JP2001500014A - 組換えアデノ随伴ウイルスの生産のためにcre―loxを用いる方法 - Google Patents
組換えアデノ随伴ウイルスの生産のためにcre―loxを用いる方法Info
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Abstract
(57)【要約】
組換えAAVの効率よい生産方法が記述される。一つの態様として、3個のベクターが宿主細胞中に導入される。第一ベクターはcre組換え酵素の発現を導き、第二ベクターはプロモーター、loxP部位が両側に位置するスペーサー配列及びrep/capを含有し、そして第三ベクターはAAV ITR ITRが両側に位置する導入遺伝子及び調節配列を含有するミニ遺伝子を含む。別の態様として、宿主細胞がcre組換え酵素を安定または誘導的に発現し、そして系の他の成分を保有する2個のベクターが宿主細胞中に導入される。
Description
【発明の詳細な説明】
組換えアデノ随伴ウイルスの生産のためにCRE−LOXを用いる方法発明の分野
本発明は一般的に組換えウイルスの生産方法に、そしてより具体的には組換え
アデノ随伴ウイルスの生産方法に関する。発明の背景
アデノ随伴ウイルス(AAV)は複製欠損性パルボウイルスであり、そのゲノ
ムは145ヌクレオチドの逆方向末端反復配列(ITR)を含んで約4.6kb
の長さである。2つのオープンリーディングフレームは一連のrep及びcap
ポリペプチドをコードする。repポリペプチド(rep78、rep68、r ep
62及びrep40)はAAVゲノムの複製、レスキュー(rescue)
及び組込みに関与する。capタンパク質(VP1、VP2及びVP3)はビリ
オンキャプシドを形成する。rep及びcapオープンリーディングフレームに
5’及び3’末端で隣接するのは145bpの逆方向末端反復配列(ITR)で
あり、その最初の125bpはYまたはT状デュープレックス構造を形成するこ
とができる。AAVベクターの開発のために重要なことには、全rep及びca p
ドメインを取り出して治療またはレポーター導入遺伝子で置き換え可能である
ことが挙げられる[B.J.Carter、「Handbook of Par
voviruses」中、編集、P.Tijsser、CRC Press、p
p.155−168(1990)]。ITRはAAVゲノムの複製、レスキュー
、パッケージング及び組込みのために必要な最小配列であることが示されている
。
この非病原性ヒトウイルスがヒト細胞に感染すると、ウイルスゲノム
は第19染色体中に組込まれ、細胞の潜伏感染をもたらす。その細胞がアデノウ
イルスまたはヘルペスウイルスのような溶菌ヘルパーウイルスに同時感染しなけ
れば感染性ウイルスの生産及びウイルスの複製は起こらない。ヘルパーウイルス
に感染すると、AAVプロウイルスはレスキューされ、増幅され、そしてAAV
及びヘルパーウイルスの両方が生産される。感染する親のssDNAはrepに
依存してデュープレックス複製型(RF)DNAに増補される。レスキューされ
たAAVゲノムは前以て形成されたタンパク質キャプシド(直径約20nmの正
二十面体)中にパッケージされ、そして細胞溶解後に+または−のいずれかのs
sDNAゲノムをパッケージした感染性ビリオンとして放出される。
AAVは外来DNAを細胞に送達するためのベクターとしてそれを魅力的にす
る独特な特徴を有する。様々なグループが疾病状態の処置におけるAAVの可能
性のある使用を研究している。遺伝子治療のための形質導入ベクターとしてAA
Vを確立することへの進展は様々な理由のために遅れている。静止細胞中に組込
むAAVの能力は可能性のある形質導入遺伝子の長期間の発現の点で重要である
が、組込まれるプロウイルスが第19染色体中の特定の部位のみを優先的に標的
とする傾向はその有用性を減少する。
しかしながら、DNAの送達のためにAAVを使用することに対する障害は、
組換えゲノムの包膜化及び感染性ビリオンの生産のために非常に効率よいスキー
ムがないことである。[R.Kotin、Hum.Gene Ther.、5:
793−801(1994)を参照]。一つのそのような方法はrAAVゲノム
を宿主細胞中にトランスフェクトし、続いて、野生型AAV及びアデノウイルス
で同時感染させることを伴う。
しかしながら、この方法は容認できない高いレベルの野生型AAVを生じる。混
入する野生型AAVまたはヘルパーアデノウイルスの非存在下で細胞をrAAV
とインキュベーションすると、わずかな組換え遺伝子発現に結びつく。repの
非存在下では、組込みは効率が悪く、そして第19染色体に導かれない。
形質導入するAAVビリオンを生産するために一般に認められた方法は、2個
の異なるが相補的なプラスミドでの同時トランスフェクションを伴う。これらの
一方は2個のシスに作用するAAV ITRの間に挟まれた治療またはレポータ
ー導入遺伝子を含む。子孫組換えゲノムのレスキュー及びそれに続くパッケージ
ングのために必要とされるAAV成分は、ウイルスのrep及びcapタンパク
質のオープンリーディングフレームをコードするもう一方のプラスミドによりト
ランスに与えられる。Repタンパク質の過剰発現はアデノウイルス及び細胞増
殖に対していくらかの阻害作用を有する[J.Li等、J.Virol.、71
:5236−5243(1997)]。この毒性は、有用なrAAV遺伝子治療
ベクターの構築のためにトランスにこれらの遺伝子を与えることが困難である主
要な原因である。
体細胞遺伝子治療用ベクターとしての使用のためにAAV及び組換えAAVウ
イルスの効率よい生産を可能にする方法が当該技術分野において依然として必要
とされている。発明の要約
本発明はrAAVの効率よい生産を可能にする方法を提供し、それは先行する
類似技術が直面した困難を克服する。この方法は遺伝子治療において有用な組換
えAAVベクターの生産のために特に望ましい。この
方法は
(a)取り除かれるとrep及びcapの活性化を導くrep及びcap遺伝
子抑制配列をスプライシングして除くことを可能にするcre導入遺伝子;
(b)AAV rep及びcap遺伝子、これらの遺伝子の5’にはlox部
位が両側に位置するスペーサーがある;
(c)AAV逆方向末端反復配列(ITR)が両側に位置する治療導入遺伝子
を含んでなるミニ遺伝子;並びに
(d)アデノウイルスまたはヘルペスウイルスヘルパー機能を宿主細胞に与え
ることを伴う。
従って、一つの態様として、本発明はインビトロで遺伝子産物を発現する配列
の調節制御下にcre導入遺伝子を含有する第一ベクター、rep及びcap遺
伝子の5’にある、lox部位が両側に位置するスペーサーを含有する第二ベク
ター、並びにAAV ITRが両側に位置する治療導入遺伝子を含有する第三ベ
クターを宿主細胞中に導入することを含んでなるrAAVの生産方法を提供する
。これらのベクターはプラスミドまたは組換えウイルスであってもよい。これら
のベクターの一つは組換えアデノウイルスまたはヘルペスウイルスであってもよ
く、それはrAAV粒子を生産するために必須のウイルスヘルパー機能を宿主細
胞に与ることができる。しかしながら、全てのベクターがプラスミドである場合
は、細胞を適切なヘルパーウイルスにも感染させなければならない。次に、cr
e組換え酵素を生産できるようにする条件下で細胞を培養する。組換え酵素はr ep
/cap遺伝子の上流のlox部位が両側に位置するスペーサーの欠失を引
き起こす。スペーサーの除去によりrep
及びcap遺伝子が発現され、これは次にAAV ITRが両側に位置す
る治療導入遺伝子のパッケージングを可能にする。
別の態様として、本発明はlox部位が両側に位置するスペーサーをrep及
びcap遺伝子の5’に保有するベクター及び上記の治療ミニ遺伝子を含有する
ベクターでcre組換え酵素を発現する宿主細胞を同時トランスフェクトする方
法を提供する。本明細書に記述される方法によりヘルパー機能を与えて、細胞を
次に適切な条件下で培養する。培養するとcre組換え酵素はスペーサーの欠失
を引き起こし、従って、rep/capの発現を活性化し、上記のようなrAA
Vを生じる。
さらに別の態様として、本発明は本発明の方法により製造されるrAAVベク
ターを提供する。
本発明の他の態様及び利点は以下のその好ましい態様の詳細な説明中にさらに
記述される。図面の簡単な説明
図1は本発明のベクター中のスペーサーとして有用なグリーン蛍光タンパク質
(GFP)cDNA、イントロン及びポリアデニル化(pAまたはポリA)シグ
ナルを含有する1600bp DNAフラグメントの概要図である。
図2はスペーサーとして有用なネオマイシン耐性(neoR)をコードする遺
伝子及びポリAを含有する1000bp DNAフラグメントの概要図である。
図3は本発明の方法におけるヒト胚腎臓293細胞のトランスフェクションの
ために有用なプラスミドpG.CMV.nls.CREを示す。
図4は本発明の方法に有用なプラスミドpAd.P5.Sp.Rep
/Capを示す。
図5は本発明の方法に有用な組換えアデノウイルス、Ad.CMV.NLS−
CREの構築を示す。
図6AはAd.CAG.Sp.LacZウイルスの構造を示す。
図6Bは1のm.o.i.でLacZウイルスに感染させた293細胞から単
離され、NotIで切断されたゲノムDNAのサザンブロット分析を与える。1
000bpの32P−NEOスペーサーをプローブとして用いた。NotIでの切
断後に(creにより媒介される組換えのない)6200bpの制限フラグメン
ト及び/または(creにより媒介される組換えのある)5200bpの制限フ
ラグメントを検出することができる。
図6Cは10のm.o.i.でLacZウイルスに感染させた293細胞から
単離され、NotIで切断されたゲノムDNAのサザンブロット分析を与える。
1000bpの32P−NEOスペーサーをプローブとして用いた。NotIでの
切断後に(creにより媒介される組換えのない)6200bpの制限フラグメ
ント及び/または(creにより媒介される組換えのある)5200bpの制限
フラグメントを検出することができる。
図6Dは100のm.o.i.でLacZウイルスに感染させた293細胞か
ら単離され、NotIで切断されたゲノムDNAのサザンブロット分析を与える
。1000bpの32P−NEOスペーサーをプローブとして用いた。NotIで
の切断後に(creにより媒介される組換えのない)6200bpの制限フラグ
メント及び/または(creにより媒介される組換えのある)5200bpの制
限フラグメントを検出するこ
とができる。
図7はAd.Tre.CMV.GFP.Rep/Capウイルスの構造を示す
。発明の詳細な説明
本発明はcre−lox系を用いたrAAVの生産方法を提供し、それは組換
えAAVの効率よい生産系を提供することにおいて以前に経験された困難を克服
する。本発明の方法は治療導入遺伝子を保有するrAAVを生産し、それらは遺
伝子治療用途に特に有用である。
要約すると、本発明は
(a)cre導入遺伝子、
(b)AAV rep及びcap遺伝子、これらの遺伝子の5’にはlox部
位が両側に位置するスペーサーがある;
(c)AAV ITRが両側に位置する治療導入遺伝子を含んでなるミニ遺伝
子;並びに
(d)アデノウイルスまたはヘルペスウイルスヘルパー機能を含有する選択さ
れた宿主細胞を培養することを伴う。
本明細書の全体にわたって「ベクター」という用語の使用は、所望する成分を
トランスフェクションまたは感染により宿主細胞に導入することができるプラス
ミドまたはウイルスベクターのいずれかをさす。「宿主細胞」という用語はHE
K293細胞及び他のパッケージング細胞のような、アデノウイルスパッケージ
ング細胞として機能することができる、すなわち、AAVの生産のために必須で
あるあらゆるアデノウイルスタンパク質を発現するあらゆる哺乳類細胞を意味す
る。「ミニ遺伝子」という用語は宿主細胞において発現を導く調節配列と適切に
結合し且つ
AAV ITRが両側に位置する治療導入遺伝子を与える配列を意味する。「導
入遺伝子」という用語はベクター中に挿入される異種起源の遺伝子を意味する。
望ましくは、成分(a)、(b)及び(c)を別個のプラスミド配列上に保有
するか、または組み換えウイルス中の導入遺伝子として保有することができる。
あるいは、creタンパク質を選択した宿主細胞により発現させることができ、
従って、ベクターによるトランスフェクションを必要としない。これらの成分の
各々には、現在、組換えアデノウイルスが好ましい。しかしながら、本明細書に
与えられる情報及び既知の技術を用いて、当業者は宿主細胞において選択した成
分の発現を導くことができる別の組換えウイルス(すなわち、非アデノウイルス
)またはプラスミドベクターを容易に構築することができるはずである。例えば
、非***細胞に感染することができないために優先度は低いけれども、例えば、
レトロウイルスまたはバキュロウイルスを用いて、この系の必要成分、例えば、
cre組換え酵素を保有するベクターを容易に構築することができる。従って、
本発明は宿主細胞中にcre組換え酵素、rep/capまたはミニ遺伝子を導
入する目的のために選択されるウイルスまたはプラスミドにより限定されない。
しかしながら、望ましくは、これらのベクターの少なくとも1つは細胞にヘル
パー機能(d)も与える組換えウイルスである。あるいは、通常のように、ヘル
パーウイルス、すなわち、アデノウイルスまたはヘルペスウイルスに細胞を同時
感染させることによりヘルパー機能を与えることができる。ミニ遺伝子を含有す
る得られたrAAVをそこから単離することができる。
A. Cre導入遺伝子
creタンパク質は34bpの特定の配列(loxP)を認識するバクテリオ
ファージP1から単離された組換え酵素である。(creタンパク質により触媒
される)2個のloxP部位間の組換えにより、ある場合に、これらの部位が両
側に位置する配列の喪失が生じる[総説には、N.Kilby等、Trends Genet.
、9:413−421(1993)を参照]。creの配列はN
.Sternberg等、J.Mol.Biol.、187:197−212(
1986)中に与えられており、あるいは、他の商業的及び学術的供給者から入
手することができる。細胞におけるcreタンパク質の発現は本発明の方法にと
って必須である。
理論に結びつけられると思わずに、本発明者等は宿主細胞におけるcre組換
え酵素の発現により、第二ベクター中のプロモーターとrep/cap遺伝子の
間に存在する「スペーサー」DNA配列を欠失させることができると考える。こ
のrep及びcap遺伝子抑制配列の欠失によりrep及びcapタンパク質を
発現及び活性化することができ、そしてAAVゲノムの複製及びパッケージング
をもたらす。
creタンパク質を2つの選択肢の方法で与えることができる。タンパク質を
コードする遺伝子が適切な宿主細胞中にトランスフェクトされる別の成分であっ
てもよい。あるいは、rAAVの発現のために選択される宿主細胞が構成的にま
たは誘導性プロモーターの下でcreタンパク質を発現してもよい。
B. 三重感染/トランスフェクション法
本発明の一つの態様として、本方法はrAAVの生産のために選択し
た宿主細胞に感染/トランスフェクトさせるために3個のベクター、すなわち、
組換えウイルスまたはプラスミドを用いる。第一ベクターは発現制御配列に適切
に連結されたcre導入遺伝子を含んでなる。第二ベクターはスペーサー配列の
下流にAAV rep及びcap遺伝子を含んでなり、スペーサー配列はlox
部位が両側に位置し、そしてそれ自体が発現制御配列の下流にある。第三ベクタ
ーは治療ミニ遺伝子、すなわち、AAV ITRが両側に位置する導入遺伝子及
び調節配列を含んでなる。これらのベクターを宿主細胞中に導入するために適当
な技術は以下に説明され、そして当業者に知られている。全てのベクターが細胞
中に存在し、そして細胞にヘルパー機能が与えられる場合に、rAAVは効率よ
く生産される。
1. 第一ベクター
上に記述したように、好ましい態様として、第一ベクターは発現制御配列に適
切に連結されたcre導入遺伝子をアデノウイルスE1欠失の位置に含有する組
み換え複製欠損性アデノウイルス、例えば、Ad.CMV.NLS−CREであ
る。図5参照。好ましくは、以下の実施例におけるように、cre遺伝子は適当
な核局在化シグナル(NLS)に適切に連結される。適当なNLSは短い配列、
すなわち、約21bpの範囲であり、通常の技術を用いてそれを容易に合成する
ことができ、またはPCRプライマー中にNLS配列を含むことによりベクター
上に作製することができる。以下の実施例1に詳細に記述されるように、cre
遺伝子及び核局在化シグナル(NLS)は以前に記述されたプラスミドから得ら
れる。
望ましくは、cre遺伝子はサイトメガロウイルス(CMV)前初期
プロモーター/エンハンサー[例えば、Boshart等、Cell、41:5
21−530(1985)を参照]の制御下にある。しかしながら、当業者は他
の適当なプロモーターを容易に選択することができる。有用なプロモーターは構
成性プロモーターまたは調節性(誘導性)プロモーターであってもよく、発現さ
れるcre遺伝子産物の量を制御することができる。例えば、別の適当なプロモ
ーターは、限定することなしにラウス肉腫ウイルスLTRプロモーター/エンハ
ンサーを含む。当業者はさらに別のプロモーター/エンハンサー配列を選択する
ことができる。
さらに、組換えウイルスはベクターでトランスフェクトした細胞においてcr
e組換え酵素の発現を導くために必要な通常の調節成分も含む。そのような調節
成分は当業者に知られており、限定することなしにポリA配列、複製起点等を含
む。
2. 第二ベクター
本方法のこの態様に有用なもう一つの「第二」ベクターはAd.Sp.Rep
/Capとして実施例2に記述される。それはスペーサー配列の下流にAAV rep
及びcap遺伝子を含有し、スペーサー配列はlox部位が両側に位置し
、それ自体が発現制御配列の下流にある。
AAV rep及びcap配列は常法により得られる。好ましくは、プロモー
ターはAAV P5プロモーターである。しかしながら、当業者は他の適当なプ
ロモーターを容易に代用することができる。そのようなプロモーターの例は第一
ベクターに関連して上に説明される。
スペーサーはプロモーターと遺伝子の間の介在DNA配列(STOP)である
。それはloxPが両側に位置し、そして多数の翻訳開始及び終
結コドンを含む。スペーサーは「組換えにより活性化される遺伝子発現(RAG
E)」法[B.Sauer、Methods Enzymol.、225:89
0−900(1993)]を用いることがきるように設計される。そのような方
法は与えられた遺伝子(この場合、rep/cap)の発現を制御する。rep
/capを発現させるためには、スペーサーは第一ベクターのcreタンパク質
の発現及びそのlox配列との相互作用により切り出されなければならない。
現在、2つの特に好ましいスペーサーがある。これらのスペーサーは以下に記
述するように市販のプラスミド(Clontech)から得られるGFP cD
NA、イントロン及びポリアデニル化シグナルを含有する1600bp DNA
フラグメント(図1)を含む。もう一つの好ましいスペーサーは記述されたよう
な[M.Anton及びF.Graham、J.Virol.、69:4600
−4606(1995)]pBS64の1.3kbp ScaI−SmaIフラ
グメントとして得られる翻訳開始及び終結配列を含有する1300bpフラグメ
ントである。別の望ましいスペーサーはネオマイシン耐性コーディング配列及び
ポリアデニル化シグナルを含有する1000bpフラグメントである[Y.Ka
negae等、NucI.Acids Res.、23:3816−3821(
1995)](図2参照)。
本明細書に与えられる情報を用いて、長さ、少なくとも1組の翻訳開始及び終
結シグナルの存在並びに場合によりポリアデニル化部位の存在のような因子を考
慮して、当業者は他の適当なスペーサーを選択及び設計することができる。これ
らのスペーサーは典型的に最後の2つの成分(すなわち、開始/終結及びポリA
部位)を含む遺伝子を含有してもよ
い。望ましくは、組み換えの可能性を減らすために、スペーサーは2kbp未満
の長さである。しかしながら、本発明はそのように限定されない。
以下に記述するように、スペーサーにはloxP部位が両側に位置し、それは
creタンパク質により認識され、そしてスペーサーの欠失に関与する。lox P
の配列は様々な出典[R.H.Hoess及びK.Abremski、Pro c.Natl.Acad. Sci.
、81:1026−1029(1984)
]から公的に利用できる。適当なスペーサーを選択し、そして既知の技術を利用
すると、本発明の方法における使用のためにスペーサー配列の末端にloxP部
位を容易に作製することができる。
さらに、rep/cap遺伝子及びスペーサーを保有する組み換えウイルスは
、loxPが両側に位置するスペーサーをcre組換え酵素により切り出した後
に、組換えウイルスでトランスフェクトされた細胞においてrep及びcapの
発現を導くために必要な通常の調節成分も含む。そのような調節成分は当業者に
知られている。
3. 第三ベクター
第三ベクターは適当な導入遺伝子、プロモーター及び導入遺伝子の発現のため
に必要な他の調節成分を含んでなる配列として定義されるミニ遺伝子を含有し、
これら全体の両側にAAV ITRが位置する。第三ベクターがLacZ遺伝子
を保有する以下の実施例において、rAAVの存在はβ−ガラクトシダーゼ活性
のアッセイにより検出される。しかしながら、望ましくは、第三ベクターはこの
方法で生産されるrAAVにより動物に送達することができる治療遺伝子を保有
する。
用いられるAAV配列は好ましくはシスに作用する5’及び3’逆方向末端反
復配列(ITR)配列[例えば、B.J.Carter、「Handbook
of Parvoviruses」中、編集、P.Tijsser、CRC P
ress、pp.155−168(1990)を参照]である。ITR配列は約
143bpの長さである。この使用にはこれらの配列のある程度のわずかな改変
が許容されると考えられるが、好ましくは、ITRをコードする実質的に全配列
をベクター中に用いる。これらのITR配列を改変する技量は当該分野の技術の
範囲内である。[例えば、Sambrook等、「Molecular Clo
ning.A Laboratory Manual.」、第2版、Cold
Spring Harbor Laboratory、New York(19
89)のような研究書;Carter等、上に引用;及びK.Fisher等、J.Virol.
、70:520−532(1996)を参照]。
現在同定されているヒトAAV型を初めとするあらゆる既知のAAVからAA
V ITR配列を得ることができる。同様に、他の動物に感染することが知られ
ているAAVも本発明のベクター構築に用いることができる。AAVの選択は以
下の発明を限定すると思われない。各種AAV株、1−4型はAmerican
Type Culture Collectionから入手でき、または様々
な商業的及び機関の供給者から要求に応じて入手可能である。以下の代表的な態
様では便宜上AAV−2を用いる。
5’及び3’AAV ITR配列は選択した導入遺伝子配列及び結合した調節
成分の両側に位置する。ベクターの導入遺伝子配列は目的のポ
リペプチドまたはタンパク質をコードする、AAV配列に対して異種起源の核酸
配列である。導入遺伝子配列の性質は得られるベクターが用いられる用途により
決まる。例えば、導入遺伝子配列の一つの型は、発現時に検出できるシグナルを
生じるレポーター配列を含む。そのようなレポーター配列は限定することなしに
大腸菌β−ガラクトシダーゼ(LacZ)cDNA、アルカリホスファターゼ遺
伝子及びグリーン蛍光タンパク質遺伝子を含む。これらの配列は、それらの発現
を導く調節配列と結合されると、常法、例えば、紫外線波長吸光度、肉眼で見え
る色の変化等により検出できるシグナルを与える。
導入遺伝子配列のより好ましい型は宿主細胞において適切な遺伝子産物を発現
する治療遺伝子である。これらの治療核酸配列は典型的に遺伝的もしくは非遺伝
的遺伝子欠損を置き換えるかもしくは修正するため、または後成的疾患もしくは
疾病を処置するためにインビボまたはエクスビボで患者に投与し、そして発現さ
せるための産物をコードする。導入遺伝子配列の選択は本発明の制限ではない。
上に同定される主要な成分に加えて、ミニ遺伝子はこのベクターでトランスフ
ェクトされた細胞において導入遺伝子の発現を導くために必要な通常の調節成分
も含む。従って、導入遺伝子に連結され、そしてAAV ITR配列の間の導入
遺伝子内に位置する選択されたプロモーターをミニ遺伝子は含んでなる。
導入遺伝子の発現を導くために用いられるプロモーターの選択は日常的なこと
であり、ベクターの制限ではない。有用なプロモーターは第一ベクター成分に関
連して上に説明されるものを含む。
また、ミニ遺伝子は望ましくは転写産物の効率よいポリアデニル化の
ために必要なシグナルを与える配列並びに機能的なスプライス供与及び受容部位
を含むイントロンを初めとする異種起源の核酸配列を含む。本発明の代表的なベ
クターに用いられる共通のポリ−A配列はパポーバウイルスSV−40から得ら
れるものである。通常、ポリ−A配列は導入遺伝子配列の後ろで且つ3’AAV
ITR配列の前に挿入される。共通のイントロン配列もSV−40から得られ
、SV−40 Tイントロン配列と呼ばれる。また、本発明のミニ遺伝子は、望
ましくは、プロモーター/エンハンサー配列と導入遺伝子の間に位置する上述の
ようなイントロンも含む。これら及び他の共通のベクター成分の選択は慣例であ
り、多数のそのような配列が利用できる[例えば、Sambrook等及びそれ
に引用される参考文献を参照]。
ミニ遺伝子を含有するrAAVベクターをプラスミドバックボーン上に保有し
、選択した宿主細胞をトランスフェクトするために用いてもよく、または選択し
た宿主細胞にそれが感染できるようにするウイルス配列(例えば、アデノウイル
ス配列)が両側に位置してもよい。適当なAd/AAV組み換えウイルスを既知
の技術により製造することができる。例えば、引用することにより本明細書に組
み込まれる1996年5月9日に公開された国際特許出願WO96/13598
号;1995年9月8日に公開されたWO95/23867号及び1995年3
月9日に公開されたWO95/06743号を参照。
C. 宿主細胞/二重感染またはトランスフェクション系
本発明の方法の別の態様として、cre組換え酵素を発現するパッケージング
細胞系を構築する。本方法のこの態様により、cre組換え酵素を発現するこの
細胞系を上記のようなcre遺伝子を保有するベクタ
ーまたはプラスミドの代わりにすることができる。従って、上記の第二及び第三
ベクターのみを続いて細胞中に導入する。
代表的な適当なcre発現細胞系は図3に示されるベクターを用いて作製され
ている。この細胞系の作製は以下の実施例4に詳細に記述される。しかしながら
、本発明はこれらの構築物に限定されない。本明細書に与えられる情報を与えら
れれば、当業者は適当な選択マーカー(例えば、neoR)を含有する別のプラ
スミドを容易に作製することができる。次に、そのようなプラスミドを本発明の
cre組み換え酵素発現細胞系の作製のために用いることができる。
そのようなcreを発現する細胞系を得ると、この細胞系に上記のrep/c
ap遺伝子を含有するベクター及びミニ遺伝子を含有するベクターを感染(また
はトランスフェクト)させることができる。
D. ベクター及びrAAVの製造
上記のベクターの各々の中に含まれる選択したDNA配列の組み立ては通常の
技術を利用する。そのような技術は研究書[Sambrook等、上に引用]中
に記述されるもののようなcDNAクローニング、ポリメラーゼ連鎖反応と組み
合わせたアデノウイルス、AAVゲノムの重複するオリゴヌクレオチド配列の使
用及び所望するヌクレオチド配列を与える他の適当な方法を含む。
3個のベクター系、またはcreを発現する宿主細胞と2個のベクターを用い
ようと、宿主細胞中へのベクターの導入は既知の技術を用いて成し遂げられる。
適切な場合、相補性ヒト胚腎臓(HEK)293細胞系(トランスに作用するE
1aタンパク質を与える機能的なアデノウイルスE1a遺伝子を含有するヒト腎
臓細胞系)を用いて標準的なトラン
スフェクション及び同時トランスフェクション技術、例えば、CaPO4トラン
スフェクション技術を利用する。本発明に用いられる他の常法はウイルスゲノム
の相同的組み換え、寒天オーバーレイにおけるウイルスのプラーク形成、シグナ
ル生成を測定する方法等を含む。
感染/トランスフェクション後に、宿主細胞を次に標準条件下で培養してrA
AVを生産できるようにする。例えば、F.L.Graham及びL.Prev
ec、Methods Mol.Biol.、7:109−128(1991)
を参照。望ましくは、常法によりいったんrAAVが同定されると、標準技術を
用いてそれを回収し、精製することができる。
以下の実施例は本発明の好ましい方法を示す。これらの実施例は実例であり、
本発明の範囲を限定すると考えられない。実施例1−Ad.CMV.NLS−CREの構築
サイトメガロウイルスプロモーターの制御下に核局在化シグナル及びcre遺
伝子を含有する組み換えアデノウイルスの構築を図5に関して以下に記述する。
SfciI及びPacIで消化し、次にクレノウ(Klenow)及びT4
DNAポリメラーゼで末端平滑化することによりプラスミドpexCANCRE
[Y.Kanegae等、Nucl.Acids Res.、23:3816−
3821(1995)]からnls−CrecDNAを単離した。次に、NLS
−CreフラグメントをプラスミドpAd.CMV.Link(X.Ye等、J .Biol.Chem.
、271:3639−3646(1996)中に記述さ
れるようにE1a及びE1bを欠失している、ヒトAd5配列、地図単位0ない
し16を
含有するプラスミド)のEcoRV部位にクローン化した。得られたプラスミド
pAd.CMV.NLS−CRE中の核局在化シグナルの方向及び存在をシーク
エンシングにより確かめた。
cre導入遺伝子を保有する組換えアデノウイルスを生産するために、pAd
.CMV.NLS−CRE組み換えベクターを293細胞中にAd d1327
バックボーンと同時にトランスフェクトした。10日後に、15個のプラークを
選択し、それらの5個を293細胞で増やした。Y.Kanegae等、Nuc l.Acids Res.
、23:3816−3821(1995)中に記述さ
れるアデノウイルス構築物を用いてCAGプロモーター(β−アクチン)とバク
テリアのLacZコーディング配列の間に位置するスペーサーを取り除く能力を
評価することにより、ウイルスをそれらの組換え酵素活性に関してスクリーニン
グした。2個のウイルスがβ−ガラクトシダーゼ活性に関して陽性の結果であり
、これはcre組換え酵素活性を示している。必要な場合、これらの組換えウイ
ルスを2回のプラーク精製により精製することができる。実施例2−Ad.sp.Rep/Capの構築
AAV rep及びcap遺伝子を含有する代表的な組換えアデノウイルスを
以下のように製造することができる。
以下のプライマー対:
XbaI ITR右向き:配列番号2
Bam P5右向き:配列番号3Bam P5左向き:配列番号4
SacI左向き:配列番号5
を用いてPCRにより全AAV2ゲノム[R.J.Samulski等、J.V irol.
、61:3096−3101(1987)]を含有するプラスミドpsub201
からの121bpのXbaI−BamHIフラグメントからAAV
P5プロモーターを得た。
Rep/Cap遺伝子の5’部分を同様にpsub201から得られるBam
HI−SacIフラグメント(504bp)からPCRにより取り出した。Ba
mHI PCRプライマーはrep mRNAと最初のrep ATGの間に唯
一の部位を生じる。
P5プロモーター及びRep/Cap遺伝子フラグメントをpSP72ベクタ
ー(Promega)のXbaI−SacI部位にサブクローン化し、p5.R
ep/Capを生じた。BamHIでの消化後にプラスミドpMA19[M.A
nton及びF.Graham、J.Virol.、69:4600−4606
(1995)]からスペーサーDNA、LoxP部位が両側に位置する1300
bpフラグメントを得た。このスペーサーDNAをP5.Rep/Cap構築物
の唯一のBamHI部位にクローン化し、P5.スペーサー.Rep/Cap構
築物を生じた。
P5.スペーサー.Rep/CapプラスミドのSacI−EcoRV部位に
Rep/Cap遺伝子の3’部分(SacI/平滑末端化フラグメント、368
0bp)をサブクローン化することにより、プロモーター、スペーサー及びre
p/Cap遺伝子を含有する完全なフラグメ
ントを得た。(完全な野生型AAVゲノムを含有する)SSV9プラスミドから
SacI−平滑末端化フラグメントとしてRep/Cap遺伝子の3’部分を単
離した。これはSSV9をXbaIで消化し、XbaI部位をクレノウで埋め、
そしてSacIで消化することによりそのフラグメントを遊離することを伴った
。
P5プロモーター、スペーサー及びrep/cap配列を含有する完全なフラ
グメントをpAd.linkベクターのBglII部位にサブクローン化した。P
5.スペーサー.Rep/Capプラスミド構築物の5’末端にBglIIリンカ
ーを付加し、そしてpSP72のマルチプルクローニング部位の3’末端に位置
するBglIIを用いることによりこれを成し遂げた。
得られたプラスミド(11250bp)はAd5地図単位(mu)0−1、P
5プロモーター、loxP部位が両側に位置するスペーサー配列、rep/ca
p及びAd5mu9−16を含有する。このプラスミドをpAd.P5.スペー
サー.Rep/Cap[図4]と称する。
rep及びcapを発現することができる組み換えアデノウイルスを生産する
ために、まず、(cre組換え酵素により触媒される)loxP部位間の組換え
後にスペーサーを取り除くことができるかどうかを決定するために、pAd.P
5.スペーサー.Rep/Capを用いてcreを発現するバクテリア株大腸菌
株BNN132(ATCC受託番号47059)を形質転換した。いくつかの形
質転換コロニーから単離したプラスミドDNAのアガロースゲルでの分析から、
実際に、分析した構築物の大部分が形質転換後にスペーサーを失うことが示され
た(データは示さない)。
また、プラスミドP5.スペーサー.Rep/CapをHEK293細胞にA
d dl327バックボーンと同時にトランスフェクトした。10日後に、20
個のプラークを選択し、増やした。完全なAAVゲノム及び1300bp DN
Aスペーサーをプローブとして用いてサザンブロットによりウイルスの構造を分
析した。1個のプラーク(P3)が制限酵素BamHIでの消化後に予想される
バンドパターンを示した(データは示さない)。
他の適当なスペーサーを用いて同様な構築物を作製することができる。例えば
、ヒト化されたGFP遺伝子を含有するプラスミドphGFP−S65Tプラス
ミド(Clontech)から1600bpスペーサーを得た。phGFP−S
65Tを制限酵素HindIII及びBamHIで切断した。5’末端にBglII
リンカーを付加した後(BglIIはBamHIと合致する)、フラグメントの両
側にloxP部位を付加するために1.6kbフラグメントをfloxベクター
[H.Gu等、Science、265:103−106(1994)]のBa
mHI部位にサブクローン化した。次に、loxP部位が両側に位置するGFP
DNAフラグメントをPvuI及びSmaIで切断し、Bluescript
IIクローニングベクター(Stratagene)のEcoRV部位にサブク
ローン化した。得られたGFPスペーサーを用いて上記のようなP5.スペーサ
ー.Rep/Capプラスミドまたはアデノウイルスを構築することができる。実施例3−rAAVの生産
実施例2に記述した研究から得られた(ウイルスを含有する)いくつかのプラ
ークからの上清を、上の実施例1に記述したように構築された
creタンパク質をコードするアデノウイルス及びpAV.CMVLacZを含
む機能的アッセイにおいてAAVを生産する能力に関して試験した。
プラスミドpAV.CMVLacZはrep及びcap遺伝子がCMVプロモ
ーターからβ−ガラクトシダーゼを発現するミニ遺伝子で置き換えられているr
AAVカセットである。pAV.CMVLacZの直線配列は:
(a)pAV2[C.A.Laughlin等、Gene、23:65−73
(1983)]を鋳型として用いてPCRにより得られた5’AAV ITR(
bp 1−173)[配列番号1のヌクレオチド番号365−538]、
(b)CMV前初期エンハンサー/プロモーター[Boshart等、Cel l
、41:521−530(1985);配列番号1のヌクレオチド番号563
−1157]、
(c)SV40イントロン(配列番号1のヌクレオチド番号1178−117
9)、
(d)大腸菌β−ガラクトシダーゼcDNA(配列番号1のヌクレオチド番号
1356−4827)、
(e)SV40ポリアデニル化シグナル(初期及び後期転写単位の両方からの
開裂/ポリ−Aシグナルを含有する237 BamHI−Bc1I制限フラグメ
ント;配列番号1のヌクレオチド番号4839−5037)及び
(f)pAV2からSnaBI−BglIIフラグメントとして得られた3’A
AV ITR(配列番号1のヌクレオチド番号5053−52
21)
を含む。
creウイルス及びRep/Capウイルスに293細胞を感染させ(感染多
重度(MOI)10)、続いて2時間後に5μgのpAV.CMVLacZでト
ランスフェクションすることにより機能的アッセイを実施した。48時間後に、
細胞を集め、凍結融解した。(rAAVを含有する)上清の1/5を用いて29
3細胞に感染させた。24時間後にX−galアッセイを実施した。
プラーク#3からのウイルスはこのアッセイにおいてβ−ガラクトシダーゼ形
質導入に関して陽性をもたらした。プラーク#3からの上清を2回目の精製(プ
ラーク増幅)に用いた。20個のプラークを選択し、増やした。実施例4−Creを発現する細胞系の製造
293細胞のトランスフェクションに用いるためにプラスミドベクター、pG
.CMV.nls.creを以下のように構築した。nls−Cre cDNA
を上の実施例1に記述したようにプラスミドpexCANCRE(Kanega
e、上に引用)から単離した。次に、nls−Creフラグメントをベクターp
GのCMVプロモーターの下流のXbaI部位にサブクローン化した。このプラ
スミドベクターは図3に示され、pUC19のバックボーン上にヒト成長ホルモ
ン(hGH)終結配列、SV40oriシグナル、ネオマイシン耐性マーカー、
SV40ポリアデニル化部位、アンピシリンマーカーを含有する。
通常の技術を用いてこのプラスミドを293細胞中にトランスフェクトした。
G−418の存在下でネオマイシン耐性に関して細胞を選択し
た。バクテリアのLacZ遺伝子が続く2個のloxP部位が両側に位置するネ
オマイシンスペーサーDNAによりβ−アクチン(CAG)プロモーターから隔
てられたバクテリアのLacZコーディング配列を含有するアデノウイルス、A
d.CAG.Sp.LacZを異なるMOI(1ないし100)で細胞に感染さ
せることにより細胞を同定した。スペーサーフラグメントを取り除いてLacZ
遺伝子の発現を導く能力に基づいて細胞を選択した。X−gal染色後に、6個
の細胞系が陽性であると分かった。これらの感染細胞からDNAを単離し、スペ
ーサーDNA(NEO)をプローブとして用いてサザンブロットにより分析した
。結果を表1に関して図6Aに示し、図6B−6Dは細胞系#2が分析した他の
293/cre細胞系よりかなり優れた効能でDNAスペーサーを取り除くこと
ができることを示す。
実施例5−Ad.GFP Rep/Capの作製
Ad.Sp.Rep/Capウイルスの構築に関して実施例2に記述したよう
に、P5プロモーター、2個のloxP部位が両側に位置するGFPスペーサー
並びにRep及びCapコーディング配列を含有するリンクプラスミドをHEK
293細胞中にAd d1327バックボーンと同時にトランスフェクトした。
10日後に、20個のプラークを選択し、増やした。この増殖中に、470−4
90nm帯域励起フィルタ
ー(Nikon)で水銀灯を用いて顕微鏡分析によりGFPの発現に関してHE
K293細胞の単層をスクリーニングした。単層の一つ(プラーク#13から)
はGFPの発現に関して陽性の領域を示した。この領域をさらに増やし、さらに
2回のプラーク精製により精製した。記述したようなGFPの発現により、そし
て/または特異的モノクローナル抗体(American Research
Products,Inc.)を用いたウェスタンブロット分析によるRep及
びCapタンパク質の発現によりAd.GFP.Rep/Capウイルスの存在
を調べた。293細胞に感染させるためにAd.GFP rep/capを含有
する(1個の精製されたプラークからの)1つの細胞ライセートを用いた(HE
K293細胞の40 x 150mm皿を用いたアデノウイルス調製物)。精製
後に全部で6.86 x 1013粒子/mlを得た。実施例3に記述したように
、rAAVの生産に関してこのウイルスを現在試験している。実施例6−Ad.TRE.CMV.GFP.Rep/capの構築
図7にAd.TRE.CMV.Rep/Capウイルスの最終構造を示す。A
AVP5プロモーターをテトラサイクリン(Tet)誘導性プロモーター(Cl
ontech)で置き換えた。このプロモーターはテトラサイクリン応答配列(
TRE)及びそれに続くCMVエンハンサーを含まないCMV最小プロモーター
を含む。GP16転写活性化ドメインに融合されたrTetR(逆Tetリプレ
ッサー)を発現する安定な遺伝子を含有する293/Tet−On細胞系(Cl
ontech)において抗生物質のドキシサクリン(Sigma)の存在下でこ
のプロモーターは誘導できる。ここでの目的は細胞毒性のRep遺伝子産物の
発現を制限するために2重誘導性発現系を構築することである。Rep及びCa
p遺伝子の発現を完全に誘導するためには、ウイルスは1−cre組換え酵素(
先に記述したようにGFPスペーサーを欠失させるために)及び2−Tet−O
n誘導性因子ドキシサクリン(DOX)の存在下でなければならない。
上記の構築物を含有するリンクプラスミドを用いてDOX及び/または(nl
s−creを発現するアデノウイルスからの)cre組換え酵素の存在または非
存在下でHEK293細胞をトランスフェクトした。細胞ホモジネートからのタ
ンパク質をRep抗体を用いてウェスタンブロットにより分析した。Repタン
パク質はDOX及びcre組み換え酵素の存在下のみで完全に誘導される。
pAd.TRE.CMV.link.1を構築するために、pTREプラスミ
ド(Clontech)を制限エンドヌクレアーゼXho及びEcoRIで切断
してTRE及び最小CMVプロモーターを単離した。Xho及びEcoRI部位
をクレノウで埋め、この448bpフラグメントをpAdlink.1プラスミ
ドのEcoRV部位に挿入した。続いて、GFP.Rep/Capフラグメント
をClaI及びBglIIIで切断し、ClaI及びBamHIで切断したpAd
.TRE.CMV.Link.1に挿入した。
このリンク組み換えプラスミドをHEK293細胞中にAd dl327バッ
クボーンと同時にトランスフェクトした。10日後に、20個のプラークを選択
し、増やした。現在、GFP並びにRep及びCapタンパク質の発現に関して
これらのプラークを分析している。多量のrepタンパク質を発現する2個のア
デノウイルスを同定した。現在、こ
れらのウイルスを精製し、研究している。
本発明の多数の修正及び改変は上に同定される明細書中に含まれ、そして当業
者にとって明らかであると考えられる。本発明の方法に対するそのような修正及
び改変はここに付加される請求の範囲の中に包含されると考えられる。
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フロントページの続き
(81)指定国 EP(AT,BE,CH,DE,
DK,ES,FI,FR,GB,GR,IE,IT,L
U,MC,NL,PT,SE),OA(BF,BJ,CF
,CG,CI,CM,GA,GN,ML,MR,NE,
SN,TD,TG),AP(GH,KE,LS,MW,S
D,SZ,UG,ZW),EA(AM,AZ,BY,KG
,KZ,MD,RU,TJ,TM),AL,AM,AT
,AU,AZ,BA,BB,BG,BR,BY,CA,
CH,CN,CU,CZ,DE,DK,EE,ES,F
I,GB,GE,GH,HU,IL,IS,JP,KE
,KG,KP,KR,KZ,LC,LK,LR,LS,
LT,LU,LV,MD,MG,MK,MN,MW,M
X,NO,NZ,PL,PT,RO,RU,SD,SE
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UA,UG,US,UZ,VN,YU,ZW
(72)発明者 フアニユーフ,ダニエル
アメリカ合衆国ペンシルベニア州19107フ
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834・アパートメント1032
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 1. (a)取り除かれるとrep及びcapの活性化を導くrep及びca p 遺伝子抑制配列をスプライシングして除くことを可能にするcre導入遺伝子 、 (b)5’にスペーサーを有するAAV rep及びcap遺伝子で、 該スペーサーにはlox部位が両側に位置する; (c)AAV逆方向末端反復配列(ITR)が両側に位置する治療導入 遺伝子を含んでなるミニ遺伝子; を含んでなり且つ発現することができる宿主細胞を十分なヘルパーウイルス機能 の存在下で培養することを含んでなり、該導入遺伝子を発現することができる組 換えAAVが生産される、組み換えアデノ随伴ウイルス(AAV)の製造方法。 2. (a)i.cre組換え酵素の発現を可能にする配列の制御下にcre 遺伝子を含んでなる第一ベクター; ii.5’から3’に向かって、選択したプロモーター、lox P 部位が両側に位置するスペーサー配列、AAV rep遺伝子及びAAV c ap 遺伝子を含んでなる第二ベクター; iii.5’から3’に向かって、本質的に5’AAV逆方向末 端反復配列(ITR)、選択したプロモーター、選択した導入遺伝子及び3’A AV ITRからなるミニ遺伝子を含んでなる第三ベクター を選択した宿主細胞中に導入し、 (b)cre組換え酵素の発現を可能にする条件下で宿主細胞を培養し 、そして (c)該導入遺伝子の産物を発現することができる組み換えAAVを回 収する ことをさらに含んでなる請求の範囲1の方法。 3. 該ベクターの少なくとも1つが組換えアデノウイルスであり、そして宿 主細胞が293細胞である請求の範囲1の方法。 4. 第一ベクターが組換えアデノウイルスであり、発現を可能にする配列が サイトメガロウイルスプロモーターを含んでなり、ベクターがcre遺伝子に適 切に連結された核局在化シグナルをさらに含んでなる請求の範囲1の方法。 5. 第二ベクターが組換えアデノウイルスであり、そして選択したプロモー ターがAAV P5を含んでなる請求の範囲1の方法。 6. スペーサー配列が (a)翻訳開始及び終結配列を含有する1300bpフラグメント; (b)GFP cDNA、イントロン及びポリアデニル化シグナルを含有する 1600bpフラグメント;並びに (c)ネオマイシンコーディング配列及びポリアデニル化シグナルを含有する 1000bpフラグメントよりなる群から選択される請求の範囲5の方法。 7. (a)creを発現する宿主細胞を生ぜしめ; (b)5’から3’に向かって、選択したプロモーター、loxP部位 が両側に位置するスペーサー配列、並びにAAV rep及びcap遺伝子を含 んでなる第一ベクター;並びに 5’から3’に向かって、本質的に5’AAV逆方向末端反復配 列(ITR)、選択したプロモーター、選択した導入遺伝子及 び3’AAV ITRからなるミニ遺伝子を含んでなる第二ベクターを該宿主細 胞中に導入し; (c)cre組換え酵素の発現並びに組換えAAVの複製及びパッケー ジングを可能にする条件下で宿主細胞を培養し;そして (d)導入遺伝子の産物を発現することができる組換えAAVを回収す る ことを含んでなる組換えアデノ随伴ウイルス(AAV)の生産方法。 8. 第一及び第二ベクターが組換えアデノウイルスである請求の範囲7の方 法。 9. スペーサー配列が (a)翻訳開始及び終結配列を含有する1300bpフラグメント; (b)GFP cDNA、イントロン及びポリアデニル化シグナルを含有する 1600bpフラグメント;並びに (c)ネオマイシンコーディング配列及びポリアデニル化シグナルを含有する 1000bpフラグメントよりなる群から選択される請求の範囲8の方法。 10. 請求の範囲1−9のいずれかの方法により生産される組み換えAAV 。
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