ES2759300T3 - Subespecies de Bacillus subtilis - Google Patents

Abstract

Cepa Bacillus que tiene el número de acceso de depósito DSM 29870 o un mutante de la misma, en donde la cepa de Bacillus o el mutante de la misma no son hemolíticas, tiene una alta compatibilidad con monensina, tiene actividad antimicrobiana contra Clostridium perfringens y E. coli y es sensible a la vancomicina, clindamicina, cloranfenicol, gentamicina, kanamicina, estreptomicina, eritromicina y tetraciclina.

Description

DESCRIPCIÓN

Subespecies de Bacillus subtilis

Índice del listado de secuencias:

[0001]

La SEC ID N.°: 1 es la secuencia de ADN del gen gyrB de la DSM 29870 (que se obtiene como se describe en el ejemplo 3).

La SEC ID N.°: 2 es la secuencia de aminoácidos parcial deducida del gen gyrB de la SEC ID N.°: 1 de la DSM 29870.

La SEC ID N.°: 3 es la secuencia de ADN del gen rpoB de la DSM 29870 (que se obtiene como se describe en el ejemplo 4).

La SEC ID N.°: 4 es la secuencia de aminoácidos parcial deducida del gen rpoB de la SEC ID N.°: 3 de la DSM 29870.

La SEC ID N.°: 5 es la secuencia de ADN del gen gyrA (secuencia del genoma publicada de Bacillus subtilis subsp. Spizizenii CP002905).

La SEC ID N.°: 6 es la secuencia de aminoácidos parcial deducida del gen gyrA de la SEC ID N.°: 5.

La SEC ID N.°: 7 es la secuencia de ADN del gen gyrA de la DSM 29870.

La SEC ID N.°: 8 es la secuencia de aminoácidos del producto del gen gyrA de la SEC ID N.°: 7 de la DSM 29870.

La SEC ID N.°: 9 es el ADNr 16S de la DSM 29870.

Las SEC ID N.°: 10 a SEC ID N.°: 31 son cebadores de PCR y secuenciación.

La SEC ID N.°: 32 es la secuencia de ADN del gen gyrB de la DSM 29870 (que se obtiene del producto de PCR).

La SEC ID N.°: 33 es la secuencia de aminoácidos parcial deducida del gen gyrB de la SEC ID N.°: 32 de la DSM 29870.

La SEC ID N.°: 34 es la secuencia de ADN del gen rpoB de la DSM 29870 (que se obtiene del producto de PCR).

La SEC ID N.°: 35 es la secuencia de aminoácidos parcial deducida del gen rpoB de la SEC ID N.°: 34 de la DSM 29870.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

Campo de la invención

[0002] La presente invención se refiere a nuevas subespecies de Bacillus subtilis. La nueva subespecie puede mejorar la salud y el rendimiento de los animales de producción. En una realización, la subespecie de Bacillus subtilis tiene actividad contra Clostridium perfringens y/o E. coli. En una realización preferida, la subespecie de Bacillus subtilis tiene una alta compatibilidad con la monensina, por ejemplo, compatibilidad con al menos 2,4 |jg/ml de monensina tal como se determina en el ejemplo 12. La invención se refiere además a composiciones que comprenden una o varias cepas de la subespecie de Bacillus subtilis y al uso de la(s) cepa(s) de la subespecie de Bacillus subtilis en un pienso para animales.

Antecedentes de la invención

[0003] Bacillus es un género de bacterias gram-positivas en forma de bastón y miembro del filo Firmicutes. La especie Bacillus puede ser de aerobios obligados (dependientes del oxígeno) o de anaerobios facultativos (que tienen la capacidad de ser aeróbicos o anaeróbicos). Los Bacillus son ubicuos en la naturaleza e incluyen especies patógenas de vida libre (no parasitarias) y parasitarias. Bajo condiciones ambientales estresantes, las bacterias pueden producir endosporas ovales que no son esporas verdaderas pero a las que las bacterias pueden reducirse y permanecer en estado latente durante períodos muy largos.

[0004] Clostridium perfringens (C. perfringens) es una bacteria gram-positiva, con forma de bastón, anaerobia, formadora de esporas del género Clostridium. Las infecciones por C. perfringens muestran evidencia de necrosis tisular, bacteriemia, colecistitis enfisematosa y gangrena gaseosa, que también se conoce como mionecrosis clostridial. La C. perfringens también puede provocar infecciones anaeróbicas polimicrobianas. La incidencia de enteritis necrótica asociada a Clostridium perfringens en aves de corral ha aumentado en los países que han dejado de usar promotores de crecimiento antibiótico. La enteritis necrótica es una enfermedad enterotoxémica que produce pérdidas económicas significativas en la industria avícola.

[0005] Existe la necesidad de desarrollar herramientas y estrategias para la prevención y el control de C. perfringens en animales monogástricos como las aves de corral. Si bien se ha sugerido la vacunación de animales, existen desafíos asociados con la vacunación de miles de animales. Por lo tanto, sería beneficioso descubrir una solución que pudiera administrarse como aditivo en un pienso para animales.

[0006] Es un objeto de la invención proporcionar soluciones que eviten y/o controlen C. perfringens en aves de corral mediante el uso de un pienso para animales que comprenda una o varias bacterias con actividad contra Clostridium perfringens.

[0007] Un desafío de suministrar Bacillus spp. en piensos es el uso habitual de antibióticos como promotores del crecimiento en el pienso. Por lo tanto, es necesario determinar la compatibilidad de las cepas con los antibióticos en piensos de uso común, como la monensina, para identificar posibles conflictos con el uso como microbiano de alimentación directa. La presente invención se refiere en una realización a una subespecie de Bacillus subtilis de alta compatibilidad con monensina.

Descripción de la técnica relacionada

[0008] WO 2010/033714 describe un método para mejorar la salud de un animal que comprende administrar al animal una composición que comprende Bacillus subtilis QST713.

[0009] EE. UU. 4.919.936 describe un método para incrementar el aumento de peso en animales que comprende alimentar a un animal con un probiótico que comprende Bacillus subtilis C-3102.

[0010] Knap et al. describen que los Bacillus licheniformis tienen un efecto sobre la enteritis necrótica en pollos de engorde (Knap et al., 2010, "Bacillus licheniformis Prevents Necrotic Enteritis in Broiler Chickens", Avian Diseases 54 (2): 931-935).

[0011] WO2013/153159 describe la cepa Bacillus subtilis DSM25841 para uso en animales. La cepa es sensible a los antibióticos utilizados en humanos y tiene actividad antimicrobiana contra Clostridium perfringens y E. coli. Resumen de la invención

[0012] La presente invención se refiere a una nueva subespecie de Bacillus subtilis. Sorprendentemente se ha descubierto que la adición de microbios de alimentación directa (DFM) de esta subespecie de Bacillus subtilis al pienso para animales puede usarse para evitar y/o controlar las infecciones de C. perfringens y/o la enteritis necrótica en animales monogástricos como cerdos y/o aves de corral.

[0013] De este modo, la invención se refiere a una cepa Bacillus que tiene el número de acceso de depósito DSM 29870 o un mutante de la misma, en donde la cepa de Bacillus no es hemolítica, tiene una alta compatibilidad con monensina, tiene actividad antimicrobiana contra Clostridium perfringens y E. coli y es sensible a la vancomicina, clindamicina, cloranfenicol, gentamicina, kanamicina, estreptomicina, eritromicina y tetraciclina. En una realización preferida, la subespecie de Bacillus subtilis tiene una alta compatibilidad con la monensina, por ejemplo, compatibilidad con al menos 2,4 pg/ml de monensina tal como se determina en el ejemplo 12.

[0014] La presente invención también se refiere a composiciones, tales como piensos para animales o aditivos para piensos, que comprenden una o varias cepas de Bacillus de la invención y el uso de la composición para tratar una infección de Clostridium perfringens o para tratar enteritis necrótica en un animal con la composición de la invención. El uso de la composición según la invención para mejorar el rendimiento de un animal, por ejemplo, mejorar la tasa de conversión de pienso, mejorar el aumento de peso corporal y/o mejorar la eficiencia del pienso y/o mejorar la salud también es parte de esta invención.

[0015] La invención se refiere además a un método para evitar y/o controlar las infecciones de C. perfringens y/o la enteritis necrótica en animales monogástricos tales como cerdos o aves de corral mediante el uso de un pienso para animales, donde el pienso para animales comprende la cepa que tiene el número de acceso al depósito DSM 29870, donde la cepa de Bacillus tiene actividad antimicrobiana contra Clostridium perfringens y/o E. coli.

[0016] En una realización, la invención se refiere a un pienso para animales con el que se alimenta a un animal monogástrico tal como un ave de corral o un cerdo; que comprende la cepa que tiene el número de acceso de depósito DSM 29870, donde la cepa de Bacillus tiene actividad antimicrobiana contra Clostridium perfringens y/o E. coli.

[0017] En una realización preferida, la invención se refiere a una composición de pienso para animales, por ejemplo, un aditivo para piensos de animales que comprende una cepa de Bacillus en la que:

i. la cepa de Bacillus tiene el número de acceso al depósito DSM 29870 o un mutante de la misma, y ii. la cepa de Bacillus tiene actividad antimicrobiana contra Clostridium perfringens y/o E. coli.

[0018] En otro aspecto, la invención se refiere a un método para evitar y/o controlar las infecciones de C. perfringens y/o la enteritis necrótica en animales como cerdos o aves de corral, que comprende los pasos de:

(a) alimentar a un animal, por ejemplo, con un pienso para cerdos o un pienso para aves de corral; y (b) administrar a un animal como un cerdo o un ave de corral una o varias cepas de Bacillus o esporas de dichas cepas en las que la cepa tiene el número de acceso al depósito DSM 29870 o un mutante de las mismas,

donde la cepa de Bacillus tiene actividad antimicrobiana contra Clostridium perfringens y/o E. coli, y donde el paso (a) ocurre antes, después o a la vez que el paso (b).

[0019] En una realización, el método se refiere a un pienso para animales con el que se alimenta a animales monogástricos tales como cerdos y/o aves de corral. Las aves de corral pueden ser, por ejemplo, pollos o aves de engorde o ponedoras.

[0020] En una realización, la composición de pienso para animales comprende una o varias bacterias adicionales; se alimenta con ella a un animal monogástrico tal como un cerdo y/o un ave de corral; y además comprende un concentrado y/o una o varias enzimas y/o uno o varios microbios adicionales y/o una o varias vitaminas y/o uno o varios minerales y/o uno o varios aminoácidos y/o uno o varios de otros ingredientes del pienso.

Leyendas de las figuras

[0021]

Figura 1: Filograma del genoma central de la especie Bacillus. Tenga en cuenta que las subespecies amyloliquefaciens y plantarum de B. amyloliquefaciens se separan con un soporte de arranque de 1 (100 %). Figura 2: Filograma rectangular con enraizamiento en el punto medio de los miembros de la especie Bacillus. Todos los borradores del genoma y los genomas completos de Bacillus subtilis que estaban disponibles en NCBI el 29-12-2014 se incluyeron en el análisis junto con representantes de otras especies. Los números indican soporte de arranque (1 = 100 %). La barra de escala en la parte superior izquierda indica una distancia evolutiva de 0,1 sustituciones de aminoácidos por posición. Vea la tabla para las descripciones de especies.

Figura 3: Filograma rectangular de miembros del género Bacillus. Esta es una vista ampliada de la figura 2 para mostrar la relación de O52BCU (alias cepa DSM 29870) con sus vecinos más cercanos.

Definiciones

[0022] En general, los términos y frases utilizados en este documento tienen su significado reconocido en la técnica, que se puede encontrar consultando textos estándar, referencias de revistas y contextos conocidos por los expertos en la materia. Las siguientes definiciones se proporcionan para aclarar su uso específico en el contexto de la divulgación.

[0023] Según se usa en este documento, las formas singulares "un", "uno/a" y "el" pretenden incluir también las formas plurales, a menos que el contexto indique claramente lo contrario.

[0024] ANI (identidad nuclear promedio): La hibridación ADN-ADN (DDH) se ha utilizado tradicionalmente para la definición filogenética de una especie. Basándose en DDH, las cepas con más del 70 % de relación se considerarían pertenecientes a la misma especie [Report of the Ad-Hoc-Committee on Reconciliation of Approaches to Bacterial Systematics. Int J Syst Bacteriol 37: 463-464] Con la disponibilidad de tecnologías de secuenciación del genoma completo baratas y asequibles, así como la mayor disponibilidad de genomas públicos, los métodos de estimación de especies basadas en el genoma completo se están volviendo populares, ya que ofrecen elegantes soluciones in silico como métodos alternativos de DDH. ANI es un enfoque basado en la distancia para delinear especies basándose en comparaciones por pares de secuencias del genoma [Goris et al., 2007, "DNA-DNA hybridization values and their relationship to whole-genome sequence similarities", Int. J. Syst. Evol. Microbiol 57: 81-91] Goris et al. usó 28 cepas diferentes para concluir que una ANI del 95 % es similar al valor de corte de DDH del 70 % mencionado anteriormente y puede usarse para la delineación de especies. ANI se ha evaluado en múltiples laboratorios y se ha convertido en la referencia para la delineación de especies [cf. Kim et al., 2014, "Towards a taxonomic coherence between average nucleotide identity and 16S rRNA gene sequence similarity for species demarcation of prokaryotes", Int. J. Syst. Evol. Micr. 64: 346-351; Richter et al., 2009, "Shifting the genomic gold standard for the prokaryotic species definition", P Natl Acad Sci USA 106: 19126-19131; y Chan et al., 2012, "Defining bacterial species in the genomic era: insights from the genus Acinetobacter", Bmc. Microbiol 12)].

[0025] Una evaluación de ANI para la designación de una cepa de Bacillus amyloliquefaciens se presenta aquí como ejemplo. Los cálculos de ANI se obtuvieron para comparaciones por pares de la cepa FZB42 de B.

amyloliquefaciens con miembros de la subespecie plantarum de B. amyloliquefaciens, subespecie amyloliquefaciens de B. amyloliquefaciens, Bacillus atrophaeus y Bacillus subtilis. Se utilizó la calculadora ANI del sitio web del laboratorio Kostas (enve-omics.ce.gatech.edu/ani/newjob). Las comparaciones con la cepa 160 de B. subtilis y la cepa C89 de B. atrophaeus proporciona una ANI de menos del 90 %, lo que indica que ANI puede usarse con éxito para distinguir entre estas especies (Tabla A).

Tabla A - ANI por parejas de B. amyloliquefaciens FZB42 en comparación con otros genomas bacterianos (en r n .

[0026] FZB42 muestra > 95 % de identificación con todos los miembros de la subespecie plantarum de B. amyloliquefaciens confirmando su designación de especie. Sin embargo, las comparaciones de FZB42 con DSM7 y otras subespecies de amyloliquefaciens muestran una ANI del 94-94,5 %, que es menor que el límite aceptable de definición de especies del 95 %. La comparación recíproca de DSM7 con otros genomas también muestra una ANI de > 95 % dentro de los aislados de la subespecie amyloliquefaciens y una ANI del 94-95 % con los aislados de la subespecie plantarum (Tabla B).

Tabla B - ANI por parejas de B. amyloliquefaciens DSM7 en comparación con otros genomas bacterianos (en r n .

[0027] Borriss et al. también observaron que la DDH entre FZB42 y DSM7 varió de 63,7-71,2 %, que está por debajo del umbral de DDH del 70 % y es una de las muchas razones por las que se clasificaron en subespecies separadas [Borriss et al., 2011, "Relationship of Bacillus amyloliquefaciens clades associated with strains DSM 7(T) and ^fZB42(T): a proposal for Bacillus amyloliquefaciens subsp amyloliquefaciens subsp nov and Bacillus amyloliquefaciens subspplantarum subsp nov based on complete genome sequence comparisons", Int. J. Syst. Evol. Micr. 61: 1786-1801].

[0028] Chan et al. recomiendan complementar ANI con filogenética del genoma central [Chan et al., 2012, "Defining bacterial species in the genomic era: insights from the genus Acinetobacter", Bmc. Microbiol 12: 302], donde los elementos comunes (generalmente secuencias codificantes o sus traducciones) se pueden utilizar para derivar inferencias filogenéticas. Para comprobar esto, se utilizó Hyatt et al. [Hyatt et al., 2010 "Prodigal: prokaryotic gene recognition and translation initiation site identification", BMC Bioinformatics 11: 119] para gene calling y se utilizó PhyloPhlan [Segata et al., 2013, "PhyloPhlAn is a new method for improved phylogenetic and taxonomic placement of microbes", Nat. Commun. 4: 2304] para generar un árbol filogenético del genoma central. Se utilizó un dendroscopio 3 [Huson et al., 2012, "Dendroscope 3: an interactive tool for rooted phylogenetic trees and networks", Syst. Biol. 61: 1061-1067] para visualizar el árbol como un filograma rectangular con enraizamiento en el punto medio junto con un soporte de arranque (véase la figura 1). Está claro que todas las cepas de B. amyloliquefaciens se agrupan en una rama distinta; y las subespecies amyloliquefaciens y plantarum se separan en dos subclados.

[0029] Según los datos presentados aquí, la siguiente definición de especie podría aplicarse a B. amyloliquefaciens: "Bacillus amyloliquefaciens" se referirá un grupo monofilético de cepas que residen en las ramas de las subespecies amyloliquefaciens o plantarum de un árbol filogenético del genoma central y cuyos genomas exhiben al menos un 95 % de identidad de nucleótidos promedio (ANI) por pares [Goris et al., 2007, "DNA-DNA hybridization values and their relationship to whole genome sequence similarities", Int J Syst Evol Microbiol 57: 81-91] en comparación con los miembros de la misma subespecie y con un ANI superior al 94 % en comparación con los miembros de la otra subespecie. Definición alternativa: "Bacillus amyloliquefaciens" se referirá a un grupo monofilético de cepas cuyos genomas exhiben al menos un 95 % de identidad de nucleótidos promedio (ANI) por pares con el tipo de cepa DSM7 si pertenecen a la subespecie amyloliquefaciens o al menos un 95 % de ANI por pares para el tipo de cepa FZB42 si pertenecen a una subespecie plantarum según lo inferido por la filogenética del genoma central.

[0030] Pienso para animales: El término "pienso para animales" se refiere a cualquier compuesto, preparado o mezcla adecuados o pensados para ser ingeridos por un animal. El pienso para un animal monogástrico comprende concentrados, así como vitaminas, minerales, enzimas, aminoácidos y/u otros ingredientes de pienso (como en una premezcla). El pienso para animales puede comprender además forraje.

[0031] Actividad antimicrobiana contra Clostridium perfringens: El término "actividad antimicrobiana contra Clostridium perfringens" significa que el crecimiento de Clostridium perfringens está inhibido y/o que se matan algunas o todas las Clostridium perfringens. Esto se puede determinar mediante el ensayo descrito en el ejemplo 6.

[0032] Mezcla: el término "mezcla" significa más de una de las cepas bacterianas descritas en este documento.

[0033] Ganancia de peso corporal: La ganancia de peso corporal de un animal es el aumento del peso corporal del animal durante un período de tiempo específico.

[0034] Composición: El término "composición" se refiere a una composición que comprende un vehículo y al menos una cepa bacteriana tal como se describe en el presente documento. Las composiciones descritas en este documento pueden mezclarse con un pienso o piensos para animales y denominarse "pienso en harina".

[0035] Concentrados: El término "concentrados" se refiere a piensos con altas concentraciones de proteínas y energía, tales como harina de pescado, melaza, oligosacáridos, sorgo, semillas y granos (enteros o preparados por trituración, molienda, etc., por ejemplo, de maíz, avena, centeno, cebada, trigo), torta de semillas oleaginosas prensadas (p. ej., de semillas de algodón, cártamo, girasol, soja (como harina de soja), colza/canola, cacahuete o maní), torta de palmiste, material derivado de levadura y granos de destilación (tales como granos de destilación húmedos (WDS) y granos de destilación secos con solubles (DDGS)).

[0036] Control de las infecciones de C. perfringens y/o la enteritis necrótica: El término "control de las infecciones de C. perfringens y/o la enteritis necrótica" se refiere a un método y/o una composición que inhibe parcial o completamente las infecciones de C. perfringens y/o la enteritis necrótica en un animal. En consecuencia, el término "control de las infecciones de C. perfringens y/o la enteritis necrótica" significa que las infecciones de C. perfringens y/o la enteritis necrótica se reducen o se eliminan o se evitan por completo.

[0037] Microbiano de alimentación directa: El término "microbiano de alimentación directa" se refiere a microorganismos vivos incluyendo esporas que, cuando se administran en cantidades adecuadas, confieren un beneficio, tal como una mejor digestión o salud, al huésped.

[0038] Factor Europeo de Eficiencia Productiva (FEEP): El Factor Europeo de Eficiencia Productiva es una forma de comparar el rendimiento de las aves vivas. Esta cifra individual facilita la comparación del rendimiento dentro de las granjas y entre ellas y se puede utilizar para evaluar variables ambientales, climáticas y de gestión. El FEEP se calcula como [(habitabilidad (%) x peso vivo (kg))/(edad de agotamiento (días) x TCA)] x 100, donde la habitabilidad es el porcentaje de aves vivas en el momento del sacrificio, el peso vivo es el peso promedio de las aves en el momento del sacrificio, la edad de agotamiento es la edad de las aves en el momento del sacrificio y la TCA es la tasa de conversión alimenticia en el momento del sacrificio.

[0039] Cantidad/concentración/dosis eficaz: Los términos "cantidad eficaz", "concentración eficaz" o "dosis eficaz" se definen como la cantidad, concentración o dosis de la(s) cepa(s) bacteriana(s) suficiente para mejorar la digestión o el rendimiento de un animal o para controlar las infecciones de C. perfringens y/o la enteritis necrótica. La dosis eficaz real en números absolutos depende de factores que incluyen: el estado de salud del animal en cuestión y otros ingredientes presentes. La "cantidad eficaz ", la "concentración eficaz " o la "dosificación eficaz" de las cepas bacterianas pueden determinarse mediante ensayos de rutina conocidos por los expertos en la técnica.

[0040] TCA (tasa de conversión alimenticia): La TCA es una medida de la eficiencia de un animal a la hora de convertir la masa de alimento en incrementos de la producción deseada. En los animales criados para la carne, como los cerdos, las aves y el pescado, la producción es la masa ganada por el animal. Específicamente, la TCA es la masa de los alimentos consumidos dividida por la producción, durante todo un período específico.

[0041] Alimentar a un animal: los términos "alimentar a un animal" o "alimentado a un animal" significa que la composición de la presente invención se administra por vía oral al animal una o varias veces en una cantidad eficaz. La administración oral generalmente se repite, p. ej., una o varias veces al día durante un período de tiempo específico, tal como varios días, una semana, varias semanas, un mes o varios meses. En consecuencia, el término "alimentar" o "alimentado" se refiere a cualquier tipo de administración oral tal como la administración a través de un pienso para animales o mediante agua potable.

[0042] Forraje: El término "forraje" tal como se define aquí también incluye forraje basto. El forraje es material vegetal fresco como heno y ensilado de plantas forrajeras, pasto y otras plantas forrajeras, algas, granos germinados y legumbres, o cualquier combinación de los mismos. Ejemplos de plantas forrajeras son alfalfa, loto de los prados, brassica (p. ej., col rizada, colza (canola), colinabo, nabo), trébol (p. ej., trébol alsike, trébol rojo, trébol subterráneo, trébol blanco), hierba (p. ej., césped bermuda, bromo, falsa avena, festuca, brezal, poa pratense, pasto ovillo, raigrás, hierba timotea), maíz, mijo, cebada, avena, centeno, sorgo, soja y trigo y vegetales tales como la remolacha. El forraje incluye además residuos agrícolas de la producción de granos (como rastrojo de maíz; paja de trigo, cebada, avena, centeno y otros granos); residuos de vegetales como hojas de remolacha; residuos de la producción de semillas oleaginosas como tallos y hojas de semillas soja, semillas de colza y otras legumbres; y fracciones del refinado de granos para consumo animal o humano o de la producción de combustible u otras industrias.

[0043] Aislado: El término "aislado" significa que la cepa o cepas bacterianas descritas en el presente documento están en una forma o entorno que no se produce en la naturaleza, es decir, la cepa o cepas bacterianas se eliminan, al menos parcialmente, de uno o varios o todos los constituyentes naturales con los que está asociado en la naturaleza.

[0044] No hemolítico: La hemólisis es la descomposición de los glóbulos rojos. La capacidad de las colonias bacterianas para inducir hemólisis cuando se cultiva en agar sangre se usa para clasificar las cepas bacterianas en cepas hemolíticas y no hemolíticas. En este contexto, la hemólisis se define según se describe en EFSA Journal 2011; 9 (11): 2445, utilizando Bacillus subtilis 168 (BGSC-1A1, Bacillus Genetic Stock Center) como control negativo. Una cepa de Bacillus se puede clasificar como no hemolítica usando el ensayo descrito en el ejemplo 8.

[0045] Gránulo: Los términos "gránulo" y/o "granulación" se refieren a pastillas o gránulos sólidos redondeados, esféricos y/o cilíndricos y a los procesos para generar tales formas sólidas, particularmente gránulos de pienso y piensos sólidos extruidos. Tal como se usa en el presente documento, los términos "extrusión" o "extruir" son términos bien conocidos en la técnica y se refieren a un proceso de presionar una composición, como se describe en el presente documento, a través de un orificio bajo presión.

[0046] Aves de corral: El término "aves de corral" se refiere a aves domesticadas mantenidas por humanos por los huevos que producen y/o su carne y/o sus plumas. Las aves de corral incluyen pollos de engorde y ponedoras. Las aves de corral incluyen miembros del superorden Galloanserae (gallinas), especialmente el orden Galliformes (que incluye pollos, gallinas de Guinea, codornices y pavos) y la familia Anatidae, en el orden Anseriformes, comúnmente conocido como "aves acuáticas" e incluyen patos y gansos domésticos. Las aves de corral también incluyen otras aves que son sacrificadas por su carne, como las crías de palomas. Los ejemplos de aves de corral incluyen pollos (incluidas las ponedoras, pollos de engorde y polluelos), patos, gansos, palomas, pavos y codornices.

[0047] Evitar las infecciones de C. perfringens y/o la enteritis necrótica: El término "evitar las infecciones de C. perfringens y/o la enteritis necrótica" se refiere a un método y/o una composición que evitan el desarrollo de una infección de C. perfringens y/o la enteritis necrótica en un animal.

[0048] Forraje basto: El término "forraje basto" se refiere a material vegetal seco con altos niveles de fibra, como fibra, salvado, cáscaras de semillas y granos y residuos agrícolas (como estiércol, copra, paja, tamo, residuos de remolacha azucarera).

[0049] Sensible a los antibióticos: El término "sensible a los antibióticos" se refiere a la propiedad fenotípica de una cepa bacteriana, por la que el cultivo de dicha cepa bacteriana se inhibe en condiciones donde de otra manera la cepa bacteriana crecería. En este contexto, la sensibilidad a los antibióticos se prueba después de las pautas de la CLSI (Métodos M07-A9 para las pruebas de sensibilidad antimicrobiana por dilución para bacterias que crecen aeróbicamente; 2012). La S. aureus ATCC 29213 se utiliza como cepa de referencia, lo que significa que debe incluirse en la prueba y que los resultados solo son válidos si S. aureus ATCC 29213 muestra resultados que cumplen con los puntos de interrupción de la pauta de CLSI (ver ejemplo tabla 5.5) (Estándares de rendimiento M100-S24 para pruebas de susceptibilidad antimicrobiana; Suplemento informativo, 2014). Una cepa de Bacillus se considera sensible si el crecimiento se detecta en o por debajo de la concentración del punto de interrupción del antibiótico apropiado especificado en EFSA Journal 2012; 10 (6): 2740.

[0050] Ensilado: El término "ensilado" se refiere a forraje fermentado, almacenado en alta humedad, con el que se puede alimentar a rumiantes (animales masticadores del bolo alimenticio, como ganado bovino y ovino) o utilizarse como materia prima para biocombustibles para digestores anaerobios. Se fermenta y almacena en un proceso llamado ensilado o ensilaje, y generalmente está hecho de cultivos de hierba o cereales (p. ej., maíz, sorgo, avena, centeno, hierba timotea, etc. El ensilado se puede hacer de muchos cultivos de campo, y se pueden usar términos especiales según el tipo (avenaje para avena, henolaje para alfalfa). El ensilado se realiza colocando vegetación verde cortada en un silo, apilándola en un montón grande cubierto con una lámina de plástico, o envolviendo balas grandes en una película de plástico.

[0051] Espora: Los términos "espora" y "endospora" son intercambiables y tienen su significado habitual que es bien conocido y entendido por los expertos en la materia. Tal como se usa en este documento, el término espora se refiere a un microorganismo en su estado latente y protegido.

[0052] Estable: El término "estable" es un término que se conoce en la técnica y, en un aspecto preferido, significa la capacidad del microorganismo de permanecer en forma de esporas hasta que se administra a un animal para mejorar la salud del animal.

[0053] Puerco: El término "puercos" o "cerdos" se refiere a los cerdos domesticados que los humanos mantienen como alimento, por ejemplo, su carne. Puerco incluye los miembros del género Sus, tales como Sus scrofa domesticus o Sus domesticus e incluyen lechones, cerdos en crecimiento y cerdas.

[0054] Proteína vegetal: El término "proteína vegetal" se refiere a cualquier compuesto, preparado o mezcla que incluye al menos una proteína derivada de un vegetal o que se origina en él, incluidas las proteínas modificadas y los derivados de proteínas.

Descripción detallada de la invención

[0055] Sorprendentemente se ha descubierto que la adición de microbios de alimentación directa (DFM) de las especies de Bacillus al pienso para animales puede usarse para evitar y/o controlar las infecciones de C. perfringens y/o la enteritis necrótica en animales monogástricos como cerdos y/o aves de corral y al mismo tiempo mejorar el aumento de peso corporal y/o la tasa de conversión alimenticia (en pollos desafiados y no desafiados).

Cepas de Bacillus de la invención

[0056] La invención se refiere en una realización a un Bacillus que tiene el número de acceso de depósito DSM 29870 o un mutante del mismo. En una realización, la invención se refiere a un Bacillus con número de acceso de depósito DSM 29870.

[0057] La invención también se refiere a un cultivo biológicamente puro de la cepa de Bacillus que tiene el número de acceso de depósito DSM 29870 o un mutante de la misma. En una realización adicional, la invención se refiere a un cultivo biológicamente puro de la cepa de Bacillus con número de acceso de depósito DSM 29870.

[0058] La invención también se refiere a una cepa de Bacillus aislada que tiene el número de acceso de depósito DSM 29870 o un mutante de la misma.

[0059] La invención también se refiere a una espora de la cepa de Bacillus que tiene el número de acceso de depósito DSM 29870 o un mutante de la misma. La espora es preferiblemente una espora estable.

Composiciones de la invención.

[0060] Aquí se describe una composición que comprende esporas (tales como esporas estables) de la(s) cepa(s) de Bacillus según la invención.

[0061] La invención se refiere en una realización a una composición que comprende un Bacillus que tiene el número de acceso de depósito DSM 29870 o un mutante del mismo.

[0062] La invención también se refiere a una composición que comprende un cultivo biológicamente puro de la cepa de Bacillus que tiene el número de acceso de depósito DSM 29870 o un mutante de la misma.

[0063] La invención también se refiere a una composición que comprende una cepa de Bacillus aislada que tiene el número de acceso de depósito DSM 29870 o un mutante de la misma.

[0064] En una realización, las esporas de Bacillus de la composición están presentes como esporas secas (como, p. ej., esporas secas por pulverización). En una realización, las esporas de Bacillus de la composición están presentes como esporas estables. La composición también puede ser una composición líquida y/o comprender un sobrenadante de cultivo que comprende la(s) cepa(s) de Bacillus de la invención.

[0065] En una realización, la composición comprende además un vehículo. El vehículo puede comprender uno o varios de los siguientes compuestos: agua, glicerol, etilenglicol, 1,2-propilenglicol o 1,3-propilenglicol, cloruro de sodio, benzoato de sodio, sorbato de potasio, sulfato de sodio, sulfato de potasio, sulfato de magnesio , tiosulfato de sodio, carbonato de calcio, citrato de sodio, dextrina, maltodextrina, glucosa, sacarosa, sorbitol, lactosa, harina de trigo, salvado de trigo, harina de gluten de maíz, almidón, celulosa farigel, núcleos de yuca, aluminosilicato de sodio, sílice amorfa coloidal, Sipernat 50S, polietilenglicol 200, polietilenglicol 400, polietilenglicol 600, polietilenglicol 1000, polietilenglicol 1500, polietilenglicol 4000 y carbopol.

[0066] En una realización preferida, la composición comprende además carbonato de calcio y aluminosilicato de sodio.

[0067] En una realización preferida, la composición comprende además carbonato de calcio, aluminosilicato de sodio y sacarosa

[0068] En otra realización preferida, la composición comprende además uno o varios vehículos tales como uno o varios vehículos seleccionados del grupo que consiste en carbonato de calcio, sulfato de sodio, almidón, farigel y núcleos de yuca.

[0069] En otra realización preferida, la composición comprende además uno o varios agentes de fluidez tales como aluminosilicato de sodio y/o sílice amorfa coloidal (p. ej., Sipernat 50S).

[0070] En otra realización preferida, la composición comprende además uno o varios aglutinantes tales como uno o varios aglutinantes seleccionados del grupo que consiste en sacarosa, sorbitol, glicerol, polietilenglicol 200, polietilenglicol 400, polietilenglicol 600, polietilenglicol 1000, polietilenglicol 1500, polietilenglicol 4000, dextrina, maltodextrina y carbopol.

[0071] En una realización preferida, la composición comprende Bacillus DSM 29870, carbonato de calcio y aluminosilicato de sodio.

[0072] En una realización preferida, la composición comprende Bacillus DSM 29870, carbonato de calcio, aluminosilicato de sodio y sacarosa.

[0073] En una realización preferida, la composición comprende Bacillus DSM 29870 y uno o varios vehículos tales como uno o varios vehículos seleccionados del grupo que consiste en carbonato de calcio, sulfato de sodio, almidón, farigel y núcleos de yuca.

[0074] En una realización preferida, la composición comprende Bacillus DSM 29870 y uno o varios agentes de fluidez tales como aluminosilicato de sodio y/o sílice amorfa coloidal (p. ej., Sipernat 50S).

[0075] En una realización preferida, la composición comprende Bacillus DSM 29870 y uno o varios aglutinantes tales como uno o varios aglutinantes seleccionados del grupo que consiste en sacarosa, sorbitol, glicerol, polietilenglicol 200, polietilenglicol 400, polietilenglicol 600, polietilenglicol 1000, polietilenglicol 1500, polietilenglicol 4000, dextrina, maltodextrina y carbopol.

[0076] En una realización, la composición comprende uno o varios coccidiostáticos en los que la composición, p. ej., es una premezcla.

[0077] En una realización preferida, la composición comprende de 105 a 1012 UFC/g de esporas aisladas de Bacillus, por ejemplo, de 105 a 107 UFC/g de esporas aisladas de Bacillus, por ejemplo, de 107 a 109 UFC/g de esporas aisladas de Bacillus, por ejemplo, de 109 a 1011 UFC/g de esporas aisladas de Bacillus, por ejemplo, de 1011 a 1012 UFC/g de esporas aisladas de Bacillus o cualquier combinación de estos intervalos.

[0078] En otra realización preferida más, la composición es un pienso para animales tal como un aditivo para piensos para animales. En una realización, el pienso para animales se caracteriza porque al menos el 70 % (por ejemplo, al menos el 80 % o al menos el 90 %) de las esporas de Bacillus sobreviven a la estabilidad gástrica en animales monogástricos como los pollos.

[0079] La composición puede ser un pienso para animales que comprende además uno o varios componentes seleccionados de la lista que consiste en: una o varias enzimas; uno o varios microbios adicionales; una o varias vitaminas; uno o varios minerales; uno o varios aminoácidos; y uno o varios de otros ingredientes de pienso.

[0080] La composición puede ser un pienso para animales o un aditivo para pienso para animales en el que el recuento bacteriano de cada espora de Bacillus es 1x103 y 1x1013 UFC/animal/día, preferiblemente entre 1x105 y 1x1011 UFC/animal/día, más preferiblemente entre 1x106 y 1x1010 UFC/animal/día y más preferiblemente entre 1x107 y 1x109 UFC/animal/día.

[0081] La composición puede ser un pienso para animales monogástricos. El animal monogástrico puede seleccionarse del grupo que consiste en cerdos, puercos, lechones, cerdas, aves de corral, pavos, patos, pollos, pollos de engorde, ponedoras, polluelos, peces y crustáceos. En una realización, el animal no es un ser humano.

En una realización, los animales monogástricos incluyen, entre otros, cerdos o puercos (incluyendo, entre otros, lechones, cerdos en crecimiento y cerdas); aves de corral como pavos, patos y pollos (incluyendo, entre otros, pollos de engorde, polluelos, ponedoras); caballos (incluyendo, entre otros, sangre caliente, sangre fría y sangre templada) y peces (incluyendo, entre otros, salmón, trucha, tilapia, bagre y carpa); y crustáceos (incluyendo, entre otros, camarones y langostinos). Los cerdos y/o las aves de corral son los animales monogástricos preferidos.

[0082] En una realización preferida, la composición es un pienso para animales o un aditivo para pienso para animales en el que la cepa de Bacillus mejora la salud intestinal de los pollos con infección de Clostridium perfringens al tener actividad antimicrobiana contra Clostridium perfringens.

[0083] En una realización preferida, la composición es un pienso para animales o un aditivo para pienso para el tratamiento de la enteritis necrótica o el tratamiento de una infección de Clostridium perfringens (p. ej., para el tratamiento de animales monogástricos, incluidos cerdos y aves de corral como los pollos).

[0084] En una realización de cualquiera de las realizaciones mencionadas anteriormente, la espora de Bacillus mata/inhibe al menos el 40 % (p. ej., al menos el 45 %, al menos el 50 %, al menos el 60 %, al menos el 70 % o al menos el 80 %) de Clostridium perfringens después de 24 horas, p. ej., determinado como se describe en el ejemplo 6.

[0085] En otra realización de la invención, una composición tal como el pienso para animales comprende además un concentrado. En otra realización de la invención, una composición tal como el pienso para animales comprende además forraje. En otra realización de la invención, una composición tal como el pienso para animales comprende además uno o varios microbios adicionales. En otra realización de la invención, una composición tal como el pienso para animales comprende además una o varias enzimas. En otra realización de la invención, una composición tal como el pienso para animales comprende además una o varias vitaminas. En otra realización de la invención, una composición tal como el pienso para animales comprende además uno o varios minerales. En otra realización de la invención, una composición tal como el pienso para animales comprende además uno o varios aminoácidos. En otra realización de la invención, una composición tal como el pienso para animales comprende además uno o varios de otros ingredientes del pienso.

[0086] En una realización de cualquiera de las realizaciones mencionadas anteriormente, la composición también mejora la salud del animal monogástrico cuando se alimenta con ella a dicho animal. En otra realización de cualquiera de las realizaciones mencionadas anteriormente, la composición también aumenta la producción de huevos de las aves de corral cuando se alimenta con ella a dichas aves de corral. En una realización de cualquiera de las realizaciones mencionadas anteriormente, la composición aumenta el rendimiento de carne del animal monogástrico cuando se alimenta con ella a dicho animal.

[0087] En una realización preferida, una composición tal como el pienso para animales comprende una o varias cepas bacterianas descritas en el presente documento, donde el recuento bacteriano de cada una de las cepas bacterianas está entre 1x104 y 1x1018 UFC/kg de composición, preferiblemente entre 1x107 y 1x1016 UFC/kg de composición, más preferiblemente entre 1x1010 y 1x1015 UFC/kg de composición y más preferiblemente entre 1x1011 y 1x1014 UFC/kg de composición.

[0088] En una realización preferida, el recuento bacteriano de cada una de las cepas bacterianas en el aditivo para pienso para animales está entre 1x104 y 1x1018 UFC/kg de composición, preferiblemente entre 1x107 y 1x1016 UFC/kg de composición, más preferiblemente entre 1x1010 y 1x1015 UFC/kg de composición y más preferiblemente entre 1x1011 y 1x1014 UFC/kg de materia seca.

[0089] En una realización preferida, el recuento bacteriano de cada una de las cepas bacterianas en el pienso para animales está entre 1x104 y 1x1014 UFC/kg de materia seca, preferiblemente entre 1x106 y 1x1012 UFC/kg de materia seca y más preferiblemente entre 1x107 y 1x1011 UFC/kg de materia seca. En una realización más preferida, el recuento bacteriano de cada una de las cepas bacterianas en la composición de pienso para animales está entre 1x108 y 1x1010 UFC/kg de materia seca.

[0090] En una realización preferida, una composición tal como el pienso para animales tiene un recuento bacteriano de cada espora de Bacillus entre 1x103 y 1x1013 UFC/animal/día, preferiblemente entre 1x105 y 1x1011 UFC/animal/día, más preferiblemente entre 1x106 y 1x1010 UFC/animal/día y más preferiblemente entre 1x107 y 1x109 UFC/animal/día.

[0091] En otra realización de la invención, la cepa o cepas bacterianas están presentes en la composición en forma de una espora, por ejemplo, una espora estable. En otra realización adicional de la invención, la espora estable germinará en el intestino y/o el estómago del animal monogástrico.

[0092] En una realización, la cepa o cepas bacterianas son estables cuando se someten a presiones aplicadas/alcanzadas durante un proceso de extrusión para granulación. En una realización particular, la cepa o cepas bacterianas son estables a presiones que varían de 1 bar a 40 bar, particularmente de 10 bar a 40 bar, más particularmente de 15 bar a 40 bar, aún más particularmente de 20 bar a 40 bar, aún más particularmente de 35 bar a 37 bar, aún más particularmente de 36 bar.

[0093] En una realización particular, la cepa o cepas bacterianas son estables a altas temperaturas. En particular, las cepas bacterianas son estables cuando se someten a temperaturas alcanzadas durante un proceso de extrusión para granulación. En una realización aún más particular, la cepa o cepas bacterianas son estables a temperaturas que varían de 80 °C a 120 °C, particularmente temperaturas que varían de 90 °C a 120 °C, aún más particularmente temperaturas que varían de 95 °C a 120 °C.

[0094] En otro aspecto, la invención se refiere a una composición, por ejemplo, una composición de pienso para animales que comprende un vehículo, tal como forraje y uno o varios de los cultivos de bacterias de la cepa que tiene el número de acceso de depósito DSM 29870.

[0095] En una realización, la composición de pienso para animales comprende un vehículo y la cepa que tiene el número de acceso al depósito DSM 29870, o un mutante de la misma.

[0096] En otra realización, la composición de pienso para animales sirve para alimentar a un animal monogástrico. Los animales monogástricos incluyen, entre otros, cerdos o puercos (incluyendo, entre otros, lechones, cerdos en crecimiento y cerdas); aves de corral como pavos, patos y pollos (incluyendo, entre otros, pollos de engorde, ponedoras); caballos (incluyendo, entre otros, sangre caliente, sangre fría y sangre templada) y peces (incluyendo, entre otros, salmón, trucha, tilapia, bagre y carpa); y crustáceos (incluyendo, entre otros, camarones y langostinos). Los cerdos y/o las aves de corral son los animales monogástricos preferidos.

[0097] En una realización, la composición de pienso para animales comprende además uno o varios microbios adicionales. En una realización particular, la composición de pienso para animales comprende además una bacteria de uno o varios de los siguientes géneros: Lactobacillus, Lactococcus, Streptococcus, Bacillus, Pediococcus, Enterococcus, Leuconostoc, Carnobacterium, Propionibacterium, Bifidobacterium, Clostridium y Megasphaera o cualquier combinación de los mismos.

[0098] En una realización particular, la composición de pienso para animales comprende además una bacteria de una o varias de las siguientes cepas de Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus subtilis, Bacillus pumilus, Bacillus polymyxa, Bacillus licheniformis, Bacillus megaterium, Bacillus coagulans, Bacillus circulans, o cualquier combinación de los mismos.

[0099] En una realización particular, la composición de pienso para animales comprende además uno o varios tipos de levadura. El tipo o tipos de levadura se pueden seleccionar del grupo que consiste en las levaduras Saccharomycetaceae, Saccharomyces (como S. cerevisiae y/o S. boulardii), Kluyveromyces (como K. marxianus y K. lactis), Candida (como C. utilis, también llamada levadura Torula), Pichia (como P. pastoris), Torulaspora (como T. delbrueckii), Phaffia y Basidiomycota.

[0100] En una realización de cualquiera de las realizaciones mencionadas anteriormente, la composición comprende además un vehículo. El vehículo puede comprender uno o varios de los siguientes compuestos: agua, glicerol, etilenglicol, 1,2-propilenglicol o 1,3-propilenglicol, aluminosilicato de sodio, cloruro de sodio, benzoato de sodio, sorbato de potasio, sulfato de sodio, sulfato de potasio, sulfato de magnesio, tiosulfato de sodio, carbonato de calcio, citrato de sodio, dextrina, maltodextrina, glucosa, sacarosa, sorbitol, lactosa, harina de trigo, salvado de trigo, harina de gluten de maíz, almidón, farigel, núcleos de yuca, sílice amorfa coloidal, Sipernat 50S, polietilenglicol 200, polietilenglicol 400, polietilenglicol 600, polietilenglicol 1000, polietilenglicol 1500, polietilenglicol 4000, carbopol y celulosa.

Pienso para animales

[0101] En un aspecto, el pienso para animales que comprende la cepa de Bacillus que tiene el número de acceso de depósito DSM 29870, o un mutante de DSM 29870, comprende además uno o varios concentrado(s), vitamina(s), mineral(es), enzima(s), aminoácido(s) y/u otro(s) ingrediente(s) del pienso (como en una premezcla). En una realización específica, el pienso para animales comprende además forraje.

[0102] El forraje tal como se define aquí también incluye forraje basto. El forraje es material vegetal fresco como heno y ensilado de plantas forrajeras, pasto y otras plantas forrajeras, algas, granos germinados y legumbres, o cualquier combinación de los mismos. Ejemplos de plantas forrajeras son alfalfa, loto de los prados, brassica (p. ej., col rizada, colza (canola), colinabo (sueco), nabo), trébol (p.ej., trébol alsike, trébol rojo, trébol subterráneo, trébol blanco), hierba (p. ej., césped Bermuda, bromo, falsa avena, festuca, brezal, poa pratense, pasto ovillo, raigrás, hierba timotea), maíz, mijo, cebada, avena, centeno, sorgo, soja y trigo y vegetales tales como la remolacha. Los cultivos adecuados para el ensilado son los pastos comunes, tréboles, alfalfa, algarrobas, avena, centeno y maíz. El forraje incluye además los residuos agrícolas de la producción de granos (como rastrojo de maíz; paja de trigo, cebada, avena, centeno y otros granos); residuos de vegetales como hojas de remolacha; residuos de la producción de semillas oleaginosas como tallos y hojas de semillas de soja, semillas de colza y otras legumbres; y fracciones del refinado de granos para consumo animal o humano o de la producción de combustible u otras industrias.

[0103] El forraje basto es generalmente un material vegetal seco con altos niveles de fibra, como fibra, salvado, cáscaras de semillas y granos y residuos agrícolas (como estiércol, copra, paja, tamo, residuos de remolacha azucarera).

[0104] Los ejemplos de concentrados son piensos con altas concentraciones de proteínas y energía, tales como harina de pescado, melaza, oligosacáridos, sorgo, semillas y granos (enteros o preparados por trituración, molienda, etc., por ejemplo, de maíz, avena, centeno, cebada, trigo), torta de semillas oleaginosas prensadas (p. ej., de semillas de algodón, cártamo, girasol, soja (como harina de soja), colza/canola, cacahuete o maní), torta de palmiste, material derivado de levadura y granos de destilación (tales como granos de destilación húmedos (WDS) y granos de destilación secos con solubles (DDGS)).

[0105] En una realización, el forraje y uno o varios microbios se mezclan con un concentrado. En otra realización, el forraje y uno o varios microbios se mezclan con una premezcla. En una realización adicional, el forraje y uno o varios microbios se mezclan con vitaminas y/o minerales. En una realización adicional, el forraje y uno o varios microbios se mezclan con una o varias enzimas. En una realización adicional, el forraje y uno o varios microbios se mezclan con otros ingredientes de pienso, tales como agentes colorantes, estabilizadores, aditivos que mejoran el crecimiento y compuestos aromatizantes/saborizantes, ácidos grasos poliinsaturados (AGPI); especies reactivas generadoras de oxígeno, péptidos antimicrobianos, polipéptidos antimicóticos y aminoácidos.

[0106] En realizaciones particulares, el pienso para animales puede comprender la cepa de Bacillus DSM 29870 o un mutante de DSM 29870 y un 0-80 % de maíz; y/o un 0-80 % de sorgo; y/o un 0-70 % de trigo; y/o un 0-70 % de cebada; y/o un 0-30 % de avena; y/o un 0-40 % de harina de soja; y/o un 0-10 % de harina de pescado; y/o un 0-20 % de suero.

[0107] El pienso para animales puede comprender la cepa de Bacillus DSM 29870 o un mutante de DSM 29870 y proteínas vegetales. En realizaciones particulares, el contenido proteínico de las proteínas vegetales es al menos del 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80 o 90 % (p/p). Las proteínas vegetales pueden derivarse de fuentes de proteínas vegetales, como legumbres y cereales, por ejemplo, materiales de plantas de las familias Fabaceae (Leguminosas), Cruciferaceae, Chenopodiaceae y Poaceae tales como harina de soja, harina de altramuz, harina de colza y combinaciones de las mismas.

[0108] En una realización particular, la fuente de proteína vegetal es el material de una o más plantas de la familia Fabaceae, p. ej., soja, altramuz, guisante o judía. En otra realización particular, la fuente de proteína vegetal es el material de una o más plantas de la familia Chenopodiaceae, p. ej., remolacha, remolacha azucarera, espinacas o quinoa. Otros ejemplos de fuentes de proteínas vegetales son la colza y el repollo. En otra realización particular, la soja es una fuente de proteína vegetal preferida. Otros ejemplos de fuentes de proteínas vegetales son cereales como cebada, trigo, centeno, avena, maíz, arroz y sorgo.

[0109] En una realización particular, el pienso para animales consiste o comprende leche (p. ej., de cerda), p. ej., para la alimentación de lechones. En otra realización particular, el pienso para animales consiste en o comprende un sustituto de leche, p.ej., para la alimentación de lechones.

Premezcla

[0110] En una realización, el pienso para animales puede incluir una premezcla, que comprenda, p. ej., vitaminas, minerales, enzimas, conservantes, antibióticos, otros ingredientes de pienso o cualquier combinación de los mismos que se mezclan con el pienso para animales.

Vitaminas y minerales

[0111] En otra realización, el pienso para animales puede incluir una o varias vitaminas, por ejemplo, una o varias vitaminas liposolubles y/o una o más vitaminas hidrosolubles. En otra realización, el pienso para animales puede incluir opcionalmente uno o varios minerales, por ejemplo, uno o varios oligoelementos y/o uno o varios macrominerales.

[0112] Por lo general, las vitaminas liposolubles e hidrosolubles, así como los oligoelementos, forman parte de la llamada premezcla destinada a agregarse al pienso, mientras que los macrominerales generalmente se agregan por separado al pienso.

[0113] Los ejemplos no limitantes de vitaminas liposolubles incluyen la vitamina A, la vitamina D3, la vitamina E y la vitamina K, p. ej., la vitamina K3

[0114] Los ejemplos no limitantes de vitaminas hidrosolubles incluyen la vitamina B12, la biotina y la colina, la vitamina B1, la vitamina B2, la vitamina B6, la niacina, el ácido fólico y el pantotenato, p. ej., Ca-D-pantotenato.

[0115] Los ejemplos no limitantes de oligoelementos incluyen el boro, el cobalto, el cloruro, el cromo, el cobre, el fluoruro, el yodo, el hierro, el manganeso, el molibdeno, el selenio y el zinc.

[0116] Ejemplos no limitantes de macrominerales incluyen el calcio, el magnesio, el potasio y el sodio.

Enzimas

[0117] En otra realización, las composiciones de pienso para animales o el aditivo para pienso para animales descrito en el presente documento incluyen opcionalmente una o varias enzimas. Las enzimas pueden clasificarse según el manual de nomenclatura de enzimas del NC-IUBMB, 1992), consulte también el sitio de ENZYME en Internet: expasy.ch/enzyme/. ENZYME es un depósito de información relativa a la nomenclatura de enzimas. Se basa principalmente en las recomendaciones del Comité de Nomenclatura de la Unión Internacional de Bioquímica y Biología Molecular (IUB-MB), Academic Press, Inc., 1992, y describe cada tipo de enzima caracterizada para la cual se ha proporcionado el número CE (Comisión de Enzimas) (Bairoch, 2000, The ENZYME database, Nucleic Acids Res. 28: 304-305) Esta nomenclatura de enzimas de la IUB-MB se basa en su especificidad de sustrato y ocasionalmente en su mecanismo molecular; tal clasificación no refleja las características estructurales de estas enzimas.

[0118] Hace unos años se propuso otra clasificación de ciertas enzimas glucosidasas, como la endoglucanasa, la xilanasa, la galactanasa, la mananasa, la dextranasa y la alfa-galactosidasa, en familias basándose en las similitudes de secuencias de aminoácidos. Actualmente se dividen en 90 familias diferentes: consulte el sitio web de CAZy (ModO) (Coutinho y Henrissat, 1999, servidor de enzimas activas en carbohidratos en la URL: afmb.cnrs-mrs.fr/~cazy/CAZY/index.html (artículos correspondientes: Coutinho, P.M. & Henrissat, B. (1999) Carbohydrate-active enzymes: an integrated database approach. En "Recent Advances in Carbohydrate Bioengineering", H.J. Gilbert, G. Davies, B. Henrissat y B. Svensson eds., The Royal Society of Chemistry, Cambridge, pp. 3-12; Coutinho, P.M. & Henrissat, B. (1999). The modular structure of cellulases and other carbohydrate-active enzymes: an integrated database approach. En "Genetics, Biochemistry and Ecology of Cellulose Degradation"., K. Ohmiya, K. Hayashi, K. Sakka, Y. Kobayashi, S. Karita y T. Kimura eds., Uni Publishers Co., Tokio, pp. 15- 23).

[0119] Así, la composición de la invención también puede comprender al menos otra enzima seleccionada del grupo que comprende fitasa (EC 3.1.3.8 o 3.1.3.26); xilanasa (EC 3.2.1.8); galactanasa (EC 3.2.1.89); alfagalactosidasa (EC 3.2.1.22); proteasa (EC 3.4); fosfolipasa A1 (EC 3.1.1.32); fosfolipasa A2 (EC 3.1.1.4); lisofosfolipasa (EC 3.1.1.5); fosfolipasa C (3.1.4.3); fosfolipasa D (EC 3.1.4.4); amilasa tal como, por ejemplo, alfa-amilasa (EC 3.2.1.1); lisozima (EC 3.2.1.17); y beta-glucanasa (EC 3.2.1.4 o EC 3.2.1.6), o cualquier mezcla de las mismas.

[0120] En una realización particular, la composición de la invención comprende una fitasa (EC 3.1.3.8 o 3.1.3.26). Ejemplos de fitasas disponibles en el mercado incluyen Bio-Feed ™ Phytase (Novozymes), Ronozyme® P y HiPhos™ (DSM Nutritional Products), Natuphos™ (BASF), Finase® y Quantum® Blue (AB Enzymes), Phyzyme® XP (Verenium/DuPont) y Axtra® PHY (DuPont). Otras fitasas preferidas incluyen las descritas en, p. ej., WO 98/28408, WO 00/43503y WO 03/066847.

[0121] En una realización particular, la composición de la invención comprende una xilanasa (EC 3.2.1.8). Ejemplos de xilanasas disponibles comercialmente incluyen Ronozyme® WX y G2 (DSM Nutritional Products), Econase® XT y Barley (AB Vista), Xylathin® (Verenium) y Axtra® XB (Xilanasa/beta-glucanasa, DuPont)

[0122] En una realización particular, la composición de la invención comprende una proteasa (EC 3.4). Los ejemplos de proteasas disponibles comercialmente incluyen Ronozyme® ProAct (DSM Nutritional Products). Aminoácidos

[0123] La composición de la invención puede comprender además uno o varios aminoácidos. Ejemplos de aminoácidos que se usan en el pienso para animales son lisina, alanina, beta-alanina, treonina, metionina y triptófano.

Otros ingredientes de pienso

[0124] La composición de la invención puede comprender además agentes colorantes, estabilizadores, aditivos que mejoran el crecimiento y compuestos aromatizantes/saborizantes, ácidos grasos poliinsaturados (PUFA); especies reactivas generadoras de oxígeno, péptidos antimicrobianos y polipéptidos antifúngicos.

[0125] Los ejemplos de agentes colorantes son los carotenoides como el betacaroteno, la astaxantina y la luteína.

[0126] Ejemplos de compuestos aromatizantes/saborizantes son creosol, anetol, deca-, undeca- y/o dodecalactonas, iononas, irona, gingerol, piperidina, ftaluro de propilideno, ftaluro de butilideno, capsaicina y tanino.

[0127] Ejemplos de péptidos antimicrobianos (PAM) son CAP18, leucocina A, tritrpticina, protegrina-1, tanatina, defensina, lactoferrina, lactoferricina y ovispirinas tales como la Novispirina (Robert Lehrer, 2000), plectasinas y estatinas, incluyendo los compuestos y polipéptidos descritos en WO 03/044049 y WO 03/048148, así como variantes o fragmentos de los anteriores que retienen la actividad antimicrobiana.

[0128] Ejemplos de polipéptidos antifúngicos (PAF) son los péptidos de Aspergillus giganteus, y Aspergillus niger, así como variantes y fragmentos de los mismos que retienen actividad antifúngica, tal como se describe en WO 94/01459 y WO 02/090384.

[0129] Ejemplos de ácidos grasos poliinsaturados son los ácidos grasos poliinsaturados C18, C20 y C22, tales como el ácido araquidónico, el ácido docosohexaenoico, el ácido eicosapentaenoico y el ácido gamma-linoleico.

[0130] Ejemplos de especies reactivas generadoras de oxígeno son productos químicos tales como perborato, persulfato o percarbonato; y enzimas tales como una oxidasa, una oxigenasa o una sintetasa.

[0131] La composición de la invención puede comprender además al menos un aminoácido. Ejemplos de aminoácidos que se usan en el pienso para animales son lisina, alanina, beta-alanina, treonina, metionina y triptófano.

Fabricación

[0132] Las dietas para animales pueden, por ejemplo, fabricarse como pienso en harina (no granulado) o granulado. Típicamente, los piensos molidos se mezclan, y se añaden cantidades suficientes de vitaminas y minerales esenciales de acuerdo con las especificaciones para la especie en cuestión. Los cultivos de bacterias y, opcionalmente, las enzimas se pueden añadir como formulaciones sólidas o líquidas. Por ejemplo, para piensos en harina se puede añadir una formulación de cultivo sólida o líquida antes o durante la etapa de mezcla de ingredientes. Para la piensos granulados, el preparado de cultivo (líquido o sólido) también se puede añadir antes o durante la etapa de ingrediente del pienso. Típicamente, un preparado de cultivo líquido comprende el cultivo de la invención, opcionalmente con un poliol como glicerol, etilenglicol o propilenglicol, y se añade después de la etapa de granulación, por ejemplo, rociando la formulación líquida sobre los gránulos. La enzima también puede incorporarse en un aditivo o premezcla de pienso.

[0133] La enzima se puede agregar a la mezcla de pienso como un gránulo, que opcionalmente se granula o se extruye. El gránulo típicamente comprende una partícula central y uno o varios recubrimientos, que típicamente son de sal y/o cera. La partícula central puede ser una mezcla homogénea de un compuesto activo opcionalmente junto con sales (p. ej., sal orgánica o inorgánica de zinc o calcio) o una partícula inerte con un compuesto activo aplicado sobre ella. El compuesto activo es el cultivo de la invención opcionalmente combinado con una o más enzimas. La partícula inerte puede ser soluble o insoluble en agua, p. ej., almidón, un azúcar (como sacarosa o lactosa) o una sal (como NaCl, Na2SO4). El recubrimiento de sal es típicamente de al menos 1 l_im de espesor y puede ser una sal en particular o una mezcla de sales, como Na2ENTONCES4, K2SO4, MgSO4 y/o citrato de sodio. Otros ejemplos son los descritos en, p. ej., WO 2008/017659, WO 2006/034710, WO 97/05245, WO 98/54980, WO 98/55599, WO 00/70034 o un recubrimiento de polímero tal como se describe en WO 01/00042.

[0134] Alternativamente, la proteasa se puede preparar congelando una mezcla de solución de cultivo líquida con un agente de carga como la harina de soja molida, y luego liofilizando la mezcla.

Métodos de tratamiento de las infecciones de C. perfringens y/o de la enteritis necrótica:

[0135] Aquí se describe un método para el tratamiento de las infecciones de C. perfringens y/o de la enteritis necrótica en un animal, por ejemplo, un animal monogástrico que incluye aves de corral usando la composición que comprende la(s) cepa(s) de Bacillus. En una realización, el animal no es un ser humano. En una realización adicional, el pienso para animales que comprende las cepas de Bacillus se usa para alimentar a un animal monogástrico en una cantidad eficaz. Los animales monogástricos incluyen, entre otros, cerdos o puercos (incluyendo, entre otros, lechones, cerdos en crecimiento y cerdas); aves de corral como pavos, patos y pollos (incluyendo, entre otros, pollos de engorde, ponedoras); caballos (incluyendo, entre otros, sangre caliente, sangre fría y sangre templada) y peces (incluyendo, entre otros, salmón, trucha, tilapia, bagre y carpa); y crustáceos (incluyendo, entre otros, camarones y langostinos). Los cerdos y/o las aves de corral son los animales monogástricos preferidos.

[0136] El pienso para animales puede comprender además uno o varios componentes seleccionados de la lista que consiste en: un concentrado, forraje; una o varias enzimas; uno o varios microbios adicionales; una o varias vitaminas; uno o varios minerales; uno o varios aminoácidos; y uno o varios de otros ingredientes de pienso.

[0137] En una realización, el método comprende administrar al pienso para animales las cepas de Bacillus que tienen el número de acceso de depósito DSM 29870 o un mutante de las mismas en una cantidad eficaz.

[0138] En otra realización del método, el pienso para animales comprende además un concentrado. En otra realización del método, el pienso para animales comprende además forraje. En otra realización del método, el pienso para animales comprende además uno o varios microbios adicionales. En otra realización del método, el pienso para animales comprende además una o varias enzimas. En otra realización del método, el pienso para animales comprende además una o varias vitaminas. En otra realización del método, el pienso para animales comprende además uno o varios minerales. En otra realización del método, el pienso para animales comprende además uno o varios aminoácidos. En otra realización del método, el pienso para animales comprende además uno o varios de otros ingredientes de pienso.

[0139] En una realización de cualquiera de las realizaciones mencionadas anteriormente, el método también mejora la salud del pienso para el animal monogástrico. En otra realización de cualquiera de las realizaciones mencionadas anteriormente, el método también aumenta la producción de huevos de las aves de corral. En una realización de cualquiera de las realizaciones mencionadas anteriormente, el método también aumenta la producción de carne del animal monogástrico.

[0140] En una realización preferida, el método comprende administrar a un animal monogástrico una o más cepas bacterianas descritas en este documento, donde el recuento bacteriano de cada una de las cepas bacterianas está entre 1x104 y 1x1014 UFC/kg de forraje, preferiblemente entre 1x106 y 1x1014 UFC/kg de forraje y más preferiblemente entre 1x107 y 1x1011 UFC/kg de pienso. En una realización más preferida, el recuento bacteriano de cada una de las cepas bacterianas descritas en este documento está entre 1x108 y 1x1010 UFC/kg de pienso.

[0141] En una realización preferida, el método comprende administrar a un animal monogástrico una o más cepas bacterianas descritas en este documento, donde el recuento bacteriano de cada una de las cepas bacterianas está entre 1x103 y 1x1013 UFC/animal/día, preferiblemente entre 1x105 y 1x1011 UFC/animal/día, más preferiblemente entre 1x106 y 1x1010 UFC/animal/día y aún más preferiblemente entre 1x107 y 1x109 UFC/animal/día.

[0142] En otro aspecto, la invención trata el método para el tratamiento de infecciones de C. perfringens que comprende:

(a) alimentar a un animal monogástrico con un pienso; y

(b) administrar a un animal la cepa que tiene el número de acceso al depósito DSM 29870 o un mutante de la misma;

donde la cepa de Bacillus tiene actividad antimicrobiana contra Clostridium perfringens y donde el paso (a) ocurre antes, después o a la vez que el paso (b).

[0143] En una realización preferida del método, se alimenta a un animal monogástrico con el pienso para animales. En una realización del método, los animales monogástrico son, p. ej., cerdos o puercos (incluyendo, entre otros, lechones, cerdos en crecimiento y cerdas); aves de corral como pavos, patos y pollos (incluyendo, entre otros, pollos de engorde, ponedoras); caballos (incluyendo, entre otros, sangre caliente, sangre fría y sangre templada) y peces (incluyendo, entre otros, salmón, trucha, tilapia, bagre y carpa); y crustáceos (incluyendo, entre otros, camarones y langostinos). Los cerdos y las aves de corral son los animales monogástricos preferidos.

[0144] En otra realización del método, el pienso para animales comprende además uno o varios componentes seleccionados de la lista que consiste en: un concentrado, forraje; una o varias enzimas; uno o varios microbios adicionales; una o varias vitaminas; uno o varios minerales; uno o varios aminoácidos; y uno o varios de otros ingredientes de pienso.

[0145] En otra realización del método, el pienso para animales comprende además un concentrado. En otra realización del método, el pienso para animales comprende además forraje. En otra realización del método, el pienso para animales comprende además uno o varios microbios adicionales. En otra realización del método, el pienso para animales comprende además una o varias enzimas. En otra realización del método, el pienso para animales comprende además una o varias vitaminas. En otra realización del método, el pienso para animales comprende además uno o varios minerales. En otra realización del método, el pienso para animales comprende además uno o varios aminoácidos. En otra realización del método, el pienso para animales comprende además uno o varios de otros ingredientes de pienso.

[0146] En otra realización del método, la cepa o cepas bacterianas están presentes en forma de esporas estables. En otra realización del método, la espora estable germinará en el rumen del rumiante.

[0147] En una realización preferida, el método comprende administrar a un animal monogástrico una o más cepas bacterianas descritas en este documento, donde el recuento bacteriano de cada una de las cepas bacterianas está entre 1x104 y 1x1014 UFC/kg de forraje, preferiblemente entre 1x106 y 1x1012 UFC/kg de forraje y más preferiblemente entre 1x107 y 1x1011 UFC/kg de forraje. En una realización más preferida, el recuento bacteriano de cada una de las cepas bacterianas descritas en este documento está entre 1x108 y 1x1010 UFC/kg de forraje.

[0148] En una realización preferida, el método comprende administrar a un animal monogástrico una o más cepas bacterianas descritas en este documento, donde el recuento bacteriano de cada una de las cepas bacterianas está entre 1x105 y 1x1014 UFC/animal/día, preferiblemente entre 1x107 y 1x1013 UFC/animal/día, y más preferiblemente entre 1x108 y 1x1012 UFC/animal/día. En una realización más preferida, el recuento bacteriano de cada una de las cepas bacterianas descritas en este documento está entre 1x109 y 1x1011 UFC/animal/día.

[0149] En una realización preferida, el método comprende administrar a un animal monogástrico una o más cepas bacterianas descritas en este documento, donde el recuento bacteriano de cada espora de Bacillus está entre 1x105 y 1x1015 UFC/animal/día, preferiblemente entre 1x107 y 1x1013 UFC/animal/día, y más preferiblemente entre 1x108 y 1x1014 UFC/animal/día.

[0150] La invención se refiere en una realización adicional al uso de la composición de pienso para animales para mejorar uno o más parámetros de rendimiento en un animal, donde los parámetros de rendimiento se seleccionan de la lista que consiste en mejorar la tasa de conversión alimenticia, mejorar el aumento de peso corporal, mejorar la eficiencia del pienso, mejorar el Factor Europeo de Eficiencia Productiva y mejorar la salud.

Ejemplos

Ejemplo 1: Identificación, caracterización y depósito del material biológico.

[0151] El siguiente material biológico fue depositado bajo los términos del Tratado de Budapest en el Leibniz-Institut DSMZ-Deutsche Sammlung von Mikro-organismen und Zellkulturen GmbH, Inhoffenstrafte 7 B, 38124 Braunschweig, Alemania, y se le dio el siguiente número de acceso:

[0152] El Bacillus subtilis DSM 29870 fue aislado por Novozymes (Novo Nordisk) de una muestra ambiental recolectada en Jamaica en 1990. La cepa se identificó como Bacillus subtilis basándose en la secuenciación de ADNr 16S.

[0153] La cepa se ha depositado en condiciones que aseguran que el acceso al cultivo estará disponible durante la tramitación de esta solicitud de patente para alguien que las leyes de patentes extranjeras determinen que tiene derecho a ello. Los depósitos representan un cultivo sustancialmente puro de la cepa depositada. Los depósitos están disponibles según lo exigen las leyes de patentes extranjeras en países en los que se presentan contrapartidas de la solicitud en cuestión o su progenie. Sin embargo, debe entenderse que la disponibilidad de un depósito no constituye una licencia para practicar la invención en cuestión en derogación de los derechos de patente otorgados por acción gubernamental.

Secuenciación del gen ADNr 16S

[0154] El ADN se extrajo de un cultivo de DSM 29870 usando el kit QiaAmp DNA Blood Mini (Qiagen art 51106). El kit se usó según lo recomendado para la extracción de ADN de bacterias gram-positivas.

[0155] El ADNr 16S se amplificó en un volumen total de 50 |_il mezclando: 10 pmol de cada uno de los cebadores 16S-F y 16S-R (Tabla 1.2), 0,2 mM de cada nucleótido, 2,5 unidades de Ampli taq, 1 x tampón Ampli taq y 5 |_il de plantilla de ADN.

[0156] El siguiente programa de PCR: 94 °C min 2 min (94 °C 30 s, 52 °C 30 s, 72 °C 1 min)x35, 72 °C 10 min se aplicó en una máquina de PCR Perkin Elmer. El producto de PCR se secuenció usando los cebadores 794-R, 357-F, 1390-R y 1000-F (Tabla 1.2) en un secuenciador ABI Prism.

[0157] La secuencia del ADNr 16S se muestra en la SEC ID N.°: 9, la secuencia se analizó mediante BLAST contra la base de datos EMBL y mostró identidad con las secuencias del ADNr 16S de Bacillus subtilis.

Ejemplo 2: secuenciación del genoma completo y colocación taxonómica de la cepa de Bacillus DSM 29870 Resumen:

[0158] La identidad nuclear promedio (ANI) y la filogenética revelan que la cepa de Bacillus DSM 29870 es una nueva subespecie de Bacillus subtilis.

Materiales y métodos:

Secuenciación del genoma de DSM 29870

[0159] El ADN se extrajo de un cultivo de DSM 29870 usando el kit QiaAmp DNA Blood Mini (Qiagen art 51106). El kit se usó según lo recomendado para la extracción de ADN de bacterias gram-positivas. El ADN genómico se fragmentó usando un ultrasonicador Covaris M220™ (Covaris, Inc., Woburn, MA) y se usó para generar la biblioteca TruSeq™ (Illumina, Inc., San Diego, CA) usando el sistema de preparación de la biblioteca Apollo 324™ (Wafergen Biosystems, Inc., Fremont, CA). Las bibliotecas preparadas se secuenciaron usando un secuenciador de mesa MiSeq (Illumina, Inc., San Diego, CA) con el Kit de reactivos MiSeq v3 (600 ciclos) para generar lecturas de extremos emparejados de ~ 360 pb hacia adelante y 240 pb hacia atrás. Las secuencias se recortaron y se empalmaron de nuevo en CLC Genomics Workbench 7.0.4 (CLC Bio, Aarhus, Dinamarca) utilizando los módulos correspondientes.

[0160] Se utilizaron los siguientes parámetros de recorte principales: Recorte ambiguo = Sí, Límite ambiguo = 2, Recorte de calidad = Sí, Límite de calidad = 0,01, Número mínimo de nucleótidos = 50, Guardar pares rotos = Sí. Se utilizaron los siguientes parámetros principales de nuevo empalme: Modo de mapeo = Lecturas de mapa de vuelta a cóntigos, Actualizar cóntigos = Sí, Tamaño de bibble automático = Sí, Longitud mínima de cóntigo = 200, Realizar andamiaje = Sí, Coste de desemparejado = 2, Coste de inserción = 3, Coste de deleción = 3, Fracción de longitud = 0,8, Fracción de similitud = 0,95.

Secuencias genómicas de referencia:

[0161] Se descargaron los borradores del genoma y los genomas completos de las cepas de Bacillus públicas de los genomas de NCBI el 29 de diciembre de 2014.

Filogenética del genoma central:

[0162] Se utilizó Prodigal versión 2.6 [Hyatt et al., 2010 "Prodigal: prokaryotic gene recognition and translation initiation site identification", BMC Bioinformatics 11: 119] para determinar las secuencias de proteínas.

[0163] Se utilizó PhyloPhlan [Segata et al., 2013, "PhyloPhlAn is a new method for improved phylogenetic and taxonomic placement of microbes", Nat. Commun. 4: 2304] para generar un árbol filogenético del genoma central basado en señales filogenéticas de las 400 secuencias de proteínas más conservadas.

[0164] Se utilizó un Dendroscopio 3 [Huson et al., 2-12. "Dendroscope 3: an interactive tool for rooted phylogenetic trees and networks", Syst. Biol. 61: 1061-1067] para visualizar el árbol como un filograma rectangular con enraizamiento en el punto medio junto con un soporte de arranque (figura 3).

Estimaciones de ANI:

[0165] Se obtuvo un script de Ruby de código abierto (ani.rb) para la estimación de ANI del laboratorio de Kostas (enveomics.blogspot.com/2013/10/anirb.html) y se usó para estimaciones ANI por pares.

Métodos detallados:

[0166] Todos los scripts y programas ejecutados en la línea de comandos corrieron en Ubuntu versión 10.04 o versión 12.04 (Canonical Ltd.).

Filogenética del genoma central:

[0167] Todos los archivos fasta de los genomas se trasladaron a la misma carpeta y luego se utilizó la versión 2.6 de Prodigal para determinar las secuencias de proteínas como se muestra en el siguiente ejemplo:

Ejemplo de ejecución de script de Prodigal

[0168]

prodigal -i RO_NN-1_CP002906.fasta-a./Protein_files/RO_NN~l_CP002906.faa-c­

m

[0169] Todas las secuencias de proteínas se trasladaron entonces a una carpeta dentro de la carpeta de entrada del directorio de trabajo Phylophlan (por ejemplo, dentro de Protein_files) y luego se ejecutó Phylophlan como en el siguiente ejemplo:

Ejemplo de ejecución de script PhyloPhlan

[0170]

./phylophlan.py—nproc14—uProtein_files

[0171] El archivo newick generado en la carpeta de salida se usó como entrada en el Dendroscopio 3 para el enraizamiento del punto medio y la imagen se exportó en el formato deseado después de que se ajustaran los tamaños de fuente y se seleccionó el método de representación en árbol deseado.

Estimaciones de ANI:

[0172] Los archivos Fasta de los genomas de cada cepa se compararon por pares usando ani.rb.

Ejemplo de ejecución de script ani:

[0173]

ruby ./ani.rb -1 O52BCU_EFGBl0.fasta-2RO_NN-1_CP002906.fasta

[0174] Los resultados se mostraron en la pantalla, se copiaron en un documento de Word y luego se resumieron en una tabla.

Resultados y discusión:

Estimaciones de ANI:

[0175] La identidad nuclear promedio (ANI) es un enfoque basado en la distancia para delinear especies basándose en comparaciones por pares de secuencias del genoma [Goris et al., 2007, "DNA-DNA hybridization values and their relationship to whole-genome sequence similarities", Int. J. Syst. Evol. Microbiol 57: 81-91]. Ver la definición de ANI para más detalles.

[0176] La tabla 2.1 muestra las estimaciones de ANI de la cepa DSM 29870 por pares en comparación con otras especies de Bacillus. Los datos muestran que la cepa DSM 29870 tiene más identidad (> 93 %) con Bacillus subtilis spizezenii TU-B-10 y Bacillus vallismortis. La identidad es más baja en todas las demás comparaciones con especies dentro del género Bacillus. El valor de ANI es inferior al 95 % en todas las comparaciones y, por lo tanto, es difícil hacer una declaración definitiva de la ubicación taxonómica utilizando solo ANI. Los valores de ANI inferiores al 95 % pero superiores al 93% también se observan entre las subespecies de Bacillus amyloliquefaciens plantarum y amyloliquefaciens. Por lo tanto, es muy posible que la cepa DSM 29870 sea una subespecie de Bacillus subtilis.

Tabla 2.1: ANI bidireccional por pares de la cepa de Bacillus O52BCU en comparación con otros genomas b a c t g r ^ ____________________________________________________________________

Bacillus Bacillus Bacillus Bacillus Bacillus Bacillus Bacillus subtilis vallismortis subtilis tequilensis amyloliquefaciens cereus Anthracis Spizizenii 168 YAU_B9601 Y2 BMG1.7 ames TU-B-10

DSM2987 93,68 93,84 92,12 92,07 82,76 79,95 80,59 0

Filogenética:

Bacillus vallismortis (Figura 3). Se hace zoom sobre la figura 3 para mostrar la relación de la cepa DSM 29870 con sus vecinos más cercanos. Ver figura 2 para el filograma completo.

Conclusión:

[0178]

El valor de la Identidad Nuclear Promedio (ANI) es inferior al 95 % en todas las comparaciones y, por lo tanto, es difícil hacer una declaración definitiva de la ubicación taxonómica utilizando solo ANI. Sin embargo, en combinación con la filogenética, concluimos que la cepa bacteriana DSM 29870 es distinta de las cepas de Bacillus conocidas hasta ahora a un nivel que al menos representa una nueva subespecie de Bacillus subtilis. Ejemplo 3: análisis de GyrB

Antecedentes

[0179] El análisis comparativo del gen gyrB que codifica la subunidad B de la proteína ADN girasa se demostró previamente como una herramienta eficiente para la caracterización taxonómica de los miembros del grupo la Bacillus subtilis. [International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology (2007), 57: 1846-1850].

[0180] La secuencia del gen gyrB de la cepa de Bacillus subtilis 168 depositada como CP010052_13 en la base de datos EMBL se usó para encontrar el gen gyrB en la secuencia del genoma de DSM 29870.

[0181] Con un script de Perl, se utilizó el EMBL: CP010052_13 para un análisis BlastN que proporcionó la ubicación (número de cóntigos, posición y orientación) del gen gyrB en la secuencia del genoma del DSM 29870. La secuencia del gen gyrB del DSM 29870 se extrajo posteriormente manualmente de la secuencia del genoma.

[0182] Para el análisis comparativo, elegimos usar solo un gen parcial gyrB. La secuencia parcial del gen gyrB de Bacillus subtilis DSM 29870 se muestra en la SEC ID N.°: 1. La secuencia se tradujo en la secuencia de aminoácidos (SEC ID N.°: 2). La secuencia de aminoácidos del producto del gen gyrB parcial abarca los aminoácidos 49-614 del producto del gen gyrB en la cepa tipo Bacillus subtilis UNIPROT: P05652 [Moriya et al., 1985, "Structure and function of the region of the replication origin of the Bacillus subtilis chromosome. III. Nucleotide sequence of some 10,000 base pairs in the origin region.". Nucleic Acid Res. 13: 2251-2265].

[0183] Las secuencias de aminoácidos y ADN se analizaron mediante BLAST [Altschul et al., 1990, "Basic local alignment search tool", J. Mol. Biol. 215: 403-410] La secuencia de aminoácidos mostró una identidad del 99,3 % con la cepa relacionada más cercana de Bacillus subtilis, la secuencia de ADN mostró una identidad del 94,6 % con el pariente más cercano, Bacillus subtilis subsp. Spizizenii. Esto indica que Bacillus subtilis DSM 29870 es una nueva subespecie de Bacillus subtilis.

Ejemplo 4: análisis de rpoB

Antecedentes

[0184] El gen rpoB que codifica la subunidad beta de los polímeros de ARN se utilizó previamente como marcador filogenético. Se revisó el uso extensivo de rpoB [Adékambi et al., 2009, "The rpoB gene as a tool for clinical microbiologists", Trends in Microbiology 17 (1): 37-45]. Se utilizó para discriminar subgrupos/especies estrechamente relacionadas de Bacillus [Qi et al., 2001, "Utilization of the rpoB Gene as a Specific Chromosomal Marker for Real-Time PCR Detection of Bacillus anthracis", Appl. Environ. Microbiol 67 (8): 3720-3727].

[0185] La secuencia del gen rpoB de la cepa Marburg de tipo salvaje de Bacillus subtilis depositada en la base de datos EMBL bajo L24376 [Boor et al., 1995, "Genetic and transcriptional organization of the region encoding the beta subunit of Bacillus subtilis RNA polymerase", J. Biol. Chem 270 (35): 20329-20336] se utilizó para encontrar el gen rpoB en la secuencia del genoma del DSM 29870.

[0186] Con un script de Perl, se utilizó el EMBL: L24376 para un análisis BlastN que proporcionó la ubicación (número de cóntigos, posición y orientación) del gen rpoB del DSM 29870. La secuencia del gen rpoB del DSM 29870 se extrajo manualmente de la secuencia del genoma. Para el análisis comparativo, elegimos usar solo un gen rpoB parcial. La secuencia parcial del gen rpoB de Bacillus subtilis DSM 29870 se muestra en la SEC ID N.°: 3.

[0187] La secuencia se tradujo en la secuencia de aminoácidos. La secuencia de aminoácidos del producto del gen rpoB parcial se muestra en la SEC ID N.°: 4. Abarca los aminoácidos equivalentes a los del 1 al 1193 del producto del gen rpoB en Bacillus subtilis de EMBL: L24376 [Boor et al., 1995, "Genetic and transcriptional organization of the region encoding the beta subunit of Bacillus subtilis RNA polymerase", J. Biol. Chem 270 (35): 20329-20336].

[0188] Las secuencias de aminoácidos y ADN fueron analizadas mediante BLAST [Altschul et al., 1990, "Basic local alignmentsearch tool". J. Mol. Biol. 215: 403-410] La secuencia de aminoácidos mostró una identidad del 99,4% con la cepa relacionada más cercana de Bacillus subtilis, la secuencia de ADN mostró una identidad del 96,5 % con el pariente más cercano, Bacillus subtilis subsp. Spizizenii. Esto indica que Bacillus subtilis DSM 29870 es una nueva subespecie de Bacillus subtilis.

Ejemplo 5: Análisis comparativo del GyrA extraído de la secuencia del genoma

Antecedentes

[0189] La secuencia parcial del gen gyrA que codifica la subunidad alfa de la proteína ADN girasa se ha utilizado previamente como marcador filogenético para discriminar a los miembros del grupo Bacillus subtilis. Doce cepas de Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus atrophaeus, Bacillus licheniformis, Bacillus mojavensis, Bacillus subtilis subsp. subtilis, Bacillus subtilis subsp. spizizenii y Bacillus vallismortis se secuenciaron, y se demostró que Bacillus subtilis subsp. subtilis podría ser discriminado de Bacillus subtilis subsp. spizizenii sobre la base de esta secuencia de genes [Chun y Bae, 2000, "Phylogenetic analysis of Bacillus subtilis and related taxa based on partial gyrA gene sequences", Antonie van Leeuwenhoek 78: 123-127]. La secuencia parcial del gen gyrA de Bacillus amyloliquefaciens KCTC 1660T depositado en EMBL como AF272015 se usó para identificar y extraer el gen gyrA del genoma del DSM 29870.

Análisis de los datos

[0190] Con un script de Perl, se utilizó el EMBL: AF272015 para un análisis BlastN que proporcionó la ubicación (número de cóntigos, posición y orientación) del gen gyrA parcial del DSM 29870. La secuencia del gen gyrA parcial del DSM 29870 se extrajo manualmente de la secuencia del genoma.

[0191] La secuencia parcial del gen gyrA de Bacillus subtilis DSM 29870 se muestra en la SEC ID N.°: 7. La secuencia se tradujo en la secuencia de aminoácidos. La secuencia de aminoácidos del producto del gen gyrA parcial abarca los aminoácidos que se muestran en la SEC ID N.°: 8. Las secuencias de aminoácidos y ADN se analizaron mediante BLAST [Altschul et al., 1990, "Basic local alignmentsearch tool", J. Mol. Biol. 215: 403-410] La secuencia de aminoácidos muestra una identidad del 97,3 % con la cepa relacionada más cercana de Bacillus subtilis subsp spizizenii TU-B10, la secuencia de ADN mostró una identidad del 89,4 % con el pariente más cercano, Bacillus subtilis subsp. spizizenii ATCC6633, esto indica que Bacillus subtilis DSM 29870 es una nueva subespecie de Bacillus subtilis.

Ejemplo 6: Determinación de la inhibición del crecimiento de Clostridium perfringens

[0192] Las cepas 23 y 48 de Clostridium perfringens cepas (ambas son positivas para netB) [Gholamiandekhordi et al., 2006, "Molecular and phenotypical characterization of Clostridium perfringens isolates from poultry flocks with different disease status", Vet. Microbiol 113: 143-152] se cultivaron durante la noche en caldo de soja tríptico (BD parte 211822) suplementado con extracto de levadura al 0,6 % (BD parte 212750) a 35 °C en condiciones anaeróbicas estáticas. Se añadieron 250 |_il del cultivo nocturno de Clostridium perfringens a 250 ml de agar tríptico de soja suplementado con extracto de levadura al 0,6 % a 40 ° C y se vertió en placas de Petri rectangulares (Nunc parte 267060). Luego se dejó enfriar el agar inoculado a temperatura ambiente, después de lo cual se hizo un pozo de 8 mm de diámetro en el agar. Las placas se almacenaron en ausencia de oxígeno hasta su uso.

[0193] El Bacillus DSM 29870 se cultivó durante la noche en caldo de soja tríptico a 35 °C en condiciones aeróbicas. Se recogieron 1000 |_il de cultivo de Bacillus y se fraccionaron en sobrenadante libre de células y en células mediante centrifugación. Se añadieron 20 |_il de sobrenadante libre de células o células diluidas 100x en solución salina tamponada con fosfato directamente a los pocillos en las placas de agar inoculadas con Clostridium perfringens. Un pocillo de control contenía 20 |_il de solución salina tamponada con fosfato. Las placas se incubaron durante 18 horas a 35 °C en condiciones anaeróbicas.

[0194] La inhibición de la cepa de Clostridium perfringens se percibió por una zona limpia circular alrededor del pozo de interés. El pozo de solución salina tamponada con fosfato se consideró un control negativo basándose en la falta de zona limpia alrededor del pozo.

[0195] El sobrenadante libre de células y las células diluidas 100x de la cepa de Bacillus DSM 29870 fueron capaces de inhibir de manera consistente el crecimiento de las cepas 23 y 48 de C. perfringens in vitro. También se observó inhibición en la cepa competidora "CloSTAT", tanto para el sobrenadante como para las células, pero no se observó en la cepa competidora GalliproTect. "CloSTAT" es una cepa de Bacillus amyloliquefaciens que se aisló del producto comercial DFM CloSTAT, Kemin. "GalliproTect" es una cepa de Bacillus licheniformis que se aisló del producto comercial Gallipro Tect, Chr. Hansen.

Ejemplo 7: Determinación de la inhibición del crecimiento de Escherichia coli

[0196] Las cepas de Escherichia coli ATCC10536 o ATCC25922, se cultivaron durante la noche en caldo de soja tríptico (BD parte 211822) suplementado con extracto de levadura al 0,6 % (BD parte 212750) a 35 °C en condiciones anaeróbicas estáticas. Se añadieron 100 |_il del cultivo nocturno de Escherichia coli a 250 ml de agar tríptico de soja suplementado con extracto de levadura al 0,6 % a 40 ° C y se vertió en placas de Petri rectangulares (Nunc parte 267060). El agar inoculado se dejó enfriar a temperatura ambiente, después de lo cual se hizo un pozo de 8 mm de diámetro en el agar.

[0197] El Bacillus DSM 29870 se cultivó durante la noche en caldo de soja tríptico a 35 °C en condiciones aeróbicas. Se recogieron 1000 |_il de cultivo de Bacillus y se fraccionaron en sobrenadante libre de células y en células mediante centrifugación. Se añadieron 20 |_il de sobrenadante libre de células o células diluidas 100x en solución salina tamponada con fosfato directamente a los pocillos en las placas de agar inoculadas con Escherichia coli. Un pocillo de control contenía 20 |_il de solución salina tamponada con fosfato. Las placas se incubaron durante 18 horas a 35 °C en condiciones aeróbicas.

[0198] La inhibición de la cepa de Escherichia coli se percibió por una zona limpia circular alrededor del pozo de interés. El pozo de solución salina tamponada con fosfato se consideró un control negativo basándose en la falta de zona limpia alrededor del pozo.

[0199] El sobrenadante libre de células y las células diluidas 100x de las cepas de Bacillus DSM 29870 pudieron inhibir de manera consistente el crecimiento de las cepas de E. coli ATCC10535 y ATCC25922 in vitro. También se observó inhibición por parte de la cepa competidora CloSTAT, tanto para el sobrenadante como para las células.

Ejemplo 8: no hemolítico

[0200] La hemólisis se probó de acuerdo con la Technical Guidance on the assessment of the toxigenic potential of Bacillus species used in animal nutrition, EFSA Journal 2011; 9 (11 ):2445.

[0201] Las placas de agar sangre de oveja se compraron listas para usar (Becton Dickenson art 254053 o 254087). Alternativamente, las placas de agar pueden prepararse añadiendo 5 % de sangre de oveja desfibrinada (obtenida del Statens Serum Institute, Dinamarca) al agar TS (Oxoid CM 131). El agar debe esterilizarse en autoclave a 121 °C durante 20 minutos y enfriarse a aproximadamente 40 °C antes de agregar la sangre inmediatamente antes de verter las placas.

[0202] Las cepas de Bacillus se sacaron de la conservación a -80 °C y se colocaron en placas de agar TSA, que se incubaron a 30 °C durante la noche o hasta que empezó a mostrarse el crecimiento. De una sola colonia se usó la menor cantidad posible de material para rayar una línea en % de una placa de agar. La placa se incubó a 30 °C durante 72 horas. Las zonas de hemólisis/zonas limpias de las cepas de Bacillus que se van a analizar se compararon con el control positivo y negativo. Como control positivo se utilizó Bacillus subtilis ATCC 21332. Como control negativo se utilizó Bacillus subtilis 168.

[0203] En un cribado de 599 aislados independientes de las cepas de Bacillus 223 (37 %) fueron negativos para la hemólisis. En otro cribado de 21 de 65 aislados independientes de Bacillus (32 %) fueron negativos para la hemólisis. Ambos cribados incluyeron exclusivamente cepas según la identificación por secuenciación de ADNr 16S, que pertenecen a Bacillus subtilis, Bacillus licheniformis, Bacillus pumilus y Bacillus amyloliquefaciens (o especies de Bacillus que son difíciles de discriminar de estas basándose en la secuenciación de ADNr 16S).

[0204] Las cepas de Bacillus no hemolíticas, por lo tanto, parecen ser comunes y bastante abundantes en la naturaleza, pero solo comprenden una minoría de las cepas naturales. Las cepas no hemolíticas parecen ser más abundantes en Bacillus licheniformis, mientras que la mayoría de las cepas de Bacillus amyloliquefaciens parecen hemolíticas. La siguiente cepa de este cribado fue negativa para la hemólisis y se seleccionó para estudios adicionales: Bacillus DSM 29870.

Ejemplo 9: sensibilidad a los antibióticos

[0205] Las concentraciones inhibitorias mínimas (MIC) de ocho antibióticos contra las cepas de Bacillus DSM 29870 se determinaron usando una microdilución de caldo esencialmente como se describe en las directrices de CLSI (M07-A9 Methods for Dilution Antimicrobial Susceptibility Tests for Bacteria That Grow Aerobically; 2012). La única modificación fue que se cambiaron los volúmenes; se añadieron 90 pl de MHB con bacterias a las diluciones de antibióticos de 10 pl, se cambiaron las ufc de bacterias y la concentración de antibióticos para que las concentraciones finales y las ufc finales cumplieran con la directriz. Las placas se incubaron durante 20-24 h en lugar de durante 16-20 h. La cepa de control recomendada en el estándar CLSI Staphylococcus aureus ATCC 29213 se usó como cepa de control.

Materiales

Cepas:

[0206]

Bacillus subtilis DSM 29870

S. aureus ATCC 29213

Antibióticos:

[0207]

Cloranfenicol (Sigma C1919, 10 mg/ml, solubilizado en etanol al 96 %)

Clindamicina (Sigma PHR1159, 10 mg/ml, solubilizada en agua)

Eritromicina (A^b BOTICIN de Amdipharm 40501, 50 mg/ml, solubilizada en etanol al 96 %) Gentamicina (Biomedicals inc., 190057, 10 mg/ml, solubilizada en agua)

Kanamicina (Sigma, No CAS. 25389-94-0, 50 mg/ml, solubilizada en agua)

Estreptomicina (Sigma, S1277, 10 mg/ml, solubilizada en agua)

Tetraciclina (Sigma, T3383, 10 mg/ml, solubilizada en agua)

Vancomicina (Sigma, V-8138, 10 mg/ml, solubilizada en agua)

Caldo Mueller Hinton 2 (Sigma/Fluka 90922)

NaCl al 0,9 % (Sigma/RdH 31434/Merck 106404)

Placas de agar triptona de soja (Oxoid CM 131)

Placas de microtitulación: placa Costar, polipropileno, fondo redondo, Corning 3879

Método

Preparación de bacterias:

[0208] Algunas colonias de Bacillus spp. (<1 día) se inocularon en el caldo Mueller Hinton 2 (MHB) y se incubaron durante aproximadamente 4 horas a 37 °C. La DO600 (BioPhotometer plus, Eppendorf) se midió y se ajustó a 0,25 (equivalente a McFarland 0,5) en MHB. Para la cepa de control se usó la suspensión directa de colonias. Algunas colonias de S. aureus ATCC 29213 (<1 día de edad) se suspendieron en MHB y la OD600 (BioPhotometer plus, Eppendorf) se midió y se ajustó a 0,10-0,12 (equivalente a McFarland 0,5) en MHB. Las suspensiones bacterianas se diluyeron 200x en MHB.

Preparación de las placas de ensayo:

[0209] Los antibióticos se diluyeron hasta la concentración de 640 pg/ml en MHB. Se preparó una serie de diluciones dobles en MHB hasta la concentración de 0,625 pg/ml. Se pipetearon 10 pl de cada dilución y de cada antibiótico en placas de microtitulación. Más tarde, cuando los antibióticos se mezclaron con la suspensión de bacterias, las muestras se diluyeron 10x (10 pl de muestra en un volumen total de 100 pl). Esto dio como resultado el rango de prueba final de 0,06-64 pg/ml.

[0210] Si las placas no se usan de inmediato, se almacenan en el congelador a -20 °C hasta su uso.

[0211] Se añadieron 90 |_il de las suspensiones bacterianas a las placas de ensayo. Las placas de ensayo se incubaron en una bolsa de plástico con un paño húmedo a 37 °C durante 20-24 h. La MIC se determinó como la concentración más baja de antibiótico que inhibía completamente el crecimiento de bacterias detectadas a simple vista.

Estimación de UFC:

[0212] Se realizaron una serie de diluciones 10x en NaCl al 0,9 % para los 10-3 de los cultivos inoculados en las placas de microtitulación. 2x 100 ul de la dilución 10-3 se sembraron en dos placas de TSA. Las placas se incubaron durante la noche a 37 °C. Se contó el número de UFC/ml.

[0213] Se realizaron tres réplicas biológicas del ensayo para Bacillus DSM 29870.

Resultados:

[0214] Los valores de MIC obtenidos para B. subtilis DSM 29870 mostraron que los valores del punto de interrupción eran iguales o inferiores a los valores del punto de interrupción dados en la directriz EFSA (EFSA Journal 2012; 10 (6):2740).

[0215] Como control S. aureus ATCC 29213 se probó en paralelo y tenía valores MIC dentro de los rangos dados por el estándar CLSI (Estándares de rendimiento M100-S24 para pruebas de susceptibilidad antimicrobiana; suplemento informativo, 2014).

[0216] Se midió la cantidad de bacterias inoculadas en las placas de ensayo (UFC/ml). En general, las UFC/ml estaba muy cerca del valor objetivo de 1,5*105 UFC/ml. Sin embargo, las UFC/ml para las cepas de Bacillus fueron posiblemente más altas que el valor real, ya que las bacterias tienden a agregarse, y una agregada solo dará como resultado una unidad formadora de colonias (Tablas 9.1 y 9.2).

-

Ejemplo 10 análisis gyrB

Amplificación por PCR de gyrB

[0217] Para la amplificación por PCR, se mezcló 1 j l de ADN genómico (ver ejemplo 2) con 12,5 j l de solución PCR Extensor Reddymix (Thermo Fisher Scientific, Surrey, Reino Unido), 1 j l de cada una de las soluciones 10 |jM de los cebadores 3AF y 4R2 (Tabla 10.1) y 9,5 j l de agua destilada. Para las reacciones de PCR de control negativo, se añadió 1 j l de agua MQ en lugar de ADN.

[0218] El termociclador de PCR (DNA Engine DYAD BIORAD) se programó para funcionar a 92 °C durante 2 min, 40*[94 °C durante 30 s, 52 °C durante 30 s, 72 °C durante 60 s], 72 °C durante 10 min. El producto de PCR se evaluó mediante electroforesis en gel de agarosa en un casete FlashGel (Lonza, Rockland, ME EE. UU.), utilizando un marcador de ADN FlashGel de 100 pb a 4000 pb, para estimar el tamaño del amplificación. La amplificación mediante PCR del gen gyrB tuvo éxito cuando se vio una banda de aproximadamente 1700 nt en el gel.

Purificación de productos de PCR

[0219] La purificación por PCR se realizó con una placa de filtro Multiscreen PCR de 96 pocillos (Millipore, Irlanda); el volumen completo de la reacción de PCR se llevó a un pocillo de una placa de 96 pocillos, se añadió agua MilliQ hasta 100 jl. La placa se sometió a vacío hasta que estuvo seca (20-25 s). Se añadieron 100 j l de agua MilliQ, se repitió la etapa de vacío. El producto de PCR se eluyó mediante la adición de 50 j l de tampón de elución (el tampón de elución era agua) y se pipeteó el producto de PCR para sacarlo de la parte superior del filtro. El producto de PCR purificado se almacenó a -22 °C.

Secuenciación de los genes

[0220] La concentración de ADN del producto de PCR purificado se cuantificó en un espectrofotómetro NanoDrop 1000 (Thermo Fisher, Waltham, MA, EE. UU.). Se prepararon cuatro reacciones de secuencia cada una usando 10 ng de producto de PCR, 1 ul de cebador 10 mM de uno de los cebadores C-F, D-R, BS-F o BS-R (Tabla 10.2) y agua destilada hasta 12 jl. Las soluciones se mezclaron y se usaron para la secuenciación de Sanger en un secuenciador ABI Prism [Sanger, »DNA sequencing with chain-terminating inhibitors,« Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, p. 5463-5467, diciembre de 1977].

T l 1 .2: r :

[0221] Las trazas de secuencia se empalmaron en un gen gyrB parcial utilizando el programa SeqMan del Lasergene (DNA STAR 7, Lasergene). La secuencia de todo el producto de PCR menos la región del cebador de Bacillus subtilis DSM 29870 se muestra en la SEC ID N.° 32. La secuencia se tradujo en un secuencia de aminoácidos (SEC ID N.°: 33). La secuencia de aminoácidos del producto del gen gyrB parcial abarca los aminoácidos 49-614 del producto del gen gyrB en la cepa tipo Bacillus subtilis UNIPROT: P05652 [Moriya et al., 1985, "Structure and function of the region of the replication origin of the Bacillus subtilis chromosome. III. Nucleotide sequence of some 10,000 base pairs in the origin region.", Nucleic Acids Res. 13: 2251-2265] Las secuencias de aminoácidos y ADN se analizaron mediante BLAST [Altschul et al., 1990, "Basic local alignment search tool", J. Mol. Biol. 215: 403-410] La secuencia de aminoácidos mostró un 99,2 % de identidad con las dos secuencias relacionadas más cercanas que eran las cepas de Bacillus subtilis subsp. spizizenii ATCC663 y W23, respectivamente. La secuencia de ADN mostró una identidad del 94,7 % con la secuencia relacionada más cercana que era de Bacillus subtilis subsp. spizizenii TU-B-10, esto indica que Bacillus subtilis DSM 29870 es una nueva subespecie de Bacillus subtilis.

Ejemplo 11 análisis rpoB

Antecedentes

[0222] El gen rpoB que codifica la subunidad beta de los polímeros de ARN se utilizó previamente como marcador filogenético para discriminar subgrupos/especies estrechamente relacionadas en Bacillus [Qi et al., 2001, "Utilization of the rpoB Gene as a Specific Chromosomal Marker for Real-Time PCR Detection of Bacillus anthracis", Appl. Environ. Microbiol 67 (8): 3720-3727] Por comparación de los genes rpoB de Bacillus amyloliquefaciens y Bacillus subtilis, se diseñaron cebadores y se utilizó una evaluación basada en secuencias similar para mostrar que DSM 29870 es una subespecie novedosa de Bacillus subtilis.

Amplificación por PCR de rpoB

[0223] Para la amplificación por PCR, se mezcló 1 j l de ADN genómico (ver ejemplo 2) con 12,5 j l de solución PCR Extensor Reddymix (Thermo Fisher Scientific, Surrey, Reino Unido), 1 j l de cada una de las soluciones 10 |jM de los cebadores rpoB-PCR-F y rpoB -PCR-R (Tabla 11.1) y 9,5 j l de agua destilada. Para las reacciones de PCR de control negativo, se añadió 1 j l de agua MQ en lugar de ADN.

[0224] El termociclador de PCR (DNA Engine DYAD BIORAD) se programó para funcionar a 92 °C durante 2 min, 40*[94 °C durante 30 s, 52 °C durante 30 s, 72 °C durante 60 s], 72 °C durante 10 min. El producto de PCR se evaluó mediante electroforesis en gel de agarosa en un casete FlashGel (Lonza, Rockland, ME EE. UU.), utilizando un marcador de ADN FlashGel de 100 pb a 4000 pb, para estimar el tamaño del amplificación. La amplificación mediante PCR del gen rpoB tuvo éxito cuando se vio una banda de aproximadamente 3600 nt en el gel (el tamaño teórico es 3639 nt basado en embl: L24376).

Purificación de productos de PCR

[0225] La purificación por PCR se realizó con una placa de filtro Multiscreen PCR de 96 pocillos (Millipore, Irlanda); el volumen completo de la reacción de PCR se llevó a un pocillo de una placa de 96 pocillos, se añadió agua MilliQ hasta 100 jl. La placa se sometió a vacío hasta que se secó (20-25 s), se añadieron 100 j l de agua MilliQ, se repitió la etapa de vacío. El producto de PCR se eluyó mediante la adición de 50 j l de tampón de elución (el tampón de elución era agua) y se pipeteó el producto de PCR para sacarlo de la parte superior del filtro. El producto de PCR purificado se almacenó a -22 °C.

Secuenciación de los genes

[0226] La concentración de ADN del producto de PCR purificado se cuantificó en un espectrofotómetro NanoDrop 1000 (Thermo Fisher, Waltham, MA, EE. UU.). Se prepararon ocho reacciones de secuencia cada una usando 10 ng de producto de PCR, 1 ul de cebador 10 mM de uno de los cebadores rpoB-seq-F1, rpoB-seq-F2, rpoB-seq-F3, rpoB-seq-F4, rpoB- seq-R1, rpoB-seq-R2, rpoB-seq-R3 y rpoB-seq-R4 y agua destilada hasta 12 l_il. Las soluciones se mezclaron y se usaron para la secuenciación de Sanger en un secuenciador ABI Prism.

T l 11.2: r :

[0227] Las trazas de secuencia se empalmaron en un gen rpoB parcial utilizando el programa SeqMan del Lasergene (DNA STAR 7, Lasergene), la secuencia de todo el producto de PCR menos la región del cebador de Bacillus subtilis DSM 29870 se muestra en la SEC ID N.°: 34. La secuencia se tradujo en un secuencia de aminoácidos (SEC ID N.°: 35). La secuencia de aminoácidos del producto del gen gyrB parcial abarca los aminoácidos 49-614 del producto del gen rpoB en la cepa tipo Bacillus subtilis UNIPROT: P05652 [Moriya et al., 1985, "Structure and function of the region of the replication origin of the Bacillus subtilis chromosome. III. Nucleotide sequence of some 10,000 base pairs in the origin region.", Nucleic Acids Res. 13: 2251-2265] Las secuencias de aminoácidos y ADN se analizaron mediante BLAST [Altschul et al., 1990, "Basic local alignment search tool", J. Mol. Biol. 215: 403-410. La secuencia de aminoácidos mostró un 99,3 % de identidad con las tres secuencias relacionadas más cercanas de Bacillus subtilis subsp. spizizenii (cepa ATCC 23059, NRRL B-14472, W23) y ATCC6633 y una tercera que estaba mal anotada en la base de datos UniProt. La secuencia de ADN mostró una identidad del 96,5 % con la secuencia relacionada más cercana que era de Bacillus subtilis subsp. spizizenii TU-B-10. Esto indica que Bacillus subtilis DSM29870 es una nueva subespecie de Bacillus subtilis. Ejemplo 12: Determinación de la compatibilidad de la monensina

[0228] La compatibilidad con la monensina del DSM 29870 se determinó usando una microdilución de caldo modificada similar a la del método descrito en el ejemplo 9. En resumen, una sola colonia de Bacillus spp. (de las placas de agar tríptico de soja durante la noche) se inoculó en caldo Mueller Hinton (MHB) y se cultivó durante la noche. Luego se inoculó el medio estéril con el cultivo nocturno y se dejó crecer durante 4 horas para analizar las bacterias en la fase de crecimiento logarítmico. Los cultivos se diluyeron entonces una vez más 1: 200 en MHB fresco y se añadieron 90 |_il de este caldo inoculado a la monensina diluida a las concentraciones indicadas. Las cepas de la técnica anterior también se probaron para comparación: NN019785, NN062266 (NRRL B-50013), NN062267 (NRRL B-50104), NN062278 (PTA-6507), NN062319 (FERM BP-1096), NN062440, NN062441 (DSM 17236), NN062439.

Cepas:

[0229]

Bacillus subtilis DSM 29870.

Bacillus licheniformis NN019785.

Bacillus amyloliquefaciens NN062266 (NRRL B-50013).

Bacillus subtilis NN062267 (NRRL B-50104).

Bacillus subtilis NN062278 (PTA-6507).

Bacillus amyloliquefaciens NN062319 (FERM BP-1096).

Bacillus subtilis NN062440.

Bacillus licheniformis NN062441 (DSM 17236).

Bacillus amyloliquefaciens NN062439.

Materiales:

[0230]

Sal de monensina sódica (Sigma, N.° CAS 22373-78-0solubilizado en etanol al 96 %).

Caldo Mueller Hinton (Becton, Dickinson and Company, 275730).

Agar tríptico de soja (Becton, Dickinson and Company, 236920).

Placas de microtitulación: placa Costar, polipropileno, fondo plano, Corning 3628

Tubos de vidrio de borosilicato: Kimbale, 16 x 125 mm, 73500-16125.

Sellos adhesivos permeables al gas: Thermo Scientific, AB-0718.

Preparación de bacterias:

[0231] Se cultivaron durante la noche Bacillus spp. en placas de agar tríptico de soja (40 g/l) a 37 °C. El caldo Mueller Hinton (21 g/l) se disolvió en agua y se esterilizó en autoclave en tubos de vidrio que contenían 5 ml de caldo cada uno. Se inoculó una sola colonia de Bacillus spp. (de las placas nocturnas) en caldo Mueller Hinton (MHB) y se incubó durante la noche a 37 °C con agitación a 200 rpm. Luego se inoculó un tubo de vidrio de 5 ml de medio estéril fresco con 25 ml de cultivo nocturno y se dejó crecer durante 4 horas a 37 °C. Los cultivos se diluyeron una vez más 1: 200 en MHB fresco. A continuación, se añadieron 90 pl de este caldo inoculado al antibiótico diluido en las concentraciones indicadas.

Preparación de las placas de ensayo:

[0232] La monensina se diluyó en etanol al 96 % hasta una concentración de 800 pg/ml. Esta solución se diluyó 10 veces en tampón fosfato estéril hasta una concentración de 80 pg/ml. Se preparó una serie de diluciones dobles en MHB hasta la concentración de 2,5 pg/ml. Se pipetearon 10 pl de cada dilución y de cada antibiótico en una placa de microtitulación. Más tarde, cuando los antibióticos se mezclaron con la suspensión de bacterias, las muestras se diluyeron 10x (10 pl de muestra en un volumen total de 100 pl). Esto dio como resultado el rango de prueba final de 0,25-8 pg/ml.

[0233] Se añadieron 90 pl de las suspensiones bacterianas a las placas de ensayo. Las placas de ensayo se cubrieron luego con un sello permeable adhesivo de vidrio y se incubaron durante la noche a 37 °C agitando a 200 rpm. La concentración máxima compatible se determinó de manera similar a un análisis de MIC como la concentración que está por encima de la que inhibió el 80 % de las bacterias detectadas a simple vista.

Resultados:

[0234] Un desafío potencial de suministrar Bacillus spp. en piensos es el uso habitual de antibióticos como promotores del crecimiento en el pienso. Por lo tanto, es necesario determinar la compatibilidad de las cepas con los antibióticos en piensos de uso común, como la monensina, para identificar posibles conflictos con el uso como microbiano de alimentación directa. Por lo tanto, se determinó la compatibilidad con la monensina de la DSM 29870 junto con las cepas de la técnica anterior. DSM 29870 tiene un mayor nivel de compatibilidad con la monensina que las cepas de la técnica anterior incluidas en este documento: NN019785, NN062266 (NRRL B-50013), NN062267 (NRRL B-50104), NN062278 (PTA-6507), NN062319 (FERM BP-1096), NN062440, NN062441 (DSM 17236), NN062439.

T l 12.1: R l m i ili n m n n in

Claims (15)

REIVINDICACIONES

1. Cepa Bacillus que tiene el número de acceso de depósito DSM 29870 o un mutante de la misma, en donde la cepa de Bacillus o el mutante de la misma no son hemolíticas, tiene una alta compatibilidad con monensina, tiene actividad antimicrobiana contra Clostridium perfringens y E. coli y es sensible a la vancomicina, clindamicina, cloranfenicol, gentamicina, kanamicina, estreptomicina, eritromicina y tetraciclina.

2. Cepa de Bacillus según la reivindicación 1, donde la cepa de Bacillus no es hemolítica tal como se describe en el ejemplo 8.

3. Cepa de Bacillus según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 2, donde la cepa Bacillus es compatible con al menos 2,4 pg/ml de monensina tal como se determina en el ejemplo 12.

4. Cepa de Bacillus según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, donde el efecto contra Clostridium perfringens se determina tal como se describe en el ejemplo 6.

5. Cepa de Bacillus según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, donde el efecto contra E. coli se determina tal como se describe en el ejemplo 7.

6. Cepa de Bacillus según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, donde la sensibilidad a la vancomicina, clindamicina, cloranfenicol, gentamicina, kanamicina, estreptomicina, eritromicina y tetraciclina se determina como tal como se describe en el ejemplo 9.

7. Cepa de Bacillus según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, donde la cepa de Bacillus tiene un ADNr 16S con más del 98 % de identidad de secuencia con la SEC ID N.°: 9.

8. Composición que comprende esporas de una cepa de Bacillus según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7.

9. Composición según la reivindicación 8, que comprende además un vehículo.

10. Composición según la reivindicación 9, donde el vehículo comprende uno o varios de los siguientes compuestos: glicerol, etilenglicol, 1,2-propilenglicol, 1,3-propilenglicol, cloruro de sodio, benzoato de sodio, sorbato de potasio, sulfato de sodio, sulfato de potasio, sulfato de magnesio, tiosulfato de sodio, carbonato de calcio, citrato de sodio, dextrina, glucosa, sacarosa, sorbitol, lactosa, almidón y celulosa.

11. Composición según cualquiera de las reivindicaciones 8 a 10, donde la composición comprende de 105 a 1012 UFC/g de esporas de Bacillus aisladas.

12. Composición según cualquiera de las reivindicaciones 8 a 11, donde la composición es un pienso para animales o un aditivo para piensos para animales.

13. Composición según cualquiera de las reivindicaciones 8 a 11 para usar en el tratamiento de la enteritis necrótica o para usar en el tratamiento de una infección Clostridium perfringens.

14. Composición para usar según la reivindicación 13 para el tratamiento de una infección de Clostridium perfringens o para el tratamiento de la enteritis necrótica en uno o más animales que comprende administrar a los animales la composición según cualquiera de las reivindicaciones 8 a 12.

15. Uso no terapéutico de la composición según cualquiera de las reivindicaciones 8 a 12 para mejorar uno o más parámetros de rendimiento en un animal no humano, en el que los parámetros de rendimiento se seleccionan de la lista que consiste en mejorar la tasa de conversión alimenticia, mejorar el aumento de pesgo corporal, mejorar la eficiencia del pienso y mejorar el Factor Europeo de Eficiencia Productiva.