CN117551678B - 一种提高丙酮酸脱羧酶SsPDC在大肠杆菌中可溶性表达的方法 - Google Patents
一种提高丙酮酸脱羧酶SsPDC在大肠杆菌中可溶性表达的方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明属于生物工程技术领域,具体涉及一种提高丙酮酸脱羧酶SsPDC在大肠杆菌中可溶性表达的方法。本发明是以聚集抗性蛋白SlyD为融合标签,通过引入SlyD融合标签来提高SsPDC蛋白的可溶性表达量,具体是在SsPDC序列的N端加上一个融合标签SlyD序列构建新的质粒SlyD‑SsPDC,得到新的质粒后,重新在大肠杆菌中进行转化表达。本发明通过增加一个融合标签SlyD,使SsPDC在大肠杆菌中的蛋白表达量极大提升,有效提高了蛋白的可溶性表达,同时也解决了包涵体表达的难题。
Description
技术领域
本发明属于生物工程技术领域,具体涉及一种提高丙酮酸脱羧酶SsPDC在大肠杆菌中可溶性表达的方法。
背景技术
蛋白的异源表达是目前生物技术领域中极其重要的一环,涉及生物制药、医美、疫苗药物、体外诊断等多个行业,外源重组蛋白的成功生产包括基因的表达、蛋白的溶解性控制及其纯化。
目前,可溶性表达一直是蛋白质高效生产中的一个难以解决的问题,尤其是在大肠杆菌表达***中,受限于蛋白的溶解性,许多较复杂的重组蛋白在表达上都会遇到形成包涵体这一问题,很多重要的蛋白质家族包括磷酸酶、羧化酶、激酶、膜相关蛋白以及许多其他类型的酶都是难以在大肠杆菌表达***中作为可溶性蛋白质表达生产。
融合标签是一些蛋白质或多肽,将合适的融合标签与目的蛋白融合表达,这些蛋白质或多肽能够帮助目的蛋白进行正确的折叠,从而提高蛋白的可溶性,融合标签通过与目标重组蛋白的N端或C端相连共同表达,从而发挥其作用。
丙酮酸脱羧酶(Pyruvate decarboxylase,PDC)是硫胺素焦磷酸(ThDP)依赖型酶,SsPDC是来自磺酸杆菌属的丙酮酸脱羧酶,能够高效催化糠醛和甲醛C-C键形成反应制备2-呋喃基羟基甲基酮,2-呋喃基羟基甲基酮可以代替乙酰呋喃为原料合成呋喃铵盐。呋喃铵盐是合成头孢呋辛类药物的中间体,由于头孢呋辛类药物具有广谱的抗菌作用,所以在医药领域的市场需求巨大。
然而,丙酮酸脱羧酶SsPDC在大肠杆菌表达***中的蛋白可溶性表达很差,表达的蛋白多为包涵体,从而极大地限制了丙酮酸脱羧酶SsPDC应用前景。
发明内容
为了提高丙酮酸脱羧酶SsPDC在大肠杆菌表达***中的可溶性蛋白表达量,本发明提出了一种促进丙酮酸脱羧酶SsPDC在大肠杆菌表达***高效表达外源蛋白的融合标签序列及构建的重组质粒,这对SsPDC在大肠杆菌表达***中的高效表达具有很好的实际应用价值。
聚集抗性蛋白(Aggregation-resistant protein,SlyD)是大肠杆菌来源的基因序列,其可以作为融合标签,它的分子量达到20.9 kDa,不仅能够提高重组蛋白的溶解性,而且还可以增加蛋白产量。
本发明所提供的一种提高丙酮酸脱羧酶SsPDC在大肠杆菌中可溶性表达的方法,具体是:以聚集抗性蛋白SlyD为融合标签,以大肠杆菌基因组为模板扩增SlyD基因片段,以同源重组的方式连接至pET28a-SsPDC上,构成SlyD-SsPDC重组质粒,此重组质粒即为pET28a-SlyD-SsPDC原核表达载体,将该原核表达载体导入大肠杆菌表达***中,得重组菌,诱导表达SlyD-SsPDC蛋白。
本发明在一个方面,提供了一种聚集抗性蛋白融合标签SlyD的基因,其核苷酸序列如SEQ.ID.No.1所示。
本发明所提供的聚集抗性蛋白SlyD融合标签的氨基酸序列,如SEQ.ID.NO.2所示。
在另一个方面,本发明提供了上述聚集抗性蛋白SlyD融合标签基因或氨基酸序列在提高SsPDC蛋白可溶性表达量中的应用。
优选的,上述的重组菌是将SlyD-SsPDC重组质粒导入基因工程菌OverExpressC43中培养获得。
并且,包含聚集抗性蛋白SlyD的pET28a-SlyD-SsPDC原核表达载体或SlyD-SsPDC重组质粒,同样是本发明所重点保护的内容,其表达所述的重组蛋白,命名为SlyD-SsPDC蛋白。
同时,所述SlyD-SsPDC重组质粒或pET28a-SlyD-SsPDC原核表达载体在提高SsPDC蛋白可溶性表达中的应用同样落入本发明所要保护的技术范围之中。
进一步的,所述的pET28a-SlyD-SsPDC原核表达载体的制备方法,包括如下步骤:
(1)扩增SlyD的编码基因;
(2)将SlyD与SsPDC构建在同一个质粒上,构建成pET28a-SlyD-SsPDC原核表达载体。
更具体的,本发明所提供的一种提高SsPDC蛋白表达量的方法,用设计SlyD基因(SEQ.ID.NO.1)的上下游引物,以大肠杆菌基因组为模板扩增SlyD基因片段,以同源重组的方式连接至pET28a-SsPDC上,构成SlyD-SsPDC重组质粒,将SlyD-SsPDC重组质粒导入基因工程菌OverExpress C43(DE3)中诱导表达SlyD-SsPDC蛋白。
本发明的有益效果在于:
(1)通过在SsPDC序列的N端加上融合标签SlyD序列构建新的质粒,得到新的质粒后,重新在大肠杆菌中进行转化表达,使SsPDC在大肠杆菌中的蛋白表达量极大提升,仅30min蛋白表达量就高达97.04%,不仅有效提高了蛋白的可溶性表达,同时也解决了包涵体表达的难题;
(2)提供了一种验证SlyD-SsPDC蛋白可溶性表达的方法,用SDS-PAGE蛋白电泳技术以及构建全细胞催化反应,验证了融合标签SlyD提高了SsPDC蛋白的可溶性表达,同时也提高了同一菌浓的反应效率。
附图说明
图1为本发明实施例1中聚集抗性蛋白SlyD融合标签经PCR扩增得到的SlyD基因琼脂糖凝胶电泳图;
图2为本发明实施例3中SlyD-SsPDC融合蛋白的SDS PAGE电泳图;
图3为本发明实施例4中的全细胞酶催化底物的转化率情况。
具体实施方式
为了能使本领域技术人员更好的理解本发明,下面结合具体实施例进一步描述本发明,需要声明的是,下述实施例仅作为解释和说明,不以任何方式限制本发明的范围。
若未特别说明,以下实施例中使用的试剂均为本领域常规试剂,可商购获得或按照本领域常规方法配制而得,规格为实验室纯级即可。若未特别说明,以下实施例中使用的方法均为本领域常规方法,使用的实验条件均为本领域常规实验条件,可参考相关实验手册或厂商说明书。
实施例1 SlyD基因的获得
一、设计引物及SlyD基因扩增
以大肠杆菌(E.coli)全基因组为模板,扩增来自于E.coli的融合标签SlyD(SEQ.ID.NO.1),设计引物,并在引物F的5’端添加同源臂AAGAAGGAGATATACCATGGGC,在引物R的5’端添加同源臂CCACCGCTGCCGCCACCGCC;引物如下:
SlyD-F:AAGAAGGAGATATACCATGGGCATGAAAGTAGCAAAAGACCTGG;
SlyD-R:CCACCGCTGCCGCCACCGCCGTGGCAACCGCAACCGCCGT;
PCR反应体系包括:超纯水17 μL、引物F 2.5 μL、引物R 2.5 μL、dNTPs 1 μL、模板1 μL、2×Phana Max Buffer 25 μL、Phana Max Super-Fidelity DNA Polymerse 1μL。
二、SlyD基因做胶回收
将上述PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳实验,将目的条带的聚集抗性蛋白SlyD进行胶回收(DNA凝胶回收试剂盒购自碧云天公司);切胶回收后,称重,将胶切碎在离心管,加入等体积的溶液I(融胶液),颠倒混匀,50-60℃水浴加热约10 min至胶全融,期间,颠倒混匀3-4次,以加速凝胶融解;胶全融后在50-60℃水浴加热2 min,加入到DNA纯化柱内,室温放置1 min,于12000 rpm离心1 min,倒弃收集管内的液体,在DNA纯化柱内加入700 μL溶液II(洗涤液),室温放置1 min,于12000 rpm离心1 min,洗去杂质,倒弃收集管内的液体,再加入500 μL溶液II,最高速离心1 min,进一步洗去杂质,倒弃收集管内的液体,12000 rpm离心1 min,除去残留液体并让残留的乙醇充分挥发。将DNA纯化柱置于1.5mL离心管上,加入30 μL溶液III(洗脱液)至管内柱面上,放置1 min,用1.5ml离心管作为收集管,溶液III需要直接加至管内柱面中央,使液体被纯化柱吸收,于12000 rpm离心1 min,所得液体即为高纯度DNA。
上述的操作中所采用的溶液I、溶液II、溶液III等均为基因做胶回收时所采用的常规溶液,在此不再详细赘述。
对SlyD基因做胶回收琼脂糖凝胶电泳图,得SlyD片段,见附图1。
附图1表明,明亮条带在500-750 bp之间,即通过引物SlyD-F、SlyD-R成功扩增得到了SlyD片段。
实施例2 构建SlyD-SsPDC重组质粒
一、设计引物及基因扩增
以pET28a-SsPDC为模板,扩增SlyD片段需要连接的质粒片段,其中的SsPDC序列为SEQ.ID.NO.3,设计引物并在引物F的5’端添加同源臂CAGGTGCTGGTGCGGGATCC,在引物R的5’端添加同源臂GTGGTGGTGGTGGTGCT;设计引物如下:
SsPDC-F:CAGGTGCTGGTGCGGGATCCACCACCCCGTATACCGTTGGT;
SsPDC-R:GTGGTGGTGGTGGTGCTGAGGTAACGGTTCTGCGCCGCCA;
将上述PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳实验,将目的条带进行胶回收(DNA凝胶回收试剂盒购自碧云天公司)得质粒片段;
二、构建重组质粒SlyD-SsPDC
使用ClonExpress试剂盒(购自诺唯赞公司)于冰上配制以下反应体系:模板片段1.5 μL、SlyD片段5.5 μL、5×CE Ⅱ Buffer 缓冲液 2 μL、重组酶ExnaseⅡ 1 μL;使用移液器轻轻吹打混匀,短暂离心(掌中宝)将反应液收集至管底;37℃水浴反应30 min,结束后立即冰浴2 min,得重组质粒SlyD-SsPDC。
三、重组质粒转化及蛋白诱导表达
从-80℃超低温冰箱中取出Overexpress C43(DE3)感受态细胞,冰上放置,待细胞融化后,分别向感受态细胞中加入2 μL SlyD-SsPDC重组质粒,冰上放置30 min,42℃热激50 s,然后冰上放置3 min,涂布于含有Kana抗性(50 μg/mL)的LB平板培养基上,37℃倒置培养过夜;
同时,将不含有融合标签的SsPDC进行复苏活化,次日挑斑后摇菌,将上述菌液取1mL转入100 mL LB(Kana),37℃摇床培养3 h后加入100 uL IPTG(0.1 mM),28℃诱导20 h,使用离心机7000 rpm,离心10 min收菌,然后放入-20℃保存。
实施例3 SDS-PAGE蛋白电泳验证
统一菌浓,将菌体沉淀用10 mL PBS缓冲液重悬,再用PB缓冲液重悬稀释20倍后,用酶标仪测OD 600,得SsPDC的菌浓为0.81,SlyD-SsPDC的菌浓为0.48;将原液按比例稀释至OD 600值为2.5,稀释后取出40 uL后与10 uL 5×蛋白上样缓冲液混匀,沸水浴10 min即为全细胞蛋白样品。
将1 mL全细胞蛋白样品进行超声破碎1 min,离心机12000 rpm离心10 min,取40uL后与10 uL 5×蛋白上样缓冲液混匀,沸水浴10 min即为上清蛋白样品。
用1mL PBS缓冲液重悬洗两遍,再用1 mL PBS缓冲液重悬取40 uL后与10 uL 5×蛋白上样缓冲液混匀,沸水浴10 min即为沉淀蛋白样品。
将Marker与上述样品进行SDS-PAGE电泳实验,结果见附图2。
附图2中,从左至右依次是蛋白Marker、SsPDC全细胞菌液、SsPDC全细胞菌液破碎后上清液、SsPDC全细胞菌液破碎后沉淀、SlyD-SsPDC全细胞菌液、SlyD-SsPDC全细胞菌液破碎后上清液、SlyD-SsPDC全细胞菌液破碎后沉淀。
附图2显示,融合标签SlyD能够提高丙酮酸脱羧酶SsPDC在大肠杆菌表达***中的蛋白表达量,同时表达的蛋白几乎为可溶性蛋白。
实施例4 全细胞酶催化反应
将冻存一天的湿菌体称取0.1 g用PBS缓冲液重悬,统一稀释至OD600为7.0,取5mL做酶催化反应,反应体系如下:糠醛40 Mm;甲醛120 mM;ThDP 0.1 mM;Mg2+2.5 mM;反应温度38℃,反应转速800 rpm;金属浴预热,最后加入甲醛开始反应;在反应开始后10min,30min时检测反应效率,结果如附图3所示。
附图3中显示了全细胞酶催化底物的转化率情况,从图3中可以看出:10 min时,SsPDC的反应效率为31.59%,SlyD-SsPDC的反应效率为55.95%;30 min时,SsPDC的反应效率为77.15%,SlyD-SsPDC的反应效率为97.04%。
上述实施例为本发明较佳的实施方式,但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制,其他的任何背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化,均应为等效的置换方式,都包含在本发明的保护范围之内。
Claims (3)
1.一种提高丙酮酸脱羧酶SsPDC在大肠杆菌中可溶性表达的方法,其特征在于,以聚集抗性蛋白SlyD为融合标签,以大肠杆菌基因组为模板扩增SlyD基因片段,以同源重组的方式连接至pET28a-SsPDC上,构成SlyD-SsPDC重组质粒,此重组质粒即为pET28a-SlyD-SsPDC原核表达载体,将该原核表达载体导入大肠杆菌表达***中得重组菌,于28℃诱导20 h,诱导表达SlyD-SsPDC蛋白;
所述以大肠杆菌基因组为模板扩增SlyD基因片段时,具体操作为:以大肠杆菌全基因组为模板,扩增来自于大肠杆菌的融合标签SlyD,设计引物,并在引物F的5’端添加同源臂AAGAAGGAGATATACCATGGGC,在引物R的5’端添加同源臂CCACCGCTGCCGCCACCGCC;引物如下:
SlyD-F:
AAGAAGGAGATATACCATGGGCATGAAAGTAGCAAAAGACCTGG;
SlyD-R:CCACCGCTGCCGCCACCGCCGTGGCAACCGCAACCGCCGT;
所述聚集抗性蛋白SlyD融合标签的基因核苷酸序列如SEQ.ID.NO.1所示;
所述SlyD-SsPDC蛋白以湿菌体的形式进行表达,具体操作如下:将冻存一天的湿菌体称取0.1 g用磷酸盐缓冲液重悬,统一稀释至OD600为7.0,取5 mL做酶催化反应,反应体系如下:糠醛40 Mm,甲醛120 mM,ThDP 0.1 mM,Mg 2+ 2.5 mM,反应温度38℃,反应转速800 rpm,金属浴预热,最后加入甲醛开始反应。
2.一种包含聚集抗性蛋白SlyD的pET28a-SlyD-SsPDC原核表达载体,其特征在于,所述的原核表达载体的制备方法,包括如下步骤:
(1)扩增SlyD的编码基因,具体操作为:以大肠杆菌全基因组为模板,扩增来自于大肠杆菌的融合标签SlyD,设计引物,并在引物F的5’端添加同源臂AAGAAGGAGATATACCATGGGC,在引物R的5’端添加同源臂CCACCGCTGCCGCCACCGCC;引物如下:
SlyD-F:
AAGAAGGAGATATACCATGGGCATGAAAGTAGCAAAAGACCTGG;
SlyD-R:CCACCGCTGCCGCCACCGCCGTGGCAACCGCAACCGCCGT;
所述聚集抗性蛋白SlyD融合标签的基因核苷酸序列如SEQ.ID.NO.1所示;
(2)将SlyD与SsPDC构建在同一个质粒上,构建成pET28a-SlyD-SsPDC原核表达载体。
3.权利要求2中所述的一种包含聚集抗性蛋白SlyD的pET28a-SlyD-SsPDC原核表达载体在提高SsPDC蛋白可溶性表达中的应用。
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