JP4344858B2 - 細胞内で抗ウイルス性小ｒｎａ分子を発現させる方法 - Google Patents

細胞内で抗ウイルス性小ｒｎａ分子を発現させる方法 Download PDF

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Description

【技術分野】
【０００１】
＜政府援助＞
本発明は、国立衛生研究所（National Institutes of Health）より授与された補助金番号ＧＭ３９４５８の下で政府の支援を用いてなされた。合衆国政府は、本発明に一定の権利を有する。
【０００２】
＜発明の分野＞
本発明は、一般に、ＲＮＡ分子を送達するように、より具体的には遺伝子発現を下方調節または調整するために使用され得る二本鎖ＲＮＡ分子を送達するように設計されているウイルス構築物を使用して細胞または動物における遺伝子発現を改変する方法に関する。本発明の詳細な態様は、ＲＮＡ分子を発現するように設計されているウイルス構築物の送達を通じて、病原性ウイルス遺伝子または病原性ウイルスの生活環に必要な遺伝子を下方調節することに関する。
【背景技術】
【０００３】
＜関連技術の記載＞
ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）またはサイレンシングは、近年発見された現象である（A. Fire et al., Nature 391, 806（1998）; C. E. Rocheleau et al. Cell 90, 707（1997））。スモール・インターフェリングＲＮＡ（small interfering RNAs）（「ｓｉＲＮＡ」）とは、それらと相同性を示す遺伝子の発現を阻害する二本鎖ＲＮＡ分子である。ｓｉＲＮＡは、様々な培養細胞でならびに無脊椎動物で、特定遺伝子の発現を下方調節するための道具として使用されてきた。そのようなアプローチの多くは、最近概説されている（P. D. Zamore Science 296,1265（2002））。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
しかし、そのようなアプローチには限界がある。例えば、本明細書中に記載される本発明以前には、ＲＮＡ干渉を通じて下方調節された特定の遺伝子を有する遺伝子組換え哺乳類の発生を可能にする技法はない。同様に、調節機能を持つ小ＲＮＡ分子を導入するためのより着実な方法が必要とされている。本明細書中に提供される本発明は、ＲＮＡが介在する遺伝子調節の分野でのこれらおよび他の制限に対処する。同じく、ウイルスおよびウイルス感染に伴う疾患の治療のための改善された方法および組成物が必要とされている。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明は、概して、細胞内でＲＮＡ分子（単数または複数）を発現する方法に関する。これらの方法は、多様な細胞型で使用され得る。ＲＮＡ分子は、様々な目的のために細胞内で発現され得る。例えば、ＲＮＡ分子は、細胞内でマーカーとなり得、遺伝子発現を調節するためのアンチセンスオリゴヌクレオチドまたはリボザイムであり得、そしてＲＮＡ干渉を通じて遺伝子を下方調節するために役立ち得る。
１態様において、本発明の方法は、ウイルスのゲノム、ウイルスの転写物、またはウイルス複製に必要な宿主細胞遺伝子などの標的核酸とＲＮＡ干渉を通じて病原体の生活環の１つまたは複数の態様を阻害する、１つまたは複数のＲＮＡ分子の発現による、感染の治療または予防に関する。
【０００６】
本発明の別の態様に従って、ＲＮＡ分子を発現させる方法が提供され、本方法は、パッケージング細胞株をレトロウイルス構築物でトランスフェクトすること、およびパッケージング細胞株から組換えレトロウイルスを回収することを含む。次いで、宿主細胞は組換えレトロウイルスに感染させられる。
【０００７】
組換えレトロウイルス構築物は、好ましくは、第一ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーター領域、少なくとも１つのＲＮＡコード領域、および少なくとも１つの終結配列を有する。ＲＮＡコード領域は、好ましくは、標的核酸内の標的配列と少なくとも約９０％同一である配列を含む。標的核酸は、例えば、病原性ウイルスＲＮＡゲノムまたはゲノム転写物の一部分、あるいは病原性ウイルスの生活環に関与する標的細胞遺伝子の一部分など病原体の生活環に必要なものであることが好ましい。
【０００８】
１実施形態において、本発明の方法は、病原体の生活環を妨害するために使用される。詳細な実施形態において、本方法は、直接ＲＮＡゲノムを標的とすることにより、ＲＮＡゲノムを有するウイルス、例えば、レトロウイルス、の生活環を妨害するために使用される。別の実施形態において、個別のウイルス遺伝子の転写物を含むウイルスゲノム転写物が標的となる。本方法はまた、宿主細胞において、宿主細胞内へウイルスが入るのに必要な受容体または補助受容体などのウイルスの生活環に関与する遺伝子を下方調節するために使用され得る。
【０００９】
本発明の１態様において、ＲＮＡコード領域は、ｓｉＲＮＡ、好ましくはセンス領域、アンチセンス領域、およびループ領域を有する自己相補的な「ヘアピン」ＲＮＡ分子をコードする。ループ領域は一般に、約２〜約１５ヌクレオチド長の間であり、そしてさらに好適な実施形態において約６〜約９ヌクレオチド長である。ヘアピン分子の二本鎖領域は、標的配列と相同なヌクレオチド配列を含む。ヘアピン分子中の配列は、標的配列と、好ましくは少なくとも約９０％同一であり、より好ましくは少なくとも約９５％同一であり、さらにより好ましくは少なくとも約９９％同一である。
【００１０】
別の実施形態において、ＲＮＡコード領域は第一ＲＮＡ分子をコードし、レトロウイルス構築物は第二ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーターおよび第二ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーターに操作可能に連結した第二ＲＮＡコード領域を有する。そのような実施形態において、第二ＲＮＡコード領域は、第一ＲＮＡ分子と実質的に相補的なＲＮＡ分子をコードする。第一および第二ＲＮＡコード領域の発現に際して、二本鎖複合体が細胞内で形成される。
【００１１】
さらに別の実施形態において、レトロウイルス構築物は、第一ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーターからのＲＮＡコード領域の発現が第一ＲＮＡ分子の合成をもたらし、かつ第二ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーターからのＲＮＡコード領域の発現が第一ＲＮＡ分子と実質的に相補的な第二ＲＮＡ分子の合成をもたらすように、ＲＮＡコード領域と操作可能に連結した第二ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーター領域を有し得る。そのような１実施形態において、ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーターは、終結配列によりＲＮＡコード領域と分離されている。
【００１２】
本発明の１実施形態において、標的細胞は胚細胞である。本明細書中に使用されるとおりの胚細胞は、単細胞胚、および初期胚内の胚細胞を含む。本発明の別の実施形態において、標的細胞は胚形成幹細胞である。標的細胞が胚細胞である場合、胚細胞は、組換えレトロウイルスを哺乳類胚細胞の透明帯と細胞膜との間に注入することにより、感染させられ得る。別の実施形態において、胚細胞は、透明帯を除去して、組換えレトロウイルスを含む溶液中で細胞を培養することにより感染させられ得る。そのような実施形態において、透明帯は、酵素的消化により除去され得る。標的細胞が胚細胞または胚形成幹細胞である場合、本発明の方法は、偽妊娠のメスに胚細胞を移植して遺伝子組換え動物を発生させることも含む。そのような様式において、遺伝子組換え動物は、ウイルスなどの特定の病原体に耐性であるように発生し得る。
【００１３】
本発明の方法はまた、様々な初代細胞、ｅｘ ｖｉｖｏ正常細胞または疾患細胞、あるいは様々な組織培養条件に適合した細胞で使用され得る。細胞は、好ましくは、ヒト、マウス、または他の脊椎動物から得られる。細胞は、制限なしに、造血幹細胞または前駆体細胞、中枢神経系細胞、様々な他の組織および器官の再生能力を持つ細胞、樹状細胞ならびに他の発達中および成熟した骨髄細胞、リンパ細胞、および異なる細胞系譜由来の癌細胞を含み得る。
【００１４】
別の態様において、本発明は、細胞内でのＲＮＡ分子（単数または複数）発現のためのレトロウイルス構築物を提供する。構築物は、好ましくは、ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩ（ｐｏｌ ＩＩＩ）プロモーターを含む。１実施形態においてレトロウイルス構築物は、ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーターと操作可能に連結したＲＮＡコード領域を有する。ＲＮＡコード領域の直後にｐｏｌ ＩＩＩターミネーター配列が続き得、ｐｏｌ ＩＩＩによるＲＮＡ合成の終結を指示する。ｐｏｌ ＩＩＩターミネーター配列は一般に、４個またはそれより多くの連続したチミジン（「Ｔ」）残基を有する。好適な実施形態において、５個の連続したＴのクラスターがターミネーターとして使用され、これによりｐｏｌ
ＩＩＩ転写はＤＮＡテンプレートの二番目または三番目のＴで止まり、したがって２個または３個のウリジン（「Ｕ」）残基のみがコード配列の３'末端に付加される。様々なｐｏｌ ＩＩＩプロモーターが本発明で使用され得、例えば、ヒトまたはマウス起源のＨ１ ＲＮＡ遺伝子またはＵ６ ｓｎＲＮＡ遺伝子由来の、あるいは任意の他の種由来のプロモーターフラグメントを含む。また、ｐｏｌ ＩＩＩプロモーターは、遍在性または組織特異的様式のいずれかで化学的小分子により誘発される能力などの他の望ましい性質を取り込むように改良／操作され得る。例えば、１つの実施形態において、プロモーターはテトラサイクリンにより活性化されてもよい。別の実施形態において、プロモーターはＩＰＴＧ（ｌａｃＩ系）により活性化されてもよい。
【００１５】
レトロウイルス構築物は、多数のレトロウイルスベクターに基づき得る。好適な実施形態において、レトロウイルス構築物は、５'レンチウイルス末端反復配列（ＬＴＲ）由来のＲおよびＵ５配列および自己不活性化レンチウイルス３'ＬＴＲを有する。別の実施形態において、レトロウイルスベクターは、マウス幹細胞ウイルス（ＭＳＣＶ）に由来する。さらに別の実施形態において、レトロウイルス構築物は、レンチウイルス構築物およびＭＳＣＶ構築物のハイブリッドである。
【００１６】
さらなる実施形態において、ＲＮＡコード領域は、センス領域、アンチセンス領域、およびループ領域を有する自己相補的なＲＮＡ分子をコードする。そのようなＲＮＡ分子は、発現した場合、好ましくは「ヘアピン」構造を形成する。ループ領域は一般に、約２〜約１５ヌクレオチド長の間である。好適な実施形態において、ループ領域は６〜９ヌクレオチド長である。本発明のそのような１実施形態において、センス領域およびアンチセンス領域は、約１５〜約３０ヌクレオチド長の間である。１実施形態において、本発明のこの実施形態のＲＮＡコード領域は、どのような余計な非コードヌクレオチドも５'末端に存在せずにＲＮＡコード配列が正確に発現され得る（すなわち、発現した配列は標的配列と５'末端で同一である）ように、ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーターの下流に操作可能に連結される。ＲＮＡコード領域の合成は、ターミネーター部位で終了する。好適な１実施形態において、ターミネーターは５個の連続したＴ残基を有する。
【００１７】
本発明の別の態様において、レトロウイルスベクターは複数のＲＮＡコード領域を含み得る。そのような１実施形態において、ＲＮＡコード領域は第一ＲＮＡ分子をコードし、レトロウイルス構築物は、第二ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーターおよび第二ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーターに操作可能に連結された第二ＲＮＡコード領域を有する。この実施形態において、第二ＲＮＡ分子は、発現した時に第一および第二ＲＮＡ分子が二本鎖構造を形成し得るように、実質的に第一ＲＮＡ分子と相補的であり得る。ＲＮＡ複合体の二本鎖領域は、ウイルスゲノム、ウイルスゲノム転写物、または病原性ウイルスの生活環に必要なタンパク質をコードする標的細胞ＲＮＡのいずれかの標的領域と少なくとも約９０％同一である。本発明の方法はまた、ヘアピン様の自己相補的なＲＮＡ分子または他の非ヘアピン分子をコードする複数のＲＮＡコード領域を含む。
【００１８】
本発明のさらに別の実施形態において、レトロウイルス構築物は、第一ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーターからのＲＮＡコード領域の発現がセンス鎖としての第一ＲＮＡ分子の合成をもたらし、かつ第二ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーターからのＲＮＡコード領域の発現が第一ＲＮＡ分子と実質的に相補的であるアンチセンス鎖としての第二ＲＮＡ分子の合成をもたらすように、反対方向に同じＲＮＡコード領域と操作可能に連結した第二ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーターを有する。そのような実施形態において、両方のＲＮＡ分子は、終結配列によりコードされる３’オーバーハングの残基を含んでも良い。１実施形態において、両方のＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーターは、終結配列によりＲＮＡコード領域と分離されている。終結配列は５個の連続したＴ残基を有することが好ましい。
【００１９】
本発明の別の態様に従って、５'ＬＴＲ配列はＨＩＶに由来し得る。レトロウイルス構築物はまた、ウッドチャック肝炎ウイルスエンハンサー要素配列および／またはｔＲＮＡアンバー抑制因子配列を有し得る。
【００２０】
本発明の１実施形態において、自己不活性化３'ＬＴＲはエンハンサー配列が欠失したＵ３要素であり得る。さらに別の実施形態において、自己不活性化３'ＬＴＲは改良ＨＩＶ３'ＬＴＲである。
【００２１】
組換えレトロウイルス構築物は、例えば、水泡性口内炎ウイルスエンベロープ糖タンパク質を有するシュードタイプとすることが可能である。
【００２２】
本発明の別の態様に従って、ウイルス構築物はまた、目的の遺伝子をコードし得る。目的の遺伝子は、ポリメラーゼＩＩプロモーターに連結し得る。様々なポリメラーゼＩＩプロモーターが本発明で使用され得、例えば、ＣＭＶプロモーターを含む。選択されるＲＮＡポリメラーゼＩＩプロモーターは、大部分の組織で発現を駆動する能力がある遍在性プロモーター、例えば、ヒトユビキチン−Ｃプロモーター、ＣＭＶβ−アクチンプロモーター、およびＰＧＫプロモーター、とすることが可能である。ＲＮＡポリメラーゼＩＩプロモーターはまた、組織特異的プロモーターとすることが可能である。そのような構築物はまた、例えば、ポリメラーゼＩＩプロモーターと操作可能に連結したエンハンサー配列を含み得る。
【００２３】
１実施形態において、目的の遺伝子は、ベクターが首尾よくトランスフェクトまたは形質導入されてその配列が発現したことを確認するために使用され得る標識遺伝子またはレポーター遺伝子である。そのような１実施形態において、目的の遺伝子はグリーン蛍光タンパク質などの蛍光レポーター遺伝子である。さらに別の実施形態において、目的の遺伝子は、首尾よく形質導入された細胞を選択するために使用され得る薬物耐性遺伝子である。例えば、薬物耐性遺伝子は、ゼオシン耐性遺伝子（ｚｅｏ）とすることが可能である。目的の遺伝子はまた、ｚｅｏ／ｇｆｐ融合などの薬物耐性遺伝子と蛍光レポーター遺伝子とのハイブリッドとすることが可能である。本発明の別の態様において、目的の遺伝子は、誘導性ｐｏｌ ＩＩＩプロモーターの転写活性を調節し得るタンパク質因子をコードする。そのような１実施形態において、目的の遺伝子は、テトラサイクリン応答性ｐｏｌ ＩＩＩプロモーターを調節するｔｅｔＲ（ｔｅｔオペロンのリプレッサー）である。
【００２４】
本発明の別の態様は、細胞内でＲＮＡ分子（単数または複数）を発現させる方法を提供することである。１実施形態において、パッケージング細胞株は、本発明のレトロウイルス構築物でトランスフェクトされ、組換えレトロウイルス性粒子がパッケージング細胞株から回収され、標的細胞が組換えレトロウイルス粒子に感染させられる。そのような方法に従って、レトロウイルス構築物は、レンチウイルス５'末端反復配列（ＬＴＲ）、自己不活性化レンチウイルス３'ＬＴＲ、第一ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーター領域、および少なくとも１つのＲＮＡコード領域からのＲおよびＵ５配列を有する。レトロウイルス構築物はまた、ＲＮＡコード領域と操作可能に連結した終結配列を有し得る。
【００２５】
さらなる態様において、ＨＩＶ感染を患っている患者を治療する方法が提供される。１実施形態において、ＣＤ３４−陽性標的細胞が患者から単離される。次いで、標的細胞は、本発明のレトロウイルス構築物でトランスフェクトされたパッケージング細胞株から回収された組換えレトロウイルスに感染させられる。好ましくは、組換えレトロウイルス構築物は、第一ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーター領域、少なくとも１つのＲＮＡコード領域、および少なくとも１つの終結配列を含む。１実施形態において、ＲＮＡコード領域はＨＩＶゲノムの標的領域、ＨＩＶゲノム転写物、またはＨＩＶ生活環に関与する細胞遺伝子と少なくとも約９０％同一である配列を含む。標的領域は、好ましくは約１８〜約２３ヌクレオチド長である。
【００２６】
１実施形態において、ＲＮＡコード領域は、ヘアピンＲＮＡ分子をコードする。
【００２７】
好適な実施形態において、ＲＮＡコード領域は、ＣＣＲ５遺伝子またはＣＸＣＲ４遺伝子の標的領域と少なくとも約９０％同一である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２８】
本発明者らは、目的の導入遺伝子を細胞または動物内へ導入する方法を見出した。この技法は、同時係属中の米国仮特許出願第６０／３２２，０３１号（２００１年９月１３日出願）および同時係属中の米国仮特許出願第６０／３４７，７８２号（２００２年１月９日出願）に記載されており、それらの全内容は本明細書中に参照として援用される。
【００２９】
他に定義されない限り、本明細書中に使用される全ての技術用語および科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者により一般的に理解されるとおりの意味を有する。本明細書中に記載されるものと類似、または等価な任意の方法、デバイス、および材料が、本発明の実施で使用され得る。
【００３０】
「導入遺伝子」は、任意のヌクレオチド配列、特にヒトの介入により、例えば本発明の方法により、宿主細胞の１つまたは複数の染色体中に結合されたＤＮＡ配列を意味する。１実施形態において、導入遺伝子は「ＲＮＡコード領域」である。別の実施形態において、導入遺伝子は「目的の遺伝子」を含む。他の実施形態において、導入遺伝子はヌクレオチド配列、好ましくはＤＮＡ配列であり得、これは、それが組み込まれている染色体を標識するために使用される。この場合、導入遺伝子は、発現され得るタンパク質をコードする遺伝子を含む必要はない。
【００３１】
「目的の遺伝子」は、宿主細胞への組み込みに望ましいタンパク質または他の分子をコードする核酸配列である。１実施形態において、目的の遺伝子は、宿主細胞でその発現が望まれるタンパク質または他の分子をコードする。この実施形態において、目的の遺伝子は一般に、転写調節配列などの、目的の遺伝子の所望の発現を得るために有用な他の配列に操作可能に連結している。
【００３２】
「機能的に関連」および「操作可能に連結している」は、制限なしに、プロモーターおよび／またはエンハンサーに関して遺伝子が正しい位置および方向にあり、プロモーターおよび／またはエンハンサーが適切な分子に接触すると遺伝子の発現が影響を受けることを意味する。
【００３３】
「ＲＮＡコード領域」は、ｓｉＲＮＡなどのＲＮＡ分子の合成用テンプレートとなり得る核酸である。好ましくは、ＲＮＡコード領域はＤＮＡ配列である。
【００３４】
「スモール・インターフェリングＲＮＡ」または「ｓｉＲＮＡ」は、それが相同性を示す遺伝子の発現を阻害する能力がある二本鎖ＲＮＡ分子である。遺伝子配列または他のヌクレオチド配列の相同性がある領域は、「標的領域」として既知である。１実施形態において、ｓｉＲＮＡは、センス領域、ループ領域、およびセンス領域と相補的なアンチセンス領域を含む「ヘアピン」またはステムループＲＮＡ分子であってもよい。他の実施形態において、ｓｉＲＮＡは、共有結合しないで会合し二本鎖を形成した２個の別個のＲＮＡ分子を含む。
【００３５】
用語「動物」は、その最も広義において使用され、哺乳類、鳥類、魚類、爬虫類、および両生類を含む全動物を示す。
【００３６】
用語「哺乳類」は、哺乳綱の全構成員を示し、哺乳類として分類される任意の動物を含み、ヒト、家庭および農場の家畜、ならびにマウス、ウサギ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ウシ、および高等霊長類などの動物園、競技用、またはペット用動物が挙げられる。
【００３７】
「標的細胞」または「宿主細胞」は、本発明の方法および組成物を使用して形質転換されることになる細胞を意味する。
【００３８】
用語「病原性ウイルス」は、動物に感染する能力があるウイルスを示すものとして、本明細書中に使用される。
【００３９】
「レトロウイルス」は、ＲＮＡゲノムを有するウイルスである。
【００４０】
「レンチウイルス」は、***細胞および非***細胞に感染する能力があるレトロウイルス属を示す。レンチウイルスの例のいくつかとして、ＨＩＶ（ヒト免疫不全ウイルス：ＨＩＶ−１型、およびＨＩＶ−２型を含む）、ヒト後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）の病原因子；ヒツジに脳炎（ビスナ） または肺炎（マエディ）を引き起こすビスナ−マエディ（visna-maedi）、ヤギで免疫不全、関節炎、および脳症を引き起こすヤギ関節炎−脳脊髄炎ウイルス；ウマで自己免疫性溶血性貧血および脳症を引き起こすウマ伝染性貧血ウイルス；ネコで免疫不全を引き起こすネコ免疫不全ウイルス（ＦＩＶ）；ウシでリンパ節症、リンパ球増加、およびおそらく中枢神経系の感染を引き起こすウシ免疫不全ウイルス（ＢＩＶ）；ならびに猿人類で免疫不全および脳症を引き起こすサル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）が挙げられる。
【００４１】
本明細書中で使用される「ハイブリッドウイルス」は、１つまたは複数の他のウイルスベクター由来の成分を有するウイルス、非レトロウイルスベクター由来の要素を含むウイルス、例えば、アデノウイルスーレトロウイルスハイブリッドを示す。本明細書中に使用された、レトロウイルス成分を有するハイブリッドベクターは、レトロウイルスの範囲内にあると判断されることになる。
【００４２】
レンチウイルスゲノムは一般に、５'末端反復配列（ＬＴＲ）、ｇａｇ遺伝子、ｐｏｌ遺伝子、ｅｎｖ遺伝子、アクセサリー遺伝子（ｎｅｆ、ｖｉｆ、ｖｐｒ、ｖｐｕ）および３'ＬＴＲで構成されている。ウイルスＬＴＲは、Ｕ３、Ｒ、およびＵ５と呼ばれる３つの領域に分けられる。Ｕ３領域は、エンハンサーおよびプロモーター要素を含む。Ｕ５領域は、ポリアデニル化シグナルを含む。Ｒ（繰返し）領域は、Ｕ３領域とＵ５領域を分断し、Ｒ領域の転写配列は、ウイルスＲＮＡの５'末端および３'末端の両方で出現する。例えば、「ＲＮＡウイルス：実践的アプローチ（RNA Viruses: A Practical Approach）」（Alan J. Canr., Ed., Oxford University Press, （2000））、O Narayan and Clements J. Gen. Virology 70: 1617-1639 （1989）、Fields et al. Fundamental Virology Raven Press. （1990）、Miyoshi H, Blomer U, Takahashi M, Gage FH, Verma IM. J Virol. 72 （10）: 8150-7 （1998）、および米国特許第６，０１３，５１６号を参照。
【００４３】
レンチウイルスベクターは当該技術分野で既知であり、いくつかは、造血幹細胞をトランスフェクトするために使用されてきている。そのようなベクターは、例えば、以下の文献に見出すことが可能であり、これらは本明細書中に参考として援用される：Evans JT et al. Hum Gene Ther 1999; 10: 1479-1489; Case SS, Price MA, Jordan CT et al. Proc Natl Acad Sci USA 1999; 96: 2988-2993; Uchida N, Sutton RE, Friera AM et al. Proc Natl Acad Sci USA 1998; 95: 11939-11944; Miyoshi H, Smith KA, Mosier DE et al. Science 1999; 283: 682-686; Sutton RE, Wu HT, Rigg R et al. 「ヒト免疫不全ウイルス１型ベクターはヒト造血幹細胞に効果的に形質導入する（Human immunodeficiency virus type 1 vectors efficiently transduce human hematopoietic stem cells）」. J Virol 1998; 72: 5781-5788。
【００４４】
「ビリオン」、「ウイルス粒子」、および「レトロウイルス性粒子」は、ＲＮＡゲノム、ｐｏｌ遺伝子由来のタンパク質、ｇａｇ遺伝子由来のタンパク質およびエンベロープ（糖）タンパク質を表す脂質二重層を含む単一のウイルスを示すものとして、本明細書中に使用される。ＲＮＡゲノムは通常、組換えＲＮＡゲノムであり、したがって、天然のウイルスゲノムにとって外来性のＲＮＡ配列を含み得る。ＲＮＡゲノムはまた欠損した内在性ウイルス配列を含み得る。
【００４５】
「シュードタイプの」レトロウイルスは、ＲＮＡゲノムの由来となるウイルス以外のウイルスに由来するエンベロープタンパク質を有するレトロウイルス性粒子である。エンベロープタンパク質は、別のレトロウイルス由来または非レトロウイルス性ウイルス由来であってもよい。好適なエンベロープタンパク質は、水泡性口内炎（stomatitius）ウイルスＧ（ＶＳＶ Ｇ）タンパク質である。しかしながら、ヒト感染の可能性を排除するために、ウイルスは代替的に、マウスまたは鳥類など特定の種に感染を限定するエコトロピックエンベロープタンパク質を有するシュードタイプとされ得る。例えば、１実施形態において、突然変異エコトロピックエンベロープタンパク質（エコトロピックエンベロープタンパク質４．１７（Powell et al. Nature Biotechnology 18 （12）: 1279-1282 （2000））など）が使用される。
【００４６】
用語「プロウイルス」は、ＲＮＡレトロウイルスのゲノムに相当する、真核生物染色体に存在する二本鎖ＤＮＡ配列を示すものとして使用される。プロウイルスは、宿主細胞の溶解または破壊を引き起こすことなく、１つの細胞世代から次へと伝達され得る。
【００４７】
「自己不活性化３'ＬＴＲ」は、ＬＴＲ配列が下流遺伝子の発現を駆動することを防ぐ突然変異、置換、または欠失が含まれる３'末端反復配列（ＬＴＲ）である。３'ＬＴＲ由来のＵ３領域のコピーは、組み込まれたプロウイルスでの両ＬＴＲの生成用テンプレートとして作用する。したがって、不活性化欠失または突然変異を持つ３'ＬＴＲがプロウイルスの５'ＬＴＲとして組み込まれる場合、５'ＬＴＲからの転写は不可能である。これは、ウイルスエンハンサー／プロモーターと任意の内部エンハンサー／プロモーターとの間の競合を排除する。自己不活性化３'ＬＴＲは、例えば、Zufferey et al. J Virol. 72: 9873-9880 （1998）、Miyoshi et al. J. Virol. 72: 8150-8157 、および Iwakuma et al. Virology 261: 120-132 （1999）に記載される。
【００４８】
用語「ＲＮＡ干渉またはサイレンシング」は、遺伝子発現のＲＮＡ媒介型阻害の全ての転写後機構および転写機構、P. D. Zamore Science 296,1265（2002）に記載されるものなどを含むものとして、広く定義される。
【００４９】
本明細書中に使用される「実質的な相補性」および「実質的に相補的な」は、２つの核酸が、約１５ヌクレオチドを超える領域、より好ましくは約１９ヌクレオチドを超える領域にわたり、少なくとも８０％相補的、より好ましくは少なくとも９０％相補的、そして最も好ましくは少なくとも９５％相補的であることを意味する。
【００５０】
本発明の１態様において、組換えレトロウイルスは、目的のＲＮＡコード領域を細胞へ、好ましくは哺乳類細胞へ送達するために使用される。細胞は、初代細胞または培養細胞であってもよい。１実施形態において、細胞は卵母細胞または胚細胞、より好ましくは１細胞期胚である。別の実施形態において、細胞は造血幹細胞である。したがって、ＲＮＡコード領域および任意の付随する遺伝要素は、宿主細胞のゲノムにプロウイルスとして組み込まれる。標的細胞が胚である場合、細胞は次いで、当該技術分野で既知の方法により、遺伝子組換え動物へ発達させられ得る。
【００５１】
ＲＮＡコード領域を送達するために使用される組換えレトロウイルスは、好ましくは改良レンチウイルスであり、したがって***細胞および非***細胞の両方に感染することが可能である。組換えレトロウイルスは、好ましくはＲＮＡコード領域を含む改良レンチウイルスゲノムを含む。さらに、改良レンチウイルスゲノムは、好ましくはウイルス複製に必要なタンパク質の内在性遺伝子を欠いており、したがって標的細胞での複製などの望ましくない複製を防ぐ。必要タンパク質は、以下に記載されるように、好ましくは、組換えレトロウイルスの産生の間パッケージング細胞株にトランスで提供される。
【００５２】
別の実施形態において、ＲＮＡコード領域を送達するために使用される組換えレトロウイルスは、改良モロニーウイルス、例えば、モロニーマウス白血病ウイルスである。さらなる実施形態において、ウイルスはマウス幹細胞ウイルスである（Hawley, R. G., et al. （1996） Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93: 10297-10302 ; Keller, G., et al. （1998） Blood 92: 877-887; Hawley, R. G., et al. （1994） Gene Ther. 1: 136-138）。組換えレトロウイルスはまた、Choi, JK; Hoanga, N; Vilardi, AM; Conrad, P; Emerson, SG; Gewirtz, AM. （2001）「ハイブリッドＨＩＶ／ＭＳＣＶ ＬＴＲはヒトＣＤ３４＋造血細胞におけるレンチウイルスベクターの導入遺伝子発現を高める（Hybrid HIV/MSCV LTR Enhances Transgene Expression of Lentiviral Vectors in Human CD34+ Hematopoietic Cells）」 Stem Cells 19、No. 3, 236-246に記載されるもののようなハイブリッドウイルスであり得る。
【００５３】
１実施形態において、導入遺伝子、好ましくはＲＮＡコード領域は、完全なレトロウイルス５'ＬＴＲおよび自己不活性化３'ＬＴＲを含むウイルス構築物に組込まれる。ウイルス構築物は、好ましくは、ウイルス構築物に基づくウイルスゲノムＲＮＡを所望の宿主特異性を持つウイルス粒子にパッケージングしたパッケージング細胞株に導入される。ウイルス粒子は回収されて宿主細胞に感染させられる。これらの態様のそれぞれが、以下に詳細に記載される。
【００５４】
＜ウイルス構築物＞
ウイルス構築物は、パッケージング細胞での組換えウイルス粒子の産生に必要な配列を含むヌクレオチド配列である。１実施形態において、ウイルス構築物はさらに宿主で目的の遺伝子の所望の発現を可能にする遺伝要素を含む。
【００５５】
ウイルス構築物の産生は、当該技術分野で既知の任意の適切な遺伝子工学技法を使用して達成され得、例えば、Sambrook et al. （「分子クローニング：実験室手引書（Molecular Cloning: A Laboratory Manual）」Cold Spring Harbor Laboratory Press, N. Y. （1989））、Coffin et al. （「レトロウイルス（Retroviruses）」Cold Spring Harbor Laboratory Press, N. Y. （1997）） および「ＲＮＡウイルス：実践的アプローチ（RNA Viruses : A Practical Approach）」 （Alan J. Cann, Ed., Oxford University Press, （2000））に記載されるように、制限なく、ＰＣＲ、オリゴヌクレオチド合成、制限エンドヌクレアーゼ消化、ライゲーション、形質転換、プラスミド精製、およびＤＮＡ配列決定の標準技法を含む。
【００５６】
ウイルス構築物は、任意の既知の生物のゲノムからの配列を組込み得る。配列は、それらの自然の形で組込まれてもよく、また任意の方法で改良されてもよい。例えば、配列は挿入、欠失、または置換を含んでもよい。好適な実施形態において、ウイルス構築物はＨＩＶゲノムまたはＳＩＶゲノムなどのレンチウイルスゲノム由来の配列を含む。別の好適な実施形態において、ウイルス構築物はマウス幹細胞ウイルス（ＭＳＣＶ）の配列を含む。
【００５７】
ウイルス構築物は、好ましくは、レンチウイルス、モロニーマウス白血病ウイルス、マウス幹細胞ウイルス、またはそれらのハイブリッドの５'ＬＴＲおよび３'ＬＴＲ由来の配列を含む。１実施形態において、ウイルス構築物は、レンチウイルスの５'ＬＴＲ由来のＲおよびＵ５配列ならびにレンチウイルス由来の不活性化または自己不活性化３'ＬＴＲを含む。ＬＴＲ配列は、任意の種からの任意のレンチウイルス由来のＬＴＲ配列であり得る。例えば、それらは、ＨＩＶ、ＳＩＶ、ＦＩＶまたはＢＩＶ由来のＬＴＲ配列であり得る。好ましくは、ＬＴＲ配列はＨＩＶ ＬＴＲ配列である。ウイルスはまた、ＭＭＶまたはＭＳＣＶ由来の配列を取り込み得る。
【００５８】
ウイルス構築物は、好ましくは、不活性化または自己不活性化３'ＬＴＲを含む。３'ＬＴＲは、当該技術分野で既知の任意の方法により自己不活性化にされ得る。１実施形態において３'ＬＴＲのＵ３要素は、そのエンハンサー配列、好ましくはＴＡＴＡ ｂｏｘ、ＳｐｌおよびＮＦ−ｋａｐｐａ Ｂ部位の欠失を含む。自己不活性化３'ＬＴＲの結果として、宿主細胞ゲノムに組み込まれたプロウイルスは不活性化５'ＬＴＲを含むことになる。
【００５９】
随意に、レンチウイルス５'ＬＴＲ由来のＵ３配列は、ウイルス構築物のプロモーター配列で置換され得る。このことは、パッケージング細胞株から回収されたウイルスの力価を増加させ得る。エンハンサー配列もまた含まれ得る。パッケージング細胞株でのウイルスＲＮＡゲノムの発現を増加させる任意のエンハンサー／プロモーターの組合せが使用され得る。そのような１実施形態においてＣＭＶエンハンサー／プロモーター配列が使用される（米国特許第５，１６８，０６２号、Karasuyama et al J. Exp. Med. 169: 13（1989）。
【００６０】
ウイルス構築物はまた、導入遺伝子を含む。導入遺伝子は、任意のヌクレオチド配列であり得、プロウイルス用マーカーとして働く配列を含む。好ましくは、導入遺伝子は、１つまたは複数のＲＮＡコード領域および／または１つまたは複数の目的の遺伝子を含む。
【００６１】
好適な実施形態において、導入遺伝子は少なくとも１つのＲＮＡコード領域を含む。好ましくは、ＲＮＡコード領域は、宿主細胞で所望のＲＮＡ分子を発現させるためのテンプレートとして働き得るＤＮＡ配列である。１実施形態において、ウイルス構築物は、２つまたはそれより多くのＲＮＡコード領域を含む。
【００６２】
ウイルス構築物はまた、好ましくは、少なくとも１つのＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーターを含む。ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーターは、ＲＮＡコード領域と操作可能に連結しており、そして終結配列とも連結し得る。また、１つより多いＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーターが組込まれ得る。
【００６３】
ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーターは、当業者に既知である。ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーターの適した範囲は、例えば、Paule and White. Nucleic Acids Research., Vol 28, pp 1283-1298 （2000）に見いだすことが可能であり、これは本明細書中にその全体が参考として援用される。ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーターの定義にはまた、ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩにその下流のＲＮＡコード配列を転写するよう指図し得る任意の合成または操作されたＤＮＡフラグメントも含まれる。さらに、ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩ（Ｐｏｌ ＩＩＩ）プロモーター、またはウイルスベクターの一部分として使用されるプロモーターが誘導され得る。任意の適した誘導Ｐｏｌ ＩＩＩプロモーターが本発明の方法で使用され得る。特に適したＰｏｌ ＩＩＩプロモーターとして、Ohkawa and Taira Human Gene Therapy、Vol. 11, pp 577-585 （2000）ならびに Meissner et al. Nucleic Acids Research, Vol. 29, pp 1672-1682 （2001）に記載されるテトラサイクリン応答性プロモーターが挙げられ、これらは本明細書中に参考として援用される。
【００６４】
１実施形態において、ウイルス構築物はさらに、１つまたは複数の標的細胞で望ましく発現されるタンパク質、例えば、レポーターまたはマーカータンパク質、をコードする遺伝子を含む。好ましくは、目的の遺伝子は５'ＬＴＲ配列と３'ＬＴＲ配列との間に位置する。さらに、目的の遺伝子は好ましくは、他の遺伝要素、例えば、プロモーターおよび／またはエンハンサーなどといった転写調節配列、と機能的に関連しており、いったん目的の遺伝子が標的細胞ゲノム中に組込まれると特定の様式で目的の遺伝子の発現を調節する。特定の実施形態において、有用な転写調節配列は、時間的かつ空間的の両方で、活性に関して高度に調節されるものである。
【００６５】
好ましくは、目的の遺伝子は内部ポリメラーゼＩＩプロモーター／エンハンサー制御配列と機能的に関連している。「内部」プロモーター／エンハンサーは、ウイルス構築物の５'ＬＴＲ配列と３'ＬＴＲ配列との間に位置し、望ましく発現する遺伝子と操作可能に連結したものである。
【００６６】
ポリメラーゼＩＩプロモーター／エンハンサーは、それが機能的に関連している遺伝子の発現を増加させることが既知である任意のプロモーター、エンハンサー、またはプロモーター／エンハンサーの組合せであり得る。「機能的に関連」および「操作可能に連結した」とは、制限なしに、プロモーターおよび／またはエンハンサーに関して導入遺伝子またはＲＮＡコード領域が正しい位置および向きにあり、プロモーターおよび／またはエンハンサーが適切な分子に接触すると遺伝子の発現が影響を受けることを意味する。
【００６７】
別の実施形態において、目的の遺伝子は、動物内、またはより具体的にヒト患者内などの異種集団内で、処理された標的細胞の選択的殺傷を可能にするための安全上の注意から含まれる遺伝子である。そのような１実施形態において、目的の遺伝子はチミジンキナーゼ遺伝子（ＴＫ）であり、その発現は、標的細胞を薬物ガンシクロビルの作用に感受性にする。
【００６８】
また、１つより多い目的の遺伝子が、内部プロモーターと機能的関連に置かれ得る。例えば、マーカータンパク質をコードする遺伝子が、第一目的の遺伝子の後に置かれて所望のタンパク質を発現する細胞の同定を可能にし得る。１実施形態において、蛍光マーカータンパク質、好ましくは緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）が、目的の遺伝子とともに構築物中に組込まれる。第二のレポーター遺伝子が含まれる場合、内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）配列もまた、好ましくは含まれる（米国特許第４，９３７，１９０号）。ＩＲＥＳ配列は、レポーター遺伝子の発現を促進し得る。
【００６９】
ウイルス構築物はまた、さらなる遺伝要素を含み得る。構築物に含まれ得る要素の型はどのような方法でも制限されず、特定の結果を達成するために当業者により選択される。例えば、標的細胞へのウイルスゲノムの核進入を促進するシグナルが含まれ得る。そのようなシグナルの例は、ＨＩＶ−１フラップシグナルである。
【００７０】
さらに、動物のゲノム中のプロウイルス組み込み部位の特性付けを促進する要素が含まれ得る。例えば、ｔＲＮＡアンバー抑制因子配列が構築物に含まれ得る。
【００７１】
また、構築物は、目的の遺伝子の発現を高めるように設計された１つまたは複数の遺伝要素を含み得る。例えば、ウッドチャック肝炎ウイルス応答要素（ＷＲＥ）が、構築物中に置かれ得る（Zufferey et al. J. Virol. 74: 3668-3681（1999）; Deglon et al. Hum. Gene Ther. 11: 179-190（2000））。
【００７２】
ニワトリβ−グロビンインスレーター（Chung et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94: 575-580 （1997））もまた、ウイルス構築物に含まれ得る。この要素は、メチル化およびヘテロクロマチン化効果による標的細胞に組み込まれたプロウイルスのサイレンシングの機会を減少させることが示されている。また、インスレーターは、内在エンハンサー、プロモーター、および外因性遺伝子を、染色体の組み込み部位での周囲のＤＮＡの正または負の位置効果から遮断し得る。
【００７３】
任意のさらなる遺伝要素は、好ましくは目的の遺伝子またはＲＮＡコード領域の３’に挿入される。
【００７４】
特定の実施形態において、ウイルスベクターは以下を含む：ＲＮＡ ｐｏｌ ＩＩＩプロモーター配列；ＨＩＶ５' ＬＴＲ由来のＲおよびＵ５配列；ＨＩＶ−１フラップシグナル；内在エンハンサー；内在プロモーター；目的の遺伝子；ウッドチャック肝炎ウイルス応答要素；ｔＲＮＡアンバー抑制因子配列；エンハンサー配列が欠失したＵ３要素；ニワトリβ−グロビンインスレーター；ならびに３'ＨＩＶ ＬＴＲのＲおよびＵ５配列。
【００７５】
ウイルス構築物は、好ましくは、パッケージング細胞株にトランスフェクトされ得るプラスミド中にクローニングされる。好適なプラスミドは、好ましくは、細菌でのプラスミド複製に有用な配列を含む。
【００７６】
模範的なレトロウイルス構築物の模式図は、図１Ａおよび図１Ｂに示される。
【００７７】
＜ウイルスの製造＞
そのゲノムは上記に記載されるウイルス構築物のＲＮＡ複製物を含む感染性レトロウイルス性粒子を製造するために、当該技術分野で既知の任意の方法が使用され得る。
【００７８】
好ましくは、ウイルス構築物はパッケージング細胞株に導入される。パッケージング細胞株は、ウイルス粒子中にウイルスゲノムＲＮＡのパッケージングにトランスで必要なウイルスタンパク質を提供する。パッケージング細胞株は、レトロウイルスタンパク質を発現する能力がある任意の細胞株であり得る。好適なパッケージング細胞株として、２９３（ＡＴＣＣ ＣＣＬ Ｘ）、ＨｅＬａ（ＡＴＣＣ ＣＣＬ ２）、Ｄ１７（ＡＴＣＣ ＣＣＬ １８３）、ＭＤＣＫ（ＡＴＣＣ ＣＣＬ ３４）、ＢＨＫ（ＡＴＣＣ ＣＣＬ−１０）、およびＣｆ２Ｔｈ（ＡＴＣＣ ＣＲＬ １４３０）が挙げられる。最も好適な細胞株は、２９３細胞株である。
【００７９】
パッケージング細胞株は、必要なウイルスタンパク質を安定して発現する。そのようなパッケージング細胞株は、例えば、米国特許第６，２１８，１８１号に記載される。あるいは、パッケージング細胞株は、必要なウイルスタンパク質をコードする核酸を含むプラスミドで一時的にトランスフェクトされ得る。
【００８０】
１実施形態において、ＲＮＡゲノムのパッケージングに必要なウイルスタンパク質を安定して発現するパッケージング細胞株は、上記に記載されるウイルス構築物を含むプラスミドでトランスフェクトされる。
【００８１】
別の実施形態において、必要なウイルスタンパク質を安定して発現しないパッケージング細胞株は、Yee et al. （Methods Cell. Biol. 43A, 99-112 （1994））に記載されるように、基本的に２つまたはそれより多くのプラスミドで同時トランスフェクトされる。プラスミドの１つは、ＲＮＡコード領域を含むウイルス構築物を含む。他のプラスミドは、細胞が、所望の宿主細胞に感染可能な機能的ウイルスを産生することを可能にするために必要なタンパク質をコードする核酸を含む。
【００８２】
パッケージング細胞株は、エンベロープ遺伝子産生物を発現しなくてもよい。この場合、パッケージング細胞株は、ウイルスゲノムを、エンベロープタンパク質を欠いた粒子中にパッケージングする。エンベロープタンパク質は、ウイルス粒子の宿主範囲に一部応答性であるので、ウイルスは、好ましくはシュードタイプである。したがって、パッケージング細胞株は、好ましくは、ウイルスが宿主細胞中へ入ることを許容する膜会合タンパク質をコードする配列を含むプラスミドでトランスフェクトされる。当業者は、使用されることになる宿主細胞に適切なシュードタイプを選択し得るだろう。例えば、１実施形態において、ウイルスは、水泡性口内炎ウイルスエンベロープ糖タンパク質（ＶＳＶｇ）でシュードタイプとなる。特定の宿主範囲を与えることに加えて、このシュードタイプは、ウイルスが非常に高い力価に濃縮されることを許容し得る。ウイルスは、代替的に、マウスまたは鳥類などの特定の種への感染を制限するエコトロピックエンベロープタンパク質でシュードタイプとなり得る。例えば、別の実施形態において、突然変異エコトロピックエンベロープタンパク質（エコトロピックエンベロープタンパク質４．１７（Powell et al. Nature Biotechnology 18 （12）: 1279-1282（2000））など）が使用される。
【００８３】
好適な実施形態において、ウイルスタンパク質を安定して発現しないパッケージング細胞株は、ウイルス構築物と、ｅｎｖ、ｎｅｆ、５'ＬＴＲ、３'ＬＴＲおよびｖｐｕ配列が削除されたＨＩＶ−１パッケージングベクターを含む第二ベクターと、ならびにエンベロープ糖タンパク質をコードする第三ベクターとでトランスフェクトされる。好ましくは、第三ベクターは、ＶＳＶｇエンベロープ糖タンパク質をコードする。
【００８４】
本発明の別の実施形態において、パッケージング細胞のＲＮＡ干渉活性は抑制されて、組換えウイルスの産生を改善する。これには、制限なしに、ダイサー（Dicer）、ＲＮＡ干渉に不可欠であるリボヌクレアーゼのＲＮａｓｅ ＩＩＩファミリーメンバーを阻害するためのｓｉＲＮＡ分子を発現する構築物の同時トランスフェクションまたは安定なトランスフェクションの使用（Hammond et al. Nat. Rev. Genet. 2: 110-119（2001））が挙げられる。
【００８５】
次いで、組換えウイルスは、好ましくはパッケージング細胞から精製され、滴定され、そして所望の濃度に希釈される。
【００８６】
＜ウイルス送達＞
ウイルスは、ウイルスが細胞に感染することを可能にする任意の方法で細胞に送達され得る。好ましくは、ウイルスは細胞膜と接触させられる。ウイルスを哺乳類細胞へ送達する好適な方法は、直接接触を通じてである。
【００８７】
１実施形態において、標的細胞は、好ましくは、培養皿でウイルスと接触させられる。ウイルスは培地に懸濁されて培養皿のウェルに加えられ得る。ウイルスを含む培地は、細胞を蒔く前に加えられても、細胞が蒔かれた後に加えられてもよい。好ましくは、生存性を提供するのに、かつ宿主細胞の感染が生じるように培地中のウイルス濃度を適したものにするのに適切な量の培地で、細胞はインキュベートされる。
【００８８】
細胞は、好ましくは、ウイルスが細胞に感染することを可能にするのに十分な長さの時間、ウイルスとともにインキュベートされる。好ましくは、細胞は、少なくとも１時間、より好ましくは少なくとも５時間、およびさらにより好ましくは少なくとも１０時間ウイルスとともにインキュベートされる。
【００８９】
任意のそのような実施形態において、細胞に感染するのに十分な任意の濃度のウイルスが使用され得る。標的細胞が培養されることになっている場合、ウイルス粒子の濃度は、少なくとも１ｐｆｕ／μｌ、より好ましくは少なくとも１０ｐｆｕ／μｌ、さらにより好ましくは少なくとも４００ｐｆｕ／μｌ、およびさらにより好ましくは少なくとも１×１０４ｐｆｕ／μｌである。
【００９０】
ウイルス感染に続いて、細胞は動物に導入され得る。培養細胞の導入位置は、使用される細胞型に依存する。例えば、細胞が造血細胞である場合、細胞は末梢血流中に導入され得る。動物に導入される細胞は、不都合な免疫応答を回避するため、好ましくはその動物由来の細胞である。同様な免疫構成を持つドナー動物由来である細胞もまた使用され得る。免疫原性応答を回避するように設計されたものを含む他の細胞もまた使用され得る。
【００９１】
別の実施形態において、適した量のウイルスが、例えば身体への注射を通じて、直接動物に導入される。そのような１実施形態において、ウイルス粒子は動物の末梢血流に注射される。他の注射位置も適している。ウイルスの型に依存して、導入は他の手段を通じて行われ得、例えば、吸入または上皮組織（例えば、目、口、または皮膚のもの）との直接接触を含む。
【００９２】
導入される細胞を取り込む細胞および動物は、例えば、ＲＮＡコード領域の組込、組み込まれたＲＮＡコード領域のコピー数、および組み込み位置について、分析され得る。そのような分析は、任意の時点で行われ得、そして当該技術分野で既知の任意の方法により行われ得る。標準方法は、例えば、Hogan et al.（前出）に記載される。
【００９３】
上記に開示される細胞の感染方法は、細胞の種特異的特性に依存しない。結果として、それらは容易に哺乳類全種に拡張される。
【００９４】
上記に記載されるように、改良レトロウイルスは、広い宿主範囲を与えるためにシュードタイプであり得る。当業者はまた、特定の動物種で目的の遺伝子の所望の発現を達成するための適切な内在プロモーターを認識するだろう。したがって、当業者は、任意の種由来の細胞を感染させる方法を改良させることができるだろう。
【００９５】
＜標的細胞での遺伝子発現の下方調節＞
本明細書中に記載される方法は、細胞でのＲＮＡ分子の発現を可能にし、Ｐｏｌ ＩＩプロモーターからは容易に発現され得ないＲＮＡ小分子の発現に特に適している。本発明の好適な実施形態に従って、ＲＮＡ分子は、標的遺伝子の発現を下方調節するために細胞内で発現される。標的遺伝子を下方調節する能力は、特定の遺伝子の生物学的機能を同定することを含む多くの治療および研究用途を有する。本発明の技法および組成物を使用して、細胞培養物でと哺乳類生物での両方で大多数の遺伝子の発現をノックダウン（または下方調節）することが可能になる。詳細には、病原性ウイルスなどの病原体の生活環に必要な標的細胞の遺伝子を下方調節することが望ましい。
【００９６】
本発明の好適な実施形態において、ＲＮＡ発現カセットはＰｏｌ ＩＩＩプロモーターおよびＲＮＡコード領域を含む。ＲＮＡコード領域は、好ましくは特定の遺伝子の発現を下方調節する能力があるＲＮＡ分子をコードする。コードされるＲＮＡ分子は、例えば、下方調節される遺伝子をコードするＲＮＡ分子の配列と相補的であり得る。そのような実施形態において、ＲＮＡ分子は、アンチセンス機構を通じて作用するように設計される。
【００９７】
より好適な実施形態は、二本鎖ＲＮＡ複合体、またはステムループもしくはいわゆる「ヘアピン」構造を有するＲＮＡ分子の発現を含む。本明細書中に使用されるとおりの、用語「ＲＮＡ二本鎖」は、ＲＮＡ複合体の二本鎖領域およびヘアピンまたはステムループ構造の二本鎖領域の両方を示す。ＲＮＡコード領域は、一本鎖ＲＮＡ、２つまたはそれより多くの相補的一本鎖ＲＮＡまたはヘアピン形成ＲＮＡをコードし得る。
【００９８】
二本鎖ＲＮＡは、ＲＮＡ干渉または抑制と呼ばれるプロセスを通じて、相補配列を有する遺伝子の遺伝子発現を阻害することが示されている（例えば、Hammond et al. Nat. Rev. Genet. 2: 110-119（2001）を参照）。
【００９９】
本発明に従って、下方調節される遺伝子の領域に一致するＲＮＡ二本鎖またはｓｉＲＮＡが、細胞で発現される。ＲＮＡ二本鎖は、下方調節の標的となる遺伝子の配列と、配列が実質的に同一である（典型的には少なくとも約８０％同一であり、より典型的には少なくとも約９０％同一である）。ｓｉＲＮＡ二本鎖は、例えば、Bummelkamp et al. Science 296: 550-553（2202）、Caplen et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98: 9742-9747 （2001）、および Paddison et al. Genes & Devel. 16: 948-958（2002）に記載される。
【０１００】
ＲＮＡ二本鎖は一般に、少なくとも約１５ヌクレオチド長であり、好ましくは約１５〜約３０ヌクレオチド長である。生物によっては、ＲＮＡ二本鎖は著しく長くなり得る。さらに好適な実施形態において、ＲＮＡ二本鎖は、約１９〜２２ヌクレオチド長の間である。ＲＮＡ二本鎖は、好ましくは標的ヌクレオチド配列とその領域を超えて同一である。
【０１０１】
下方調節されることになる遺伝子が高度に保存されている遺伝子のファミリーである場合、二本鎖領域の配列は、配列の比較により所望の遺伝子のみを標的とするように選択され得る。生物内の相同遺伝子のファミリー間で十分な同一性がある場合、二本鎖領域は、複数の遺伝子を同時に下方調節するように設計され得る。
【０１０２】
二本鎖ＲＮＡは、単一のレトロウイルス構築物由来の細胞で発現され得る。好適な実施形態において、構築物中の単一のＲＮＡコード領域は、センス領域、ループ領域、およびアンチセンス領域を含む自己相補的なヘアピンＲＮＡの発現のテンプレートとしての役目を果たす。この実施形態は図２に例示されており、これはセンス領域１１０、ループ領域１２０、アンチセンス領域１３０、およびターミネーター領域１４０を有するＲＮＡコード領域に操作可能に連結されたＲＮＡ Ｐｏｌ ＩＩＩプロモーター１００を有するＲＮＡ発現カセットの概略図を示す。センス領域１１０およびアンチセンス領域１３０は、それぞれ好ましくは約１５〜約３０ヌクレオチド長である。ループ領域１２０は、好ましくは約２〜約１５ヌクレオチド長であり、より好ましくは約４〜約９ヌクレオチド長である。発現に続いて、センス領域およびアンチセンス領域は二本鎖を形成する。
【０１０３】
別の実施形態において、レトロウイルス構築物は２つのＲＮＡコード領域を含む。第一コード領域は第一ＲＮＡの発現用テンプレートであり、そして第二コード領域は第二ＲＮＡの発現用テンプレートである。発現に続いて、第一ＲＮＡと第二ＲＮＡは二本鎖を形成する。レトロウイルス構築物は、好ましくは、第一ＲＮＡコード領域と操作可能に連結した第一Ｐｏｌ ＩＩＩプロモーターおよび第二ＲＮＡコード領域と操作可能に連結した第二Ｐｏｌ ＩＩＩプロモーターも含む。この実施形態は図３に図示されており、第一ＲＮＡコード領域１１０に連結したＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーター１００および第一ターミネーター配列１４０、ならびに第二ＲＮＡコード領域１１５に連結した第二ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーター１０５および第二ターミネーター１４５を有するＲＮＡ発現カセットの概略図を示す。
【０１０４】
本発明のさらに別の実施形態において、レトロウイルス構築物は、第一ＲＮＡ ＰｏｌＩＩＩプロモーターからのＲＮＡコード領域の発現がセンス鎖としての第一ＲＮＡ分子合成をもたらし、かつ第二ＲＮＡ Ｐｏｌ ＩＩＩプロモーターからのＲＮＡコード領域の発現が第一ＲＮＡ分子と実質的に相補的であるアンチセンス鎖としての第二ＲＮＡ分子合成をもたらすように、第一ＲＮＡコード領域と操作可能に連結した第一ＲＮＡ Ｐｏｌ ＩＩＩプロモーター、および反対方向で同じ第一ＲＮＡコード領域と操作可能に連結した第二ＲＮＡ ＰＯＬ ＩＩＩプロモーターを含む。そのような１実施形態において、その両方のＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーターは、終結配列、好ましくは５個の連続したＴ残基を有する終結配列によりＲＮＡコード領域と分断されている。図４は、ＲＮＡコード領域１１０に連結した第一ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーター１００および第一ターミネーター配列１４０を有するＲＮＡ発現カセットの概略図を示す。発現カセットは、ＲＮＡコード領域１１５（１１０と逆順で同じ配列）に連結した第二ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーター１０５および第二ターミネーター１４５を有する。
【０１０５】
さらなる実施形態において、ＲＮＡ二本鎖は、２つまたはそれより多くのレトロウイルス構築物を使用して発現される。１実施形態において、第一ＲＮＡの発現を指示する第一レトロウイルス構築物が使用され、そして第一ＲＮＡと相補的である第二ＲＮＡの発現を指示する第二レトロウイルス構築物が使用される。発現に続いて、第一ＲＮＡおよび第二ＲＮＡは二本鎖領域を形成する。しかしながら、単一のレトロウイルス構築物由来のレトロウイルス性粒子を使用して全二本鎖領域を導入することが好ましい。上記に記載されるように、単一のウイルス構築物から二本鎖ＲＮＡを発現する複数の戦略が、図２〜図４に示される。
【０１０６】
ＲＮＡ二本鎖は、二本鎖の片側または両側に一本鎖領域が隣接していてもよい。例えば、ヘアピンの場合、一本鎖ループ領域は１つの末端で二本鎖領域と連結する。
【０１０７】
ＲＮＡコード領域は一般に、ターミネーター配列に操作可能に連結している。ｐｏｌ ＩＩＩターミネーターは、好ましくは４個またはそれより多くのチミジン（「Ｔ」）残基の長さを含む。好適な実施形態において、５個の連続したＴのクラスターは、ＲＮＡコード領域の直後の下流に連結してターミネーターとしての役割を果たす。そのような構造において、ｐｏｌ ＩＩＩ転写はＤＮＡテンプレートの二番目または三番目のＴで終了し、したがって２または３個のウリジン（「Ｕ」）残基のみがコード配列の３'末端に加えられる。
【０１０８】
ＲＮＡコード領域の配列、およびしたがってＲＮＡ二本鎖の配列は、好ましくは、発現が細胞または生物で下方調節されることになる遺伝子の配列と相補的であるように選択される。所定の標的遺伝子のために所定のＲＮＡ二本鎖配列で達成される下方調節の程度は、配列により変化するだろう。当業者は、有効な配列を容易に同定し得るだろう。例えば、抑制量を最大にするために、標的細胞を処理する前または遺伝子組換え動物を発生させる前に多数の配列が細胞培養物で試験され得る。ＲＮＡ干渉に関する配列要件の理解が決定されることで、ＲＮＡ二本鎖は当業者により選択され得る。
【０１０９】
＜標的細胞におけるウイルス複製および／または遺伝子発現の阻害＞
本発明の１態様に従って、標的のＲＮＡ二本鎖は、例えば、ウイルスの遺伝子発現、およびウイルス複製に必要な細胞性受容体または補助受容体の発現を含むウイルスの生活環または複製に必要な配列である。本発明の１実施形態において、阻害されることになるウイルスはヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）である。
【０１１０】
本発明はまた、ウイルス感染している患者を治療する方法を含む。１実施形態において、本方法は、通常のウイルス複製に重要であるヌクレオチドの少なくとも約１５〜２５ヌクレオチドの領域と、少なくとも９０％の相同性を有し、好ましくは同一である少なくとも１つの二本鎖ＲＮＡをコードする、組換えレトロウイルス性粒子を有効量患者へ投与することを含む。例えば、二本鎖ＲＮＡは、ウイルスゲノム、ウイルス遺伝子転写物、またはウイルスの生活環に必要な患者の細胞性受容体の遺伝子の核酸と相同性を有し得る。
【０１１１】
１実施形態において、治療されることになる患者は、ヒト免疫不全ウイルスに感染している。組換えウイルス粒子で治療する前に、標的細胞を患者から取り出す。好適な実施形態において、標的細胞は、ＣＤ３４−陽性造血幹細胞である。そのような幹細胞は、当業者により精製され得る。そのような精製の方法は既知であり、例えば、米国特許第４，９６５，２０４号、第４，７１４，６８０号、第５，０６１，６２０号、第５，６４３，７４１号、第５，６７７，１３６号、第５，７１６，８２７号、第５，７５０，３９７号、および第５，７５９，７９３号に教示される。そのようなＣＤ３４−陽性幹細胞を精製する方法の１つは、末梢血のサンプルを遠心分離して単核球と顆粒球とを分離して蛍光標示式細胞分取法（ＦＡＣＳ）により分類することを含む。上記の技法いずれかを通じて分類された細胞は、ＣＤ３４＋細胞に富むものであり得る。特定の実施形態において、細胞は磁気分離技術を通じてＣＤ３４＋細胞に富むものであり、ミルテンイ・バイオテック（Miltenyi Biotec）から入手可能であるもの、または以下の文献に記載される：Kogler et al. （1998） Bone Marrow Transplant. 21: 233-241; Pasino et al.（2000） Br. J. Haematol. 108: 793-800。単離ＣＤ３４−陽性幹細胞は、ウイルスゲノム内の１つまたは複数の標的および／またはウイルスの生活環に必要である細胞標的（例えば、病原性ウイルスの進入に必要な受容体または補助受容体を含む）に対する有向の二本鎖ＲＮＡをコードするＲＮＡコード領域を有する組換えレトロウイルス性粒子で処理される。処理された幹細胞は、次いで患者に再導入される。
【０１１２】
本発明の方法は、様々なウイルス性疾患（例えば、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ−１およびＨＩＶ−２）、Ａ型肝炎、Ｂ型肝炎、Ｃ型肝炎を含む）を治療するために使用され得る。
【０１１３】
患者にウイルスなどの所望の病原体に対する免疫または耐性増加を与える目的で、抗ウイルス性組換えレトロウイルスで患者を治療することもまた可能である。
【０１１４】
＜細胞性標的＞
本発明に従って、当業者は、細胞性成分、ＲＮＡまたは病原体の生活環、特にウイルスの生活環に必要な細胞性タンパク質をコードするＲＮＡのいずれかを、標的とし得る。好適な実施形態において、選択される細胞性標的は、正常な細胞増殖および生存に必要であるタンパク質またはＲＮＡではない。ウイルスの生活環を破壊するのに適したタンパク質として、例えば、ウイルス進入に関係する細胞表面受容体（一次受容体および二次受容体の両方を含む）、およびウイルスゲノムの転写に関係する転写因子、宿主染色体への組み込みに関係するタンパク質、およびウイルス遺伝子発現の翻訳または他の調節に関係するタンパク質が挙げられる。
【０１１５】
細胞内へのウイルス侵入のための受容体として、多数の細胞性タンパク質が既知である。そのような受容体のいくつかは、E. Baranowski、C. M. Ruiz-Jarabo、およびE. Domingoによる論文「ウイルスによる細胞認識の進化（Evolution of Cell Recognition by Viruses）」Science 292: 1102-1105に列挙され、これは本明細書中にその全体が参照により援用される。ウイルスよる認識に関係するいくつかの細胞性受容体は、以下に列挙される：アデノウイルス：ＣＡＲ、インテグリン、ＭＨＣ Ｉ、ヘパラン硫酸グリコサミノグリカン、シアル酸；サイトメガロウイルス：ヘパラン硫酸グリコサミノグリカン；コクサッキーウイルス：インテグリン、ＩＣＡＭ−１、ＣＡＲ、ＭＨＣ Ｉ；Ａ型肝炎：マウス様Ｉ型内在性膜糖タンパク質；Ｃ型肝炎：ＣＤ８１、低密度リポタンパク質受容体；ＨＩＶ（レトロウイルス科）：ＣＤ４、ＣＸＣＲ４、ヘパラン硫酸グリコサミノグリカン；ＨＳＶ：ヘパラン硫酸グリコサミノグリカン、ＰＶＲ、ＨｖｅＢ、ＨｖｅＣ；インフルエンザウイルス：シアル酸；はしか：ＣＤ４６、ＣＤ５５；ポリオウイルス、：ＰＶＲ、ＨｖｅＢ、ＨｖｅＣ；ヒトパピローマウイルス：インテグリン。当業者は、本発明が現在既知である受容体を使用することに制限されないことを認識するだろう。新規細胞性受容体および補助受容体が発見されると、本発明の方法はそのような配列に応用され得る。
【０１１６】
＜ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）＞
ＨＩＶウイルス標的：
本発明の１実施形態において、レトロウイルス構築物は、ＨＩＶウイルス性ＲＮＡゲノム、すなわちＨＩＶウイルスゲノムの発現領域に対して（例えば、組み込まれたＨＩＶウイルスの９−ｋｂ転写物のうち約１９〜２５ヌクレオチド長の任意の領域、または、ＨＩＶの様々なスプライシングｍＲＮＡ転写物のいずれかに対して）少なくとも９０％相同性を有する二本鎖分子をコードするＲＮＡコード領域を有する（Schwartz, S; Felber, BK; Benko, DM; Fenya, EM; Pavlakis, GN.「ヒト免疫不全ウイルス１型の多重スプライシングｍＲＮＡ種のクローニングおよび機能分析（Cloning and functional analysis of multiply spliced mRNA species of human immunodeficiency virus type 1）」. J. Virol. 1990; 64（6）: 2519-29）。ＨＩＶ転写物中の標的領域は、ウイルス遺伝子（例えば、ＨＩＶ−１ ＬＴＲ、ｖｉｆ、ｎｅｆ、およびｒｅｖを含む）のいずれかに対応するように選択され得る。別の実施形態において、ＲＮＡコード領域は、ＨＩＶウイルスの受容体または補助受容体と少なくとも９０％相同性を有する二本鎖領域をコードする。例えば、ＨＩＶのＴ細胞侵入の一次受容体はＣＤ４である。好適な実施形態において、補助受容体であるＣＸＣケモカイン受容体４（ＣＸＣＲ４）およびＣＣケモカイン受容体５（ＣＣＲ５）は、本発明の方法に従って下方調節される。ＣＸＣＲ４（Feddersppiel et al. Genomics 16: 707-712（1993））は、ＨＩＶのＴ細胞栄養株の主要な補助受容体であるが、一方ＣＣＲ５（Mummidi et al. J. Biol. Chem. 272: 30662-30671（1997））は、ＨＩＶのマクロファージ栄養株の主要な補助受容体である。ＨＩＶに対する他の細胞性標的は、ＨＩＶ生活環に含まれるタンパク質のＲＮＡ転写物を含み、シクロフィリン、ＣＲＭ−１、インポーチン−β、ＨＰ６８（Zimmerman C, et al.「未成熟ＨＩＶ−１キャプシドの組立に必要な宿主タンパク質の同定（Identification of a host protein essential for assembly of immature HIV-1 capsids）」. NATURE 415 （6867）: 88-92（2002））、および依然として未知の他の細胞性要因が挙げられる。
【０１１７】
以下の実施例は、例示のみを目的として提供され、いかなる方法でも本発明の範囲を制限することを意図しない。実際、本明細書中に示されまた記載されるものに加えて、本発明の様々な修正が、以下の記載から当業者に明らかになり、そして添付の特許請求の範囲内に該当するだろう。
【０１１８】
本明細書中で引照される全ての特許および参考文献は、その全体が本明細書により参考として援用される。
【実施例１】
【０１１９】
この実施例に従って、ｓｉＲＮＡ発現カセットをＨＣ−ＦＵＧＷベクターのＰａｃＩ部位へ挿入することにより、ｌａｃＺ遺伝子に対するｓｉＲＮＡレンチウイルス構築物が構築された（図５）。ＨＣ−ＦＵＧＷベクター（配列番号：３）は、形質導入事象を追跡するための、ヒトユビキチンプロモーターにより駆動されるＧＦＰ標識遺伝子を含む。このベクターはまた、ウイルス力価を改善するためのＨＩＶ ＤＮＡフラップ要素、およびウイルス遺伝子の高レベル発現のためのＷＰＲＥも含む。ｓｉＲＮＡ発現カセットは、ｐｏｌ ＩＩＩプロモーターおよび小ヘアピンＲＮＡコード領域からなり、これにｐｏｌ ＩＩＩターミネーター部位が続く。ｐｏｌ ＩＩＩプロモーターは、ヒトＨ１−ＲＮＡプロモーターの−２４０〜−８領域に由来し、そして７塩基対のリンカー配列を通じて下流のＲＮＡコード領域に接続されて、転写がＲＮＡコード配列の最初のヌクレオチドから正確に開始されることを確実にする。小ヘアピンＲＮＡコード領域は、ｌａｃＺ遺伝子コード配列のセンス鎖の１９１５〜１９３３領域に対応する１９個のｎｔ配列、および９個のｎｔループ領域により分断された１９個ｎｔの完全な逆相補配列を含む。ターミネーターは、ＲＮＡコード配列の直後の下流に連結した５個の連続したチミジン残基からなる。
【実施例２】
【０１２０】
この実施例は、培養哺乳類細胞へのレトロウイルスベクターの形質導入を実証する（図６）。実施例１に記載される小ヘアピンＲＮＡ分子をコードするレトロウイルスベクターを使用して、ｌａｃＺを発現する培養哺乳類細胞をトランスフェクトし、そして試験遺伝子ｌａｃＺの発現の著しい減少を引き起こした。ｌａｃＺ ｓｉＲＮＡウイルスを、レトロウイルスベクター、ヘルパーウイルスプラスミド、およびＶＳＶｇ発現プラスミドの、ＨＥＫ２９３細胞への同時トランスフェクションにより産生した。ウイルス粒子を細胞培養物の上清から収穫して、超遠心分離により濃縮した。濃縮ウイルス調製物を使用して、ｌａｃＺとホタルルシフェラーゼ（Ｌｕｃ）レポーター遺伝子との両方を宿している、マウス胚線維芽細胞（ＭＥＦ）またはＨＥＫ２９３細胞のいずれかに感染させた。感染を、ウイルス性ベクターの標識遺伝子カセットから発現するＧＦＰシグナルによりモニタリングした。この実験条件下、＞９８％の試験細胞がＧＰＦ＋であり、したがって首尾よく形質導入された。ｌａｃＺおよびＬｕｃレポーター遺伝子の発現レベルを、市販のキット（Roche製ｌａｃＺアッセイキットおよびPromega製Ｌｕｃ）を使用して化学発光アッセイにより測定した。ｌａｃＺ ｓｉＲＮＡウイルスは、ｌａｃＺの発現のみを阻害し、Ｌｕｃは阻害しなかった。特異的阻害を、ｌａｃＺ活性対Ｌｕｃ活性の比により決定した。未感染の親細胞のｌａｃＺ／Ｌｕｃ比を、任意に１に設定し、これに応じて感染細胞の値を計算した。図６に示されるとおり、ウイルスのトランスフェクションは、ＭＥＫ細胞およびＨＥＫ２９３細胞の両方でｌａｃＺ遺伝子の発現量の劇的な減少をもたらした。
【０１２１】
ｔｅｔ−誘導ｌａｃＺ ｓｉＲＮＡレンチウイルスベクターをまた、図８に例示されるようにも調製した。Ｔｅｔリプレッサー遺伝子（ＴｅｔＲ；配列番号：７）の発現が下流のＧＦＰマーカーによりモニタリングされ得るように、それをヒトユビキチンＣプロモーターの制御下に置いた。抗ｌａｃＺ ｓｉＲＮＡカセットを、ＰＳＥとＴＡＴＡ ｂｏｘとの間に単一のＴｅｔＲ結合部位（ＴｅｔＯ１）を含むヒトＵ６−プロモーター（−３２８〜＋１）由来のＴｅｔ−誘導ｐｏｌ ＩＩＩプロモーター（配列番号：６）により駆動した。ＴｅｔＲコード配列を、大腸菌のＴＯＰ１０株由来のゲノムＤＮＡからＰＣＲ増幅して、Ｂｇｌ２−ＥｃｏＲ１フラグメントとしてＦＵＩＧＷの改良体中にクローニングした。テトラサイクリンの不在下、ＴｅｔＲはプロモーターに結合してその発現は抑制される。テトラサイクリンの添加で、ＴｅｔＲはプロモーターから動いて転写が開始される。
【０１２２】
Ｔｅｔ−誘導ｓｉＲＮＡ発現カセットは、ドキシサイクリン処理に応じて遺伝子発現を調節することが可能であった。ウイルスをＴｅｔ−誘導ｌａｃＺ−ｓｉＲＮＡカセットおよびユビキチンＣプロモーター制御下のＴｅｔリプレッサーを保有するレトロウイルス構築物から調製し、そしてｌａｃＺおよびルシフェラーゼ（２９３Ｚ＋Ｌｕｃ）の両方を発現するＨＥＫ２９３細胞に形質導入するために使用した。形質導入細胞を、４８時間１０ｕｇ／ｍｌドキシサイクリンで処理する（Ｐｌｕｓ Ｄｏｘ）か、または対照としてドキシサイクリン処理を行わなかった（Ｎｏ Ｄｏｘ）。ＬａｃＺおよびルシフェラーゼ活性を先の図に記載されるように測定した。相対抑制活性をｌａｃＺ対ルシフェラーゼの比として計算し、そしてＮｏＤｏｘ対照を任意に１に設定した。図９に見られるとおり、ドキシサイクリンの存在下、ｌａｃＺ活性の抑制は、顕著に向上した。
【実施例３】
【０１２３】
この実施例は、レンチウイルスベクターによりコードされるｓｉＲＮＡ分子を発現する遺伝子組換え動物の発生を実証する。実施例１に記載されるｌａｃＺ特異的ｓｉＲＮＡ構築物の発現は、ＲＯＳＡ２６＋／−マウスでｌａｃＺ活性の高度抑制をもたらした。ＲＯＳＡ２６＋／−動物は、遍在的に発現されるｌａｃＺレポーター遺伝子のコピーを１つ保有する。実施例２に記載されるｌａｃＺ ｓｉＲＮＡウイルス調製物を、ホルモン刺激したＣ５７Ｂ１／６メス・ドナー×ＲＯＳＡ２６＋／＋種オスから得られたＲＯＳＡ２６＋／−単細胞胚の卵黄周囲注射のため使用した。注射単細胞胚を、続いて時期を合わせた偽妊娠メス受容者の卵管へ移した。１５．５〜１７．５日胚（Ｅ１５．５〜１７．５）の胎児を代理母から取り出した。蛍光顕微鏡下胎児で観測される陽性ＧＦＰシグナルにより、成功した遺伝子導入を採点した。胎児の肢組織から調製されたタンパク質抽出物を、使用説明書（Roche）に従ってＬａｃＺ化学発光アッセイに使用し、そして組織抽出物のタンパク質濃度をBradfordアッセイ（BioRad）により決定した。ＬａｃＺ発現レベルは、タンパク質１ｕｇあたりの光単位（ＬＵ／ｕｇ）として表した。Ｃ５７Ｂ１／６メス×ＲＯＳＡ２６＋／＋オス、およびＣ５７Ｂ１／６メス×Ｃ５７Ｂ１／６オスの時期を合わせた交配からのＥ１５．５〜１７．５胎児を、それぞれ陽性および陰性対照とした。結果を図７に示す。動物Ｇ１〜Ｇ４（ｓｉＲＮＡ構築物をコードするレンチウイルスベクターで治療されたもの）では、未治療の対照動物と比較して、動物はｌａｃＺ遺伝子の顕著に減少した発現を示した。
【実施例４】
【０１２４】
抗ヒトＣＣＲ５ ｓｉＲＮＡをコードするＲＮＡコード領域を含むレンチウイルス構築物を調製した。図１０に例示されるように、ベクターは、ＨＩＶベースのレンチウイルスベクター５'ＬＴＲ、ＨＩＶフラップ要素、ヒトＵ６−ＲＮＡ Ｐｏｌ ＩＩプロモーター（−３２８〜＋１；配列番号：４）、ヒトＣＣＲ５特異的短鎖ヘアピンＲＮＡカセット、内在ユビキチンプロモーター、ユビキチンプロモーターと操作可能に連結したＧＦＰ標識遺伝子、ＷＲＥ調節要素、およびＨＩＶベースの自己不活性化レンチウイルス３'ＬＴＲを含む。抗ＣＣＲ５ ｓｉＲＮＡの構造および配列は図１０および配列番号：１で提供される。
【０１２５】
組換えレトロウイルスを、上記に記載されるように、抗ＣＣＲ５ ｓｉＲＮＡベクター構築物から調製した。ヒトＭＡＧＩ−ＣＣＲ５細胞（Deng et al., Nature 381: 661 （1996））を、非特異的対照ｓｉＲＮＡをコードする組換えウイルスまたはレトロウイルスに感染させ、そしてＣＣＲ５の細胞表面発現をフローサイトメトリー分析により測定した。平均蛍光強度により相対的発現レベルを計算した。図１１に見られるとおり、抗ＣＣＲ５ ｓｉＲＮＡは、ＣＣＲ５発現レベルをほぼ完全に減少させたが、非特異的ｓｉＲＮＡは発現をまったく抑制しなかった。
【実施例５】
【０１２６】
図１２に例示されるように、レンチウイルスベクターをコードするさらなる抗ＨＩＶ−１ ｓｉＲＮＡを構築した。このベクターは、抗ＨＩＶ−１ Ｒｅｖ遺伝子特異的短鎖ヘアピンｓｉＲＮＡ（配列番号：２）をコードするＲＮＡコード領域を含む。抗ＨＩＶ−１
Ｒｅｖ ｓｉＲＮＡは、ＨＩＶ−１のＲｅｖコードの８４２０〜８４６８領域を標的とした（「ＮＬ４−３株のヌクレオチド配位（nucleotide coordinate of NL4-3 strain）」; Salminen et al. Virology 213 : 80-86 （1995））。ｓｉＲＮＡコード領域の配列および構造は、同じく図１２に例示される。抗ＨＩＶ−１ Ｒｅｖ ｓｉＲＮＡの発現は、ヒトＨ１−ＲＮＡ Ｐｏｌ ＩＩＩプロモーター（−２４０〜−９；配列番号：５）により駆動された。
【０１２７】
抗ＨＩＶ−１ Ｒｅｖ ｓｉＲＮＡの、ヒト細胞でＨＩＶ転写を抑制する能力を測定した。ＨＩＶ−１の転写活性を、基本的にLi et al. J. Virol. 65: 3973（1991））に記載されるとおり、ｅｎｖ／ｎｅｆ領域で挿入されたホタルルシフェラーゼレポーター遺伝子の活性に基づいて測定した。
【０１２８】
上記に記載されるとおり、ベクター構築物から組換えレトロウイルスを調製し、そしてＨＩＶ−１を含むヒト細胞をレポーター構築物に感染させるために使用した。形質導入されていない親細胞のルシフェラーゼ活性を任意に１に設定し、これに従って形質導入細胞の相対的ＨＩＶ転写レベルを計算した。非特異的ｓｉＲＮＡを対照として使用した。
【０１２９】
図１３に見られるとおり、ＨＩＶ−１転写は、抗ＨＩＶ−１ Ｒｅｖ ｓｉＲＮＡコード領域を含む組換えレトロウイルスに感染した細胞で顕著に抑制されたが、一方非特異的ｓｉＲＮＡは明らかな効果を有さなかった。
【実施例６】
【０１３０】
この実施例に従って、ｓｉＲＮＡ発現カセットをＨＣ−ＦＵＧＷベクターのＰａｃＩ部位へ挿入することにより、ＨＩＶゲノムに対するｓｉＲＮＡレンチウイルス構築物を構築した。ＨＣ−ＦＵＧＷベクターは、形質導入事象を追跡するための、ヒトユビキチンプロモーターにより駆動されるＧＦＰ標識遺伝子を含む。ベクターはまた、ウイルス力価を改善するためのＨＩＶ ＤＮＡフラップ要素、およびウイルス遺伝子の高レベル発現のためのＷＰＲＥも含む。ｓｉＲＮＡ発現カセットは、ｐｏｌ ＩＩＩプロモーターおよび小ヘアピンＲＮＡコード領域からなり、これにｐｏｌ ＩＩＩターミネーター部位が続く。ｐｏｌ ＩＩＩプロモーターは、ヒトＨ１−ＲＮＡプロモーターの−２４０〜−８領域に由来し、７塩基対のリンカー配列を通じて下流のＲＮＡコード領域に接続されて、転写がＲＮＡコード配列の最初のヌクレオチドから正確に開始されることを確実にする。小ヘアピンＲＮＡコード領域は、ＣＣＲ５コード配列の１つの領域に対応する２１個のｎｔ配列、および４個のｎｔループ領域により分断された２１個のｎｔの完全な逆相補配列を含む。ターミネーターは、ＲＮＡコード配列の直後の下流に連結した５個の連続したチミジン残基からなる。
【０１３１】
レトロウイルス構築物を使用して、パッケージング細胞株（ＨＥＫ２９３細胞）を、ヘルパーウイルスプラスミドおよびＶＳＶｇ発現プラスミドとともにトランスフェクトする。組換えウイルス粒子が回収される。
【０１３２】
免疫磁気アプローチを使用して、ＣＤ３４−陽性造血幹細胞を患者の骨髄から単離する（例えば、Choi et al. （1995） Blood 85: 402-413; Fehse et al. （1997） Human Gene Therapy 8: 1815-1824; Di Nicola et al. （1996） Bone Marrow Transplant. 18: 1117-1121; Servida et al. （1996） Stem Cells 14: 430-438; de Wynter et al. （1995） Stem Cells 13: 524-532; Ye et al. （1996） Bone Marrow Transplant. 18: 997-1008を参照）。細胞を培養して、組換えウイルス粒子で処理する。感染細胞を、ＧＦＰの発現に基づいてＦＡＣＳにより分類する。ＧＦＰを発現している細胞を、注射して患者に再導入する。
【実施例７】
【０１３３】
この実施例に従って、ｓｉＲＮＡ発現カセットをＨＣ−ＦＵＧＷベクターのＰａｃＩ部位に挿入することにより、ＨＩＶゲノムに対するｓｉＲＮＡレンチウイルス構築物を構築する。ｓｉＲＮＡ発現カセットは、抗ＨＩＶ−１ Ｒｅｖ遺伝子特異的短鎖ヘアピンｓｉＲＮＡをコードするＲＮＡコード領域に操作可能に連結したヒトＨＩプロモーターを含む。ｓｉＲＮＡ発現カセットはさらに、抗ＣＣＲ５小ヘアピンＲＮＡに操作可能に連結したｐｏｌ ＩＩＩプロモーターを含む。レトロウイルス構築物は、図１４に例示される。
【０１３４】
レトロウイルス構築物を使用して、パッケージング細胞株（ＨＥＫ２９３細胞）を、ヘルパーウイルスプラスミドおよびＶＳＶｇ発現プラスミドとともにトランスフェクトする。組換えウイルス粒子が回収される。
【０１３５】
免疫磁気アプローチを使用して、ＣＤ３４−陽性造血幹細胞を患者の骨髄から単離する（例えば、Choi et al. （1995） Blood 85: 402-413; Fehse et al. （1997） Human Gene Therapy 8: 1815-1824; Di Nicola et al. （1996） Bone Marrow Transplant. 18: 1117-1121; Servida et al. （1996） Stem Cells 14: 430-438; de Wynter et al. （1995） Stem Cells 13: 524-532; Ye et al. （1996） Bone Marrow Transplant. 18: 997-1008を参照）。細胞を培養して、組換えウイルス粒子で処理する。感染細胞を、ＧＦＰの発現に基づいてＦＡＣＳにより分類する。ＧＦＰを発現している細胞を、注射して患者に再導入する。
【図面の簡単な説明】
【０１３６】
【図１Ａ】「ＲＮＡカセット」と名付けられたＲＮＡ発現のための発現カセットおよび「標識遺伝子」または目的の遺伝子を保有するレトロウイルスベクターの概略図を示す。ＲＮＡ発現カセットは、レトロウイルス構築物の任意の許容部位で、単一コピーまたは複数のタンデムコピーのいずれかとして埋め込まれ得る。また、図に示されないものの、１個より多いＲＮＡ発現カセットがレトロウイルス構築物に存在し得る。
【図１Ｂ】ＲＮＡ発現カセットが標識遺伝子に隣接する、同様な構築物を示す。
【図２】ｓｉＲＮＡ領域１１０〜１３０に連結したＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーター１００を有し、センス領域１１０、ループ領域１２０、およびアンチセンス領域１３０、およびターミネーター配列１４０を有するＲＮＡ発現カセットの概略図を示す。
【図３】第一ＲＮＡコード領域１１０に連結したＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーター１００および第一ターミネーター配列１４０、ならびに第二のＲＮＡコード領域１１５に連結した第二ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーター１０５および第二ターミネーター１４５を有するＲＮＡ発現カセットの概略図を示す。
【図４】 ＲＮＡコード領域１１０に連結した第一ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーター１００および第一ターミネーター配列１４０を有するＲＮＡ発現カセットの概略図を示す。発現カセットは、１１０と逆順で同じ配列のＲＮＡコード領域１１５に連結した第二ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーター１０５および第二ターミネーター１４５を有する。
【図５】レンチウイルスベクターをコードするｌａｃＺ ｓｉＲＮＡの概要説明図である。５'ＬＴＲ：ＨＩＶベースのレンチウイルスベクター５'ＬＴＲ；Ｆ：ＨＩＶフラップ要素；ｐｏｌ ＩＩＩ：ヒトＨ１−ＲＮＡ Ｐｏｌ ＩＩＩプロモーター（−２４０〜−８）；ｓｉＲＮＡ：ｌａｃＺ特異的小ヘアピンＲＮＡコード領域、その構造ならびに詳細な配列は以下に図示される。ＵｂｉＣ：内在的ヒトユビキチンＣプロモーター；ＧＦＰ：ＵｂｉＣプロモーターにより駆動されるＧＦＰ標識遺伝子。Ｗ：ウッドチャックＲＮＡ調節要素。３'ＬＴＲ：ＨＩＶベースの自己不活性化レンチウイルス３'ＬＴＲ。
【図６】レンチウイルスベクターによりコードされたｌａｃＺ特異的ｓｉＲＮＡは、ウイルスを形質導入された哺乳類細胞で、ｌａｃＺレポーター遺伝子の発現を効果的に阻害し得る。ＭＥＦ：マウス胚線維芽細胞；ＨＥＫ２９３：ヒト胚腎臓細胞。試験細胞株はいずれもｌａｃＺおよびホタルルシフェラーゼレポーター遺伝子を宿し、そしてレポーター遺伝子の発現レベルは、化学発光アッセイにより測定され得る。Ｃｔｒｌ：感染していない親細胞のｌａｃＺ活性対Ｌｕｃ活性の比で、任意に１に設定された。形質導入：ｌａｃＺ対Ｌｕｃ比の減少として計算されたｌａｃＺ発現の特異的阻害。
【図７】レンチウイルスベクターによりコードされたｌａｃＺ特異的ｓｉＲＮＡ分子を発現する遺伝子組換え動物は、ＲＯＳＡ２６＋／−バックグラウンドで遍在性ｌａｃＺレポーター遺伝子の発現を首尾よく抑制し得る。ＲＯＳＡ１〜６：６つのＥ１７．５ ＲＯＳＡ２６＋／−胚の肢組織でのｌａｃＺ活性で、陽性対照として供される。個々のＲＯＳＡ２６＋／−胚間のｌａｃＺ活性の差異は、可変のタンパク質抽出効率から生じ得る。ＴＧ１〜４：ＲＯＳＡ＋／−バックグラウンドでｌａｃＺ ｓｉＲＮＡ分子をコードしたレンチウイルスベクターを発現する４つのＥ１７．５遺伝子組み替え胚の肢組織でのｌａｃＺ活性。ＷＴ１〜６：６つのＥ１７．５ Ｃ５７Ｂ１／６野生型胚の肢組織でのｌａｃＺ活性、陰性対照として含まれる。内因性β−ガラクトシダーゼ活性のバックグラウンドレベルは、全般的に１，０００ＬＵ／ｕｇを下回り、したがってカラムは見えない。
【図８】Ｔｅｔ−誘導ｌａｃＺ ｓｉＲＮＡレンチウイルスベクターの概略説明図を示す。Ｔｅｔリプレッサー遺伝子（ＴｅｔＲ；配列番号：７）は、ヒトユビキチンＣプロモーターの制御下にあり、その発現はＩＲＥＳ要素（内部リボソーム侵入部位）とカップリングした下流のＧＦＰマーカーによりモニタリングされ得る。抗ｌａｃＺ ｓｉＲＮＡカセットは、ＰＳＥとＴＡＴＡ ｂｏｘとの間に単一ＴｅｔＲ結合部位（ＴｅｔＯ１）を含むヒトＵ６−プロモーター（−３２８〜＋１）由来のＴｅｔ−誘導ｐｏｌ ＩＩＩプロモーター（配列番号：６）により駆動される。テトラサイクリンの不在下、ＴｅｔＲはプロモーターに結合してその発現は抑制される。テトラサイクリンの添加で、ＴｅｔＲはプロモーターから動いて転写が開始される。
【図９】Ｔｅｔ−誘導ｓｉＲＮＡ発現カセットがドキシサイクリン処理に応じて遺伝子発現を調節し得ることを実証した実験結果を示す。ｌａｃＺおよびルシフェラーゼ二重発現ＨＥＫ２９３細胞（２９３Ｚ＋Ｌｕｃ）に、ユビキチンＣプロモーターの制御下にある、Ｔｅｔ−誘導ｌａｃＺ−ｓｉＲＮＡカセットおよびＴｅｔリプレッサーを保有するレンチウイルスベクターを形質導入した（図８）。形質導入した細胞を、４８時間１０ｕｇ／ｍｌドキシサイクリンで処理する（Ｐｌｕｓ Ｄｏｘ）か、または対照としてドキシサイクリン処理を行わなかった（Ｎｏ Ｄｏｘ）。ＬａｃＺおよびルシフェラーゼ活性を先の図で記載されるように測定した。相対的抑制活性をｌａｃＺ対ルシフェラーゼの比として計算し、そしてＮｏ Ｄｏｘ対照を任意に１に設定した。
【図１０】抗ヒトＣＣＲ５ ｓｉＲＮＡコード化レンチウイルスベクターの概要説明図を示す。５'ＬＴＲ：ＨＩＶベースのレンチウイルスベクター５'ＬＴＲ；Ｆ：ＨＩＶフラップ要素；ヒトＵ６−ＲＮＡ Ｐｏｌ ＩＩＩプロモーター（−３２８〜＋１）；ｓｉＲＮＡ：ヒトＣＣＲ５特異的短鎖ヘアピンカセット、およびその構造ならびに詳細な配列は以下に図示される。ＵｂｉＣ：内在的ヒトユビキチンＣプロモーター；ＧＦＰ：ＵｂｉＣプロモーターにより駆動されるＧＦＰ標識遺伝子。Ｗ：ウッドチャックＲＮＡ調節要素。３'ＬＴＲ：ＨＩＶベースの自己不活性化レンチウイルス３'ＬＴＲ。
【図１１】レンチウイルスベクターによりコードされた抗ヒトＣＣＲ５特異的ｓｉＲＮＡは、形質導入されたヒト細胞におけるＣＣＲ５発現を効率的に抑制し得る。形質導入または非形質導入ＭＡＧＩ−ＣＣＲ５でのＣＣＲ５の細胞表面発現（Deng, et al., Nature, 381, 661（1996））を、フローサイトメトリー分析（ＦＡＣＳ）で測定し、そして相対的発現レベルを平均蛍光強度により計算した。非特異的ｓｉＲＮＡも、対照として含まれた。
【図１２】抗ＨＩＶ−1 ｓｉＲＮＡコード化レンチウイルスベクターの概要説明図である。５'ＬＴＲ：ＨＩＶベースのレンチウイルスベクター５'ＬＴＲ；Ｆ：ＨＩＶフラップ要素；ヒトＨ１−ＲＮＡ Ｐｏｌ ＩＩＩプロモーター（−２４０〜−９）；ｓｉＲＮＡ：ＨＩＶ−１ Ｒｅｖ遺伝子特異的短鎖ヘアピンカセット、その構造ならびに詳細な配列は以下に図示される。ＵｂｉＣ：内在的ヒトユビキチンＣプロモーター；ＧＦＰ：ＵｂｉＣプロモーターにより駆動されるＧＦＰ標識遺伝子。Ｗ：ウッドチャックＲＮＡ調節要素。３'ＬＴＲ：ＨＩＶベースの自己不活性化レンチウイルス３'ＬＴＲ。
【図１３】図１３は、レンチウイルスベクターによりコードされる抗ＨＩＶ−１ Ｒｅｖ遺伝子特異的ｓｉＲＮＡがヒト細胞におけるＨＩＶ転写の発現を効率的に抑制し得ることを表示する。ＨＩＶ−１ウイルスの転写活性は、ｅｎｖ／ｎｅｆ領域に挿入されたホタルルシフェラーゼレポーター遺伝子で測定される（Li, et al J Virol., 65, 3973（1991））。非形質導入親細胞のルシフェラーゼ活性を任意に１に設定し、これに従って形質導入細胞の相対的ＨＩＶ転写レベルを計算した。非特異的ｓｉＲＮＡ含有ベクターは対照として含まれた。
【図１４】抗ＨＩＶ Ｒｅｖおよび抗ヒトＣＣＲ ｓｉＲＮＡ発現カセットの両方を保有する二価レトロウイルスベクターの概略図を示す。符号は先の図で記載されるものと同じである。
【配列表】
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Claims (34)

  1. 細胞内におけるＲＮＡ分子の発現のためのレトロウイルス構築物であって、
    ５'レンチウイルス末端反復配列（ＬＴＲ）由来のＲおよびＵ５配列、
    自己不活性化レンチウイルス３'ＬＴＲ、
    第一ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーター、および
    前記第一ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーターと操作可能に連結した第一ＲＮＡコード領域、
    を含み、
    前記第一ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーターおよび前記第一ＲＮＡコード領域は、５'ＬＴＲおよび３'ＬＴＲの間に位置し、そして
    前記第一ＲＮＡコード領域は、病原性ウイルスゲノム、若しくはゲノム転写物、または病原性ウイルスの生活環に関与する標的細胞遺伝子の標的領域と少なくとも９０％同一である配列を含む、
    レトロウイルス構築物。
  2. 前記標的領域は、１５〜３０のヌクレオチド長である、請求項１に記載のレトロウイルス構築物。
  3. 前記標的領域は、１８〜２３ヌクレオチド長である、請求項２に記載のレトロウイルス構築物。
  4. 前記標的領域は、ＣＣＲ５およびＣＸＣＲ４からなる群より選択されるヒト遺伝子転写物の領域である、請求項３に記載のレトロウイルス構築物。
  5. 前記標的領域はヒト免疫不全ウイルス転写物の領域である、請求項３に記載のレトロウイルス構築物。
  6. 前記病原性ウイルスはヒト免疫不全ウイルスである、請求項１〜３のいずれか一項に記載のレトロウイルス構築物。
  7. 前記病原性ウイルスは、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）、インフルエンザウイルス、アデノウイルス、およびポリオウイルスからなる群より選択される、請求項１〜３のいずれか一項に記載のレトロウイルス構築物。
  8. 前記第一ＲＮＡコード領域は第一ＲＮＡ分子をコードし、かつ前記レトロウイルス構築物はさらに第二ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーターおよび該第二ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーターと操作可能に連結した第二ＲＮＡコード領域を含み、該第二ＲＮＡコード領域は前記標的領域で前記第一ＲＮＡ分子と相補的な第二ＲＮＡ分子をコードする、請求項１〜７のいずれか一項に記載のレトロウイルス構築物。
  9. 前記レトロウイルス構築物は、前記第一ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーターからの前記第一ＲＮＡコード領域の発現が第一ＲＮＡ分子の合成をもたらし、かつ第二ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーターからの前記第一ＲＮＡコード領域の発現が前記標的領域で前記第一ＲＮＡ分子と相補的な第二ＲＮＡ分子の合成をもたらすように、前記第一ＲＮＡコード領域と操作可能に連結した第二ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーター領域をさらに含む、請求項１〜７のいずれか一項に記載のレトロウイルス構築物。
  10. 前記第一ＲＮＡコード領域は、センス領域、アンチセンス領域、およびループ領域を有するＲＮＡ分子をコードし、かつ前記センス領域は前記アンチセンス領域と相補的である、請求項１〜７のいずれか一項に記載のレトロウイルス構築物。
  11. 前記ループ領域は２〜１５ヌクレオチド長である、請求項１０に記載のレトロウイルス構築物。
  12. 前記第一ＲＮＡコード領域は、配列番号１の配列と少なくとも９０％同一である配列を含む、請求項１に記載のレトロウイルス構築物。
  13. 前記第一ＲＮＡコード領域は、配列番号１の配列と少なくとも９５％同一である配列を含む、請求項１に記載のレトロウイルス構築物。
  14. 前記第一ＲＮＡコード領域は、配列番号１の配列を含む、請求項１に記載のレトロウイルス構築物。
  15. 前記第一ＲＮＡコード領域は、配列番号２の配列を含む、請求項１に記載のレトロウイルス構築物。
  16. 第二ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーターと操作可能に連結した配列番号２の配列を含むＲＮＡコード領域をさらに含む、請求項１に記載のレトロウイルス構築物。
  17. 少なくとも一つの終結配列をさらに含む、請求項１〜１６のいずれか一項に記載のレトロウイルス構築物。
  18. 前記ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーターは誘導性である、請求項１〜１７のいずれか一項に記載のレトロウイルス構築物。
  19. 前記誘導性プロモーターはテトラサイクリンで活性化される、請求項１８に記載のレトロウイルス構築物。
  20. 前記５'ＬＴＲ配列はＨＩＶに由来する、請求項１〜１９のいずれか一項に記載のレトロ
    ウイルス構築物。
  21. 前記５'ＬＴＲ配列はモロニーマウス白血病ウイルスに由来する、請求項１〜１９のいず
    れか一項に記載のレトロウイルス構築物。
  22. 前記５'ＬＴＲ配列はマウス幹細胞ウイルス（ＭＳＣＶ）に由来する、請求項１〜１９の
    いずれか一項に記載のレトロウイルス構築物。
  23. ウッドチャック肝炎ウイルスエンハンサー要素配列を含む、請求項１〜２２のいずれか一項に記載のレトロウイルス構築物。
  24. ｔＲＮＡアンバー抑制配列を含む、請求項１〜２３のいずれか一項に記載のレトロウイルス構築物。
  25. 前記自己不活性化レンチウイルス３'ＬＴＲは、エンハンサー配列が欠失したＵ３要素を
    含む、請求項１〜２４のいずれか一項に記載のレトロウイルス構築物。
  26. 前記自己不活性化３'ＬＴＲはＨＩＶに由来する、請求項１〜２４のいずれか一項に記載のレトロウイルス構築物。
  27. パッケージング細胞株を請求項１〜２６のいずれか一項に記載のレトロウイルス構築物でトランスフェクトする工程、
    前記パッケージング細胞株から組換えレトロウイルスを回収する工程、および、
    標的細胞を前記組換えレトロウイルスに感染させる工程、
    を含む、インビトロで細胞を感染させる方法。
  28. 前記組換えレトロウイルスはシュードタイプである、請求項２７に記載の方法。
  29. 前記組換えレトロウイルスは水泡性口内炎ウイルスエンベロープ糖タンパク質を有するシュードタイプである、請求項２８に記載の方法。
  30. 前記パッケージング細胞株はＨＥＫ２９３細胞株である、請求項２７〜２９のいずれか一項に記載の方法。
  31. 前記標的細胞はヒト細胞である、請求項２７〜３０のいずれか一項に記載の方法。
  32. 前記標的細胞は造血細胞である、請求項３１に記載の方法。
  33. 前記標的細胞はＣＤ３４−陽性造血細胞である、請求項３２に記載の方法。
  34. 前記標的細胞は培養細胞である、請求項２７〜３３のいずれか一項に記載の方法。
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