CN106967658B

CN106967658B - 一种提高Fab抗体表达量的方法

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Publication number: CN106967658B
Application number: CN201710099209.1A
Authority: CN
Inventors: 张守涛; 郭亚楠; 田庆南
Original assignee: Zhengzhou University
Current assignee: Zhengzhou University
Priority date: 2017-02-23
Filing date: 2017-02-23
Publication date: 2020-09-15
Anticipated expiration: 2037-02-23
Also published as: CN106967658A

Abstract

本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种基因工程中提高Fab抗体表达量的方法。该方法包括：构建重组质粒pVEGF‑Fab，制备特定的蛋白酶缺陷性细胞突变株（△pepN、△DegQ、△dcp和△pepP），转化，诱导表达Fab抗体等步骤。本申请对于宿主细胞株的改造较为特殊和新颖，所制备宿主细胞株由于特定蛋白酶缺失，可较好解除对Fab表达后抑制或降解作用，从而提高Fab表达量，因而对于特定的Fab抗体表达制备具有较好地应用价值，同时也为其他抗体蛋白表达和制备提供了较好的借鉴和参考，因而具有较好的实用价值和科研意义。

Description

一种提高Fab抗体表达量的方法

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种基因工程中提高Fab抗体表达量的方法。

背景技术

细菌细胞(例如大肠杆菌，E.coli)通常用于产生重组蛋白。细菌表达***相比真核细胞表达***具有成本低廉、大规模发酵容易、条件易于自动化控制等优点，通过大肠杆菌表达重组蛋白是一种高效、经济的途径。使用细菌细胞(例如大肠杆菌)来产生重组蛋白还有其他许多优势，特别是由于细菌细胞作为宿主细胞的通用性质允许了通过质粒的基因***。大肠杆菌被用于产生许多重组蛋白，包括人胰岛素和Fab抗体蛋白等。

Fab是IgG分子的抗原结合片段，是由Fd链与L链通过二硫键结合形成的异二聚合体。由于Fab抗体片段没有Fc段，不需要进行复杂的糖基化和翻译后修饰，所以不需要通过哺乳动物细胞***来生产。而大肠杆菌凭着自身遗传背景清楚、易于操作、生产周期短、成本低且表达量高以及表达产物易于分离纯化等优点，成为大规模制备重组抗体片段最常用的原核表达***。大肠杆菌周质空间中蛋白酶含量低、杂蛋白含量少，因此Fab在周质空间中的表达更有利于生产制备高活性的Fab抗体。

尽管使用细菌细胞来产生Fab重组蛋白有许多优势，但仍有显著的局限，这包括对蛋白酶敏感性较好地Fab蛋白。其原因在于，Fab在大肠杆菌表达中最具挑战性的问题就是4个链内和1个链间二硫键的形成，这关系到Fab分子结构和功能的完整性。一般而言，蛋白酶对于大肠杆菌周质和胞质中旧的和错误折叠的蛋白的翻换起重要作用。当细菌蛋白酶起作用时，可对重组蛋白进行降解，从而显著降低活性蛋白的产率。在大肠杆菌中，已鉴定获得了许多细菌蛋白酶，包括DegP-Q、Tsp、prlC、pepA-T、tsh、espc、eatA、clpA、clpP、ClpX、dcp、DegS、lon等等。

对于部分蛋白研究成果列举如下：

氨肽酶N(Aminopeptidase N，pepN)，蛋白分子量为99kDa，属于蛋白家族M1，在其活性中心发现锌离子。氨肽酶N在哺乳动物、昆虫、植物和细菌等多种物种中具有良好的保守性。在大肠杆菌，氨肽酶N被认为是主要的氨肽酶，它依赖ATP降解胞内蛋白。在应对营养缺陷时，氨肽酶N在蛋白降解中发挥主要作用，使降解的氨基酸成为可利用的营养物质。进一步发现，邻菲咯啉，嘌呤霉素，乌苯美司抑制等可抑制该酶活性。

大肠杆菌degQ基因，编码455个氨基酸残基的蛋白质degQ，该蛋白属于丝氨酸内肽酶家族。应激状态下，degQ的主要功能是降解大肠杆菌周质腔内聚集的大量变性和未折叠的蛋白质。degQ可高效打开Val-Xaa和Ile-Xaa间的肽键。

大肠杆菌dcp基因，编码681个氨基酸残基的蛋白质dcp，该蛋白属于C端外肽酶，在其活性中心发现锌离子。dcp酶具有广泛的特异性，可以从蛋白质及各种肽C末端切割二肽。

大肠杆菌pepP基因，编码441个氨基酸残基的蛋白质pepP，该蛋白属于N端外肽酶，在其活性中心发现锰离子。dcp酶可以从蛋白质及各种肽N末端释放任何与脯氨酸相连的氨基酸残基，包括脯氨酸。

为较好表达重组蛋白，避免大肠杆菌蛋白酶对重组蛋白的影响，通常也采用一些特定的蛋白酶缺陷型细菌菌株进行重组蛋白表达，如Lac、rec、gal、ara、arg、thi、pro等蛋白酶缺陷型菌株的应用。但是这些缺陷型菌株对于宿主细胞（大肠杆菌）的生长往往也存在一些不特定性的影响，例如：菌体细胞生长速度、稳定性、重组蛋白表达产率和毒性等影响，进而导致其失去产业化应用前景。

总之，正是由于特定菌株的缺失，及改造可能性的多样化，使得针对Fab抗体的表达而言，现有技术中尚缺少较为合适的提高其表达量的基因工程的改造方法。

发明内容

本发明通过对大肠杆菌基因组进行改造，目的在于提供一种能够较好提高Fab抗体蛋白表达量的Fab抗体的制备方法，从而为相关疾病的研究及治疗奠定基础。

本申请所采取的技术方案详述如下。

一种提高Fab抗体表达量的方法，包括如下步骤：

（1）按照现行常规转基因操作方法，构建重组质粒pVEGF-Fab；构建重组质粒时，例如利用pETDuet-1质粒进行双表达载体构建，由于pETDuet-1质粒具有两个独立启动子，因而对Fab抗体的编码基因进行了适当优化，基因优化原则为：

在Fab编码基因的轻链和重链Fd的N端各加上一个独立的来自革兰氏阴性菌周质引导肽序列，具体而言：

轻链之前添加OmpA氨基酸序列：KKTAIAIAVALAGFATVAQA；

在重链Fd段之前添加OmpA氨基酸序列：KKTAIAIAVALAGFATVAQA；

（2）制备特定的重组大肠杆菌表达菌株，具体过程为：

首先，人工合成pepN、DegQ、dcp和pepP的整合盒，与pKO3质粒进行连接，分别构建重组质粒pKO3-pepN、pKO3-DegQ、pKO3-dcp和pKO3-pepP；

所构建的重组质粒pKO3-pepN中，含有如SEQ ID NO.1所示的敲除突变的pepN基因，重组质粒中含有ApaI限制性标记物；

所构建的重组质粒pKO3-DegQ中，含有如SEQ ID NO.2所示的敲除突变的DegQ基因，重组质粒中含有ApaI限制性标记物；

所构建的重组质粒pKO3-dcp中，含有如SEQ ID NO.3所示的敲除突变的dcp基因，重组质粒中含有ApaI限制性标记物；

所构建的重组质粒pKO3-pepP中，含有如SEQ ID NO.4所示的敲除突变的pepP基因，重组质粒中含有ApaI限制性标记物；

其次，将所构建重组质粒pKO3-pepN、pKO3-DegQ、pKO3-dcp和pKO3-pepP同时转化到大肠杆菌感受态细胞中，并进行筛选，获得蛋白酶缺陷性细胞突变株（△pepN、△DegQ、△dcp和△pepP）；

所述大肠杆菌为K-12菌株家族，具体例如：

W3110(F-λ-rph-1 INV(rrnD,rrnE)ilvG（ATCC27325），

MG1655(F-λ-ilvG-rfb-50 rph-1)（ATCC700926），

W3101(F-λ-ilvG-IN(rrnD-rrnE)1 rph-1 galT22)等；

优选地，使用野生型W3110菌株，即，K-12 W 3110；

（3）将步骤（1）所构建的重组质粒pVEGF-Fab转化到步骤（2）所改造制备的化学感受态的蛋白酶缺陷性细胞突变株（△pepN、△DegQ、△dcp和△pepP）中，进一步进行诱导表达即可。

总体而言，本申请中相关基因工程操作技术较为成熟，但是对于宿主细胞株的改造较为特殊和新颖，所制备宿主细胞株由于特定蛋白酶缺失，可较好解除对Fab表达后抑制或降解作用，从而提高Fab表达量，因而对于特定的Fab抗体表达制备具有较好地应用价值，同时也为其他抗体蛋白表达和制备提供了较好的借鉴和参考，因而具有较好的实用价值和科研意义。

附图说明

图1为W3110 突变株（pepN、DegQ、dcp和pepP）与野生型W3110相比的生长情况；诱导Fab表达时，与野生型相比，基因突变后的突变株的生长没有显著影响；

图2为W3110 突变株（pepN、DegQ、dcp和pepP）与野生型W3110相比的Fab表达情况；与野生型相比，突变株显著提高了Fab的表达水平；

图3为W3110 突变株（pepN、DegQ、dcp和pepP）与野生型W3110相比的生长情况；与野生型相比，基因的突变对突变株的生长没有显著影响。

具体实施方式

下面结合实施例对本申请做进一步的解释说明，在介绍具体实施例前，就下述实施例中涉及部分生物材料、实验试剂、实验设备等情况简要介绍说明如下。

生物材料：

野生型大肠杆菌W3110，购自ATCC（货号ATCC27325）；

pKO3质粒购自BioVector质粒载体菌种细胞基因保藏中心（货号Biovector-pKO3）；

相关基因、引物序列等合成及测序由金维智生物(北京)公司合成提供；

实验试剂：

限制性内切酶SalI、NotI、Nde 1、 Xho 1、Nco1、Hind III和ApaI购自NEB(北京)；

IPTG、蔗糖、氯霉素、琼脂糖、TMB等常用分子生物学试剂购自康为生物(北京)公司；

兔抗人CH1、兔抗人k偶联HRP等抗体购自Thermo Fisher中国

实施例1

本申请所提供提高Fab抗体表达量的方法，主要依赖于对大肠杆菌的改造实现的。本实施例以原始宿主细胞株大肠杆菌W3110（W3110(F-l-rph-1 INV(rrnD,rrnE)ilvG）为例，就突变体细胞株W3110（△pepN、△DegQ、△dcp和△pepP）的制备过程简要介绍如下。

（1）分别构建重组质粒pKO3-pepN、pKO3-DegQ、pKO3-dcp和pKO3-pepP

分别将人工合成pepN、DegQ、dcp和pepP的整合盒（重整后基因序列）进行SalI、NotI双酶切，同时对pKO3质粒进行SalI、NotI双酶切，然后将酶切产物进行连接，分别构建重组质粒pKO3-pepN、pKO3-DegQ、pKO3-dcp和pKO3-pepP；

需要解释的是，选择pKO3质粒的原因主要有三点：一是，pKO3质粒使用pSC101的温度敏感型突变体的复制起点（RepA）以及氯霉素标记物，可以加强和选择染色体整合事件；二是，编码果聚糖蔗糖酶的sacB基因对生长于蔗糖上的大肠杆菌是致死的，因此（与氯霉素标记物及pSC101起点相同）可用于加强并选择去整合以及质粒消除；三是，除了***的基因之外，pKOS***可将所有选择性标记物从宿主基因组移除。

所构建的重组质粒pKO3-pepP中，含有如SEQ ID NO.4所示的敲除突变的pepP基因，重组质粒中含有ApaI限制性标记物。

（2）重组质粒的转化、筛选，具体而言，将步骤（1）中的连接产物（即所构建的重组质粒）转化到化学感受态的大肠杆菌W3110细胞（野生型细胞）中，并进一步筛选获得突变株，具体过程简要介绍如下。

第1天，将40μL的大肠杆菌细胞与pKO3 重组质粒（四种质粒等比例混合）在冷的BioRad 0.2cm电穿孔皿中混合，然后在2500V、5uF和200Ω下进行电穿孔；

立即加入1000μL的2×PY，培养箱中，30℃、250rpm培养1小时；

在2×PY中以1/10系列稀释培养液，然后将100μL的等分试样涂板在2×PY琼脂板上（含20μg/mL的氯霉素），分别在30℃和43℃进行预热，并孵育过夜。

第2天，以30℃下生长的菌落数目对电穿孔效率进行估量，以43℃下生长时存活的菌落代表潜在的整合事件；

挑取来自43℃平板的单菌落并将其重悬于10mL的2×PY中；将其中的100μL涂板在2×PY脂板上（含有5%（w/v）的蔗糖），预热至30℃时，将产生单菌落的平板孵育过夜。

第3天，进一步进行筛选，筛选后所保留的单菌落代表潜在的同时去整合和质粒愈合事件；如果去整合和愈合事件在生长早期发生，则菌落集合的大部分将是克隆性的；

挑取单菌落并复制涂板在2×PY琼脂上（含有20μg/mL的氯霉素或5%（w/v）蔗糖，30℃下过夜孵育平板。

第4天，在蔗糖上生长且在氯霉素上死亡的菌落代表潜在的染色体替换和质粒愈合事件，挑取阳性克隆进行PCR鉴定，对鉴定正确的阳性菌落在含有5%（w/v）蔗糖的2×PY琼脂上平板上30℃过夜孵育。

第5天，对PCR鉴定正确的、氯霉素敏感和蔗糖抗性的大肠杆菌阳性重组菌落，进一步进行测序鉴定，确保所构建的重组大肠杆菌改造正确，并作为感受态细胞保存备用。

PCR鉴定时，对突变细胞株W3110（△pepN、△DegQ、△dcp和△pepP）是否携带有正确的突变基因组的检测，是以PCR扩增产物中是否存在非天然存在的ApaI限制性位点为检测目标的，PCR检测鉴定时，引物序列设计如下：

pepN For：5'-CGAATTGTGTCATAGGTGCGCAGTA-3'，

pepN Rev：5'-GGCTTTACCGTACTGTTGGTGACGCA-3'；

DegQ For：5'-TACTGGATACCATGGCGCACGACTAT-3'，

DegQ Rev：5'-CGGCGTCGTTGATGACGTGTTTATT-3'；

dcp For：5'-CGCACCGTAAACGTTACCACCGGCATA-3'，

dcp Rev：5'-TCGCAGTCGCCAGCAAAATGCATAA-3'；

pepP For：5'-AAGCTGGATAAAGTGACCGGCGAAA-3'，

pepP Rev：5'-TCTGGCGCAGTCGCTTCAATCAAA-3'；

PCR扩增时，以细胞裂解物（95℃、在1xPCR缓冲液中将细胞单菌落加热10分钟，却至室温后，13200rpm离心10分钟，沉淀物即为细胞裂解物）作为扩增模板；

50μL扩增体系设计如下：

缓冲液x10（Roche），5μL；

dNTP混合（Roche,10mM混合），1μL；

5'寡核苷酸（5pmol），1.5μL；

3'寡核苷酸（5pmol），1.5μL；

细胞裂解物，2μL；

Taq DNA聚合酶（Roche 5U/μL），0.5μL；

超纯水H₂O，38.5μL；

PCR反应程序为：94℃、1分钟；94℃、1分钟，55℃、1分钟，72℃、1分钟，30个循环；72℃、10分钟。

反应完成后，取25μL的PCR反应液移至新的微量离心管中，加入19μL的H₂O、5μL的缓冲液3（NEB），1μL的ApaI（Fermentas，混合均匀并在37℃下孵育2小时，以对ApaI进行消化。

同时，将其余PCR反应液中加入5μL加样缓冲液（×6），取20μL加载到加有嗅乙啶（5μL的10mg/mL储液）的0.8% TAE 200mL琼脂糖凝胶（Invitrogen）上，100V电泳1小时；电泳时，将10μL大小标记物（Perfect DNA marker 0.1~12kb，Novagen）加载到最后一道电泳槽中。

ApaI消化完成后溶液中，加入加样缓冲液（x6），同样进行电泳分析。

将电泳后凝胶使用UV透光发光器（transluminator）进行观察。

电泳检测结果表明，所有经扩增的基因组片段都显示出下列正确大小的带：3157pb（对于pepN），2130bp（对于DegQ）和2761kb（对于dcp）1677(对于pepP)。

进一步地，ApaI消化后，电泳结果证实了在蛋白酶缺陷性菌株中存在引入的ApaI位点，而W3110对照中没有。使用pepN引物组所扩增基因组DNA，用ApaI消化所产生的DNA可以产生2591和517bps的带。使用DegQ引物组扩增基因组DNA，用ApaI消化所产生的DNA可以产生1649和481bps的带。使用dcp引物组扩增基因组DNA，用ApaI消化所产生的DNA可以产生2051和708bps的带。使用pepP引物组扩增基因组DNA，用ApaI消化所产生的DNA可以产生1677和288bps的带。

实施例2

按照现行常规转基因操作方法，构建重组质粒pVEGF-Fab，以用于Fab抗体的表达。

由于需要选用具有两个独立启动子的pETDuet-1作为表达载体进行双基因共表达，因而需对Fab的编码基因进行适当优化，基因优化原则为：

轻链之前添加OmpA氨基酸序列：KKTAIAIAVALAGFATVAQA，根据大肠杆菌原核表达***进行密码子优化之后通过固相亚磷酞胺三酷法合成轻链DNA全长，利用5’Nde 1和3'Xho 1***于第一个启动子之后；

在重链Fd段之前添加OmpA氨基酸序列：KKTAIAIAVALAGFATVAQA，根据大肠杆菌原核表达***进行密码子优化之后通过固相亚磷酞胺三酷法合成重链Fd DNA全长利用5'端Nco1和3'端Hind III酶切位点***于第二个启动子之后；

将所构建的重组质粒pVEGF-Fab转化到实施例1所改造制备的化学感受态的蛋白酶缺陷性细胞突变株W3110（△pepN、△DegQ、△dcp和△pepP）中（具体操作过程可参考《分子克隆实验指南》J.萨姆布鲁克，D.W.拉塞尔著；黄培堂等译，不再赘述）。

实施例3

挑取实施例2中转化后的阳性单菌落，加到含有10μg/mL四环素的5mL的 2×PY(1%植物蛋白胨，0.5%酵母提取物，0.5%NaCl)培养液中，37℃、250rpm摇动培养过夜；

将100μL过夜培养物接种于200mL加有四环素（10μg/mL）的SM6E培养基中，30℃、250rpm摇动培养过夜；重复此步骤一次，直至培养至OD₆₀₀约为2，然后直接应用或长期保存备用（长期保存程序为：离心，收集细胞，然后将细胞重悬在100mL的SM6E中，以12.5%的终浓度加入甘油，-80℃存储）

取2mL培养物，加入到200mL含有10μg/mL四环素的SM6E培养基中，30℃、250rpm摇动培养至OD₆₀₀约为2。

加入IPTG至终浓度为200μM，以诱导重组蛋白的产生。分别在加入IPTG后的1、2、4、6、12、和24h时，取样测定分析细菌的生长及蛋白的表达。

分析细菌的生长，在上述取样时间取0.5mL培养物样品记录OD₆₀₀值，然后相对于时间（小时）对OD₆₀₀作图，结果见图1。

图1结果显示：诱导Fab表达时，与野生型W3110相比，突变pepN、DegQ、dcp和pepP等基因对W3110突变株的生长没有显著影响。

测定蛋白的表达时，取1mL培养物样品，12000rpm离心5分钟后，将细胞粒状沉淀重悬于200μL周质提取缓冲液（100mM Tris.HCl/10mM EDTA pH7.4）中；

30℃下以250rpm摇动过夜释放周质蛋白；

次日，将所述提取物，12000rpm离心10分钟，保存上清液，直接检测或存储在-20℃作为‘周质提取物’；丢弃剩余的细胞粒状沉淀。

采用ELISA法对重组蛋白表达量进行定量分析，具体过程为：

用含2μg/mL捕获抗体（兔抗人CH1）的PBS涂覆96孔ELISA，4℃过夜；

用300μL的样品/缀合物缓冲液（PBS，0.2% BSA，0.1% Tween 20）清洗3次；

在100μL的样品/缀合物缓冲液中，在平板上对样品和标准进行系列的1/2稀释，在室温下以250rpm将平板摇动1小时；

用300μL清洗缓冲液(PBS，0.1% Tween 20)清洗3次后，加入100μL显示抗体(兔抗人Κ偶联HRP，1/1000稀释)；然后在室温下以250rpm摇动平板1小时；

用300μL清洗缓冲液清洗3次后，加入100 μL的TMB底物液并使用酶标仪记录OD₆₃₀；通过与标准进行比较，进而计算周质提取物中的Fab浓度。

结果见图2。图2结果表明诱导Fab表达时，与野生型W3110相比，使用突变株W3110mutants（△pepN、△DegQ、△dcp和△pepP）显著提高Fab的表达。

实施例4

通过摇瓶实验，发明人同时对转化后的大肠杆菌突变株W3110（△pepN、△DegQ、△dcp和△pepP）的生长情况进行了检测，相关实验简要介绍如下。

将单菌落挑取到5mL的LB培养液（每升培养液中，10g胰蛋白陈，5g酵母提取物，10gNaC）中，37℃、250rpm摇动过夜培养；进一步转接至75mL的LB培养液中培养至OD₆₀₀=0.1左右；然后37℃、250rpm摇动培养，每小时取出0.2mL培养样品并记录OD₆₀₀值，相对时间（小时）对OD₆₀₀作图，结果如图3所示。在摇瓶实验中，与野生型W3110相比，突变pepN、DegQ、dcp和pepP等基因对W3110突变株的生长没有显著影响。

SEQUENCE LISTING

<110> 郑州大学

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caggctgtcc gtcatggtgc atcagatgct ccccttcgtc tcaacggcga agacctcaaa 180

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cagtctggct ccaatgctgg aaaaagtgct tccggcagtg gtgagcgtac gggtggaagg 180

aacggccagt cagggacaga aaatcccgga agaattcaaa aagttttttg gtgatgattt 240

accggatcaa cctgcacaac ccttcgaagg tttaggctcc ggtgtcatca tcaacgccag 300

taaaggctat gtgctgacca acaaccatgt gattaatcag gcacagaaaa tcagtattca 360

gctcaatgat gggcgcgagt ttgatgcaaa actgattggt agcgatgacc agagcgatat 420

cgccctgtta caaattcaaa acccgagcaa attaacgcaa atcgctattg ccgactccga 480

taaattgcgc gtcggtgatt ttgccgtagc ggtcggtaac ccatttggcc ttgggcaaac 540

cgccacctct ggcattgttt ccgcattagg ccgcagcggg ttgaatcttg aaggtctgga 600

aaactttatc cagacagatg cttccattaa ccgcggtaac tccggcggtg cactattaaa 660

ccttaacggt gagttaattg gcatcaacac tgcaatcctt gcgcctggcg gcgggagcgt 720

cgggattgga tttgccatcc ccagtaatat ggcgcgaaca ctggcgcagc agcttatcga 780

ctttggtgaa atcaaacgcg gtttgttagg catcaaaggc accgagatga gtgccgatat 840

cgccaaagcc ttcaaccttg acgtgcagcg tggcgcgttt gtcagcgaag tgttgccagg 900

ttctggctcg gcaaaagcgg gcgtcaaagc gggcgatatt attaccagcc tcaacggcaa 960

accgctgaat agctttgctg agttgcgctc tcgtatcgcg accaccgagc cgggcacgaa 1020

agtgaagctt ggcctgctgc gtaacggcaa accactggaa gtagaagtga cgctcgatac 1080

cagcacctct tcgtcggcca gcgctgaaat gatcacgcca gcgctggaag gtgcaacgtt 1140

gagcgatggt cagctaaaag atggcggcaa aggtattaaa atcgatgaag ttgtcaaagg 1200

aagcccagct gctcaggctg gcttgcaaaa agacgatgtg atcattggcg tcaaccgcga 1260

tcgggtgaac tcgattgctg aaatgcgtaa agtgctggcg gcaaaaccgg ccatcatcgc 1320

cctgcaaatt gtacgcggca atgaaagcat ctatctgctg atgcgttaa 1369

<210> 3

<211> 2049

<212> DNA

<213> Escherichia coli

<400> 3

atgacaacaa tgtaatcctt tccttgtgca aagcacactg ccgtatctgg ctccccattt 60

tgatcaaatt gccaatcatc actatcgccc ggcattcgat gagggaatgc agcaaaagcg 120

ggcccagaaa ttgctgccat cgcgcttaac ccgcaaatgc ctgatttcaa caatactatt 180

ctggcactgg aacaaagcgg agaattactt acccgcgtta ccagcgtctt ttttgcgatg 240

actgcggcgc ataccaatga tgaattacag cgtcttgacg agcagttttc cgctgaactg 300

gcggaactgg ctaatgatat ctatctgaac ggtgaattat tcgcgcgggt agatgctgtc 360

tggcagcgcc gtgaatccct ggggcttgat agtgaatcca tccgcctggt ggaggtgatt 420

catcaacgtt ttgtccttgc cggagccaaa cttgcgcaag ctgataaagc aaaattaaaa 480

gtactgaata cagaagctgc gaccctgacc agccagttta accagcgatt actggcagca 540

aataaatccg gcggtctggt tgtgaacgat atcgcgcagc tggcaggaat gagtgagcaa 600

gagattgcgc tggcggcaga ggcggctcgc gagaaaggtc tggataacaa atggctgatt 660

ccgctgctga ataccaccca acaaccggcg cttgccgaaa tgcgcgatcg tgcgacgcgt 720

gaaaaactgt ttattgcggg ctggacgcga gcggaaaaaa atgatgccaa tgatacccgc 780

gctatcattc aacgtctggt ggagatccgt gcacaacagg caacactact tggttttcct 840

cattatgccg catggaaaat cgccgatcag atggcaaaaa cacctgaagc agcacttaac 900

tttatgcggg aaattgttcc agcggcgcgt caacgtgcga gcgatgaatt agcctccata 960

caggcggtta tcgataagca gcagggcggg tttagcgcgc agccgtggga ctgggcattt 1020

tatgcggaac aggtacggcg ggagaaattt gatcttgatg aggcgcagct caagccatat 1080

tttgaattaa acacggtgtt aaatgaaggt gtattctgga ccgcgaatca gctcttcggt 1140

attaagtttg tcgaacgttt tgatattcct gtctaccatc ctgacgttcg tgtgtgggaa 1200

atttttgatc ataatggcgt ggggctggcg ttattttacg gtgatttctt cgcccgtgat 1260

tcaaaaagcg gcggtgcatg gatgggcaat tttgttgagc aatcaacgct taataaaaca 1320

catccggtaa tttataacgt ctgcaattat cagaaacccg ctgccggtga gcctgcgttg 1380

ttactctggg atgatgtcat aaccttattc catgaatttg gtcatacgct gcacggcctt 1440

tttgcccgcc agcgttatgc cacgctttcc ggcaccaaca cgccgcgtga ttttgtcgaa 1500

tttccgtcgc aaatcaacga acactgggca acgcatccgc aggtattcgc tcgctacgcc 1560

cggcattatc agagcggggc agcaatgcct gacgaactgc aacagaaaat gcgtaatgcc 1620

agcctgttca acaaagggta tgagatgagc gaactgctta gcgccgcact tctcgatatg 1680

cgctggcatt gcctggaaga aaacgaagca atgcaggatg tcgatgattt tgaattgcgg 1740

gcgctggtgg cggaaaatat ggatcttcct gctataccgc cacgctatcg cagcagttat 1800

ttcgcccata tttttggtgg cggatatgct gcaggttatt acgcttatct gtggacgcaa 1860

atgttggccg atgatggtta tcagtggttt gttgagcagg gcggattaac gcgtgaaaat 1920

gggctgcgtt ttcgcgaggc gatcctttcc agaggtaaca gcgaagatct ggaacgcctg 1980

tatcgacaat ggcgcggtaa ggcacctaag attatgccga tgctgcaaca tcgtggcttg 2040

aacatataa 2049

<210> 4

<211> 1327

<212> DNA

<213> Escherichia coli

<400> 4

atgagtgaga tatcccggta agagtttcag cgtcgccgtc agggccctgg tggagcaaat 60

gcaacccggc agcgccgcgc tgatttttgc tgcaccagaa gtaacacgta gcgccgacag 120

cgaatacccc tatcgtcaga acagtgactt ctggtacttc accggcttta acgaaccgga 180

agcggtgctg gtgctgatta aaagcgatga cactcataac cacagcgttc tgtttaaccg 240

cgttcgcgac ctgacggcgg agatctggtt tggccgtcgc ttaggccagg atgccgcgcc 300

agagaaactg ggcgttgacc gcgcactggc attcagcgaa atcaatcagc aactttatca 360

actacttaac ggcctggatg tggtttacca tgcccagggc gaatatgcat atgctgatgt 420

aatcgtgaac agtgcgctgg aaaaactgcg taaaggttcg cggcaaaatc tcaccgcacc 480

ggcaacgatg atcgactggc gtcctgttgt tcatgaaatg cgcctgttca aatcgccaga 540

agagattgcc gtactccgcc gcgcgggaga aatcaccgcc atggcacata cacgggcgat 600

ggaaaaatgc cgtccgggaa tgttcgagta ccatctggaa ggcgaaattc accacgaatt 660

taaccgccac ggtgcgcgct atccgtccta taacaccatt gtcggcagcg gtgaaaacgg 720

ctgcattctg cactacaccg aaaacgagtg tgaaatgcgc gacggcgacc tggtgttgat 780

tgacgcgggt tgtgaataca aaggttacgc tggcgatatt acccgcacct tcccggtcaa 840

cggcaaattc acccaggccc agcgtgaaat ctacgacatt gtgctggagt ctctcgaaac 900

cagcctgcgc ctgtatcgtc cgggaacttc cattctggaa gtcactggtg aagtggtgcg 960

catcatggtt agcggcctgg taaaactcgg catcctgaaa ggtgatgttg atgaactgat 1020

cgctcagaac gcccatcgtc ctttctttat gcatggcctt agccactggt taggactgga 1080

tgtccatgac gtgggtgttt atggtcagga tcgctcgcgc attctggaac cgggcatggt 1140

actgaccgta gagccagggc tgtatattgc gccggatgca gaagtgccag aacaatatcg 1200

cggtatcggc attcgtattg aagacgacat tgtgattacc gaaaccggta acgaaaacct 1260

caccgccagc gtggtgaaaa agccggaaga aatcgaagcg ttgatggttg ctgcgagaaa 1320

gcaatga 1327

Claims

1.一种提高Fab抗体表达量的方法，其特征在于，该方法包括如下步骤：

（1）按照现行常规转基因操作方法，构建重组质粒pVEGF-Fab；

（2）制备特定的重组大肠杆菌表达菌株，具体过程为：

所构建的重组质粒pKO3-pepN中，含有如SEQ ID NO.1所示的敲除突变的pepN基因；

所构建的重组质粒pKO3-DegQ中，含有如SEQ ID NO.2所示的敲除突变的DegQ基因；

所构建的重组质粒pKO3-dcp中，含有如SEQ ID NO.3所示的敲除突变的dcp基因；

所构建的重组质粒pKO3-pepP中，含有如SEQ ID NO.4所示的敲除突变的pepP基因；

其次，将所构建重组质粒pKO3-pepN、pKO3-DegQ、pKO3-dcp和pKO3-pepP同时转化到大肠杆菌感受态细胞中，并进行筛选，获得pepN、DegQ、dcp和pepP基因缺陷细胞突变株；

（3）将步骤（1）所构建的重组质粒pVEGF-Fab转化到步骤（2）所改造制备的化学感受态的pepN、DegQ、dcp和pepP基因缺陷细胞突变株中，进一步进行诱导表达Fab抗体。

2.如权利要求1所述提高Fab抗体表达量的方法，其特征在于，步骤（2）中，所述大肠杆菌为K-12菌株家族。

3.如权利要求2所述提高Fab抗体表达量的方法，其特征在于，所述大肠杆菌菌株为W3110、MG1655或W3101。

4.如权利要求1所述提高Fab抗体表达量的方法，其特征在于，步骤（1）中，利用pETDuet-1质粒进行重组质粒的构建。

5.如权利要求4所述提高Fab抗体表达量的方法，其特征在于，步骤（1）中，对Fab抗体的编码基因进行了优化，基因优化方式为：

轻链之前添加OmpA氨基酸编码序列；

在重链Fd段之前添加OmpA氨基酸编码序列。