JP2001506504A - 乳酸の発酵生産および単離 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 乳酸産生細菌の栄養基質としてホエータンパク質が存在するか、または加えられる乳酸産生細菌による発酵槽中の糖含有発酵液からの乳酸の発酵法であって、タンパク質のアミノ酸への加水分解が糖の有機酸への発酵と同時に起こるように、発酵の間、少なくとも１種のプロテアーゼを発酵槽に加え、発酵により生じた乳酸を発酵液から単離する方法。好ましくは、乳酸アンモニウムの生成のためにアンモニアを加え、好ましくは、限外ろ過、イオン交換、通常の電気透析および二極性膜を用いる電気透析からなる方法によって乳酸を単離する。

Description

【発明の詳細な説明】 乳酸の発酵生産および単離 発明の分野 本発明は、乳酸の発酵生産および乳酸含有溶液から乳酸を単離する方法に関す る。 発明の背景 欧州特許第２３０．０２１号は、グルコースが連続的に乳酸エステルに発酵さ れ、その後、電気透析によって乳酸を溶液から抽出する方法であって、乳酸が生 成する速度と同じ速度で乳酸を取り除くことによって発酵槽（ファーメンター） 中のｐＨが制御され、発酵槽の内容物が電気透析ユニットを経て、再循環してい る方法を記載している。酵母抽出物および無機塩が栄養分として用いられる。該 系の欠点は、発酵槽液体中の細菌が電気透析膜に吸着し、電気透析ユニットにお いて電気耐性を増加させ、その結果、実質的に電気透析過程の電力消費を増加さ せることが知られている。 Boyavalら（Biotechnology Letters Vol．9，No.3，207-212，1987）は、第１ 段階においてバイオマスおよび乳酸の生産、第２段階において、限外ろ過による 細胞の分離および濃縮、第３段階において、電気透析による乳酸エステル濃縮お よび精製を包含する３段階の発酵法を用いる乳酸発酵のためのバイオリアクター を記載している。しかしながら、該系は、限外ろ過膜が詰まり、その結果、透過 流が徹底的に制限されるという欠点を示すことが報告されている。 米国特許第４，１１０，１７５号は、乳酸を包含する有機酸の一般的な電解浄 化法を記載している。該方法の改良型は、米国特許第５，００２，８８１号に記 載されており、該方法において乳酸は、グルコース含有培地の発酵によって乳酸 アンモニウムとして生成され、限外ろ過を用いて発酵液から乳酸アンモニウムを 分離することができ、限外ろ過器の保留液（retentate）は発酵槽に戻される。 該方法において、後の電気透析過程において細菌が膜に吸着することはなく、し たがって、電力消費量はより低い。該特許において使用される微生物は、乳酸菌 を用いる場合の乳酸発酵の維持に必要であることが知られる、酵母抽出物または コーンスティープリカーを含有するいずれかの特別の栄養培地を必要としない特 徴を有するバチルス・コアギュランス（Bacillus coagulans）である。電気透析 の前に、発酵槽液体を逆浸透（ＲＯ）によって濃縮し、その後、一操作で二極性 膜により乳酸アンモニウムから乳酸が生成する電気透析ユニットにおいて、濃縮 した液体を処理する。該操作において、同時に水酸化アンモニウムが生成し、乳 酸の中和のための培地として発酵槽に戻すことができる。しかしながら、該過程 において、アミノ酸を発酵細菌の栄養分として用いるので、比較的高コストであ るという欠点が生じる。さらなる欠点は、二極性膜を用いる電気透析処理に含ま れる濃縮のために用いるＲＯにより、該過程の効率を減少させる変換されない有 機物質（残余グルコースおよびアミノ酸）が生じることである。また、得られた 生産物は、乳酸中の残余糖の存在のため、熱安定性でないかもしれない。 ホエー中のラクトースの発酵におけるホエータンパク質からのアミノ酸の生成 および栄養分としてのホエータンパク質の使用は、米国特許第４，６９８，３０ ３号に記載されている。しかしながら、米国特許第４，６９８，３０３号は、ホ エータンパク質からのアミノ酸の生成のために、加水分解が別個の酸性酵素的過 程として行われ、その後、該加水分解産物を栄養分として膜発酵槽に与える、独 立した加水分解を必要とするという欠点を有する。 発明の簡単な説明 本発明の目的は、上記の先行技術の方法の欠点を排除するために、乳酸を簡単 かつ安価な方法で生産および単離できる方法を提供することにある。 よって、本発明の１の態様は、乳酸産生細菌の栄養基質としてホエータンパク 質が存在するかまたは加えられる乳酸産生細菌による発酵槽中の糖含有発酵液か らの乳酸の発酵法であって、タンパク質のアミノ酸への加水分解が糖の有機酸へ の発酵と同時に行われるように、発酵の間、少なくとも１種類のタンパク質加水 分解酵素を発酵槽に加えること、および発酵により生じた乳酸を単離することか らなる方法に関する。 本発明の別の態様は、乳酸含有発酵液から乳酸を単離する方法に関する。 発明の詳細な記載 本発明によると、糖含有溶液およびホエータンパク質、例えば、ホエータンパ ク質濃縮液の製造により生じたホエー透過液、ならびにタンパク質加水分解酵素 （以後、プロテアーゼという）の混合物を含む滅菌増殖培地を、乳酸を生産する 細菌培養物による発酵槽中において連続発酵に付す。 本発明によって使用される糖含有溶液中の「糖」なる語は、いずれかの乳酸発 酵に適する糖、例えば、グルコース、フルクトースまたはガラクトースのような 単糖類、スクロース、マルトース、セロビオースまたはラクトースのような二糖 類、あるいは多糖類である。異なる糖の混合物も、もちろん使用できる。糖は、 適当には、例えば、ホエー透過液から由来のものであってもよいが、また、いず れか他の供給源から由来のものであってもよい。 好ましい具体例において、発酵液のｐＨは、乳酸と水溶性の塩を形成するアン モニアを典型的にはアンモニアガスの形態で加えることによって、約ｐＨ５−７ の範囲内で実質上、一定に維持される。他の塩基、例えば、ＮａＯＨ、Ｃａ（Ｏ Ｈ）₂またはＣａＣＯ₃によって所望のｐＨを維持できるが、これは、いくつかの 理由で、なかでも、カルシウムイオンは発酵液において望ましくないこと、およ びアンモニアはＮａＯＨのような塩基よりもより安価であることにより、あまり 好ましくない。さらに、塩基としてのアンモニアの使用は、乳酸菌に窒素源を提 供するという利点があり、それは、例えばＮａＯＨと比較して、細菌の増殖を改 善する結果になることが見出された。 別の好ましい具体例において、発酵液を、細菌培養物および非加水分解ホエー タンパク質を含有する保留液（retentate）を保持し、発酵過程において形成さ れる乳酸を包含する溶解物質を通過させる限外ろ過過程に付す。乳酸は、例えば 、上記のように塩基としてアンモニアを加える場合、乳酸アンモニウムの形態で あってもよい。 次いで、限外ろ過過程の透過液を好ましくは、透過液中に存在するカルシウム およびマグネシウムイオンならびに可能な鉄イオンをナトリウムイオンと交換す るために、好ましくは、主に二価のイオンを結合するキレート樹脂を利用するイ オン交換ユニットにおいて処理し、それにより、さもなければ、後の透過液の電 気透析処理において、膜のゆっくりとした不可逆性のスケーリング（scaling） を導くかもしれない塩、例えば、リン酸カルシウムのようなカルシウム塩の沈殿 を防止する。さらに、鉄イオンの除去により、無色の最終的な乳酸生産物を生じ る。 次いで、イオン交換操作から得られた溶出液を好ましくは、電気透析法、好ま しくは、第１工程で通常型の電気透析膜を使用する２工程電気透析法において濃 縮する。 その後、濃縮液を好ましくは、二極性膜が形成された塩を乳酸、無機酸および 水酸化アンモニウム溶液に分離する第２の電気透析過程に付す。米国特許第５， ００２，８８１号の記載と同様に、それにより、乳酸アンモニウムは、二つの分 離流、塩基性流および酸性流において水酸化アンモニウムおよび乳酸に変換され る。しかしながら、本発明における供給流は、二極性電気透析膜を汚染し得る有 機物質を含有しないので、本発明は単純な方法を示すものである。存在する無機 塩もまた、該工程において、水酸化物として塩基性流において陽イオンに、酸性 流において陰イオンに分離する。 該２工程電気透析法の利点は、第１の電気透析工程において除去される残余糖 およびアミノ酸のような有機成分が、後に、乳酸アンモニウムを乳酸に変換する 第２の（二極性）電気透析を妨害しないことである。 典型的には、水酸化アンモニウム含有溶液を設定値、例えば、ｐＨ約５．０− ７．０、好ましくは、約５．５−６．５、より好ましくは、約５．５−６．０の 範囲のｐＨにｐＨを調節する量で反応器へ戻す。酸性溶液を好ましくは、陽イオ ンを水素イオンと交換する強陽イオン交換体に導く。次いで、陽イオン交換操作 由来の溶出液を好ましくは、乳酸を吸着するＯＨ型の弱陰イオン交換体において 処理する。次いで、吸着された乳酸を、例えば、他の陰イオンは陰イオン交換カ ラムに保持されるが、乳酸および揮発性の脂肪性有機酸のみを濃縮された非常に 純粋な形態で溶出する０．５Ｍリン酸を用いて溶出する。 上記のイオン交換法の別法として、酸性溶液を第３の電気透析段階に付しても よい。この場合、酸性溶液のｐＨを例えば、ギ酸を用いて、約１．５〜約２．５ 、好ましくは、約２．０〜約２．２に調整して、無機酸から乳酸を分離する。該 強酸性溶液の電気透析により、乳酸を電荷した無機酸から分離し、大量のギ酸お よび少量の酢酸と共に希釈液（diluate）流中に収集することができる。 本発明による乳酸の単離方法は、好ましくは、上記の工程の組み合わせ、すな わち、限外ろ過、キレート樹脂を用いるイオン交換、第１の電気透析、第２の電 気透析、ならびに陽イオンおよび陰イオン交換または第３の電気透析を、好まし くは、その記載順序において含むが、所望または有益ならば、該方法における１ 以上の工程をある場合に削除してもよく、および／または該工程の順序をある場 合に変更してもよいことは、当業者には明らかであろう。 最終的に、乳酸を精製し、例えば、流下薄膜型多段真空蒸発器を用いて、所望 の濃度に濃縮する。乳酸の濃縮は、別法で、他の既知方法、例えば、いずれかの ギ酸および酢酸を水と一緒に蒸留除去する加圧蒸発器において行ってもよい。 本発明は、いずれかの適当なプロテアーゼによってアミノ酸に加水分解され得 るホエータンパク質を用いて、発酵の栄養分を提供する。多くのかかるプロテア ーゼは市販されており、その例は、デンマークのNovo Nordisk A/Sから入手で な乳酸産生細菌、または１種以上の乳酸菌の組み合わせ、例えば、エル・ヘルベ チカス（L．helveticus）、エル・デルブリュッキイ（L．delbruckii）、エル・ カセイ（L．casei）、エル・アシドフィラス（L．acidophilus）またはエル・ブ ルガリカス（L．bulgaricus）のようなラクトバチルス（Lactobacillus）属の細 菌を用いてもよい。ラクトバチルス種のような乳酸産生細菌を単独または別の微 生物と一緒に、例えば、ストレプトコッカス・サーモフィラス（Streptococcus thermophilus）との、例えば、コカルチャーとして使用してもよい。 エル・ヘルベチカスのような乳酸菌の異なる株の使用は、Ｌ（＋）、Ｌ（−） またはＤ（−）ならびにＬ（＋）／（−）およびＤ（−）の混合物の生成を可能 にする。以下において、「乳酸」なる語は、乳酸のこれらの型のいずれか１つま たはそれらの混合物を示すものである。 本発明によると、酵素を直接、発酵槽に加え、さらに、米国特許第４，６９８ ， ３０３号に記載の方法に必要なｐＨを低下させるような操作は要求されない。タ ンパク質分解酵素を直接、発酵槽に加える乳酸の生産方法は、今までに開示も示 唆もされなかったと考えられる。 タンパク質分解酵素を直接、いずれの有害な影響もなく、発酵槽に加えること が可能であるという本発明者による知見の結果として、発酵および加水分解を同 じ容器、すなわち、発酵槽において行うことができ、それにより、米国特許第４ ，６９８，３０３号において開示されたものと比較して、より簡単で安価な方法 を提供する。さらに、米国特許第４，６９８，３０３号に記載の方法の利点は、 本発明を用いる場合に維持される。特に、発酵槽に酵素を直接添加することによ る加水分解は、いずれかの実質的なタンパク質沈殿が起こる前にタンパク質がペ プチドおよびアミノ酸に加水分解されるほど速いので、タンパク質によって汚染 されることなく限外ろ過膜を発酵槽に連結することができる。 発酵槽への酵素の直接添加を用いることのさらなる利点は、非常に小さい孔サ イズ、例えば、約１０，０００ダルトン以下、好ましくはより小さいサイズを有 する限外ろ過器の使用を可能にすることである。よって、例えば、約５０００ダ ルトンのカットオフ値を有する限外ろ過器を用いて一定の大きさの流束を維持す ることができ、その結果、発酵槽に連結された限外ろ過器由来の透過液中の高分 子成分（主に、乳酸菌により生産された非加水分解タンパク質、ポリグルカンお よび他の多糖類）の含量が他の既知の系におけるよりも少量であるので、発酵産 物である乳酸の精製を単純化できる。最終的に、発酵に関連する限外ろ過の使用 は、添加された酵素が膜を通過できないので、該酵素は発酵槽に留まり、そのた め、酵素が作用する期間がより長くなり、他の乳酸発酵系と比較して、酵素の消 費量を実質的に節約できることを意味する。 本発明は、さらに、以下の限定しない実施例において説明されるであろう。 実施例 Ｋｏｃｈ Ｓ４−ＨＦＫ−１３１スパイラル型膜を用いる１００ｌの膜反応器 において、乳酸発酵を行った。限外ろ過膜のカットオフ値は５ＫＤであって、全 膜領域は７．３ｍ²であった。膜上の引入れ口および流出口圧は、各々、４．４ および２．９バールであった。 ９０ｌの水性増殖培地をスイート（sweet）ホエー、ホエータンパク質濃縮液 および付加栄養分を基礎として作成し、培地の組成は以下のようであった： 培地を７０℃に４５分間加熱し、発酵温度４５℃に冷却した。１８ｇの凍結乾 を加えた。発酵を嫌気性条件下で９時間、バッチ法で行った。次いで、連続発酵 を開始した。水性の供給培地は、ホエー透過液を基礎とし、以下の組成： を有した。 反応器中のｐＨをアンモニアガスで５．７５に調整した。 バイオマス濃度は、反応器内容物の連続的流出を経て、約７−８％に維持され た。該バイオマス濃度で、限外ろ過器の透過流束は発酵の間、一定であり、約１ ｌ／分（８．２ｌ／（ｍ²・時間））であった。連続発酵の３４日間、限外ろ過 器の適切な洗浄を行わなかった。 発酵槽中の希釈率（Ｄ）は、０．１５〜０．３時間^-1に変化させた。これは、 変換収率に影響を与えず、発酵の３４日間、９９．５％以上で一定であった。限 外ろ過透過液中の乳酸エステル濃度は、４．０％であって、Ｄ＝０．３時間^-1で の生産性は１２ｇ／（ｌ・時間）であった。 さらに、限外ろ過後の乳酸の単離を上記のように、すなわち、キレート樹脂を 用いるイオン交換、第１の電気透析、第２の電気透析ならびに陽イオンおよび陰 イオン交換の組み合わせを用いて行った。乳酸の全回収率は非常に高く、発酵槽 に加えられた糖の量に基づいて約８５−９０％であった。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，Ｌ Ｕ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ， ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，Ｍ Ｗ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ ，ＡＴ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ， ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＣＺ，ＤＥ，Ｄ Ｅ，ＤＫ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＩ，ＧＢ ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＧＷ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＳ， ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，Ｌ Ｒ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ， ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，Ｔ Ｍ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ ，ＺＷ

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．乳酸産生細菌の栄養基質としてホエータンパク質が存在するか、または加 えられる乳酸産生細菌による発酵槽中の糖含有発酵液からの乳酸の発酵法であっ て、タンパク質のアミノ酸への加水分解が糖の有機酸への発酵と同時に行われる ように、発酵の間、少なくとも１種のタンパク質加水分解酵素を発酵槽に加える こと、および発酵により生じた乳酸を単離することからなる方法。 ２．アンモニアの発酵液への添加によって、発酵液のｐＨが実質的に一定のレ ベルに維持され、それにより、発酵液中に乳酸アンモニウムが生成される請求項 １記載の方法。 ３．発酵液からの乳酸の単離が限外ろ過工程を含む請求項１または２記載の方 法。 ４．タンパク質加水分解酵素および非加水分解タンパク質のろ過器の通過を防 ぐカットオフ値を有するろ過器を用いて限外ろ過が行われる請求項３記載の方法 。 ５．ろ過器が約１０，０００ダルトン以下の、例えば、５０００ダルトンのカ ットオフ値を有する請求項４記載の方法。 ６．乳酸の単離がさらに、カルシウムおよびマグネシウムイオンを除去するた めのイオン交換工程を含む請求項３−５のいずれかに記載の方法。 ７．イオン交換工程が主として二価のイオンを結合するキレート樹脂を利用す る請求項６記載の方法。 ８．乳酸の単離がさらに、少なくとも１つの電気透析工程を含む請求項３−７ のいずれかに記載の方法。 ９．電気透析が通常型の電気透析膜を用いる第１の電気透析工程および二極性 膜を用いる第２の電気透析工程を包含する請求項８記載の方法。 １０．乳酸の単離がさらに、強陽イオン交換体を用いるイオン交換工程および 弱陰イオン交換体を用いるイオン交換工程を含む請求項３−９のいずれかに記載 の方法。 １１．乳酸の単離がさらに、乳酸含有溶液のｐＨが約１．５−２．５の範囲に 調整される第３の電気透析工程を含む請求項３−９のいずれかに記載の方法。 １２．発酵液が乳酸アンモニウムを含有し、乳酸が： 発酵液を限外ろ過工程に付して、乳酸アンモニウムを含有する実質的に高分子 を含まない透過液とし、 限外ろ過の生産物をキレート樹脂を用いるイオン交換に付して、カルシウムお よびマグネシウムイオンを除去し、 イオン交換の生産物を、通常型の電気透析膜を用いる第１の電気透析および二 極性膜を用いる第２の電気透析に付して、乳酸アンモニウムを乳酸および水酸化 アンモニウムに変換し、 第２の透析の乳酸含有生産物を、（１）強陽イオン交換体を用いるイオン交換 および弱陰イオン交換体を用いるイオン交換、または（２）乳酸含有溶液のｐＨ が約１．５−２．５の範囲に調整される第３の電気透析工程に付し、次いで、 得られた乳酸を所望の濃度に濃縮することによって単離される請求項１記載の 方法。 １３．乳酸アンモニウムを含有する溶液から乳酸を単離する方法であって： 乳酸アンモニウムを含有する実質的に高分子を含まない透過液を形成し、 該透過液をキレート樹脂を用いるイオン交換に付して、カルシウムおよびマグ ネシウムイオンを除去し、 イオン交換の生産物を、通常型の電気透析膜を用いる第１の電気透析および二 極性膜を用いる第２の電気透析に付して、乳酸アンモニウムを乳酸および水酸化 アンモニウムに変換し、 第２の電気透析の乳酸含有生産物を、（１）強陽イオン交換体を用いるイオン 交換および弱陰イオン交換体を用いるイオン交換、または（２）乳酸含有溶液の ｐＨが約１．５−２．５の範囲に調整される第３の電気透析工程に付し、次いで 、 得られた乳酸の濃度を所望の濃度に濃縮する工程からなる方法。