ES2221181T3 - Composiciones de fitasa de alta actividad. - Google Patents
Composiciones de fitasa de alta actividad.Info
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Abstract
La invención se refiere a un procedimiento de preparación de líquidos acuosos que contiene una fitasa, consistiendo el procedimiento a cultivar de los microorganismos del tipo Aspergillus o Trichoderma en un medio que contiene fuentes de carbono y de nitrógeno asimilables (por ejemplo iones de glucosa y de amonio), en filtrar el medio y en someter el filtrado obtenido a una ultrafiltración para obtener una composición acuosa que tiene al menos 14 000 FTU/g. Este líquido acuoso puede utilizarse para preparar granulados que pueden incorporarse a alimentos para animales.
Description
Composiciones de fitasa de alta actividad.
La presente invención se refiere a la preparación
y formulación de enzimas fitasas y a su uso para preparar
granulados para enzimas alimentarios en piensos para animales.
Se está haciendo más habitual el uso de diversos
enzimas tales como fitasas en el pienso para animales, por ejemplo
de ganado. Estos enzimas se incluyen para mejorar la captación de
nutrientes o minerales del pienso por el animal, y pueden ayudar
también a la digestibilidad. Normalmente se producen cultivando
microorganismos en fermentadores a gran escala manejados por los
productores industriales de enzimas. Al final de la fermentación, el
"caldo" resultante normalmente se somete a una serie de etapas
de filtración para separar la biomasa (los microorganismos) del
enzima deseado (en disolución). La solución enzimática después se
vende como un líquido (a menudo después de añadir diversos
estabilizantes) o se procesa hasta que se obtiene una formulación
seca.
Las formulaciones enzimáticas líquidas y secas se
usan a escala comercial en la industria de piensos para animales.
Las formulaciones líquidas se pueden añadir al pienso después de su
nodulización para evitar la inactivación térmica del enzima que
podría producirse durante el proceso de nodulización.
Las formulaciones secas normalmente implican
nodulización con vapor, en la que el pienso se somete a inyección
(inyecciones) de vapor antes de la nodulización. En la etapa de
nodulización posterior, el pienso se fuerza a través de una matriz o
troquel y las tiras resultantes se cortan en nódulos adecuados de
longitud variable. Durante este proceso, las temperaturas pueden
elevarse a los 60-95ºC.
Las fitasas son enzimas que (al menos
parcialmente) hidrolizan fitato (myo-inositolhexaquis
fosfato) a myo-inositol y fosfato inorgánico. Estos enzimas
se encuentran en el salvado de trigo, en semillas vegetales, en el
intestino de animales y pueden producirse por microorganismos. Las
fitasas se proporcionan en piensos para animales porque, como
pueden degradar el fitato, pueden aumentar la disponibilidad del
fósforo y de otros componentes nutricionales para el animal. Las
fitasas también pueden aumentar la digestibilidad del calcio.
El fósforo es un elemento esencial para el
crecimiento de los organismos. Para el ganado, el pienso a menudo
se complementa con fósforo inorgánico para obtener un buen
crecimiento en animales monogástricos. Sin embargo, normalmente esto
no es necesario en los piensos para rumiantes, porque los
microorganismos presentes en el rumen producen enzimas que catalizan
la conversión de fitasa en inositol y fosfato inorgánico. La
degradación de fitato a menudo es deseable porque el ácido fítico
puede ser anti-nutricional cuando forma quelatos
con minerales útiles tales como calcio, cinc, magnesio y hierro; y
puede reaccionar también de manera adversa con proteínas,
disminuyendo de esta manera su biodisponibilidad para el animal. La
adición de fitasa puede reducir también la cantidad de pienso
inorgánico que es necesario añadir y, por lo tanto, se excreta menos
fósforo en el estiércol, lo cual es mejor para el medio
ambiente.
Se ha clonado y expresado el gen para diversos
enzimas fitasas. El documento
EP-A-0.420.358
(Gist-Brocades) describe la expresión de fitasas
microbianas.
En una última solicitud
EP-A-0.684.313
(Hoffmann-La Roche) se describe una secuencia de
ADN que codifica diversos polinucleótidos que tienen actividad
fitasa.
El documento
EP-A-0.758.018
(Gist-Brocades) se refiere a métodos para mejorar la
estabilidad de enzimas, especialmente para uso como piensos para
animales, y hace referencia a fitasas.
El documento
WO-A-94/03612 (Alko) describe la
producción de enzimas que degradan fitato en Trichoderma,
mientras que el documento
WO-A-97/16076 (Novo Nordisk)
describe preparaciones que contienen enzimas para uso en la
fabricación de piensos para animales que comprenden diversas
substancias hidrófobas.
El pienso para animales representa uno de los
costes principales contraídos en el mantenimiento del ganado y de
otros animales. Además, ciertos aditivos tales como enzimas de tipo
fitasa pueden aumentar significativamente el coste del pienso para
animales. Un objetivo de la presente invención es poder
proporcionar composiciones de fitasa que sean más baratas de
producir. Esto se puede conseguir pudiendo fabricar composiciones de
fitasa de alta actividad o muy concentradas. Hay varios factores
que han permitido al presente solicitante poder preparar estas
composiciones de alta actividad y esto se analizará
posteriormente.
Una ventaja adicional de poder preparar
composiciones de fitasa de alta actividad que se ha observado por
el solicitante, es que estas composiciones pueden mostrar un
notable aumento de estabilidad, especialmente durante un proceso de
nodulización en la preparación de pienso para animales (nódulos) y,
por lo tanto, es más probable que retengan una mayor actividad
fitasa que las composiciones de la técnica anterior a lo largo del
tiempo.
En un primer aspecto de la presente invención se
proporciona un proceso para la preparación de un líquido acuoso que
comprende una fitasa, comprendiendo el proceso:
(a) cultivar en un medio acuoso un microorganismo
del género Aspergillus o Trichoderma que tiene un gen
de fitasa heterólogo bajo el control de un promotor de glucoamilasa
(para Aspergillus) o celobiohidrolasa (para
Trichoderma), en condiciones que permiten la expresión
recombinante de la fitasa, comprendiendo el medio, como alimento
para el microorganismo, una fuente de carbono asimilable y una
fuente de nitrógeno asimilable;
(b) filtrar el medio acuoso para retirar los
microorganismos dando un filtrado acuoso; y
(c) someter el filtrado de (b) a ultrafiltración
para dar un líquido acuoso que tiene una concentración de fitasa de
al menos 14.000 FTU/g.
Se ha descubierto que este proceso proporciona
una concentración particularmente alta de fitasa en la composición
acuosa resultante. Esto ha permitido la preparación de otras
composiciones de fitasa, también a niveles altos de actividad, lo
que significa que no sólo el proceso es más barato (por unidad de
actividad enzimática), sino que también se ha descubierto que las
composiciones que contienen fitasa más concentrada son mucho más
estables que sus equivalentes menos concentradas.
Los microorganismo son, preferiblemente, de las
especies Aspergillus niger, Aspergillus oryzae o
Trichoderma reesei. Para los organismos del género
Aspergillus, el gen de fitasa está convenientemente bajo el
control de un promotor de glucoamilasa (o amiloglucosidasa, AG).
Para los organismos del género Trichoderma, es preferible
usar un promotor de celobiohidrolasa.
La fuente de carbono asimilable puede comprender
glucosa y/o maltodextrina, y/o la fuente de nitrógeno asimilable
consta de iones amonio. La glucosa y los iones amonio pueden ser
las únicas fuentes asimilables de carbono o nitrógeno en el medio
acuoso. Es decir, se contempla que no se usan fuentes complejas de
carbono o nitrógeno. Los iones amonio se pueden proporcionar en
forma de amoniaco o en forma de una sal de amonio. Las sales de
amonio preferidas incluyen nitrato amónico, sulfato amónico y
fosfato amónico.
Preferiblemente, la fuente de carbono y/o
nitrógeno se suministra al medio de cultivo durante el proceso de
fermentación. La velocidad de suministro de cualquiera de las
fuentes puede ser substancialmente igual que la velocidad a la que
se consume por los microorganismos. De esta manera, la fuente de
carbono y/o nitrógeno se puede proporcionar de una manera continua
o constante. Las fuentes de carbono y nitrógeno se pueden
proporcionar por separado o en el mismo suministro.
El líquido acuoso resultante puede tener una
concentración de fitasa de al menos 16.000 y posiblemente incluso
de 18.000 o más FTU/g.
Usando estos organismos particulares en estas
condiciones, el filtrado se concentrará relativamente. Esto permite
someterlo a ultra-filtración. En algunos métodos de
la técnica anterior, el filtrado resultante contiene demasiados
residuos y otras substancias como para permitir la
ultra-filtración (el filtro se obstruye). Sin
embargo, en el proceso de la presente invención, el filtrado está
relativamente "limpio", lo que permite someter el filtrado a
una ultra-filtración, sin ningún procesamiento
adicional, y por lo tanto, se puede obtener por
ultra-filtración una composición acuosa con una
concentración particularmente alta.
Los métodos de la técnica anterior han analizado
la posibilidad de someter el filtrado o la composición acuosa a
etapas de cristalización y/o de eliminación del color, por ejemplo,
filtración en carbón. Sin embargo, en la presente invención se puede
prescindir de estas dos etapas adicionales (que pueden aumentar el
coste de producción de la fitasa).
Preferiblemente, los microorganismos no poseen, o
al menos no expresan, un gen de glucoamilasa. Esto significa que el
microorganismo puede dedicar más energía a la producción de la
fitasa.
El microorganismo puede poseer múltiples copias
del gen de fitasa. Se ha descubierto que esto aumenta los niveles
de producción de la fitasa porque hay más genes de fitasa a
expresar.
La composición acuosa puede carecer
substancialmente de taka-amilasa.
En el proceso de la invención, es preferible que
los microorganismos hayan consumido (substancialmente) todas las
fuentes de carbono y/o nitrógeno antes de que tenga lugar la
filtración en (b). Esto se puede conseguir permitiendo continuar la
fermentación durante algún tiempo después de que haya tenido lugar
el último suministro de las fuentes de carbono y/o nitrógeno. Como
alternativa, se puede permitir que continúe la fermentación más allá
de la etapa en la que se han añadido todas las fuentes de carbono
y/o nitrógeno. La ventaja de esto, como resultará evidente, es que
la composición acuosa puede liberarse (substancialmente) de las
fuentes de carbono y/o nitrógeno (por ejemplo, la glucosa y/o los
iones amonio). De nuevo, esto hace que se obtenga un líquido acuoso
más limpio, que puede contener menos subproductos. Reduciendo el
número de subproductos se puede minimizar el número de etapas de
procesamiento necesarias para poder usar el líquido acuoso o para
poder obtener una alta actividad de fitasa deseada.
El organismo más preferido es Aspergillus
niger. También es preferible que la fitasa se exprese en un
microorganismo con una secuencia señal de glucoamilasa.
El líquido acuoso que contiene fitasa resultante
después se puede usar para diversos propósitos, aunque en este
documento se contempla específicamente su aplicación en piensos
para animales. Un segundo aspecto de la invención se refiere a este
líquido acuoso, tal como el que se puede preparar mediante un
proceso del primer aspecto, que comprende fitasa a una
concentración de al menos 14.000 FTU/g.
En la memoria descriptiva, una "fitasa" se
refiere no sólo a enzimas fitasas de origen natural, sino a
cualquier enzima que posea actividad fitasa, por ejemplo, la
capacidad de catalizar la reacción que implica la retirada o
liberación de fósforo inorgánico (fosfato) a partir de
myo-inositol fosfatos. Preferiblemente, la fitasa pertenecerá
a la clase EC 3.1.3.8. La propia fitasa es, preferiblemente, una
fitasa fúngica, tal como la proveniente de una especie de
Aspergillus o Trichoderma.
La invención también puede proporcionar procesos
para la preparación de formulaciones de fitasa en forma de
granulados que usan un polímero de carbohidrato comestible como
vehículo. El vehículo puede estar en forma de partículas o de polvo.
El líquido acuoso que contiene fitasa, tal como una solución o
suspensión, se puede mezclar con el vehículo sólido y se deja
absorber en el vehículo. Durante o después de la mezcla, el líquido
que contiene fitasa y el vehículo se procesan para dar un
granulado, que puede secarse posteriormente. El uso del vehículo de
carbohidrato puede permitir la absorción de grandes cantidades de
la composición (y por lo tanto de fitasa). La mezcla se puede usar
para formar una pasta plástica o una masa no elástica que se puede
procesar fácilmente en gránulos, por ejemplo, se puede extruir. De
manera conveniente, el vehículo no es fibroso, lo que permite una
nodulización más fácil: los materiales fibrosos pueden impedir la
nodulización por extrusión.
Hay numerosos documentos de la técnica anterior
que hacen referencia a nódulos que contienen diversos enzimas, pero
éstos encuentran utilidad como detergentes, a menudo en
composiciones de lavado. A diferencia de ello, la presente solicitud
encuentra utilidad en piensos para animales y, por esta razón, los
granulados de la invención son comestibles (por animales) y
preferiblemente también digeribles. Por lo tanto, no será
sorprendente que los granulados, los gránulos y las composiciones de
la invención carezcan de jabón, detergentes y lejía o agentes
blanqueadores, zeolitas, aglutinantes, cargas (TiO_{2}, caolín,
silicatos, talco, etc.) por mencionar algunos.
El polímero de carbohidrato comestible se debe
elegir de manera que sea comestible por el animal para el que está
destinado el pienso y, preferiblemente, también digerible. El
polímero preferiblemente comprende glucosa (por ejemplo, un polímero
que contiene glucosa) o unidades
(C_{6}H_{10}O_{5})_{n}. Preferiblemente, el polímero
de carbohidrato comprende unidades de
\alpha-D-glucopiranosa, amilosa
(un polímero lineal de (1 \rightarrow 4)
\alpha-D-glucano) y/o
amilopectina (un D-glucano ramificado con enlaces
\alpha-D-(1 \rightarrow 4) y
\alpha-D-(1 \rightarrow 6). El polímero de
carbohidrato preferido es el almidón. Otros polímeros que contienen
glucosa adecuados que se pueden usar en lugar de o además del
almidón incluyen \alpha-glucanos,
\beta-glucanos, pectina (tal como
proto-pectina) y glucógeno. También se contemplan
derivados de estos polímeros de carbohidrato, tales como éteres y/o
ésteres de los mismos, aunque a menudo se evita el almidón
gelatinizado. Convenientemente, el polímero de carbohidrato es
insoluble en agua.
En los ejemplos descritos en este documento, se
usa almidón de maíz, patata y arroz. Sin embargo, es igualmente
aplicable el almidón obtenido de otras fuentes (por ejemplo, de
plantas tales como hortalizas o cultivos) tales como tapioca,
mandioca, trigo, maíz, sagú, centeno, avena, cebada, ñame, sorgo o
arruruz. De manera similar, en la invención se puede usar tanto
almidón nativo como almidón modificado (por ejemplo, dextrina).
Preferiblemente, el carbohidrato (por ejemplo, almidón) contiene
poca o ninguna proteína, por ejemplo, menos de un 5% (p/p), tal como
menos de un 2% (p/p), preferiblemente menos de un 1% (p/p).
Al menos el 15% (p/p) del vehículo sólido puede
estar constituido por el polímero de carbohidrato (tal como
almidón). Preferiblemente, sin embargo, al menos el 30% (p/p) del
vehículo sólido está constituido por el carbohidrato, óptimamente al
menos el 40% (p/p). Ventajosamente, el componente principal del
vehículo sólido es el carbohidrato (por ejemplo, almidón), por
ejemplo más del 50% (p/p), preferiblemente al menos el 60% (p/p),
convenientemente al menos el 70% (p/p) y óptimamente al menos el
80% (p/p). Estos porcentajes en peso se basan en el peso total de
los componentes no-enzimáticos en el granulado seco
final.
La cantidad de líquido que contiene fitasa que se
puede absorber en el vehículo normalmente está limitada por la
cantidad de agua que se puede absorber. En el caso del almidón
natural granular, esto puede variar entre un 25 y un 30% (p/p), sin
usar temperaturas elevadas (que hacen que el almidón se hinche). En
la práctica, el porcentaje de líquido enzimático a añadir al
carbohidrato a menudo será mucho mayor que esto, porque el líquido
que contiene enzima normalmente contiene una cantidad significativa
de sólidos. La solución de fitasa puede contener aproximadamente un
25% (p/p) de sólidos, como resultado de lo cual el carbohidrato (por
ejemplo, almidón) y la solución de fitasa se pueden mezclar en una
proporción de carbohidrato:solución de fitasa de 0,5:1 a 2:1, por
ejemplo, de 1,2:1 a 1,6:1, tal como una proporción de
aproximadamente 60% (p/p):40% (p/p), respectivamente.
Preferiblemente, la cantidad de líquido añadido al vehículo sólido
es tal que (substancialmente) toda el agua en el líquido (acuoso)
se absorbe por el carbohidrato presente en el vehículo sólido.
A temperaturas elevadas, el almidón y otros
polímeros de carbohidrato pueden absorber cantidades mucho mayores
de agua hinchándose. Por esta razón, el polímero de carbohidrato
deseablemente puede absorber agua (o líquidos acuosos que contienen
enzima). Por ejemplo, el almidón de maíz puede absorber hasta tres
veces su peso de agua a 60ºC y hasta diez veces a 70ºC. De esta
manera, en la presente invención se contempla el uso de mayores
temperaturas para absorber una mayor cantidad de líquido que
contiene enzima y, de hecho, es preferible especialmente cuando se
trata con enzimas fitasas termoestables. Por lo tanto, para estos
enzimas, la mezcla del vehículo sólido y el líquido se puede
realizar a temperaturas elevadas (por ejemplo, por encima de la
temperatura ambiente), tal como por encima de 30ºC, preferiblemente
por encima de 40ºC y óptimamente por encima de 50ºC. Como
alternativa o además, el líquido puede proporcionarse a esta
temperatura.
Sin embargo, en general, se prefieren condiciones
sin hinchamiento a menores temperaturas (por ejemplo, a temperatura
ambiente) para minimizar la pérdida de actividad que surge de la
inestabilidad de fitasas (termosensibles) a mayores temperaturas.
Convenientemente, la temperatura durante la mezcla del enzima y el
líquido es de 20 a
25ºC.
25ºC.
El proceso mecánico usado en la presente
invención para preparar la mezcla del líquido que contiene fitasa y
el vehículo sólido en gránulos (en otras palabras, la nodulización)
puede emplear técnicas conocidas usadas frecuentemente en procesos
de formulación de alimentos, piensos y enzimas. Este proceso puede
comprender expansión, extrusión, esferonización, nodulización,
granulación de alta cizalla, granulación en tambor, aglomeración en
lecho fluido o una combinación de los mismos. Estos procesos
normalmente se caracterizan por una entrada de energía mecánica, tal
como la transmisión de un tornillo, la rotación de un mecanismo de
mezcla, la presión de un mecanismo de rodillos de un aparato de
nodulización, el movimiento de las partículas por una placa inferior
rotatoria de un aglomerador de lecho fluido o el movimiento de las
partículas mediante una corriente de gas, o una combinación de los
mismos. Estos procesos permiten que el vehículo sólido (por ejemplo,
en forma de un polvo) se mezcle con el líquido que contiene fitasa
(una solución o pasta acuosa) y de esta manera se granule
posteriormente.
En otra realización más de la invención, el
granulado (por ejemplo, un aglomerado) se forma por pulverización o
aplicación del líquido que contiene fitasa como un recubrimiento
sobre el vehículo, tal como en un aglomerador de lecho fluido. En
este caso, los gránulos resultantes pueden incluir un aglomerado
como el que se puede producir en un aglomerador de lecho fluido.
Preferiblemente, la mezcla del líquido que
contiene fitasa y el vehículo sólido comprende adicionalmente un
amasado de la mezcla. Esto puede mejorar la plasticidad de la
mezcla para facilitar la granulación (por ejemplo, extrusión).
Si el granulado se forma por extrusión, ésta se
realiza preferiblemente a baja presión. Esto puede ofrecer la
ventaja de que la temperatura de la mezcla a extruir no aumente o
lo haga sólo ligeramente. La extrusión a baja presión incluye, por
ejemplo, la extrusión en una cesta Fuji Paudal o un extrusor
abovedado. Preferiblemente, la extrusión no provoca que la
temperatura del material a extruir se eleve por encima de 40ºC. La
extrusión puede producir gránulos de manera natural (los gránulos
se pueden romper después de pasar a través de un troquel) o se puede
usar un instrumento de corte.
Convenientemente, los gránulos tendrán un
contenido de agua del 30 al 40%, tal como del 33 al 37%. El
contenido enzimático es convenientemente del 3 al 10%, por ejemplo,
del 5 al 9%.
Los gránulos obtenidos se pueden someter a un
acabado (esferonización) tal como en un esferonizador, por ejemplo,
una máquina MARUMERISER^{TM} y/o a compactación. Los gránulos se
pueden esferonizar antes de secarse, ya que esto puede reducir la
formación de polvo en el granulado final y/o puede facilitar
cualquier recubrimiento del granulado.
Después, los gránulos se pueden secar, tal como
en una secadora de lecho fluido o, en el caso de aglomeración en
lecho fluido, se pueden secar inmediatamente (en el aglomerador)
para obtener granulados (sólidos secos). La persona especialista
puede usar otros métodos conocidos para secar gránulos en la
industria alimentaria, de piensos o enzimas. Convenientemente, el
granulado es fluido.
El secado tiene lugar, preferiblemente, a una
temperatura de 25 a 60ºC, tal como de 30 a 50ºC. En este caso, el
secado puede durar de 10 minutos a varias horas, tal como de 15 a
30 minutos. El período de tiempo necesario dependerá, por supuesto,
de la cantidad de gránulos a secar, aunque como orientación esto es
de 1 a 2 segundos por kg de gránulos.
Después de secar los gránulos, el granulado
resultante preferiblemente tiene un contenido de agua del 3 al 10%,
tal como del 5 al 9%.
Se puede aplicar un recubrimiento al granulado
para proporcionar características o propiedades adicionales (por
ejemplo, preferidas) tales como un bajo contenido de polvo, color,
protección del enzima del ambiente que le rodea, diferentes
actividades enzimáticas en un granulado o una combinación de los
mismos. Los gránulos se pueden recubrir con una grasa, cera,
polímero, sal, pomada y/o ungüento o con un recubrimiento (por
ejemplo, líquido) que contiene un (segundo) enzima o una
combinación de los mismos. Será evidente que, si se desea, se pueden
aplicar varias capas de recubrimientos (diferentes). Para aplicar
el (los) recubrimiento(s) sobre los granulados, se dispone
de varios métodos conocidos que incluyen el uso de un lecho
fluidizado, un granulador de alta cizalla, un mezclador granulador
o un mezclador Nauta.
En otras realizaciones se pueden incorporar
ingredientes adicionales al granulado, por ejemplo, como adyuvantes
del procesamiento, para mejorar adicionalmente la estabilidad de
nodulización y/o la estabilidad de almacenamiento del granulado. A
continuación se analizan varios de tales aditivos preferidos.
Se pueden incluir sales en el granulado (por
ejemplo, con el vehículo sólido o líquido). Preferiblemente (como
se sugiere en el documento
EP-A-0.758.018), se puede(n)
añadir sal(es) inorgánica(s), lo cual puede mejorar la
estabilidad durante el procesamiento y el almacenamiento de la
preparación de fitasa seca. Las sales inorgánicas preferidas
comprenden un catión divalente, tal como cinc, magnesio y calcio.
El sulfato es el anión más preferido.
Preferiblemente (como se sugiere en el documento
EP-A-0.758.018), se puede(n)
añadir sal(es) inorgánica(s), lo cual puede mejorar la
estabilidad del procesamiento y almacenamiento de la preparación de
enzima seca. Las sales inorgánicas preferidas son solubles en agua.
Pueden comprender un catión divalente, tal como cinc (en
particular), magnesio y calcio. El sulfato es el anión más
preferido, aunque se pueden usar otros aniones que produzcan
solubilidad en agua. Las sales se pueden añadir (por ejemplo, a la
mezcla) en forma sólida. Sin embargo, la(s) sal(es) se
puede(n) disolver en el agua o en el líquido que contiene
enzima antes de la mezcla con el vehículo sólido. Convenientemente,
la sal se proporciona en una cantidad que es al menos el 15% (p/p
con respecto al enzima), tal como al menos el 30%. Sin embargo, la
cantidad puede ser tan alta como al menos el 60% o incluso el 70%
(de nuevo, p/p con respecto al enzima). Estas cantidades pueden
aplicarse a los gránulos o al granulado. Por lo tanto, el granulado
puede comprender menos del 12% (p/p) de la sal, por ejemplo, del
2,5 al 7,5%, por ejemplo, del 4 al 6%.
Si la sal se proporciona en el agua, entonces
puede estar en una cantidad del 5 al 30% (p/p), tal como del 15 al
25%.
Se puede obtener una mejora adicional de la
estabilidad de nodulización incorporando compuestos hidrófobos,
formadores de gel o de disolución lenta (por ejemplo, en agua).
Estos se pueden proporcionar en una cantidad del 1 al 10%, tal como
del 2 al 8%, y preferiblemente del 4 al 6% en peso (con respecto al
peso de agua y de los ingredientes de vehículo sólido). Las
substancias adecuadas incluyen celulosas derivatizadas, tales como
HPMC
(hidroxi-propil-metil-celulosa),
CMC (carboxi-metil-celulosa), HEC
(hidroxi-etil-celulosa); alcoholes
polivinílicos (PVA); y/o aceites comestibles. Se pueden añadir
aceites comestibles, tales como aceite de soja o aceite de canola
(por ejemplo, a la mezcla a granular) como adyuvante de
procesamiento, aunque como regla, preferiblemente están ausentes
las substancias hidrófobas (por ejemplo, aceite de palma).
Preferiblemente, los gránulos tienen una
distribución de tamaños relativamente estrecha (por ejemplo, están
monodispersos). Esto puede facilitar una distribución homogénea de
la fitasa en los gránulos y/o el granulado enzimático en el pienso
para animales. El proceso de la invención tiende a producir
granulados con una distribución de tamaños estrecha. Sin embargo,
si es necesario, se puede incluir una etapa adicional en el proceso
para estrechar adicionalmente la distribución de tamaños de los
gránulos, tal como tamizado. La distribución de tamaños del
granulado está convenientemente entre 100 \mum y 2000 \mum,
preferiblemente entre 200 \mum y 1800 \mum y óptimamente entre
300 \mum y 1600 \mum. Los gránulos pueden tener forma irregular
(aunque preferiblemente regular), por ejemplo, aproximadamente
esférica.
En el pienso para animales, que incluye pienso
para mascotas, se pueden incluir otro(s) enzima(s)
apropiado(s). La función de estos enzimas a menudo es mejorar
la velocidad de conversión del pienso, por ejemplo, reduciendo la
viscosidad o reduciendo el efecto anti-nutricional
de ciertos compuestos alimentarios. También se pueden usar enzimas
alimentarios para otros fines, tales como para reducir la cantidad
de compuestos que son dañinos para el medio ambiente presentes en el
estiércol. Son enzimas preferidos para estos propósitos:
carbohidrasas, tales como enzimas amilolíticos y enzimas que
degradan la pared de las células vegetales, entre los que se
incluyen celulasas, tales como \beta-glucanasas,
hemicelulasas tales como xilanasas, o galactanasas; peptidasas,
galactosidasas, pectinasas, esterasas; proteasas, preferiblemente
con un pH óptimo neutro y/o ácido; y lipasas, preferiblemente
fosfolipasas tales como las fosfolipasas pancreáticas A2 de
mamíferos. Preferiblemente, el enzima no incluye enzimas que
degradan el almidón (por ejemplo, amilasas). En algunas
realizaciones se pueden excluir las proteasas, ya que pueden
provocar daños si se ingieren. Si el enzima es un enzima que degrada
la pared de la célula vegetal, por ejemplo una celulasa, y en
particular una hemicelulasa tal como xilanasa, entonces el
granulado final puede tener una actividad del enzima que varía de
3.000 a 100.000, preferiblemente de 5.000 a 80.000 y óptimamente de
8.000 a 70.000 EXU/g. Si el enzima es una celulasa, tal como
\beta-glucanasa, entonces el granulado final puede
tener una actividad enzimática de 500 a 15.000, preferiblemente de
1.000 a 10.000, y óptimamente de 1.500 a 7.000 BGU/g.
Los gránulos pueden comprender de un 5 a un 20,
por ejemplo, de un 7 a un 15% del (de los) enzima(s). El
enzima puede ser de origen natural o recombinante.
Por lo tanto, un proceso preferido de acuerdo con
la invención comprende:
- a.
- mezclar el líquido acuoso que contiene fitasa y el vehículo sólido que constituye al menos un 15% (p/p) o un polímero de carbohidrato comestible, por ejemplo, mezclando el vehículo sólido con un líquido acuoso que contiene enzima;
- b.
- opcionalmente amasar la mezcla resultante;
- c.
- granular, por ejemplo, mediante un proceso mecánico, la mezcla para obtener gránulos que contienen enzima, por ejemplo, usando un granulador o por extrusión;
- d.
- opcionalmente esferonizar los gránulos;
- e.
- secar los gránulos resultantes para obtener un granulado que contiene enzima.
Durante todo el proceso, es deseable mantener la
temperatura máxima a la que se expone(n) lo(s)
enzima(s) por debajo de 80ºC.
Los granulados de la invención son adecuados para
uso en la preparación de un pienso para animales. En su sentido más
amplio, este aspecto de la invención abarca un granulado que
comprende una fitasa y un polímero de carbohidrato comestible,
teniendo el granulado una actividad de al menos 6.000 FTU/g. En
tales procesos, los granulados se mezclan con substancias
alimentarias, como tales o como parte de una premezcla. Las
características de los granulados de acuerdo con la invención
permiten su uso como componentes de una mezcla que es adecuada como
pienso para animales, especialmente si la mezcla se trata con vapor
y posteriormente se granula. Los gránulos secos pueden ser visibles
o distinguibles en dichos nódulos.
De esta manera, un tercer aspecto de la presente
invención se refiere a un proceso para la preparación de pienso
para animales, o una premezcla o precursor de un pienso para
animales, comprendiendo el proceso mezclar una composición del
segundo aspecto con una o más substancias o ingredientes de pienso
para animales (por ejemplo, semillas). Esto después puede
esterilizarse, por ejemplo, sometiéndolo a tratamiento térmico. La
composición resultante después se procesa convenientemente en
nódulos.
Un cuarto aspecto de la invención se refiere a
una composición que comprende un granulado del segundo aspecto, que
es preferiblemente una composición alimentaria comestible tal como
un pienso para animales. Esta composición está preferiblemente en
forma de bolitas (puede haber 1-5, por ejemplo, de
2 a 4 gránulos secos en cada nódulo).
Convenientemente, la composición comprende de
0,05 a 2,0, tal como de 0,3 a 1,0, óptimamente de 0,4 a 0,6 FTU/g
de la fitasa. Puede estar presente una xilanasa en una cantidad de
0,5 a 50, por ejemplo de 1 a 40 EXU/g. Como alternativa o además,
puede estar presente una celulasa en una cantidad de 09,1 a 1,0,
por ejemplo, de 0,2 a 0,4 BGU/g.
La composición puede tener un contenido de agua
del 10 al 20%, por ejemplo, del 12 al 15%. La cantidad de
enzima(s) es convenientemente del 0,0005 al 0,0012%, tal
como al menos 5 ppm.
Un quinto aspecto se refiere a un proceso para
promover el crecimiento de un animal, comprendiendo el proceso
alimentar a un animal con una dieta que comprende una composición
del segundo aspecto o una composición del cuarto aspecto. De esta
manera, la dieta del animal puede incluir el propio granulado o el
granulado presente en un pienso.
Un sexto aspecto de la presente invención se
refiere al uso de composiciones en, o como un componente de, un
pienso para animales o para uso en una dieta para animales.
Un séptimo aspecto de la presente invención
también se refiere al uso de una composición que comprende al menos
un 15% (p/p) de un polímero de carbohidrato comestible como
vehículo para una fitasa para mejorar la estabilidad de
nodulización de la fitasa.
Los animales adecuados incluyen animales de
granja (cerdos, aves de corral, ganado), animales no rumiantes o
monogástricos (cerdos, aves, aves de corral, animales marinos tales
como peces), rumiantes (bovinos u ovinos, por ejemplo, vacas,
ovejas, cabras, ciervos, terneros, corderos). Las aves de corral
incluyen pollos, gallinas y pavos.
Las características preferidas y las
características de un aspecto de la invención son igualmente
aplicables a otros mutatis mutandis.
Los siguientes ejemplos se presentan solamente
para ilustrar la invención y no pretenden ni se deben interpretar
como limitantes.
Se realizaron preparaciones de esporas fúngicas
de Aspergillus niger siguiendo técnicas convencionales.
Las esporas y posteriormente las células se
transfirieron a través de una serie de fermentaciones discontinuas
en matraces Erlenmeyer a un fermentador de 10 l. Después del
crecimiento en cultivo discontinuo, el contenido de este fermentador
se usó como inóculo para una fermentación discontinua final de 500
litros.
Los medios usados contienen: 91 g/l de almidón de
maíz (productos químicos BDH); amonio 38 g/l de glucosa.H_{2}O;
0,6 g/l de MgSO_{4}.7H_{2}O; 0,6 g/l de KCl; 0,2 g/l de
FeSO_{4}.7H_{2}O y 12 g/l de KNO_{3}. El pH se mantuvo a 4,6
\pm 0,3 por titulación automática con NaOH 4 N o H_{2}SO_{4}
4 N.
Las células se dejaron crecer a 28ºC a una
concentración de oxígeno disuelto controlada automáticamente a una
saturación de aire del 25%. La producción de fitasa alcanzó un
nivel máximo de 5-10 U/ml después de 10 días de
fermentación.
La fermentación se repitió usando sulfato amónico
en lugar de almidón de maíz (para dar un contenido de nitrógeno
asimilable equivalente).
Se añaden 100 \mul de filtrado de caldo
(diluido cuando sea necesario) o de sobrenadante o 100 \mul de
agua desmineralizada como referencia a una mezcla de incubación que
tiene la siguiente composición:
- tampón acetato sódico 0,25 M, pH 5,5, o
- tampón glicina-HCl; pH 2,5
- ácido fítico 1 mM, sal sódica
- agua desmineralizada hasta 900 \mul
La mezcla resultante se incubó durante 30 minutos
a 37ºC. La reacción se detuvo añadiendo 1 ml de TCA (ácido
tricloroacético) al 10%. Una vez finalizada la reacción, se
añadieron 2 ml de reactivo (3,66 g de FeSO_{4}.7H_{2}O en 50 ml
de solución de molibdato amónico (2,5 g de
(NH_{4})_{6}Mo_{7}O_{24}.4H_{2}O y 8 ml de
H_{2}SO_{4}, diluido hasta 250 ml con agua
desmineralizada)).
La intensidad del color azul se midió
espectrofotométricamente a 750 nm. Las medidas son indicativas de
la cantidad de fosfato liberado en relación con una curva de
calibración de fosfato en el intervalo 0-1
mMol/l.
Para obtener la sobreexpresión de fitasa en A.
niger, se obtuvo un cassette de expresión en el que el gen de
la fitasa de A. ficuum estaba bajo el control del promotor
de la amiloglucosidasa (AG) de A. niger en combinación con
una secuencia señal. Para la secuencia líder más larga, la
secuencia del promotor de AG se fusionó con la secuencia que
codificaba fitasa que incluía la secuencia líder de fitasa que
estaba fusionada con el fragmento génico de fitasa que codificaba la
proteína madura (como referencia, véase el ejemplo 10 del documento
EP-A-0.420.358).
La cepa de A. niger CBS 513.88 (depositada
el 10 de octubre de 1988) se transformó con 10 \mug de fragmento
de ADN por procedimientos conocidos (por ejemplo, véase el ejemplo
9 del documento EP-A-0.420.358). Se
aislaron transformantes individuales de A. niger de cada
cassette de expresión, y las esporas se cultivaron por medio de
cultivo rayado en placas selectivas de
acetamida-agar. Se recogieron esporas de cada
transformante a partir de células cultivadas durante 3 días a 37ºC
en placas con agar y dextrosa de patata al 0,4% (Oxoid, Inglaterra).
La producción de fitasa se ensayó en matraces de agitación en las
siguientes condiciones:
Se inocularon aproximadamente 1 x 10^{8}
esporas en 100 ml de medio de pre-cultivo que
contenía (por litro): 1 g de KH_{2}PO_{4}; 30 g de maltosa; 5 g
de extracto de levadura; 10 g de hidrolizado de caseína; 0,5 g de
MgSO_{4}.7H_{2}O y 3 g de Tween 80. El pH se ajustó a 5,5.
Después de dejarse crecer durante una noche a
34ºC en un agitador rotatorio, se inoculó 1 ml del cultivo en
desarrollo en un cultivo principal de 100 ml que contenía (por
litro): 2 g de KH_{2}PO_{4}; 70 g de maltodextrina (maldex
MDO_{3}, Amylum); 12,5 g de extracto de levadura; 25 g de
hidrolizado de caseína; 2 g de K_{2}SO_{4}; 5 g de
MgSO_{4}.7H_{2}O; 0,03 g de ZnCl_{2}; 0,02 g de CaCl_{2};
0,05 g de MnSO_{4}.4H_{2}O y FeSO_{4}. El pH se ajustó a
5,6.
El micelio se desarrolló durante al menos 140
horas. La producción de fitasa se midió como se describe en el
ejemplo 2. La fermentación se repitió usando cantidades
equivalentes de glucosa y sulfato de amonio como fuentes de carbono
y nitrógeno. El caldo se filtró para dar un filtrado que se separó
de la biomasa. Usando el cassette de expresión PFYT3 (promotor de
AG/líder de fitasa), se obtuvo una actividad máxima de fitasa de 280
U/ml.
La purificación para obtener fitasa altamente
purificada se realizó como se indica a continuación:
1. Cromatografía de intercambio catiónico a pH
4,9
2. Cromatografía de intercambio catiónico a pH
3,8
3. Cromatografía de intercambio aniónico a pH
6,3
4. Ultrafiltración
1. El filtrado de fitasa se diluyó 20 veces con
agua y el pH se ajustó a 4,9. Este material se pasó a través de una
columna S Sepharose Fast Flow equilibrada con un tampón de ácido
cítrico 20 mM/NaOH pH 4,9. El material sin unir, junto con la
fitasa, se recogió y se usó para la siguiente etapa.
2. El material a pH 4,9 se llevó a pH 3,8 y la
fitasa se unió a una columna S Sepharose Fast Flow equilibrada con
tampón ácido cítrico 2 mM/NaOH pH 3,8. La fitasa se eluyó de la
columna con un tampón NaPO_{4} 20 mM, NaCl 50 mM, pH 7,6.
3. Las fracciones de fitasa combinadas de la
segunda etapa de intercambio catiónico se ajustaron a pH 6,3 y la
fitasa se unió a una columna S Sepharose Fast Flow equilibrada con
un tampón de KPO_{4} 10 mM, pH 6,3. La fitasa se eluyó usando un
gradiente de NaCl 1 M en el mismo tampón.
El producto final (con anión intercambiado) que
contenía 10 mg de proteína/ml se concentró diez veces por
ultrafiltración usando una Celda Agitada Amicon (módulo 2L) con una
membrana Kalle E35 a 3 bares (300 kPa).
La concentración final para la fitasa purificada
alcanzó 280-300 g/l (28-30%). Con
una actividad específica de 100 FTU/mg de proteína, esto dio como
resultado una actividad fitasa de 28.000-30.000
FTU/g.
Para demostrar que una mayor concentración de
enzima (en los gránulos preparados usando el líquido con fitasa de
alta actividad) proporciona una mayor estabilidad durante la
nodulización, se prepararon granulados con una concentración de
enzima creciente y se ensayó la estabilidad durante la nodulización
de estas muestras.
Muestra comparativa
A
Se preparó una mezcla mezclando y amasando un 73%
(p/p) de almidón de maíz, un 4% (p/p) de fitasa Ultra Filtrate de
baja concentración y un 23% (p/p) de agua. Esta mezcla se extruyó
usando un extrusor de cesta Nica E-220 para obtener
un extruido húmedo que se esferonizó en un Fuji Paudal
Marumeriser^{TM} durante 2 minutos para obtener partículas
redondas de un diámetro medio de 600 \mum. Estas partículas se
secaron posteriormente en un secador de lecho fluido Glatt GPCG 1.1.
La actividad final del granulado fue de 610 FTU/g.
Muestra comparativa
B
Se preparó una mezcla mezclando y amasando un 70%
(p/p) de almidón de maíz, un 17% (p/p) de fitasa Ultra Filtrate y
un 13% (p/p) de agua. Esta mezcla se extruyó usando un extrusor de
cesta Nica E-220 para obtener un extruido húmedo
que se esferonizó en un Fuji Paudal Marumeriser^{TM} durante 2
minutos para obtener partículas redondas de un diámetro medio de
600 \mum. Estas partículas se secaron posteriormente en un
secador de lecho fluido Glatt GPCG 1.1. La actividad final del
granulado fue de 4170 FTU/g.
Muestra
C
Se preparó una mezcla mezclando y amasando un 67%
(p/p) de almidón de maíz, un 30% (p/p) de la fitasa Ultra Filtrate
preparada en el ejemplo 4 (aunque diluida a 18.400 FTU/g) y un 3%
de agua. Esta mezcla se extruyó usando un extrusor de cesta Nica
E-220 para obtener un extruido húmedo que se
esferonizó en un Fuji Paudal Marumeriser^{TM} durante 2 minutos
para obtener partículas redondas de un diámetro medio de 600
\mum. Estas partículas se secaron posteriormente en un secador de
lecho fluido Glatt GPCG 1.1. La actividad final del granulado fue de
6830 FTU/g.
Los diferentes granulados con enzima se pusieron
posteriormente en un ensayo de nodulización y se compararon sus
estabilidades de nodulización. El ensayo de nodulización consiste
en mezclar los granulados de enzima con una premezcla del pienso a
1500, 320 y 200 ppm respectivamente. Estas mezclas se
pre-trataron por inyección de vapor para dar un
aumento de temperatura hasta los 75ºC, después de lo cual las
mezclas se nodulizaron en una máquina de nodulización para obtener
los nódulos de pienso a una temperatura de 82ºC, que posteriormente
se secaron. Este tipo de proceso es típico para la industria
alimentaria para obtener nódulos de pienso.
La tabla 1 resume los resultados de los ensayos
de nodulización. Es evidente que los dos gránulos con la mayor
concentración de enzima tenían una estabilidad de nodulización
mucho mayor.
Se añadieron 30 kg de almidón de patata y 2,5 de
aceite de soja en un mezclador/amasador y se mezclaron.
Posteriormente se añadió un ultra-filtrado de
fitasa proveniente de Aspergillus (16.849 FTU/g) que contenía
MgSO_{4}.7H_{2}O (se disolvieron 3,5 kg de MgSO_{4}.7H_{2}O
en 14 kg de ultra-filtrado). El producto se mezcló
minuciosamente en el amasador, y después se extruyó y se secó en un
secador de lecho fluido como en el ejemplo 1. Esto dio como
resultado un producto de 5870 FTU/g.
Se preparó una mezcla mezclando y amasando un 62%
(p/p) de almidón de arroz y un 38% (p/p) del mismo
ultra-filtrado de fitasa usado en el ejemplo 6. Esta
mezcla se extruyó usando el extrusor de cesta Fuji Paudal para
obtener un extruido húmedo que después se esferonizó en el
MARUMERISER^{TM} durante un minuto para obtener partículas
redondas con un diámetro medio de 785 \mum. Estas partículas se
secaron posteriormente en un secador de lecho fluido como en el
ejemplo 1. La actividad final del granulado fue de 7280 FTU/g.
Se obtuvo una preparación enzimática amasando una
mezcla de un 54% (p/p) de almidón de maíz, un 5% de HPMC
(hidroxi-propil-metil-celulosa)
y un 41% (p/p) del ultra-filtrado de fitasa usado
en el ejemplo 6. Esta mezcla se extruyó usando el extrusor de cesta
Fuji Paudal para obtener un extruido húmedo que después se
esferonizó en el MARUMERISER^{TM} durante un minuto para obtener
partículas redondas de un diámetro medio de 780 \mum. Estas
partículas se secaron posteriormente en un secador de lecho fluido
durante 20 minutos a una temperatura del lecho de 40ºC, y a una
temperatura de entrada de 75ºC. El granulado con enzima seco
obtenido de esta manera tuvo una actividad de 8470 FTU/g.
Se obtuvo una preparación enzimática mezclando y
amasando un 54% (p/p) de almidón de maíz, y un 5% (p/p) de HEC
(hidroxi-etil-celulosa) con un 41%
(p/p) del ultra-filtrado de fitasa usado en el
ejemplo 6. Esta mezcla se extruyó usando el extrusor de cesta Fuji
Paudal para obtener un extruido húmedo que se esferonizó en el
MARUMERISER^{TM} durante un minuto para obtener partículas
redondas de un diámetro medio de 780 \mum. Estas partículas se
secaron posteriormente en un secador de lecho fluido durante 20
minutos a una temperatura del lecho de 40ºC, y a una temperatura de
entrada de 75ºC. El granulado con enzima seco obtenido de esta
manera tuvo una actividad de 8410 FTU/g.
Se utilizó un ultrafiltrado de 18.000 FTU/g,
proveniente del ultrafiltrado del ejemplo 4, y se diluyó.
Muestras
La actividad de las 3 muestras preparadas fue de
610 (A, Comparativa); 4170 (B, Comparativa) y 6830 (C) FTU/g. Esto
dio tres piensos de actividad 1,153, 1,685 y 1,745 FTU/g,
respectivamente.
150 g de la primera muestra se mezclaron con 20
kg de pienso como se describe más adelante. Después de esto, la
premezcla se mezcló con 80 kg de pienso y se dividió en dos partes
para preparar pienso para dos ensayos a dos temperaturas diferentes.
La segunda mezcla fue de 153,6 g en 20 kg de pienso. Esta muestra
de 20.153,6 g se dividió en dos partes iguales de 10.076 kg. Cada
parte se mezcló después con 230 kg de pienso para obtener la harina
para los ensayos.
Para el tercer ensayo, se mezclaron 96 g de
granulado con 20 kg de pienso y se dividieron en dos partes de
10.048 g. Cada parte se mezcló después con 230 kg de pienso para
obtener la harina para los ensayos. La velocidad de nodulización fue
de 600 kg/h.
La mezcla de pienso constaba de:
| Maíz | 20,00% |
| Trigo | 30,00% |
| Semillas de soja (calentada) | 10,00% |
| Soja (harina gruesa 46,7/3,7) | 18,20% |
| Tapioca (65% almidón) | 6,97% |
| Harina animal (56,5/10,9) | 4,00% |
| Harina de pescado (70,6% re) | 1,00% |
| Harina de plumas, hidr. | 1,00% |
| Aceite de soja/aceite de maíz | 1,30% |
| Grasa animal | 4,00% |
| Premezcla vit./min. (maíz) | 1,00% |
| Carbonato cálcico | 0,85% |
| Fosfato monocálcico | 1,05% |
| Sal | 0,26% |
| L-lisina HCl | 0,16% |
| DL-metionina | 0,21% |
Después, se nodulizaron las tres mezclas. El
pienso se introdujo en un acondicionador donde se añadió vapor
directo a la harina. La temperatura alcanzó los 75ºC.
Posteriormente, la harina salió del nodulizador donde se empujó a
través de una placa de troquel con orificios de 5 mm y 65 mm de
espesor. La temperatura del pienso en este punto subió otros 4ºC
hasta 79ºC.
La actividad de los tres piensos fue 10,11 (A);
10,04 (B) y 9,81 (C).
Los resultados de este ensayo para actividad
residual fueron: 63 (A); 66 (B) y 72% (C) respectivamente para las
muestras originales de 610; 4170 y 6830 FTU/g. Esto demuestra que
incluso con actividades similares (B y C), la formulación con mayor
actividad (C; 6830 FTU/g, de la invención) dio una estabilidad
durante la nodulización mucho mayor. Esta fue un 6% mayor que para
la muestra B (comparativa), lo cual fue sorprendente, ya que sólo se
observó un aumento del 3% (de A a B) con un aumento muy grande en
la actividad (610 a 4170 FTU/g).
Claims (29)
1. Un proceso para la preparación de un líquido
acuoso que comprende una fitasa, comprendiendo el proceso:
(a) cultivar en un medio acuoso un microorganismo
del género Aspergillus o Trichoderma que tiene un gen
de fitasa heterólogo bajo el control de un promotor de glucoamilasa
(para Aspergillus) o celobiohidrolasa (para
Trichoderma), en condiciones que permiten la expresión
recombinante de la fitasa, comprendiendo el medio, como alimento
para el microorganismo, una fuente de carbono asimilable y una
fuente de nitrógeno asimilable que consta de iones amonio;
(b) filtrar el medio acuoso para retirar los
microorganismos para dar un filtrado acuoso; y
(c) someter el filtrado de (b) a ultrafiltración
para dar un líquido acuoso que tiene una concentración de fitasa de
al menos 14.000 FTU/g.
2. Un proceso de acuerdo con la reivindicación 1,
en el que el microorganismo es Aspergillus niger, Aspergillus
oryzae o Trichoderma reesei.
3. Un proceso de acuerdo con la reivindicación 1
ó 2, en el que el microorganismo no posee, o no expresa, un gen de
glucoamilasa (AG) y/o el microorganismo posee múltiples copias del
gen de fitasa y/o la fitasa se expresa en el microorganismo con una
secuencia señal de glucoamilasa.
4. Un proceso de acuerdo con cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, en el que el líquido acuoso carece
substancialmente de taka-amilasa y/o donde los
microorganismos han consumido substancialmente todas las fuentes de
carbono y nitrógeno presentes en el medio antes de la filtración en
(b).
5. Un proceso de acuerdo con cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, en el que el líquido acuoso carece de
las fuentes de carbono y/o nitrógeno.
6. Un proceso de acuerdo con cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, en el que ni el filtrado acuoso ni el
líquido acuoso se someten a una etapa de cristalización y/o de
eliminación del color.
7. Un proceso de acuerdo con cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, en el que el líquido acuoso resultante
tiene una actividad fitasa de 18.000 FTU/g o mayor.
8. Un líquido acuoso que se puede preparar por un
proceso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones
anteriores, que comprende una fitasa a una concentración de al
menos 14.000 FTU/g.
9. Un líquido acuoso de acuerdo con la
reivindicación 8 que proviene de un medio de cultivo en el que se
expresó la fitasa.
10. Un proceso para la preparación de un
granulado que contiene fitasa, adecuado para uso en un pienso para
animales, comprendiendo el proceso procesar un vehículo sólido que
comprende al menos un 15% (p/p) de un polímero de carbohidrato
comestible y un líquido acuoso de acuerdo con la reivindicación 8 ó
9 para obtener gránulos que contienen fitasa.
11. Un proceso de acuerdo con la reivindicación
10 que comprende mezclar el líquido acuoso y el vehículo, y amasar
la mezcla resultante y, opcionalmente, posteriormente secar los
gránulos.
12. Un proceso de acuerdo con la reivindicación
10 ó 11, comprendiendo el proceso:
- a)
- mezclar el líquido acuoso que contiene la fitasa con el vehículo sólido,
- b)
- procesar mecánicamente la mezcla obtenida en a) para obtener gránulos que contienen enzima; y
- c)
- secar los gránulos que contienen enzima obtenidos en b).
13. Un proceso de acuerdo con la reivindicación
12, comprendiendo el proceso extrusión, nodulización, granulación
de alta cizalla, expansión, aglomeración en lecho fluido o una
combinación de los mismos.
14. Un granulado que contiene fitasa que se puede
preparar mediante un proceso de acuerdo con cualquiera de las
reivindicaciones 10 a 13.
15. Un granulado que comprende gránulos secos
formados a partir de una fitasa y un vehículo sólido que comprende
al menos un 15% (p/p) de un polímero de carbohidrato
comestible.
16. Un granulado de acuerdo con la reivindicación
15, comprendiendo el granulado al menos un catión divalente y/o uno
o más compuestos hidrófobos, formadores de gel o insolubles en
agua.
17. Un granulado de acuerdo con la reivindicación
21, en el que el compuesto hidrófobo, formador de gel o insoluble
en agua comprende una celulosa derivatizada, alcohol polivinílico
(PVA) o un aceite comestible.
18. Un granulado de acuerdo con la reivindicación
17, en el que la celulosa derivatizada es
hidroxi-propil-metil-celulosa,
carboxi-metil-celulosa o
hidroxi-etil-celulosa y/o el aceite
comestible es aceite de soja o aceite de canola.
19. Un granulado de acuerdo con una cualquiera de
las reivindicaciones 15 a 18 que comprende además una
endo-xilanasa y/o \beta-glucanasa
y/o donde el vehículo comprende almidón.
20. Un granulado de acuerdo con cualquiera de las
reivindicaciones 15 a 19, en el que la fitasa es distinta de una
fitasa que tolera el calor (termoestable) y/o una fitasa fúngica,
proviniendo opcionalmente dicha fitasa fúngica de una especie
Aspergillus o Trichoderma.
21. Un proceso para la preparación de un pienso
para animales, una premezcla o precursor de un pienso para
animales, comprendiendo el proceso mezclar un granulado que
contiene fitasa como se ha definido en cualquiera de las
reivindicaciones 15 a 20 con una o más substancias o ingredientes de
pienso para animales.
22. Un proceso de acuerdo con la reivindicación
21, en el que la mezcla de substancia(s) de pienso y la
composición o granulado se trata con vapor, se noduliza y
opcionalmente se seca.
23. Una composición que comprende un granulado de
acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 15 a 20 y/o un
granulado que contiene fitasa con una actividad de al menos 6.000
FTU/g.
24. Una composición de acuerdo con la
reivindicación 31 que es una composición alimentaria comestible y/o
un pienso para animales.
25. Una composición de acuerdo con la
reivindicación 24 que comprende nódulos de una o más substancias o
ingredientes de pienso mezclados con un granulado de acuerdo con
cualquiera de las reivindicaciones 15 a 20.
26. Una composición de acuerdo con cualquiera de
las reivindicaciones 23 a 25 que es un pienso para animales o una
premezcla o precursor de un pienso para animales, que se puede
preparar por un proceso de acuerdo con la reivindicación 21 ó
22.
27. Un proceso para promover el crecimiento de un
animal, comprendiendo el proceso alimentar a un animal con una
dieta que comprende un granulado como se define en cualquiera de
las reivindicaciones 15 a 20 o una composición como se define en
cualquiera de las reivindicaciones 23 a 26.
28. Uso de un granulado como se define en
cualquiera de las reivindicaciones 19 a 27 como un componente de un
pienso para animales o para uso en una dieta animal no
terapéutica.
29. Uso de una composición que comprende al menos
un 15% (p/p) de un polímero de carbohidrato comestible como
vehículo para una fitasa para mejorar la estabilidad de la fitasa
durante la nodulización.
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