JP2918895B2 - 組換え型ｄｎａ由来ボルデテラ毒素サブユニット類似体 - Google Patents
組換え型ｄｎａ由来ボルデテラ毒素サブユニット類似体Info
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Description
【発明の詳細な説明】 発明の背景 本発明は異種蛋白質の一部との融合に依らないE.coli
におけるボルデテラ属菌（Bordetella）外毒素のS1,S2,
S3,S4及びS5のサブユニット類似体（アナログ）の高レ
ベル直接組換え発現を提供する。さらに特に、該サブユ
ニットの遺伝子工学的改変により、毒素中和レベルの抗
体を引き出し、且つ実質的に反応原性成分を生じない能
力を有するBordetella類の毒素類似体が提供される。遺
伝子工学的サブユニットを用いて、免疫原性効能を有し
且つ実質的に反応原性成分がないサブユニットワクチン
を生産し得る。
におけるボルデテラ属菌（Bordetella）外毒素のS1,S2,
S3,S4及びS5のサブユニット類似体（アナログ）の高レ
ベル直接組換え発現を提供する。さらに特に、該サブユ
ニットの遺伝子工学的改変により、毒素中和レベルの抗
体を引き出し、且つ実質的に反応原性成分を生じない能
力を有するBordetella類の毒素類似体が提供される。遺
伝子工学的サブユニットを用いて、免疫原性効能を有し
且つ実質的に反応原性成分がないサブユニットワクチン
を生産し得る。
Bordetella外毒素という語、B.pertussis（百日咳
菌），B.parapertussis及びB.bronchisepticaといった
種々のBordetella種のゲノムによりコードされる毒素群
を表わしている。Bordetella外毒素を示すために一般に
用いる他の語としては、pertussis毒素（『PTX』）、リ
ンパ球増加症促進因子（『LPF』）、及び島活性化蛋白
質（『IAP』）、がある。
菌），B.parapertussis及びB.bronchisepticaといった
種々のBordetella種のゲノムによりコードされる毒素群
を表わしている。Bordetella外毒素を示すために一般に
用いる他の語としては、pertussis毒素（『PTX』）、リ
ンパ球増加症促進因子（『LPF』）、及び島活性化蛋白
質（『IAP』）、がある。
百日咳は依然として全世界の多くの地域において乳児
罹患率及び死亡率の主要原因である。全細胞Bordetella
pertussisワクチンはこの疾病を制御する有効な手段を
提供してきた。しかしながら、このようなワクチンの使
用は軽症副作用と直接相関しており、且つ一時的にはさ
らに重症副作用とも、さらに時として胎児神経学的事象
に関連していた。一般に用いられているワクチンに関連
があることが公知の有害な副作用を排除するために、努
めて広範な努力が払われてきた。これらの努力により無
細胞ワクチンの生産及び試験が行われ、さらに安全な組
換え物質を開発せんとする基礎研究が行われてきた。組
換えDNA由来ワクチンのクローニング及び開発に対する
決定的第一段階は、pertussis毒素オペロンの配列を決
定することと、その後の個々のサブユニットのアミノ酸
配列を推定することであった（Locht,C.及びKeith,J.
M.,1986,Science 232:1258−1264;Locht等,1986,Nucl.A
cids Res.14:3251−3261;並びにNicosia等,1986,Proc.N
atl.Acad.Sci.USA83:4631−4635）。
罹患率及び死亡率の主要原因である。全細胞Bordetella
pertussisワクチンはこの疾病を制御する有効な手段を
提供してきた。しかしながら、このようなワクチンの使
用は軽症副作用と直接相関しており、且つ一時的にはさ
らに重症副作用とも、さらに時として胎児神経学的事象
に関連していた。一般に用いられているワクチンに関連
があることが公知の有害な副作用を排除するために、努
めて広範な努力が払われてきた。これらの努力により無
細胞ワクチンの生産及び試験が行われ、さらに安全な組
換え物質を開発せんとする基礎研究が行われてきた。組
換えDNA由来ワクチンのクローニング及び開発に対する
決定的第一段階は、pertussis毒素オペロンの配列を決
定することと、その後の個々のサブユニットのアミノ酸
配列を推定することであった（Locht,C.及びKeith,J.
M.,1986,Science 232:1258−1264;Locht等,1986,Nucl.A
cids Res.14:3251−3261;並びにNicosia等,1986,Proc.N
atl.Acad.Sci.USA83:4631−4635）。
Nicosis等（1987,Infect.Immun.,55:963−967）は、B
ordetella pertussisの各サブユニットS1,S2,S3,S4及び
S5をコードするmRNAがE.coliのクローン化遺伝子から効
率よく転写され得ることを立証した。彼等は本来のpert
ussis毒素ポリシストロンメッセージの高レベル転写を
示そうとしたけれども、直接発現により産生された蛋白
質量は非常に低いかあるいは検出不可能であった。さら
に、その後合成された融合蛋白質は、中和反応又は保護
免疫反応のいかなるものも引き出すことができなかっ
た。
ordetella pertussisの各サブユニットS1,S2,S3,S4及び
S5をコードするmRNAがE.coliのクローン化遺伝子から効
率よく転写され得ることを立証した。彼等は本来のpert
ussis毒素ポリシストロンメッセージの高レベル転写を
示そうとしたけれども、直接発現により産生された蛋白
質量は非常に低いかあるいは検出不可能であった。さら
に、その後合成された融合蛋白質は、中和反応又は保護
免疫反応のいかなるものも引き出すことができなかっ
た。
Barbieri等（1987,Infect.Immun.,55:1321〜1323）
は、E.coliにおける融合蛋白質としてのS1サブユニット
の発現を立証した。この融合蛋白質はベータ−ガラクト
シダーゼの最初の６個のアミノ酸、pUC18ポリリンカー
によりコードされる５個のアミノ酸、その後に続くS1サ
ブユニットの２〜235のアミノ酸を含有する。少量産生
されるS1融合蛋白質は真正の又は天然のpertussis毒素
のADP−リボシルトランスフェラーゼ（ADP−リボース転
移酸素）活性の約25％を有するにすぎなかった。
は、E.coliにおける融合蛋白質としてのS1サブユニット
の発現を立証した。この融合蛋白質はベータ−ガラクト
シダーゼの最初の６個のアミノ酸、pUC18ポリリンカー
によりコードされる５個のアミノ酸、その後に続くS1サ
ブユニットの２〜235のアミノ酸を含有する。少量産生
されるS1融合蛋白質は真正の又は天然のpertussis毒素
のADP−リボシルトランスフェラーゼ（ADP−リボース転
移酸素）活性の約25％を有するにすぎなかった。
Locht等（Abatract,Modern Approaches to New Vacci
ns,Cold Spring Harbor Laboratory,Cold spring Harbo
r,New York,1986年９月９−14日）は、S1サブユニット
の２〜187アミノ酸を含有する融合蛋白質を発現すると
ができた。その酸素活性が毒素の反応原性に関与すると
確信されているADP−リボシルトランスフェラーゼに関
連したNAD結合部位をそれは欠いていると考えられたの
で、その構築物は毒素活性を有していないであろうと彼
等は予測した。この分子を用いたその後の実験から、こ
の切頭型分子は本質的に低減のない酸素活性を有するこ
とが示された。公知の従来の技術のサブユニット又はサ
ブユニット類似体で毒素中和レベルの抗体を引き出す能
力を有するものはなく、また反応原性に関連した酸素活
性を実質的に有していないものもなかった。
ns,Cold Spring Harbor Laboratory,Cold spring Harbo
r,New York,1986年９月９−14日）は、S1サブユニット
の２〜187アミノ酸を含有する融合蛋白質を発現すると
ができた。その酸素活性が毒素の反応原性に関与すると
確信されているADP−リボシルトランスフェラーゼに関
連したNAD結合部位をそれは欠いていると考えられたの
で、その構築物は毒素活性を有していないであろうと彼
等は予測した。この分子を用いたその後の実験から、こ
の切頭型分子は本質的に低減のない酸素活性を有するこ
とが示された。公知の従来の技術のサブユニット又はサ
ブユニット類似体で毒素中和レベルの抗体を引き出す能
力を有するものはなく、また反応原性に関連した酸素活
性を実質的に有していないものもなかった。
発明の要約 本発明は、少なくともBordetella外毒素のサブユニッ
トS1をコードする部分、あるいは上記部分の断片又は誘
導体より成る組換えDNA分子を提供するが、ここで上記
部分あるいは断面又は誘導体は、（ａ）毒素中和レベル
の抗体を引き出す（誘発する）ことができ、（ｂ）実質
的には能原性成分を含まない生物学的活性を有するポリ
ペプチドをコードする。ポリペプチドS1サブユニット又
はそのサブユニット類似体はpertussis毒性に対して免
疫防御を提供する際に重要であることが公知の主要エピ
トープよりなる。毒素中和レベルの抗体はpertussis毒
性に対する免疫防御を示す。部位特異的突然変異誘発に
より実質的には酸素的に不活性であるサブユニットS1の
類似体が生じる。
トS1をコードする部分、あるいは上記部分の断片又は誘
導体より成る組換えDNA分子を提供するが、ここで上記
部分あるいは断面又は誘導体は、（ａ）毒素中和レベル
の抗体を引き出す（誘発する）ことができ、（ｂ）実質
的には能原性成分を含まない生物学的活性を有するポリ
ペプチドをコードする。ポリペプチドS1サブユニット又
はそのサブユニット類似体はpertussis毒性に対して免
疫防御を提供する際に重要であることが公知の主要エピ
トープよりなる。毒素中和レベルの抗体はpertussis毒
性に対する免疫防御を示す。部位特異的突然変異誘発に
より実質的には酸素的に不活性であるサブユニットS1の
類似体が生じる。
すなわち、本発明は、百日咳菌（Bordetelle pertus
sis）外毒素のポリペプチド類似体であって、前記類似
体のアミノ酸配列が、天然サブユニットS1のアミノ酸配
列中少なくとも、バリン７からプロリン14までの領域に
１つ以上の部位特異的突然変異を有することで天然サブ
ユニットS1のアミノ酸配列と異なり、また前記類似体
が、（ａ）百日咳菌に対する、毒素中和レベルの抗体を
誘発することが可能で、（ｂ）百日咳菌外毒素反応原性
と関連する酵素活性を含まないことを特徴とする前記ポ
リペプチド類似体を提供する。
sis）外毒素のポリペプチド類似体であって、前記類似
体のアミノ酸配列が、天然サブユニットS1のアミノ酸配
列中少なくとも、バリン７からプロリン14までの領域に
１つ以上の部位特異的突然変異を有することで天然サブ
ユニットS1のアミノ酸配列と異なり、また前記類似体
が、（ａ）百日咳菌に対する、毒素中和レベルの抗体を
誘発することが可能で、（ｂ）百日咳菌外毒素反応原性
と関連する酵素活性を含まないことを特徴とする前記ポ
リペプチド類似体を提供する。
さらに、本発明は、上記ポリペプチド類似体をコード
する組換えDNA分子および該類似体を含有する百日咳ワ
クチンを提供する。
する組換えDNA分子および該類似体を含有する百日咳ワ
クチンを提供する。
遺伝子工学的処理を施したBordetella外毒素のS1サブ
ユニット及びこのサブユニットの類似体は、pertussis
性疾患防止に使用するための組換えDNA由来サブユニッ
トワクチン物質を提供する。S1サブユニット及びその類
似体は、単独又はサブユニットS2,S3,S4及びS5、並びに
その混合物と併用して、ワクチン産物を提供し得る。サ
ブユニットS2,S3,S4及びS5はB.pertussisから精製可能
であるか、もしくは融合又は非融合産物として組換えに
より得られる。Bordetella外毒素のサブユニットS2,S3,
S4及びS5の高レベル組換え発現はまた、直接非融合法に
よりE.coliで達成されている。酵母菌、例えばＳ．cerv
isiae及び細菌類、例えばSalmonella typhimurium又は
S.typhi，Bacillus,sp．並びにウイルス、例えばワクシ
ニアウイルスなどを含むそれに代わる組換え宿主をこれ
らのサブユニット類似体の発現用に用いてもよい。
ユニット及びこのサブユニットの類似体は、pertussis
性疾患防止に使用するための組換えDNA由来サブユニッ
トワクチン物質を提供する。S1サブユニット及びその類
似体は、単独又はサブユニットS2,S3,S4及びS5、並びに
その混合物と併用して、ワクチン産物を提供し得る。サ
ブユニットS2,S3,S4及びS5はB.pertussisから精製可能
であるか、もしくは融合又は非融合産物として組換えに
より得られる。Bordetella外毒素のサブユニットS2,S3,
S4及びS5の高レベル組換え発現はまた、直接非融合法に
よりE.coliで達成されている。酵母菌、例えばＳ．cerv
isiae及び細菌類、例えばSalmonella typhimurium又は
S.typhi，Bacillus,sp．並びにウイルス、例えばワクシ
ニアウイルスなどを含むそれに代わる組換え宿主をこれ
らのサブユニット類似体の発現用に用いてもよい。
詳細な説明 本発明は、ワクチン生産に必要なすべてのPTXサブユ
ニットの高レベル、直接組換え発現を提供する。さら
に、S1サブユニット類似体は高度に免疫原性を示し且つ
実質的に反応原性成分を含まない生物学的活性を提供す
るが、このような成分は、その毒性及び反応原性に関連
した毒素分子の酵素活性であり、B.pertussis細胞から
抽出されるワクチン物質とともに見出されると考えられ
且つ反応原性を示すことが公知のB.pertussisの外来成
分（例えば内毒素）である。単独で、又はPTXの他のサ
ブユニットと組合わせて用いるS1類似体は、未改変の天
然型サブユニット又は組換え由来サブユニット中に存在
する反応原性成分により発症する恐れのある副作用に有
効で且つ大いにそれを低減するワクチン産物を提供す
る。
ニットの高レベル、直接組換え発現を提供する。さら
に、S1サブユニット類似体は高度に免疫原性を示し且つ
実質的に反応原性成分を含まない生物学的活性を提供す
るが、このような成分は、その毒性及び反応原性に関連
した毒素分子の酵素活性であり、B.pertussis細胞から
抽出されるワクチン物質とともに見出されると考えられ
且つ反応原性を示すことが公知のB.pertussisの外来成
分（例えば内毒素）である。単独で、又はPTXの他のサ
ブユニットと組合わせて用いるS1類似体は、未改変の天
然型サブユニット又は組換え由来サブユニット中に存在
する反応原性成分により発症する恐れのある副作用に有
効で且つ大いにそれを低減するワクチン産物を提供す
る。
Bordetella pertussis毒素の個々のサブユニットS1,S
2,S3,S4及びS5は、各々サブクローン化され、E.coliに
おいて独自に直接発現された。組換えS1（rS1）の発現
に際してはシグナル配列が重要な役割りを演じるものと
思われる。シグナルペプチド不在下では、無意量のrS1
がE.coli中に発現された。S1サブユニットの天然型リー
ターか又は合成リーダーがプレ蛋白質上に存在する場
合、総細胞蛋白質の10〜30％の範囲の高レベルの発現が
得られる。供給バッチ10リットル発酵器中（8mg S1/OD
−Ｌの非最適発現レベルで）での生産規模でのrS1発現
体細胞の醗酵により、図に示されているように、その成
熟種へのrS1のほぼ完全な蛋白質分解処理が行われた。
実験室規模での発現体細胞の発酵からは、不完全にプロ
セシングされたS1が生じた。プレ蛋白質と成熟蛋白質は
ともに対数的細胞成長後に見出された。合成されたE.co
li切断可能リーダー配列がシグナルプロセシングを強化
できなかったことは、不完全切断が、B.pertussis蛋白
質分解的切断部位をE.coliリーダーペプチダーゼが非相
容的に認識した結果ではないことを示唆した。高レベル
E.coliリーダーペプチダーゼを発現するプラスミドによ
り同時形質転換される細胞を用いてシグナルペプチダー
ゼ合成を増大するか、又は低コピー数ベクターを用いて
S1発現レベルを低下させることによりプロセシングブロ
ックを克服できなかったことは、問題が切断経路の飽和
にあるのではないことを示した。これらの結果から、
Ｅ．coliにおける外来蛋白質の翻訳後プロセシングが成
長中の細胞の生理学的状態に関連したほとんど不明の機
序により制御される可能性があることが立証される。
2,S3,S4及びS5は、各々サブクローン化され、E.coliに
おいて独自に直接発現された。組換えS1（rS1）の発現
に際してはシグナル配列が重要な役割りを演じるものと
思われる。シグナルペプチド不在下では、無意量のrS1
がE.coli中に発現された。S1サブユニットの天然型リー
ターか又は合成リーダーがプレ蛋白質上に存在する場
合、総細胞蛋白質の10〜30％の範囲の高レベルの発現が
得られる。供給バッチ10リットル発酵器中（8mg S1/OD
−Ｌの非最適発現レベルで）での生産規模でのrS1発現
体細胞の醗酵により、図に示されているように、その成
熟種へのrS1のほぼ完全な蛋白質分解処理が行われた。
実験室規模での発現体細胞の発酵からは、不完全にプロ
セシングされたS1が生じた。プレ蛋白質と成熟蛋白質は
ともに対数的細胞成長後に見出された。合成されたE.co
li切断可能リーダー配列がシグナルプロセシングを強化
できなかったことは、不完全切断が、B.pertussis蛋白
質分解的切断部位をE.coliリーダーペプチダーゼが非相
容的に認識した結果ではないことを示唆した。高レベル
E.coliリーダーペプチダーゼを発現するプラスミドによ
り同時形質転換される細胞を用いてシグナルペプチダー
ゼ合成を増大するか、又は低コピー数ベクターを用いて
S1発現レベルを低下させることによりプロセシングブロ
ックを克服できなかったことは、問題が切断経路の飽和
にあるのではないことを示した。これらの結果から、
Ｅ．coliにおける外来蛋白質の翻訳後プロセシングが成
長中の細胞の生理学的状態に関連したほとんど不明の機
序により制御される可能性があることが立証される。
PTXサブユニットS2,S3,S4及びS5は、図２に示されて
いる通り、E.coliにおいて同様に発現された。組換えS1
と同様に、rS1,rS2,rS3及びrS5サブユニットは実験質規
模発酵では不完全プロセシングを示すと考えられた。rS
1は生産規模で完全にプロセシングされ得たので、同様
の発酵条件を用いて他のサブユニットを完全なプロセシ
ング形態で産生し得る。rS1と対比して、rS4サブユニッ
トは成熟メチオニルポリペプチドとして高レベルで発現
可能であるが、しかしその天然型リーダーペプチド配列
により発現される場合は検出可能でなかった。サブユニ
ットS2,S3,S4及びS5は、目下、メチオニル成熟ポリペプ
チドとして全て発現されている。これらの分子のアミノ
酸分析により、異種性（非天然性）メチオニル残基を細
胞性メチオニンアミノペプチダーゼにより各種（S4以
外）から除去して完全成熟蛋白質の天然型配列を提供す
ることが立証される。細胞性酵素に関するアミノ末端認
識配列の不適合性ゆえに、メチオニル残基は実質的には
組換えS4から除去されない。組換え蛋白質はすべて、溶
解細胞から封入体として回収された。サブユニットは真
正の天然型サブユニットと本質的に等しいSDS−PAGEの
移動パターンを有するか、あるいはWesternブロットに
おいてモノクローン性及びポリクローン性抗毒素血清と
反応することが判明した。図２に示されているようにE.
coliにおけるサブユニットS1,S2,S3,S4及びS5の高レベ
ル組換え発現は、直接、非融合手段により達成される。
いる通り、E.coliにおいて同様に発現された。組換えS1
と同様に、rS1,rS2,rS3及びrS5サブユニットは実験質規
模発酵では不完全プロセシングを示すと考えられた。rS
1は生産規模で完全にプロセシングされ得たので、同様
の発酵条件を用いて他のサブユニットを完全なプロセシ
ング形態で産生し得る。rS1と対比して、rS4サブユニッ
トは成熟メチオニルポリペプチドとして高レベルで発現
可能であるが、しかしその天然型リーダーペプチド配列
により発現される場合は検出可能でなかった。サブユニ
ットS2,S3,S4及びS5は、目下、メチオニル成熟ポリペプ
チドとして全て発現されている。これらの分子のアミノ
酸分析により、異種性（非天然性）メチオニル残基を細
胞性メチオニンアミノペプチダーゼにより各種（S4以
外）から除去して完全成熟蛋白質の天然型配列を提供す
ることが立証される。細胞性酵素に関するアミノ末端認
識配列の不適合性ゆえに、メチオニル残基は実質的には
組換えS4から除去されない。組換え蛋白質はすべて、溶
解細胞から封入体として回収された。サブユニットは真
正の天然型サブユニットと本質的に等しいSDS−PAGEの
移動パターンを有するか、あるいはWesternブロットに
おいてモノクローン性及びポリクローン性抗毒素血清と
反応することが判明した。図２に示されているようにE.
coliにおけるサブユニットS1,S2,S3,S4及びS5の高レベ
ル組換え発現は、直接、非融合手段により達成される。
本発明の実施に際しては代替的方法及び材料を用いる
ことができるけれども、好ましい方法及び材料を以下に
記載する。以下に引用の全参考文献は参考文献として本
明細書に組み込まれている。
ことができるけれども、好ましい方法及び材料を以下に
記載する。以下に引用の全参考文献は参考文献として本
明細書に組み込まれている。
サブユニットS1,S2,S3,S4及びS5の組み換え発現に関す
る材料と方法 材料：ニューイングランド・バイオラブス（Beverly,M
A）、ベセスダ・リサーチ・ラボラトリ（Gaithersburg,
MD）、ベーリンガマンハイム・バイオケミカルス（Indi
anapolis,IN）及びインターナショナル・バイオテクノ
ロジー,Inc（New Haven,CT）の各社からDNA改変酵素を
購入し、メーカーの指示に従って酵素を使用した。化学
薬品及び生化学薬品はすべて分析用試薬品等であった。
精製pertussis毒素PTXはリスト・バイオケミカル・ラボ
ラトリ,Inc.（Campbell,CA）から購入した。Caruthers
（1982,H.G.Gussen及びA.Lang編集。『遺伝子断片の化
学的及び酵素的合成』Vejlag Chemie,Weinheim,***,71
−79頁）に従って合成オリゴヌクレオチドを合成した。
全PTXに対するウサギ抗血清は、アンチボディーズ,Inc.
（DavisCA）及びNIAIDロッキーマウンテンラボラトリで
生産され、天然PTXからのサブユニットに対するモノク
ローン性抗体は標準的方法により産生された（Kohlerと
Milstein,1975,Nature 256:495−497;Nowinski等,1979,
Virology 93:111−126）。放射性ヨウ素処理蛋白質Ａと
ウサギ抗マウスIgGはニュー・イングランド・ニューク
レア（Wilmington,DEL）から購入した。抗S1モノクロー
ン抗体IB7（Sato等の記載の通り。1987,Infect.Immun,5
5:909−915）は日本のH.Sato氏（NIH,to Keyo）から寄
贈されたものであった。
る材料と方法 材料：ニューイングランド・バイオラブス（Beverly,M
A）、ベセスダ・リサーチ・ラボラトリ（Gaithersburg,
MD）、ベーリンガマンハイム・バイオケミカルス（Indi
anapolis,IN）及びインターナショナル・バイオテクノ
ロジー,Inc（New Haven,CT）の各社からDNA改変酵素を
購入し、メーカーの指示に従って酵素を使用した。化学
薬品及び生化学薬品はすべて分析用試薬品等であった。
精製pertussis毒素PTXはリスト・バイオケミカル・ラボ
ラトリ,Inc.（Campbell,CA）から購入した。Caruthers
（1982,H.G.Gussen及びA.Lang編集。『遺伝子断片の化
学的及び酵素的合成』Vejlag Chemie,Weinheim,***,71
−79頁）に従って合成オリゴヌクレオチドを合成した。
全PTXに対するウサギ抗血清は、アンチボディーズ,Inc.
（DavisCA）及びNIAIDロッキーマウンテンラボラトリで
生産され、天然PTXからのサブユニットに対するモノク
ローン性抗体は標準的方法により産生された（Kohlerと
Milstein,1975,Nature 256:495−497;Nowinski等,1979,
Virology 93:111−126）。放射性ヨウ素処理蛋白質Ａと
ウサギ抗マウスIgGはニュー・イングランド・ニューク
レア（Wilmington,DEL）から購入した。抗S1モノクロー
ン抗体IB7（Sato等の記載の通り。1987,Infect.Immun,5
5:909−915）は日本のH.Sato氏（NIH,to Keyo）から寄
贈されたものであった。
プラスミド及び細菌菌株:PTXオペロンを含有するプラス
ミドpPTX42が報告されている（LochtとKeith,上記;Loch
t等、上記を参照）。発現プラスミドpCFM1036,pCFM114
6,pCFM1152及びpCFM1156はAmgenで得られた。Amgenの発
現ベクター系の詳細な説明は発行済みの欧州特許第136,
490号明細書に報告されており、本明細書でも参考文献
に入れられている。このようなプラスミドは誘導可能プ
ロモータ、合成リボソーム結合部位、クローニング群、
プラスミド複製起源、転写ターミネータ、プラスミドコ
ピー数調節遺伝子、及びカナマイシン耐性遺伝子を含有
してもよい。得られたプラスミドは、多くの点で互いに
異なる。プラスミドpCFM1036は、以下のオリゴヌクレオ
チドにより合成PLプロモータを含有する単一のAat II及
びEcoR I制限部位間のDNA配列を置換することによりpCF
M836（欧州特許第136,490号）により得られる： 該プラスミドは、制限クラスターに先行する誘導可能プ
ロモータを含有しない。プラスミドpCFM1146は単一のCl
a I及びXba I制御部位間の小DNA配列を以下のオリゴヌ
クレチオドで置換することにより： またT4ポリメラーゼ酵素で末端を充填し、その後平滑末
端を連結して２つの内生Nde I制限部位を破壊すること
により、pCFM836から得られる。該プラスミドは制限ク
ラスターの直前に合成リボゾーム結合部位を含有しな
い。プラスミドpCFM1156は単一のXba I及びKpn I制限部
位間の小DNA配列を以下のオリゴヌクレオチドで置換す
ることによりpCFM1146から得られる： プラスミドpCFM1152は、copBプロモータを含有し、co
pB遺伝子の一部をコードするBgl II〜Bgl II（248塩基
対）DNAをプラスミドpCFM512（欧州特許第136,490号）
からのそれに対応するDNAで置換することによりpCFM115
6から得られる。このプラスミドは、pCFM1156より少な
いコピー数を有する。
ミドpPTX42が報告されている（LochtとKeith,上記;Loch
t等、上記を参照）。発現プラスミドpCFM1036,pCFM114
6,pCFM1152及びpCFM1156はAmgenで得られた。Amgenの発
現ベクター系の詳細な説明は発行済みの欧州特許第136,
490号明細書に報告されており、本明細書でも参考文献
に入れられている。このようなプラスミドは誘導可能プ
ロモータ、合成リボソーム結合部位、クローニング群、
プラスミド複製起源、転写ターミネータ、プラスミドコ
ピー数調節遺伝子、及びカナマイシン耐性遺伝子を含有
してもよい。得られたプラスミドは、多くの点で互いに
異なる。プラスミドpCFM1036は、以下のオリゴヌクレオ
チドにより合成PLプロモータを含有する単一のAat II及
びEcoR I制限部位間のDNA配列を置換することによりpCF
M836（欧州特許第136,490号）により得られる： 該プラスミドは、制限クラスターに先行する誘導可能プ
ロモータを含有しない。プラスミドpCFM1146は単一のCl
a I及びXba I制御部位間の小DNA配列を以下のオリゴヌ
クレチオドで置換することにより： またT4ポリメラーゼ酵素で末端を充填し、その後平滑末
端を連結して２つの内生Nde I制限部位を破壊すること
により、pCFM836から得られる。該プラスミドは制限ク
ラスターの直前に合成リボゾーム結合部位を含有しな
い。プラスミドpCFM1156は単一のXba I及びKpn I制限部
位間の小DNA配列を以下のオリゴヌクレオチドで置換す
ることによりpCFM1146から得られる： プラスミドpCFM1152は、copBプロモータを含有し、co
pB遺伝子の一部をコードするBgl II〜Bgl II（248塩基
対）DNAをプラスミドpCFM512（欧州特許第136,490号）
からのそれに対応するDNAで置換することによりpCFM115
6から得られる。このプラスミドは、pCFM1156より少な
いコピー数を有する。
プラスミドpBR332,pUC18,pUC19並びにファージM13mp1
8及びM13mp19DNAは、ベセスダ・リサーチ・ラボラトリ
ーズから購入した。E.coliリーダーペプチダーゼに関す
る遺伝子を含有するプラスミドpTD125（Dale,T.1983,J.
Bacteriol.143:76−83）はW.Wickner（UCLA）から寄贈
された。E.coliFM5細胞は、Amgen Inc.（Thousand Oak
s,CA）で、C.F.MorrisからのE.coliＫ−12株（Bachmann
等,1986,Bacteriol.Rev.40:116−167）から得られたも
ので、完全ラムダファージレプレッサ遺伝子、CI857（S
ussman等,1962,C.R.Acad,Sci.245:1517〜1579）を含有
する。個々のサブユニット発現プラスミドの構造は本明
細書に記されている。標準的方法により（Maniatis等,1
982,Molecular cloning:実験室マニュアル。Cold Spri
ngs Harbor Laboratory,NY）、ベクター産生、細胞形質
転換及びコロニー選択を実施した。
8及びM13mp19DNAは、ベセスダ・リサーチ・ラボラトリ
ーズから購入した。E.coliリーダーペプチダーゼに関す
る遺伝子を含有するプラスミドpTD125（Dale,T.1983,J.
Bacteriol.143:76−83）はW.Wickner（UCLA）から寄贈
された。E.coliFM5細胞は、Amgen Inc.（Thousand Oak
s,CA）で、C.F.MorrisからのE.coliＫ−12株（Bachmann
等,1986,Bacteriol.Rev.40:116−167）から得られたも
ので、完全ラムダファージレプレッサ遺伝子、CI857（S
ussman等,1962,C.R.Acad,Sci.245:1517〜1579）を含有
する。個々のサブユニット発現プラスミドの構造は本明
細書に記されている。標準的方法により（Maniatis等,1
982,Molecular cloning:実験室マニュアル。Cold Spri
ngs Harbor Laboratory,NY）、ベクター産生、細胞形質
転換及びコロニー選択を実施した。
分析方法：プライマー伸長、鎖終止法によりDNA配列分
析を行なった（Sanger等,1977,Proc.Acad.Sci.USA74:54
63−5467;Heidecker等,1980,Gene 10:69−73）。ABI 47
0A気相マイクロシーケンサー中で自動Edman分解により
蛋白質配列分析を実施した（Hewick等,1981,J,Biol.Che
m.256:7990−7997;Hunkapillar等,1983,Meth.Enzymol.9
1:399−413）。Laemmliの報告（1970,Nature 227:680−
685）の通りにSDS−ポリアクリルアミドゲル電気泳動
（SDS−PAGE）を実施し、ポリアクリルアミドゲルから
のポリペプチド溶出はHunkapiller等の方法により実施
し（1983,Meth.Enzymol.91:227−236）、Burnette（198
1,Analyt.Biochem.112:195−203）による報告の通りにW
esternブロッティングを実施した。組換え蛋白質対総細
胞蛋白質又は総封入体蛋白質の比を、全細胞分解産物又
は封入体調製物のSDS−PAGEを実施し、その後Coomassie
BrilliantBlue R250で染色し、次いでデンシトメータ
によりゲルスキャニングによって査定した。過去の報告
と同様に（Katada等,1982,Proc.Natl.Acad,Sci.USA79:3
129−3133;Lim等,1985,J.Bjol.Chem.260:2585−258
8）、NAD−グリコヒドロラーゼ及びADP−リボシルトラ
ンスフェラーゼに関するアッセイを行なった。種々の組
換えサブユニット調製物に対する抗血清を用いてのPTX
に対するCHO細胞の形態学的反応の低減（Hewlett等,198
3,Infect.Immun.40:1198−1203）を、Gillenius等の手
法（1985,J.Biol.Stand.13:61〜66）により実施した。
析を行なった（Sanger等,1977,Proc.Acad.Sci.USA74:54
63−5467;Heidecker等,1980,Gene 10:69−73）。ABI 47
0A気相マイクロシーケンサー中で自動Edman分解により
蛋白質配列分析を実施した（Hewick等,1981,J,Biol.Che
m.256:7990−7997;Hunkapillar等,1983,Meth.Enzymol.9
1:399−413）。Laemmliの報告（1970,Nature 227:680−
685）の通りにSDS−ポリアクリルアミドゲル電気泳動
（SDS−PAGE）を実施し、ポリアクリルアミドゲルから
のポリペプチド溶出はHunkapiller等の方法により実施
し（1983,Meth.Enzymol.91:227−236）、Burnette（198
1,Analyt.Biochem.112:195−203）による報告の通りにW
esternブロッティングを実施した。組換え蛋白質対総細
胞蛋白質又は総封入体蛋白質の比を、全細胞分解産物又
は封入体調製物のSDS−PAGEを実施し、その後Coomassie
BrilliantBlue R250で染色し、次いでデンシトメータ
によりゲルスキャニングによって査定した。過去の報告
と同様に（Katada等,1982,Proc.Natl.Acad,Sci.USA79:3
129−3133;Lim等,1985,J.Bjol.Chem.260:2585−258
8）、NAD−グリコヒドロラーゼ及びADP−リボシルトラ
ンスフェラーゼに関するアッセイを行なった。種々の組
換えサブユニット調製物に対する抗血清を用いてのPTX
に対するCHO細胞の形態学的反応の低減（Hewlett等,198
3,Infect.Immun.40:1198−1203）を、Gillenius等の手
法（1985,J.Biol.Stand.13:61〜66）により実施した。
発現プラスミドの作製：従来の報告とは異なり、全プラ
スミドは一連のE.coli汎化発現ベクターから作製され
た。従来の技術の図１に示される制限部位を用いて個々
のpertussis毒素サブユニット遺伝子セグメントを単離
した。上流制限部位はサブユニットのシグナルペプチド
含有型の発現に関する開始コドンのすぐ内側か又はサブ
ユニット類似体のメチオニル成熟形の発現に関するサブ
ユニットの成熟、プロセシング形のアミノ末端残基に関
するコドンのすぐ内側であった。ある場合には、完全Ｂ
オリゴマーの共発現はS2の上流非コード領域からS3末端
までを含有する断片を利用し、またE.coli発現ベクター
の合成リボソーム結合部位を省き、他の場合には、S2の
上流非コード領域を欠失し、合成E.coliリボゾーム結合
部位が挿入された。合成オリゴヌクレオチドを使用し
て、遺伝子セグメントを、合成プロモータ及びリボゾー
ム結合部位の下流の至適距離の位置で発現プラスミドに
挿入した。上流リンカーにより、プレサブユニット作製
の場合は真正開始コドンの後に、あるいは成熟アミノ末
端の最初のコドン後方に各遺伝子の読み枠を修復した。
後者のオリゴヌクレオチドはメチオニル開始コドンを包
含した。いくつかの場合には、コドン使用は、その結果
生じるmRNAの５′末端近くの二次構造に関するポテンシ
ャルを低減するべく改変された。例えば、S1サブユニッ
トのシグナル領域の３位のシステインコドン（LochtとK
eith,上記）はセリンコドンで置換され、好ましくない
ジスルフィド相互作用の可能性を排除した。
スミドは一連のE.coli汎化発現ベクターから作製され
た。従来の技術の図１に示される制限部位を用いて個々
のpertussis毒素サブユニット遺伝子セグメントを単離
した。上流制限部位はサブユニットのシグナルペプチド
含有型の発現に関する開始コドンのすぐ内側か又はサブ
ユニット類似体のメチオニル成熟形の発現に関するサブ
ユニットの成熟、プロセシング形のアミノ末端残基に関
するコドンのすぐ内側であった。ある場合には、完全Ｂ
オリゴマーの共発現はS2の上流非コード領域からS3末端
までを含有する断片を利用し、またE.coli発現ベクター
の合成リボソーム結合部位を省き、他の場合には、S2の
上流非コード領域を欠失し、合成E.coliリボゾーム結合
部位が挿入された。合成オリゴヌクレオチドを使用し
て、遺伝子セグメントを、合成プロモータ及びリボゾー
ム結合部位の下流の至適距離の位置で発現プラスミドに
挿入した。上流リンカーにより、プレサブユニット作製
の場合は真正開始コドンの後に、あるいは成熟アミノ末
端の最初のコドン後方に各遺伝子の読み枠を修復した。
後者のオリゴヌクレオチドはメチオニル開始コドンを包
含した。いくつかの場合には、コドン使用は、その結果
生じるmRNAの５′末端近くの二次構造に関するポテンシ
ャルを低減するべく改変された。例えば、S1サブユニッ
トのシグナル領域の３位のシステインコドン（LochtとK
eith,上記）はセリンコドンで置換され、好ましくない
ジスルフィド相互作用の可能性を排除した。
種々のプラスミド構築物でE.coliFM5細胞を形質転換
後、カナマイシン含有寒天上に置き、適当数のコロニー
を選別し、レプリカ平板培養し、小液体培養として増殖
し（『ミニプレップ』）、42℃で４時間誘導させた。次
いでミニプレップを細菌細胞内の封入体の存在に関して
光学顕微鏡でスクリーニングした。明らかな封入体を示
す標本を固定して、レプリカ平板培養からの適合コロニ
ーに誘導温度でフラスコ規模の（１リットル）実験室発
酵を実施した。いくつかの標本は後に10リットルの工業
用発酵器中での供給バッチ発酵に供した。誘導後種々の
時間に発酵中の標本を抜き取り、SDS−PAGEにより、そ
の後クマシーブリリアントブルー染色とWesternブロッ
ティングとによって適当なPTXサブユニットの出現に関
して調べた；ブロットは先ず適当なモノクローン抗体と
反応させてオートラジオグラフィで検査し、次いでポリ
クローン抗PTX血清と反応させた後、さらにオートラジ
オグラフィで調べた。各発現クローンからのプラスミド
の構造は、単離プラスミドの制限マッピングにより確証
され、接合領域のDNA配列により立証された。
後、カナマイシン含有寒天上に置き、適当数のコロニー
を選別し、レプリカ平板培養し、小液体培養として増殖
し（『ミニプレップ』）、42℃で４時間誘導させた。次
いでミニプレップを細菌細胞内の封入体の存在に関して
光学顕微鏡でスクリーニングした。明らかな封入体を示
す標本を固定して、レプリカ平板培養からの適合コロニ
ーに誘導温度でフラスコ規模の（１リットル）実験室発
酵を実施した。いくつかの標本は後に10リットルの工業
用発酵器中での供給バッチ発酵に供した。誘導後種々の
時間に発酵中の標本を抜き取り、SDS−PAGEにより、そ
の後クマシーブリリアントブルー染色とWesternブロッ
ティングとによって適当なPTXサブユニットの出現に関
して調べた；ブロットは先ず適当なモノクローン抗体と
反応させてオートラジオグラフィで検査し、次いでポリ
クローン抗PTX血清と反応させた後、さらにオートラジ
オグラフィで調べた。各発現クローンからのプラスミド
の構造は、単離プラスミドの制限マッピングにより確証
され、接合領域のDNA配列により立証された。
組換えS1の発現:S1発現プラスミド（pPTX S1/1）を含有
するE.coli細胞を工業規模で供給バッチ10リットル発酵
器中で42℃で誘導した場合、それらは、SDS−PAGEにお
いて真正PTX S1と同時移動する約26,000ダルトンの主要
細胞内蛋白質（図2A左，レーンrS1）を産生した部分ア
ミノ酸配列分析（５サイクル）により、このポリペプチ
ドが成熟S1サブユニットを予測させるアミノ末端配列を
有することが確認された（LochtとKeith,上記）。その
蛋白質はWesternブロットにおけるマウス抗S1モノクロ
ーン抗体との反応性により免疫化学的にS1と同定された
（図2A右，レーンrS1）。
するE.coli細胞を工業規模で供給バッチ10リットル発酵
器中で42℃で誘導した場合、それらは、SDS−PAGEにお
いて真正PTX S1と同時移動する約26,000ダルトンの主要
細胞内蛋白質（図2A左，レーンrS1）を産生した部分ア
ミノ酸配列分析（５サイクル）により、このポリペプチ
ドが成熟S1サブユニットを予測させるアミノ末端配列を
有することが確認された（LochtとKeith,上記）。その
蛋白質はWesternブロットにおけるマウス抗S1モノクロ
ーン抗体との反応性により免疫化学的にS1と同定された
（図2A右，レーンrS1）。
１リットルフラスコ規模でのS1発現体細胞の実験室発
酵により、rS1シグナルペプチドの不完全切断が生じ、
E.coliにおける他のPTXサブユニットの発現に関する現
象も観察された（以下参照）ことに注目すべきである。
プレ蛋白質開裂範囲を増大するために企画された一連の
実験によりフラスコ規模で観察されるシグナルプロセシ
ングに対する分子ブロックを確認する試みがなされた：
すなわち、低コピー数発現ベクターへのS1遺伝子の挿
入、真正S1シグナルペプチドに代わる合成E.coli開裂シ
グナル配列の置換（Picker等,1983,Infect.Immun.42:26
9−275）、サブユニット発現細胞とE.coliリーダーペプ
チド含有発現プラスミドとを同時形質転換して（Date,
上記）この酵素の構築レベルを増大するなどの試みがな
された。これらのアプローチでシグナル開裂の何らかの
有意の変化を引き起こしたものはない。しかしながら、
供給バッチ処理に対する発酵条件を改良した結果、実質
的に完全な成熟型へのプレS1のプロセシングが生じた。
酵により、rS1シグナルペプチドの不完全切断が生じ、
E.coliにおける他のPTXサブユニットの発現に関する現
象も観察された（以下参照）ことに注目すべきである。
プレ蛋白質開裂範囲を増大するために企画された一連の
実験によりフラスコ規模で観察されるシグナルプロセシ
ングに対する分子ブロックを確認する試みがなされた：
すなわち、低コピー数発現ベクターへのS1遺伝子の挿
入、真正S1シグナルペプチドに代わる合成E.coli開裂シ
グナル配列の置換（Picker等,1983,Infect.Immun.42:26
9−275）、サブユニット発現細胞とE.coliリーダーペプ
チド含有発現プラスミドとを同時形質転換して（Date,
上記）この酵素の構築レベルを増大するなどの試みがな
された。これらのアプローチでシグナル開裂の何らかの
有意の変化を引き起こしたものはない。しかしながら、
供給バッチ処理に対する発酵条件を改良した結果、実質
的に完全な成熟型へのプレS1のプロセシングが生じた。
成熟メチオニルポリペプチドとしてS4サブユニット発
現が成功したことにより（以下）、rS1に関しても同様
の手法の使用が促進された。しかしながら、E.coliにお
けるrS4発現と異なり、成熟メチオニルS1の発現量は非
常に低く、それを検出するためにWesternブロットを必
要とした。これに対して、その真正シグナル配列を用い
たrS1の発現は、総細胞蛋白質の10〜30％のレベルで完
全にプロセシングされたポリペプチドを産生した。後述
の通り、組換えによるrS1の成熟アミノ末端の切断によ
り、非常に高いレベルの発現を生じた。事実、成熟S1配
列の最初の２個というわずかな残基（AspAsp）をMet V
alで置換した結果、メチオニル成熟型に対して有意の発
現を生じた。
現が成功したことにより（以下）、rS1に関しても同様
の手法の使用が促進された。しかしながら、E.coliにお
けるrS4発現と異なり、成熟メチオニルS1の発現量は非
常に低く、それを検出するためにWesternブロットを必
要とした。これに対して、その真正シグナル配列を用い
たrS1の発現は、総細胞蛋白質の10〜30％のレベルで完
全にプロセシングされたポリペプチドを産生した。後述
の通り、組換えによるrS1の成熟アミノ末端の切断によ
り、非常に高いレベルの発現を生じた。事実、成熟S1配
列の最初の２個というわずかな残基（AspAsp）をMet V
alで置換した結果、メチオニル成熟型に対して有意の発
現を生じた。
S2,S3,S4及びS5の発現：実行可能性の一検査として、PT
XS4サブユニットがその天然型リーダーペプチドを伴わ
ない成熟メチオニル蛋白質として先ず発現され、上記の
通りE.coli中で高レベルで産生された（図2B左,rmS4レ
ーン）。SDS−PAGEにおけるその移動は全毒素標本から
のS4の場合に関してわずかに減速されたけれども、予測
されたアミノ酸配列を示した。HPLCによりB.pertussis
から精製されるS4は、ゲル電気泳動で同様の減速を示し
た（Locht等，上記）。組換えS4は、Westernブロットに
おいてポリクローン抗血清とよく反応するが（図2B右，
レーンS4）、しかしS4モノクローン抗体との反応性を減
少した。
XS4サブユニットがその天然型リーダーペプチドを伴わ
ない成熟メチオニル蛋白質として先ず発現され、上記の
通りE.coli中で高レベルで産生された（図2B左,rmS4レ
ーン）。SDS−PAGEにおけるその移動は全毒素標本から
のS4の場合に関してわずかに減速されたけれども、予測
されたアミノ酸配列を示した。HPLCによりB.pertussis
から精製されるS4は、ゲル電気泳動で同様の減速を示し
た（Locht等，上記）。組換えS4は、Westernブロットに
おいてポリクローン抗血清とよく反応するが（図2B右，
レーンS4）、しかしS4モノクローン抗体との反応性を減
少した。
S1に関して得られた結果と対比的に、その天然型リー
ダーペプチド配列を有するS4の発現（LochtとKeith,上
記）により検出不可能レベルの蛋白質が生じた（データ
を示さず）。しかしながら、Nicosia等（上記）が異な
る翻訳開始部位をさらに上流に予測したことに注目すべ
きである;S4リーダーペプチドにこの付加配列を使用す
るとさらに高レベルの発現が生じる可能性がある。組換
えS2,S3及びS5は各々それらの天然型リーダー配列によ
り発現される（図2A,それぞれレーンrS2,rS3及びrS
5）；これらのサブユニットのうち実験室規模発酵中に
完全にプロセシングされたものはないが、しかしながら
供給バッチ処理を用いた予備的工業規模発酵によりS2及
びS5のプロセシングに顕著な改良が示されている。S2,S
3及びS5はまた、メチオニル成熟形態で、それらの天然
型リーダーペプチドによって得られるものに匹敵するレ
ベルで、各々E.coli中で発現される（図2B,それぞれレ
ーンrmS2,rmS3及びrmS5）。上記の通り、細胞性メチオ
ニンアミノペプチダーゼによりS2,S3及びS5の異種メチ
オニン残基をプロセスして完全成熟ポリペプチドの天然
型配列を産生する。
ダーペプチド配列を有するS4の発現（LochtとKeith,上
記）により検出不可能レベルの蛋白質が生じた（データ
を示さず）。しかしながら、Nicosia等（上記）が異な
る翻訳開始部位をさらに上流に予測したことに注目すべ
きである;S4リーダーペプチドにこの付加配列を使用す
るとさらに高レベルの発現が生じる可能性がある。組換
えS2,S3及びS5は各々それらの天然型リーダー配列によ
り発現される（図2A,それぞれレーンrS2,rS3及びrS
5）；これらのサブユニットのうち実験室規模発酵中に
完全にプロセシングされたものはないが、しかしながら
供給バッチ処理を用いた予備的工業規模発酵によりS2及
びS5のプロセシングに顕著な改良が示されている。S2,S
3及びS5はまた、メチオニル成熟形態で、それらの天然
型リーダーペプチドによって得られるものに匹敵するレ
ベルで、各々E.coli中で発現される（図2B,それぞれレ
ーンrmS2,rmS3及びrmS5）。上記の通り、細胞性メチオ
ニンアミノペプチダーゼによりS2,S3及びS5の異種メチ
オニン残基をプロセスして完全成熟ポリペプチドの天然
型配列を産生する。
Ｂオリゴマーサブユニット（S2−S4−S5−S3）を表わ
す完全ポリシストロンセグメントはPLプロモータ制御下
で発現された。図３はS2サブユニットの産生に及ぼす上
流非コード領域の作用を説明している。ある場合には、
発現プラスミドはS1の終止コドンとS2の開始コドンとの
間の全シストロン間部分を保持した（LochtとKeith,上
記）が、しかし他のすべての発現プラスミドにおいて用
いた合成リボソーム結合部位を有していなかった。これ
により、抗S2モノクローン抗体を用いてWesternブロッ
トで検出した場合に完全にプロセシングされたと思われ
る組換えS2の合成が生じた（図3,レーンＤ及びＥ）が、
しかし示されていないポリクローン抗体分析からは、他
のＢオリゴマーサブユニットもまた完全にプロセシング
されてその成熟形態となることが示唆された。非コード
化シストロン間セグメントを合成Shine−Delgarno配列
で置換すると、さらに高レベルのrS2合成が起る（図3,
レーンＢ及びＣ）；しかしながら、この物質は不完全に
プロセシングされる。各シストロンの合成効率は、その
メッセージの５′末端との近接度、すなわちS2＞S4＞S5
＞S3に直接相関していると思われる。オペロン保持対が
高度発現S1構成物から下流による予備的実験では（上記
参照）、S1を含めた各サブユニットの非常に低レベルの
合成と不完全なプロセシングが起きた。
す完全ポリシストロンセグメントはPLプロモータ制御下
で発現された。図３はS2サブユニットの産生に及ぼす上
流非コード領域の作用を説明している。ある場合には、
発現プラスミドはS1の終止コドンとS2の開始コドンとの
間の全シストロン間部分を保持した（LochtとKeith,上
記）が、しかし他のすべての発現プラスミドにおいて用
いた合成リボソーム結合部位を有していなかった。これ
により、抗S2モノクローン抗体を用いてWesternブロッ
トで検出した場合に完全にプロセシングされたと思われ
る組換えS2の合成が生じた（図3,レーンＤ及びＥ）が、
しかし示されていないポリクローン抗体分析からは、他
のＢオリゴマーサブユニットもまた完全にプロセシング
されてその成熟形態となることが示唆された。非コード
化シストロン間セグメントを合成Shine−Delgarno配列
で置換すると、さらに高レベルのrS2合成が起る（図3,
レーンＢ及びＣ）；しかしながら、この物質は不完全に
プロセシングされる。各シストロンの合成効率は、その
メッセージの５′末端との近接度、すなわちS2＞S4＞S5
＞S3に直接相関していると思われる。オペロン保持対が
高度発現S1構成物から下流による予備的実験では（上記
参照）、S1を含めた各サブユニットの非常に低レベルの
合成と不完全なプロセシングが起きた。
組換えPTXサブユニットの特性：もし存在するとしても
極く少量のプロセシングされたPTXサブユニットは、E.c
oli細胞から分泌されると考えられるが、しかし完全に
プロセシングされたrS1が細胞周辺腔に限定されて見出
されることがあるという例もいくつか示されている。大
量の各サブユニットは封入体の形で見出され、総細胞蛋
白質の10〜30％を構成していた。Frenchプレス及び低速
遠心分離による細胞溶解により、個々のサブユニットと
してその蛋白質の65％までを含有するペレット分画を生
じた。
極く少量のプロセシングされたPTXサブユニットは、E.c
oli細胞から分泌されると考えられるが、しかし完全に
プロセシングされたrS1が細胞周辺腔に限定されて見出
されることがあるという例もいくつか示されている。大
量の各サブユニットは封入体の形で見出され、総細胞蛋
白質の10〜30％を構成していた。Frenchプレス及び低速
遠心分離による細胞溶解により、個々のサブユニットと
してその蛋白質の65％までを含有するペレット分画を生
じた。
PTXサブユニットはすべて、ポリクローンウサギ抗毒
素血清を用いたWesternブロットにおいて検出可能であ
った（図２）。上記の通り、サブユニットrS1及びrS2は
Westernブロットにおいて特異的モノクローン抗体とよ
く反応した。メチオニルポリペプチドとして作られた組
換えS4は抗S4モノクローン抗体との反応性を減じた。サ
ブユニットS3及びS5に対するモノクローン抗体は利用で
きなかったが、rS3はS2の密接な配列相同性により抗S2
モノクローン抗体を用いたWeternブロット上で検出可能
であった（LochtとKeith,上記）。
素血清を用いたWesternブロットにおいて検出可能であ
った（図２）。上記の通り、サブユニットrS1及びrS2は
Westernブロットにおいて特異的モノクローン抗体とよ
く反応した。メチオニルポリペプチドとして作られた組
換えS4は抗S4モノクローン抗体との反応性を減じた。サ
ブユニットS3及びS5に対するモノクローン抗体は利用で
きなかったが、rS3はS2の密接な配列相同性により抗S2
モノクローン抗体を用いたWeternブロット上で検出可能
であった（LochtとKeith,上記）。
粗製組換えrS1調製物をCHO細胞から単離した膜ととも
に〔32P〕NADの存在下でインキュベートした場合、約4
1,000ダルトンの蛋白質がADP−リボシル化されたが、こ
れは天然型の全PTXによりリボシル化される量と同等で
ある；この分子は、アデニレートシクラーゼ複合体のNi
膜調節蛋白質であると考えられている（Bokoch等,1983,
J.Biol.Chem.258:2072−2075;及びHsia等,1983,J.Biol.
Chem.259:1086−1090）。日常的アッセイのために、リ
ボシラーゼに対する基質としてウシのトランスデューシ
ンを利用することができる（図４）が、この分子はNAD
からのpertussis毒素触媒ADP−リボース運搬体に対する
受容体であることが立証されている（Manning等，上記;
West等，上記）。この結果、該毒素のＡプロモータ（S1
サブユニット）上のADP−リボシルトランスフェラーゼ
活性の位置が確かめられ、組換えB.pertussis蛋白質が
E.coliにおけるその天然の三次構造に近い形態に折り畳
まれることが示唆される。さらに、NAD−グリコヒドロ
ラーゼ活性を示す組換えS1もまた、Ａプロモータを用い
て同定される。rS1の粗製封入体調製物を用いた又は精
製組換えメチオニルS4を用いて腹腔内注射によりマウス
を免疫し、追加抗原刺激した。使用したrS1サブユニッ
ト材料は完全プロセシングポリペプチドと非プロセシン
グプレ蛋白質を約1:2の割合で含有した;2つのrS1種の相
対的免疫原性は分からない。抗毒素抗体の存在に関して
固相RIAで血清標本を試験した（図５）。組換えS1を投
与された動物は、完全Freundアジュバントを免疫化用量
に配合したか否かにかかわらず、有意の抗毒素反応を示
した。アジャバント含有形態の組換えS4もまた、アジャ
バント含有の全毒素及び市販pertussisワクチンと比べ
て大いに免疫原性を有した。
に〔32P〕NADの存在下でインキュベートした場合、約4
1,000ダルトンの蛋白質がADP−リボシル化されたが、こ
れは天然型の全PTXによりリボシル化される量と同等で
ある；この分子は、アデニレートシクラーゼ複合体のNi
膜調節蛋白質であると考えられている（Bokoch等,1983,
J.Biol.Chem.258:2072−2075;及びHsia等,1983,J.Biol.
Chem.259:1086−1090）。日常的アッセイのために、リ
ボシラーゼに対する基質としてウシのトランスデューシ
ンを利用することができる（図４）が、この分子はNAD
からのpertussis毒素触媒ADP−リボース運搬体に対する
受容体であることが立証されている（Manning等，上記;
West等，上記）。この結果、該毒素のＡプロモータ（S1
サブユニット）上のADP−リボシルトランスフェラーゼ
活性の位置が確かめられ、組換えB.pertussis蛋白質が
E.coliにおけるその天然の三次構造に近い形態に折り畳
まれることが示唆される。さらに、NAD−グリコヒドロ
ラーゼ活性を示す組換えS1もまた、Ａプロモータを用い
て同定される。rS1の粗製封入体調製物を用いた又は精
製組換えメチオニルS4を用いて腹腔内注射によりマウス
を免疫し、追加抗原刺激した。使用したrS1サブユニッ
ト材料は完全プロセシングポリペプチドと非プロセシン
グプレ蛋白質を約1:2の割合で含有した;2つのrS1種の相
対的免疫原性は分からない。抗毒素抗体の存在に関して
固相RIAで血清標本を試験した（図５）。組換えS1を投
与された動物は、完全Freundアジュバントを免疫化用量
に配合したか否かにかかわらず、有意の抗毒素反応を示
した。アジャバント含有形態の組換えS4もまた、アジャ
バント含有の全毒素及び市販pertussisワクチンと比べ
て大いに免疫原性を有した。
培養CHO細胞を全pertussis毒素で処理した場合、抗毒
素血清により阻害され得る（Gellenius等，上記）『集
塊』形態を生じた（Hewlett等，上記）。予備実験で
は、上記の通り調製され、且つ相対的に高力価の抗毒素
抗体をもつrS1又はrS4に対するマウス血清は、天然毒素
に対するCHO細胞の反応を慣例的に中和することができ
なかった。
素血清により阻害され得る（Gellenius等，上記）『集
塊』形態を生じた（Hewlett等，上記）。予備実験で
は、上記の通り調製され、且つ相対的に高力価の抗毒素
抗体をもつrS1又はrS4に対するマウス血清は、天然毒素
に対するCHO細胞の反応を慣例的に中和することができ
なかった。
組換えS1によるマウスの免疫防御：粗製組換えS1、精製
組換えS4、及び適当な対照物質（上記参照）で免疫化し
たマウスに、B.pertussisマウス有毒株18323による脳内
チャレンジ（脳注）を施こし、チャレンジ後45日間の死
亡率を採点した（図６）。50μｇの試験物質（市販pert
ussisワクチンの1:35希釈液100μ）を腹腔内注射して
マウスを免疫した；接種後21日目に同量を注射してブー
ストし、成育可能B.pertussis菌株18323の脳内チャレン
ジにより７日後にチャレンジした（３×104細菌／動
物）。組換え調製物には活性なホロ毒素が欠如している
ため防御は予測されなかったけれども、意外にも非免疫
化対照に対してrS1免疫化動物に関する生存時間の増大
が認められた。さらに、アジュバント含有rS1を投与さ
れた多数のマウスはチャレンジに対して完全に防御され
た；アジャバント含有rS4で免疫したマウスは、良好な
抗体反応を示した（図５参照）けれども、非免疫化マウ
スより良好に防御されはしなかった。別の予備実験で
は、アジュバント含有rS1はチャレンジに対する用量−
反応防御を引き出すと思われた。脳内チャレンジアッセ
イにおける不完全防御は、免疫化物質中に活性ホロ毒素
がなかったことによるものと考えられる；にもかかわら
ず、この予備試験で達成された防御は、組換えS1蛋白質
がサブユニットワクチン材料としての能力を有している
ことを立証するものである。その後の研究からは、B.pe
rtussisマウス有毒菌株18323による脳内チャレンジに対
する免疫防御は確証されていない。
組換えS4、及び適当な対照物質（上記参照）で免疫化し
たマウスに、B.pertussisマウス有毒株18323による脳内
チャレンジ（脳注）を施こし、チャレンジ後45日間の死
亡率を採点した（図６）。50μｇの試験物質（市販pert
ussisワクチンの1:35希釈液100μ）を腹腔内注射して
マウスを免疫した；接種後21日目に同量を注射してブー
ストし、成育可能B.pertussis菌株18323の脳内チャレン
ジにより７日後にチャレンジした（３×104細菌／動
物）。組換え調製物には活性なホロ毒素が欠如している
ため防御は予測されなかったけれども、意外にも非免疫
化対照に対してrS1免疫化動物に関する生存時間の増大
が認められた。さらに、アジュバント含有rS1を投与さ
れた多数のマウスはチャレンジに対して完全に防御され
た；アジャバント含有rS4で免疫したマウスは、良好な
抗体反応を示した（図５参照）けれども、非免疫化マウ
スより良好に防御されはしなかった。別の予備実験で
は、アジュバント含有rS1はチャレンジに対する用量−
反応防御を引き出すと思われた。脳内チャレンジアッセ
イにおける不完全防御は、免疫化物質中に活性ホロ毒素
がなかったことによるものと考えられる；にもかかわら
ず、この予備試験で達成された防御は、組換えS1蛋白質
がサブユニットワクチン材料としての能力を有している
ことを立証するものである。その後の研究からは、B.pe
rtussisマウス有毒菌株18323による脳内チャレンジに対
する免疫防御は確証されていない。
S1類似体 蛋白質工学技術及び部位特異的変異誘発技術を用い
て、切頭型の類似体を作成した。バリン７とプロリン14
を境界とする領域がS1分子のADP−リボース転移酵素作
用に必要な領域であることが分かった。マウスにおいて
毒素作用から受動保護するモノクローン抗体と結合する
抗原決定基（すなわち保護応答の引出しに関係する抗原
決定基）がバリン７とプロリン14を境界とする領域の中
に少なくとも部分的に存在する。バリン７とプロリン14
を境界とする領域のS1分子の変異誘発によって酵素作用
を欠くS1類似分子が保護性抗原決定基を保持したままで
生成された。保護性抗原決定基は百日咳毒素に対する免
疫保護を与える上で重要である。１種類またはそれ以上
のアミノ酸の置換及び／または欠失も含めたバリン７か
らプロリン14の改変により、毒素中和レベルの抗体を引
き出すことができ且つ実質的に反応原性成分を含まない
S1類似体生成物が得られる。
て、切頭型の類似体を作成した。バリン７とプロリン14
を境界とする領域がS1分子のADP−リボース転移酵素作
用に必要な領域であることが分かった。マウスにおいて
毒素作用から受動保護するモノクローン抗体と結合する
抗原決定基（すなわち保護応答の引出しに関係する抗原
決定基）がバリン７とプロリン14を境界とする領域の中
に少なくとも部分的に存在する。バリン７とプロリン14
を境界とする領域のS1分子の変異誘発によって酵素作用
を欠くS1類似分子が保護性抗原決定基を保持したままで
生成された。保護性抗原決定基は百日咳毒素に対する免
疫保護を与える上で重要である。１種類またはそれ以上
のアミノ酸の置換及び／または欠失も含めたバリン７か
らプロリン14の改変により、毒素中和レベルの抗体を引
き出すことができ且つ実質的に反応原性成分を含まない
S1類似体生成物が得られる。
PTX S1遺伝子のpUC18への二次クローニング Bordetella pertussis毒素（PTX）用のオペロン全体
を含むプラスミドpPTX42をJ.Keith（NIAID,RockyMounta
in Laboratory）から形質転換JM109細胞として入手し
た。アンピシリンを含むＬブイヨンの中で細菌を成長さ
せて、プラスミドを回収した後標準的方法で精製した
（前出Maniatiset al）。制限酵素Ava I及びXba Iを用
いてプラスミドの消化を行なった後、アクリルアミドゲ
ルの電気泳動とそれにひき続いてのDNA断片のゲルから
の溶離を行なうことによって、PTX S1遺伝子（シストロ
ン）の一部を含む792bpのDNA断片（前出Locht and Keit
h）をpPTX42から単離した。このDNA断片はプレS1蛋白質
用の開放読み枠のすぐ内側にあるAva I部位に始まっ
て、S1用終止コドンのXba I部位で終了するものであ
る。標準クローン化ベクターpUC18もAva I及びXba Iを
用いて消化し、消化物をホスファターゼで処理した。消
化したpUC18ベクターpPTX42の792bpのDNA断片（Ava I−
Xba I）とT4DNA合成酵素との連結反応を標準条件下で行
なった。新鮮なコンピテントDH52a細胞を連結反応混合
物を用いて形質転換し、形質転換物質をアンピシリンと
「ブルーガル」（“Blue−gal",メアリランド州ガイザ
ースバーグ,Bethesda Research Laboratories）を含む
Ｌブイヨンの寒天平板上で選択した。12の白色コロニー
を選択し、レプリカ平板法で培養し、2mlの液体培養菌
として成長させた。標準アルカリ溶解法によって細胞を
「ミニプレップ」した後、DNAをAva IとXba Iで消化
し、消化物をアクリルアミドゲルの電気泳動にかけた。
を含むプラスミドpPTX42をJ.Keith（NIAID,RockyMounta
in Laboratory）から形質転換JM109細胞として入手し
た。アンピシリンを含むＬブイヨンの中で細菌を成長さ
せて、プラスミドを回収した後標準的方法で精製した
（前出Maniatiset al）。制限酵素Ava I及びXba Iを用
いてプラスミドの消化を行なった後、アクリルアミドゲ
ルの電気泳動とそれにひき続いてのDNA断片のゲルから
の溶離を行なうことによって、PTX S1遺伝子（シストロ
ン）の一部を含む792bpのDNA断片（前出Locht and Keit
h）をpPTX42から単離した。このDNA断片はプレS1蛋白質
用の開放読み枠のすぐ内側にあるAva I部位に始まっ
て、S1用終止コドンのXba I部位で終了するものであ
る。標準クローン化ベクターpUC18もAva I及びXba Iを
用いて消化し、消化物をホスファターゼで処理した。消
化したpUC18ベクターpPTX42の792bpのDNA断片（Ava I−
Xba I）とT4DNA合成酵素との連結反応を標準条件下で行
なった。新鮮なコンピテントDH52a細胞を連結反応混合
物を用いて形質転換し、形質転換物質をアンピシリンと
「ブルーガル」（“Blue−gal",メアリランド州ガイザ
ースバーグ,Bethesda Research Laboratories）を含む
Ｌブイヨンの寒天平板上で選択した。12の白色コロニー
を選択し、レプリカ平板法で培養し、2mlの液体培養菌
として成長させた。標準アルカリ溶解法によって細胞を
「ミニプレップ」した後、DNAをAva IとXba Iで消化
し、消化物をアクリルアミドゲルの電気泳動にかけた。
rPTX S1発現プラスミドpPTX S1/1の構成 792bpのAva I−Xba I断片を上述のようなプラスミドp
PTX42から単離した。Escherichia coli発現プラスミドp
CFM1156,pCFM1036をカルフォルニア州サウザンド・オー
クスのAmgen Inc.,Charles F.Morrisから入手した。
プラスミドpCFM1156を制限酵素Sst I及びNde Iで消化
し、NA45紙（ニューハンプシャー州キーン,Schleicher
＆Schuell）上への電気溶出により1.8Kbの断片をアガロ
ースゲルから単離した。プラスミドpCFM1036をSst IとX
ba Iで消化し、2.8KbのDNA断片を同様の方法で単離し
た。S1の開放読み枠の欠失部分を再構成するオリゴデオ
キシヌクレオチドリンカーの２つの相補鎖をCaruthers
et al（前出）のアミノホスフィン化学法で合成した。
標準アミノ酸配列を保持しながら、合成断片の配列をコ
ドン使用法において変更して、mRANの潜在的二次構造を
低減した。例外として、プレプロテインシグナル配列順
のアミノ酸位置番号２にあるシステインコドンをセリン
コドンと置換して、成熟蛋白質の41と199の位置にある
２つのシステイン残基とプレプロテインシグナルとの間
のジスルフィド相互作用を無くした。このようなオリゴ
デオキシヌクレオチドリンカーはpCFM1156の１つに対し
て付着性のNde I部位を有し、S1遺伝子の792−bpDNA断
片のAva I部位への結合用のAva I付着末端を有してい
た。このオリゴデオキシヌクレオチドの配列は、 であった。
PTX42から単離した。Escherichia coli発現プラスミドp
CFM1156,pCFM1036をカルフォルニア州サウザンド・オー
クスのAmgen Inc.,Charles F.Morrisから入手した。
プラスミドpCFM1156を制限酵素Sst I及びNde Iで消化
し、NA45紙（ニューハンプシャー州キーン,Schleicher
＆Schuell）上への電気溶出により1.8Kbの断片をアガロ
ースゲルから単離した。プラスミドpCFM1036をSst IとX
ba Iで消化し、2.8KbのDNA断片を同様の方法で単離し
た。S1の開放読み枠の欠失部分を再構成するオリゴデオ
キシヌクレオチドリンカーの２つの相補鎖をCaruthers
et al（前出）のアミノホスフィン化学法で合成した。
標準アミノ酸配列を保持しながら、合成断片の配列をコ
ドン使用法において変更して、mRANの潜在的二次構造を
低減した。例外として、プレプロテインシグナル配列順
のアミノ酸位置番号２にあるシステインコドンをセリン
コドンと置換して、成熟蛋白質の41と199の位置にある
２つのシステイン残基とプレプロテインシグナルとの間
のジスルフィド相互作用を無くした。このようなオリゴ
デオキシヌクレオチドリンカーはpCFM1156の１つに対し
て付着性のNde I部位を有し、S1遺伝子の792−bpDNA断
片のAva I部位への結合用のAva I付着末端を有してい
た。このオリゴデオキシヌクレオチドの配列は、 であった。
pCFM1036の2.8KbのDNA断片と、pCFM1156の1.8KbのDNA
断片と、S1遺伝子セグメントを含む792bpのDNA断片と、
オリゴデオキヌクレオチドリンカーとT4DNA合成酵素と
を用いて連結反応の準備を行なった。連結後のFM6細胞
（カルフォルニア州サウザンド・オークス.Amgen In
c.,C.F.Morrisから入手）を連結反応混合物を用いて形
質転換し、カナマイシンを用いてＬブイヨン寒天に塗布
した。コロニーを選択して、両方ともアルカリ法（前出
Maniatis et al）によってレプリカ平板法による培養と
ミニプレッピングを行なった。ミニプレップしたDNA試
料の制限酵素マッピングを行なって、所期のDNA制限断
片を保有していることが分かった。合成リンカーの始端
部から真正S1遺伝子の開放読み枠内へと延びる領域をDN
A配列分析によって評価した。引続いてこのプラスミド
を誘導した結果、組換えS1蛋白質が高レベルに発現し
た。
断片と、S1遺伝子セグメントを含む792bpのDNA断片と、
オリゴデオキヌクレオチドリンカーとT4DNA合成酵素と
を用いて連結反応の準備を行なった。連結後のFM6細胞
（カルフォルニア州サウザンド・オークス.Amgen In
c.,C.F.Morrisから入手）を連結反応混合物を用いて形
質転換し、カナマイシンを用いてＬブイヨン寒天に塗布
した。コロニーを選択して、両方ともアルカリ法（前出
Maniatis et al）によってレプリカ平板法による培養と
ミニプレッピングを行なった。ミニプレップしたDNA試
料の制限酵素マッピングを行なって、所期のDNA制限断
片を保有していることが分かった。合成リンカーの始端
部から真正S1遺伝子の開放読み枠内へと延びる領域をDN
A配列分析によって評価した。引続いてこのプラスミド
を誘導した結果、組換えS1蛋白質が高レベルに発現し
た。
rPTX S1発現プラスミドpPTX S1/2の構築 Acc I及びSph Iによる消化でプラスミドpPTX S1/1か
ら181−bpのDNA断片を単離した。続いてDNA断片の精製
をポリアクリルアミドゲル上で行なった。このDNA断片
はS1遺伝子内部の左手部分である。同じ方法を用いて遺
伝子の残りの右手部分を表す564bpのDAN断片を、pUC18
にクローン化したPTX S1から単離した。これはSph I及
びBamH Iによるプラスミドの消化によって行ない、後者
の酵素によりS1クローン化部位（Xba I）の下流側のpUC
18クローン化クラスター内部のBamH I部位において切断
した。制限酵素Nde I,Sst I,BamH Iによる消化の後、ア
ガロースゲル電気泳動による単離とDNA断片の電気溶離
を行なって、1.8Kb及び2.8KbのDNA断片を発現ベクターp
CFM1156から単離した。オリゴデオキシヌクレオチドリ
ンカーを合成した。この日本鎖リンカーはNde IとAcc I
の付着末端を有し、下記の配列を有していた。
ら181−bpのDNA断片を単離した。続いてDNA断片の精製
をポリアクリルアミドゲル上で行なった。このDNA断片
はS1遺伝子内部の左手部分である。同じ方法を用いて遺
伝子の残りの右手部分を表す564bpのDAN断片を、pUC18
にクローン化したPTX S1から単離した。これはSph I及
びBamH Iによるプラスミドの消化によって行ない、後者
の酵素によりS1クローン化部位（Xba I）の下流側のpUC
18クローン化クラスター内部のBamH I部位において切断
した。制限酵素Nde I,Sst I,BamH Iによる消化の後、ア
ガロースゲル電気泳動による単離とDNA断片の電気溶離
を行なって、1.8Kb及び2.8KbのDNA断片を発現ベクターp
CFM1156から単離した。オリゴデオキシヌクレオチドリ
ンカーを合成した。この日本鎖リンカーはNde IとAcc I
の付着末端を有し、下記の配列を有していた。
pPTX S1/1からの181bp（Acc I−Sph I）及び564bp（S
ph I−BamH I）のDAN断片、pCFM1156からの1.8Kb（Nde
I−Sst I）及び2.8Kb（Sst I−BamH I）のDNA断片、オ
リゴデオキシヌクレオチドリンカー、及びT4DNA合成酵
素を用いた標準的な方法（前出Maniatis et al）によっ
て連結反応を実施した。連結反応後、この混合物を用い
て新鮮なコンピテントFM5細胞に形質転換した。カナマ
イシン耐性形質転換細胞を得、プラスミドDNAのミニプ
レップに関する酵素分析を行ない、結合部のDAN配列の
分析によって構造を確認した。
ph I−BamH I）のDAN断片、pCFM1156からの1.8Kb（Nde
I−Sst I）及び2.8Kb（Sst I−BamH I）のDNA断片、オ
リゴデオキシヌクレオチドリンカー、及びT4DNA合成酵
素を用いた標準的な方法（前出Maniatis et al）によっ
て連結反応を実施した。連結反応後、この混合物を用い
て新鮮なコンピテントFM5細胞に形質転換した。カナマ
イシン耐性形質転換細胞を得、プラスミドDNAのミニプ
レップに関する酵素分析を行ない、結合部のDAN配列の
分析によって構造を確認した。
pPTX S1/2のBal31消化と切頭型S1遺伝子によるベクター
の構築 成熟したS1分子のアミノ末端付近にある重要な抗原決
定基と酵素的に活性の部位を評価するために、この蛋白
質の切頭変異型を作成した。発現プラスミドpPTX S1/2
をNde Iで消化し、標準条件下でエキソヌクレアーゼBal
31（IBI）で処理した後、110分まで何回かに分けてアリ
コートを取出した。65℃で15分間Bal31の不活性化を行
なった後、アガロースゲル上での電気泳動により、電気
泳動移動度の増大に関して試料の分析を行なった。100
分と110分のアリコートからの試料をプールし（断片
Ａ）、残りの試料はプールした後、別のBal31で消化し
た。180分まで何回かに分けてアリコートを取出した。
反応を停止させた後、再び電気泳動移動度の増大に関し
てアリコートを検査し、さらに４つの断片（B,C,D,E）
を保存した。５つの断片を個々にSst Iで消化し、電気
溶離によって３〜3.5KbのDNA断片をアガロースゲルから
単離した。
の構築 成熟したS1分子のアミノ末端付近にある重要な抗原決
定基と酵素的に活性の部位を評価するために、この蛋白
質の切頭変異型を作成した。発現プラスミドpPTX S1/2
をNde Iで消化し、標準条件下でエキソヌクレアーゼBal
31（IBI）で処理した後、110分まで何回かに分けてアリ
コートを取出した。65℃で15分間Bal31の不活性化を行
なった後、アガロースゲル上での電気泳動により、電気
泳動移動度の増大に関して試料の分析を行なった。100
分と110分のアリコートからの試料をプールし（断片
Ａ）、残りの試料はプールした後、別のBal31で消化し
た。180分まで何回かに分けてアリコートを取出した。
反応を停止させた後、再び電気泳動移動度の増大に関し
てアリコートを検査し、さらに４つの断片（B,C,D,E）
を保存した。５つの断片を個々にSst Iで消化し、電気
溶離によって３〜3.5KbのDNA断片をアガロースゲルから
単離した。
発現ベクターpCFM1156をSst I及びHpa Iで消化して、
同様に18KbのDNA断片を単離した。それぞれpPTX S1/2か
ら得た個々の３〜3.5KbのDNA断片を（Bal31平滑端−Sst
I）と1.8KbのDNA断片（Sst I−Hpa I）を標準条件下で
T4DNA合成酵素を用いて結合した。個々の結合混合物を
用いて新鮮なコンピテントFM5細胞を形質転換して、カ
ナマイシン耐性形質転換細胞を単離した。それぞれ切頭
型フラクションＡとＢによる形質転換細胞を取出して、
42℃でミニプレップを誘導し、光学顕微鏡により封入体
の有無について調製物の検査を行なった。封入体の存在
する調製物をXba Iで消化し、アガロースゲル電気泳動
によってDNA挿入断片をその大きさに関して検査した。
大きさ600〜650bpの範囲の調製物を選択してDNAを配列
分析し、切頭型の構造を確認した。発現した組換え蛋白
質を分析した結果、S1分子のADPリボシル転移酵素作用
及び保護応答を引出すのに必要な抗原決定基（すなわち
マウスにおいて毒素作用から受動的に保護する働きをす
るモノクローン抗体と結合する抗原決定基）に必要な領
域は、成熟した分子のバリン７からプロリン14までの領
域の中に存在することが分かった（完全なアミン酸配列
については、前出Locht and Keith参照）。このようなS
1分子の切頭型は、ベクターの構築により全てそのＮ末
端がメチオニルバリルで始まり、その後に切頭型配列が
続く。
同様に18KbのDNA断片を単離した。それぞれpPTX S1/2か
ら得た個々の３〜3.5KbのDNA断片を（Bal31平滑端−Sst
I）と1.8KbのDNA断片（Sst I−Hpa I）を標準条件下で
T4DNA合成酵素を用いて結合した。個々の結合混合物を
用いて新鮮なコンピテントFM5細胞を形質転換して、カ
ナマイシン耐性形質転換細胞を単離した。それぞれ切頭
型フラクションＡとＢによる形質転換細胞を取出して、
42℃でミニプレップを誘導し、光学顕微鏡により封入体
の有無について調製物の検査を行なった。封入体の存在
する調製物をXba Iで消化し、アガロースゲル電気泳動
によってDNA挿入断片をその大きさに関して検査した。
大きさ600〜650bpの範囲の調製物を選択してDNAを配列
分析し、切頭型の構造を確認した。発現した組換え蛋白
質を分析した結果、S1分子のADPリボシル転移酵素作用
及び保護応答を引出すのに必要な抗原決定基（すなわち
マウスにおいて毒素作用から受動的に保護する働きをす
るモノクローン抗体と結合する抗原決定基）に必要な領
域は、成熟した分子のバリン７からプロリン14までの領
域の中に存在することが分かった（完全なアミン酸配列
については、前出Locht and Keith参照）。このようなS
1分子の切頭型は、ベクターの構築により全てそのＮ末
端がメチオニルバリルで始まり、その後に切頭型配列が
続く。
S1変異誘発 バリン７とプロリン14によって境界される領域を厳密
にマッピングすると共に、その領域の保護抗原決定基を
保持しながら酵素作用を欠くS1の類似分子を生成するた
めに、保護抗原決定基の保持率をモノクローン抗体1B7
との反応性によって規定る。これを、バリン７からプロ
リン14までの残基をコードする真正領域を合成オリゴデ
オキシヌクレオチドセグメントと置換することで達成し
た。これらのセグメントは、真正アミノ酸配列を改変で
きるように一重または二重のコドン置換を含んでいた。
改変は欠失及び／または置換によって達成することがで
きる。１つの塩基を改変した所期の特性のS1類似体を得
ることも本発明の範囲に含まれる。１つの塩基を改変し
て、アミン酸配列を改変することができる。但し、当業
者であれば承知されているように、１つの塩基を改変し
た場合は少なくとも２つの塩基を変更した場合に比較し
て遺伝子型復帰が野性型になる傾向が統計的に高くな
る。従って好適実施態様では、コドンの改変をする際に
各コドンの少なくとも２つの塩基を置換して復帰効率を
低減する。オリゴデオキシヌクレオチドリンカーをAcc
IとBspM IIの付着末端を用いて合成すると、表Ｉのリン
カー説明に示したコドン変更を除いて真正S1配列を含ん
でいた。
にマッピングすると共に、その領域の保護抗原決定基を
保持しながら酵素作用を欠くS1の類似分子を生成するた
めに、保護抗原決定基の保持率をモノクローン抗体1B7
との反応性によって規定る。これを、バリン７からプロ
リン14までの残基をコードする真正領域を合成オリゴデ
オキシヌクレオチドセグメントと置換することで達成し
た。これらのセグメントは、真正アミノ酸配列を改変で
きるように一重または二重のコドン置換を含んでいた。
改変は欠失及び／または置換によって達成することがで
きる。１つの塩基を改変した所期の特性のS1類似体を得
ることも本発明の範囲に含まれる。１つの塩基を改変し
て、アミン酸配列を改変することができる。但し、当業
者であれば承知されているように、１つの塩基を改変し
た場合は少なくとも２つの塩基を変更した場合に比較し
て遺伝子型復帰が野性型になる傾向が統計的に高くな
る。従って好適実施態様では、コドンの改変をする際に
各コドンの少なくとも２つの塩基を置換して復帰効率を
低減する。オリゴデオキシヌクレオチドリンカーをAcc
IとBspM IIの付着末端を用いて合成すると、表Ｉのリン
カー説明に示したコドン変更を除いて真正S1配列を含ん
でいた。
発現プラスミドの構築については、電気溶離によって
下記のDNA断片をアガロースゲルから単離した。
下記のDNA断片をアガロースゲルから単離した。
１） pPTX S1（6A）からの1824bpのDNA断片。上述のよ
うに構築されたプラスミドであり、アスパラギン酸１と
アスパラギン酸２を欠除してメチオニルバリルで置換し
た組換えS1類似分子を発現した。
うに構築されたプラスミドであり、アスパラギン酸１と
アスパラギン酸２を欠除してメチオニルバリルで置換し
た組換えS1類似分子を発現した。
２） pPTX S1（33B）からの3.56KbのDNA断片（Sst Iか
らBspM II）。上述のように構築されたプラスミドであ
り、最初の14個のアミノ酸残基を欠失してメチオニルバ
リルで置換した組換えS1類似分子を発現した。この特定
遺伝子構造では、その結果得られた短縮分子の平滑端末
連結により新しいBspM II部位を作製した。天然のS1シ
ストロン要素には存在しないこのような制限部位によっ
て、Acc IおよびBspM II付着末端を有する比較的短かい
オリゴヌクレオチドを利用して変異誘発できるようにな
る。
らBspM II）。上述のように構築されたプラスミドであ
り、最初の14個のアミノ酸残基を欠失してメチオニルバ
リルで置換した組換えS1類似分子を発現した。この特定
遺伝子構造では、その結果得られた短縮分子の平滑端末
連結により新しいBspM II部位を作製した。天然のS1シ
ストロン要素には存在しないこのような制限部位によっ
て、Acc IおよびBspM II付着末端を有する比較的短かい
オリゴヌクレオチドを利用して変異誘発できるようにな
る。
上記２つのDNA断片を上述の個々のオリゴデオキシヌ
クレオチド断片と標準的な連結条件下で結合した。この
結果、S1遺伝子が新たに構築された。すなわち、pPTX S
1（6A）の一部がAcc I制限部位の地点に上流側コドンを
与え、合成断片がAcc I部位とBspM II部位との間コドン
に各種の変異を与え、pPTX S1（33B）の一部が新規のBs
pM II制限部位の下流側のS1コード領域の残りとなっ
た。結合後、それぞれの混合物を用いて新鮮なコンピテ
ントFM5細胞の別個の調製物の形質転換を行なった。形
質転換細胞を取出して、ミニプレッとして成長させ、誘
導して組換え蛋白質を生成した後、光学顕微鏡検査によ
り封入体を含む試料を同定した。これらの試料を誘導温
度でより大規模（１〜６リットル）に発酵させて、各組
換え類似蛋白質をより大量に生成した。単離した細胞ペ
ーストを1MMのDTTを含む蒸留水に再懸濁した後、フレン
チプレスで溶解させた。これらの封入体蛋白質調製物を
少ないものでは30％、多いものでは80％の組換え蛋白質
を含んでいた。各調製物を分析して、本発明者らの研究
では切頭型S1類似体と同一であるとされる優性抗原決定
基に対するモノクローン抗体B2F8にウェスタンブロット
法で結合する能力（前出Burnette）、および毒性B.pert
ussisによる脳内攻撃からマウスを受動的に保護するこ
とが知られているモノクローン抗体1B7に結合する能力
（前出Sato et al）を調べた。また、ADPリボース転移
酵素活性についても評価した。その結果を表２に示す。
クレオチド断片と標準的な連結条件下で結合した。この
結果、S1遺伝子が新たに構築された。すなわち、pPTX S
1（6A）の一部がAcc I制限部位の地点に上流側コドンを
与え、合成断片がAcc I部位とBspM II部位との間コドン
に各種の変異を与え、pPTX S1（33B）の一部が新規のBs
pM II制限部位の下流側のS1コード領域の残りとなっ
た。結合後、それぞれの混合物を用いて新鮮なコンピテ
ントFM5細胞の別個の調製物の形質転換を行なった。形
質転換細胞を取出して、ミニプレッとして成長させ、誘
導して組換え蛋白質を生成した後、光学顕微鏡検査によ
り封入体を含む試料を同定した。これらの試料を誘導温
度でより大規模（１〜６リットル）に発酵させて、各組
換え類似蛋白質をより大量に生成した。単離した細胞ペ
ーストを1MMのDTTを含む蒸留水に再懸濁した後、フレン
チプレスで溶解させた。これらの封入体蛋白質調製物を
少ないものでは30％、多いものでは80％の組換え蛋白質
を含んでいた。各調製物を分析して、本発明者らの研究
では切頭型S1類似体と同一であるとされる優性抗原決定
基に対するモノクローン抗体B2F8にウェスタンブロット
法で結合する能力（前出Burnette）、および毒性B.pert
ussisによる脳内攻撃からマウスを受動的に保護するこ
とが知られているモノクローン抗体1B7に結合する能力
（前出Sato et al）を調べた。また、ADPリボース転移
酵素活性についても評価した。その結果を表２に示す。
S1類似体４−１（Arg9→Lys）は中和性mAb 1B7との反
応性を保持したままで転移酵素活性はほとんど、あるい
は全く示さなかった。定量法において４−１蛋白質の量
を増大しても、認められる酵素活性の量はごくわずかに
すぎなかった（第8A図）。測定を繰返し行なった結果、
S1類似体の固有ADPリボース転移酵素活性が少なくとも
5,000以下の活性割合に低下した。単残基置換の変異体
に関連するNADグリコヒドロラーゼ活性の測定を行なっ
た結果（第8D図）、ADPリボース転移酵素活性の評価か
ら得られたのと同様のパターンを得た。S1類似体４−１
は検出可能なグリコヒドロラーゼ活性をほとんど、ある
いは全く示さず、この活性の大きさが少なくとも50〜10
0以下の活性割合に低減していることが分かった。
応性を保持したままで転移酵素活性はほとんど、あるい
は全く示さなかった。定量法において４−１蛋白質の量
を増大しても、認められる酵素活性の量はごくわずかに
すぎなかった（第8A図）。測定を繰返し行なった結果、
S1類似体の固有ADPリボース転移酵素活性が少なくとも
5,000以下の活性割合に低下した。単残基置換の変異体
に関連するNADグリコヒドロラーゼ活性の測定を行なっ
た結果（第8D図）、ADPリボース転移酵素活性の評価か
ら得られたのと同様のパターンを得た。S1類似体４−１
は検出可能なグリコヒドロラーゼ活性をほとんど、ある
いは全く示さず、この活性の大きさが少なくとも50〜10
0以下の活性割合に低減していることが分かった。
受動保護性モノクローン抗体に結合する能力（すなわ
ち主な保護性抗原決定基を保持する）を有し、毒性作用
の主要標識（ADPリボース転移酵素）を欠落することが
できるため、第７図に示すようにクローンpPTX S1（6A
−3/4−１）によって生成された組換えS1類似体分子お
よびその改変体は単独で、あるいは他のPTXサブユニッ
トと組合せて完全で経済的なサブユニットワクチンとし
て使用できる。アルギニン９をリンシンで置換したクロ
ーンpPTX S1（6A−3/4−１）によって生成されたS1類似
体は、完全なサブユニットワクチンに必要な所望特性を
有するrS1類似体の実例である。他の6A−3/4−１類似体
は、例えば１と２の位置にアスパルチルアスパルチル残
基を、0,1,2の位置にメチオニルアスパルチルアスパル
チル残基を、0,1,2の位置にメチオニルバリルアスパル
チル残基を含む場合がある。
ち主な保護性抗原決定基を保持する）を有し、毒性作用
の主要標識（ADPリボース転移酵素）を欠落することが
できるため、第７図に示すようにクローンpPTX S1（6A
−3/4−１）によって生成された組換えS1類似体分子お
よびその改変体は単独で、あるいは他のPTXサブユニッ
トと組合せて完全で経済的なサブユニットワクチンとし
て使用できる。アルギニン９をリンシンで置換したクロ
ーンpPTX S1（6A−3/4−１）によって生成されたS1類似
体は、完全なサブユニットワクチンに必要な所望特性を
有するrS1類似体の実例である。他の6A−3/4−１類似体
は、例えば１と２の位置にアスパルチルアスパルチル残
基を、0,1,2の位置にメチオニルアスパルチルアスパル
チル残基を、0,1,2の位置にメチオニルバリルアスパル
チル残基を含む場合がある。
現存の無細胞性ワクチンはS1,S2,S3,S4,S5のサブユニ
ットの含有する。培養した哺乳類細胞において百日咳毒
素によって生じる形態的な変化は、最近になってS1サブ
ユニットの特性であることが証明された（Burns et a
l.,1987,Infect,Immun.55:24−28）が、この効果はＢオ
リゴマーの存在時にしか示されていない。ここに記載す
る予備研究によって、主要な保護性抗原決定基は保持す
るが毒性作用を欠くrS1類似体を用いた単一サブユニッ
トワクチンの可能性が証明されている。S1類似体もサブ
ユニットS2,S3,S4,S5と組合せての用途を有する。これ
らのサブユニットはS1への免疫応答を増大すると共に、
自身で保護性抗原決定基を有することができる。S1サブ
ユニット類似体を含むワクチンがさらにBordetella外毒
素の前記サブユニットS2,S3,S4,S5およびそれらの混合
物の少なくとも１つを含むことも本発明の範囲に該当す
る。サブユニットS2,S3,S4,S5はB.petussisから誘導し
ても良いし、あるいは遺伝子工学的に得られたサブユニ
ットおよびそれらの類似体とすることができる。遺伝子
工学的に得られたサブユニット生成物は融合蛋白質と非
融合蛋白質を含むことができる。
ットの含有する。培養した哺乳類細胞において百日咳毒
素によって生じる形態的な変化は、最近になってS1サブ
ユニットの特性であることが証明された（Burns et a
l.,1987,Infect,Immun.55:24−28）が、この効果はＢオ
リゴマーの存在時にしか示されていない。ここに記載す
る予備研究によって、主要な保護性抗原決定基は保持す
るが毒性作用を欠くrS1類似体を用いた単一サブユニッ
トワクチンの可能性が証明されている。S1類似体もサブ
ユニットS2,S3,S4,S5と組合せての用途を有する。これ
らのサブユニットはS1への免疫応答を増大すると共に、
自身で保護性抗原決定基を有することができる。S1サブ
ユニット類似体を含むワクチンがさらにBordetella外毒
素の前記サブユニットS2,S3,S4,S5およびそれらの混合
物の少なくとも１つを含むことも本発明の範囲に該当す
る。サブユニットS2,S3,S4,S5はB.petussisから誘導し
ても良いし、あるいは遺伝子工学的に得られたサブユニ
ットおよびそれらの類似体とすることができる。遺伝子
工学的に得られたサブユニット生成物は融合蛋白質と非
融合蛋白質を含むことができる。
次項に記載の実験を行なう目的で、本発明者らは発現
系を改変して、アルギニン９をリシンに置換するが、ア
ミン末端に天然のアスパルチルアスパルテート残基も有
するS1サブユニット類似体を生成した。
系を改変して、アルギニン９をリシンに置換するが、ア
ミン末端に天然のアスパルチルアスパルテート残基も有
するS1サブユニット類似体を生成した。
S1/1−４類似体とS1/1の生物学的活性の評価 細胞***、遠心分離、尿素可変化、イオン交換クロマ
トグラフィー、ゲル濾過クロマトグランフィーを含む方
法によって、未配列の組換えS1蛋白質と類似体S1/1−４
（上述のようにArg9−Lys置換と天然配列のアスパルチ
ルアスパルテートアミノ末端残基を含む）とをE.coli生
成細胞から個々に単離した。細胞ペーストを25mMのトリ
ス緩衝液（pH8.5）に懸濁し、高圧破裂（フレンチプレ
ス）によって溶解させた。溶解物を遠心分離にかけ、組
換えS1蛋白質を含む不溶性ペレットを8Mの尿素、25mMの
トリス（pH8.5）に可溶化した。濃度50μＭになるまでC
uSO4を添加した後、混合物を一晩撹拌して組換えS1蛋白
質の中にジスルフィド結合を形成させた。混合物を同量
の8Mの尿素、25mMのクエン酸ナトリウム（pH3.8）で希
釈し、8M尿素においてpH3.8に平衡させたＳ−セファロ
ースカラム（「高速流」）にかけた。8M尿素、12.5mMク
エン酸ナトリウム（pH3.8）においてNaClの直線勾配を
用いてカラムから溶離した。それぞれのカラムから幅広
のピークを採集して、pH7.5に調整した。これらのクロ
マトグラフィーフラクションのプールを2Mの尿素、10mM
の燐酸カリウム（pH7.5）において平衡させたセファク
リルＳ−200カラムに個々にかけ、溶離物のプールを収
集したところ、各種類（S1/1およびS1/1−４）の酸化単
量体組換えS1蛋白質が認められた。精製したS1サブユニ
ット蛋白質をSDS−PAGEおよびそれに続くゲル内蛋白質
の銀染色法によって分析した（第９図）。ゲル（12.5％
のアクリルアミド）を還元条件下に泳動した。レーン
１、分子量標準（Pharmacia）。レーン２、２μｇのB.p
ertussisホロ毒素（List Biological Laboratories）。
レーン３、0.2μｇのB.pertussis S1サブユニット蛋白
質（List Biological Laboratories）。レーン４、0.2
μｇの組換えS1/1。レーン５、0.2μｇの組換えS1/1−
４。レーン６、ブランク。レーン７、0.4μｇのS1サブ
ユニット蛋白質（List）。レーン８、0.4μｇの組換えS
1/1。レーン９、0.4μｇの組換えS2/1−４。この段階で
組換えS1種は純度90％以上であった。
トグラフィー、ゲル濾過クロマトグランフィーを含む方
法によって、未配列の組換えS1蛋白質と類似体S1/1−４
（上述のようにArg9−Lys置換と天然配列のアスパルチ
ルアスパルテートアミノ末端残基を含む）とをE.coli生
成細胞から個々に単離した。細胞ペーストを25mMのトリ
ス緩衝液（pH8.5）に懸濁し、高圧破裂（フレンチプレ
ス）によって溶解させた。溶解物を遠心分離にかけ、組
換えS1蛋白質を含む不溶性ペレットを8Mの尿素、25mMの
トリス（pH8.5）に可溶化した。濃度50μＭになるまでC
uSO4を添加した後、混合物を一晩撹拌して組換えS1蛋白
質の中にジスルフィド結合を形成させた。混合物を同量
の8Mの尿素、25mMのクエン酸ナトリウム（pH3.8）で希
釈し、8M尿素においてpH3.8に平衡させたＳ−セファロ
ースカラム（「高速流」）にかけた。8M尿素、12.5mMク
エン酸ナトリウム（pH3.8）においてNaClの直線勾配を
用いてカラムから溶離した。それぞれのカラムから幅広
のピークを採集して、pH7.5に調整した。これらのクロ
マトグラフィーフラクションのプールを2Mの尿素、10mM
の燐酸カリウム（pH7.5）において平衡させたセファク
リルＳ−200カラムに個々にかけ、溶離物のプールを収
集したところ、各種類（S1/1およびS1/1−４）の酸化単
量体組換えS1蛋白質が認められた。精製したS1サブユニ
ット蛋白質をSDS−PAGEおよびそれに続くゲル内蛋白質
の銀染色法によって分析した（第９図）。ゲル（12.5％
のアクリルアミド）を還元条件下に泳動した。レーン
１、分子量標準（Pharmacia）。レーン２、２μｇのB.p
ertussisホロ毒素（List Biological Laboratories）。
レーン３、0.2μｇのB.pertussis S1サブユニット蛋白
質（List Biological Laboratories）。レーン４、0.2
μｇの組換えS1/1。レーン５、0.2μｇの組換えS1/1−
４。レーン６、ブランク。レーン７、0.4μｇのS1サブ
ユニット蛋白質（List）。レーン８、0.4μｇの組換えS
1/1。レーン９、0.4μｇの組換えS2/1−４。この段階で
組換えS1種は純度90％以上であった。
S1のArg9−Lys変異の生物学的活性を評価するため
に、変異体類似体と天然型配列の組換えS1蛋白質を関連
させて百日咳ホロ毒素種にする必要があった。高度に精
製した百日咳毒素Ｂオリゴマー（毒素サブユニットS2,S
3,S4,S5の五量体構造）がCenter for Biologis Evaluat
ion and Research,Food and Drug AdministrationのD.B
urnsから提供された。２種類のS1サブユニット種を下記
の方法によりＢオリゴマーと個々に関連させてホロ毒素
分子（S1/1またはS1/1−４の何れかを含む）を形成し
た。等モル量の組換えS1種とＢオリゴマーを2Mの尿素、
10mMの燐酸カリウム溶液（pH7.5）において結合して、3
7℃で30分間温置した。ネイティブなアクリルアミドゲ
ルにおける電気泳動によってホロ毒素の形成を評価した
（第10図）。ゲル１、組換えS1/1と天然型オリゴマー。
ゲル２、組換えS1/1−４と天然型Ｂオリゴマー。ゲル
３、天然型Ｂオリゴマー。ゲル４、天然型B.pertussis
ホロ毒素。ゲル５、組換えS1/1。これらのゲルが示すよ
うに、ホロ毒素種は天然型Ｂオリゴマーと組換えS1/1ま
たは組換えS1/1−４の何れかとの組合せから組立てられ
たものであった。
に、変異体類似体と天然型配列の組換えS1蛋白質を関連
させて百日咳ホロ毒素種にする必要があった。高度に精
製した百日咳毒素Ｂオリゴマー（毒素サブユニットS2,S
3,S4,S5の五量体構造）がCenter for Biologis Evaluat
ion and Research,Food and Drug AdministrationのD.B
urnsから提供された。２種類のS1サブユニット種を下記
の方法によりＢオリゴマーと個々に関連させてホロ毒素
分子（S1/1またはS1/1−４の何れかを含む）を形成し
た。等モル量の組換えS1種とＢオリゴマーを2Mの尿素、
10mMの燐酸カリウム溶液（pH7.5）において結合して、3
7℃で30分間温置した。ネイティブなアクリルアミドゲ
ルにおける電気泳動によってホロ毒素の形成を評価した
（第10図）。ゲル１、組換えS1/1と天然型オリゴマー。
ゲル２、組換えS1/1−４と天然型Ｂオリゴマー。ゲル
３、天然型Ｂオリゴマー。ゲル４、天然型B.pertussis
ホロ毒素。ゲル５、組換えS1/1。これらのゲルが示すよ
うに、ホロ毒素種は天然型Ｂオリゴマーと組換えS1/1ま
たは組換えS1/1−４の何れかとの組合せから組立てられ
たものであった。
次に半組換えホロ毒素（Ｂオリゴマー＋S1/1または類
似体S1/1−４）の検査を、試験管内でのチャイニーズハ
スター卵巣（CHO）細胞の集塊応答（clustering respon
se）を引出す能力に関して行なった。この応答は百日咳
毒素の細胞変性の尺度であることが証明されている。実
験用標本と適当な対照標本をCHO細胞培養媒体（10％の
ウシ胎児血清を含むダルベッコ改良イーグル培地）に希
釈し、限外濾過によって滅菌した後、96穴のプラスチッ
ク培養皿において連続移動することによってさらに希釈
した。ほぼ５〜７×103の新たにトリプシン処理したCHO
細胞（アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション
CCL61,CHO−K1細胞）をそれぞれの穴に加えて、培養皿
を５％CO2の中で37℃で48〜72時間温置した。細胞単層
をリン酸塩緩衝食塩水で洗浄してクリスタルバイオレッ
トで染色し、光学顕微鏡検査によって細胞クラスターの
有無を調べた。
似体S1/1−４）の検査を、試験管内でのチャイニーズハ
スター卵巣（CHO）細胞の集塊応答（clustering respon
se）を引出す能力に関して行なった。この応答は百日咳
毒素の細胞変性の尺度であることが証明されている。実
験用標本と適当な対照標本をCHO細胞培養媒体（10％の
ウシ胎児血清を含むダルベッコ改良イーグル培地）に希
釈し、限外濾過によって滅菌した後、96穴のプラスチッ
ク培養皿において連続移動することによってさらに希釈
した。ほぼ５〜７×103の新たにトリプシン処理したCHO
細胞（アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション
CCL61,CHO−K1細胞）をそれぞれの穴に加えて、培養皿
を５％CO2の中で37℃で48〜72時間温置した。細胞単層
をリン酸塩緩衝食塩水で洗浄してクリスタルバイオレッ
トで染色し、光学顕微鏡検査によって細胞クラスターの
有無を調べた。
第11図はこのような分析の結果を示したものであり、
特に興味がもたれるのはS1/1−４類似体に関連するパネ
ルG,H,Jの結果である。S1/1−４類似体単独とS1/1−４
類似体およびＢオリゴマーから形成したホロ毒素の1600
倍希釈液が細胞集塊が無いことを示しているのに対し、
200倍希釈液は相当量の集塊を示している。パネルＡは2
00倍緩衝希釈液のみで処理した細胞である。パネルＢは
200分の１の希釈度のＢオリゴマーのみを用いての処理
である。この希釈度ではある程度の集塊が認められる
が、これは精製後に残留する天然型S1サブユニットの汚
染によるものである。パネルＢは同一の穴（パネルＩ）
の別の領域と比較することが可能であり、希釈度200倍
のＢオリゴマー標品の集塊作用があることを明確に示し
ている。パネルＣは希釈度200分の１の市販の天然型S1
サブユニット（List Biologicals）で処理した細胞であ
る。パネルＤは希釈度2000分の１の市販の天然型百日咳
ホロ毒素（List Biologicals）であり、百日咳毒素が培
地内のCHO細胞に対して劇的な細胞変性効果をもつこと
を示している。パネルＥは希釈度2000分の１の天然型配
列の組換えS1サブユニットである。パネルＦはＢオリゴ
マーと結合して2000倍に希釈したS1/1を示す。CHO細胞
集塊作用は天然型ホロ毒素の場合と同じ程度に劇的であ
り、Ｂオリゴマーおよび組換えS1蛋白質とホロ毒素の関
連を示す物理的ゲル結果（上記）を支持するものであ
る、パネルＧはArg−Lys変異体S1/1−４自身はCHO細胞
に対して何の作用もないことを示している。パネルＨは
S1/1−４類似体とＢオリゴマーから形成したホロ毒素の
希釈度が1600分の１の時、CHO細胞の集塊が無いことを
示している。希釈度200分の１（パネルＪ）でS1/1−４
含有ホロ毒素のある程度の集塊が見られるが、類似体S1
種が集塊作用に与える影響は、同じ希釈度のＢオリゴマ
ーに比較して無視し得るものであると考えられる（パネ
ルＩ）。
特に興味がもたれるのはS1/1−４類似体に関連するパネ
ルG,H,Jの結果である。S1/1−４類似体単独とS1/1−４
類似体およびＢオリゴマーから形成したホロ毒素の1600
倍希釈液が細胞集塊が無いことを示しているのに対し、
200倍希釈液は相当量の集塊を示している。パネルＡは2
00倍緩衝希釈液のみで処理した細胞である。パネルＢは
200分の１の希釈度のＢオリゴマーのみを用いての処理
である。この希釈度ではある程度の集塊が認められる
が、これは精製後に残留する天然型S1サブユニットの汚
染によるものである。パネルＢは同一の穴（パネルＩ）
の別の領域と比較することが可能であり、希釈度200倍
のＢオリゴマー標品の集塊作用があることを明確に示し
ている。パネルＣは希釈度200分の１の市販の天然型S1
サブユニット（List Biologicals）で処理した細胞であ
る。パネルＤは希釈度2000分の１の市販の天然型百日咳
ホロ毒素（List Biologicals）であり、百日咳毒素が培
地内のCHO細胞に対して劇的な細胞変性効果をもつこと
を示している。パネルＥは希釈度2000分の１の天然型配
列の組換えS1サブユニットである。パネルＦはＢオリゴ
マーと結合して2000倍に希釈したS1/1を示す。CHO細胞
集塊作用は天然型ホロ毒素の場合と同じ程度に劇的であ
り、Ｂオリゴマーおよび組換えS1蛋白質とホロ毒素の関
連を示す物理的ゲル結果（上記）を支持するものであ
る、パネルＧはArg−Lys変異体S1/1−４自身はCHO細胞
に対して何の作用もないことを示している。パネルＨは
S1/1−４類似体とＢオリゴマーから形成したホロ毒素の
希釈度が1600分の１の時、CHO細胞の集塊が無いことを
示している。希釈度200分の１（パネルＪ）でS1/1−４
含有ホロ毒素のある程度の集塊が見られるが、類似体S1
種が集塊作用に与える影響は、同じ希釈度のＢオリゴマ
ーに比較して無視し得るものであると考えられる（パネ
ルＩ）。
初期の実験は、CHO細胞の集塊現象を引出すために必
要な各種百日咳毒素種の有効濃度を定量するために行な
われて来た。これまでの結果から、市販の百日咳毒素も
組換えS1/1を含むホロ毒素も0.25〜0.30ng/ml程度の低
濃度で細胞集塊（cell clustering）を生じのに対し、S
1/1−４類似対を含むホロ毒素は、集塊作用を引出すの
に少なくとも10〜25ng/mlの濃度を要することが明らか
になった。
要な各種百日咳毒素種の有効濃度を定量するために行な
われて来た。これまでの結果から、市販の百日咳毒素も
組換えS1/1を含むホロ毒素も0.25〜0.30ng/ml程度の低
濃度で細胞集塊（cell clustering）を生じのに対し、S
1/1−４類似対を含むホロ毒素は、集塊作用を引出すの
に少なくとも10〜25ng/mlの濃度を要することが明らか
になった。
これらの結果は、百日咳濃度の細胞特性作用がそのS1
サブユニットの一部分の中に存在し、その酵素作用と直
接関係することを確認するものである。さらに重要なこ
ととして、これらの実験から、部位特異的突然変異誘発
によって誘導された特定の組換え毒素サブユニットか
ら、比較的毒性の低い百日咳毒素分子を形成することが
できる。
サブユニットの一部分の中に存在し、その酵素作用と直
接関係することを確認するものである。さらに重要なこ
ととして、これらの実験から、部位特異的突然変異誘発
によって誘導された特定の組換え毒素サブユニットか
ら、比較的毒性の低い百日咳毒素分子を形成することが
できる。
本発明は、特許請求の範囲に記載の本発明の範囲に含
まれる変更および変形の全てを包含するものとする。
まれる変更および変形の全てを包含するものとする。
図面の簡単な説明 図１はPTXオペロンのシストロン順位を模式的に説明
したものである（従来の技術,Locht及びKeith,上記）。
S1,S2,S4,S5及びS3を示す領域はこれらのPTXサブユニッ
トの各々に関して提案された開放読み枠を示している。
各シストロン直前に充填領域は推定上のシグナル配列を
示す。各シストロン要素のすぐ下流の制限酵素部位は、
そのシストロンの発現ベクターへのサブクローニングに
用いる下流制限部位を示している。各シグナル配列領域
のすぐ内側に位置する制限酵素部位は、適当なオリゴデ
オキシヌクレオチドリンカーと共に発現ベクターへの全
身シストロンのサブクローニングに関する上流制限部位
として用いられて、そのシグナル配列を完全に含む未成
熟PTXサブユニットを産生する。各成熟PTCサブユニット
開放読み枠のすぐ内側の制限酵素部位は、適当なオリゴ
デオキシヌクレオチドリンカーとともに、そのコード換
シグナル配列を伴わずに、シストロンのサブクローニン
グに関する上流制限部位として用いられ、メチオニル−
成熟PTXサブユニットを産生する。
したものである（従来の技術,Locht及びKeith,上記）。
S1,S2,S4,S5及びS3を示す領域はこれらのPTXサブユニッ
トの各々に関して提案された開放読み枠を示している。
各シストロン直前に充填領域は推定上のシグナル配列を
示す。各シストロン要素のすぐ下流の制限酵素部位は、
そのシストロンの発現ベクターへのサブクローニングに
用いる下流制限部位を示している。各シグナル配列領域
のすぐ内側に位置する制限酵素部位は、適当なオリゴデ
オキシヌクレオチドリンカーと共に発現ベクターへの全
身シストロンのサブクローニングに関する上流制限部位
として用いられて、そのシグナル配列を完全に含む未成
熟PTXサブユニットを産生する。各成熟PTCサブユニット
開放読み枠のすぐ内側の制限酵素部位は、適当なオリゴ
デオキシヌクレオチドリンカーとともに、そのコード換
シグナル配列を伴わずに、シストロンのサブクローニン
グに関する上流制限部位として用いられ、メチオニル−
成熟PTXサブユニットを産生する。
図２は、組換えPTXサブユニットのSDS−ポリアクリル
アミドゲル及びWesternブロットである。パネルＡの左
は、測定可能量で産生された組換えPTXサブユニットのC
oomassieBrilliant Blue−染色ゲルを示す；パネルＡ
右は、ウサギのポリクローン性抗PTX過免疫血清を用い
た場合の平行ゲルのWesternブロットである。PTXは市販
等級のpertussis毒素を含有するレーンを示す。これら
の結果は、組換え（ｒ）S1,S2,S3及びS5がすべて有意量
で産生されたことを立証している。Westernブロットか
らは、rS1がそのプレ蛋白質種から完全にプロセシング
され、rS2およびrS5は一部プロセシングされ、rS3は発
酵条件下では実質的にプロセシングされないことが示さ
れている。rS4は視覚化されるほど十分量でプロセシン
グされなかった。パネルＢはメチオニル−成熟組換え
（rm）サブユニットとしての発現産物を示している。こ
れらのサブユニットは、rmS1を除いて、有意量で作製さ
れる（データ示さず）。
アミドゲル及びWesternブロットである。パネルＡの左
は、測定可能量で産生された組換えPTXサブユニットのC
oomassieBrilliant Blue−染色ゲルを示す；パネルＡ
右は、ウサギのポリクローン性抗PTX過免疫血清を用い
た場合の平行ゲルのWesternブロットである。PTXは市販
等級のpertussis毒素を含有するレーンを示す。これら
の結果は、組換え（ｒ）S1,S2,S3及びS5がすべて有意量
で産生されたことを立証している。Westernブロットか
らは、rS1がそのプレ蛋白質種から完全にプロセシング
され、rS2およびrS5は一部プロセシングされ、rS3は発
酵条件下では実質的にプロセシングされないことが示さ
れている。rS4は視覚化されるほど十分量でプロセシン
グされなかった。パネルＢはメチオニル−成熟組換え
（rm）サブユニットとしての発現産物を示している。こ
れらのサブユニットは、rmS1を除いて、有意量で作製さ
れる（データ示さず）。
図３は、rS2の発現に及ぼす上流非コード化配列の作
用を立証するWesternブロットである。図の詳細は本文
に記されている。
用を立証するWesternブロットである。図の詳細は本文
に記されている。
図４は、組換えS1のADP−リボシルトランスフェラー
ゼ活性を立証するSDS−ポリアクリルアミドゲルのオー
トラジオグラムである。組換えS1（500ng）、精製天然
型pertussis毒素（１μｇ）、及び反応緩衝液を別々
に、実質的には下記と同様に〔32P〕NAD存在下でウシト
ランスデューシンと反応させた：（Manning等,1984,J.B
iol.Chem.259:749−756;West等,1985,J85,J.Biol.Chem.
260:14428−14430）。その標本を冷却10％トリクロロ酢
酸で沈降させ、その沈渣をSDS−PAGEとその後のオート
ラジオグラフィにかけた。39Kdでの放射性バンドはリボ
シル換されたトランデェーシンサブユニットである。レ
ーンA,反応緩衝液対照；レーンB,天然PTX;レーンC,rS
1。
ゼ活性を立証するSDS−ポリアクリルアミドゲルのオー
トラジオグラムである。組換えS1（500ng）、精製天然
型pertussis毒素（１μｇ）、及び反応緩衝液を別々
に、実質的には下記と同様に〔32P〕NAD存在下でウシト
ランスデューシンと反応させた：（Manning等,1984,J.B
iol.Chem.259:749−756;West等,1985,J85,J.Biol.Chem.
260:14428−14430）。その標本を冷却10％トリクロロ酢
酸で沈降させ、その沈渣をSDS−PAGEとその後のオート
ラジオグラフィにかけた。39Kdでの放射性バンドはリボ
シル換されたトランデェーシンサブユニットである。レ
ーンA,反応緩衝液対照；レーンB,天然PTX;レーンC,rS
1。
図５は、マウスのrS1及びrS4サブユニットの免疫原性
を示すラジオイムノアッセイのグラフである。マウスは
組換えS1、メチオニルrS4、天然型pertussis毒素（PT
X）、市販pertussisワクチン、又は賦形剤（NMS）で過
免疫化された。いくつかの標本は完全Freundアジュバン
ト（CFA）を含有した。血清を収集し、その希釈液を固
相ラジオイムノアッセイにおけるそれらの抗PTX力価に
関して調べた。
を示すラジオイムノアッセイのグラフである。マウスは
組換えS1、メチオニルrS4、天然型pertussis毒素（PT
X）、市販pertussisワクチン、又は賦形剤（NMS）で過
免疫化された。いくつかの標本は完全Freundアジュバン
ト（CFA）を含有した。血清を収集し、その希釈液を固
相ラジオイムノアッセイにおけるそれらの抗PTX力価に
関して調べた。
図６は、B.pertussisによるi.c.チャレンジに対する
マウスのrS1及びrS4の免疫防御力を立証するグラフであ
る。図の詳細は本文に記されている。
マウスのrS1及びrS4の免疫防御力を立証するグラフであ
る。図の詳細は本文に記されている。
図７は、pPTX S1（6A−3/4−１）の発現から推定され
るrS1ミュータントの推定アミノ酸配列である。
るrS1ミュータントの推定アミノ酸配列である。
図8A及び8Bは、組換え類似体S1のADP−リボシルトラ
ンフェラーゼ活性及びグリコヒドロラーゼ活性のグラフ
である。
ンフェラーゼ活性及びグリコヒドロラーゼ活性のグラフ
である。
図９は、精製S1サブユニット蛋白質のSDS−ポリアク
リルアミドゲルのオートラジオグラムである。
リルアミドゲルのオートラジオグラムである。
図10は、天然型Ｂオリゴマーと組換えS1/1又は組換え
S1/1−４の組合わせからのホロ毒素のネイティブ、非還
元性、非変性ポリアクリルアミドゲルのオートラジオグ
ラムである。
S1/1−４の組合わせからのホロ毒素のネイティブ、非還
元性、非変性ポリアクリルアミドゲルのオートラジオグ
ラムである。
図11は、光学顕微鏡により細胞クラスターの存在に関
して調べた細胞単層の写真である。
して調べた細胞単層の写真である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (56)参考文献 特開 昭63−240789（ＪＰ，Ａ) 欧州公開232229（ＥＰ，Ａ１) Ｓｃｉｅｎｃｅ．1986，Ｖｏｌ．232. Ｎｏ．4755，Ｐ1258−1264 Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃ ｉ．ＵＳＡ，Ｖｏｌ．83，Ｎｏ．13 （1986）Ｐ．4631−4635 (58)調査した分野(Int.Cl.6，ＤＢ名) C12N 15/00 - 15/90 C12P 21/00 - 41/00 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)
Claims (5)
- 【請求項１】百日咳毒素のサブユニットS1のアミノ酸残
基を毒素中和レベルの抗体を誘発させる能力を維持しつ
つ百日咳毒性に関連する酵素活性をなくさせるか減少さ
せることができる他のアミノ酸残基に置換することによ
り修飾した百日咳毒素のサブユニットS1を含み、少なく
ともＮ−未端から９番目の位置のアルギニン（アルギニ
ン９）が他のアミノ酸に置換されている、百日咳ワクチ
ンの調製に使用され実質的に毒性を有しなく免疫学的に
活性なポリペプチド。 - 【請求項２】前記アルギニンがリシンに置換されている
請求項１に記載のポリペプチド。 - 【請求項３】前記置換がアルギニン残基をコードするコ
ドンの部位特異的突然変異誘発によってなされたもので
ある請求項１に記載のポリペプチド。 - 【請求項４】百日咳毒素のサブユニットS2,S3,S4及びS5
の少なくとも一つを更に含む請求項１に記載のポリペプ
チド。 - 【請求項５】請求項１ないし４のいずれかのポリペプチ
ドの有効量を含有する百日咳に対する免疫用ワクチン組
成物。
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| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US9430787A | 1987-09-04 | 1987-09-04 | |
| US23248288A | 1988-08-17 | 1988-08-17 | |
| US094,307 | 1988-08-17 | ||
| US232,482 | 1988-08-17 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH04501051A JPH04501051A (ja) | 1992-02-27 |
| JP2918895B2 true JP2918895B2 (ja) | 1999-07-12 |
Family
ID=26788722
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP63507460A Expired - Lifetime JP2918895B2 (ja) | 1987-09-04 | 1988-08-26 | 組換え型ｄｎａ由来ボルデテラ毒素サブユニット類似体 |
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| EP (2) | EP0306318B2 (ja) |
| JP (1) | JP2918895B2 (ja) |
| KR (1) | KR0168039B1 (ja) |
| CN (1) | CN1033866C (ja) |
| AT (1) | ATE125568T1 (ja) |
| CA (1) | CA1341560C (ja) |
| DE (1) | DE3854213T3 (ja) |
| DK (1) | DK175821B1 (ja) |
| ES (1) | ES2076160T5 (ja) |
| FI (1) | FI101632B (ja) |
| GR (1) | GR3017497T3 (ja) |
| IE (1) | IE69753B1 (ja) |
| IL (3) | IL103121A (ja) |
| NO (2) | NO301844B1 (ja) |
| WO (1) | WO1989001976A1 (ja) |
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|---|---|---|---|---|
| US6713072B1 (en) * | 1987-11-02 | 2004-03-30 | Chiron S.R.L. | Immunologically active polypeptides with altered toxicity useful for the preparation of an antipertussis vaccine |
| IT1223334B (it) * | 1987-11-02 | 1990-09-19 | Sclavo Spa | Polipeptidi immunologicamente attivi con una tossicita' alterata utili per la preparazione di un vaccino antipertosse |
| US5925546A (en) * | 1987-11-02 | 1999-07-20 | Chiron S.P.A. | Immunologically active polypeptides with altered toxicity useful for the preparation of an antipertussis vaccine |
| US5358868A (en) * | 1987-11-24 | 1994-10-25 | Connaught Laboratories Limited | Genetic detoxification of pertussis toxin |
| GB8727489D0 (en) * | 1987-11-24 | 1987-12-23 | Connaught Lab | Detoxification of pertussis toxin |
| US5332583A (en) * | 1987-11-24 | 1994-07-26 | Connaught Laboratories Limited | Vaccine containing genetically-detoxified pertussis holotoxin |
| US7232671B2 (en) * | 1989-02-15 | 2007-06-19 | The United States Of America As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services | Pertussis toxin gene: cloning and expression of protective antigen |
| CA2009991A1 (en) * | 1989-02-15 | 1990-08-15 | Witold Cieplak | Pertussis toxin gene: cloning and expression of protective antigen |
| ES2078258T3 (es) * | 1989-04-28 | 1995-12-16 | Sclavo Spa | Mutantes de toxina pertussica, cepas de bordetella capaces de producir tales mutantes y su uso en el desarrollo de vacunas antipertussicas. |
| US5786189A (en) * | 1989-11-29 | 1998-07-28 | Smithkline Beecham Biologicals (S.A.) | Vaccine |
| GB9326174D0 (en) * | 1993-12-22 | 1994-02-23 | Biocine Sclavo | Mucosal adjuvant |
| US20030072774A1 (en) * | 1994-06-10 | 2003-04-17 | Diane M. Gajewczyk | Proteinaceous adjuvants |
| CA2220063C (en) * | 1995-05-04 | 2003-08-26 | Connaught Laboratories Limited | Acellular pertussis vaccines and methods of preparation thereof |
| CA2253937A1 (en) * | 1996-05-10 | 1997-11-20 | Phylomed Corporation | Methods for oxidizing disulfide bonds using ozone |
| FR2754543B1 (fr) | 1996-10-11 | 1998-12-31 | Pasteur Institut | Souche de bordetella deficiente dans la production de toxine et exprimant une proteine hydride, liposomes comprenant de la fha et leurs utilisations comme vaccins, et utilisation de la fha pour stimuler les reponses immunitaires |
| US6818222B1 (en) | 1997-03-21 | 2004-11-16 | Chiron Corporation | Detoxified mutants of bacterial ADP-ribosylating toxins as parenteral adjuvants |
| US9453251B2 (en) | 2002-10-08 | 2016-09-27 | Pfenex Inc. | Expression of mammalian proteins in Pseudomonas fluorescens |
| GB0313916D0 (en) | 2003-06-16 | 2003-07-23 | Glaxosmithkline Biolog Sa | Vaccine composition |
| CA2574953A1 (en) | 2004-07-26 | 2006-02-09 | Dow Global Technolgies Inc. | Process for improved protein expression by strain engineering |
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| JP5444553B2 (ja) | 2007-04-27 | 2014-03-19 | フェネックス インコーポレイテッド | 微生物宿主を迅速にスクリーニングして、異種タンパク質発現の収率および／または質が改善されている特定の株を同定する方法 |
| US9580719B2 (en) | 2007-04-27 | 2017-02-28 | Pfenex, Inc. | Method for rapidly screening microbial hosts to identify certain strains with improved yield and/or quality in the expression of heterologous proteins |
| ITMI20090946A1 (it) | 2009-05-28 | 2010-11-29 | Novartis Ag | Espressione di proteine ricombinanti |
| BR112012024898A2 (pt) | 2010-03-30 | 2015-10-06 | Pfenex Inc | expressão de nível elevado de proteínas recombinantes de toxinas |
| US9169304B2 (en) | 2012-05-01 | 2015-10-27 | Pfenex Inc. | Process for purifying recombinant Plasmodium falciparum circumsporozoite protein |
| US20140037680A1 (en) | 2012-08-06 | 2014-02-06 | Glaxosmithkline Biologicals, S.A. | Novel method |
| SG11201500573RA (en) | 2012-08-06 | 2015-02-27 | Glaxosmithkline Biolog Sa | Method for eliciting in infants an immune response against rsv and b. pertussis |
| PE20151720A1 (es) | 2013-03-08 | 2015-12-10 | Crucell Holland Bv | Vacuna acelular contra pertussis |
| EP3030260A1 (en) | 2013-08-05 | 2016-06-15 | GlaxoSmithKline Biologicals S.A. | Combination immunogenic compositions |
| CN109172818B (zh) * | 2018-08-02 | 2021-10-22 | 浙江康佰裕生物科技有限公司 | 一种蛋白牛痘疫苗及其效力检测方法 |
| CA3115085A1 (en) * | 2018-10-15 | 2020-04-23 | Arizona Board Of Regents On Behalf Of The University Of Arizona | Vaccine polypeptide compositions and methods |
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| FR2590483B1 (fr) * | 1985-11-22 | 1988-12-09 | Pasteur Institut | Antigenes purifies ayant des proprietes vaccinantes contre b. pertussis, moyens notamment adns recombinants pour les produire et compositions de vaccins les contenant |
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-
1988
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-
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| Ｓｃｉｅｎｃｅ．１９８６，Ｖｏｌ．２３２．Ｎｏ．４７５５，Ｐ１２５８−１２６４ |
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