JP2002502255A - 高活性フィターゼ粒状物 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 アスペルギルスまたはトリコデルマ属の微生物を同化可能な炭素および窒素源（例えば、グルコースおよびアンモニウムイオン）を含有する培地中で培養し、培地を濾過し、得られた濾液を限外濾過に付して、少なくとも１４，０００ＦＴＵ／ｇを有する水性組成物を得ることを含む、水性フィターゼ含有液の製法を開示する。該水性液体は、動物飼料中に混合できる粒状物の調製に使用できる。

Description

【発明の詳細な説明】 高活性フィターゼ粒状物 発明の分野 本発明は、フィターゼ酵素の調製および処方ならびに動物飼料における飼料酵 素用の粒状物の調製におけるそれらの使用に関する。 発明の背景 動物、例えば、家畜の飼料におけるフィターゼのような種々の酵素の使用は、 より一般的になっている。これらの酵素は、動物による飼料からの栄養またはミ ネラルの取り込みを改善するために包含され、また、それらは消化を助ける。そ れらは、通常、産業上の酵素生産者によって行われる大規模な発酵槽における微 生物の培養によって生産される。発酵の最後に得られる「ブイヨン」を、通常、 一連の濾過段階に付して、バイオマス（微生物）を所望の酵素（溶液中）から分 離する。次いで、酵素溶液は、液体として販売されるか（しばしば、種々の安定 化剤の添加後に）、または乾燥製剤に加工処理する。 酵素液および乾燥製剤は、動物飼料産業によって商業的規模で使用される。ペ レット成形工程の間に起こるであろう酵素の熱不活性化を回避するために、ペレ ット成形後に液体製剤を飼料に加えてもよい。 乾燥製剤は、通常、飼料をペレット成形前に蒸気注入に付す蒸気ペレット成形 を含む。続くぺレット成形段階において、飼料をマトリックスまたはダイに押し 通し、得られた細片を種々の長さの適当なペレットに切断する。該工程の間、温 度は６０−９５℃に上昇し得る。 フィターゼは、（少なくとも部分的に）フィチン酸塩（リン酸ｍｙｏ−イノシ トールヘキサキス）をｍｙｏ−イノシトールおよび無機リン酸塩に加水分解する 酵素である。これらの酵素は、小麦ふすま、植物のシード、動物の腸に見られ、 微生物によって生産できる。フィターゼは、フィチン酸塩を分解でき、リンおよ び他の栄養成分の動物に対する有効性を増大できるので、それらは動物飼料に提 供される。また、フィターゼはカルシウムの消化を増進できる。 リンは、生物の成長のための必須元素である。家畜の場合、しばしば飼料は、 単胃動物をよく成長させるために無機リンで補われる。しかしながら、ルーメン に存在する微生物がフィチン酸塩のイノシトールおよび無機リン酸塩への変換を 触媒する酵素を生産するので、反芻動物の飼料においてはその必要はない。カル シウム、亜鉛、マグネシウムおよび鉄のような有用なミネラルをキレート化する ので、フィチン酸は反栄養的であり、また、タンパク質と逆効果に反応して、そ れにより動物に対するそれらの生物学的利用能を減少させることから、フィチン 酸塩の分解は、しばしば、望ましい。また、フィターゼの添加は、添加される必 要がある無機飼料の量を減少させ、それゆえ、ほとんどリンが***物中に排出さ れず、環境により良い。 種々のフィターゼ酵素の遺伝子がクローン化され、発現されてきた。ＥＰ−Ａ −０，４２０，３５８（Gist-Brocades）は、微生物フィターゼの発現を記載し ている。 後の出願ＥＰ−Ａ−０，６８４，３１３（Hoffmann-La Roche）は、フィター ゼ活性を有する種々のポリヌクレオチドをコードするＤＮＡ配列を記載している 。 ＥＰ−Ａ−０，７５８，０１８（Gist-Brocades）は、特に動物飼料としての 使用のために、酵素の安定性を改善する方法およびフィターゼを言及している。 ＷＯ−Ａ−９４／０３６１２（Alko）は、トリコデルマ（Trichoderma）にお けるフィチン酸塩分解酵素の生産を記載し、一方、ＷＯ−Ａ−９７／１６０７６ （Novo Nordisk）は、種々の疎水性物質を含む動物飼料の製造において使用する ための酵素含有調製物を記載している。 動物飼料は、家畜および他の動物を維持するのに被る最も大きなコストの１つ である。さらに、フィターゼのような酵素等の添加物は、動物飼料のコストをか なり大きくする。本発明の１の目的は、生産の費用がより安いフィターゼ組成物 を提供できることにある。これは、高活性または高濃度のフィターゼ組成物を製 造できることにより、達成できる。本発明者らにこれらの高活性組成物を製造で きるようにしたいくつかの因子が存在し、これらを後記に検討する。 発明者らによって記載された高活性フィターゼ組成物を製造できることにおけ る付加的な利益は、これらの組成物が特に動物飼料（ペレット）の調製における ペレット成形工程の間、安定性における著しい増加を示し、それゆえ、先行技術 の組成物より高いフィターゼ活性を長時間保持する可能性があることである。 発明の記載 本発明の第１の態様において、（ａ）微生物のための栄養として同化可能な炭 素源および同化可能な窒素源を含む水性培地中、グルコアミラーゼ（アスペルギ ルス（Aspergillus）の場合）またはセロビオヒドロラーゼ（トリコデルマ（Tri choderma）の場合）プロモーターの制御下で異種フィターゼ遺伝子を有するアス ペルギルスまたはトリコデルマ属の微生物をフィターゼの組換え体発現を可能に する条件下で培養し； （ｂ）水性培地を濾過して微生物を除去して、水性濾液を得；次いで （ｃ）（ｂ）由来の濾液を限外濾過に付して、少なくとも１４，０００ＦＴＵ ／ｇのフィターゼ濃度を有する水性液体を得ることからなる、フィターゼを含む 水性液体の製法が提供される。 この方法は、得られる水性組成物中に特に高濃度のフィターゼを提供すること が見出された。これは、また高活性レベルで、他のフィターゼ組成物の調製を可 能にし、それは、より安価な（酵素活性の単位あたり）方法であるというだけで なく、より濃縮されたフィターゼ含有組成物があまり濃縮されていないものより も非常に安定であることが見出された。 微生物は、好ましくは、アスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger）、ア スペルギルス・オリザエ（Aspergillus oryzae）またはトリコデルマ・レッセイ （Trichoderma reesei）種である。アスペルギルス微生物の場合、フィターゼ遺 伝子は、適当には、グルコアミラーゼ（またはアミログルコシダーゼ、ＡＧ）プ ロモーターの制御下にある。トリコデルマ微生物の場合、セロビオヒドロラーゼ プロモーターを使用することが好ましい。 同化可能な炭素源は、グルコースおよび／またはマルトデキストリンを含むこ とができ、および／または同化可能な窒素源はアンモニウムイオンを含むことが できる。グルコースおよびアンモニウムイオンは、水性培地中の唯一の同化可能 な炭素または窒素源であることができる。すなわち、複合炭素または窒素源を使 用しないことを意図する。アンモニウムイオンは、アンモニアまたはアンモニウ ム塩のいずれかとして提供され得る。好ましいアンモニウム塩は、硝酸アンモニ ウム、硫酸アンモニウムおよびリン酸アンモニウムを包含する。 好ましくは、炭素および／または窒素源は、発酵工程の間、培養基に供給され る。どちらの供給源の供給率も、実質上、微生物によって消費されるのと同一で ある。したがって、炭素および／または窒素源は、連続的または継続的方法で提 供できる。炭素および窒素源は、別々に提供でき、または同時に提供できる。 得られる水性液体は、少なくとも１６，０００ＦＴＵ／ｇ、できれば１８，０ ００ＦＴＵ／ｇ以上までもの濃度のフィターゼを有することができる。 これらの条件下でこれらの特定の微生物を用いることによって、濾液は比較的 濃縮されるであろう。これは、濾液を限外濾過に付すことができる。いくつかの 先行技術の方法において、得られた濾液は、多くの破壊物の破片および他の物質 を含むので、限外濾過をできない（フィルターが詰まる）。しかしながら、本発 明の方法において、濾液は比較的「きれい」であり、いずれかのさらなる処理も せずに、限外濾過に付すことができ、したがって、限外濾過によって、特に高濃 度の水性組成物を得ることができる。 先行技術の方法は、濾液または水性組成物のいずれかを結晶化および／または 着色除去工程、例えば、木炭濾過に付す可能性を検討した。しかしながら、これ らの付加的な工程のどちらも（フィターゼを生産するコストに加算するであろう ）、本発明において省くことができる。 好ましくは、微生物は、グルコアミラーゼ遺伝子を有さないか、または少なく とも発現しない。これは、微生物がより多くのエネルギーをフィターゼの生産に 当てることができることを意味する。 微生物は、多コピーのフィターゼ遺伝子を所有し得る。これは、より多くの発 現されるべきフィターゼ遺伝子が存在するので、フィターゼの生産レベルを増加 させることが見出された。 水性組成物は、実質上、タカ−アミラーゼを含まない。 本発明の方法において、（実質上、）全ての炭素および／または窒素源が （ｂ）における濾過を行う前に、微生物によって消費されることが好ましい。こ れは、炭素および／または窒素源の最後の供給が行われた後、しばらく発酵を持 続させることによって達成できる。別法では、全ての炭素および／または窒素源 が加えられた段階を過ぎても発酵を持続させることができる。明らかなように、 該利益は、水性組成物を次いで、（実質上、）炭素および／または窒素源（例え ば、グルコースおよび／またはアンモニウムイオン）を含まない状態にできるこ とである。さらに、このことは、よりきれいな水性液体を生じることができ、そ れはほとんど副産物を含有しない。副産物の数を減少させることによって、水性 液体を使用できるかまたは所望の高フィターゼ活性を得ることができるために必 要な処理工程の数を最小限にすることができる。 最も好ましい生物は、アスペルギルス・ニガーである。また、フィターゼがグ ルコアミラーゼシグナル配列を有する微生物において発現されることが好ましい 。 次いで、得られた水性フィターゼ含有液体は、動物飼料におけるその適用が特 に本明細書で意図されるが、種々の目的に使用できる。本発明の第２の態様は、 少なくとも１４，０００ＦＴＵ／ｇの濃度でフィターゼを含む、第１の態様の方 法によって調製できるような該水性液体に関する。 明細書において、「フィターゼ」なる語は天然のフィターゼ酵素のみならず、 フィターゼ活性、例えば、リン酸ｍｙｏ−イノシトールからの無機リン（リン酸 塩）の除去または遊離を含む反応を触媒する能力を有するいずれかの酵素も意味 する。好ましくは、フィターゼはクラスＥＣ３．１．３．８に属するであろう。 フィターゼ自体は、好ましくは、アスペルギルスまたはトリコデルマ種由来のよ うな真菌性フィターゼである。 本発明は、また、担体として食用炭水化物ポリマーを使用する粒状物の形態の フィターゼ製剤の製法を提供できる。担体は、粒子または粉末形態であってもよ い。溶液またはスラリーのようなフィターゼ含有水性液体を固形担体と混合でき 、担体上に吸収させる。混合の間または後、フィターゼ含有液および担体を粒状 物に加工処理し、次いで、それを乾燥させることができる。炭水化物担体の使用 は、大量の組成物（および、それによりフィターゼ）の吸収を可能にし得る。容 易に顆粒に加工処理できる、例えば、押出し成形できる成形力のあるペーストま たは 弾性のないドーを形成させるために、混合物を使用してもよい。適当には、担体 は、より容易な造粒を可能にする非繊維質であり：繊維状物質は押出し成形によ る造粒を妨げることができる。 いくつかの先行技術は種々の酵素を含有するペレットについて記載しているが 、これらは界面活性剤としての、しばしば、洗浄組成物における使用を見出して いる。対照的に、本出願は、動物飼料における使用を見出し、それゆえ、本発明 の粒状物は食用に適し（動物による）、また、好ましくは消化できる。したがっ て、本発明の粒状物、顆粒および組成物がほんの少し例を挙げれば、石鹸、界面 活性剤および漂白剤または漂白化合物、沸石、結合剤、充填剤（ＴｉＯ₂、カオ リン、ケイ酸塩、タルク等）ではないことは、驚くべきことではない。 食用炭水化物ポリマーは、飼料の目的となる動物による食用に適し、好ましく は、そのうえ消化できるように選択されるべきである。ポリマーは、好ましくは 、グルコース（例えば、グルコース含有ポリマー）または（Ｃ₆Ｈ₁₀Ｏ₅）_n単位 を含む。好ましくは、炭水化物ポリマーは、α−Ｄ−グルコピラノース単位、ア ミロース（線状（１→４）α−Ｄ−グルカンポリマー）および／またはアミロペ クチン（α−Ｄ−（１→４）およびα−Ｄ−（１→６）結合を有する分枝Ｄ−グ ルカン）を含む。デンプンは、好ましい炭水化物ポリマーである。デンプンの代 わりにまたはデンプンに加えて使用できる他の適当なグルコース含有ポリマーは 、α−グルカン、β−グルカン、ペクチン（例えば、プロト−ペクチン）および グリコーゲンを包含する。糊化デンプンはしばしば避けられるが、これらの炭水 化物ポリマーの誘導体、例えば、それらのエーテルおよび／またはエステルもま た、考慮される。適当には、炭水化物ポリマーは水不溶性である。 本明細書に記載の実施例において、コーン、ジャガイモおよび米デンプンが使 用される。しかしながら、タピオカ、キャッサバ、小麦、トウモロコシ、サゴ、 ライ麦、オート麦、大麦、ヤマイモ、モロコシまたはクズウコンのような他の（ 例えば、野菜または穀物のような植物）供給源から得られるデンプンは、等しく 適用できる。同様に、天然または修飾（例えば、デキストリン）型の両方のデン プンが本発明に使用できる。好ましくは、炭水化物（例えば、デンプン）は、タ ンパク質をほとんど含まないか、または全く含まず、例えば、５％（ｗ／ｗ） 未満、例えば、２％（ｗ／ｗ）未満、好ましくは、１％（ｗ／ｗ）未満である。 固形担体の少なくとも１５％（ｗ／ｗ）で、炭水化物ポリマー（例えば、デン プン）を含んでもよい。好ましくは、しかしながら、固形担体の少なくとも３０ ％（ｗ／ｗ）で炭水化物を含み、最適には少なくとの４０％（ｗ／ｗ）である。 有利なことに、固形担体の主成分は、例えば５０％（ｗ／ｗ）以上、好ましくは 少なくとも６０％（ｗ／ｗ）、適当には少なくとも７０％（ｗ／ｗ）、最適には 少なくとも８０％（ｗ／ｗ）の炭水化物（例えば、デンプン）である。これらの 重量パーセンテージは、最終的な乾燥粒状物中の非酵素的成分の全重量に基づい ている。 担体上に吸収され得るフィターゼ含有液量は、通常、吸収され得る水の量によ って制限される。天然の粒状デンプンの場合、これは、高温（デンプンの膨張を 引き起こす）を用いることなく、２５−３０％（ｗ／ｗ）で変化できる。酵素含 有液は通常、かなりの量の固形物を含有するので、実際、炭水化物に加えられる べき酵素液のパーセンテージは、しばしば、これよりも大量である。フィターゼ 溶液は、約２５％（ｗ／ｗ）固形物を含有でき、その結果、炭水化物（例えば、 デンプン）およびフィターゼ溶液は、０．５：１〜２：１、例えば、１．２：１ 〜１．６：１の炭水化物：フィターゼ溶液比で、例えば、各々、約６０％（ｗ／ ｗ）：４０％（ｗ／ｗ）の比率で混合できる。好ましくは、固形担体に加えられ る液体の量は、（実質上、）（水性）液体中の全ての水が固形担体中に存在する 炭水化物によって吸収されるような量である。 高温にて、デンプンおよび他の炭水化物ポリマーは、膨張下で大量の水を吸収 できる。この理由で、炭水化物ポリマーは望ましくは、水（または酵素含有水性 液体）を吸収できる。例えば、コーンスターチは、６０℃でその重量の３倍まで の水を吸収でき、７０℃で１０倍までを吸収できる。したがって、より大量の酵 素含有液を吸収するために、より高温の使用が本発明により意図され、実際に、 熱安定性フィターゼ酵素を扱う場合、特に好ましい。したがって、これらの酵素 の場合、固形担体および液体の混合は、高温（例えば、周囲の温度以上）、例え ば３０℃以上、好ましくは４０℃以上、最適には５０℃以上で行うことができる 。別法またはさらに、該温度で液体を提供してもよい。 しかしながら、一般に、より高温での（熱感受性）フィターゼの不安定性から 生じる活性の喪失を最小限にするためには、より低い（例えば、周囲の）温度で 膨張しない条件が好ましい。適当には、酵素および液体の混合の間の温度は、２ ０〜２５℃である。 フィターゼ含有液および固形担体の混合物を顆粒にする（換言すれば、造粒す る）ための本発明で使用される機械的加工処理は、食物、飼料および酵素処方工 程において頻繁に用いられる既知技術を用いることができる。これは、膨張、押 出し成形、球状化（spheronisation）、ペレット成形、高剪断造粒、ドラム造粒 、流動層凝集またはそれらの組み合わせを含んでもよい。これらの方法は、通常 、機械的エネルギーの投入、例えば、スクリューの駆動、混合機械装置の回転、 ペレット成形装置の回転機械装置の圧力、流動層凝集機の回転底プレートによる 粒子の移動またはガス流による粒子の移動、あるいはそれらの組み合わせによっ て特徴付けられる。これらの方法は、固形担体（例えば、粉末形態の）をフィタ ーゼ含有液（水性溶液またはスラリー）と混合し、次いで、造粒させる。 本発明のさらなる具体例において、粒状物（例えば、凝集塊）は、例えば、流 動層凝集機において、フィターゼ含有液を担体上に噴霧または被覆することによ って形成される。ここに、得られる顆粒は、流動層凝集機において生産できるよ うな凝集塊を包含できる。 好ましくは、フィターゼ含有液および固形担体の混合は、付加的に、混合物の 練合を含む。これは、造粒（例えば、押出し成形）を容易にするために、混合物 の可塑性を改善し得る。 粒状物が押出し成形によって形成される場合、好ましくは、低圧で行われる。 これは、押出し成形されている混合物の温度が上昇しないか、またはわずかしか 上昇しないという利益を提供し得る。低圧押出し成形は、例えば、Ｆｕｊｉ Ｐ ａｕｄａｌバスケットまたはドーム押し出し成形機における押出し成形を包含す る。好ましくは、押出し成形されている物質の温度は４０℃以上に上昇しない。 押出し成形は、自然に顆粒（顆粒はダイを通過後に分離し得る）を製造してもよ く、またはカッターを使用してもよい。 適当には、顆粒は３０〜４０％、例えば３３〜３７％の水分含量を有するであ ろう。酵素含量は、適当には、３〜１０％、例えば、５〜９％である。 得られた顆粒は、例えば、球状成形機（spheromiser）、例えば、ＭＡＲＵＭ ＥＲＩＳＥＲ^TM（登録商標）機中で、丸状化（例えば、球状化）および／または 圧縮に付すことができる。最終的な粒状物中のダスト形成を減少させ、および／ または粒状物のいずれかの被覆を容易にし得るので、顆粒を乾燥前に球状にして もよい。 次いで、顆粒を例えば、流動層乾燥機中で乾燥させることができ、または、流 動層凝集の場合、直ちに乾燥させて（凝集機中で）、（固形乾燥）粒状物を得る ことができる。食物、飼料または酵素産業において顆粒を乾燥させるための他の 既知方法は、当業者によって用いることができる。適当には、粒状物は流動可能 である。 乾燥は、好ましくは、２５〜６０℃、例えば３０〜５０℃の温度で行う。ここ に、乾燥を１０分〜数時間、例えば、１５〜３０分続けてもよい。もちろん、必 要な時間は乾燥させるべき顆粒の量に依存するが、目安として、これは、顆粒１ ｋｇあたり１〜２秒である。 顆粒を乾燥後、得られる粒状物は、好ましくは３〜１０％、例えば５〜９％の 水分含量を有する。 低ダスト含量、色、酵素の周りの環境からの保護、１の粒状物における種々の 酵素活性またはそれらの組み合わせのような付加的な（例えば、好ましい）特徴 または特性を与えるために、被覆を粒状物に適用してもよい。顆粒は、脂肪、ワ ックス、ポリマー、塩、膏薬（unguent）および／または軟膏（ointment）また は（第２の）酵素を含有する被覆剤（例えば、液体）またはそれらの組み合わせ で被覆できる。所望により、（異なる）被覆の数重の層が適用できることは明ら かであろう。粒状物上へ被覆を適用するために、流動層、高剪断造粒機、混合造 粒機またはＮａｕｔａ−ミキサーの使用を包含するいくつかの既知方法を利用で きる。 他の具体例において、付加的な成分を例えば、加工助剤として、粒状物のペレ ット成形安定性および／または貯蔵安定性のさらなる改善のために、粒状物中に 混合することができる。いくつかのかかる好ましい添加物を後記で検討する。 塩は、（例えば、固形担体または液体と一緒に）粒状物中に含まれてもよい。 好ましくは（ＥＰ−Ａ−０，７５８，０１８に示されるように）、無機塩を加え ることができ、それは乾燥フィターゼ調製物の加工および貯蔵安定性を改善し得 る。好ましい無機塩は、二価のカチオン、例えば、亜鉛、マグネシウムおよびカ ルシウムを含む。硫酸塩が最も好ましいアニオンである。 好ましくは（ＥＰ−Ａ−０，７５８，０１８に示されるように）、無機塩を加 えることができ、それは乾燥酵素調製物の加工および貯蔵安定性を改善し得る。 好ましい無機塩は、水溶性である。それらは、二価のカチオン、例えば、亜鉛（ 特に）、マグネシウムおよびカルシウムを含んでもよい。水溶性を生じる他のア ニオンを用いることもできるが、硫酸塩が最も好ましいアニオンである。塩は、 固形形態で（例えば、混合物に）加えてもよい。しかしながら、塩は、固形担体 との混合前に、水または酵素含有液中に溶解できる。適当には、塩は、少なくと も１５％（酵素に基づくｗ／ｗ）、例えば、少なくとも３０％の量で提供される 。しかしながら、それは、少なくとも６０％または７０％までもの（また、酵素 に基づくｗ／ｗ）高い割合であってもよい。これらの量は、顆粒または粒状物の いずれかに適用することができる。したがって、粒状物は、１２％（ｗ／ｗ）未 満、例えば、２．５〜７．５％、例えば、４〜６％の塩を含んでもよい。 塩が水中で提供されるならば、それは、５〜３０％（ｗ／ｗ）、例えば、１５ 〜２５％の量であることができる。 ペレット成形安定性のさらなる改善は、疎水性のゲル形成または溶解の遅いる （例えば、水に）化合物の混合によって得られ得る。これらは、１〜１０重量％ 、例えば２〜８重量％、好ましくは４〜６重量％（水および固形担体成分の重量 に基づく）で提供されてもよい。適当な物質は、誘導体化セルロース、例えば、 ＨＰＭＣ（ヒドロキシ−プロピル−メチル−セルロース）、ＣＭＣ（カルボキシ −メチル−セルロース）、ＨＥＣ（ヒドロキシ−エチル−セルロース）；ポリビ ニルアルコール（ＰＶＡ）；および／または食用油を包含する。概して、疎水性 物質（例えば、パーム油）が存在しないことが好ましいが、大豆油またはカノー ラ油のような食用油は、加工助剤として（例えば、造粒されるべき混合物に）加 えることができる。 好ましくは、顆粒は、比較的狭いサイズ分布を有する（例えば、それらは単分 散である）。このことは、顆粒中でのフィターゼの均一な分散および／または動 物飼料中での酵素粒状物の均一な分散を容易にすることができる。本発明の方法 は、狭いサイズ分布を有する粒状物を生産する傾向にある。しかしながら、必要 に応じて、顆粒のサイズ分布をさらに狭くするために該方法にさらなる工程、例 えば、スクリーニングを包含させることができる。粒状物のサイズ分布は、適当 には１００μｍ〜２０００μｍ、好ましくは２００μｍ〜１８００μｍ、最適に は３００μｍ〜１６００μｍである。顆粒は、不規則な（しかし、好ましくは規 則的な）形状、例えば、ほぼ球状であってもよい。 他の適当な酵素は、ペットフードを包含する動物飼料に含まれることができる 。これらの酵素の機能は、しばしば、例えば、粘性を減少させることによって、 またはある特定の飼料化合物の反栄養効果を減少させることによって、飼料変換 率を改善することである。***物中の環境に対して有害な化合物の量を減少させ るような飼料酵素もまた、使用できる。これらの目的に好ましい酵素は：カルボ ヒドラーゼ、例えば、デンプン分解酵素およびβ−グルカナーゼのようなセルラ ーゼ、キシラナーゼのようなヘミセルラーゼまたはガラクタナーゼを包含する植 物細胞壁分解酵素；ペプチダーゼ、ガラクトシダーゼ、ペクチナーゼ、エステラ ーゼ；好ましくは中性および／または酸性のｐＨ最適条件を有するプロテアーゼ ；およびリパーゼ、好ましくは、哺乳動物脾臓ホスホリパーゼＡ２のようなホス ホリパーゼである。好ましくは、酵素は、デンプン分解酵素（例えば、アミラー ゼ）を包含しない。いくつかの具体例において、プロテアーゼを摂取すると害に なるので、それらを除外してもよい。酵素が植物細胞壁分解酵素、例えば、セル ラーゼ、特にキシラナーゼのようなヘミセルラーゼであるならば、最終的な粒状 物は、３，０００〜１００，０００、好ましくは５，０００〜８０，０００、最 適には８，０００〜７０，０００ＥＸＵ／ｇの範囲の酵素活性を有し得る。酵素 がβ−グルカナーゼのようなセルラーゼであるならば、最終的な粒状物は、５０ ０〜１５，０００、好ましくは１，０００〜１０，０００、最適には１，５００ 〜７，０００ＢＧＵ／ｇの酵素活性を有することができる。 顆粒は、５〜２０、例えば、７〜１５％の酵素を含んでもよい。酵素は、天然 または組換え体であってもよい。 したがって、本発明による好ましい製法は： ａ．水性フィターゼ含有液体および少なくとも１５％（ｗ／ｗ）の食用炭水化 物ポリマーを含む固形担体を混合し、例えば、固形担体と水性酵素含有液を混合 し； ｂ．所望により、得られた混合物を練合し； ｃ．例えば、機械的な加工処理によって、混合物を造粒して、例えば、造粒機 または押出し成形を用いることによって、酵素含有顆粒を得； ｄ．所望により、顆粒を球状にし； ｅ．得られた顆粒を乾燥させて、酵素含有粒状物を得る ことからなる。 全工程の間、酵素が曝される最高温度を８０℃以下に維持しようとするであろ う。 本発明の粒状物は、動物飼料の調製における使用に適する。その最も広くは、 本発明の該態様は、フィターゼおよび食用炭水化物ポリマーを含む粒状物、少な くとも６，０００ＦＴＵ／ｇの活性を有する粒状物に及ぶ。かかる方法において 、プレミックス自体またはプレミックスの一部として、粒状物を飼料物質と混合 する。本発明の粒状物の特徴は、特に、混合物を蒸気処理し、次いでペレット成 形する場合、動物飼料としてよく適する混合物の成分としての使用を可能にする 。乾燥顆粒は、かかるペレット中において、目に見えるか、または識別すること ができる。 したがって、本発明の第３の態様は、第２の態様の組成物を１以上の動物飼料 物質（例えば、シード）または成分と混合することからなる、動物飼料または動 物飼料のプレミックスもしくは前駆物質の製法に関する。次いで、これを例えば 、熱処理に付して滅菌できる。次いで、得られた組成物を適当には、ペレットに 加工処理する。 本発明の第４の態様は、好ましくは、動物飼料のような食用飼料組成物である 、第２の態様の粒状物を含んでなる組成物に関する。該組成物は、好ましくは、 ペレット形態である（ペレットあたり１−５、例えば、２−４乾燥顆粒が存在し て いてもよい）。 適当には、組成物は、０．０５〜２．０、例えば、０．３〜１．０、最適には ０．４〜０．６ＦＴＵ／ｇのフィターゼを含む。キシラナーゼは、０．５〜５０ 、例えば、１〜４０ＥＸＵ／ｇで存在し得る。別法またはさらに、セルラーゼは 、０９．１〜１．０、例えば、０．２〜０．４ＢＧＵ／ｇで存在し得る。 組成物は、１０〜２０％、例えば、１２−１５％の水分含量を有することがで きる。酵素量は、適当には、０．０００５〜０．００１２％、例えば、少なくと も５ｐｐｍである。 第５の態様は、動物に第２の態様の組成物または第４の態様の組成物を含む食 餌を与えることからなる、動物の成長を促進するための方法に関する。ここに、 動物の食餌は、粒状物自体か、または飼料中に存在する粒状物のいずれかを包含 することができる。 本発明の第６の態様は、動物飼料中におけるまたは動物飼料の成分としての、 あるいは動物食餌における使用のための組成物の粒状物の使用に関する。 また、本発明の第７の態様は、フィターゼのペレット成形安定性を改善するた めに、少なくとも１５％（ｗ／ｗ）の食用炭水化物ポリマーをフィターゼの担体 として含む組成物の使用に関する。 適当な動物は、飼育動物（豚、家禽、家畜）、非反芻または単胃動物（豚、鳥 、家禽、魚のような海洋動物）、反芻動物（牛または羊、例えば、乳牛、羊、ヤ ギ、シカ、仔牛、仔羊）を包含する。家禽は、ひな鳥、鶏および七面鳥を包含す る。 本発明の１の態様の好ましい特色および特徴は、別の必要な変更を加えて、等 しく適用できる。 以下の実施例は、単に本発明を説明するものとして与えられ、限定しようとす るものではなく、または限定するものとして解釈されるべきではない。 実施例 実施例１ エー・ニガー（A．niger）ＣＢＳ５１３．８８の発酵 アスペルギルス・ニガー真菌の胞子調製物を標準的な技術にしたがって調製し た。 胞子および次いで細胞を３角フラスコ中の一連のバッチ発酵後、１０Ｌの発酵 槽に移した。バッチ培養における生育後、該発酵槽の内容物を最終的な５００リ ットルのバッチ発酵の接種原として使用した。 使用した培地は：９１ｇ／ｌコーンスターチ（BDH chemicals）；アンモニウ ム３８ｇ／ｌグルコースＨ₂Ｏ；０．６ｇ／ｌ ＭｇＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏ；０．６ｇ ／ｌ ＫＣｌ；０．２ｇ／ｌ ＦｅＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏおよび１２ｇ／ｌ ＮＫＯ₃ を含有する。ｐＨは、４Ｎ ＮａＯＨまたは４ＮＨ₂ＳＯ₄のいずれかでの自動滴 定によって４．６±０．３に維持された。 細胞は、２８℃で自動的に制御された溶存酸素濃度にて、２５％空気飽和で生 育させた。フィターゼ生産は、発酵１０日後に最大レベル５−１０Ｕ／ｍｌに達 した。 コーンスターチの代わりに硫酸アンモニウムを用いて発酵を繰り返した（等量 の同化可能窒素含量を得るために）。 実施例２ フィターゼの精製およびキャラクタリゼーション：フィターゼ活性アッセイ １００μｌのブイヨン濾液（必要により希釈した）または上清または対照とし て１００μｌの脱塩水（demiwater）を以下の組成： ０．２５Ｍ酢酸ナトリウムバッファーｐＨ５．５、または グリシンＨＣｌバッファーｐＨ２．５ １ｍＭフィチン酸，ナトリウム塩 ９００μｌまでの脱塩水 を有するインキュベーション混合物に加える。 得られた混合物を３７℃で３０分間インキュベートした。１ｍｌの１０％ＴＣ Ａ（トリクロロ酢酸）の添加によって反応を止めた。反応終了後、２ｍｌの試薬 （５０ｍｌのモリブデン酸アンモニウム溶液（脱塩水で２５０ｍｌに希釈した２ ．５ｇ（ＮＨ₄）₆Ｍｏ₇Ｏ₂₄・４Ｈ₂Ｏおよび８ｍｌのＨ₂ＳＯ₄）中の３．６６ｇ のＦｅＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏ）を加えた。 青色の強度を７５０ｎｍで分光光度測定した。測定値は、０−１ミリモル／１ の範囲でのリン酸塩の検量線に関して放出されるリン酸塩の量を示す。 実施例３ Ａ． エー・ニガーアミノグルコシダーゼ(ＡＧ)遺伝子のプロモーターおよび ／またはシグナルは配列に融合させたエー・フィカム（A．Ficuum）フィターゼ 遺伝子を含有する発現ベクターで形質転換されたエー・ニガーＣＢＳ５１３．８ ６におけるフィターゼ発現 エー・ニガーにおけるフィターゼの過剰発現を得るために、エー・フィカムフ ィターゼ遺伝子がシグナル配列と共にエー・ニガーアミノグルコシダーゼ（ＡＧ ）プロモーターの制御下にある発現カセットを得た。より長いリーダー配列の場 合、ＡＧプロモーター配列を、成熟タンパク質をコードするフィターゼ遺伝子フ ラグメントに融合されたフィターゼリーダー配列を包含するフィターゼコード化 配列に融合した（参考のためにＥＰ−Ａ−０，４２０，３５８の実施例１０参照 ）。 Ｂ． エー・ニガーにおけるＡＧプロモーターの制御下でのフィターゼ遺伝子 の発現 エー・ニガー株ＣＢＳ５１３．８８（１９８８年１０月１０日に寄託された） を既知方法によって１０μｇのＤＮＡフラグメントで形質転換した（例えば、Ｅ Ｐ−Ａ−０，４２０，３５８の実施例９を参照）。各発現カセット由来の単一の エー・ニガー形質転換株を単離し、胞子を選択的アセトアミド寒天プレート上で ストリーキングした。各形質転換株の胞子を３７℃で０．４％ジャガイモデキス トロース（Oxoid，England）寒天プレート上で３日間生育させた細胞から収集し た。振盪フラスコ中、以下の条件下でフィターゼ生産を試験した： 約１ｘ１０⁸胞子を（リットルあたり）：１ｇＫＨ₂ＰＯ₄；３０ｇマルトース ；５ｇ酵母抽出物；１０ｇカゼイン水解物；０．５ｇ ＭｇＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏおよ び３ｇＴｗｅｅｎ８０を含有する１００ｍｌ前培養基中に接種した。ｐＨは５． ５に調整した。 回転式振盪機中、３４℃で一晩生育後、１ｍｌの生育培養物を（リットルあた り）：２ｇＫＨ₂ＰＯ₄；７０ｇマルトデキストリン（maldex MDO₃，Amylum）； １２．５ｇ酵母抽出物；２５ｇカゼイン水解物；２ｇ Ｋ₂ＳＯ₄；５ｇ ＭｇＳ Ｏ₄・７Ｈ₂Ｏ；０．０３ｇ ＺｎＣｌ₂；０．０２ｇ ＣａＣｌ₂；０．０５Ｍｎ ＳＯ₄・４Ｈ₂ＯおよびＦｅＳＯ₄を含有する１００ｍｌの主培養基中に接種した 。ｐＨは５．６に調整した。 菌糸体は、少なくとも１４０時間生育させた。フィターゼ生産は、実施例２に 記載のように測定した。等価量のグルコースおよび硫酸アンモニウムを炭素およ び窒素源として用いて、発酵を繰り返した。ブイヨンを濾過して濾液を得、それ をバイオマスから分離した。発現カセットＰＦＹＴ３（ＡＧ−プロモーター／フ ィターゼリーダー）を用いて、最大フィターゼ活性２８０Ｕ／ｍｌを得た。 実施例４ 濾液からのフィターゼの精製 高度に精製したフィターゼを得るための精製は以下のとおりであった： １．ｐＨ４．９でカチオン交換クロマトグラフィー ２．ｐＨ３．８でカチオン交換クロマトグラフィー ３．ｐＨ６．３でアニオン交換クロマトグラフィー ４．限外濾過 １．フィターゼ濾液を水で２０倍希釈し、ｐＨを４．９に調整した。該物質を ２０ｍＭクエン酸／ＮａＯＨ ｐＨ４．９バッファーで平衡化したＳセファロー ス高速フロー（S Sepharose Fast Flow）カラムを通過させた。フィターゼを有 する非結合物質を収集し、次の段階に用いた。 ２．ｐＨ４．９の物質をｐＨ３．８にし、フィターゼを２ｍＭクエン酸／Ｎａ ＯＨ ｐＨ３．８バッファーで平衡化したＳセファロース高速フローカラム上に 結合させた。２０ｍＭ ＮａＰＯ₄、５０ｍＭ ＮａＣｌ ｐＨ７．６バッファ ーを用いて、フィターゼをカラムから溶出した。 ３．第２のカチオン交換段階由来のプールしたフィターゼフラクションをｐＨ ６．３に調整し、フィターゼを１０ｍＭ ＫＰＯ₄ｐＨ６．３バッファーで平衡 化したＱセファロース高速フローカラム上に結合させた。同一バッファー中の１ Ｍ ＮａＣｌまでの勾配を用いて、フィターゼを溶出した。 Ｋａｌｌｅ Ｅ３５膜を備え付けたＡｍｉｃｏｎ Ｓｔｉｒｒｅｄ Ｃｅｌｌ （２Ｌモジュール）を用いる３バールでの限外濾過により、１０ｍｇタンパク質 ／ｍｌを含有する最終的な（アニオン交換した）生産物を１０倍濃縮した。 精製フィターゼのための最終的な濃縮は、２８０−３００ｇ／ｌ（２８−３０ ％）に到達した。１００ＦＴＵ／ｍｇタンパク質の比活性で、これは２８，００ ０−３０，０００ＦＴＵ／ｇのフィターゼ活性を生じる。 実施例５ 高活性フィターゼ安定性試験 より高い酵素濃度（高活性フィターゼ液を用いて作製された顆粒中において） がより高いペレット成形安定性を与えることを明らかにするために、高い酵素濃 度を有する粒状物を作製し、これらの試料のペレット成形安定性を試験した。比較試料Ａ：混合、練合、押出し成形、球状化および乾燥によるコーンスター チをベースとする低活性酵素粒状物の調製 ７３％（ｗ／ｗ）のコーンスターチおよび低濃度４％（ｗ／ｗ）のフィターゼ 限外濾液および２３％（ｗ／ｗ）の水を混合および練合することによって、混合 物を調製した。ＮｉｃａＥ−２２０バスケット押出し成形機を用いて該混合物を 押出し成形して、湿った押出し成形物を得、それをＦｕｊｉ Ｐａｕｄａｌ Ｍａ ｒｕｍｅｒｉｓｅｒ^TM中で２分間球状化して、平均直径６００μｍの丸い粒子を 得た。次いで、これらの粒子をＧｌａｔｔ ＧＰＣＧ１．１流動層乾燥機中で乾 燥させた。粒状物の最終的な活性は、６１０ＦＴＵ／ｇであった。 比較試料Ｂ：混合、練合、押出し成形、球状化および乾燥によるコーンスター チをベースとする中程度活性酵素粒状物の調製 ７０％（ｗ／ｗ）のコーンスターチおよび１７％（ｗ／ｗ）のフィターゼ限外 濾液および１３％（ｗ／ｗ）の水を混合および練合することによって、混合物を 調製した。ＮｉｃａＥ−２２０バスケット押出し成形機を用いて該混合物を押出 し成形して、湿った押出し成形物を得、それをＦｕｊｉ Ｐａｕｄａｌ Ｍａｒｕ ｍｅｒｉｓｅｒ^TM中で２分間球状化して、平均直径６００μｍの丸い粒子を得た 。次いで、これらの粒子をＧｌａｔｔ ＧＰＣＧ１．１流動層乾燥機中で乾燥さ せた。粒状物の最終的な活性は、４１７０ＦＴＵ／ｇであった。 試料Ｃ 混合、練合、押出し成形、球状化および乾燥によるコーンスターチをベースと する高活性酵素粒状物の調製 ６７％（ｗ／ｗ）のコーンスターチおよび実施例４で調製した（しかし、１８ ，４００ＦＴＵ／ｇに希釈した）３０％（ｗ／ｗ）のフィターゼ限外濾液および ３％（ｗ／ｗ）の水を混合および練合することによって、混合物を調製した。Ｎ ｉｃａ Ｅ−２２０バスケット押出し成形機を用いて該混合物を押出し成形して 、湿った押出し成形物を得、それをＦｕｊｉ Ｐａｕｄａｌ Ｍａｒｕｍｅｒｉｓ ｅｒ^TM中で２分間球状化して、平均直径６００μｍの丸い粒子を得た。次いで、 これらの粒子をＧｌａｔｔ ＧＰＣＧ１．１流動層乾燥機中で乾燥させた。粒状 物の最終的な活性は、６８３０ＦＴＵ／ｇであった。 ペレット成形安定性の比較 その後、異なる酵素粒状物をペレット成形試験に付し、それらのペレット成形 安定性を比較した。ペレット成形試験は、酵素粒状物を飼料プレミックスと各々 、１５００、３２０および２００ｐｐｍで混合することからなる。これらの混合 物を蒸気注入により前処理して温度を７５℃上げ、その後、混合物をペレット成 形機中でペレット成形して８２℃にて飼料ペレットを得、次いでそれを乾燥させ た。該タイプの方法は、飼料ペレットを得るために飼料産業にとって典型的であ る。 表１はペレット成形試験の結果を要約する。最大酵素濃度を有する２つの粒状 物がより大きいペレット成形安定性を有したことは明らかである。表１ ペレット成形試験の結果 実施例６ 混合、練合、ペレット成形および乾燥による大豆油およびＭｇＳＯ₄添加を含 むジャガイモデンプンをベースとする酵素粒状物の調製 混合機／練合機中、３０ｋｇのジャガイモデンプンを加え、２．５ｋｇの大豆 油を混合した。次いで、ＭｇＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏを含有する（３．５ｋｇのＭｇＳＯ₄ ・７Ｈ₂Ｏを１４ｋｇの限外濾液中に溶解した）アスペルギルス由来のフィター ゼ限外濾液（１６，８４０ＦＴＵ／ｇ）を加えた。生産物を練合機中で徹底的に 混合し、次いで、押出し成形し、実施例１のように流動層乾燥機中で乾燥させた 。これは、５８７０ＦＴＵ／ｇの生産物を生じた。 実施例７ 混合、練合、押出し成形、球状化および乾燥による米デンプンをベースとする 酵素粒状物の調製 ６２％（ｗ／ｗ）の米デンプンおよび３８％（ｗ／ｗ）の実施例６に用いられ たのと同じフィターゼ限外濾液を混合および練合することによって、混合物を調 製した。Ｆｕｊｉ Ｐａｕｄａｌバスケット押出し成形機を用いて、該混合物を 押出し成形して、湿った押出し成形物を得、次いで、それをＭＡＲＵＭＥＲＩＳ ＥＲ^TM中で１分間球状化して、平均直径７８５μｍの丸い粒子を得た。次いで、 これらの粒子を実施例１のように流動層乾燥機中で乾燥させた。粒状物の最終的 な活性は、７２８０ＦＴＵ／ｇであった。 実施例８ 混合、練合、押出し成形、球状化および乾燥によるＨＰＭＣ添加を含むコーン スターチをベースとする酵素粒状物の調製 ５４％（ｗ／ｗ）のコーンスターチ、５％のＨＰＭＣ（ヒドロキシ−プロピル −メチル−セルロース）および４１％（ｗ／ｗ）の実施例６に用いられたフィタ ーゼ限外濾液の混合物を練合することによって、酵素調製物を得た。Ｆｕｊｉ Ｐａｕｄａｌバスケット押出し成形機を用いて、該混合物を押出し成形して、湿 った押出し成形物を得、それをＭＡＲＵＭＥＲＩＳＥＲ^TM中で１分間球状化して 、平均直径７８０μｍの丸い粒子を得た。次いで、これらを流動層乾燥機中、４ ０℃の層温度および７５℃の入口温度で２０分間乾燥させた。このように得られ た乾燥酵素粒状物は、８４７０ＦＴＵ／ｇの活性を有した。 実施例９ 混合、練合、押出し成形、球状化および乾燥によるＨＥＣ添加を含むコーンス ターチをベースとする酵素粒状物の調製 ５４％（ｗ／ｗ）のコーンスターチ、５％のＨＥＣ（ヒドロキシ−エチル−セ ルロース）を４１％（ｗ／ｗ）の実施例６に用いられたのと同じフィターゼ限外 濾液と混合および練合することによって、酵素調製物を得た。Ｆｕｊｉ Ｐａｕ ｄａｌバスケット押出し成形機を用いて、該混合物を押出し成形して、湿った押 出し成形物を得、それをＭＡＲＵＭＥＲＩＳＥＲ^TM中で１分間球状化して、平均 直径７８０μｍの丸い粒子を得た。次いで、これらを流動層乾燥機中、４０℃の 層温度および７５℃の入口温度で２０分間乾燥させた。このように得られた乾燥 酵素粒状物は、８４１０ＦＴＵ／ｇの活性を有した。 実施例１０ 実施例４由来の限外濾液から得た１８，０００ＦＴＵ／ｇの限外濾液を用い、 希釈した。 試料 調製した３つの試料の活性は、６１０（Ａ、比較）；４１７０（Ｂ、比較）お よび６８３０（Ｃ）ＦＴＵ／ｇであった。これは、各々、活性１．１５３、１． ６８５および１．７４５ＦＴＵ／ｇ飼料の３つの飼料を与えた。 第１の試料１５０ｇを後記のように２０ｋｇの飼料と混合した。この後、プレ ミックスを８０ｋｇの飼料と混合し、２つに分けて、２つの異なる温度での２つ の試験のための飼料にした。第２の試料は２０ｋｇ飼料中１５３．６ｇであった 。該２０，１５３．６ｇの試料を１０．０７６ｋｇの２つの等しい部分に分けた 。次いで、各部分を２３０ｋｇの飼料と混合して、試験用のミールを得た。 第３の試験の場合、９６ｇの粒状物を２０ｋｇの飼料と混合し、１０．０４８ ｇの２つの部分に分けた。次いで、各部分を２３０ｋｇの飼料と混合して、試験 用のミールを得た。ペレット成形速度は６００ｋｇ／時間であった。 飼料混合物は： コーン ２０．００％ 小麦 ３０．００％ 大豆（加熱した） １０．００％ 大豆（粗いミール４６．７／３．７） １８．２０％ タピオカ（６５％デンプン） ６．９７％ アニマルミール（５６．５／１０．９） ４．００％ フィッシュミール（７０．６％の場合） １．００％ フェザーミール、水硬性 １．００％ 大豆油／トウモロコシ油 １．３０％ 動物性脂肪 ４．００％ ビタミン(vit.)／ミネラル(Min.)プレミックス(トウモロコシ)１．００％ 炭酸カルシウム ０．８５％ モノカルシウムホスフェート １．０５％ 塩 ０．２６％ Ｌ−リジンＨＣｌ ０．１６％ ＤＬ−メチオニン ０．２１％ からなった。 次いで３つの混合物をペレット成形した。直接蒸気をミールに加えるコンディ ショナー中に飼料を入れた。温度は７５℃に上昇した。次いで、ミールは、５ｍ ｍ穴および６５ｍｍの厚さを有するダイプレートを押し通されてペレット成形機 の外部に出た。この時点での飼料温度は、さらに４℃上昇して７９℃であった。 ３つの飼料の活性は、１０．１１（Ａ）；１０．０４（Ｂ）および９．８１（ Ｃ）であった。 残留活性に関する該試験結果は：元の６１０；４１７０および６８３０ＦＴＵ ／ｇ試料に対して、各々、６３（Ａ）；６６（Ｂ）および７２％（Ｃ）であった 。これは、類似の活性であっても（ＢおよびＣ）、最大活性の製剤（Ｃ；６８３ ０ＦＴＵ／ｇ、本発明）の方が非常に大きいペレット成形安定性を与えたことを 示す。これは、（比較）試料Ｂより６％大きく、活性が非常に大きく増加してい る（６１０から４１７０ＦＴＵ／ｇ）場合、たった３％の増加のみしか観察され なかったことに注目すべきである（ＡからＢ）。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ１２Ｎ 9/98 Ｃ１２Ｎ 9/98 15/09 (Ｃ１２Ｎ 9/16 Ｂ //(Ｃ１２Ｎ 9/16 Ｃ１２Ｒ 1:685） Ｃ１２Ｒ 1:685） (Ｃ１２Ｎ 9/16 Ｂ (Ｃ１２Ｎ 9/16 Ｃ１２Ｒ 1:69） Ｃ１２Ｒ 1:69） (Ｃ１２Ｎ 9/16 Ｂ (Ｃ１２Ｎ 9/16 Ｃ１２Ｒ 1:885） Ｃ１２Ｒ 1:885） Ｃ１２Ｎ 15/00 Ａ (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ， ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，Ｌ Ｓ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ， ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，Ｅ Ｅ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＧＷ，ＨＵ ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ， ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，Ｍ Ｄ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ， ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，Ｕ Ｚ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ (72)発明者 アンデラ，カール・シドニウス・マリア オランダ、エヌエル―2625エルエル・デル フト、フラベインホフ７番

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １． （ａ）微生物のための栄養として同化可能な炭素源および同化可能な窒素 源を含む水性培地中、グルコアミラーゼ（アスペルギルスの場合）またはセロビ オヒドロラーゼ（トリコデルマの場合）プロモーターの制御下で異種フィターゼ 遺伝子を有するアスペルギルスまたはトリコデルマ属の微生物をフィターゼの組 換え体発現を可能にする条件下で培養し； （ｂ）水性培地を濾過して微生物を除去して、水性濾液を得；次いで （ｃ）（ｂ）由来の濾液を限外濾過に付して、少なくとも１４，０００ＦＴＵ ／ｇのフィターゼ濃度を有する水性液体を得ることからなる、フィターゼを含む 水性液体の製法。 ２． 微生物がアスペルギルス・ニガー、アスペルギルス・オリザエまたはトリ コデルマ・レッセイである請求項１記載の製法。 ３． 微生物がグルコアミラーゼ（ＡＧ）遺伝子を有さないか、または発現しな い請求項１または２記載の製法。 ４． 微生物が多コピーのフィターゼ遺伝子を有する前記請求項のいずれか１項 記載の製法。 ５． 水性液体が実質上、タカ−アミラーゼを含有しない前記請求項のいずれか １項記載の製法。 ６． 実質上、培地中の全ての炭素および窒素源が（ｂ）における濾過前に微生 物によって消費された前記請求項のいずれか１項記載の製法。 ７． 水性液体が炭素および／または窒素源を含有しない前記請求項のいずれか １項記載の製法。 ８． フィターゼがグルコアミラーゼシグナル配列を有する微生物において発現 される前記請求項のいずれか１項記載の製法。 ９． 水性濾液または水性液体のいずれも結晶化および／または着色除去工程に 付さない前記請求項のいずれか１項記載の製法。 １０． 得られた水性液体が１８，０００ＦＴＵ／ｇ以上のフィターゼ活性を有 する前記請求項のいずれか１項記載の製法。 １１． 少なくとも１４，０００ＦＴＵ／ｇの濃度のフィターゼを含む前記請求 項のいずれか１項記載の製法によって調製できる水性液体。 １２． フィターゼが発現された培養基から得られる請求項１１記載の水性液体 。 １３． 少なくとも１５％（ｗ／ｗ）の食用炭水化物ポリマーおよび請求項１１ または１２記載の水性液体を加工処理して、フィターゼ含有顆粒を得ることから なる、動物飼料における使用に適するフィターゼ含有粒状物の製法。 １４． 水性液体および担体を混合し、得られた混合物を練合する請求項１３記 載の製法。 １５． 次いで顆粒を乾燥する請求項１４記載の製法。 １６． ａ）フィターゼを含有する水性液体を固形担体と混合し； ｂ）ａ）で得られた混合物を機械的に加工処理して酵素含有顆粒を得；次いで ｃ）ｂ）で得られた酵素含有顆粒を乾燥させることからなる、請求項１３また は１４記載の製法。 １７． 加工処理が押出し成形、ペレット成形、高剪断造粒、膨張、流動層凝集 またはそれらの組み合わせからなる、請求項１５記載の製法。 １８． 請求項１３〜１７のいずれか１項記載の製法により調製できるフィター ゼ含有粒状物。 １９． フィターゼおよび少なくとも１５％（ｗ／ｗ）の食用炭水化物ポリマー を含む固形担体から形成された乾燥顆粒を含んでなる粒状物。 ２０． 顆粒が少なくとも１個の２価カチオンを含む請求項１９記載の粒状物。 ２１． 顆粒が１以上の疎水性のゲル形成または水不溶性化合物を含む請求項１ ９または２０記載の粒状物。 ２２． 疎水性のゲル形成または水不溶性化合物が誘導体化セルロース、ポリビ ニルアルコール（ＰＶＡ）または食用油を含む請求項２１記載の粒状物。 ２３． 誘導体化セルロースがヒドロキシ−プロピル−メチル−セルロース、カ ルボキシ−メチル−セルロースまたはヒドロキシ−エチル−セルロースであり、 および／または食用油が大豆油もしくはカノーラ油である請求項２２記載の粒状 物。 ２４． さらにエンド−キシラナーゼおよび／またはβ−グルカナーゼを含む請 求項１９〜２３のいずれか１項記載の粒状物。 ２５． 担体がデンプンを含む請求項１９〜２４のいずれか１項記載の粒状物。 ２６． フィターゼが熱耐性（熱安定性）フィターゼ以外である請求項１９〜２ ５のいずれか１項記載の粒状物。 ２７． フィターゼが真菌性フィターゼである請求項１９〜２６のいずれか１項 記載の粒状物。 ２８． 真菌性フィターゼがアスペルギルスまたはトリコデルマ種由来である請 求項１９〜２７のいずれか１項記載の組成物。 ２９． 請求項１９〜２８のいずれか１項記載のフィターゼ含有粒状物を１以上 の動物飼料物質または成分と混合することからなる、動物飼料、動物飼料のプレ ミックスまたは前駆物質の製法。 ３０． 飼料物質および組成物または粒状物の混合物を蒸気処理し、ペレット成 形し、所望により乾燥させる請求項２９記載の製法 ３１． 請求項１９〜２８のいずれか１項記載の粒状物および／または少なくと も６，０００ＦＴＵ／ｇの活性を有するフィターゼ含有粒状物を含んでなる組成 物。 ３２． 食用飼料組成物である請求項３１記載の組成物。 ３３． 動物飼料である請求項３２記載の組成物。 ３４． 請求項１９〜２７のいずれか１項記載の粒状物と混合した１以上の飼料 物質または成分のペレットを含んでなる請求項３２または３３記載の組成物。 ３５． 請求項２９または３０記載の製法により調製できる動物飼料、または動 物飼料のプレミックスもしくは前駆物質である請求項３１〜３４のいずれか１項 記載の組成物。 ３６． 動物に請求項１９〜２７のいずれか１項記載の粒状物または請求項３１ 〜３５のいずれか１項記載の組成物を含む食餌を与えることからなる、動物の成 長を促進する方法。 ３７． 動物飼料における、または動物飼料の成分としての、または動物用食餌 における使用のための請求項１９〜２７のいずれか１項記載の粒状物の使用。 ３８． フィターゼのペレット成形安定性を改善するために、少なくとも１５％ （ｗ／ｗ）の食用炭水化物ポリマーをフィターゼの担体として含んでなる組成物 の使用。