JPH01257491A - 不溶性融合異種蛋白質の処理方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は細菌等を宿主として生産された不溶性融合異種
蛋白質を可溶化、精製及びリフォールディングする方法
等の処理方法に関するものである。

、（従来の技術とその課題） 遺伝子操作技術により、宿主細胞にとっては異種の蛋白
質を該蛋白質をコードする遺伝子を宿主細胞に導入する
ことで生産することが可能である。

この様にして生産された異種蛋白質は、しばしば生理活
性を発現し得ない高次構造をとり、宿主細胞内に不溶性
の凝集塊として析出した状態で生産される。この様な不
溶性異種蛋白質については、可溶化、精製及びリフォー
ルディングという一連の処理がその利用には欠かせない
。

宿主細胞で生産された不溶性異種蛋白質を可溶化し、リ
フォールディングさせる一連の方法として、例えば４〜
９Ｍのグアニジン塩酸塩等の強い蛋白質変性剤溶液中で
不溶性異種蛋白質を可溶化処理し、蛋白質変性剤濃度を
低下させてリフォールディングさせる方法が知られてい
る。この方法においては、蛋白質変性剤濃度を低下させ
るために透析又は希釈等の操作を行う必要があり、大量
の試料を処理するには操作性等に課題がある。また更に
はグアニジン塩酸塩等を用いた場合には、生じる廃液の
処理に関する課題等がある。グアニジン塩酸塩は、通常
の廃液処理方法、例えば活性汚泥法等では処理出来ない
からである。

他にアルカリ溶液中で不溶性異種蛋白質を可溶化し処理
し、溶液のｐＨを低下させてリフォールディングさせる
方法が知られている。この方法においては、ｐＨの低下
を酸物質添加することで行うことが出来るため、前記の
処理方法に比べて簡便な操作で大量の試料を処理するこ
とが出来る。

しかし、この方法においては、アルカリ溶液が不溶性異
種蛋白質の凝集塊の内部と接触しにくく、従って不溶性
異種蛋白質の可溶化率が低下し易いという課題がある。

可溶化率の低下は収率の低下を招くため、好ましいもの
ではない。

蛋白質は、−次構造、二次構造、三次構造そして時には
四次構造を持つことが知られている。−次構造は、約２
０種類のアミノ酸より構成されるが、現在確定されたも
のでも２００種類以上の異なる一次構造の蛋白質がある
。二次及び三次構造のいわゆる高次構造は、蛋白質の一
次構造内のアミノ酸の分子内結合により構成されるが、
Ｘ線結品回折により三次構造の確定された蛋白質は、現
在１００種類以上になる。更には、最近の遺伝子操作技
術では宿主細胞内で生産されにくい異種蛋白質を、生産
され易い蛋白質と融合させた形態で生産させる方法が知
られている。この技術は、二あるいはそれ以上の蛋白質
を、任意の酵素に特異的に切断されるアミノ酸配列を介
して融合させた形態で生産し、後に該酵素で処理して目
的とする蛋白質を得るものである。

この様に、遺伝子操作技術を用いて生産された種々の構
造を有する蛋白質あるいはそれらの融合蛋白質は、その
可溶化、精製及びリフォールディング等の処理時には最
適条件を有するのもと推ｎ１される。例えば大腸菌で生
産されたヒト神経成長因子（以下ＮＧＦと略する）とヒ
ト成長ホルモンの一部分（以下ｈＧＨと略する）の様な
不溶性融合異種蛋白質では、例えばアルカリ溶液により
可溶化処理を行い、該溶液のｐＨを低下させてリフォー
ルディング処理を行おうとしても、ｐＨを低下させる過
程で析出を生じてしまい、その収率は１−１覚ましく悪
化する。

本発明者らは従来技術の課題を解決した、従来知られて
いない不溶性融合異種蛋白質の可溶化、精製及びリフォ
ールディング処理等の処理方法について鋭意研究を行っ
た結果、本発明を完成させるに至った。すなわち本発明
は、 （１）宿主細胞内で生産された不溶性融合異種蛋白質を
蛋白質変性剤の存在下で酸性水溶液と接触させることを
特徴とする不溶性融合異種蛋白質の可溶化処理方法、 （２）宿主細胞内で生産された不溶性融合異種蛋白質を
蛋白質変性剤の存在下で酸性水溶液と接触させ、次いで
該溶液のｐＨをアルカリ物質を添加して上昇させること
を特徴とする不溶性融合異種蛋白質の精製処理方法及び （３）宿主細胞内で生産された不溶性融合異種蛋白質を
蛋白質変性剤の存在下で酸性水溶液と接触させ、次いで
該溶液のｐＨをアルカリ物質を添加して上昇させた後低
下させることを特徴とする不溶性異種蛋白質のりフォー
ルディング処理方法を提供するものであり、以下詳細に
説明する。

（発明の構成） （１）不溶性融合異種蛋白質の可溶化処理方法本発明が
提供する不溶性融合異種蛋白質の可溶化処理方法は、宿
主細胞を例えばホモジナイズ、超音波処理等の方法によ
り破砕した不溶性融合異種蛋白質を含む菌体破砕物、又
はそれらの菌体破砕物から遠心分離、限外濾過、ゲル濾
過等の方法を用いて得られた菌体破砕物の濃縮物を、弱
い蛋白質変性剤の存在下で酸性水溶液と接触させ、目的
の融合蛋白質を可溶化する方法である。

融合蛋白質としては、目的とする蛋白質のＮ末端側上流
に、使用する宿主細胞により生産され易い同種あるいは
異種蛋白質の全部又は一部分を有するもので、例えば後
に実施例において示す様なＮＧＦとｈＧＨの融合蛋白質
等がある。

蛋白質変性剤としては、例えばグアンニジン塩酸塩、尿
素、界面活性剤、チオシアン酸塩等の通常知られた変性
剤を用いることが出来るが、生体への影響が少なく、廃
棄処理の簡便な尿素が好ましい。蛋白質変性剤の濃度は
、不溶性融合異種蛋白質が溶液中に分散する程度用いれ
ば良い。この分散に必要な濃度は、主に使用する変性剤
の性質を考慮して適宜決定すれば良い。例えば尿素を用
いる場合には、一般に蛋白質の尿素による変性が２Ｍ程
度から生じること、不溶性融合異種蛋白質凝集塊の分散
は、尿素の蛋白質を変性させる濃度以下で生じることを
考慮して、２Ｍ程度を用いれば良い。

蛋白質変性剤は、酸性水溶液中に溶解してお（か又は酸
性水溶液を不溶性融合蛋白質凝集塊に接触させる操作に
先立って該融合蛋白質と共存させておけば良いが、酸性
水溶液の接触に先立って共存させて方がその使用量を減
少させることが出来るため好ましい。本発明において蛋
白質変性剤を用いて不溶性融合異種蛋白質を分散させる
ことで、該融合蛋白質凝集塊の内部にも酸性水溶液が接
触し品く成り、可溶化率を向上させることが出来る。

またこの分散、可溶化の操作の時に、撹拌等の操作を合
せて行っても良い。

酸性水溶液としては、例えば塩酸、チオシアン酸、ヨウ
化水素、臭化水素等の無機酸、又は酢酸等の有機酸等、
通常の酸物質の水溶液で良いが、融合異種蛋白質の変性
に効果的な酢酸等の有機酸の水溶液が好ましい。酸物質
の濃度は、水溶液のｐＨを目的とする融合異種蛋白質を
可逆的に酸変性させるｐＨとする濃度であれば良く、例
えばＮＧＦとｈＧＨの融合蛋白質においては、ｐＨ２〜
５、好ましくはｐＨ３〜４と成る様に酸物質を用いれば
良い。

（２）不溶性融合異種蛋白質の精製処理方法本発明が提
供する不溶性融合異種蛋白質の精製処理方法は、可溶化
された融合異種蛋白質を含む酸性水溶液のｐＨを、アル
カリ物質を添加して上昇させることから成る。不溶性融
合異８蛋白質の可溶化処理は、前記（１）の処理方法と
同様に行えば良い。

使用するアルカリ物質としては、例えば水酸化ナトリウ
ム、水酸化カリウム、炭酸ナトリウム、アンモニア、ア
ルキルアミン類等、特に制限はない。

ｐＨは、融合異種蛋白質を可逆的にアルカリ変性させる
範囲に上昇させれば良いが、可能な範囲で高いｐＨにま
で上昇させることが好ましい。高いｐＨに上昇させるこ
とで、目的とする融合異種蛋白質以外の夾雑物の析出が
多くなり、精製度が向上すると同時に該蛋白質のアルカ
リ水溶液への可溶化率が向上するためである。例えばＮ
ＧＦとｈＧＨの融合蛋白質においては、ｐＨ１０〜１３
の範囲にｐＨを上昇させれば良い。

ｐＨを上昇させることで析出する夾雑物は、例えば遠心
分離、限外濾過、ゲル濾過等の９通常の方法により除去
出来る。

（３）不溶性融合異種蛋白質のりフォールディング処理
方法 本発明が提供する不溶性融合異種蛋白質のりフォールデ
ィング処理方法は、アルカリ水溶液中に溶解した融合異
種蛋白質を、溶液のｐＨを低下させることで生理活性を
発現し得る形態にリフォールディング、させることから
成る。不溶性融合異種蛋白質をアルカリ水溶液中に溶解
する操作は、前記した（１）及び（２）の様に行えば良
いが、可溶化処理において高濃度の蛋白質変性剤を使用
した場合には、得られた融合蛋白質の酵素による切断等
の操作のためにも最終的に変性剤の濃度を低下させる操
作が必要となる。従って、リフォールディング処理のた
めの可溶化処理においては、可溶化操作で不溶性融合異
種蛋白質凝集塊の分散のために該蛋白質を変性させない
濃度の蛋白質を使用するか、高濃度の変性剤を用いた後
、酸性水溶液と接触させた段階で変性剤濃度が該蛋白質
を変性させない濃度に成る様に使用することが好ましい
。高濃度の蛋白質変性剤を用いた結果、リフォールディ
ング後の溶液中に融合蛋白質を変性させる濃度の変性剤
が含まれている場合には、必要に応じて透析、該溶液の
希釈等の操作を行って変性剤濃度を低下させれば良い。

この様に、可溶化処理において蛋白質変性剤を用いるこ
とで、不溶性融合異種蛋白質の可溶化率を高めることが
出来、従って、最終的な蛋白質の収率を向上させること
が出来る。

上記の様にして先ず融合異種蛋白質を酸性水溶液中に可
溶化し、続いて前記（２）の処理方法で説明した様にし
て該溶液のｐｌ（を上昇させる。

アルカリ物質としては、前記した精製処理方法において
記述した様な通常のアルカリ物質を用いれば良いが、ア
ンモニア、トリエチルアミン等の有機塩基を用いること
で他のアルカリ物質を用いた場合に比べ高いリフォール
ディング率が得られるため好ましい。更には、モノエタ
ノールアミン、ジエチレントリアミン、トリエチレンテ
トラミン、テトラエチレンペンタミンの中から選ばれる
少なくとも一種の有機塩基の水溶液を用いることでより
高いリフォールディング率を得ることができる。

有機塩基の水溶液が高い割合いで融合異種蛋白質のりフ
ォールディングを引起こす理由は明らかではないが、有
機塩基が水のカオトロピックな性質を乱さないためでは
ないかと推察され−る。を機塩基の中でもモノエタノー
ルアミン、ジエチレントリアミン、トリエチレンテトラ
ミン、テトラエチレンペンタミンが更に高い割合いでリ
フォールディングを引起こすメカニズムについても定か
ではないが、恐らくそれらの直鎖構造が関係しているの
ではないかと推察される。

ｐＨは、（２）の処理方法において説明した様に、目的
とする融合蛋白質を可逆的にアルカリ変性させる範囲に
上昇させれば良く、例えばＮＧＦとｈＧＨの融合蛋白質
においては、ｐＨ１０以下ではアルカリ変性が不十分で
あり、ｐＨ１３以上では、不可逆的な変性が起り易いこ
とからｐＨ１０〜１３の範囲が好ましい。高いリフォー
ルディング率を得るためには、ｐＨ１１〜１２の範囲が
より好ましい。これは、ｐＨがアリカリ可溶化のみなら
ずリフォールディングにも微妙な影響を与えるためであ
ると推察される。

以上の操作により、アルカリ水溶液中に溶解した融合異
種蛋白質を得る。この様な操作により、例えばＮＧＦと
ｈＧＨの融合異種蛋白質の様な、単にアリカリ水溶液を
用いて可溶化処理を行ったのみではりフォールディング
のために溶液のｐＨを低下させる段階で析出してしまう
融合異種蛋白質を、溶液のｐＨの低下の段階においても
析出しない様に出来ると同時に、夾雑物を除去すること
も出来る。夾雑物の除去は、（２）で説明した様１；ｐ
　Ｈの上昇を行った段階で行えば良い。

アルカリ溶液のｐＨを低下させる操作は、透析等により
行っても良いが、例えば塩酸、硫酸等の無機酸あるいは
酢、酸、グリシン等の有機酸等を添加して低下させるこ
とが操作性等の面から好ましい。ただし、先に述べた様
に、リフォールディング後の溶液中に融合異種蛋白質を
変性させる濃度の変性剤が存在し、変性剤濃度を低下さ
せる操作が必要である場合には、透析等の操作を行うこ
とで、ｐＨの低下と変性剤濃度の低下を一度に行うこと
が出来る。ｐＨは、アルカリ水溶液のｐＨに比べて低い
ｐＨに調整すれば良いが、好ましくはｐＨ７〜９、更に
好ましくはｐＨ７〜８の中性がら弱アルカリ性の範囲に
調整するのが良い。この中性から弱アルカリ性の範囲で
は、融合界ａ蛋白質は安定的に存在するからである。

アルカリ水溶液のｐＨの低下に先だって、″例えば還元
型グルタチオン、システィン、２−メルカプトエタノー
ル、ジチオテレイトール、硫化水素等のスルフヒドリル
化合物を添加しておくことで融合異種蛋白質中のジスル
フィド結合が誤って形成されるのを防止することが出来
、リフォールディング率を向上させるためには好ましい
。、（発明の効果） 本発明の可溶化処理方法では、簡便な操作で不溶性融合
異種蛋白質を可溶化することが出来る。

また、本発明の精製処理方法では、可溶化処理方法を用
いて得られる融合異種蛋白質を含有する酸性水溶液のｐ
Ｈをアルカリ物質を添加するという簡便な操作により、
該溶液中の夾雑物を除去することが可能である。更に本
発明のりフォールディング処理方法で、これらの可溶化
及び精製処理方法と同様の操作で得られる融合異種蛋白
質を含有するアルカリ水溶液のｐＨを低下させるという
操作により、活性を発現し得る形態の目的異種蛋白質を
得ることが出来る。これら本発明が提供する処理方法は
、従来の処理方法では処理出来ない大量の融合異種蛋白
質を、迅速かつ簡便に処理可能なものである。特に本発
明で蛋白質変性剤として尿素を用いた場合には、廃液の
処理も簡便な操作で行うことが出来る。

（実施例） 以下本発明を更に詳細に説明するために大腸菌で生産さ
れたＮＧＦとｈＧＨの融合異種蛋白質に関する実施例を
示すが、本発明はこれら実施例に限定されるものではな
い。

以下実施例において示されるＮＧＦとｈＧＨの融合異種
蛋白質（以下ＮＧＦ−ｈＧＨと略する）は、分子量約３
万ダルトンであり、その上流部分（Ｎ末端側）は１４０
アミノ酸から成るｈＧＨの一部分である。下流部分には
１１８アミノ酸から成るＮＧＦが位置し、両者はりフォ
ールディングの後に分離するため、酵素ファクターＸａ
の特異的認識アミノ酸配列（Ｉ　ｌｅ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ
−Ａｒｇ）により結合されている。このＮＧＦ−ｈＧＨ
は、特開昭６１−２０５４８５号に示された方法に従っ
て、大腸菌を宿主細胞として生産した。

実施例１ 宿主細胞の培養後、菌体１０ｇを５％グリセロール、２
　ｍ　Ｍ　Ｅ　Ｄ　Ｔ　Ａを含む２０　ｍ　Ｍ　トリス
−塩酸緩衝液（ｐＨ８）１００ｍｌに懸濁し、超音波細
胞破砕機で破砕した後、遠心分離し、ＮＧＦ−ｈＧＨを
菌体の不溶性断片と共に８ｇの沈澱として得た。沈澱を
７Ｍ尿素を含む０．１Ｍ酢酸水溶液（ｐＨ４）２００ｍ
ｌに懸濁し、可溶化処理を行った。その結果、沈澱中の
菌体断片等以外の沈澱が可溶化された。

実施例２ 実施例１で可溶化されたＮＧＦ−ｈＧＨを含む酢酸水溶
液に、重量比１０％のモノエタノールアミン２００ｍ１
を添加し、ｐＨを１２に調整した。

この結果、得られたアルカリ溶液中に蛋白質の析出が生
じた。生じた沈澱は、実施例１で可溶化しなかった夾雑
物と共に、遠心分離により除去した。

実施例３ 実施例２で得られたＮＧＦ−ｈＧＨを含むアルカリ溶液
４００ｍ１を、０．１５Ｍ）リス−塩酸緩衝液（ｐＨ８
，５）１０１に対し透析し、尿素の濃度を低下させると
同時に該溶液のｐＨを８．５に低下させた。この透析の
段階では、蛋白質の析出は観察されなかった。透析後、
５００ｍｇのＮＧＦ−ｈＧＨを含む粗蛋白質溶液を得た
。

得られたＮＧＦ−ｈＧＨの粗抽出物１ｍｇを含む溶液に
、ファクターＸａ　（Ｓ　ｉ　ｇｍａ社製）１０ｕｇを
添加し、３７℃で１時間処理した。

処理後の溶液について５ＤＳ−ポリアクリルアミド電気
泳動を行い、その蛋白質構成を調べた結果、分子量的１
５０００ダルトンのｈＧＨと分子量的１’　４０００ダ
ルトンのＮＧＦが存在していることが確認された。リフ
ォールディングが不十分である場合、あるいは効能度蛋
白質変性剤の残留に起因する未切断のＮＧＦ−ｈＧＨの
存在は、確認できなかった。

上記の様にして得られたＮＧＦを含む粗ＮＧＦ溶液を、
ラットフェオクロモサイトーマＰＣＩ２細胞の培養液に
添加して、そのＮＧＦの活性を調査した。その結果蛋白
質濃度ｌｕｇ／ｍｌと成る様にＮＧＦ溶液を培地に添加
した場合に、コントロールとして用いたマウスＮＧＦ　
（Ｓ　ｉ　ｇｍａ社製、２．５ＮＧＦ）を１１００ｎ／
ｍｌと成る様に添加した場合と同等の活性が認められた
。この結果、得られた溶液中のＮＧＦは生理活性を発現
し得る形態にリフォールディングされていることが確認
された。

なお、本実施例及び以下の実施例において溶液中の蛋白
質量は、２８０ｎｍでの吸光度を測定して決定した。

実施例４ 実施例１と同様にして、宿主細胞からＮＧＦ−ｈＧＨを
含む沈澱を１０ｇ得た。この沈澱を３．５Ｍの尿素を含
む０．　１Ｍ酢酸水溶液（ｐＨ４）２００ｍｌに懸濁し
、可溶化処理を行った。

続いて重量比１０％のモノエタノールアミン２００ｍ１
を添加し、ｐＨを１２に調整した後、遠心分離を行って
析出した沈澱を除去した。１ｍＭと成る様に還元型グル
タチオンを添加し、９０分間撹拌した後、塩酸を添加し
て溶液のｐＨを８．５に低下させ、生理活性を発現し得
る形態にリフォールディングされたＮＧＦを含む溶液を
得た。この溶液には、４５０ｍｇの蛋白質が含まれてい
た。ＮＧＦの活性は、実施例３と同様にして確認した。

比較例１ 実施例１と同様にして宿主細胞から得た沈澱８ｇを３．
５Ｍの尿素を含む酢酸溶液（ｐＨ４）２００ｍｌを用い
て可溶化処理し、アルカリ物質を添加することなしに０
．１５Ｍ）リス−塩酸緩衝液（ｐＨ８，５）１０１に対
して透析したところ、溶液中に溶解していた蛋白質の大
部分が析出し沈澱した。沈澱５０ｍｇを遠心分離により
分離して透析液に懸濁した後、ファクターＸａを添加し
てＮＧＦとｈＧＨを切断しようと試みたが、５ＤＳ−ボ
ロアクリルアミド電気泳動の結果、ＮＧＦ−ｈＧＨの大
部分は未切断であった。この蛋白質溶液について、実施
例３と同様にＮＧＦの活性を調査したが、ＮＧＦの活性
は確認出来なかった。

比較例２ 実施例１と同様にして宿主細胞から得た沈澱８ｇを、３
．５Ｍの尿素を含む重量比１０％のモノエタノールアミ
ン溶液（ｐＨ１２）２００ｍｌを用いて可溶化した後、
０．１５Ｍトリス−塩酸（ｐＨ８，５）１０１に対して
透析したところ、溶液中に溶解していた蛋白質の大部分
が析出し沈澱した。この沈澱について、比較例１と同様
の処理を行ったが活性を有するＮＧＦは得られなかった
。

Claims (7)

【特許請求の範囲】
1. （１）宿主細胞内で生産された不溶性融合異種蛋白質を
   蛋白質変性剤の存在下で酸性水溶液と接触させることを
   特徴とする不溶性融合異種蛋白質の可溶化処理方法。
2. （２）宿主細胞内で生産された不溶性融合異種蛋白質を
   蛋白質変性剤の存在下で酸性水溶液と接触させ、次いで
   該溶液のｐＨをアルカリ物質を添加して上昇させること
   を特徴とする不溶性融合異種蛋白質の精製処理方法。
3. （３）宿主細胞内で生産された不溶性融合異種蛋白質を
   蛋白質変性剤の存在下で酸性水溶液と接触させ、次いで
   該溶液のｐＨをアルカリ物質を添加して上昇させた後低
   下させることを特徴とする不溶性異種蛋白質のリフオー
   ルディング処理方法。
4. （４）不溶性融合異種蛋白質が大腸菌で生産された、ヒ
   ト神経成長因子とヒト成長ホルモンの一部から成る融合
   蛋白質であることを特徴とする請求項（１）〜（３）の
   いずれかに記載の方法。
5. （５）蛋白質変性剤が尿素であることを特徴とする請求
   項（１）〜（３）のいずれかに記載の方法。
6. （６）アルカリ物質としてモノエタノールアミン、ジエ
   チレントリアミン、トリエチレンテトラミン、テトラエ
   チレンペンタミンから選ばれる少なくとも一種の有機塩
   基を用いることを特徴とする請求項（２）又は（３）に
   記載の方法。
7. （７）請求項（３）の方法において、スルフヒドリル化
   合物の存在下で溶液のｐＨを低下させることを特徴とす
   る方法。