CZ299459B6

CZ299459B6 - Zpusob prípravy granulátu obsahujícího fytázu, takto získaný granulát, zpusob prípravy krmiva pro zvírata, kompozice obsahující uvedený granulát, zpusob podporení rustu zvírat a použití uvedeného granulátu

Info

Publication number: CZ299459B6
Application number: CZ0433599A
Authority: CZ
Inventors: Carolus Maria Barendse@Rudolf; Marinus Henricus Meesters@Gabriel; Sidonius Maria Andela@Carl
Original assignee: Basf Aktiengesellschaft
Priority date: 1997-06-04
Filing date: 1998-06-04
Publication date: 2008-08-06
Also published as: IL133280A0; JP2002502255A; EP1457560A1; WO1998054980A2; SK167899A3; EP0990026A2; ID24116A; SK167699A3; WO1998055599A3; EP0990026B1; IL133281A; ATE266721T1; DE69835815D1; PT990026E; DK0986313T3; IL133281A0; CA2292953A1; GB9928686D0; ES2272005T3; EP0986313A2

Abstract

Zpusob prípravy granulátu obsahujícího fytázu s aktivitou alespon 6000 FTU/g, vhodného pro použití v krmivu pro zvírata, jehož podstata spocívá v tom, že se a) smísí vodná kapalina obsahující fytázu v koncentraci alespon 14 000 FTU/g s pevným nevláknitým nosicem obsahující alespon 30 % hmotnosti škrobu; b) smes získaná v kroku a) se vytlacuje k získání granulí obsahujících enzym s obsahem vody 30až 40 % a majících velikost od 100 do 2000 mikrometru; a c) granule obsahující enzym získané v kroku b) se suší. Dále se popisuje takto získaný granulát, zpusob prípravy krmiva pro zvírata, kompoziceobsahující uvedený granulát, zpusob podporení rustu zvírat a použití uvedeného granulátu.

Description

Způsob přípravy granulátu obsahujícího fytázu, takto získaný granulát, způsob přípravy krmivá pro zvířata, kompozice obsahující uvedený granulát, způsob podpoření růstu zvířat a použití uvedeného granulátu

Oblast techniky

Vynález se týká způsobu přípravy granulátu obsahujícího fytázu, takto získaného granulátu, způsobu přípravy krmivá pro zvířata, kompozice obsahující uvedený granulát, způsobu podpoření io růstu zvířat a použití uvedeného granulátu.

Dosavadní stav techniky

Použití různých enzymů, jakým je například íýtáza, v krmivech pro zvířata, například v rámci živočišné výroby, se stává obvyklou praxí. Tyto enzymy jsou do krmiv přidávány za účelem zlepšení biodostupnosti živných a minerálních látek pro zvířata, přičemž tyto enzymy mohou rovněž zlepšit stravitelnost složek krmivá. Takové enzymy jsou obvykle vyráběny kultivací mikroorganismů ve fermentorech provozovaných v rámci velkovýroby průmyslovými výrobci enzymů. Po ukončení fermentace se rezultující břečka podrobí řadě filtračních stupňů za účelem oddělení biomasy (mikroorganismy) od požadovaného enzymu (v roztoku). Takto získaný roztok enzymu se potom prodává buď ve formě kapaliny (často až po přidání různých stabilizátorů), nebo se zpracuje na suchou formulaci.

Kapaliny s obsahem enzymu a suché formulace obsahující enzym jsou potom použity v komerčním měřítku při velkovýrobě krmiv. Kapalné formulace mohou být přidány ke krmivům až po jejich peletizaci, aby se zabránilo tepelné desaktivaci enzymu nebo enzymů, ke které by jinak mohlo dojít v průběhu peletizačního procesu.

Suché formulace obvykle podstupují parní peletizaci, při které se krmivo vystaví před peletizaci účinku vstřikované páry. Při následném peletizačním stupni se krmivo tlačí skrze průvlak a získané pásy se nasekají na vhodné pelety různých délek. V průběhu tohoto procesu může teplota vystoupit na 60 až 95 °C.

Fytázy jsou enzymy, které (alespoň částečně) hydrolyzují fytát (myo-inositolhexakis-fosfát) na myo-inositol a anorganický fosfát. Tyto enzymy se nacházejí v pšeničných otrubách, v semenech rostlin, v živočišných střevech a mohou být rovněž produkovány mikroorganismy. Fytázy se dodávají do krmivá pro zvířata, protože jsou schopné odbourávat fytát a mohou zvyšovat biodostupnost fosforu a dalších nutričních složek pro zvířata. Fytázy mohou rovněž zvyšovat stravi40 telnost vápníku.

Fosfor je esenciálním prvkem pro růst organismu. Hospodářským zvířatům je do krmivá často přidáván anorganický fosfor za účelem dosažení dobrého růstu monogastrických zvířat. To však není často zapotřebí v případě krmiv určených pro přežvýkavce vzhledem k tomu, že v bachoru přežvýkavců jsou přítomné mikroorganismy, které katalyzují konverzi fytátu na inositol a anorganický fosfát. Odbourání fytátu je často žádoucí vzhledem k tomu, že kyselina fytová může mít antinutriční charakter v případě, že chelatizuje užitečné minerály, jakými jsou vápník, zinek, hořčík a železo, přičemž může rovněž nepříznivě reagovat s proteiny a tak snižovat jejich biodostupnost pro zvířata. Přídavek fytázy může rovněž snížit množství anorganické složky krmivá, které by mělo být přidáno, v důsledku čehož dochází k vylučování menšího množství fosforu ve hnoji, čímž se hnůj stává přijatelnější pro okolní životní prostředí.

Pro různé fytázové enzymy již byly klonovány a exprimovány příslušné geny. Takto EP-A 0 420 358 (Gist-Brocades) popisuje expresi mikrobiálních fýtáz.

- 1 CZ 299459 B6

V pozdější patentové přihlášce EP-A 0 684 313 (Eloffmann La Roche) se popisují sekvence DNA kódující různé polynukleotidy mající fytázovou aktivitu.

V patentovém dokumentu EP-A 0 758 018 (Gist-Brocades) se popisují způsoby zlepšení stabili5 ty enzymů, zejména určených pro použití v krmivech pro zvířata a jsou zde uvedeny fytázy.

V patentovém dokumentu WO-A 94/03612 (Alko) se popisuje výroba enzymů odbourávajících fytát kultivací mikroorganismu Trichoderma, zatímco patentový dokument WO-A 97/16076 (Novo Nordisk) popisuje přípravky obsahující enzym pro použití při výrobě krmiv pro zvířata ío obsahujících různé hydrofobní látky.

Krmivo pro zvířata představuje jednu z největších nákladových položek při chovu hospodářských užitkových zvířat a i ostatních zvířat. Kromě toho přísady, jakými jsou například fytázy, mohou ještě dále významně zvýšit pořizovací náklady spojené s krmivý. Proto je jedním z cílů vynálezu poskytnout fytázové kompozice, které se vyrábí s nižšími pořizovacími náklady. Toho může být dosaženo v případě, že bude možné vyrobit fytázové kompozice s vysokým obsahem fytázy nebo s vysokou aktivitou fytázy. Existuje několik faktorů, které umožnily přihlašovateli vyrobit také kompozice s vysokou aktivitou fytázy a tyto faktory budou diskutovány v další části popisu.

Dodatečnou výhodou přípravy kompozic s vysokou aktivitou fytázy, která byla přihlašovatelem zjištěna, je to, že tyto kompozice vykazují citelně zvýšenou stabilitu enzymu, zejména v průběhu peletizačního procesu při přípravě krmiv pro zvířata (ve formě pelet), v důsledku čehož si krmivo zachovává vyšší aktivitu fytázy ve srovnání s kompozicemi podle dosavadního stavu techniky.

Podstata vynálezu

Předmětem vynálezu je způsob přípravy granulátu obsahujícího fytázu s aktivitou alespoň 6000 FTU/g, vhodného pro použití v krmivu pro zvířata, jehož podstata spočívá v tom, že se

a) smísí vodná kapalina obsahující fytázu v koncentraci alespoň 14 000 FTU/g s pevným nevláknitým nosičem obsahující alespoň 30 % hmotnosti škrobu;

b) směs získaná v kroku a) se vytlačuje k získání granulí obsahujících enzym s obsahem vody 30 až 40 % a majících velikost od 100 do 2000 mikrometrů; a

c) granule obsahující enzym získané v kroku b) se suší.

Předmětem vynálezu je rovněž granulát obsahující fytázu mající aktivitu alespoň 6000 FTU/g připravitelný výše uvedeným způsobem. Granulát výhodně obsahuje vysušené granule z fytázy a pevného nevláknitého nosiče, který obsahuje alespoň 30 % hmotnosti škrobu, přičemž granulát má velikost částic od 100 do 2000 mikrometrů a aktivitu alespoň 6000 FTU/g. Granule výhodně obsahují alespoň jeden dvouvalenční kation a/nebo jednu nebo více hydrofobních, gelotvomých nebo ve vodě nerozpustných sloučenin. Výhodně hydrofobní, gelotvomá nebo ve vodě neroz45 pustná sloučenina obsahuje derivatizovanou celulózu, polyvinylalkohol nebo jedlý olej. Derivatizovanou celulózou je výhodně hydroxypropylmethylcelulóza, karboxymethylcelulóza nebo hydroxyethylcelulóza a/nebo jedlým olejem je sójový olej nebo olej canola. Granulát výhodně dodatečné obsahuje endo-xylanázu a/nebo beta-glukanázu. Výhodně je fytáza jiná než tepelně tolerantní fytáza a/nebo fungální fytáza, přičemž uvedená fungální fytáza je případně odvozena od druhů Aspergillus nebo Trichoderma.

Předmětem vynálezu je rovněž způsob přípravy krmivá pro zvířata, předsměsi pro toto krmivo nebo prekurzoru tohoto krmivá, jehož podstata spočívá v tom, že se smísí výše definovaný granulát obsahující fytázu s jednou nebo více látek nebo přísad, které jsou součástí krmivá pro zvířata.

-2CZ 299459 B6

Výhodně se směs látek a přísad, které jsou součástí krmivá, a kompozice nebo granulátu podrobí účinku páry, načež se peletizuje a případně suší.

Předmětem vynálezu je rovněž kompozice obsahující výše definovaný granulát. Výhodně je tato kompozice jedlou krmivovou kompozicí a/nebo krmivém pro zvířata. Výhodně obsahuje pelety tvořené jednou nebo více látkami nebo přísadami, které tvoří součást krmivá, smíšenými s výše definovaným granulátem. Výhodně je tato kompozice krmivém pro zvířata, předsměsí pro toto krmivo nebo prekurzorem tohoto krmivá, které jsou připravitelné výše definovaným způsobem.

Předmětem vynálezu je rovněž způsob podpoření růstu zvířat, jehož podstata spočívá v tom, že se zvířata krmí potravou, která obsahuje výše definovaný granulát nebo výše definovanou kompozici.

Předmětem vynálezu je rovněž použití výše definovaného granulátu v krmivu pro zvířata nebo jako složky krmivá pro zvířata nebo pro použití v neterapeutické zvířecí dietě.

Příprava vodné kapaliny obsahující fytázu zahrnuje

a) kultivaci ve vodném prostředí mikroorganismu rodu Aspergillus nebo Trichoderma majícího heterologní gen fytázy pod kontrolou glukoamylazového (v případě rodu Aspergillus) nebo celobiohydrolazového (v případě rodu Trichoderma) promotoru a za podmínek umožňujících rekombinantní expresi fytázy, přičemž vodné prostředí obsahuje jako živinu pro mikroorganismus asimilovatelný zdroj uhlíku a asimilovatelný zdroj dusíku,

b) filtraci vodného prostředí za účelem odstranění mikroorganismu a získání vodného filtrátu, a

c) podrobení filtrátu získaného ve stupni b) mikrofiltraci k získání vodné kapaliny mající koncentraci fytázy rovnou alespoň 14 000 FTU/g.

Nově bylo zjištěno, že tento způsob poskytuje obzvláště vysokou koncentraci fytázy v získaném vodném roztoku. To umožnilo přípravu dalších fytázových kompozic, které mají rovněž vysokou hladinu aktivity enzymu, což znamená, že uvedený způsob je nejen lacinější (náklady jsou vztaženy na jednotku enzymatické aktivity), nýbrž i poskytuje vyšší stabilitu enzymu vzhledem k tomu, že bylo zjištěno, že koncentrovanější kompozice obsahující fytázu jsou mnohem více sta35 bilnější než kompozice s nižší koncentrací.

Výhodnými mikroorganismy jsou druhy Aspergillus niger, Aspergillus oryzae nebo Trichoderma reesei. V případě mikroorganismu Aspergillus je gen fytázy vhodně pod kontrolou glukoamylázového (nebo amyloglukosidázového (AG)) promotoru. V případě mikroorganismu Trichoderma je výhodné použít celobiohydrolázový promotor.

Asimilovatelný zdroj uhlíku může zahrnovat glukózu nebo/a maltodextrin nebo/a asimilovatelný zdroj dusíku může obsahovat amoniové ionty. Glukóza a amoniové ionty mohou být jedinými zdroji asimilovatelného uhlíku nebo dusíku ve vodném prostředí. Předpokládá se, že nebude použit žádný komplexní zdroj uhlíku nebo dusíku. Amoniové ionty mohou být dodány ve formě buď amoniaku, nebo amonné soli. Výhodné amonné soli zahrnují dusičnan amonný, síran amonný a fosforečnan amonný.

Výhodně se zdroj uhlíku nebo/a dusíku dodá do kultivačního prostředí v průběhu fermentačního procesu. Rychlost dodávky jak zdroje uhlíku, tak i zdroje dusíku může být v podstatě stejná jako rychlost konzumace těchto zdrojů mikroorganismem. Takto může být zdroj uhlíku nebo/a dusíku dodáván do kultivačního prostředí kontinuálním způsobem. Zdroj uhlíku a zdroj dusíku mohou být dodávány do kultivačního prostředí odděleně nebo společně.

-3 CZ 299459 B6

Získaná vodná kapalina může mít koncentraci fytázy alespoň rovnou 16 000 a možná i 18 000 FTU/g nebo dokonce ještě vyšší koncentraci fytázy.

Použitím uvedených mikroorganismů za uvedených podmínek se dosáhne relativně vysoké kon5 centrace fytázy ve filtrátu. To umožňuje jeho ultrafiltrací. Při realizaci některých dosud známých způsobů obsahuje rezultující filtrát příliš mnoho jemně desintegrovaného pevného podílu a příliš mnoho dalších látek na to, aby mohla být provedena jeho ultrafiltrace (dochází k ucpání filtru uvedenými látkami). Avšak při provádění způsobu podle vynálezu se získá relativně čirý filtrát, který může být podroben ultrafiltrací bez dalšího dodatečného zpracování, přičemž tato ultraío filtrace poskytuje vodnou kompozici s vysokou koncentrací fytázy.

V rámci způsobů dosavadního stavu techniky byla diskutována možnost podrobení buď filtrátu, nebo vodné kompozice buď krystalizačnímu, nebo/a odbarvovacímu stupni, provedenému například filtrací přes aktivní uhlí. Při způsobu podle vynálezu však nemusí být oba uvedené stupně (které by jinak zvyšovaly provozní náklady výroby fytázy) provedeny.

Výhodně mikroorganismy nemají nebo alespoň neexprimují glukoamylázový gen. To znamená, že mikroorganismus může věnovat více energie výrobě fytázy.

Mikroorganismus může mít několik kopií genu fytázy. Bylo zjištěno, že tímto způsobem může být dosaženo vyšší produktivity při produkci fytázy, protože takto dochází k expresi většího počtu genů fytázy.

Vodná kompozice může být v podstatě prosta taka-amylázy.

Při provádění uvedeného způsobu je výhodné, jestliže mikroorganismus zkonzumuje ještě před filtrací provedenou v rámci stupně b) (v podstatě) veškeré množství zdroje uhlíku nebo/a dusíku. Toho může být dosaženo tím, že se fermentace nechá probíhat po určitou dobu ještě potom, co došlo k poslední dodávce zdroje uhlíku nebo/a dusíku. Alternativně je možné ponechat probíhat fermentaci ještě za stupněm, kdy byl přidán veškerý zdroj uhlíku nebo/a dusíku. Jednoznačně patrnou výhodou takového postupu je, že vodná kompozice je potom (v podstatě) prosta zdroje uhlíku nebo/a dusíku (například prosta glukózy nebo/a amonných iontů). To má rovněž za následek získání čistší vodné kapaliny, která může obsahovat menší množství vedlejších produktů. Snížením počtu vedlejších produktů lze minimalizovat počet procesních stupňů nezbytných k získání požadované vysoké enzymatické aktivity fytázy.

Nej výhodnějším mikroorganismem je Aspergillus niger. Je rovněž výhodné, když je fytáza exprimována v mikroorganismu s glukoamylázovou signální sekvencí.

V rámci této přihlášky vynálezu pojem „fytáza“ nezahrnuje pouze přírodně se vyskytující fytázu, nýbrž zahrnuje i jakýkoliv enzym, který má aktivitu fytázy, například schopnost katalyzovat reakci zahrnující odstranění nebo uvolnění anorganického fosforu (fosforečnanu) z myoinositolfosfátů. Výhodně bude fytáza náležet do třídy EC 3.1.3.8. Samotnou fytázou je výhodně fungální fytáza, jakou je například fytáza odvozená od druhů Aspergillus nebo Trichoderma.

Při způsobu přípravy fytázových formulací ve formě granulátů se jako nosič používá jedlý uhlohydrátový polymer. Tento nosič může být v zrnité nebo práškové formě. Vodná kapalina obsahující fytázu, kterou je například roztok nebo suspenze, může být smíšena s pevným nosičem, na kterém dochází k její absorpci. V průběhu míšení nebo po něm se kapalina obsahující fytázu a pevný nosič zpracují na granulát, který může být následně vysušen. Použití uhlohydrátového nosiče umožňuje absorpci většího množství kapaliny (a tudíž i fytázy). Získaná směs může být použita k vytvoření tvárné pasty nebo neelastické hmoty, které mohou být snadno zpracovány na granule, což znamená že tato pasta nebo hmota je vytlačovatelná v extrudéru. Vhodně nosič neobsahuje vlákna, což umožní snadnější granulací: případně přítomná vlákna by mohla bránit granulaěnímu procesu realizovaného vytlačováním.

-4CZ 299459 B6

V rámci dosavadního stavu techniky existuje celá řada dokumentů týkajících se pelet obsahujících enzymy, avšak takové pelety nacházejí použití jako povrchově aktivní činidla (detergenty), nejčastěji v pracích prášcích. Na rozdíl od toho se předmět přihlášky vynálezu týká použití pelet v krmivech pro zvířata a z tohoto důvodu jsou granuláty podle vynálezu jedné (pro zvířata) a výhodně také stravitelné. Není proto překvapující, že granuláty, granule a kompozice podle vynálezu jsou prosté mýdel, detergentů a bělidel, zeolitů, pojiv, plniv (TiO₂, kaolin, křemičitany, talek, atd.) a obdobných látek.

Jedlý uhlohydrátový polymer by měl být zvolen tak, aby byl pro zvíře, pro které je krmivo určeno, jedlý a výhodně také stravitelný. Takové polymery výhodně zahrnují glukózu (například polymer obsahující glukózu) nebo jednotky (C6Hio0₅)_n. Výhodně uhlohydrátový polymer obsahuje α-D-glukopyranozové jednotky, amylózu (lineární (1 —>4)-a-D-glukanový polymer) nebo/a amylopektin (rozvětvený D-glukan s vazbami (1—>4)-a-D a (1—>6)-a-D). Výhodným uhlohydrátovým polymerem je škrob. Další vhodné polymery obsahující glukózu, které mohou být použity místo škrobu nebo společně se škrobem, zahrnují α-glukany, β-glukany, pektin (jakým je proto-pektin) a glykogen. Rovněž lze uvažovat o derivátech uvedených polymerů, jakými jsou jejich ethery nebo/a estery, i když je třeba nejlépe se vyhnout zželatinovanému škrobu, který by neměl být přítomen. Vhodným uhlohydrátovým polymerem je ve vodě nerozpustný uhlohydrátový polymer.

V dále uvedených příkladech je použit kukuřičný, bramborový a rýžový škrob. Rovněž však mohou být použity škroby získané s dalších zdrojů (například z rostlin, jakými jsou například zelenina nebo jiná zemědělská plodina), mezi které například patří tapioka, maniok, pšenice, ságo, žito, oves, ječmen, jam, sorgum nebo maranta třinová. Stejně tak mohou být v rámci vynálezu použity přirozeně se vyskytující nebo modifikované (například dextrin) typy škrobů. Výhodně uhlohydrát (například škrob) obsahuje malé množství nebo nulové množství proteinu, například méně než 5 % hmotn., například méně než 2 % hmotn, a výhodně méně než 1 % hmotn.

Alespoň 15 % hmotn. pevného nosiče může být tvořeno uhlohydrátovým polymerem (jakým je například škrob). Výhodně je však alespoň 30 % hmotn. pevného nosiče tvořeno uhlohydrátem a optimálně je alespoň 40 % hmotn. pevného nosiče tvořeno uhlohydrátem. Výhodněji uhlohydrát (například škrob) tvoří převážnou složku pevného nosiče, což znamená, že například více než 50 % hmotn., výhodně alespoň 60 % hmotn., vhodně alespoň 70 % hmotnosti a optimálně ales35 poň 80 % hmotnosti pevného nosiče je tvořeno uvedeným uhlohydrátem. Tyto hmotnostní procentické údaje jsou vztaženy na celkovou hmotnost neenzymových složek ve finálním suchém granulátu.

Množství kapaliny obsahující íytázu (a tudíž i množství enzymu), které může být absorbováno nosičem je obvykle omezeno množstvím vody, které může být absorbováno. Pro přírodní granulámí škrob se může uvedené množství pohybovat mezi 25 a 30 % hmotn. aniž by přitom byla použita zvýšená teplota (která by způsobila nabobtnání škrobu). V praxi bude procentické množství enzymové kapaliny, určené pro přidání k uhlohydrátu, často mnohem větší, protože kapalina obsahující enzym bude obvykle obsahovat velké množství pevného podílu. Fytázový roztok může obsahovat asi 25 % hmotnosti pevného podílu, v důsledku čehož mohou být uhlohydrát (například škrob) a fytázový roztok smíšeny v poměru uhlohydrát: fytázový roztok rovném 0,5 : 1 až 2 : 1, například 1,2 : 1 až 1,6 : 1, což je v poměru asi 60 % hmotn.: 40 % hmotn. Výhodně se k pevnému nosiči přidá takové množství kapaliny, že (v podstatě) veškerá voda v uvedené (vodné) kapalině je absorbována uhlohydrátem přítomným v pevném nosiči.

Při zvýšených teplotách mohou škrob a ostatní uhlohydrátové polymery absorbovat mnohem větší množství vody při současném nabobtnání. Z tohoto důvodu je uhlohydrátový polymer schopen absorbovat vodu (nebo vodné kapaliny obsahující enzym) požadovaným způsobem. Tak například kukuřičný škrob může absorbovat při teplotě 60 °C množství vody, které je rovné trojnásobku jeho hmotnosti, přičemž při teplotě 70 °C tento škrob absorbuje množství vody rovné

-5CZ 299459 B6 až desetinásobku jeho hmotnosti. V rámci vynálezu se takto uvažuje o použití vyšších teplot za účelem dosažení absorpce větších množství kapaliny obsahující enzym, což přichází zejména v úvahu v případě tepelně stabilních enzymů. U těchto enzymů může být proto smíšení pevného nosiče a kapaliny (enzymu a vody) provedeno při zvýšené teplotě (například při teplotě vyšší než je okolní teplota), jakou je například teplota vyšší než 30 °C, výhodně vyšší než 40 °C a optimálně vyšší než 50 °C. Alternativně nebo dodatkově může být uvedená kapalina připravena při této teplotě.

Nicméně obecně jsou výhodné podmínky, při kterých k nabobtnání pevného nosiče nedochází, ío což znamená nízké teploty (například teplotu okolí). To může minimalizovat úbytek aktivity enzymů, ke kterému dochází v důsledku nestability enzymů (tepelně sensitivních enzymů) při zvýšených teplotách. Vhodnými teplotami pro smíšení enzymu a vody jsou teploty od 20 do °C.

Mechanické zpracování, použité v rámci vynálezu pro převedení směsi enzymu, vody (například kapaliny obsahující íytázu) a pevného nosiče do formy granulí (jinými slovy: granulování), může zahrnovat známé techniky, které se běžně používají v procesu formulace krmiv a enzymů. Tyto techniky mohou zahrnovat expanzi, vytlačování, sféronizaci, peletování, vysokostřižnou granulaci, bubnovou granulaci, aglomeraci ve fluidním loži nebo kombinaci uvedených technik. Tyto procesy jsou obvykle charakterizovány uplatněním mechanické energie, například prostřednictvím pohonu šneku, otáčení mísícího mechanismu, tlaku válcovacího mechanismu peletizačního stroje, pohybu částic způsobeného otáčením základnové desky, pohybu částic způsobeného proudem plynu v aglomeračním zařízení provozovaném na bázi fluidní vrstvy, přičemž lze použít i kombinace uvedených mechanismů. Tyto procesy umožňují smíšení pevného nosiče (například ve formě prášku) s enzymem a vodou, například ve formě kapaliny obsahující enzym (vodný roztok nebo suspenze) a následné granulování získané směsi.

V rámci další formy provedení vynálezu se granulát (například aglomerát) vytvoří postřikem pevného nosiče kapalinou obsahující enzym v aglomeračním zařízení s fluidní vrstvou. V tomto případě získané granule obsahují granulát, který může být vyroben v aglomeračním zařízení s fluidním ložem.

Výhodně míšení kapaliny obsahující íytázu a pevného nosiče může dodatečně zahrnovat hnětení směsi. To může zlepšit plastičnost směsi, což zase usnadňuje průběh granulace (například vytla35 čování).

V případě, že se granulát připravuje vytlačováním, potom se toto vytlačování výhodně provádí při nízkém tlaku. Výhodou tohoto nízkotlakového vytlačování je, že při něm nedochází nebo dochází jen v malé míře ke zvýšení teploty. Nízkotlakové vytlačování se například provádí v košovém extrudéru typu Fuji Paudal. Výhodně nemá vytlačování za následek zvýšení teploty vytlačovaného materiálu nad teplotu 40 °C. Vytlačováním mohou být získány granule, které se mohou odlamovat po průchodu skrze průvlak extrudéru, nebo mohou být získány pomocí řezačky.

Vhodně budou mít granule obsah vody 30 až 40 % hmotn., například 33 až 37 % hmotn. Obsah enzymu v granulích výhodně činí 3 až 10 % hmotn., zejména 5 až 9 % hmotn.

Získané granule mohou být zaobleny (sféronizace), například ve sféromizéru, zejména ve sféromizéru typu Marumeriser, nebo/a zhutněny. Granule mohou být zaobleny ještě před sušením, neboť se tím dosáhne omezení tvorby prachu ve finálním granulátu, přičemž zaoblený usnadňuje povlékání granulátu.

Granule mohou být potom vysušeny, například v sušičce s fluidním ložem, nebo může být v případě aglomerace prováděné ve fluidním loži přímo vysušen v aglomeračním zařízení k získání

-6CZ 299459 B6 pevného suchého granulátu. Mohou být použity i další sušicí metody, o kterých je obecně známo, že jsou vhodné pro sušení granulátu. Výhodně je granulát tekoucím produktem.

Uvedené sušení se výhodně provádí při teplotě od 25 do 60 °C, například při teplotě od 30 do

50 °C. Sušení může trvat od 10 minut do několika hodin, například od 15 do 30 minut. Doba sušení bude samozřejmě záviset na množství granulátu určeného k sušení, přičemž jako vodítko lze uvést, že vysušení jednoho kilogramu granulí trvá 1 až 2 sekundy.

Po vysušení granulí má rezultující granulát výhodně obsah vody rovný 3 až 10 % hmotn., napříío klad 5 až 9 % hmotn.

Získané granule mohou být povlečeny za účelem získání dodatečných (například výhodných) charakteristik nebo vlastností, mezi které patří nízký obsah prachu (neprašná úprava), získání požadované barvy, ochrana enzymu před okolním prostředím, dosažení různých účinků enzymu v jednom a téže granulátu nebo kombinace uvedených charakteristik. Granule mohou být povlečeny tukem, voskem, polymerem, solí nebo/a mastí nebo povlakem (například kapalinou) obsahujícím (druhý) enzym. Je samozřejmě možné povléci granule několika požadovanými vrstvami (různých) povlaků. Pro nanesení povlaku nebo povlaků na granule je známé celá řada postupů, které zahrnují použití fluidního lože, vysokostřižného granulátoru, mixéru-granulátoru nebo mixéru typu Nauta.

V rámci dalších forem provedení mohou být do granulátu zabudovány dodatečné přísady, mezi které například patří procesní pomocná činidla sloužící k dalšímu zlepšení stability enzymů v průběhu peletizačního procesu nebo/a stability granulátu v průběhu skladování. Některé z výhodných přísad j sou uvedeny dále.

Do granulátu mohou být začleněny soli (například společně s pevným nosičem nebo vodou). Výhodně mohou být přidány anorganické soli (jak je to navrženo v patentovém dokumentu EP-A 0 758 018), které mohou zlepšit zpracování a stabilitu v průběhu skladování suchého enzymové30 ho přípravku. Výhodnými anorganickými solemi jsou ve vodě rozpustné soli. Tyto soli mohou obsahovat dvojmocný kationt, jakým je (zejména) hořčík a vápník. Nej výhodnějším aniontem je síranový aniont, i když mohou být použity i další ve vodě rozpustné anionty. Soli mohou být přidány (například do směsi) v pevné formě. Nicméně tyto soli mohou být rozpuštěny ve vodě nebo v kapalině obsahující enzym a to ještě dříve než je uvedená voda nebo kapalina obsahující enzym smíšena s pevným nosičem. Vhodně je sůl přidána v množství alespoň rovném 15 % hmotn. (vztaženo na hmotnost enzymu), například v množství rovném alespoň 30 % hmotn. Nicméně sůl může být přidána v množstvím rovném až 60 % hmotn. nebo dokonce v množství rovném až 70 % hmotn. (opět vztaženo na hmotnost enzymu). Tato množství mohou být aplikována buď do granulí, nebo do granulátu. Granulát může proto obsahovat méně než 12 % hmotn. soli, například

2,5 až 7,5 % hmotn. soli, zejména 4 až 6 % hmotn. soli.

V případě, že je sůl přidána ve vodě, potom její množství může činit 5 až 30 % hmotn., zejména 15 až 25 % hmotn.

Dalšího zlepšení stability enzymu v průběhu peletizace může být dosaženo zabudováním hydrofobních, gelotvomých nebo pomalu (například ve vodě) rozpustných sloučenin. Tyto sloučeniny mohou být přidány v množství 1 až 10 % hmotn., například v množství 2 až 8 % hmotn. a výhodně v množství 4 až 6 % hmotn. (vztaženo na hmotnost vody a složek pevného nosiče). Takové vhodné sloučeniny zahrnují deriváty celulózy, jakými například jsou HPMC (hydroxypropyl50 methylcelulóza), CMC (karboxymethylcelulóza), HEC (hydroxyethylcelulóza; polyvinylalkoholy (PVA); nebo/a jedlé oleje. Tyto jedlé oleje, jako například sójový olej nebo olej canola, mohou být přidány (například do směsi určené ke granulaci) jako pomocná procesní činidla, i když je často výhodné, aby granuláty neobsahovaly žádné hydrofobní látky (například palmový olej).

-7CZ 299459 B6

Granuláty mají výhodně relativně úzkou distribuci velikosti částic (například jsou monodisperzní). Tato vlastnost může usnadnit homogenní distribuci enzymu v granulátu nebo/a homogenní distribuci enzymového granulátu v krmivu pro zvířata. V rámci způsobu podle vynálezu je snaha připravit granuláty s úzkou distribucí velikosti částic. Nicméně v případě potřeby je možné zařadit do způsobu podle vynálezu dodatečný stupeň, který ještě dále zužuje distribuci velikosti částic připravených granulí a který zahrnuje prosévání. Distribuce velikosti částic uvažovaného granulátu se vhodně pohybuje mezi 100 a 2000 mikrometry, výhodně mezi 200 a 1800 mikrometry a optimálně mezi 300 a 1600 mikrometry. Granule mohou mít nepravidelný (avšak výhodně pravidelný) tvar, například přibližně sférický tvar.

Do krmiv zvířat, která zahrnují krmivá určená pro domácí zvířata mohou být přidány další vhodné enzymy. Funkce těchto enzymů často spočívá ve zlepšení rychlosti konverze krmivá, čehož se dosáhne například snížením viskozity nebo snížením antinutričního účinku některých složek krmivá. Rovněž mohou být použity krmné enzymy, například za účelem snížení množství slouče15 nin ve hnoji, které jsou škodlivé pro okolní životní prostředí. Výhodnými enzymy pro tyto účely jsou: karbohydrázy, jakými jsou amyolytické enzymy a enzymy odbourávající rostlinnou buněčnou stěnu, zahrnující celulázy, jako β-glukanázy, hemicelulázy, jako xylanázy, nebo galaktanázy; peptidázy, galaktosidázy, pektinázy, esterázy; proteázy, výhodně s neutrálním nebo/a kyselým optimem pH; a lipázy, výhodně fosfolipázy, jako například savčí pankreatické fosfolipázy.

Výhodně tyto enzymy nezahrnují enzymy odbourávající škrob (například amylázy). V rámci některých forem provedení mohou být z enzymů vyloučeny proteázy, zejména ty, které mohou při trávení produkovat škodliviny.

Jestliže je enzymem enzym odbourávající rostlinnou buněčnou stěnu, jako například celuláza, a zejména hemiceluláza, jako xylana, potom finální granulát může mít aktivitu enzymu pohybující se od 3000 do 100 000, výhodně od 5000 do 80 000 a optimálně od 8000 do 70 000 EXU/g. Jestliže je enzymem celuláza, jako například β-glukonáza, potom může mít finální granulát enzymatickou aktivitu od 500 do 15 000, výhodně od 1000 do 10 000 a optimálně od 1500 do

7000 BGU/g.

Uvedené granule mohou obsahovat 5 až 20, například 7 až 15 % hmotn. enzymu nebo enzymů. Tyto enzymy mohou být přirozeně se vyskytujícími enzymy nebo rekombinantními enzymy.

Výhodný způsob podle vynálezu proto zahrnuje:

a) smíšení vodné kapaliny obsahující fytázu a pevného nosiče obsahující alespoň 15 % hmotn. jedlého uhlohydrátového polymeru, například smíšení pevného nosiče s vodnou kapalinou obsahující enzym;

b) případně hnětení získané směsi;

c) granulování, například mechanickým zpracováním, směsi za účelem získání granulí obsahujících enzym, například za použití granulátoru nebo vytlačováním;

d) případnou sféronizaci granulí; a

e) sušení získaných granulí k získání granulátu obsahujícího enzym.

V průběhu celého tohoto procesu je třeba udržovat nejvyšší teplotu, které je enzym vystaven nebo které jsou enzymy vystaveny, nižší než 80 °C.

Granuláty podle vynálezu jsou vhodné pro použití při přípravě krmiv pro zvířata. V rámci nejširší formy provedení vynález zahrnuje granulát obsahující íytázu a jedlý uhlohydrátový polymer, přičemž tento granulát má aktivitu alespoň rovnou 6000 FTU/g. Při výrobě krmiv pro zvířata se

-8CZ 299459 B6 uvedený granulát smísí s krmivovými látkami buď jako takový, nebo jako součást předsměsi. Charakteristiky granulátu podle vynálezu umožňují jeho použití jako složky směsi, která je obzvláště vhodná jako krmivo pro zvířata, zejména v případě, kdy je tato směs zpracována parou a následně peletizována. Vysušené granule mohou být v takových peletách viditelné nebo rozli5 šitelné.

Způsob přípravy krmivá pro zvířata nebo předsměsi pro taková krmivá nebo prekurzoru takových krmiv spočívá v tom, že se smísí výše definovaná kompozice s jednou nebo více látek (například zrní) nebo přísad tvořících součást krmiv pro zvířata. Směs může být sterilizována, například vystavením účinku páry. Rezultující kompozice se potom vhodným způsobem zpracuje na pelety.

Kompozice obsahující granulát je výhodně jedlou krmivovou kompozicí, jakou je například krmivo pro zvířata. Tato kompozice je výhodně ve formě pelet (z nichž každá může obsahovat 1 až 5 granulí, například 2 až 4 granule).

Vhodně uvedená kompozice obsahuje 0,05 až 2,0, například 0,3 až 1,0, optimálně 0,4 až 0,6, FTU/g íytázy. Xylanáza může být přítomna v množství 0,5 až 50, například 1 až 40, EXU/g. Alternativně nebo dodatečně může být přítomna celuláza v množství 0,091 až 1,0, například 0,2 až 0,4, BGU/g.

Uvedená kompozice může mít obsah vody 10 až 20 % hmotn., například 12 až 15 % hmotnosti. Množství enzymu nebo enzymů je vhodně rovno 0,0005 až 0,0012 % hmotn., zejména alespoň rovno 5 ppm.

V rámci způsobu podpoření růstu zvířat se zvířatům podává potrava obsahující výše definovanou kompozici. Tato potrava může zahrnovat buď granulát jako takový, nebo granulát přítomný v krmivu.

Šestý předmět vynálezu se týká použití kompozic v krmivu pro zvířata nebo jako složky pro tato krmivá nebo v potravinovém režimu zvířat.

Kompozice obsahující alespoň 15 % hmotnosti jedlého uhlohydrátového polymeru jako nosiče íytázy se používá za účelem zlepšení stability fytázi v průběhu peletizace.

Vhodnými zvířaty jsou hospodářská zvířata (prasata, drůbež, skot, koně, ovce), nepřežvykující nebo monogastrická zvířata (prasata, drůbež, mořská zvířata, jako například ryby), přežvýkavci (hovězí dobytek, ovce, například krávy, kozy, jeleni, telata a jehňata). Drůbež zahrnuje zejména slepice, kuřata a krocany a krůty).

Výhodné znaky a charakteristiky některého z předmětů vynálezu jsou rovněž aplikovatelné na další mutatis mutandis.

V následující části popisu bude vynález blíže objasněn pomocí konkrétních příkladů jeho provedení.

-9CZ 299459 B6

Příklady provedení vynálezu

Příklad 1

Fermentace Aspergillus niger CBS 513.88

Přípravky fungálních spor Aspergillus niger byly připraveny za použití standardních technik.

Spory a následně buňky pocházející ze série šaržových fermentací provedených v Erlenmayerových baňkách byly převedeny do fermentoru o obsahu 10 litrů. Po nárůstu kultury byl obsah fermentor použit jako zaočkovací kultura pro finální šaržovou fermentaci provedenou v objemu kultury rovném 500 litrů.

Použitá kultivační prostředí obsahují: 91 g/1 kukuřičného škrobu (BDH Chemicals), amonium, 38 g/1 hydrátu glukózy, 0,6 g/1 heptahydrátu síranu horečnatého, 0,6 g/1 chloridu draselného, 0,2 g/1 heptahydrátu síranu železnatého a 12 g/1 dusičnanu draselného. pH se udržuje na hodnotě 4,6 ± 0,3 automatickou titrací za použití buď 4N NaOH, nebo 4N H₂SO₄.

Buňky byly kultivovány při teplotě 28 °C a při automaticky regulované koncentraci rozpuštěného kyslíku (25 % nasycení vzduchu). Produkce íytázy dosáhla maximální úrovně 5 až 10 U/ml po 10 dnech fermentace.

Uvedená fermentace byla opakována za použití síranu amonného namísto kukuřičného škrobu (poskytujícího ekvivalentní obsah asimilovatelného dusíku).

Příklad 2

Čistění a charakterizace íytázy: test stanovující aktivitu íytázy

100 μΐ kultivačního filtrátu (v případě potřeby zředěného) nebo supematantu nebo 100 μΐ demineralizované vody použité jako referenční vzorek bylo přidáno do inkubační směsi mající násle35 dující složení:

- 0,25M natriumacetátový pufr, pH 5,5 nebo

- glycin/HCl-pufr, pH 2,5,

- lmM sodná sůl kyseliny fytové a

- demineralizovaná voda (doplněno na objem 900 μΐ).

Rezultující směs se inkubuje po dobu 30 minut při teplotě 37 °C. Reakce se zastaví přidáním 1 ml 10% kyseliny trichloroctové. Po ukončení reakce se přidají 2 ml činidla (3,66 g heptahydrátu síranu železnatého v 50 ml roztoku molybdenanu amonného (2,5 g (NH₄)₆Mo₇O₂₄.4H₂O a 8 ml kyseliny sírové, zředěno demineralizovanou vodou na finální objem 250 ml).

Intenzita modrého zbarvení se měří spektrofotometricky při 750 nm. Tato měření indikují množství uvolněného fosforečnanu při porovnání s fosforečnanovou kalibrační křivkou vynesenou pro koncentrační rozsah 0 až 1 mMol/1.

-10CZ 299459 B6

Příklad 3

A) Exprese fytázy v Aspergillus niger CBS 523.86 mediovaná expresním vektorem obsahujícím

A. Ficuum-fytázový gen kondenzovaný s promotorem nebo/a signálními sekvencemi genu A. niger-amiloglukosidázy

K dosažení nadměrné exprese fytázy v mikroorganismu Aspergillus niger se odvodí expresní kazeta, ve které je gen A. ficuum-íytázy pod kontrolou A. niger-amyloglukosidázového promoio toru (AG) v kombinaci se signální sekvencí. K získání delší vedoucí sekvence se promotorová sekvence AG kondenzuje se sekvencí kódující fytázu zahrnující fytázovou vedoucí sekvenci, která byla kondenzována fytázovým genovým fragmentem kódujícím zralý protein (viz příklad patentového dokumentu EP-A 0 420 358).

B) Exprese fytázového genu pod kontrolou promotoru AG v Aspergillus niger

Aspergillus niger, kmen CBS 513.88 (deponovaný 10.10.1988) byl transformován 10 pg fragmentu DNA známými postupy (viz například příklad 9 patentového dokumentu EP-A 0 420 358). Vždy jeden transformant byl izolován z každé expresní kazety a spory byly zaočko20 vány na selektivní acetamid-agarové desky. Byl proveden sběr spor každého transformantu po 3 denním nárůstu buněk při teplotě 37 °C na agarových deskách s 0,4% obsahem bramborové dextrózy (Oxoid, Velká Británie). Produkce fytázy byla testována v třepáčkových baňkách za následujících podmínek:

přibližně 1 x 10⁸ spor se zaočkuje do 100 ml předkultivačního prostředí, které v jednom litru obsahuje: 1 g KH₂PO₄, 30 g maltózy, 5 g kvasničného extraktu, 10 g kaseinového hydrolyzátu, 0,5 g heptahydrátu síranu horečnatého a 3 g Tween-u 80. pH bylo nastaveno na hodnotu 5,5.

Po nárůstu přes noc při teplotě 34 °C v rotační třepačce byl 1 ml kultivačního prostředí zaočko30 ván do 100 ml hlavního kultivačního prostředí, které v jednom litru obsahuje: 2 g KH₂PO₄, 70 g maltodextrinu (maldex MDO₃, Amylum), 12,5 g kvasničného extraktu, 25 g kaseionového hydrolyzátu, 2 g síranu draselného, 5 g heptahydrátu síranu horečnatého, 0,03 g chloridu zinečnatého, 0,02 g chloridu vápenatého, 0,05 g tetrahydrátu síranu horečnatého a síranu železnatého. pH se nastaví na hodnotu 5,6.

Mycelium se ponechá růst po dobu alespoň 140 hodin. Produkce fytázy se měří stejně jako v příkladu 2. Uvedená fermentace se opakuje za použití ekvivalentních množství glukosy a síranu amonného ve funkci zdroje uhlíku a dusíku. Kultivační břečka se zfiltruje k získání filtrátu, který je takto oddělen od biomasy. Za použití expresní kazety PFYT3 (promotor AG/vedoucí fytázová sekvence) se dosáhne maximální aktivity fytázy 280 U/ml.

Příklad 4

Čistění: izolace fytázy z filtrátu

Čistění provedené za účelem získání vysokopurifikované fytázy se provede následujícím způsobem:

1. kationtoměničová chromatografie při pH 4,9,

2. kationtoměničová chromatografie při pH 3,8,

3. aniontoměničová chromatografie při pH 6,3 a

4. ultrafiltrace.

-11 CZ 299459 B6

1. Fytázový filtrát se zředí 20 krát vodou a jeho pH se nastaví na hodnotu 4,9. Takto získaný podíl se nechá přetéci přes sloupec produktu S Sepharose Fast Flow, který je v rovnováze s 20 mM pufrem na bázi systému kyselina citronová/NaOH, pH 4,9. Nevázaný podíl s fýtázou se jímá a použije v následujícím stupni.

2. pH nevázaného podílu se nastaví z původní hodnoty 4,9 na hodnotu 3,8 a fýtáza se váže na sloupci produktu S Sepharose Fast Flow, který je v rovnováze s 2 mM pufrem na bázi systému kyselina citronová/NaOH, pH 3,8. Fytáza se potom eluuje ze sloupce 20 mM Na₃PO₄-50 mM ío NaCl-pufrem, pH 7,6.

3. Spojené frakce fytázy z druhého kationtoměničového stupně se nastaví na hodnotu pH 6,3 a fytáza se váže na sloupec produktu Q Sepharose Fast Flow, který je v rovnováze s 10 mM K₃PO₄-pufrem, pH 6,3. Fytáza se potom eluuje za použití elučního gradientu k dosažení koncent15 race v témže pudru až 1M.

Shrnutí	výsledků čistění
Vzorek	Purifikační faktor
Výchozí filtrát	1

Po kationtoměničové chromatografii,pH4,9 1,07

Po kationtoměničové chromatografii,pH3,8 1,2

Po aniontoměničové chromatografii,pHl,46 1,46

Finální produkt (po aniontoměničové chromatografii) obsahující 10 mg proteinu na 1 ml byl 20 desetkrát koncentrován ultrafiltrací za použití zařízení Amicon Stirred Cell (2L modul) s membránou typu Kalle E35 při tlaku 0,3 MPa.

Finální koncentrace přečištěné fytázy dosahuje hodnoty 280 až 300 g/1 (28 až 30 %). Při specifické aktivitě 100 FTU/mg proteinu to znamená aktivitu fytázy 28 000 až 30 000 FTU/g.

Příklad 5

Stabilitní testy provedené s vysokoaktivní fýtázou

Za účelem demonstrace skutečnosti, že vyšší koncentrace enzymu (v granulích získaných za použití kapaliny s vysokou aktivitou fytázy) poskytují vyšší stabilitu enzymu v průběhu peletizačního procesu, byly připraveny granuláty se stoupající koncentrací enzymu, načež byla testována stabilita fytázy ve vzorcích těchto granulátů v průběhu peletizace.

Srovnávací vzorek A:

Příprava enzymového granulátu na bázi kukuřičného škrobu s nízkou aktivitou enzymu míšením, hnětením, vytlačováním, sféronizací a sušením

Míšením a hnětením se připraví směs 73 % hmotn. kukuřičného škrobu, 4 % hmotnosti fytázového ultrafiltrátu s nízkým obsahem fytázy a 23 % hmotnosti vody. Tato směs se potom vytlačuje

- 12CZ 299459 B6 za použití košového extrudéru typu Nica E-220, přičemž se získá mokrý extrudát, který se potom sféronizuje v zařízení Fuji Paudal Marumeriser po dobu 2 minut k získání kulatých částic se středním průměrem 600 pm. Tyto částice se následně suší v sušičce s fluidním ložem typu Glatt GPCG 1.1. Finální aktivita granulátu je rovna 610 FTU/g.

Srovnávací vzorek B:

Příprava enzymového granulátu na bázi kukuřičného škrobu se střední aktivitou enzymu míšením, hnětením, vytlačováním, sféronizací a sušením

Míšením a hnětením se připraví směs 70 % hmotnosti kukuřičného škrobu, 17 % hmotnosti fytázového ultrafiltrátu se střední aktivitou enzymu a 13 % hmotnosti vody. Tato směs se vytlačuje za použití košového extrudéru typu Nica E-220, přičemž se získá mokrý extrudát, který se potom sféronizuje v zařízení Fuji Paudal Marumeriser po dobu 2 minut k získání středního průměru částic 600 pm. Tyto částice byly následně vysušeny v sušičce s fluidní vrstvou typu Glatt GPCG 1.1. Finální aktivita získaného granulátu byla rovna 4170 FTU/g.

Vzorek C:

Příprava enzymového granulátu na bázi kukuřičného škrobu s vysokou aktivitou enzymu míšením, hnětením, vytlačováním, sféronizací a sušením

Míšením a hnětením se připraví směs 67 % hmotn. kukuřičného škrobu, 30 % hmotn. fytázového ultrafiltrátu připraveného v příkladu 4 (avšak zředěného na aktivitu 18 400 FTU/g) a 3 % hmotn.

vody. Tato směs se potom vytlačuje za použití košového extrudéru typu Nica E-220, přičemž se získá mokrý extrudát, který se potom sféronizuje v zařízení typu Fuji Paudal Marumeriser po dobu 2 minut k získání kulatých částic mající střední průměr 500 pm. Tyto částice byly následně sušeny v sušičce s fluidní vrstvou typu Glatt GPCG 1.1. Finální aktivita získaného granulátu je rovna 6830 FTU/g.

Srovnání stabilit enzymu v průběhu peletizace

Jednotlivé typy granulátů byly následně podrobeny peletizačnímu testu a jejich stability byly potom vzájemně srovnány. Peletizační test sestává ze smíšení enzymového granulátu s krmivo35 vou předsměsí k dosažení obsahů 1500, 320 a 200 ppm. Tyto směsi se potom předběžně zpracují vstřikovanou parou k dosažení teploty 75 °C, načež se peletizují v peletizačním stroji při teplotě 82 °C k získání pelet, které se následně suší. Takový typ peletizačního procesu se zpravidla používá při průmyslové výrobě krmivových pelet.

V tabulce 1 jsou shrnuty výsledky peletizačních testů. Z těchto výsledků je patrné, že oba druhy pelet s vysokou koncentrací enzymu vykazují mnohem vyšší stabilitu enzymu v průběhu peletizace.

- 13 CZ 299459 B6

Tabulka 1

Výsledky paletizačních testů

Číslo vzorku	Aktivita granulátu v FTU/g	Teplota po zpracování parou (°C)	Teplota pelet CC)	Výtěžek enzymu po peletizaci {%>
Srovná-
vací
vzorek A	610	75	82	nižší než 17

Srovná-

vací
vzorek B	4170	75	82	37
Vzorek C	6830	75	82	48

Příklad 6

Příprava enzymového granulátu na bázi bramborového škrobu obsahujícího přísadu sójového oleje a síranu horečnatého míšením, hnětením, peletizací a sušením

Do mixéru/hnětače se předloží 30 kg bramborového škrobu, ke kterému se přimísí 2,5 kg 15 sójového oleje. Potom se přidá fytázový ultrafiltrát odvozený od mikroorganismu Aspergillus (16 840 FTU/g) a obsahující heptahydrát síranu horečnatého (3,5 kg MgSO₄.H₂O se rozpustí ve 14 kg ultrafiltrátu). Tento produkt se důkladně promísí v hnětači, načež se vytlačuje a vysuší v sušičce s fluidním ložem stejně jako v příkladu 1. Získá se produkt mající aktivitu 5870 FTU/g.

Příklad 7

Příprava enzymového granulátu na bázi rýžového škrobu míšením, hnětením, vytlačováním, sféronizací a sušením

Míšením a hnětením se připraví směs 62 % hmotn. rýžového škrobu a 38 % hmotn. stejného filtrátu, jaký byl použit v příkladu 6. Tato směs se vytlačuje za použití košového extrudéru typu Fuji Paudal, přičemž se získá mokrý extrudát, který se potom sféronizuje v zařízení Marumeriser po dobu 1 minuty k získání kulatých částic majících střední průměr 785 pm. Tyto částice se nás30 ledně vysuší v sušičce s fluidním ložem stejně jako v příkladu 1. Finální aktivita granulátu je rovna 7280 FTU/g.

- 14CZ 299459 B6

Příklad 8

Příprava enzymového granulátu na bázi kukuřičného škrobu obsahujícího přísadu hydroxy5 propylmethylcelulózy (HMPC) míšením, hnětením, vytlačováním, sféronizací a sušením

Hnětením směsi 54 % hmotn. kukuřičného škrobu, 5 % hmotn. hydroxypropylmethylcelulózy a 41 % hmotn. fytázového ultrafiltrátu použitého v příkladu 6 se získá enzymový přípravek, který se následně vytlačuje za použití košového extrudéru typu Fuji Paudal, přičemž se získá mokrý ío extrudát, který se sféronizuje v zařízení Marumeriser po dobu jedné minuty k získání kulatých částic majících střední průměr 780 pm. Tyto částice se potom suší v sušičce s fluidním ložem po dobu 20 minut při teplotě fluidního lože 40 °C a vstupní teplotě vzduchu 75 °C. Takto se získá suchý enzymový granulát, který má aktivitu 8470 FTU/g.

Příklad 9

Příprava enzymového granulátu na bázi kukuřičného škrobu obsahující přísadu hydroxyethylcelulózy (HEC) míšením, hnětením, vytlačováním, sféronizací a sušením

Enzymový přípravek zde byl získán míšením a hnětením 54 % hmotn. kukuřičného škrobu, 5 % hmotnosti hydroxymethylcelulózy a 41 % hmotn. stejného fytázového ultrafiltrátu, jaký byl použit v příkladu 6. Tato směs byla potom vytlačována za použití košového extrudéru typu Fuji Paudal, přičemž byl získán mokrý extrudát, který byl sféronizován v zařízení Marumeriser po dobu jedné minuty k získání kulatých částic majících střední průměr 780 μιη. Tyto částice byly následně sušeny v sušičce s fluidním ložem po dobu 20 minut při teplotě fluidního lože 40 °C a vstupní teplotě vzduchu 75 °C. Takto získaný suchý enzymový granulát měl aktivitu 8410 FTU/g.

Příklad 10

V rámci tohoto příkladu byl použit ultrafiltrát mající aktivitu 18 000 FTU/g, který je odvozen z ultrafiltrátu z příkladu 4 a zředěn.

Vzorky

Aktivity 3 připravených vzorků byly 610 FTU/g (srovnávací vzorek A), 4170 FTU/g (srovnávací vzorek B) a 6830 FTU/g (vzorek C). Tyto vzorky poskytují tři krmivá s aktivitou 1,153, 1,685 resp. 1,745 FTU/g krmivá.

150 g prvního vzorku bylo smíšeno s 20 kg krmivá, které bude popsáno níže. Potom byla tato předsměs smíšena s 80 kg krmivá a rozdělena do dvou částí, které budou podrobeny testům při dvou různých teplotách. 153,6 g druhého vzorku bylo smíšeno s 20 kg krmivá. Tato směs o hmotnosti 20 153,6 g byla rozdělena do dvou stejných částí. Každá z těchto částí byla potom smíšena s 230 kg krmivá k získání krmivového vzorku pro testy.

Pro účely třetího testu bylo 96 g granulátu smíšeno s 20 kg krmivá a získaná směs byl rozdělena do dvou částí o hmotnosti 10 048 g. Každá z těchto částí byla potom smíšena s 230 kg krmivá k získání krmivového vzorku pro testy. Rychlost peletizace byla 600 kg/h. Použitá krmivová směs byla tvořena:

20,00 % hmotn. kukuřice,

30,00 % hmotn. pšenice,

-15 CZ 299459 B6

10,00 % hmotn. sójových bobů,

18,20 % hmotn. sóji (hrubá moučka 46,7/3,7),

6,96 % hmotn. tapioky (65 % škrobu),

4,00 % hmotn. živočišné moučky (56,5/10,9),

1 % hmotn. rybí moučky (70,7 %),

1,30 % hmotn. směsi sójového a kukuřičného oleje,

4,00 % hmotn. živočišného tuku,

1,00 % hmotn. vitamino-minerálové předsměsi,

0,85 % hmotn. uhličitanu vápenatého, ίο 1,05 % hmotn. hydrogenfosforečnanu vápenatého,

0,26 % hmotnosti soli,

0,16 % hmotn. lysin-hydrochloridu a 0,21 % hmotn. DL-methioninu.

Uvedené tři směsi byly potom peletizovány. Za tím účelem bylo krmivo zavedeno do kondicionéru, kde bylo přímo vystaveno účinku páry. Jeho teplota stoupla na 75 °C. Potom bylo zavedeno do peletizačního stroje, kde bylo protlačováno skrze povlakovou desku s 5 mm otvory a 65 mm tloušťkou. Teplota krmivá v tomto stádiu stoupla o další 4 °C a dosáhla takto 79 °C.

Aktivita uvedených tří krmiv byla 10,11 (vzorek A), 10,04 (vzorek B) resp. 9,81 (vzorek C).

Při tomto testu byly stanoveny následující hodnoty zbytkové aktivity: 63 % (vzorek A), 66 % (vzorek B) resp. 72 % (vzorek C) pro vzorky s původní aktivitou 610, 4170 resp. 6 830 FTU/g. Z toho plyne, že dokonce při obdobných aktivitách (vzorek B a vzorek C) poskytuje formulace s nejvyšší aktivitou (vzorek C podle vynálezu: 6830 FTU/g)) mnohem vyšší stabilitu enzymu v průběhu peletizace. Tato stabilita je o 6 % vyšší než stabilita srovnávacího vzorku B, přičemž bylo pozorováno pouze malé 3% zvýšení stability (od vzorku A ke vzorku B), a to při výrazném zvýšení aktivity (z 610 FTU/g vzorku A na 4170 FTU/g vzorku B).

Claims

PATENTOVÉ NÁROKY

1. Způsob přípravy granulátu obsahujícího fytázu s aktivitou alespoň 6000 FTU/g, vhodného pro použití v krmivu pro zvířata, vyznačený tím, že se

a) smísí vodná kapalina obsahující fytázu v koncentraci alespoň 14 000 FTU/g s pevným nevlák40 nitým nosičem obsahujícím alespoň 30 % hmotnosti škrobu;

b) směs získaná v kroku a) se vytlačuje k získání granulí obsahujících enzym s obsahem vody 30 až 40 % a majících velikost od 100 do 2000 pm; a

45 c) granule obsahující enzym získané v kroku b) se suší.
2. Granulát obsahující fytázu mající aktivitu alespoň 6000 FTU/g připravitelný způsobem podle nároku 1.

- 16CZ 299459 B6
3. Granulát, vyznačený tím, že obsahuje vysušené granule z fytázy a pevného nevláknitého nosiče, který obsahuje alespoň 30 % hmotnosti škrobu, přičemž granulát má velikost částic od 100 do 2000 pm a aktivitu alespoň 6000 FTU/g.
5 4. Granulát podle nároku 3, vyznačený tím, že granule obsahují alespoň jeden dvouvalenční kation a/nebo jednu nebo více hydrofobních, gelotvomých nebo ve vodě nerozpustných sloučenin.

5. Granulát podle nároku4, vyznačený tím, že hydrofobní, gelotvomá nebo ve vodě ío nerozpustná sloučenina obsahuje derivatizovanou celulózu, polyvinylalkohol (PVA) nebo jedlý olej.
6. Granulát podle nároku 5, vyznačený tím, že derivatizovanou celulózou je hydroxypropylmethylcelulóza, karboxymethylcelulóza nebo hydroxyethylcelulóza a/nebo jedlým olejem

15 je sójový olej nebo olej canola.
7. Granulát podle některého z nároků 3 až 6, vyznačený tím, že dodatečně obsahuje endo-xylanázu a/nebo β-glukanázu.

20
8. Granulát podle některého z nároků 3 až 7, vyznačený tím, že fytáza je jiná než tepelně tolerantní, termostabilní, fytáza a/nebo fungální fytáza, přičemž uvedená fungální fytáza je případně odvozena od druhů Aspergillus nebo Trichoderma.
9. Způsob přípravy krmivá pro zvířata, předsměsi pro toto krmivo nebo prekurzoru tohoto

25 krmivá, vyznačený tím, že se smísí granulát obsahující fytázu definovaný v některém z nároků 3 až 8 s jednou nebo více látek nebo přísad, které jsou součástí krmivá pro zvířata.
10. Způsob podle nároku 9, vyznačený tím, že směs látek a přísad, které jsou součástí krmivá, a kompozice nebo granulátu se podrobí účinku páry, načež se peletizuje a případně suší.
11. Kompozice obsahující granulát podle některého z nároků 3 až 8.
12. Kompozice podle nároku 11, vyznačená tím, že je jedlou krmivovou kompozicí a/nebo krmivém pro zvířata.
13. Kompozice podle nároku 12, vyznačená tím, že obsahuje pelety tvořené jednou nebo více látkami nebo přísadami, které tvoří součást krmivá, smíšenými s granulátem podle některého z nároků 3 až 8.

40
14. Kompozice podle některého z nároků 11 až 13, vyznačená tím, že je krmivém pro zvířata, předsměsi pro toto krmivo nebo prekurzorem tohoto krmivá, které jsou připravitelné způsobem podle nároku 9 nebo 10.
15. Způsob podpoření růstu zvířat, vyznačený tím, že se zvířata krmí potravou, která

45 obsahuje granulát podle některého z nároků 3 až 8 nebo kompozici podle některého z nároků 11 až 13.
16. Použití granulátu definovaného v některém z nároků 2 až 8 v krmivu pro zvířata nebo jako složky krmivá pro zvířata nebo pro použití v neterapeutické zvířecí dietě.