페라제, 과산화효소, 및 치료상 활성인 폴리펩티드에 융합된 효소가 포함되지만, 이에 한정되지는 않는다.
또다른 실시양태에서, 효소는 중온성(mesophilic) 효소 폴리펩티드, 예를 들어 인간 및/또는 수의학적 치료 및/또는 진단 용도에 바람직한 것일 수 있다. 이같은 치료적 중온성 효소로는, 예를 들어, 조직 플리스미노겐 활성화제; 유로키나제, 렙틸라아제, 스트렙토키나제; 카탈라제, 과산화물 디스뮤타제; DNA분해효소(DNAse), 아미노산 가수분해효소 (예를 들어, 아스파라기나아제, 아미도히드로라아제); 카르복시펩티다아제; 프로테아제, 트립신, 펩신, 키모트립신, 파파인, 브로멜라인, 콜라게나아제; 뉴라미니다아제; 락테아제, 말타아제, 수크라아제, 및 아라비노푸라노시아다아제가 포함된다.
또다른 실시양태는 재조합 효소 대체물의 발현을 위한 핵산 및 조절 요소를 함유하는 발현 벡터로 슈도모나스 플루오레센스 숙주 세포를 형질전환시키고, 세포를 재조합 효소 대체물의 발현에 적절한 조건 하에 배양하는 것에 의한 슈도모나스 플루오레센스 세포에서의 재조합 효소 대체물의 제조를 제공한다. 숙주 세포 내에서 발현되는 재조합 효소 대체물은 알가시다아제 베타(Algasidase beta), 라로니다아제(Laronidase), 및 치료상 활성인 폴리펩티드에 융합된 재조합 효소 대체물로 구성되는 군으로부터 선택된다.
포유류 항체 및 항체 단편의 제조
본 발명의 한 실시양태에서, 슈도모나스 플루오레센스 종의 숙주 세포에 의한 재조합 포유류 단쇄, Fab 단편 및/또는 전체 사슬 항체 또는 이의 단편 또는 일부분의 제조가 제공된다. 한 실시양태에서, 단백질의 발현 후에, 단백질이 단리 및 선택적으로 정제될 수 있다. 선택적으로, 단백질이 복원되어 활성 단백질이 제조될 수 있다. 항체 또는 항체 단편은 제조 동안 세포 내에서의 표적화를 위해 분비 신호 서열에 선택적으로 연결된다.
또다른 실시양태에서, 재조합 포유류 단쇄, Fab 단편 및/또는 전장 항체 또는 이의 단편 또는 일부분을 발현하도록 형질전환된 슈도모나스 종의 숙주 세포가 제공된다.
한 실시양태에서, 슈도모나스 플루오레센스 세포는 단쇄 항체 또는 이의 단편 또는 일부분을 제조할 수 있다. 단쇄 항체는 안정하게 폴딩된 단일 폴리펩티드 사슬 상에 항체의 항원-결합 영역을 포함할 수 있다. 단쇄 항체는 고전적인 면역글로불린보다 크기가 작지만, 항체의 항원-특이적 결합 성질은 유지될 수 있다. 단쇄 항체는 치료제, 예컨대 "네이키드(naked)" 단쇄 항체, 이중특이적 항체 바인더(binder), 라디오콘쥬게이트(radioconjugate) 또는 이펙터(effector) 도메인과의 융합물용으로, 또는 진단법, 예컨대 종양 조영 또는 생체내 또는 생체외 암 마커 분석법, 연구 도구, 예컨대 신규 치료 표적물의 동정 및 특징화가 포함되는 단백질 정제 및 검출, 항체 마이크로어레이, 디스플레이 기술 및/또는 유전자 또는 의약 전달용 비히클을 위해 사용될 수 있다.
또다른 실시양태에서, 슈도모나스 플루오레센스 세포는 Fab 단편 또는 이의 일부분을 제조한다. Fab 단편은 특정 항체의 조각일 수 있다. Fab 단편은 항원 결합 부위를 함유할 수 있다. Fab 단편은 2 개의 사슬을 함유할 수 있다: 경쇄(輕鎖) 및 중쇄(重鎖) 단편. 이러한 단편들은 링커 또는 이황화물 결합에 의해 연결될 수 있다.
본 발명의 다른 실시양태에서, 전체 사슬 항체가 슈도모나스 플루오레센스, 및 다른 슈도모나스 종에서 발현될 수 있다. Fc 영역을 함유하는 손상되지 않은 항체는 생체 내에서 분해 및 청소(clearance)에 대해 더욱 저항성이어서, 순환에서의 생물학적 반감기가 더 길다. 이같은 항체는 지속적인 치료를 필요로 하는 질환에 대한 치료제로서 사용될 수 있다.
한 실시양태에서, 개별적인 시스트론성 또는 다시스트론성 서열을 함유하는 발현 벡터를 제공함으로써 슈도모나스 종에서 기능성 항체 또는 이의 단편을 제조하는 방법이 제공된다. 개별적인 시스트론 발현 벡터는, 경쇄 및 중쇄의 발현이 개별적인 프로모터에 의해 독립적으로 조절되도록, 면역글로불린 경쇄의 발현을 위한 제 1 프로모터-시스트론 쌍 및 면역글로불린 중쇄의 발현을 위한 제 2 프로모터-시스트론 쌍을 함유할 수 있다. 발현 카세트 폴리뉴클레오티드 내의 각각의 시스트론은 전장 항체의 경쇄 또는 중쇄를 코딩하는 핵산 서열에 작동적으로 연결된 번역 개시 영역 (TIR: translation initiation region)을 포함할 수 있다. 한 실시양태에서, TIR 서열은 경쇄 및 중쇄에 상이한 번역 강도 조합을 제공하도록 조작될 수 있다. 한 별법 실시양태에서, 중쇄 코딩 서열은 경쇄 코딩 서열과 동일한 플라스미드 상에 위치할 수 있다. 별법 실시양태에서, 중쇄 및 경쇄 서열은 단일 플라스미드 내의 다시스트론성 서열에서 발견되거나, 또는 숙주의 게놈 내로 코딩된다.
또다른 실시양태에서, 항체의 경쇄 및 중쇄를 각각 코딩하는 2 개의 개별적인 번역 단위로 형질전환된 숙주 세포에서 기능성 항체 또는 이의 단편을 제조하는 방법이 제공된다. 한 실시양태에서, 이 방법은 a) 경쇄 및 중쇄가 순차적인 방식으로 발현되어, 경쇄 및 중쇄의 제조가 일시적으로 분리되도록 하는 적절한 조건 하에 숙주 세포를 배양하고, b) 경쇄와 중쇄가 조립되도록 하여 기능성 항체 또는 이의 단편을 형성시키는 것을 포함한다.
추가적인 실시양태에서, 슈도모나스 발현 시스템은 Fab, Fab', F(ab')2, F(ab')2-류신 지퍼(zipper), Fv, dsFv, 항-CD18 항체, 키메라성 항체, 인간 항체, 인간화된 항체, 또는 하기의 표 3에 기술된 것들을 포함하지만 이에 한정되지는 않는, 인간 치료용 단쇄, Fab 단편 또는 전장 항체 또는 이의 일부분을 발현할 수 있다.
Figure 112006050327557-pct00002
Figure 112006050327557-pct00003
Figure 112006050327557-pct00004
전사 인자의 제조
본 발명의 한 실시양태에서, 슈도모나스 플루오레센스 종의 숙주 세포에 의한 재조합 포유류 전사 인자의 제조가 제공된다. 한 실시양태에서, 단백질의 발현 후, 단백질이 단리될 수 있다. 또다른 실시양태에서, 단백질이 정제될 수 있다. 선택적으로, 단백질이 복원되어 활성 단백질이 제조될 수 있다. 또다른 실시양태에서, 재조합 포유류 전사 인자를 발현하도록 형질전환된 슈도모나스 종의 숙주 세포가 제공된다.
본 발명의 발현 시스템 내로의 삽입에 적절한 전사 인자로는 헬릭스-턴-헬릭스 (helix-turn-helix) 족의 것들 및 Pac 족의 구성원, 뿐만 아니라 당업계에 공지된 다른 전사 인자 족이 포함된다. 본 발명에서 사용하기에 적절한 이러한 족의 구성원에는 포유류의 하기의 것들 및 이의 포유류 상동체 및 유사체가 포함된다: 전사 조절인자; ASNC 족의 전사 인자 예컨대 ASNC_trans_reg, 추정 전사 조절인자; luxR 족의 박테리아성 조절 단백질; 박테리아성 조절 헬릭스-턴-헬릭스 전사 인자; arsR 족의 박테리아성 조절 단백질; 헬릭스-턴-헬릭스 도메인의 전사 인자 (특히 rpiR 족); 박테리아성 조절 단백질 전사 인자, 박테리아성 조절 헬릭스-턴-헬릭스 전사 인자; DNA 결합 도메인 전사 인자; MarR 족의 전사 인자; ROK 족의 전사 인자; MerR 족의 조절 단백질; 아르기닌 억제인자 전사 인자; 피르미쿠트(firmicute) 전사 인자; 제2철 섭취 조절 전사 인자; 시그마 전사 인자; 응답 조절 리시버(receiver) 전사 인자; 트립토판 RNA-결합 감쇄자(attenuator) 단백질 전사 인자; 추정 당-결합 도메인 전사 인자; PRD 도메인 전사 인자; 질소 조절 단백질 전사 인자; 유전 적격성(competence)의 음성 조절인자, 예컨대 MecA; 음성 전사 조절인자 전사 인자; 박테리아성 전사 조절인자 전사 인자; 글리세롤-3-포스페이트 응답성 전사 인자; 철 의존성 억제인자 전사 인자; 및 수많은 종 특이적 전사 조절인자 전사 인자.
슈도모나스 종에 의해 발현되는 전사 인자는 진단용, 치료법용, 및 연구용 용도로 사용될 수 있다.
벡터 제조
폴리뉴클레오티드
재조합 포유류 단백질 및 펩티드는 표적 폴리펩티드 코딩 서열이 전사 및 번역 조절 요소에 작동적으로 부착되어, 숙주 세포가 이로부터 단백질을 발현할 수 있는 기능성 유전자를 형성한 폴리뉴클레오티드로부터 발현될 수 있다. 코딩 서열은, 이용가능하다면, 표적 폴리펩티드에 대한 천연 코딩 서열일 수 있지만, 또한, 예를 들어, 슈도모나스 플루오레센스와 같은 슈도모나스 종의 코돈 사용 경향을 반응하도록 유전자를 합성함으로써, 선택된 숙주 세포에서 사용하기 위해 선택된, 개선된, 또는 최적화된 코딩 서열일 수도 있다. 생성된 유전자(들)은 1 개 이상의 벡터 내에 구축되거나, 또는 벡터 내로 삽입될 것이고, 그 후 벡터가 발현 숙주 세포 내로 형질전환될 것이다. "발현가능한 형태"로 제공되는 것으로 일컬어지는 핵산 또는 폴리뉴클레오티드는 선택된 박테리아성 발현 숙주 세포에 의해 발현될 수 있는 1 개 이상의 유전자를 함유하는 핵산 또는 폴리뉴클레오티드를 의미한다.
조절 요소
본원에서 사용되는 조절 요소는 표적 재조합 포유류 단백질 코딩 유전자에 작동적으로 부착될 수 있다. 본원에서 사용되는 단백질-코딩 유전자의 코딩 서열은, 성숙 폴리펩티드 코딩 서열 및 전사-조절 요소에 더하여, 추가적인 코딩 요소, 예를 들어, 펩티드 택(tag), 프리-펩티드(pre-peptide), 프로-펩티드(pro-peptide), 프리-프로-펩티드(pre-pro-peptide), 또는 선택된 발현 숙주 세포에서 기능성인 분비 신호 펩티드를 제외한, 당업계에 공지된 기타 통상적으로 활용되는 코딩 요소를 함유할 수 있다.
본원에서 사용된 용어 "작동적으로 부착된"은 코딩 서열과 관련하여 조절 요소가 코딩 서열의 발현을 지시할 수 있도록 하는 배열로 전사 및 임의의 번역 조절 요소가 코딩 서열에 공유결합적으로 부착된 임의의 구성을 지칭한다. 한 실시양태에서, 조절 요소는 숙주 세포 내로의 형질전환을 겪기 전에 전체 유전자의 일부일 수 있다; 그러나, 다른 실시양태에서, 조절 요소는 숙주 게놈의 일부일 수 있거나 또다른 유기체의 게놈의 일부일 수 있는, 또는 이들로부터 유래될 수 있는 또다른 유전자의 일부이다.
프로모터 및 부속 요소
본 발명에 따라 사용되는 프로모터는 구성 프모모터 또는 조절된 프로모터일 수 있다. 유용한 조절된 프로모터의 통상적인 예로는 lac 프로모터로부터 유래된 족의 프로모터 (즉 lacZ 프로모터), 특히 DeBoer의 미국 특허 제4,551,433호에 기술된 tac 및 trc 프로모터, 뿐만 아니라 Ptac16, Ptac17, PtacII, PlacUV5, 및 T7lac 프로모터가 포함된다.
본 발명에 따른 발현 시스템에서 유용한 lac-유형이 아닌 프로모터의 통상적인 예로는, 예를 들어, 표 4에 열거된 것들이 포함된다.
lac 유형이 아닌 프로모터의 예
프로모터 유도인자
λPR 고온
λPL 고온
Pm 알킬- 또는 할로-벤조에이트
Pu 알킬- 또는 할로-벤조에이트
Psal 살리실레이트
예를 들어: [J. Sanchez-Romero & V. De Lorenzo (1999) Manual of Industrial Microbiology and Biotechnology (A. Demain & J. Davies, eds.) pp. 460-74 (ASM Press, Washington, D. C.)]; [H. Schweizer (2001) Current Opinion in Biotechnology 12:439-445]; 및 [R. Slater & R. Williams (2000) Molecular Biology and Biotechnology (J. Walker & R. Rapley, eds.) pp.125-54] 참조. 선택된 박테리아성 숙주 세포에 천연인 프로모터의 뉴클레오티드 서열을 갖는 프로모터, 예를 들어, 슈도모나스 안트라닐레이트 또는 벤조에이트 오페론 프로모터 (Pant, Pben) 또한 표적 폴리펩티드를 코딩하는 트랜스진의 발현을 제어하는데 사용될 수 있다. 서열이 동일 또는 상이한 2 개 이상의 프로모터가 서로 공유결합적으로 부착된 직렬 프로모터, 예를 들어 Pant-Pben 직렬 프로모터 (인터프로모터(interpromoter) 혼성물) 또는 Plac-Plac 직렬 프로모터 또한 사용될 수 있다.
조절된 프로모터는 프로모터가 그 일부인 유전자의 전사를 제어하기 위해 프로모터 조절 단백질을 사용한다. 조절된 프로모터가 본원에서 사용되는 경우, 상응하는 프로모터 조절 단백질 또한 본 발명에 따른 발현 시스템의 일부일 것이다. 프로모터 조절 단백질의 예로는 하기의 것들이 포함된다: 활성화제 단백질, 예를 들어, 대장균 이화생성물 활성화제 단백질, MalT 단백질; AraC 족 전사 활성화제; 억제인자 단백질, 예를 들어, 대장균 LacI 단백질; 및 이중-기능 조절 단백질, 예를 들어, 대장균 NagC 단백질. 많은 조절된 프로모터/프로모터-조절-단백질 쌍이 당업계에 공지되어 있다.
프로모터 조절 단백질은, 이펙터(effector) 화합물, 즉 조절 단백질과 가역적으로 또는 비가역적으로 회합하여 조절 단백질이 프로모터의 제어 하에 있는 유전자의 1 개 이상의 DNA 전사 조절 영역에서 방출되거나 이러한 영역에 결합될 수 있도록 함으로써 유전자 전사의 개시에서 전사효소의 작용을 허용 또는 차단하는 화합물과 상호작용한다. 이펙터 화합물은 유도인자 또는 공-억제인자(co-repressor)로 분류되고, 이러한 화합물에는 천연 이펙터 화합물 및 무상(gratuitous) 유도인자 화합물이 포함된다. 많은 조절된-프로모터/프로모터-조절-단백질/이펙터-화합물 트리오(trio)가 당업계에 공지되어 있다. 이펙터 화합물은 세포 배양 또는 발효 전반에 걸쳐 사용될 수 있지만, 조절된 프로모터가 사용되는 한 실시양태에서, 원하는 양 또는 밀도의 숙주세포 생물량의 성장 후, 직접적으로 또는 간접적으로 원하는 표적 유전자(들)이 발현되도록 하기 위해 적절한 이펙터 화합물이 배양물에 첨가된다.
예를 들어, lac 족 프로모터가 사용되는 경우, lacI 유전자가 또한 시스템 내에 존재할 수 있다. (일반적으로) 구성적으로 발현되는 유전자인 lacI 유전자는 이러한 프로모터들의 lac 오퍼레이터에 결합하는 Lac 억제인자 단백질 (LacI 단백질)을 코딩한다. 따라서, lac 족 프로모터가 사용되는 경우, lacI 유전자가 또한 발현 시스템에 포함되어 발현될 수 있다. lac 프로모터 족 구성원, 예를 들어, tac 프로모터의 경우, 이펙터 화합물은 유도인자, 예컨대 IPTG (이소프로필-β-D-1-티오갈락토피라노사이드, "이소프로필티오갈락토사이드"로도 칭해짐)와 같은 무상 유도인자이다.
기타 요소
기타 조절 요소가 발현 구축물 내에 포함될 수 있다. 이같은 요소로는, 예를 들어, 전사 인핸서 서열, 번역 인핸서 서열, 기타 프로모터, 활성화제, 번역 시작 및 정지 신호, 전사 종결인자, 시스트론성 조절인자, 다시스트론성 조절인자, 발현된 폴리펩티드의 동정, 분리, 정제 또는 단리를 용이하게 하는 택 서열, 예컨대 뉴클레오티드 서열 "택" 및 "택" 펩티드 코딩 서열이 포함되지만, 이에 한정되지는 않는다.
최소한도로, 본 발명에 따른 단백질-코딩 유전자는, 포유류 단백질 코딩 서열에 더하여, 여기에 작동적으로 연결된 하기의 조절 요소를 포함할 수 있다: 프로모터, 리보좀 결합 부위 (RBS), 전사 종결인자, 번역 시작 및 정지 신호. 유용한 RBS는 발현 시스템에서 숙주 세포로 유용한 임의의 종으로부터, 예컨대 선택된 숙주 세포로부터 수득될 수 있다. 많은 특이적이고 다양한 컨센서스(consensus) RBS, 예를 들어, [D. Frishman 등 (1999) Gene 234(2):257-65]; 및 [B. E. Suzek 등 (2001) Bioinformatics 17(12):1123-30]에 기술되고 참조된 것들이 공지되어 있다. 또한, 천연 또는 합성 RBS, 예를 들어, EP 0207459 (합성 RBS); [O. Ikehata 등 (1989) Eur . J. Biochem . 181(3):563-70] (AAGGAAG의 천연 RBS 서열)에 기술된 것들을 사용할 수 있다. 본 발명에서 유용한 방법, 벡터, 및 번역 및 전사 요소, 및 기타 요소의 추가적인 예는, 예를 들어 미국 특허 제5,055,294호 및 제5,128,130호 (Gilroy 등); 제5,281,532호 (Rammler 등); 제4,695,455호 및 제4,861,595호 (Barnes 등); 제4,755,465호 (Gray 등); 및 제5,169,760호 (Wilcox)에 기술되어 있다.
벡터
슈도모나스에 의한 본 발명의 효소를 코딩하는 DNA의 전사는 인핸서 서열을 벡터 또는 플라스미드 내로 삽입함으로써 증가된다. 전형적인 인핸서는 프로모터 상에 작용하여 이의 전사를 증가시키는, 크기가 일반적으로 약 10 내지 300 bp인 DNA의 시스-작용성 요소이다. 인핸서의 예로는 본 명세서의 다른 곳에서 기술되는 바와 같은 다양한 슈도모나스 인핸서가 포함된다.
일반적으로, 재조합 발현 벡터는 복제 기원 및 슈도모나스 숙주 세포의 형질전환을 허용하는 선택가능한 마커, 예를 들어, 슈도모나스 플루오레센스의 항생제가 없는 저항성 유전자, 및 하류의 구조 서열의 전사를 지시하는 고수준으로 발현된 유전자로부터 유래되는 프로모터를 포함할 것이다. 이같은 프로모터는 특히 3-포스포글리세레이트(3-phosphoglycerate) 키나제 (PGK)와 같은 효소, 또는 열 쇼크 단백질을 코딩하는 오페론으로부터 유래될 수 있다. 이종성 구조 서열이 적절한 단계에서 번역 개시 및 종결 서열과 조립되고, 한 실시양태에서는 번역된 효소의 분비를 지시할 수 있는 리더(leader) 서열과 조립된다. 선택적으로, 이종성 서열은 원하는 특징, 예를 들어, 발현된 재조합 생성물의 안정화 또는 단순화된 정제를 제공하는 N-말단 동정 펩티드를 포함하는 융합 효소를 코딩할 수 있다.
효소의 발현에서 슈도모나스 플루오레센스와 함께 사용하기 위한 유용한 발현 벡터는 기능성 프로모터를 갖는 작동가능한 리딩(reading) 상(相) 내에 원하는 단백질을 코딩하는 구조 DNA 서열을 적절한 번역 개시 및 종결 신호와 함께 삽입함으로써 구축된다. 벡터는 1 개 이상의 표현형으로 선택가능한 마커 및 복제 기원을 포함하여, 벡터의 유지를 확실하게 하고, 바람직한 경우 숙주 내에서의 증폭을 제공할 것이다.
벡터는 숙주 세포 내에서 재조합 단백질을 발현시키는데 유용한 것으로 당업계에 공지되어 있고, 임의의 벡터를 본 발명에 따른 유전자를 발현시키는데 사용할 수 있다. 이같은 벡터로는, 예를 들어, 플라스미드, 코스미드, 및 파지 발현 벡터가 포함된다. 유용한 플라스미드 벡터로는 발현 플라스미드 pBBR1MCS, pDSK519, pKT240, pML122, pPS1O, RK2, RK6, pRO1600, 및 RSF1010이 포함되지만 이에 한정되지는 않는다. 이같은 유용한 벡터의 다른 예로는, 예를 들어, [N. Hayase (1994) Appl . Envir . Microbiol . 60(9):3336-42]; [A. A. Lushnikov 등 (1985) Basic Life Sci . 30:657-62]; [S. Graupner & W. Wackernagel (2000) Biomolec. Eng . 17(1):11-16]; [H. P. Schweizer (2001) Curr . Opin . Biotech . 12(5):439-45]; [M. Bagdasarian & K. N. Timmis (1982) Curr . Topics Microbiol . Immunol. 96:47-67]; [T. Ishii 등 (1994) FEMS Microbiol . Lett . 116(3):307-13]; [I. N. Olekhnovich & Y. K. Fomichev (1994) Gene 140(1):63-65]; [M. Tsuda & T. Nakazawa (1993) Gene 136(1-2):257-62]; [C. Nieto 등 (1990) Gene 87(1):145-49]; [J. D. Jones & N. Gutterson (1987) Gene 61(3):299-306]; [M. Bagdasarian 등 (1981) Gene 16(1-3):237-47]; [H. P. Schweizer 등 (2001) Genet . Eng . (NY) 23:69-81]; [P. Mukhopadhyay 등 (1990) J. Bact. 172(1):477-80]; [D. O. Wood 등 (1981) J. Bact . 145(3):1448-51]; 및 [R. Holtwick 등 (2001) Microbiology 147 (Pt 2):337-44]에 기술된 것들이 포함된다.
슈도모나스 숙주 세포에서 유용할 수 있는 발현 벡터의 추가적인 예로는 지시된 레플리콘으로부터 유래된 표 5에 열거된 것들이 포함된다.
Figure 112006050327557-pct00005
발현 플라스미드 RSF1010은, 예를 들어, [F. Heffron 등 (1975) Proc . Nat'l Acad . Sci . USA 72(9):3623-27], 및 [K. Nagahari & K. Sakaguchi (1978) J. Bact. 133(3):1527-29]에 기술되어 있다. 플라스미드 RSF1010 및 이의 유도체는 본 발명에서 특히 유용한 벡터이다. 당업계에 공지된, RSF1010의 예시적인 유용한 유도체로는, 예를 들어, pKT212, pKT214, pKT231 및 관련된 플라스미드, 및pMYC1050 및 관련된 플라스미드 (예를 들어, Thomson 등의 미국 특허 제5,527,883호 및 제5,840,554호 참조), 예를 들어, pMYC1803이 포함된다. 플라스미드 pMYC1803은 RSF1010을 기초로 하는 플라스미드 pTJS260 (Wilcox의 미국 특허 제5,169,760호 참조)로부터 유래되고, 이는 RSF1010 플라스미드로부터의 복제 및 가동화 유전자좌 및 조절된 테트라사이클린 저항성 마커를 갖는다. 다른 예시적인 유용한 벡터로는 Puhler 등의 미국 특허 제4,680,264호에 기술된 것들이 포함된다.
한 실시양태에서, 발현 플라스미드가 발현 벡터로 사용된다. 또다른 실시양태에서, RSF1010 또는 이의 유도체가 발현 벡터로 사용된다. 또다른 실시양태에서는, pMYC1050 또는 이의 유도체, 또는 pMYC1803 또는 이의 유도체가 발현 벡터로 사용된다.
플라스미드 내에 또한 존재하는 선택 마커 유전자를 사용함으로써 플라스미드가 숙주 세포 내에서 유지될 수 있다. 선택 마커 유전자는 상응하는 항생제(들)이 발효 배지에 첨가되는, 항생제 저항성 유전자(들), 또는 당업계에 유용한 것으로 공지된 임의의 다른 유형의 선택 마커 유전자, 예를 들어, 상응하는 형질, 예를 들어, 생체촉매성 형질 예컨대 아미노산 생합성 또는 뉴클레오티드 생합성 형질 또는 탄소원 활용 형질에 대해 영양요구성인 숙주 세포에서 플라스미드가 사용되는 자가영양-복구 유전자일 수 있다.
분자 유전학 및 유전 공학 기술에 필요한 광범위한 서열 정보는 널리 공개적으로 입수가능하다. 포유류의 완전한 뉴클레오티드 서열, 뿐만 아니라 인간 유전자, cDNA 서열, 아미노산 서열 및 게놈에 대한 액세스(access)는 GenBank로부터 URL 주소 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Entrez에서 수득할 수 있다. 유전자 및 이의 생성물 및 생물의학 용도에 관한 정보가 통합되어 있는 전자 백과사전인 Weizmann Institute of Science Genome and Bioinformatics사의 GeneCards (http://bioinformatics.weizmann.ac.il/cards/)로부터 추가적인 정보를 또한 수득할 수 있고, 뉴클레오티드 서열 정보를 EMBL Nucleotide Sequence Database (http://www.ebi.ac.uk/embl/) 또는 DNA Databank of Japan (DDBJ, http://www.ddbj.nig.acjp/)으로부터 또한 수득할 수 있다; 아미노산 서열에 관한 정보에 대한 추가적인 사이트로는 Georgetown의 단백질 정보 리소스 웹사이트 (http://www-nbrf.georgetown.edu/pir/) 및 Swiss-Prot (http://au.expasy.org/sprot/sprot-top.html)가 포함된다.
형질전환
슈도모나스 숙주 세포를 벡터(들)로 형질전환시키는 것은 당업계에 공지된 임의의 형질전환 기술을 사용하여 수행할 수 있고, 박테리아성 숙주 세포는 손상되지 않은 세포로서 또는 원형질체로서 (즉 세포질 포함) 형질전환될 수 있다. 예시적인 형질전환 방법론에는 천공 방법론, 예를 들어, 전기천공, 원형질체 융합, 박테리아성 접합, 및 2가 양이온 처리, 예를 들어, 염화칼슘 처리 또는 CaCl/Mg2 + 처리, 또는 당업계에 주지된 기타 방법이 포함된다. 예를 들어, [Morrison (1977) J. Bact . 132:349-351]; [Clark-Curtiss & Curtiss (1983) Methods in Enzymology 101:347-362], [Sambrook 등 (1989) Molecular Cloning, A Laboratory Manual (2nd ed.)]; [Kriegler (1990) Gene Transfer and Expression : A Laboratory Manual]; 및 [Ausubel 등, eds. (1994) Current Protocols in Molecular Biology] 참조.
슈도모나스 유기체
본 명세서의 주요 발명은 슈도모나스 플루오레센스의 용도이지만, 다른 슈도모나스 및 밀접하게 관련된 박테리아 유기체가 유용할 수 있다. 슈도모나스 및 밀접하게 관련된 박테리아는 일반적으로 "그램(-) 프로테오박테리아(Proteobacteria) 아군 1" 또는 "그램-음성 호기성 간균 및 구균"으로 정의된 군의 일부이다 (Buchanan and Gibbons (eds.) (1974) Bergey's Manual of Determinative Bacteriology, pp. 217-289).
"그램 음성 호기성 간균 및 구균" (Bergey (1974))
I족. 슈도모나다시아에(Pseudomonadaceae) 글루코노박테르(Gluconobacter)
슈도모나스
잔토모나스(Xanthomonas)
주글로에아(Zoogloea)
II족 아조토박테라시아에(Azotobacteraceae) 아조모나스(Azomonas)
아조토박테르(Azotobacter)
베이제린키아(Beijerinckia)
데륵시아(Derxia)
III족. 리조비아시아에(Rhizobiaceae) 아그로박테리움(Agrobacterium)
리조비움(Rhizobium)
IV족. 메틸로모나다시아에(Methylomonadaceae) 메틸로코쿠스(Methylococcus)
메틸로모나스(Methylomonas)
V족. 할로박테리아시아에(Halobacteriaceae) 할로박테리움(Halobacterium)
할로코쿠스(Halococcus)
기타 속 아세토박테르(Acetobacter)
알칼리게네스(Alcaligenes)
보르데텔라(Bordetella)
브루셀라(Brucella)
프란시셀라(Francisella)
테르무스(Thermus)
"그램-음성 프로테오박테리아 아군 1"에는 분류에서 사용되는 기준에 따라 이러한 항목에 분류되는 프로테오박테리아가 또한 포함된다. 이 항목에는 이전에는 이러한 섹션으로 분류되었지만 더이상 그렇지 않은 군, 예컨대 문헌 [Bergey (1974)]에 정의된 바와 같은, 아시도보락스(Acidovorax), 브레분디모나스(Brevundimonas), 부르크홀데리아(Burkholderia), 히드로게노파가(Hydrogenophaga), 오세아니모나스(Oceanimonas), 랄스토니아(Ralstonia) 및 스테노트로포모나스(Stenotrophomonas) 속, 잔토모나스(Xanthomonas) 속에 속하는 (이전에는 잔토모나스 종(種)으로 칭해짐) 유기체를 재편성함으로써 창작된 스핀고모나스(Sphingomonas) 속 (및 이들로부터 유래된 블라스토모나스(Blastomonas) 속), 아세토박테르(Acetobacter) 속에 속하는 유기체들을 재편성함으로써 창작된 아시도모나스(Acidomonas) 속이 또한 포함된다. 또한, 숙주는 슈도모나스 속, 슈도모나스 에날리아(Pseudomonas enalia) (ATCC 14393), 슈도모나스 니그리파시엔스 (Pseudomonas nigrifaciens) (ATCC 19375) 및 슈도모나스 푸트레파시엔스(Pseudomonas putrefaciens) (ATCC 8071)로부터의 세포를 또한 포함하고, 이들은 각각 알테로모나스 할로플란크티스(Alteromonas haloplanktis), 알테로모나스 니그리파시엔스(Alteromonas nigrifaciens) 및 알테로모나스 푸트레파시엔스(Alteromonas putrefaciens)로 재분류되었다. 유사하게, 예를 들어, 슈도모나스 아시도보란스(Pseudomonas acidovorans) (ATCC 15668) 및 슈도모나스 테스토스테로니(Pseudomonas testosteroni) (ATCC 11996)는 각각 코마모나스 아시도보란스(Comamonas acidovorans) 및 코마모나스 테스토스테로니(Comamonas testosteroni)로 각각 재분류되었고; 슈도모나스 니그리파시엔스 (ATCC 19375) 및 슈도모나스 피스시다(Pseudomonas piscicida) (ATCC 15057)는 각각 슈도알테로모나스 니그리파시엔스(Pseudoalteromonas nigrifaciens) 및 슈도알테로모나스 피스시다(Pseudoalteromonas piscicida)로 재분류되었다. "그램-음성 프로테오박테리아 아군 1"은 하기의 과(科) 중 임의의 것에 속하는 것으로 분류된 프로테오박테리아를 또한 포함한다: 슈도모나다시아에, 아조토박테라시아에 (현재 종종 동의어인, 슈도모나다시아에의 "아조토박테르(Azotobacter) 군"으로 칭해짐), 리조비아시아에, 및 메틸로모나다시아에 (현재 종종 동의어인 "메틸로코카시아에(Methylococcaceae)"로 칭해짐). 결과적으로, 본 명세서에 다르게 기술된 이러한 속들에 더하여, "그램-음성 프로테오박테리아 아군 1"에 속하는 추가적인 프로테오박테리아 속은 1) 아조리조필루스(Azorhizophilus) 속의 아조토박테르 군 박테리아; 2) 셀비브리오(Cellvibrio), 올리겔라(Oligella) 및 테레디니박테르(Teredinibacter) 속의 슈도모나다시아에 과 박테리아; 3) 켈라토박테르(Chelatobacter), 엔시페르(Ensifer), 리베리박테르(Liberibacter) ("칸디다투스 리베리박테르(Candidatus Liberibacter)"로도 또한 칭해짐) 및 시노리조비움(Sinorhizobium) 속의 리조비아시아에 과 박테리아; 및 4) 메틸로박테르(Methylobacter), 메틸로칼둠(Methylocaldum), 메틸로미크로비움(Methylomicrobium), 메틸로사르시나(Methylosarcina), 및 메틸로스파에라(Methylosphaera) 속의 메틸로코카시아에 과 박테리아를 포함한다.
또다른 실시양태에서, 숙주 세포는 "그램-음성 프로테오박테리아 아군 2"로부터 선택된다. "그램-음성 프로테오박테리아 아군 2"는 하기 속의 프로테오박테리아의 군으로 정의된다 (카탈로그에 열거되고, 공개적으로 입수가능하며, 기탁된 균주의 전체 숫자가 괄호 안에 표시되고, 달리 표시되지 않는 한 모두 ATCC에 기탁됨): 아시도모나스 (2); 아세토박테르 (93); 글루코노박테르 (37); 브레분디모나스 (23); 베이제린키아 (13); 데륵시아 (2); 브루셀라 (4); 아그로박테리움 (79); 켈라토박테르 (2); 엔시페르 (3); 리조비움 (144); 시노리조비움 (24); 블라스토모나스 (1); 스핀고모나스 (27); 알칼리게네스 (88); 보르데텔라 (43); 부르크홀데리아 (73); 랄스토니아 (33); 아시도보락스 (20); 히드로게노파가 (9); 주글로에아 (9); 메틸로박테르 (2); 메틸로칼둠 (1, NCIMB에 기탁됨); 메틸로코쿠스 (2); 메틸로미크로비움 (2); 메틸로모나스 (9); 메틸로사르시나 (1); 메틸로스파에라; 아조모나스 (9); 아조리조필루스 (5); 아조토박테르 (64); 셀비브리오 (3); 올리겔라 (5); 슈도모나스 (1139); 프란시셀라 (4); 잔토모나스 (229); 스테노트로포모나스 (50); 및 오세아니모나스 (4).
"그램-음성 프로테오박테리아 아군 2"의 예시적인 숙주 세포 종으로는 하기의 박테리아들이 포함되지만 이에 한정되지는 않는다 (예시적인 균주(들)의 ATCC 또는 기타 기탁 번호를 괄호 안에 나타냄): 아시도모나스 메타놀리카(Acidomonas methanolica) (ATCC 43581); 아세토박테르 아세티(Acetobacter aceti) (ATCC 15973); 글루코노박테르 옥시단스(Gluconobacter oxydans) (ATCC 19357); 브레분디모나스 디미누타(Brevundimonas diminuta) (ATCC 11568); 베이제린키아 인디카(Beijerinckia indica) (ATCC 9039 및 ATCC 19361); 데륵시아 굼모사(Derxia gummosa) (ATCC 15994); 브루셀라 멜리텐시스(Brucella melitensis) (ATCC 23456), 브루셀라 아보르투스(Brucella abortus) (ATCC 23448); 아그로박테리움 투메파시엔스(Agrobacterium tumefaciens) (ATCC 23308), 아그로박테리움 라디오박테르(Agrobacterium radiobacter) (ATCC 19358), 아그로박테리움 리조게네스(Agrobacterium rhizogenes) (ATCC 11325); 켈라토박테르 헤인트지이(Chelatobacter heintzii) (ATCC 29600); 엔시페르 아드하에렌스(Ensifer adhaerens) (ATCC 33212); 리조비움 레구미노사룸(Rhizobium leguminosarum) (ATCC 10004); 시노리조비움 프레디이(Sinorhizobium fredii) (ATCC 35423); 블라스토모나스 나타토리아(Blastomonas natatoria) (ATCC 35951); 스핀고모나스 파우시모빌리스(Sphingomonas paucimobilis) (ATCC 29837); 알칼리게네스 파에칼리스(Alcaligenes faecalis) (ATCC 8750); 보르데텔라 페르투시스(Bordetella pertussis) (ATCC 9797); 부르크홀데리아 세파시아(Burkholderia cepacia) (ATCC 25416); 랄스토니아 피케티이(Ralstonia pickettii) (ATCC 27511); 아시도보락스 파실리스(Acidovorax facilis) (ATCC 11228); 히드로게노파가 플라바(Hydrogenophaga flava) (ATCC 33667); 주글로에아 라미게라(Zoogloea ramigera) (ATCC 19544); 메틸로박테르 루테우스(Methylobacter luteus) (ATCC 49878); 메틸로칼둠 그라실레(Methylocaldum gracile) (NCIMB 11912); 메틸로코쿠스 캅술라투스(Methylococcus capsulatus) (ATCC 19069); 메틸로미크로비움 아길레(Methylomicrobium agile) (ATCC 35068); 메틸로모나스 메타니카(Methylomonas methanica) (ATCC 35067); 메틸로사르시나 피브라타(Methylosarcina fibrata) (ATCC 700909); 메틸로스파에라 한소니이(Methylosphaera hansonii) (ACAM 549); 아조모나스 아길리스(Azomonas agilis) (ATCC 7494); 아조리조필루스 파스팔리(Azorhizophilus paspali) (ATCC 23833); 아조박테르 크로오코쿰(Azotobacter chroococcum) (ATCC 9043); 셀비브리오 믹스투스(Cellvibrio mixtus) (UQM 2601); 올리겔라 우레트랄리스(Oligella urethralis) (ATCC 17960); 슈도모나스 아에루기노사(Pseudomonas aeruginosa) (ATCC 10145), 슈도모나스 플루오레센스 (ATCC 35858); 프란시셀라 툴라렌시스(Francisella tularensis) (ATCC 6223); 스테노트로포모나스 말토필리아(Stenotrophomonas maltophilia) (ATCC 13637); 잔토모나스 캄페스트리스(Xanthomonas campestris) (ATCC 33913); 및 오세아니모나스 도우도로피이(Oceanimonas doudoroffii) (ATCC 27123).
또다른 실시양태에서, 숙주 세포 "그램-음성 프로테오박테리아 아군 3"으로부터 선택된다. "그램-음성 프로테오박테리아 아군 3"은 하기 속의 프로테오박테리아의 군으로 정의된다: 브레분디모나스; 아그로박테리움; 리조비움; 시노리조비움; 블라스토모나스; 스핀고모나스; 알칼리게네스; 부르크홀데리아; 랄스토니아; 아시도보락스; 히드로게노파가; 메틸로박테르; 메틸로칼둠; 메틸로코쿠스; 메틸로미크로비움; 메틸로모나스; 메틸로사르시나; 메틸로스파에라; 아조모나스; 아조리조필루스; 아조박테르; 셀비브리오; 올리겔라; 슈도모나스; 테레디니박테르; 프란시셀라; 스테노트로포모나스; 잔토모나스; 및 오세아니모나스.
또다른 실시양태에서, 숙주 세포는 "그램-음성 프로테오박테리아 아군 4"로부터 선택된다. "그램-음성 프로테오박테리아 아군 4"는 하기 속의 프로테오박테리아의 군으로 정의된다: 브레분디모나스; 블라스토모나스; 스핀고모나스; 부르크홀데리아; 랄스토니아; 아시도보락스; 히드로게노파가; 메틸로박테르; 메틸로칼둠; 메틸로코쿠스; 메틸로미크로비움; 메틸로모나스; 메틸로사르시나; 메틸로스파에라; 아조모나스; 아조리조필루스; 아조토박테르; 셀비브리오; 올리겔라; 슈도모나스; 테레디니박테르; 프란시셀라; 스테노트로포모나스; 잔토모나스; 및 오세아니모나스.
한 실시양태에서, 숙주 세포는 "그램-음성 프로테오박테리아 아군 5"로부터 선택된다. "그램-음성 프로테오박테리아 아군 5"는 하기 속의 프로테오박테리아의 군으로 정의된다: 메틸로박테르; 메틸로칼둠; 메틸로코쿠스; 메틸로미크로비움; 메틸로모나스; 메틸로사르시나; 메틸로스파에라; 아조모나스; 아조리조필루스; 아조토박테르; 셀비브리오; 올리겔라; 슈도모나스; 테레디니박테르; 프란시셀라; 스테노트로포모나스; 잔토모나스; 및 오세아니모나스.
숙주 세포는 "그램-음성 프로테오박테리아 아군 6"으로부터 선택될 수 있다. "그램-음성 프로테오박테리아 아군 6"은 하기 속의 프로테오박테리아의 군으로 정의된다: 브레분디모나스; 블라스토모나스; 스핀고모나스; 부르크홀데리아; 랄스토니아; 아시도보락스; 히드로게노파가; 아조모나스; 아조리조필루스; 아조토박테르; 셀비브리오; 올리겔라; 슈도모나스; 테레디니박테르; 스테노트로포모나스; 잔토모나스; 및 오세아니모나스.
숙주 세포는 "그램-음성 프로테오박테리아 아군 7"로부터 선택될 수 있다. "그램-음성 프로테오박테리아 아군 7"은 하기 속의 프로테오박테리아의 군으로 정의된다: 아조모나스; 아조리조필루스; 아조박테르; 셀비브리오; 올리겔라; 슈도모나스; 테레디니박테르; 스테노트로포모나스; 잔토모나스; 및 오세아니모나스.
숙주 세포는 "그램-음성 프로테오박테리아 아군 8"로부터 선택될 수 있다. "그램-음성 프로테오박테리아 아군 8"은 하기 속의 프로테오박테리아의 군으로 정의된다: 브레분디모나스; 블라스토모나스; 스핀고모나스; 부르크홀데리아; 랄스토니아; 아시도보락스; 히드로게노파가; 슈도모나스; 스테노트로포모나스; 잔토모나스; 및 오세아니모나스.
숙주 세포는 "그램-음성 프로테오박테리아 아군 9"로부터 선택될 수 있다. "그램-음성 프로테오박테리아 아군 9"는 하기 속의 프로테오박테리아의 군으로 정의된다: 브레분디모나스; 부르크홀데리아; 랄스토니아; 아시도보락스; 히드로게노파가; 슈도모나스; 스테노트로포모나스; 및 오세아니모나스.
숙주 세포는 "그램-음성 프로테오박테리아 아군 10"으로부터 선택될 수 있다. "그램-음성 프로테오박테리아 아군 10"은 하기 속의 프로테오박테리아의 군으로 정의된다: 부르크홀데리아; 랄스토니아; 슈도모나스; 스테노트로포모나스; 및 잔토모나스.
숙주 세포는 "그램-음성 프로테오박테리아 아군 11"로부터 선택될 수 있다. "그램-음성 프로테오박테리아 아군 11"은 하기 속의 프로테오박테리아의 군으로 정의된다: 슈도모나스; 스테노트로포모나스; 및 잔토모나스. 숙주 세포는 "그램-음성 프로테오박테리아 아군 12"로부터 선택될 수 있다. "그램-음성 프로테오박테리아 아군 12"는 하기 속의 프로테오박테리아의 군으로 정의된다: 부르크홀데리아; 랄스토니아; 슈도모나스. 숙주 세포는 "그램-음성 프로테오박테리아 아군 13"으로부터 선택될 수 있다. "그램-음성 프로테오박테리아 아군 13"은 하기 속의 프로테오박테리아의 군으로 정의된다: 부르크홀데리아; 랄스토니아; 슈도모나스; 및 잔토모나스. 숙주 세포는 "그램-음성 프로테오박테리아 아군 14"로부터 선택될 수 있다. "그램-음성 프로테오박테리아 아군 14"는 하기 속의 프로테오박테리아의 군으로 정의된다: 슈도모나스 및 잔토모나스. 숙주 세포는 "그램-음성 프로테오박테리아 아군 15"로부터 선택될 수 있다. "그램-음성 프로테오박테리아 아군 15"는 슈도모나스 속의 프로테오박테리아의 군으로 정의된다.
숙주 세포는 "그램-음성 프로테오박테리아 아군 16"으로부터 선택될 수 있다. "그램-음성 프로테오박테리아 아군 16"은 하기의 슈도모나스 종의 프로테오박테리아의 군으로 정의된다 (예시적인 균주(들)의 ATCC 또는 기타 기탁 번호를 괄호 안에 나타냄): 슈도모나스 아비에타니필라(P. abietaniphila) (ATCC 700689); 슈도모나스 아에루기노사(P. aeruginosa) (ATCC 10145); 슈도모나스 알칼리게네스(P. alcaligenes) (ATCC 14909); 슈도모나스 안구일리셉티카(P. anguilliseptica) (ATCC 33660); 슈도모나스 시트로넬로리스(P. citronellolis) (ATCC 13674); 슈도모나스 플라베센스(P. flavescens) (ATCC 51555); 슈도모나스 멘도시나(P. mendocina) (ATCC 25411); 슈도모나스 니트로레두센스(P. nitroreducens) (ATCC 33634); 슈도모나스 올레오보란스(P. oleovorans) (ATCC 8062); 슈도모나스 슈도알칼리게네스(P. pseudoalcaligenes) (ATCC 17440); 슈도모나스 레시노보란스(P. resinovorans) (ATCC 14235); 슈도모나스 스트라미네아(P. straminea) (ATCC 33636); 슈도모나스 아가리시(P. agarici) (ATCC 25941); 슈도모나스 알칼리필라(P. alcaliphila); 슈도모나스 알기노보라(P. alginovora); 슈도모나스 안데르소니이(P. andersonii); 슈도모나스 아스플레니이(P. asplenii) (ATCC 23835); 슈도모나스 아젤라이카(P. azelaica) (ATCC 27162); 슈도모나스 베이제린키이(P. beijerinckii) (ATCC 19372); 슈도모나스 보레알리스(P. borealis); 슈도모나스 보레오폴리스(P. boreopolis) (ATCC 33662); 슈도모나스 브라시카세아룸(P. brassicacearum); 슈도모나스 부타노보라(P. butanovora) (ATCC 43655); 슈도모나스 셀룰로사(P. cellulosa) (ATCC 55703); 슈도모나스 아우란티아카(P. aurantiaca) (ATCC 33663); 슈도모나스 클로라피스(P. chlororaphis) (ATCC 9446, ATCC 13985, ATCC 17418, ATCC 17461); 슈도모나스 프라기(P. fragi) (ATCC 4973); 슈도모나스 룬덴시스(P. lundensis) (ATCC 49968); 슈도모나스 타에트로렌스(P. taetrolens) (ATCC 4683); 슈도모나스 시스시콜라(P. cissicola) (ATCC 33616); 슈도모나스 코로나파시엔스(P. coronafaciens); 슈도모나스 디테르페니필라(P. diterpeniphila); 슈도모나스 엘론가타(P. elongata) (ATCC 10144); 슈도모나스 플렉텐스(P. flectens) (ATCC 12775); 슈도모나스 아조토포르만스(P. azotoformans); 슈도모나스 브레네리(P. brenneri); 슈도모나스 세드렐라(P. cedrella); 슈도모나스 코루가타(P. corrugata) (ATCC 29736); 슈도모나스 엑스트리모리엔탈리스(P. extremorientalis); 슈도모나스 플루오레센스 (ATCC 35858); 슈도모나스 게사르디이(P. gessardii); 슈도모나스 리바넨시스(P. libanensis); 슈도모나스 만델리이(P. mandelii) (ATCC 700871); 슈도모나스 마르기날리스(P. marginalis) (ATCC 10844); 슈도모나스 미구라에(P. migulae); 슈도모나스 무시도렌스(P. mucidolens) (ATCC 4685); 슈도모나스 오리엔탈리스(P. orientalis); 슈도모나스 로데시아에(P. rhodesiae); 슈도모나스 신잔타(P. synxantha) (ATCC 9890); 슈도모나스 톨라아시이(P. tolaasii) (ATCC 33618); 슈도모나스 베로니이(P. veronii) (ATCC 700474); 슈도모나스 프레데릭스베르겐시스(P. frederiksbergensis); 슈도모나스 게니쿨라타(P. geniculata) (ATCC 19374); 슈도모나스 긴게리(P. gingeri); 슈도모나스 그라미니스(P. graminis); 슈도모나스 그리몬티이(P. grimontii); 슈도모나스 할로데니트리피칸스(P. halodenitrificans); 슈도모나스 할로필라(P. halophila); 슈도모나스 히비시콜라(P. hibiscicola) (ATCC 19867); 슈도모나스 후티엔시스(P. huttiensis) (ATCC 14670); 슈도모나스 히드로게노보라(P. hydrogenovora); 슈도모나스 제세니이(P. jessenii) (ATCC 700870); 슈도모나스 킬로넨시스(P. kilonensis); 슈도모나스 란세올라타(P. lanceolata) (ATCC 14669); 슈도모나스 리니(P. lini); 슈도모나스 마르기나타(P. marginata) (ATCC 25417); 슈도모나스 메피티카(P. mephitica) (ATCC 33665); 슈도모나스 데니트리피칸스(P. denitrificans) (ATCC 19244); 슈도모나스 페르투시노게나(P. pertucinogena) (ATCC 190); 슈도모나스 픽토룸(P. pictorum) (ATCC 23328); 슈도모나스 사이크로필라(P. psychrophila); 슈도모나스 풀바(P. fulva) (ATCC 31418); 슈도모나스 몬테일리이 (P. monteilii) (ATCC 700476); 슈도모나스 모셀리이(P. mosselii); 슈도모나스 오리지하비탄스(P. oryzihabitans) (ATCC 43272); 슈도모나스 플레코글로시시다(P. plecoglossicida) (ATCC 700383); 슈도모나스 푸티다(P. putida) (ATCC 12633); 슈도모나스 리악탄스(P. reactans); 슈도모나스 스피노사(P. spinosa) (ATCC 14606); 슈도모나스 발레아리카(P. balearica); 슈도모나스 루테올라(P. luteola) (ATCC 43273); 슈도모나스 스투트제리(P. stutzeri) (ATCC 17588); 슈도모나스 아미그달리(P. amygdali) (ATCC 33614); 슈도모나스 아벨라나에(P. avellanae) (ATCC 700331); 슈도모나스 카리카파파야에(P. caricapapayae) (ATCC 33615); 슈도모나스 시코리이(P. cichorii) (ATCC 10857); 슈도모나스 피쿠세렉타에(P. ficuserectae) (ATCC 35104); 슈도모나스 푸스코바기나에(P. fuscovaginae); 슈도모나스 멜리아에(P. meliae) (ATCC 33050); 슈도모나스 시린가에(P. syringae) (ATCC 19310); 슈도모나스 비리디플라바(P. viridiflava) (ATCC 13223); 슈도모나스 테르모카르복시도보란스(P. thermocarboxydovorans) (ATCC 35961); 슈도모나스 테르모톨레란스(P. thermotolerans); 슈도모나스 티베르발렌시스(P. thivervalensis); 슈도모나스 반코우베렌시스(P. vancouverensis) (ATCC 700688); 슈도모나스 위스콘시넨시스(P. wisconsinensis); 및 슈도모나스 시아메넨시스(P. xiamenensis).
숙주 세포는 "그램-음성 프로테오박테리아 아군 17"로부터 선택될 수 있다. "그램-음성 프로테오박테리아 아군 17"은 하기의 슈도모나스 종에 예를 들어 속하는 것들이 포함되는, "형광성 슈도모나드"로 당업계에 공지된 프로테오박테리아의 군으로 정의된다: 슈도모나스 아조토포르만스; 슈도모나스 브레네리; 슈도모나스 세드렐라; 슈도모나스 코루가타; 슈도모나스 엑스트리모리엔탈리스; 슈도모나스 플루오레센스; 슈도모나스 게사르디이; 슈도모나스 리바넨시스; 슈도모나스 만델리이; 슈도모나스 마르기날리스; 슈도모나스 미구라에; 슈도모나스 무시도렌스; 슈도모나스 오리엔탈리스; 슈도모나스 로데시아에; 슈도모나스 신잔타; 슈도모나스 톨라아시이; 및 슈도모나스 베로니이.
숙주 세포는 "그램(-) 프로테오박테리아 아군 18"로부터 선택될 수 있다. "그램(-) 프로테오박테리아 아군 18"은 하기에 예를 들어 속하는 것들이 포함되는, 슈도모나스 플루오레센스 종의 모든 아종(亞種), 변종, 균주 및 기타 하위분야 단위의 군으로 정의된다 (예시적인 균주(들)의 ATCC 또는 기타 기탁 번호를 괄호 안에 나타냄): 생물변이형 1 또는 생물변이형 I로도 칭해지는 슈도모나스 플루오레센스 생물형 A (ATCC 13525); 생물변이형 2 또는 생물변이형 II로도 칭해지는 슈도모나스 플루오레센스 생물형 B (ATCC 17816); 생물변이형 3 또는 생물변이형 III으로도 칭해지는 슈도모나스 플루오레센스 생물형 C (ATCC 17400); 생물변이형 4 또는 생물변이형 IV로도 칭해지는 슈도모나스 플루오레센스 생물형 F (ATCC 12983); 생물변이형 5 또는 생물변이형 V로도 칭해지는 슈도모나스 플루오레센스 생물형 G (ATCC 17518); 슈도모나스 플루오레센스 생물변이형 VI; 슈도모나스 플루오레센스 Pf0-1; 슈도모나스 플루오레센스 Pf-5 (ATCC BAA-477); 슈도모나스 플루오레센스 SBW25; 및 슈도모나스 플루오레센스 아종 셀룰로사 (NCIMB 10462).
숙주 세포는 "그램(-) 프로테오박테리아 아군 19"로부터 선택될 수 있다. "그램(-) 프로테오박테리아 아군 19"는 슈도모나스 플루오레센스 생물형 A의 모든 균주의 군으로 정의된다. 이러한 생물형의 특정 균주는 슈도모나스 플루오레센스 균주 MB101 (Wilcox의 미국 특허 제5,169,760호 참조), 및 이의 유도체이다. 이의 유도체의 예는 MB101 염색체 asd (aspartate dehydrogenase gene: 아스파테이트 탈수소효소 유전자) 유전자좌에 천연 대장균 PlacI-lacI-lacZYA 구축물을 삽입함(즉, PlacZ가 결실됨)으로써 구축된 슈도모나스 플루오레센스 균주 MB214이다.
한 실시양태에서, 숙주 세포는 슈도모나달레스(Pseudomonadales) 목(目)의 임의의 프로테오박테리아이다. 특정 실시양태에서, 숙주 세포는 슈도모나다시아에(Pseudomonadaceae) 과(科)의 임의의 프로테오박테리아이다.
본 발명에서 사용될 수 있는 추가적인 슈도모나스 플루오레센스 균주로는 하기의 ATCC 명칭을 갖는, 슈도모나스 플루오레센스 미굴라(Migula) 및 슈도모나스 플루오레센스 로이토키톡(Loitokitok)이 포함된다: (NCIB 8286); NRRL B-1244; NCIB8865 균주 CO1; NCIB8866 균주 CO2; 1291 (ATCC 17458; IFO 15837; NCIB 8917; LA; NRRL B-1864; 피롤리딘; PW2 (ICMP 3966; NCPPB 967; NRRL B-899); 13475; NCTC 10038; NRRL B-1603 (6; IFO 15840); 52-1C; CCEB488-A (BU 140); CCEB 553 (IEM 15/47); IAM 1008 (AHH-27); IAM 1055 (AHH-23); 1 (IFO 15842); 12 (ATCC 25323; NIH 11; den Dooren de Jong 216); 18 (IFO 15833; WRRL P-7); 93(TR-10); 108 (52-22; IFO 15832); 143 (IFO 15836; PL); 149 (2-40-40; IFO 15838); 182 (IFO 3081; PJ 73); 184 (IFO 15830); 185 (W2 L-1); 186 (IFO 15829; PJ 79); 187 (NCPPB 263); 188 (NCPPB 316); 189 (PJ 227; 1208); 191 (IFO 15834; PJ 236; 22/1); 194 (Klinge R-60; PJ 253); 196 (PJ 288); 197 (PJ 290); 198 (PJ 302); 201 (PJ 368); 202 (PJ 372); 203 (PJ 376); 204 (IFO 15835; PJ 682); 205 (PJ 686); 206 (PJ 692); 207 (PJ 693); 208 (PJ 722); 212 (PJ 832); 215 (PJ 849); 216 (PJ 885); 267 (B-9); 271 (B-1612); 401 (C71A; IFO 15831; PJ 187); NRRL B-3178 (4; IFO 15841); KY8521; 3081; 30-21; (IFO 3081); N; PYR; PW; D946-B83 (BU 2183; FERM-P3328); P-2563 (FERM-P 2894; IFO 13658);IAM-1126 (43F); M-1; A506 (A5-06); A505 (A5-05-1); A526 (A5-26); B69; 72; NRRL B-4290; PMW6 (NCIB 11615); SC 12936; A1 (IFO 15839); F 1847 (CDC-EB); F 1848 (CDC 93); NCIB 10586; P17; F-12; AmMS 257; PRA25; 6133D02; 6519E01; N1; SC15208; BNL-WVC; NCTC2583 (NCIB 8194); H13; 1013 (ATCC 11251; CCEB 295); IFO 3903; 1062; 또는 Pf-5.
발효
용어 "발효"는 문헌적인 발효가 이용되는 실시양태와 다른 비발효성 배양 모드가 이용되는 실시양태 모두를 포함한다. 발효는 임의의 규모로 수행될 수 있다. 한 실시양태에서, 발효 배지는 농축 배지(rich media), 최소 배지, 및 무기염 배지로 구성되는 군으로부터 선택될 수 있다; 농축 배지는 사용될 수 있지만, 전형적으로는 회피된다. 또다른 실시양태에서 최소 배지 또는 무기염 배지가 선택된다. 또다른 실시양태에서는, 최소 배지가 선택된다.
무기염 배지는 무기염, 및 예를 들어 글루코스, 수크로스 또는 글리세롤과 같은 탄소 공급원으로 구성된다. 무기염 배지의 예로는, 예를 들어, M9 배지, 슈도모나스 배지 (ATCC 179), 데이비스 앤드 밍지올리(Davis and Mingioli) 배지 ([BD Davis & ES Mingioli (1950) J. Bact. 60:17-28] 참조)가 포함된다. 무기염 배지를 만들기 위해 사용되는 무기염에는, 예를 들어, 인산칼륨, 황산암모늄 또는 염화암모늄, 황산마그네슘 또는 염화마그네슘, 및 미량의 무기물 예컨대 염화칼슘, 철, 구리, 망간 및 아연의 황산염, 및 붕산염으로부터 선택되는 것들이 포함된다. 전형적으로, 유기 질소 공급원, 예컨대 펩톤, 트립톤, 아미노산 또는 효모 추출물은 무기염 배지에 포함되지 않는다. 그 대신, 무기 질소 공급원이 사용되고, 이는, 예를 들어, 암모늄 염, 수성 암모니아 및 기체성 암모니아로부터 선택될 수 있다. 무기염 배지는 전형적으로 글루코스를 탄소 공급원으로 함유할 것이다. 무기염 배지와 비교하면, 최소 배지 또한 무기염 및 탄소 공급원을 함유할 수 있지만, 예를 들어 낮은 수준의 아미노산, 비타민, 펩톤 또는 기타 성분이, 비록 매우 최소한도의 수준으로 첨가되지만, 첨가될 수 있다.
한 실시양태에서, 배지는 하기의 표 7에 열거된 성분을 사용하여 제조할 수 있다. 성분들은 하기의 순서로 첨가될 수 있다: 먼저 (NH4)HPO4, KH2PO4 및 시트르산을 약 30 ℓ의 증류수에 용해시킬 수 있다; 이어서 미량 원소의 용액을 첨가한 후, 소포제, 예컨대 Ucolub N 115를 첨가할 수 있다. 이어서, 열 살균 (예컨대 약 121 ℃에서) 후, 글루코스 MgSO4 및 티아민-HCl의 살균 용액을 첨가할 수 있다. pH를 약 6.8로 제어하는 것은 수성 암모니아를 사용하여 달성할 수 있다. 이어서 살균 증류수를 첨가하여 초기 부피를 371 - 글리세롤 모액 (123 ㎖)으로 조정할 수 있다. 화학물질은 다양한 공급원, 예컨대 Merck로부터 시판된다. 슈도모나스 종 및 관련 박테리아의 성장을 위해 이러한 배지에서 높은 세포 밀도 배양 (HCDC: high cell density cultivation)이 일어나도록 할 수 있다. HCDC는 배치 공정으로 시작될 수 있고, 2단계 페드-배치(fed-batch) 배양이 이어진다. 배치 파트에서의 궁극적인 성장 후, 생물량 농도가 수배 증가할 수 있는 3회의 배가 시간의 기간에 걸쳐, 감소된 특정 성장 속도로 성장이 제어될 수 있다. 이같은 배양 절차에 대한 상세사항은 [Riesenberg, D 등 (1991) "High cell density cultivation of Escherichia coli at controlled specific growth rate" J Biotechnol 20(1):17-27]에 기술되어 있다.
Figure 112006050327557-pct00006
본 발명에 따른 발현 시스템은 임의의 발효 형식으로 배양될 수 있다. 예를 들어, 배치, 페드-배치, 반-연속 및 연속 발효 모드가 본원에서 사용될 수 있다.
본 발명에 따른 발현 시스템은 임의 규모 (즉, 부피)의 발효로의 트랜스진 발현에 유용하다. 따라서, 예를 들어, 마이크로리터 규모, 센티리터 규모, 및 데시리터 규모의 발효 부피가 사용될 수 있고; 1 리터 규모 및 더 큰 발효 부피가 사용될 수 있다. 한 실시양태에서, 발효 부피는 1 리터 이상일 것이다. 또다른 실시양태에서, 발효 부피는 5 리터 이상, 10 리터 이상, 15 리터 이상, 20 리터 이상, 25 리터 이상, 50 리터 이상, 75 리터 이상, 100 리터 이상, 200 리터 이상, 500 리터 이상, 1,000 리터 이상, 2,000 리터 이상, 5,000 리터 이상, 10,000 리터 이상 또는 50,000 리터 이상일 것이다.
본 발명에서, 형질전환된 숙주 세포의 성장, 배양 및/또는 발효는 숙주 세포의 생존을 허용하는 온도 범위, 예컨대 약 4 ℃ 내지 약 55 ℃ (경계 포함) 범위 내의 온도에서 수행된다. 또한, "성장"은 활성 세포 분열 및/또는 확장의 생물학적 상태, 뿐만 아니라 분열하지 않고/않거나 확장되지 않는 세포가 대사적으로 유지되는 생물학적 상태 모두를 지시하도록 사용되고, 후자의 생물학적 상태에 대해 사용될 때는 용어 "유지"와 동의어이다.
세포 밀도
재조합 포유류 단백질의 발현에서 슈도모나스 플루오레센스를 사용하는 것의 추가적인 장점에는 대장균 또는 기타 박테리아 발현 시스템과 비교하여 높은 세포 밀도로 성장할 수 있는 슈도모나스 플루오레센스의 용량이 포함된다. 이 때문에, 본 발명에 따른 슈도모나스 플루오레센스 발현 시스템은 약 20 g/ℓ 이상의 세포 밀도를 제공할 수 있다. 게다가 본 발명에 따른 슈도모나스 플루오레센스 발현 시스템은 부피 당 생물량의 단위로 제시되면 약 70 g/ℓ 이상의 세포 밀도를 제공할 수 있고, 이때 생물량은 건조 세포 중량으로 측정된다.
한 실시양태에서, 세포 밀도는 20 g/ℓ 이상일 것이다. 또다른 실시양태에서, 세포 밀도는 25 g/ℓ 이상, 30 g/ℓ 이상, 35 g/ℓ 이상, 40 g/ℓ 이상, 45 g/ℓ 이상, 50 g/ℓ 이상, 60 g/ℓ 이상, 70 g/ℓ 이상, 80 g/ℓ 이상, 90 g/ℓ 이상, 100 g/ℓ 이상, 110 g/ℓ 이상, 120 g/ℓ 이상, 130 g/ℓ 이상, 140 g/ℓ 이상, 또는 150 g/ℓ 이상일 것이다.
또다른 실시양태에서, 유도 시 세포 밀도는 20 g/ℓ 내지 150 g/ℓ 사이; 20 g/ℓ 내지 120 g/ℓ 사이; 20 g/ℓ 내지 80 g/ℓ 사이; 25 g/ℓ 내지 80 g/ℓ 사이; 30 g/ℓ 내지 80 g/ℓ 사이; 35 g/ℓ 내지 80 g/ℓ 사이; 40 g/ℓ 내지 80 g/ℓ 사이; 45 g/ℓ 내지 80 g/ℓ 사이; 50 g/ℓ 내지 80 g/ℓ 사이; 50 g/ℓ 내지 75 g/ℓ 사이; 50 g/ℓ 내지 70 g/ℓ 사이; 40 g/ℓ 내지 80 g/ℓ 사이일 것이다.
단리 및 정제
본 발명의 단백질은 황산암모늄 또는 에탄올 침전, 산 추출, 음이온 또는 양이온 교환 크로마토그래피, 포스포셀룰로스 크로마토그래피, 소수성 상호작용 크로마토그래피, 친화 크로마토그래피, 니켈 크로마토그래피, 히드록실아파타이트 크로마토그래피, 역상 크로마토그래피, 렉틴 크로마토그래피, 예비 전기영동, 세제 가용화, 컬럼 크로마토그래피와 같은 물질로의 선택 침전, 면역정제 방법 등이 포함되지만 이에 한정되지 않는 당업계에 주지된 표준 기술에 의해 실질적인 순도로 단리 및 정제될 수 있다. 예를 들어, 분자 부착성이 확립된 단백질은 리간드와 가역적으로 융합될 수 있다. 적절한 리간드와 함께, 단백질이 정제 컬럼에 선택적으로 부착된 후, 비교적 순수한 형태로 컬럼으로부터 유리될 수 있다. 이어서 융합된 단백질을 효소적 활성에 의해 제거한다. 또한, 면역친화 컬럼 또는 Ni-NTA 컬럼을 사용하여 단백질을 정제할 수 있다. 일반적인 기술은, 예를 들어, [R. Scopes (1982) Protein Purification : Principles and Practice, Springer- Verlag: N. Y.]; [Deutscher (1990) Guide to Protein Purification, Academic Press]; 미국 특허 제4,511,503호; [S. Roe (2001) Protein Purification Techniques: A Practical Approach, Oxford Press]; [D. Bollag, 등 (1996) Protein Methods, Wiley-Lisa, Inc.]; [AK Patra 등 (2000) Protein Expr Purif , 18(2):182-92]; 및 [R. Mukhija, 등 (1995) Gene 165 (2):303-6]에 추가로 기술되어 있다. 또한, 예를 들어, [Deutscher (1990) "Guide to Protein Purification," Methods in Enzymology vol. 182] 및 이러한 시리즈의 다른 권(略); [Coligan, 등 (1996 및 정기적인 증보판) Current Protocols in Protein Science, Wiley/Greene, NY]; 및 단백질 정제 생성물의 사용에 대한 제조업자, 예를 들어, Pharmacia (Piscataway, N. J.) 또는 Bio-Rad (Richmond, Calif.)의 문헌 참조. 재조합 기술과의 조합은 적절한 절편에, 예를 들어, 프로테아제가 제거가능한 서열을 통해 융합될 수 있는 FLAG 서열 또는 등가물에 융합되도록 한다. 또한, 예를 들어, [Hochuli (1989) Chemische Industrie 12:69-70]; [Hochuli (1990) "Purification of Recombinant Proteins with Metal Chelate Absorbent" in Setlow (ed.) Genetic Engineering , Principle and Methods 12:87-98, Plenum Press, NY]; 및 [Crowe, 등 (1992) QIAexpress : The High Level Expression & Protein Purification System QUIAGEN, Inc., Chatsworth, Calif.] 참조.
발현된 단백질의 검출은 당업계에 공지된 방법에 의해 달성될 수 있고, 예를 들어, 방사능면역 검정법, 웨스턴 블롯팅 기술 또는 면역침전법이 포함된다.
재조합적으로 제조 및 발현된 효소는 수많은 방법에 의해 재조합 세포 배양물로부터 회수 및 정제될 수 있고, 예를 들어, 고성능 액체 크로마토그래피 (HPLC)를 필요하다면 최종 정제 단계에서 사용할 수 있다.
본 발명에서 발현된 특정 단백질은 불용성 응집물 ("봉입체")을 형성할 수 있다. 여러 프로토콜이 봉입체로부터 단백질을 정제하는데 적절하다. 예를 들어, 봉입체의 정제에는 숙주 세포의 파열에 의한, 예를 들어, 50 mM TRIS/HCl pH 7.5, 50 mM NaCl, 5 mM MgCl2, 1 mM DTT, 0.1 mM ATP 및 1 mM PMSF의 완충액에서의 인큐베이션에 의한 봉입체의 추출, 분리 및/또는 정제가 전형적으로 수반된다. 전형적으로 세포 현탁액을 프렌치 프레스(French Press)에 2-3회 통과시켜 용균시킨다. 또한 세포 현탁액을 Polytron (Brinkman Instruments)을 사용하여 균질화시키거나, 얼음 상에서 초음파처리할 수 있다. 박테리아의 별법적인 용균 방법은 당업자에게 명백하다 (예를 들어, [Sambrook, J., E. F. Fritsch and T. Maniatis eds.(1989) "Molecular Cloning: A Laboratory Manual", 2ded., Cold Spring Harbor Laboratory Press]; [Ausubel 등, eds. (1994) Current Protocols in Molecular Biology] 참조).
필요하다면, 봉입체가 가용화될 수 있고, 용균된 세포 현탁액을 전형적으로 원심분리하여 원치 않는 불용성 물질을 제거할 수 있다. 봉입체를 형성한 단백질은 상용성 완충액으로의 희석 또는 투석에 의해 복원될 수 있다. 적절한 용매로는, 요소 (약 4 M 내지 8 M), 포름아미드 (부피/부피 기준으로 약 80 ％ 이상) 및 구아니딘 히드로클로라이드 (약 4 M 내지 약 8 M)가 포함되지만 이에 한정되지는 않는다. 구아니딘 히드로클로라이드 및 유사한 작용제는 변성제이지만, 이러한 변성은 비가역적이 아니고, 변성제의 제거 (예를 들어, 투석에 의한 제거) 또는 희석 시 복원이 일어나서, 면역학적으로 및/또는 생물학적으로 활성인 단백질이 재형성될 수 있다. 기타 적절한 완충액은 당업자에게 공지되어 있다.
별법으로, 숙주 주변세포질로부터 재조합 단백질을 정제할 수 있다. 숙주 세포의 용균 후, 재조합 단백질이 숙주 세포의 주변세포질 내로 내보내질 때, 박테리아의 주변세포질 분획을 당업자에게 공지된 기타 방법에 더하여 저온 삼투압 쇼크에 의해 단리할 수 있다. 재조합 단백질을 주변세포질로부터 단리하기 위해, 예를 들어, 박테리아 세포를 원심분리하여 펠렛을 형성시킬 수 있다. 펠렛을 20 ％ 수크로스를 함유하는 완충액에 재현탁시킬 수 있다. 세포를 용균시키기 위해, 박테리아를 원심분리시키고, 펠렛을 빙냉 5 mM MgSO4에 재현탁시키고 빙욕에서 약 10 분 동안 유지시킬 수 있다. 세포 현탁액을 원심분리하고, 상층액을 따라 내어 보존할 수 있다. 상층액 내에 존재하는 재조합 단백질을 당업자에게 주지된 표준 분리 기술에 의해 숙주 단백질로부터 분리할 수 있다.
초기 염 분획화로 많은 원치 않는 숙주 세포 단백질 (또는 세포 배양 배지로부터 유래된 단백질)을 당해 재조합 단백질로부터 분리할 수 있다. 한 이같은 예는 황산암모늄일 수 있다. 황산암모늄은 단백질 혼합물 내의 물의 양을 효과적으로 감소시킴으로써 단백질을 침전시킨다. 그러면 단백질이 이들의 용해도를 기초로 침전한다. 단백질이 더 소수성일수록, 더 낮은 황산암모늄 농도에서 더 쉽게 침전한다. 전형적인 프로토콜은 결과적인 황산암모늄 농도가 20-30 ％ 사이이도록 포화 황산암모늄을 단백질 용액에 첨가하는 것을 포함한다. 이러한 농도는 가장 소수성인 단백질을 침전시킬 것이다. 이어서 침전물을 폐기하고 (당해 단백질이 소수성이지 않다면), 당해 단백질을 침전시키는 것으로 알려진 농도로 상층액에 황산암모늄을 첨가한다. 이어서 침전물을 완충액 내에 가용화시키고, 희석 또는 여과를 통해 필요하다면 과량의 염을 제거한다. 단백질의 용해도에 의존하는 기타 방법, 예컨대 저온 에탄올 침전은 당업자에게 주지되어 있고, 복합 단백질 혼합물을 분획화하는데 사용될 수 있다.
구멍 크기가 상이한 막 (예를 들어, Amicon 또는 Millipore 막)을 통과시키는 초여과를 사용하여 크기가 더 크거나 더 작은 단백질로부터 재조합 단백질을 단리하기 위해, 재조합 단백질의 분자량을 사용할 수 있다. 첫번째 단계로서, 단백질 혼합물을 분자량 차단이 당해 단백질의 분자량보다 낮은 구멍 크기를 갖는 막을 통과시켜 초여과시킬 수 있다. 이어서 초여과 보전물을 분자량 차단이 당해 단백질의 분자량보다 큰 막에 대해 초여과시킬 수 있다. 재조합 단백질은 막을 통과하여 여과물이 될 것이다. 이어서 여과물을 하기 기술되는 바와 같이 크로마토그래프에 적용할 수 있다.
재조합 단백질은 이의 크기, 최종 표면 전하, 소수성, 및 리간드에 대한 친화력을 기초로 다른 단백질로부터 또한 분리될 수 있다. 또한, 단백질에 대해 생성된 항체를 컬럼 매트릭스에 접합시켜서, 단백질을 면역정제할 수 있다. 모든 이러한 방법은 당업계에 주지되어 있다. 많은 상이한 제조업자 (예를 들어, Pharmacia Biotech)로부터의 설비를 사용하여 임의의 규모로 크로마토그래피 기술을 수행할 수 있다는 것이 당업자에게 명백할 것이다.
복원 및 리폴딩
불용성 단백질은 2차 및 3차 단백질 구조 형상이 생성되도록 복원 또는 리폴딩될 수 있다. 재조합 생성물의 구성의 완성에서, 필요하다면 단백질 리폴딩 단계가 사용될 수 있다. 리폴딩 및 복원은 단백질의 해리/회합을 촉진하는 것으로 당업계에 공지된 작용제를 사용하여 달성할 수 있다. 예를 들어, 단백질을 디티오트레이톨과 함께 인큐베이션한 후 산화된 글루타티온 2나트륨 염과 함께 인큐베이션하고, 이어서 요소와 같은 리폴딩제를 함유하는 완충액와 함께 인큐베이션할 수 있다.
재조합 단백질은, 예를 들어, 이를 포스페이트-완충 염수 (PBS) 또는 50 mM Na-아세테이트, pH 6 완충액 + 200 mM NaCl에 대해 투석함으로써 또한 복원될 수 있다. 별법으로, 단백질을 Ni-NTA 컬럼과 같은 컬럼 상에 고정시키고, 프로테아제 저해제를 함유하는 500 mM NaCl, 20 ％ 글리세롤, 20 mM 트리스/HCl pH 7.4에서 선형 6M - 1M 요소 구배를 사용함으로써, 단백질이 리폴딩될 수 있다. 복원은 1.5 시간 이상의 기간에 걸쳐 수행될 수 있다. 복원 후, 단백질은 250 mM 이미다졸의 첨가에 의해 용출될 수 있다. 이미다졸은 PBS 또는 50 mM 아세트산나트륨 pH 6 완충액 + 200 mM NaCl에 대한 최종 투석 단계에 의해 제거될 수 있다. 정제된 단백질을 4 ℃에서 보관하거나 - 80 ℃에서 동결시킬 수 있다.
기타 방법으로는, 예를 들어, [MH Lee 등 (2002) Protein Expr . Purif . 25(1):166-73]; [W. K. Cho 등 (2000) J. Biotechnology 77(2-3):169-78]; [Deutscher (1990) "Guide to Protein Purification," Methods in Enzymology vol. 182] 및 이러한 시리즈의 다른 권; [Coligan, 등 (1996 및 정기적인 증보판) Current Protocols in Protein Science, Wiley/Greene, NY]; [S. Roe (2001) Protein Purification Techniques : A Practical Approach, Oxford Press]; [D. Bollag, 등 (1996) Protein Methods, Wiley-Lisa, Inc.]에 기술될 수 있는 것들이 포함된다.
활성 단백질 또는 펩티드 분석
전형적으로, "활성" 단백질은 상응하는 천연 단백질에 필적하는 생물학적 기능 또는 생물학적 효과를 갖는 단백질을 포함한다. 단백질의 문맥에서, 이는 표준 파라메터를 사용하여 상응하는 천연 단백질과 비교했을 때 약 20 ％ 이상, 약 50 ％ 이상, 약 60 ％ 이상, 약 70 ％ 이상, 약 75 ％ 이상, 약 80 ％ 이상, 약 85 ％ 이상, 약 90 ％ 이상, 약 95 ％ 이상, 약 98 ％ 이상 또는 100 ％의 생물학적 기능을 갖는 생물학적 기능 또는 효과를 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드가 포함하는 것을 전형적으로 의미한다. 단백질 활성의 결정은 특정 단백질에 대한 상응하는 표적화된 유사한 표준 생물학적 분석법을 사용하여 수행할 수 있다. 재조합 단백질이 생물학적 기능 또는 효과를 갖는다는 것의 한 지표는 재조합 폴리펩티드가 천연 폴리펩티드와 면역학적으로 교차 반응성이라는 것이다.
전형적으로 활성 단백질은 천연 포유류 단백질의 특이적 활성의 20 ％ 이상, 30 ％ 이상, 40 ％ 이상, 50 ％ 이상, 60 ％ 이상, 70 ％ 이상, 80 ％ 이상, 90 ％ 이상, 또는 95 ％ 이상의 활성을 갖는다. 또한, 선택적으로 기질 특이성 (kcat/Km)이 천연 포유류 단백질과 실질적으로 유사하다. 전형적으로, kcat/Km은 천연 단백질의 kcat/Km의 30 ％ 이상, 40 ％ 이상, 50 ％ 이상, 60 ％ 이상, 70 ％ 이상, 80 ％ 이상, 또는 90 ％ 이상일 것이다. 단백질 및 펩티드 활성의 크기 및 기질 특이성 (kcat/Km)을 분석 및 정량하는 방법은 당업자에게 주지되어 있다.
재조합 포유류 단백질의 활성은 당업계에 공지된, 임의의 단백질 특이적인 통상적 또는 표준 시험관내 또는 생체내 분석법에 의해 측정할 수 있다. 슈도모나스에 의해 제조된 재조합 포유류 단백질의 활성을 상응하는 천연 포유류 단백질의 활성과 비교하여, 동일 또는 유사한 생리 조건 하에 천연 단백질에서 일반적으로 관찰되는 활성과 실질적으로 유사한 또는 동등한 활성을 재조합 포유류 단백질이 나타내는지 여부를 결정할 수 있다.
재조합 단백질의 활성을 기존에 확립된 천연 단백질 표준 활성과 비교할 수 있다. 별법으로, 재조합 단백질의 활성을 천연 단백질과의 동시 비교 분석 또는 실질적으로 동시의 비교 분석으로 결정할 수 있다. 예를 들어, 시험관내 분석법을 사용하여 재조합 단백질과 표적 사이, 예를 들어 발현된 효소와 기질 사이, 발현된 호르몬과 호르몬 수용체 사이, 발현된 항체와 항원 사이 등의 임의의 검출가능한 상호작용을 결정할 수 있다. 이같은 검출에는 비색 변화, 증식 변화, 세포 사멸, 세포 리펠링(repelling), 방사성에서의 변화, 용해도에서의 변화, 겔 전기영동 및/또는 겔 배제 방법에 의한 측정 시 분자량에서의 변화, 인산화 능력의 측정, 항체 특이성 분석법 예컨대 ELISA 분석법 등이 포함될 수 있다. 또한, 생체내 분석법에는 천연 단백질의 생리학적 효과와 비교하여 슈도모나스에 의해 제조된 단백질의 생리학적 효과, 예를 들어, 중량 증진, 전해물 밸런스에서의 변화, 혈액 응고 시간에서의 변화, 응혈 용해에서의 변화 및 항원성 응답의 유도를 검출하는 분석법이 포함된다. 일반적으로, 슈도모나스에 의해 제조된 재조합 포유류 단백질의 활성 성질을 결정하기 위해, 이같은 활성이 분석가능한 한 천연 단백질에 대한 비교 분석을 가능하게 하는 임의의 시험관내 또는 생체내 분석법을 사용할 수 있다. 별법으로, 본 발명에서 제조된 단백질을, 정상적으로 이 단백질과 상호작용하는 분자, 예를 들어 천연 단백질이 정상적으로 상호작용하는 신호 경로의 성분 또는 기질과 단백질 사이의 상호작용을 자극 또는 저해하는 능력에 대해 분석할 수 있다. 전형적으로 이같은 분석법은 단백질이 표적 분자와 상호작용하도록 하는 조건 하에 단백질을 기질 분자와 조합시키는 단계를 포함할 수 있고, 단백질과 표적 분자와의 상호작용의 생화학적 결과를 검출한다.
단백질 활성을 결정하기 위해 사용될 수 있는 분석법은, 예를 들어, [Ralph, P. J., 등 (1984) J. Immunol . 132:1858]; [Saiki 등 (1981) J. Immunol . 127:1044]; [Steward, W. E. II (1980) The Interferon Systems . Springer-Verlag, Vienna and New York]; [Broxmeyer, H. E., 등 (1982) Blood 60:595]; [Sambrook, J., E. F. Fritsch and T. Maniais eds. (1989) "Molecular Cloning: A Laboratory Manual", 2d ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press]; [Berger, S. L. and A. R. Kimmel eds. (1987) "Methods in Enzymology: Guide to Molecular Cloning Techniques", Academic Press]; [AK Patra 등 (2000) Protein Expr Purif 18(2):182-92]; [Kodama 등 (1986) J. Biochem . 99:1465-1472]; [Stewart 등 (1993) Proc . Nat'l Acad . Sci . USA 90:5209-5213]; [Lombillo 등 (1995) J. Cell Biol. 128:107-115]; [Vale 등 (1985) Cell 42:39-50]에 기술되어 있다.
박테리아 균주 및 성장 조건
달리 구체화되지 않는 한, 모든 슈도모나스 발현 테스트에 사용된 모든 균주는 슈도모나스 플루오레센스 균주 MB101을 기초로 하였다. 대장균 균주 JM109 (Promega), XL2 Blue (Stratagene) 또는 Top 10 (Invitrogen)을 일반적인 클로닝에 사용하였다. 대장균 발현 연구를 위해서는, BL21 (DE3) Gold를 사용하였다. 슈도모나스 플루오레센스 균주는 30 ℃에서 요구되는 15 ㎍/㎖ 테트라사이클린 및 30 ㎍/㎖ 카나마이신이 보충된 LB 또는 무기염 배지에서 성장시켰다. 대장균 균주는 37 ℃에서 요구되는 30 ㎍/㎖ 카나마이신 및/또는 15 ㎍/㎖ 클로르암페니콜, 또는 15 ㎍/㎖ 테트라사이클린이 보충된 LB에서 성장시켰다. 성장 단계 후 세포들을 0.3 mM IPTG로 유도하였다.
단백질 활성 검출 ( ELISA 분석)
PBS (pH 7.6) 내의 10 ㎍/㎖의 β-갈락토시다아제 용액 200 ㎕를 미량역가 플레이트의 각 웰에 첨가하여 플레이트를 코팅하였다. 플레이트를 실온에서 16 시간 동안 인큐베이션한 후, 200 ㎕ PBS + 0.1％ Tween-20 (PBS-T)로 3회 세정하였다. 1차 항체를 PBS 내에서 2 ％ 탈지 분유 (중량/부피)로 희석하였다. 200 ㎕ 의 희석된 항체를 각 웰에 첨가하고, 실온에서 1 시간 동안 인큐베이션하였다. 이어서 플레이트를 200 ㎕ PBS-T로 4회 세정하였다. 2차 항체를 또한 PBS 내에서 2 ％ 탈지 분유 (중량/부피)로 희석하여, 각 웰에 200 ㎕를 첨가하고, 실온에서 1.5 - 2 시간 동안 인큐베이션하였다. 이어서 플레이트를 PBS-T로 4회 세정하였다. 3차 항체를 사용하여 scFv 항체를 검출하였다: 알칼리성 포스파타아제가 접합된 양의 항-마우스 항체 (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA 카탈로그 #A5324). 각각의 원하는 웰에 200 ㎕의 희석된 항체 용액 (또는 PBS-T)을 첨가하고, 실온에서 1.5 시간 동안 인큐베이션하였다. 이어서 플레이트를 PBS-T로 4회 세정하였다. 각각의 웰에 200 ㎕의 새롭게 제조된 Sigma Fast pNPP 기질 (Sigma 카탈로그 #R-2770)을 첨가하였다. 30 분 후, 50 ㎕의 3M NaOH를 각 웰에 첨가하여 반응을 정지시키고, 흡광도를 405 nm에서 판독하였다.
발효
슈도모나스 플루오레센스용 발효기 배양을 위한 접종물은 효모 추출물 및 덱스트로스가 보충된 화학적으로 규정된 배지 600 ㎖를 함유하는 진탕 플라스크에 접종함으로써 생성된다. 전형적으로 테트라사이클린을 첨가하여 야간 접종 동안 개시물(starter) 배양물 내에, 뿐만 아니라 발효기 내에 재조합 플라스미드가 유지되는 것을 확실히 한다. 이어서 효모 추출물을 보충하지 않으면서, 높은 생물량을 지지하도록 고안된 화학적으로 규정된 배지를 함유하는 20 ℓ 발효기에 진탕 플라스크 배양물을 무균적으로 옮긴다. 발효기 내로의 공기 흐름 및 교반기 혼합 속도를 조절함으로써 산소를 액체 배양물 내에 양(陽)의 수준으로 유지시킨다; pH는 수성 암모니아의 첨가를 통해 6.0 초과로 유지시킨다. 페드-배치 고밀도 발효 공정은 약 24 시간의 초기 성장 단계 및 유도인자가 첨가되어 재조합 유전자 발현이 개시되는 유전자 발현 (유도) 단계로 분리된다. 옥수수 시럽 형태의 글루코스가 발효 공정 전반에 걸쳐 제한 농도로 공급된다. 유도 단계를 개시시키기 위한 표적 세포 밀도는 전형적으로 575 nm에서 150 OD 유닛이다. 발효의 유도 단계는 전형적으로 약 45 내지 55 시간 동안 지속된다. 이러한 단계 동안, 표적 유전자 발현 수준, 세포 밀도 등을 결정하기 위한 다양한 분석을 위해 샘플을 발효기로부터 회수한다.
대장균에 대한 각각의 발효 실험을 위해, 동결된 글리세롤 모액을 -80 ℃ 저장소로부터 제거하고, 해동시키고, 희석한 후, 카나마이신이 보충된 LB 브로쓰(broth) 600 ㎖를 함유하는 진탕 플라스크에 접종한다. 300 rpm에서 하룻밤 동안 진탕하면서 진탕 플라스크 배양물에 37 ℃에서 접종한 후, 복합 배지를 함유하는 20 ℓ 발효기로 무균적으로 옮긴다. 발효기 내의 온도는 37 ℃로 유지하고, pH는 수성 암모니아 및 인산의 첨가에 의해 7로 유지하고, 용해된 산소는 20 ％ 초과로 유지한다. 짧은 초기 배치 단계 후, 글리세롤을 단계적으로 증가하는 속도로 첨가하여 과량의 탄소를 유지시킨다. 세포 밀도가 600 nm에서 24-28 OD 유닛에 도달했을 때, 재조합 발현이 유도인자, 예컨대 이소프로필-티오갈락토시드 (IPTG)의 첨가에 의해 야기된다. 발효기가 부피 용량에 도달하거나 성장 속도가 현저히 감소하기 시작하면서 발효의 유도 단계는 전형적으로 약 3 내지 5 시간 동안 지속된다. 이러한 단계 동안, 표적 유전자 발현 수준, 세포 밀도 등을 결정하 기 위한 다양한 분석을 위해 샘플을 발효기로부터 회수한다.
세포 분획화 및 SDS - PAGE 분석
샘플을 A575 = 30으로 표준화시키고, 1 ㎖ 표준화 배양물을 펠렛화시킨다. 세포를 1 ㎖ 용균 완충액 (50 mM 트리스 염기; 200 mM NaCl; 5 ％ 부피/부피 글리세롤; 20 mM EDTA 2나트륨 염; 0.5 ％ 부피/부피 Triton X-100; 1 mM DTT) 내에 재현탁시킨다. 박테리아 용균물에 특이적인 프로테아제 저해제 칵테일 (Sigma #P8465)을 1× 농축물에 첨가한다. 재현탁된 세포를 0.1 ㎜ 유리 비드와 함께 2 ㎖ 스크류 캡(screw cap) 미세원침관에 약 3/4 정도 채워서 첨가하고, 최고 세팅(setting)으로의 BioSpec 비드 연마기에서의 4, 1 분 인큐베이션을 사용하여 세포를 기계적으로 용균시킨다. 인큐베이션 사이에 세포를 얼음 상에서 유지시킨다. 약 100 ㎕의 용균된 세포 용액을 비드로부터 제거하고, 새로운 관 내로 옮겨 펠렛화시킨다. 상층액 (가용성 분획)을 새로운 관에 제거한다. 펠렛 (불용성 분획)을 동일한 부피 (100 ㎕)의 용균 완충액 + 프로테아제 저해제에 재현탁시킨다. 5 ㎕의 각 샘플을 5 ㎕의 2× LDS 로딩 완충액 (Invitrogen)에 첨가하고, 4-12 ％ 또는 10 ％ Bis-Tris NuPAGE 겔 (Invitrogen) 상에 로딩하고, 지시된 대로 1× MES 또는 1× MOPS 완충액 내에서 러닝시켰다(running).
실시예 1: 세포질 내에서의 scFV 의 발현
단쇄 항체 단편 (scFV)은 진단 및 치료제로서의 용도가 증가하고 있다. 이러한 비교적 소형인 단백질은 면역글로불린의 가변 경쇄 및 중쇄를 코딩하는 유전자와 함께 융합함으로써 제조된다.
Gal13 scFv 의 클로닝
파지 디스플레이(display) 벡터 pCANTAB6 내로 클로닝된 Gal13 scFv 유전자 (Genbank 접근 번호 AF238290) ([P Martineau 등 (1998) J. Mol . Biol . 280(1):117-27] 참조)를 주형으로 사용하여 774 염기쌍 생성물을 증폭시키고, 이어서 이 생성물을 pCR2.1 TOPO 벡터 (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) 내로 클로닝하였다. scFv 유전자를 TOPO 벡터로부터 SpeI 및 SalI 제한 효소 (New England Biolabs, Beverly, MA, USA)로 절단하고, Ptac 프로모터의 하류에서 슈도모나스 플루오레센스 벡터 pMYC1803의 SpeI 및 XhoI 부위 내로 클로닝하여, pDOW1117을 제조하였다. 생성된 플라스미드를 슈도모나스 플루오레센스 내로 전기천공시켰다. Gal13 유전자를 pET24d+ 발현 벡터 (Novagen, Madison, WI, USA) 내로 클로닝한 후, SalI 및 NcoI 부위가 코딩 서열에 플랭킹되도록(flanked) 증폭시켰다. PCR 생성물을 SalI 및 NcoI으로 소화시키고, T7 프로모터의 하류에서 pET24d+ 벡터의 동일한 부위 내로 클로닝하였다. 이어서 새롭게 형성된 구축물을 사용하여 XL2 Blue 적격 세포(competent cell)를 형질전환시켰다. 일단 서열이 확인되면, 발현을 위해 DNA 구축물을 사용하여 BL21 (DE3) Gold (Stratagene, San Diego, CA, USA)를 형질전환시켰다.
대장균 및 슈도모나스 플루오레센스에서의 단쇄 항체 단편 ( scFv )의 발현
scFv 분자를 대장균과 슈도모나스 플루오레센스 모두에서 발현시켰고, 그중 한 scFv는 대장균 단백질 β-갈락토시다아제 단쇄 항체 Gal13에 대한 결합 활성이 있다 (P. Martineau 등, "Expression of an antibody fragment at high levels in the bacterial cytoplasm," J. Mol . Biol . 280(1):117-27 (1998)). 슈도모나스 플루오레센스는 20 ℓ 발효 동안 대장균 보다 약 6 배 많은 단백질을 발현하였고, SDS-PAGE 및 농도계측에 의해 결정 시 슈도모나스 플루오레센스에서는 수율이 3.1 g/ℓ이고 대장균에서는 수율이 0.5 g/ℓ였다 (표 8 참조). 슈도모나스 플루오레센스는 약 96 ％의 가용성 단백질을 발현한 반면, 대장균은 단지 48 ％의 가용성 단백질만을 발현하였다.
Gal13 발효 요약 (*BSA 표준물과 비교)
대장균 슈도모나스 플루오레센스 Pf/Ec
발효 시간 (시) 8-9 70 8
최대 hGH 역가 (*g/ℓ) 0.4 (85 ％cv) 3.1 (24 ％cv) 8
건조 생물량 (g/ℓ) ND (30) 59 (2)
hGH/생물량 (％중량/중량) (1) 5 (5)
양 발현 시스템으로부터 정제된 물질들은 도 2에 나타난 바와 같이 효소면역측정법 (ELISA: enzyme-linked immunosorbant assay)에서 활성인 것으로 확인되었다. 친화 크로마토그래피를 사용하여 양 균주의 용균물로부터 동일한 용균물 부피의 가용성 분획으로부터 물질들을 또한 정제하였다. 최종적으로, 슈도모나스 플루오레센스 공정에 대한 전체적인 부피 회수는 1.34 g/ℓ 대 0.07 g/ℓ로 대장균보다 약 20 배 더 효율적이었다.
실시예 2: 세포질 내에서의 인간 γ- IFN 의 발현
인간 감마-인터페론의 클로닝
[PW Gray 등 (1982) Nature 298:859-63]에 기술된 바와 같이 재조합 γ-IFN의 N-말단이 Met-Cys-Tyr-Cys-Gln-Asp-Pro로 시작되어 천연 분비 신호가 결여되도록 인간 감마 인터페론 (hu-γIFN, Genbank 접근 번호 X13274)을 인간 지라 cDNA 라이브러리 (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA; 카탈로그 #10425-015)로부터 증폭시켰다. 생성물을 pCR2.1 TOPO 벡터 내로 클로닝하고, 서열을 확인하였다. hu-γIFN 유전자를 TOPO 벡터로부터 SpeI 및 XhoI 제한 효소로 절단하고, pMYC1803의 동일한 부위 내로 클로닝하였다. 별도의 반응에서, hu-γIFN을 AflIII 및 XhoI 부위가 이러한 코딩 서열에 플랭킹되도록 증폭시켰다. 생성된 단편을 TOPO-TA 벡터 (Invitrogen) 내로 클로닝하고, 화학적으로 적격인 대장균 JM109 세포 (Promega, Madison, WI, USA) 내로 형질전환시켰다. AflIII 및 XhoI (New England Biolabs)으로의 소화에 의해 유전자를 단리하고, T7 프로모터의 하류에서 pET24d+ (Novagen, Madison, WI, USA)의 NcoI 및 XhoI 부위 내로 클로닝하고, JM109 내로 형질전환시켰다. 양성 클론을 대장균 BL21 (DE3) 세포 (Novagen) 내로 형질전환시켜, 발현에 대해 테스트하였다.
인간 감마-인터페론 정제
슈도모나스 플루오레센스 배양물로부터의 동결된 세포 페이스트(paste)를 해동시키고, 용균 완충액 (50 mM NaCl, 10 mM EDTA (에틸렌디아민테트라아세트산, 카탈로그 #BPII8-500, Fisher Scientific, Springfield, NJ, USA), 1 mM PMSF (페닐메틸술포닐 플루오라이드, 카탈로그 #P-7626, Sigma, St. Louis, MO), 1 mM 디티오트레이톨 (카탈로그 #D-0632, Sigma) 및 1 mM 벤즈아미딘 (카탈로그 # B-6506, Sigma)을 함유하는 50 mM 인산칼륨, pH 7.2)에 용균 완충액 2 ㎖ 당 세포 페이스트 약 1 g의 비율로 재현탁시켰다. 세포를 미세유화기(microfluidizer) (모델 11OY, Microfluidics Corporation, Newton, MA, USA)에 3회 통과시켜 파열시켰다. 세포 잔해물 및 파열되지 않은 세포를 원심분리 (Beckman Coulter 원심분리기를 사용하여 23,708 × g 및 4 ℃에서 60 분; 모델 JA 25.50, Beckman Coulter, Inc., Fullerton, CA, USA)에 의해 제거하였다. 10 ％ 중량/부피 규조토 (Celite 제품, World Minerals, Inc., Goleta, CA, USA)를 첨가하고, 진공 여과와 함께 결과물을 종이 필터 (Whatman 1, 카탈로그 # 1001-150, Whatman Paper Ltd., Maidstone, Kent, UK)에 통과시킴으로써, 생성된 상층액 (무세포 추출물)을 정화시켰다.
정화된 세포 추출물을 완충액 A로 평형화된 SP-Sepharose FAST FLOW (6 ％ 가교결합된 아가로스 비드 물질; 카탈로그 # 17- 0709-10, Amersham Biosciences, Piscataway, NJ, USA)의 3.2 ㎝ × 13.5 ㎝ 크로마토그래피 컬럼에 0.5 ㎖/분의 유속으로 적용하였다. 완충액 A의 조성은 50 mM HEPES, pH 7.8 (즉 Fisher Scientific 사의 N-(2-히드록시에틸)피페라진)N'-(2-에탄술폰산), 카탈로그 # BP-310-100), 50 mM NaCl, 1 mM EDTA, 및 0.02 ％ 아지드화나트륨 (카탈로그 # 71289, Sigma Chemical Co.)이었다. 로딩 후, 컬럼을 컬럼 부피 (컬럼 부피 = 108 ㎖)의 3 배의 완충액 A 및 5 배 부피의 0.4M NaCl을 함유하는 완충액 A로 세정하였다. 2 ㎖/분의 유속으로 동일한 완충액 내에서 0.4 M 내지 1 M 구배의 NaCl을 컬럼 부피의 총 7 배로 적용하여 컬럼을 추가로 전개시켰다. 이어서 순수한 IFN-γ를 함유하는 분획을 풀링하고(pooled), 1× PBS (포스페이트-완충 염수, pH 7.2)에 대해 4 ℃에서 투석하였다. 초여과 (YM30 초여과 막을 사용; 카탈로그 # 13722, Millipore, Bedford, MA USA)에 의해 단백질을 농축시킨 후, 액체 질소 내에 동결시켜 80 ℃에서 보관하였다.
대장균 및 슈도모나스 플루오레센스에서의 인간 γ-인터페론의 발현
인간 γ-인터페론은 γ-IFN 유전자를 발현하는 대장균의 발효에 의해 상업적으로 제조된다. 이 단백질은 불용성 및 불활성 형태로 세포질 내에서 발현된다. 재조합 폴리펩티드를 활성 제약 성분으로 제조하기 위해서는, 인터페론이 회수, 가용화, 리폴딩 및 정제되어야 한다. 모든 이러한 단위 작업은 이러한 단백질에 대한 제품 비용 (COG: cost of good)을 크게 증가시킨다. 인간 지라 cDNA 라이브러리를 주형으로 사용하여 천연 신호 서열이 없는 γIFN cDNA를 증폭시키고, 대장균 및 슈도모나스 플루오레센스 발현 벡터 내로 클로닝시켰다. 슈도모나스 플루오레센스 구축물은 전형적인 20 ℓ 발효 반응 동안 약 4 g/ℓ의 γIFN 단백질을 제조하였다. 가용성 및 불용성 분획의 SDS-PAGE 및 웨스턴 분석은 대부분의 단백질 (95 ％)이 가용성 분획 내에 존재하는 것을 나타낸다. 도 1은 슈도모나스 플루오레센스 샘플의 가용성 분획으로부터 정제된 hu-γ-IFN이 시판되는 표준물에 필적하는 활성을 나타낸다는 것을 보여준다. 도 5 및 표 9는 대장균 및 슈도모나스 플루오레센스 발현 시스템 간의 γ-IFN 발현의 비교를 나타낸다.
γ-IFN 발효 요약 (* BSA 표준물과 비교)
대장균 슈도모나스 플루오레센스 Pf/Ec
발효 시간 (시) 7-9 50 6
최대 hGH 역가 (*g/ℓ) 3.9 4.5 1.5
건조 생물량 (g/ℓ) 약 22 100 4.5
hGH/생물량 (％중량/중량) 약 17.7 4.5 0.25
인간 감마 인터페론 활성의 분석
세포주 및 배지: Hela 세포 (카탈로그 # CCL-2) 및 뇌심근염 바이러스 (ECMV, 카탈로그 # VR-129B)를 American Type Culture Collection (Manassas, VA)으로부터 입수하였다. HeLa 세포는 10 ％ 소태아 혈청 (Gibco, Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)을 함유하는 이글스 변형 필수 배지 (Cellgro EMEM, Mediatech, Herdon, VA, USA) 내에서 37 ℃/5 ％ CO2에서 유지시켰다.
정제된 hu-γIFN의 활성을 [JA Lewis (1987), Lymphokines and Interferons : A Practical Approach MJ Clemens 등 (eds.) (IRL Press Ltd, Oxford, England)]에 기존에 기술된 바와 같은 바이러스성 저해 분석법을 이용하여 분석하였다. 간략하게, HeLa 세포를 96-웰 미량역가 플레이트에 3 × 104 /웰로 파종하였다. 24 ㅅ시간 후, 슈도모나스 플루오레센스로부터 단리된 정제된 hu-γIFN 또는 대장균 재조합 hu-γIFN (R & D Systems (Minneapolis,MN, USA)으로부터 입수)을 웰 당 0, 0.01 또는 0.05 ng으로 3중으로 웰에 첨가하였다. 세포를 hu-γIFN과 24 시간 동안 예비 인큐베이션시킨 후, ECMV를 다양한 희석물로 3중 웰의 세트에 첨가하였다. 세포를 5 일 동안 인큐베이션한 후, 5-브로모-2'-데옥시유리딘 혼입을 모니터링하는 세포 증식 ELISA (카탈로그 # 1647229, Roche Molecular Biochemicals, Indianapolis, IN, USA)를 사용하여 세포 생존율을 측정하였다. 결과는 흡광도 단위로 표현되고, 활발하게 분열하는 (살아있는) 세포의 수가 더 많이 존재할수록 흡광도가 더 커진다.
실시예 3: 세포질 내에서의 hGH 의 발현
인간 cDNA 라이브러리로부터 인간 성장 호르몬 (hGH)을 증폭시키기 위해 프라이머를 고안하였다. 이러한 연구를 위해, 주형으로서의 상기 플라스미드 및 프라이머 ELVIrev 및 hgh-sig를 사용하고 95 ℃ 2분의 PCR 사이클링 프로필 (95 ℃ 60 초, 42 ℃ 120초, 72 ℃ 3 분)을 25회 반복하여, 제조업자의 프로토콜에 따라 AmpliTaq 중합효소 (Perkin Elmer)를 사용하여 hGH을 증폭시켰다. 생성물을 Wizard PCR DNA 정제 키트 (Promega)를 사용하여 정제하고, SpeI 및 XhoI 제한 효소 (New England Biolabs)로 소화시키고, pMYC1803의 동일한 부위 내로 클로닝하였다 (도 3 참조). 증폭된 hGH에서 발견된 돌연변이는 ELVIrev와 함께 hgh-sigcorr 프라이머를 사용하고 PCR 및 클로닝 절차를 반복함으로써 수정하였다.
hGH의 클로닝에 사용된 프라이머
Figure 112006050327557-pct00007
hGH 의 정제
20 ℓ 발효 후, hGH를 대장균 및 슈도모나스 플루오레센스 세포의 불용성 분획으로부터 정제하였고, 단, DEAE FF 용출 동안 0 내지 0.5 M 구배의 NaCl을 0.25 M NaCl 단계 대신 사용하였다.
대장균 대 슈도모나스 플루오레센스에서의 인간 성장 호르몬의 발현
인간 성장 호르몬을 코딩하는 cDNA를 인간 뇌하수체 cDNA 라이브러리로부터 증폭시켰다. 천연 분비 신호 서열이 제거되었고, 미생물 발현을 위해 N-말단 메티오닌이 구축물 내로 조작되었다. 대장균 발현을 위해, hGH 유전자를 함유하는 pET25 벡터를 BL21(DE3) 내로 형질전환시켰고, 이는 hGH 전사에 필요한 통합된 T7 중합효소 유전자를 함유한다. 슈도모나스 플루오레센스 발현 연구는 MB214 균주에서 수행하였고, 이는 Ptac 프로모터로부터의 발현을 제어하기 위해 통합된 lacI 유전자를 함유한다. 양 발현 시스템을 20 ℓ 발현 규모에서 평가하였다. 표 10에 나타난 바와 같이, 건조 생물량 1 g 당 제조된 단백질의 양에서 슈도모나스 플루오레센스 (Pf)가 대장균 (EC)을 능가하였다 (1.6 × 이상).
hGH 발효 요약 (* BSA 표준물과 비교)
대장균 슈도모나스 플루오레센스 Pf/Ec
발효 시간 (시) 7-9 55 6
최대 hGH 역가 (*g/ℓ) 2.6 (23 ％cv) 7.3 (5 ％cv) 3
건조 생물량 (g/ℓ) 37 66 2
hGH/생물량 (％중량/중량) 7 11 1.6
세포 분획화 및 SDS-PAGE 분석은 hGH가 양 발현 시스템의 불용성 분획에서 발견되는 것을 나타낸다 (도 4). 놀랍게도, 건조 생물량 1 g 당 단백질 제조에서 단지 1.6×의 차이에도 불구하고, 대장균과 비교하여 약 7× 많은 hGH 단량체가 슈도모나스 플루오레센스로부터 정제되었다.
대장균 및 슈도모나스 플루오레센스로부터의 hGH 정제 비교
rh-GH를 함유하는 슈도모나스 플루오레센스의 1.62-1.75 ℓ 부분
습윤 생물량 (습윤 g) 정제된 단량체 (㎎) 정제된 이량체 (㎎)
가용성 최소 NA NA
지질 추출물 검출되지 않음 -- --
불용성 지질 62.2-63.1 1483 346
rh-GH를 함유하는 대장균의 1.5-1.6 ℓ 부분
가용성 최소 NA NA
지질 추출물 검출되지 않음 -- --
불용성 지질 35.0 200 333
실시예 4: 주변세포질 내에서의 단백질의 발현
분비 신호 펩티드의 특징화
슈도모나스 플루오레센스 분비 신호 펩티드는 알칼리성 포스파타아제 (phoA) 코딩 서열-게놈 DNA 융합물의 형성 및 발현에 의해 발견되었고, 2004년 11월 22일 출원된 미국 출원 제10/996,007호에 더욱 상세하게 기술되어 있다. 발현된 융합물 6종을 하기에서 더욱 특징화하였다.
SPScan 프로그램 (Menne 등, 2000)에 의해, 다른 슈도모나드로부터의 상동성 단백질에 대한 비교에 의해 phoA 융합물을 추론하면서, 분비된 유전자에 대한 신호 서열에 대한 절단 부위를 동정하였다. 추정 지질단백질의 절단 부위는 신호 펩티다아제 II 모티프에 대한 비교에 의해 추론하였다; 신호 펩티다아제 II는 지질단백질의 신호 서열을 특이적으로 절단한다. 모든 6종의 신호 펩티드를 SignalP (추정 신호 펩티드의 분석을 위한 소프트웨어 프로그램; Center for Biological Sequence Analysis of the Technical University of Denmark로부터 http://www.cbs.dtu.dklservices/SignalP/.에서 입수가능)를 사용하여 분석하였다. 또한, [Nielsn 등 (1997) Protein Engineering 10:1-6] 참조. 일부 경우에, 보충원을 사용하여 신호 펩티드의 신원을 추가로 특징화하였다. 이러한 정보가 표 12에 제시된다.
Figure 112006050327557-pct00008
융합 단백질을 검출하기 위한 phoA 융합 단백질의 웨스턴 분석
융합 단백질이 제조되었는지 여부를 분석하기 위해, 알칼리성 포스파타아제에 대한 항체를 사용한 웨스턴 분석을 전체 세포 분획 (세포질 및 주변세포질) 및 무세포 브로쓰 분획으로 원심분리에 의해 분리된 배양물 상에 수행하였다. 삽입 부위가 결정된 5 종의 균주 중에서, 4 종 (추정 아주린, 추정 포스페이트 결합 단백질, 추정 주변세포질 지질단백질 B, 추정 Fe(III) 결합 단백질)이 예상 크기의 융합 단백질을 제조하였고, 1 종 (추정 oprE 단백질)은 예상보다 약 40 kD 작은 단백질을 제조하였고, 1 종 (추정 Lys-Arg-Orn 결합 단백질)은 예상보다 약 20 kD 작은 단백질을 제조하였다.
단백질을 SDS-PAGE에 의해 분리하고, Xcell SureLockTM Mini-Cell & XCell II TM Blot Module (Invitrogen)을 사용하여 40 V에서 1 시간 동안 니트로셀룰로스 막으로 옮겼다. 웨스턴 실험은 SuperSignal West HisProbeTM Kit (Pierce)로부터 제공되는 사용설명서를 사용하여 수행하였다.
pbp - hGH 융합물의 구축, 발현 및 특징화
슈도모나스 플루오레센스 포스페이트 결합 단백질 분비 리더를 인간 성장 호르몬 (hGH) 유전자의 성숙 도메인의 N-말단에 융합시키고, 발현 및 분비에 대해 테스트하였다.
sig_pbp for (gctctagaggaggtaacttatgaaactgaaacg) 및 pbp_hgh (gggaatggttgggaaggocacogcgttggc)를 프라이머로 사용하여, 주형으로서의 슈도모나스 플루오레센스 pbp 신호 서열의 클론으로부터 pbp 신호-서열 코딩 영역을 PCR 증폭시킨 후, 겔-정제하였다. 이의 결과로 pbp 신호 펩티드 CDS 및 hGH의 성숙 도메인의 5' 말단에 대한 코딩 서열을 함유하는 올리고뉴클레오티드 단편이 제조되었다.
hGH의 성숙 도메인만을 증폭시키도록 고안된 프라이머 ELVIfor (agagaactagtaaaaaggagaaatccatggctacaggctcccggacgtcc) 및 ELVIrev (agagactcgagtcattagaagccacagctgccctccac)를 사용하여 인간 뇌하수체 cDNA 라이브러리 (Clontech, Palo Alto CA)로부터 인간 성장 호르몬을 코딩하는 cDNA를 PCR 증폭시킨 후, pMYC1 803/SpeI XhoI 내로 클로닝하여, pDOW2400을 형성시켰다. 프라이머 pbp_hgh_revcomp (gccaacgcggtggccttcccaaccattccc) 및 hgh_rev (agagactcgagtcattagaagccacagctgccctccacagagcggcac)를 사용하여 성숙 hGH 유전자를 pDOW2400으로부터 증폭시킨 후, Strataprep 컬럼 (Stratagene)으로 정제하여, 프라이머 및 기타 반응 성분들을 제거하였다. pbp-hGH 융합물을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 제조하기 위해, 2 개의 PCR 반응을 조합하고, sig_pbp for 및 hgh_rev로 다시 증폭시켜, 2 개의 조각을 연결시켰다. 예상된 681 bp 단편을 상기와 같은 Strataprep으로 정제하고, XbaI 및 XhoI 제한효소로 소화시키고, 탈인산화된 pDOW1269/XhoISpeI에 결찰시켜, pDOW 1323-10을 형성시켰고, 이때 pbp_hGH는 pMYC1803와 유사한 벡터 내에서 tac 프로모터의 제어 하에 있지만, tetR 테트라사이클린 저항성 마커 유전자 대신 pyrF 선택가능 마커를 갖는다. 결찰 혼합물을 MB101 pyrF proC lacIQ1 내로 형질전환시켰다. 삽입물을 상기 기술된 방법을 사용하여 더 다우 케미칼 캄파니(The Dow Chemical Company)가 서열분석하였다. 이러한 융합물의 DNA 및 아미노산 서열이 도 10 및 도 11에 각각 제시된다.
생성된 균주를 먼저 진탕 플라스크 규모로 테스트하였다. 프로세싱된 것 및 프로세싱되지 않은 것에 대한 예상 크기 (각각 22.2 kDa 및 24.5 kDa)의 유도된 밴드가 SDS-PAGE에 의해 검출되었다. 단백질의 약 절반 정도가 프로세싱되었고 (주변세포질로의 국소화를 가리킴), 프로세싱된 것들 중 약 절반은 가용성 분획에, 절반은 불용성 분획에 존재하였다. 발현 연구를 20 ℓ 생물반응기로 규모를 증진시켰다. 쿠마시 염색된 SDS-PAGE 겔의 농도계측은 제조된 전체 hGH의 18 ％가 프로세싱되었고 가용성임을 나타냈다. 균주는 모든 형태의 hGH를 3.2 g/ℓ로 제조하였다; 프로세싱된 가용성 hGH는 0.6 g/ℓ였다.
pbp - scFv 융합물의 구축, 발현 및 특징화
포스페이트 결합 단백질의 아미노산 24 개의 추정 신호 서열 (즉 Met1 포함)을 gal2 scFv 유전자 (gal2)의 오픈 리딩 프레임(open reading frame)에 +2 아미노산 (Ala) 위치에서 융합시켰다. 도 8 및 도 9 참조. 신호 서열은 프로세싱된 것으로 나타나고, 이는 주변세포질로의 분비를 가리킨다. 또한, 브로쓰로의 분비가 있어서, 단백질이 무세포 배양 상층액 내에서 검출되었다. 놀랍게도, 포스페이트 결합 단백질 신호 서열에의 융합이 슈도모나스 플루오레센스에서의 gal2 scFv의 발현을 개선시키는 것으로 여겨진다. 아미노 말단에서 융합된 분비 신호 없이, gal2 scFv의 발현은 검출가능하지 않았다.
Gal2 의 클로닝
프라이머 sig_pbp for (상기), 및 pbp_gal2SOE for (aaccgcggtggccgcccaggtgcag)의 역 상보물을 함유하는 pbp_gal2SOE rev (ctgcacctgggcggccaccgcgtt)를 사용하고, 슈도모나스 플루오레센스 pbp 분비 신호 펩티드를 코딩하는 플라스미드를 주형으로 사용하여, PCR을 수행하였다. 그 결과, pbp 신호 펩티드 코딩 서열 (CDS) 및 gal2 단쇄 항체 (scAb 또는 scFv)의 5' 말단 에 대한 CDS를 함유하는 올리고뉴클레오티드 단편이 제조되었다.
프라이머 pbp_gal2SOE for 및 scFv2rev (acgcgtcgacttattaatggtg atgatggtgatgtgcggccgcacgtttgatc)를 사용하고, gal2-코딩 폴리뉴클레오티드를 주형으로 사용하여, PCR을 수행하였다. 그 결과, pbp 신호 펩티드의 3' 말단을 코딩하는 CDS 및 gal2를 코딩하는 오픈 리딩 프레임 (ORE)을 함유하는 폴리뉴클레오티드 단편이 제조되었다.
반응 생성물을 정제하였다. 약 15 ng의 각각의 반응 생성물을 프라이머 sig_pbp_for 및 scFv2rev를 사용하는 추가적인 PCR 반응에서 "주형" DNA로 사용하였다. 그 결과, gal2 코딩 서열에 융합된 pbp 신호 펩티드 CDS를 갖는 핵산 단편이 제조되었다.
신호 서열의 예측물 - 1 아미노산 (제안된 절단 부위 이전의 마지막 아미노산)이 gal2 scFv의 +2 아미노산 (Ala)에 융합되었다. 생성된 융합물을 Ptac 프로모터의 제어 하에 슈도모나스 플루오레센스 벡터 pMYC1803 내로 클로닝하여, 플라스미드 pDOW1123 (pbp:gal2)이 제조되었다. 이 플라스미드를 플라스미드 pCN51-lacI (2004년 11월 19일 출원된 미국 출원 제10/994,138호에 기술됨)를 지니는 슈도모나스 플루오레센스 균주 MB 101 내로 형질전환시켰다.
추정 포스페이트 결합 단백질 신호 서열의 gal2 scFv 에의 융합
포스페이트 결합 단백질 신호 서열을 단쇄 항체 유전자에 융합시키고, 주변세포질 및/또는 세포 상층액으로의 분비에 대해 테스트하였다.
분비된 Gal2 발효 요약 (* BSA 표준물과 비교)
대장균 슈도모나스 플루오레센스 Pf/Ec
발효 시간 (시) 8-9 50-70 8
최대 hGH 역가 (*g/ℓ) 1.6 (0.8 프로세싱됨) 9.3 (25 ％CV) 6(12)
건조 생물량 (g/ℓ) 18 (70) 4
hGH/생물량 (％중량/중량) 8.9 (4.4 프로세싱됨) 13 1.5 (3)
생성된 균주를 먼저 진탕 플라스크 규모로 테스트하였다. 프로세싱되지 않은 gal2 및 프로세싱된 gal2에 대한 예상 크기 (29 kDa 및 27 kDa)의 유도된 밴드가 SDS-PAGE에 의해 불용성 단백질 분획에서 검출되었다 (데이타는 제시되지 않음). 발현 연구를 20 ℓ 발효로 규모를 증진시켰다. 다시, SDS-PAGE 분석은 유도된 단백질의 대부분이 불용성 단백질 분획에서 발견되는 것을 나타냈다.
또한 웨스턴 분석은 pbp:gal2 (pDOW1123)에 대해 일부 프로세싱된 gal2가 가용성 단백질 분획 내에 존재한다는 것을 가리켰다. pDOW 1123을 지니는 균주로부터 제조된 주변세포질 분획의 웨스턴 분석 (에피센터(Epicentre) 원형질막 키트를 사용함)은 가용성 gal2 단백질의 존재를 나타냈다.
재조합 gal2 scFv를 Qiagen Ni-NTA 프로토콜을 이용하여 진탕 플라스크 실험의 세포 추출물로부터 단리한 후, [P. Martineau 등, J Mol . Biol . 280:117-127 (1998)]에 기술된 바와 같이 리폴딩시켰다. 이러한 항체는 ELISA 분석에서 β-갈락토시다아제에 대해 활성인 것으로 발견되었다.
SEQUENCE LISTING <110> Dow Chemical Company <120> Expression of Mammalian Proteins in Pseudomonas fluorescens <130> 00588.105024 DOw 107CON1 <140> <141> 2006-04-07 <160> 21 <170> PatentIn version 3.3 <210> 1 <211> 609 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Met Lys Trp Val Thr Phe Ile Ser Leu Leu Phe Leu Phe Ser Ser Ala 1 5 10 15 Tyr Ser Arg Gly Val Phe Arg Arg Asp Ala His Lys Ser Glu Val Ala 20 25 30 His Arg Phe Lys Asp Leu Gly Glu Glu Asn Phe Lys Ala Leu Val Leu 35 40 45 Ile Ala Phe Ala Gln Tyr Leu Gln Gln Cys Pro Phe Glu Asp His Val 50 55 60 Lys Leu Val Asn Glu Val Thr Glu Phe Ala Lys Thr Cys Val Ala Asp 65 70 75 80 Glu Ser Ala Glu Asn Cys Asp Lys Ser Leu His Thr Leu Phe Gly Asp 85 90 95 Lys Leu Cys Thr Val Ala Thr Leu Arg Glu Thr Tyr Gly Glu Met Ala 100 105 110 Asp Cys Cys Ala Lys Gln Glu Pro Glu Arg Asn Glu Cys Phe Leu Gln 115 120 125 His Lys Asp Asp Asn Pro Asn Leu Pro Arg Leu Val Arg Pro Glu Val 130 135 140 Asp Val Met Cys Thr Ala Phe His Asp Asn Glu Glu Thr Phe Leu Lys 145 150 155 160 Lys Tyr Leu Tyr Glu Ile Ala Arg Arg His Pro Tyr Phe Tyr Ala Pro 165 170 175 Glu Leu Leu Phe Phe Ala Lys Arg Tyr Lys Ala Ala Phe Thr Glu Cys 180 185 190 Cys Gln Ala Ala Asp Lys Ala Ala Cys Leu Leu Pro Lys Leu Asp Glu 195 200 205 Leu Arg Asp Glu Gly Lys Ala Ser Ser Ala Lys Gln Arg Leu Lys Cys 210 215 220 Ala Ser Leu Gln Lys Phe Gly Glu Arg Ala Phe Lys Ala Trp Ala Val 225 230 235 240 Ala Arg Leu Ser Gln Arg Phe Pro Lys Ala Glu Phe Ala Glu Val Ser 245 250 255 Lys Leu Val Thr Asp Leu Thr Lys Val His Thr Glu Cys Cys His Gly 260 265 270 Asp Leu Leu Glu Cys Ala Asp Asp Arg Ala Asp Leu Ala Lys Tyr Ile 275 280 285 Cys Glu Asn Gln Asp Ser Ile Ser Ser Lys Leu Lys Glu Cys Cys Glu 290 295 300 Lys Pro Leu Leu Glu Lys Ser His Cys Ile Ala Glu Val Glu Asn Asp 305 310 315 320 Glu Met Pro Ala Asp Leu Pro Ser Leu Ala Ala Asp Phe Val Glu Ser 325 330 335 Lys Asp Val Cys Lys Asn Tyr Ala Glu Ala Lys Asp Val Phe Leu Gly 340 345 350 Met Phe Leu Tyr Glu Tyr Ala Arg Arg His Pro Asp Tyr Ser Val Val 355 360 365 Leu Leu Leu Arg Leu Ala Lys Thr Tyr Glu Thr Thr Leu Glu Lys Cys 370 375 380 Cys Ala Ala Ala Asp Pro His Glu Cys Tyr Ala Lys Val Phe Asp Glu 385 390 395 400 Phe Lys Pro Leu Val Glu Glu Pro Gln Asn Leu Ile Lys Gln Asn Cys 405 410 415 Glu Leu Phe Lys Gln Leu Gly Glu Tyr Lys Phe Gln Asn Ala Leu Leu 420 425 430 Val Arg Tyr Thr Lys Lys Val Pro Gln Val Ser Thr Pro Thr Leu Val 435 440 445 Glu Val Ser Arg Asn Leu Gly Lys Val Gly Ser Lys Cys Cys Lys His 450 455 460 Pro Glu Ala Lys Arg Met Pro Cys Ala Glu Asp Tyr Leu Ser Val Val 465 470 475 480 Leu Asn Gln Leu Cys Val Leu His Glu Lys Thr Pro Val Ser Asp Arg 485 490 495 Val Thr Lys Cys Cys Thr Glu Ser Leu Val Asn Arg Arg Pro Cys Phe 500 505 510 Ser Ala Leu Glu Val Asp Glu Thr Tyr Val Pro Lys Glu Phe Asn Ala 515 520 525 Glu Thr Phe Thr Phe His Ala Asp Ile Cys Thr Leu Ser Glu Lys Glu 530 535 540 Arg Gln Ile Lys Lys Gln Thr Ala Leu Val Glu Leu Val Lys His Lys 545 550 555 560 Pro Lys Ala Thr Lys Glu Gln Leu Lys Ala Val Met Asp Asp Phe Ala 565 570 575 Ala Phe Val Glu Lys Cys Cys Lys Ala Asp Asp Lys Glu Thr Cys Phe 580 585 590 Ala Glu Glu Gly Lys Lys Leu Val Ala Ala Ser Gln Ala Ala Leu Gly 595 600 605 Leu <210> 2 <211> 698 <212> PRT <213> homo sapiens <400> 2 Met Arg Leu Ala Val Gly Ala Leu Leu Val Cys Ala Val Leu Gly Leu 1 5 10 15 Cys Leu Ala Val Pro Asp Lys Thr Val Arg Trp Cys Ala Val Ser Glu 20 25 30 His Glu Ala Thr Lys Cys Gln Ser Phe Arg Asp His Met Lys Ser Val 35 40 45 Ile Pro Ser Asp Gly Pro Ser Val Ala Cys Val Lys Lys Ala Ser Tyr 50 55 60 Leu Asp Cys Ile Arg Ala Ile Ala Ala Asn Glu Ala Asp Ala Val Thr 65 70 75 80 Leu Asp Ala Gly Leu Val Tyr Asp Ala Tyr Leu Ala Pro Asn Asn Leu 85 90 95 Lys Pro Val Val Ala Glu Phe Tyr Gly Ser Lys Glu Asp Pro Gln Thr 100 105 110 Phe Tyr Tyr Ala Val Ala Val Val Lys Lys Asp Ser Gly Phe Gln Met 115 120 125 Asn Gln Leu Arg Gly Lys Lys Ser Cys His Thr Gly Leu Gly Arg Ser 130 135 140 Ala Gly Trp Asn Ile Pro Ile Gly Leu Leu Tyr Cys Asp Leu Pro Glu 145 150 155 160 Pro Arg Lys Pro Leu Glu Lys Ala Val Ala Asn Phe Phe Ser Gly Ser 165 170 175 Cys Ala Pro Cys Ala Asp Gly Thr Asp Phe Pro Gln Leu Cys Gln Leu 180 185 190 Cys Pro Gly Cys Gly Cys Ser Thr Leu Asn Gln Tyr Phe Gly Tyr Ser 195 200 205 Gly Ala Phe Lys Cys Leu Lys Asn Gly Ala Gly Asp Val Ala Phe Val 210 215 220 Lys His Ser Thr Ile Phe Glu Asn Leu Ala Asn Lys Ala Asp Arg Asp 225 230 235 240 Gln Tyr Glu Leu Leu Cys Leu Asp Asn Thr Arg Lys Pro Val Asp Glu 245 250 255 Tyr Lys Asp Cys His Leu Ala Gln Val Pro Ser His Thr Val Val Ala 260 265 270 Arg Ser Met Gly Gly Lys Glu Asp Leu Ile Trp Glu Leu Leu Asn Gln 275 280 285 Ala Gln Glu His Phe Gly Lys Asp Lys Ser Lys Glu Phe Gln Leu Phe 290 295 300 Ser Ser Pro His Gly Lys Asp Leu Leu Phe Lys Asp Ser Ala His Gly 305 310 315 320 Phe Leu Lys Val Pro Pro Arg Met Asp Ala Lys Met Tyr Leu Gly Tyr 325 330 335 Glu Tyr Val Thr Ala Ile Arg Asn Leu Arg Glu Gly Thr Cys Gln Glu 340 345 350 Ala Pro Thr Asp Glu Cys Lys Pro Val Lys Trp Cys Ala Leu Ser His 355 360 365 His Glu Arg Leu Lys Cys Asp Glu Trp Ser Val Asn Ser Val Gly Lys 370 375 380 Ile Glu Cys Val Ser Ala Glu Thr Thr Glu Asp Cys Ile Ala Lys Ile 385 390 395 400 Met Asn Gly Glu Ala Asp Ala Met Ser Leu Asp Gly Gly Phe Val Tyr 405 410 415 Ile Ala Gly Lys Cys Gly Leu Val Pro Val Leu Ala Glu Asn Tyr Asn 420 425 430 Lys Ser Asp Asn Cys Glu Asp Thr Pro Glu Ala Gly Tyr Phe Ala Val 435 440 445 Ala Val Val Lys Lys Ser Ala Ser Asp Leu Thr Trp Asp Asn Leu Lys 450 455 460 Gly Lys Lys Ser Cys His Thr Ala Val Gly Arg Thr Ala Gly Trp Asn 465 470 475 480 Ile Pro Met Gly Leu Leu Tyr Asn Lys Ile Asn His Cys Arg Phe Asp 485 490 495 Glu Phe Phe Ser Glu Gly Cys Ala Pro Gly Ser Lys Lys Asp Ser Ser 500 505 510 Leu Cys Lys Leu Cys Met Gly Ser Gly Leu Asn Leu Cys Glu Pro Asn 515 520 525 Asn Lys Glu Gly Tyr Tyr Gly Tyr Thr Gly Ala Phe Arg Cys Leu Val 530 535 540 Glu Lys Gly Asp Val Ala Phe Val Lys His Gln Thr Val Pro Gln Asn 545 550 555 560 Thr Gly Gly Lys Asn Pro Asp Pro Trp Ala Lys Asn Leu Asn Glu Lys 565 570 575 Asp Tyr Glu Leu Leu Cys Leu Asp Gly Thr Arg Lys Pro Val Glu Glu 580 585 590 Tyr Ala Asn Cys His Leu Ala Arg Ala Pro Asn His Ala Val Val Thr 595 600 605 Arg Lys Asp Lys Glu Ala Cys Val His Lys Ile Leu Arg Gln Gln Gln 610 615 620 His Leu Phe Gly Ser Asn Val Thr Asp Cys Ser Gly Asn Phe Cys Leu 625 630 635 640 Phe Arg Ser Glu Thr Lys Asp Leu Leu Phe Arg Asp Asp Thr Val Cys 645 650 655 Leu Ala Lys Leu His Asp Arg Asn Thr Tyr Glu Lys Tyr Leu Gly Glu 660 665 670 Glu Tyr Val Lys Ala Val Gly Asn Leu Arg Lys Cys Ser Thr Ser Ser 675 680 685 Leu Leu Glu Ala Cys Thr Phe Arg Arg Pro 690 695 <210> 3 <211> 333 <212> DNA <213> homo sapiens <400> 3 atggccctgt ggatgcgcct cctgcccctg ctggcgctgc tggccctctg gggacctgac 60 ccagccgcag cctttgtgaa ccaacacctg tgcggctcac acctggtgga agctctctac 120 ctagtgtgcg gggaacgagg cttcttctac acacccaaga cccgccggga ggcagaggac 180 ctgcaggtgg ggcaggtgga gctgggcggg ggccctggtg caggcagcct gcagcccttg 240 gccctggagg ggtccctgca gaagcgtggc attgtggaac aatgctgtac cagcatctgc 300 tccctctacc agctggagaa ctactgcaac tag 333 <210> 4 <211> 49 <212> DNA <213> artificial <220> <223> hGH-sig <400> 4 agagaactag taaaaaggag aaatccatgt tcccaaccat tcccttatc 49 <210> 5 <211> 62 <212> DNA <213> artificial <220> <223> hGH-sigcorr <400> 5 agagaactag taaaaaggag aaatccatgt tcccaaccat tcccttatcc aggccttttg 60 ac 62 <210> 6 <211> 50 <212> DNA <213> artificial <220> <223> ELVIfor <400> 6 agagaactag taaaaaggag aaatccatgg ctacaggctc ccggacgtcc 50 <210> 7 <211> 38 <212> DNA <213> artificial <220> <223> ELVIrev <400> 7 agagactcga gtcattagaa gccacagctg ccctccac 38 <210> 8 <211> 20 <212> PRT <213> pseudomonas fluorescens <400> 8 Lys Lys Ser Thr Leu Ala Val Ala Val Thr Leu Gly Ala Ile Ala Gln 1 5 10 15 Gln Ala Gly Ala 20 <210> 9 <211> 15 <212> PRT <213> pseudomonas fluorescens <400> 9 Lys Leu Lys Arg Leu Met Ala Ala Met Thr Phe Val Ala Ala Gly 1 5 10 15 <210> 10 <211> 19 <212> PRT <213> pseudomonas fluorescens <400> 10 Phe Ala Lys Leu Val Ala Val Ser Leu Leu Thr Leu Ala Ser Gly Gln 1 5 10 15 Leu Leu Ala <210> 11 <211> 15 <212> PRT <213> pseudomonas fluorescens <400> 11 Ile Lys Arg Asn Leu Leu Val Met Gly Leu Ala Val Leu Leu Ser 1 5 10 15 <210> 12 <211> 22 <212> PRT <213> pseudomonas fluorescens <400> 12 Gln Asn Tyr Lys Lys Phe Leu Leu Ala Ala Ala Val Ser Met Ala Phe 1 5 10 15 Ser Ala Thr Ala Met Ala 20 <210> 13 <211> 31 <212> PRT <213> pseudomons fluorescens <400> 13 Met Ile Arg Asp Asn Arg Leu Lys Thr Ser Leu Leu Arg Gly Leu Thr 1 5 10 15 Leu Thr Leu Leu Ser Leu Thr Leu Leu Ser Pro Ala Ala His Ser 20 25 30 <210> 14 <211> 30 <212> DNA <213> artificial <220> <223> pbp_hgh_revcomp <400> 14 gccaacgcgg tggccttccc aaccattccc 30 <210> 15 <211> 48 <212> DNA <213> artificial <220> <223> hgh_rev <400> 15 agagactcga gtcattagaa gccacagctg ccctccacag agcggcac 48 <210> 16 <211> 192 <212> PRT <213> artificial <220> <223> hGH without signal sequence from construct <400> 16 Met Phe Pro Thr Ile Pro Leu Ser Arg Pro Phe Asp Asn Ala Met Leu 1 5 10 15 Arg Ala His Arg Leu His Gln Leu Ala Phe Asp Thr Tyr Gln Glu Phe 20 25 30 Glu Glu Ala Tyr Ile Pro Lys Glu Gln Lys Tyr Ser Phe Leu Gln Asn 35 40 45 Pro Gln Thr Ser Leu Cys Phe Ser Glu Ser Ile Pro Thr Pro Ser Asn 50 55 60 Arg Glu Glu Thr Gln Gln Lys Ser Asn Leu Glu Leu Leu Arg Ile Ser 65 70 75 80 Leu Leu Leu Ile Gln Ser Trp Leu Glu Pro Val Gln Phe Leu Arg Ser 85 90 95 Val Phe Ala Asn Ser Leu Val Tyr Gly Ala Ser Asp Ser Asn Val Tyr 100 105 110 Asp Leu Leu Lys Asp Leu Glu Glu Gly Ile Gln Thr Leu Met Gly Arg 115 120 125 Leu Glu Asp Gly Ser Pro Arg Thr Gly Gln Ile Phe Lys Gln Thr Tyr 130 135 140 Ser Lys Phe Asp Thr Asn Ser His Asn Asp Asp Ala Leu Leu Lys Asn 145 150 155 160 Tyr Gly Leu Leu Tyr Cys Phe Arg Lys Asp Met Asp Lys Val Glu Thr 165 170 175 Phe Leu Arg Ile Val Gln Cys Arg Ser Val Glu Gly Ser Cys Gly Phe 180 185 190 <210> 17 <211> 475 <212> DNA <213> homo sapiens <400> 17 agagaactag taaaaaggag aaatccatgc agggccaatt ttttagagaa atagaaaact 60 taaaggagta ttttaatgca agtagcccag atgtagctaa gggtgggcct ctcttctcag 120 aaattttgaa gaattggaaa gatgaaagtg acaaaaaaat tattcagagc caaattgtct 180 ccttctactt caaactcttt gaaaacctca aagataacca ggtcattcaa aggagcatgg 240 atatcatcaa gcaagacatg tttcagaagt tcttgaatgg cagctctgag aaactggagg 300 acttcaaaaa gctgattcaa attccggtgg atgatctgca gatccagcgc aaagccataa 360 atgaactcat caaagtgatg aatgacctgt caccaaaatc taacctcaga aagcggaaga 420 gaagtcagaa tctctttcga ggccggagag catcaacgta atgactcgag tctct 475 <210> 18 <211> 834 <212> DNA <213> artificial <220> <223> phosphate-binding protein-gal2 single chain antibody fusion <400> 18 atgaaactga aacgtttgat ggcggcaatg acttttgtcg ctgctggcgt tgcgaccgcc 60 aacgcggtgg ccgcccaggt gcagctgcag gagtcgggcc caggactggt gaagccttcg 120 gagaccctgt ccctcacctg cactgtctct ggtggttcca tcagtagtta tcactggagc 180 tggatccggc agcccccagg gaagggactg gagtggattg ggtatatcta ttacagtggg 240 agcaccaact acaacccctc cctcaagaat cgagtcacca tatctgtaga cacgtccaag 300 aaccagttct ccctgaacct gaggtctgtg accgctgcag acacggccgt gtattactgt 360 gcgcgaggaa cgtatggccc agccggagat gcttttgata tctgggggca agggaccacg 420 gtcaccgtct cgagtggtgg aggcggttca ggcggaggtg gcagcggcgg tggcggatcg 480 gacatccaga tgacccagtc tccttccacc ctgtctgcat ctattggaga cagagtcacc 540 atcacctgcc gggccagtga gggtatttat cactggttgg cctggtatca gcagaagcca 600 gggaaagccc ctaaactcct gatctataag gcctctagtt tagccagtgg ggccccatca 660 aggtccagcg gcagtggatc tgggacagat ttcactctca ccatcagcag cctgcagcct 720 gatgattttg caacttatta ctgccaacaa tatagtaatt atccgctcac tttcggcgga 780 gggaccaagc tggagatcaa acgtgcggcc gcacatcacc atcatcacca ttaa 834 <210> 19 <211> 276 <212> PRT <213> artificial <220> <223> phosphate-binding protein-gal2 single chain antibody fusion <400> 19 Met Lys Leu Lys Arg Leu Met Ala Ala Met Thr Phe Val Ala Ala Gly 1 5 10 15 Val Ala Thr Ala Asn Ala Val Ala Ala Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser 20 25 30 Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr 35 40 45 Val Ser Gly Gly Ser Ser Ser Tyr His Trp Ser Trp Ile Arg Gln Pro 50 55 60 Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile Gly Tyr Ile Tyr Tyr Ser Gly Ser 65 70 75 80 Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Asn Arg Val Thr Ile Ser Val Asp 85 90 95 Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu Asn Leu Arg Ser Val Thr Ala Ala 100 105 110 Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Thr Tyr Gly Pro Ala Gly 115 120 125 Asp Ala Phe Asp Ile Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 130 135 140 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp 145 150 155 160 Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Ile Gly Asp 165 170 175 Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Glu Gly Ile Tyr His Trp Leu 180 185 190 Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr 195 200 205 Lys Ala Ser Ser Leu Ala Ser Gly Ala Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser 210 215 220 Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Asp 225 230 235 240 Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Ser Asn Tyr Pro Leu Thr 245 250 255 Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Ala Ala Ala His His 260 265 270 His His His His 275 <210> 20 <211> 648 <212> DNA <213> artificial <220> <223> phosphate binding protein-human growth hormone fusion <400> 20 atgaaactga aacgtttgat ggcggcaatg acttttgtcg ctgctggcgt tgcgaccgcc 60 aacgcggtgg ccttcccaac cattccctta tccaggcctt ttgacaacgc tatgctccgc 120 gcccatcgtc tgcaccagct ggcctttgac acctaccagg agtttgaaga agcctatatc 180 ccaaaggaac agaagtattc attcctgcag aacccccaga cctccctctg tttctcagag 240 tctattccga caccctccaa cagggaggaa acacaacaga aatccaacct agagctgctc 300 cgcatctccc tgctgctcat ccagtcgtgg ctggagcccg tgcagttcct caggagtgtc 360 ttcgccaaca gcctggtgta cggcgcctct gacagcaacg tctatgacct cctaaaggac 420 ctagaggaag gcatccaaac gctgatgggg aggctggaag atggcagccc ccggactggg 480 cagatcttca agcagaccta cagcaagttc gacacaaact cacacaacga tgacgcacta 540 ctcaagaact acgggctgct ctactgcttc aggaaggaca tggacaaggt cgagacattc 600 ctgcgcatcg tgcagtgccg ctctgtggag ggcagctgtg gcttctaa 648 <210> 21 <211> 215 <212> PRT <213> artificial <220> <223> phosphate binding protein-human growth hormone fusion <400> 21 Met Lys Leu Lys Arg Leu Met Ala Ala Met Thr Phe Val Ala Ala Gly 1 5 10 15 Val Ala Thr Ala Asn Ala Val Ala Phe Pro Thr Ile Pro Leu Ser Arg 20 25 30 Pro Phe Asp Asn Ala Met Leu Arg Ala His Arg Leu His Gln Leu Ala 35 40 45 Phe Asp Thr Tyr Gln Glu Phe Glu Glu Ala Tyr Ile Pro Lys Glu Gln 50 55 60 Lys Tyr Ser Phe Leu Gln Asn Pro Gln Thr Ser Leu Cys Phe Ser Glu 65 70 75 80 Ser Ile Pro Thr Pro Ser Asn Arg Glu Glu Thr Gln Gln Lys Ser Asn 85 90 95 Leu Glu Leu Leu Arg Ile Ser Leu Leu Leu Ile Gln Ser Trp Leu Glu 100 105 110 Pro Val Gln Phe Leu Arg Ser Val Phe Ala Asn Ser Leu Val Tyr Gly 115 120 125 Ala Ser Asp Ser Asn Val Tyr Asp Leu Leu Lys Asp Leu Glu Glu Gly 130 135 140 Ile Gln Thr Leu Met Gly Arg Leu Glu Asp Gly Ser Pro Arg Thr Gly 145 150 155 160 Gln Ile Phe Lys Gln Thr Tyr Ser Lys Phe Asp Thr Asn Ser His Asn 165 170 175 Asp Asp Ala Leu Leu Lys Asn Tyr Gly Leu Leu Tyr Cys Phe Arg Lys 180 185 190 Asp Met Asp Lys Val Glu Thr Phe Leu Arg Ile Val Gln Cys Arg Ser 195 200 205 Val Glu Gly Ser Cys Gly Phe 210 215

Claims (30)

  1. a. 슈도모나스 플루오레센스(Pseudomonas fluorescens) 숙주 세포를 재조합 포유류 단백질을 코딩하는 핵산으로 형질전환시키고;
    b. 세포를 재조합 포유류 단백질이 발현되도록 하는 조건 하에 성장시키는 것
    을 포함하며, 상기 재조합 포유류 단백질이 인간 또는 쥐 항체 또는 그의 단편, 또는 사이토카인이고, 가용성 형태로 존재하며, 전체 세포 단백질의 5 내지 75％로 제조되는 것인, 슈도모나스 플루오레센스 숙주 세포에서 재조합 포유류 단백질을 제조하는 방법.
  2. 제1항에 있어서, 대장균 발현 시스템에서의 단백질 발현 수준과 비교했을 때 증가된 수준으로 단백질이 발현되는 방법.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 재조합 포유류 단백질을 단리하는 것을 추가로 포함하는 방법.
  4. 제1항 또는 제2항에 있어서, 재조합 포유류 단백질을 정제하는 것을 추가로 포함하는 방법.
  5. 제1항 또는 제2항에 있어서, 재조합 포유류 단백질이 세포 내에 활성 형태로 존재하는 것인 방법.
  6. 제1항 또는 제2항에 있어서, 재조합 포유류 단백질이 인간 펩티드인 방법.
  7. 제1항 또는 제2항에 있어서, 재조합 포유류 단백질을 코딩하는 핵산이 프로모터에 작동적으로 연결되고 상기 프로모터가 슈도모나스 플루오레센스 숙주 세포에 천연적으로 존재하는 것인 방법.
  8. 제1항 또는 제2항에 있어서, 재조합 단백질이 10 g/리터 이상의 농도로 제조되는 방법.
  9. 제1항 또는 제2항에 있어서, 재조합 포유류 단백질의 질량이 1 kD 내지 500 kD인 방법.
  10. 제1항 또는 제2항에 있어서, 재조합 포유류 단백질이 항체인 방법.
  11. 제10항에 있어서, 항체를 코딩하는 상기 핵산이 2개 이상의 발현 벡터를 포함하는 것인 방법.
  12. 제11항에 있어서, 상기 2개 이상의 발현 벡터가 제 1 프로모터-시스트론 쌍 및 제 2 프로모터-시스트론 쌍을 포함하는 것인 방법.
  13. 제12항에 있어서, 상기 제 1 프로모터-시스트론 쌍이 면역글로불린 경쇄이고, 상기 제 2 프로모터-시스트론 쌍이 면역글로불린 중쇄인 방법.
  14. 제13항에 있어서, 경쇄 및 중쇄가 동일한 플라스미드 상에 위치하는 것인 방법.
  15. 제13항에 있어서, 상기 제 1 또는 제 2 프로모터-시스트론 쌍이, 항체를 코딩하는 핵산에 작동적으로 연결된 번역 개시 영역을 더 포함하는 것인 방법.
  16. 제15항에 있어서, 번역 개시 영역이 제 1 또는 제 2 프로모터-시스트론 쌍에 상이한 번역 강도를 제공하는 방법.
  17. 제10항에 있어서, 상기 핵산이 항체 또는 항체 단편을 코딩하고 2개 이상의 개별적인 번역 서열을 포함하며, 상기 번역 서열이 순차적인 방식으로 발현되는 것인 방법.
  18. 제17항에 있어서, 2개 이상의 개별적인 번역 서열이 경쇄 및 중쇄를 포함하는 것인 방법.
  19. 제10항에 있어서, 상기 항체가, Fab, Fab', F(ab')2, F(ab')2-류신 지퍼(zipper), Fv, dsFv 및 항-CD18 항체로 이루어진 군 중에서 선택된 항체 단편, 단쇄 항체, 또는 전체 사슬 항체인 방법.
  20. 제19항에 있어서, 상기 Fab 단편이 경쇄 단편 및 중쇄 단편을 포함하는 것인 방법.
  21. 제19항에 있어서, 상기 Fab가 항원 결합 부위를 포함하는 것인 방법.
  22. 제10항에 있어서, 상기 항체 또는 항체 단편이 키메라성 항체, 인간 항체 또는 인간화된 항체인 방법.
  23. 제10항에 있어서, 분비 신호 서열을 상기 항체에 연결시키는 것을 더 포함하는 방법.
  24. 제10항에 있어서, 상기 항체가 Fc 영역을 더 포함하는 것인 방법.
  25. 제10항에 있어서, 상기 항체가 융합 단백질인 방법.
  26. 제1항에 있어서, 상기 핵산이 재조합 인간 펩티드를 코딩하는 것인 방법.
  27. 제26항에 있어서, 재조합 인간 펩티드가 발현되는 방법.
  28. 제1항 또는 제2항에 있어서, 재조합 포유류 단백질을 코딩하는 핵산이 조절된 프로모터에 작동적으로 연결되고, 재조합 포유류 단백질의 발현을 허용하는 상기 조건이 조절된 프로모터의 유도를 포함하는 것인 방법.
  29. 제14항에 있어서, 상기 제 1 또는 제 2 프로모터-시스트론 쌍이, 항체를 코딩하는 핵산에 작동적으로 연결된 번역 개시 영역을 더 포함하는 것인 방법.
  30. 제29항에 있어서, 번역 개시 영역이 제 1 또는 제 2 프로모터-시스트론 쌍에 상이한 번역 강도를 제공하는 방법.
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