JPH06225782A - トレハロースの単離精製法 - Google Patents
トレハロースの単離精製法Info
- Publication number
- JPH06225782A JPH06225782A JP1561493A JP1561493A JPH06225782A JP H06225782 A JPH06225782 A JP H06225782A JP 1561493 A JP1561493 A JP 1561493A JP 1561493 A JP1561493 A JP 1561493A JP H06225782 A JPH06225782 A JP H06225782A
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- JP
- Japan
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- trehalose
- crystallization
- exchange resin
- crystals
- alcohol
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- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Saccharide Compounds (AREA)
Abstract
(57)【要約】
【目的】トレハロース含有発酵液から大量生産に適する
方法で、簡単に純度の高いトレハロース結晶が得られる
方法を提供する。 【構成】トレハロース含有発酵液からトレハロースを単
離精製するに際し、限外濾過膜処理した後に濃縮・晶析
せしめることを特徴とするトレハロースの単離精製法。
方法で、簡単に純度の高いトレハロース結晶が得られる
方法を提供する。 【構成】トレハロース含有発酵液からトレハロースを単
離精製するに際し、限外濾過膜処理した後に濃縮・晶析
せしめることを特徴とするトレハロースの単離精製法。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明はトレハロースの製造法に
関するものである。トレハロースは、医薬品及び食品分
野において、細胞活性保持剤、耐寒性剤、不凍性剤等と
しての利用が期待されている。
関するものである。トレハロースは、医薬品及び食品分
野において、細胞活性保持剤、耐寒性剤、不凍性剤等と
しての利用が期待されている。
【０００２】
【従来の技術】従来、トレハロースの製造法としては、
乾燥酵母等の天然物から抽出する方法、マルトース、シ
ュクロース等を酵素処理してトレハロースに変える方
法、微生物を培養してトレハロースを生成蓄積させる方
法等が知られている。
乾燥酵母等の天然物から抽出する方法、マルトース、シ
ュクロース等を酵素処理してトレハロースに変える方
法、微生物を培養してトレハロースを生成蓄積させる方
法等が知られている。
【０００３】トレハロースの分離方法としては、乾燥酵
母等からの抽出法、酵素法でトレハロースを生成させ精
製する方法、微生物培養によりトレハロースを生成し精
製する方法がある。乾燥酵母からの抽出法の場合には、
エーテル、アルコール抽出し、アルコールとアセトンを
用いて晶析を繰り返す方法(Ｓcience、61(1587)、570、
1925) 、酵母をＮＨ2ＳＯ4処理し、重金属のＨｇ、Ｆｅ
による沈澱後、濾液に多量の95％アルコールを添加して
晶析させる方法（Ｓcience、82(2131)、422、1935) 、
酵母よりアルコール抽出し、イオン交換樹脂（Ａmberli
te ＩＲ−100、ＩＲ−４Ｂ）でイオン性物質を除去して
から多量の95％アルコールを添加して晶析させる方法
（Ｊ.Ａm.Ｃhem.Ｓoc.,72、2059、1950）等が報告され
ている。これらの方法は精製工程が多段で操作が煩雑で
ありながら純度が低く収率も低いものであった。
母等からの抽出法、酵素法でトレハロースを生成させ精
製する方法、微生物培養によりトレハロースを生成し精
製する方法がある。乾燥酵母からの抽出法の場合には、
エーテル、アルコール抽出し、アルコールとアセトンを
用いて晶析を繰り返す方法(Ｓcience、61(1587)、570、
1925) 、酵母をＮＨ2ＳＯ4処理し、重金属のＨｇ、Ｆｅ
による沈澱後、濾液に多量の95％アルコールを添加して
晶析させる方法（Ｓcience、82(2131)、422、1935) 、
酵母よりアルコール抽出し、イオン交換樹脂（Ａmberli
te ＩＲ−100、ＩＲ−４Ｂ）でイオン性物質を除去して
から多量の95％アルコールを添加して晶析させる方法
（Ｊ.Ａm.Ｃhem.Ｓoc.,72、2059、1950）等が報告され
ている。これらの方法は精製工程が多段で操作が煩雑で
ありながら純度が低く収率も低いものであった。
【０００４】一方、酵素法については、マルトースをマ
ルトースホスホリラーゼ及びトレハロースホスホリラー
ゼで処理してトレハロースを生成させ、酵素反応液から
沈澱物を除去後アニオン交換樹脂で精製する方法が知ら
れている（特開昭58−216695号公報）。アニオン交換樹
脂処理で精製した糖液は、ホウ酸型陰イオン交換樹脂に
流してトレハロースを吸着させ、ホウ酸カリウム溶液で
溶離分画し、得られたトレハロース画分はカチオン型イ
オン交換樹脂で処理し、濃縮後低級アルコールを加えて
蒸留することによりホウ酸を除去し、アルコール晶析を
繰り返してトレハロース結晶を得ている。また、シュク
ロースに固定化したグルコシル・トランスフェラーゼを
作用させてパラチノースを生成させ、これを晶析分離し
た残りの糖液には副生物であるトレハロースが存在して
いる。この糖液をまず亜硫酸型と亜硫酸水素型の混床の
強塩基性陰イオン交換樹脂でクロマトグラフィー処理
し、次いでＣａ型の強酸性陽イオン交換樹脂でクロマト
グラフィー処理してトレハロースを分離する方法が知ら
れている（特開平４−131090号公報）。これらの方法は
いずれもクロマトグラフィーによる精製を行っているの
で大量生産法としては不向きであり、なおかつ純度も低
い。
ルトースホスホリラーゼ及びトレハロースホスホリラー
ゼで処理してトレハロースを生成させ、酵素反応液から
沈澱物を除去後アニオン交換樹脂で精製する方法が知ら
れている（特開昭58−216695号公報）。アニオン交換樹
脂処理で精製した糖液は、ホウ酸型陰イオン交換樹脂に
流してトレハロースを吸着させ、ホウ酸カリウム溶液で
溶離分画し、得られたトレハロース画分はカチオン型イ
オン交換樹脂で処理し、濃縮後低級アルコールを加えて
蒸留することによりホウ酸を除去し、アルコール晶析を
繰り返してトレハロース結晶を得ている。また、シュク
ロースに固定化したグルコシル・トランスフェラーゼを
作用させてパラチノースを生成させ、これを晶析分離し
た残りの糖液には副生物であるトレハロースが存在して
いる。この糖液をまず亜硫酸型と亜硫酸水素型の混床の
強塩基性陰イオン交換樹脂でクロマトグラフィー処理
し、次いでＣａ型の強酸性陽イオン交換樹脂でクロマト
グラフィー処理してトレハロースを分離する方法が知ら
れている（特開平４−131090号公報）。これらの方法は
いずれもクロマトグラフィーによる精製を行っているの
で大量生産法としては不向きであり、なおかつ純度も低
い。
【０００５】更に、微生物を培養してトレハロースを生
成させる方法の場合には、ノカルディア属のトレハロー
ス生産菌の培養液を除菌し、メタノール処理して不溶物
を除去した濾液からトレハロースを分離する方法が知ら
れている（特開昭50−154485号公報）。この方法におい
ては濾液を陰イオン交換樹脂及び陽イオン交換樹脂でそ
れぞれ２回づつ処理し、ゲル濾過を行い、活性炭カラム
に吸着溶離後エタノール晶析を繰り返してトレハロース
結晶を得ている。リゾクトニア属、スクレロチウム属等
の菌を培養して得た菌体を粉砕してトリクロロ酢酸水溶
液で抽出し、この抽出液からトレハロースを分離する方
法も知られている（特開平３−130084号公報）。抽出液
はまずクロロホルムとエーテルで処理して脂質及びトリ
クロロ酢酸を除去し、イオン交換樹脂を通した後蒸発乾
固させ、これをアセトニトリル等で溶解してシリカゲル
クロマトグラフィーでトレハロースを分離しうることが
示されている。また、培養後菌体を分離し、上清を濃縮
後Ｂio−Ｇel Ｐ−２でクロマトグラフィーを行い、得
られたトレハロース画分をＤowex 50で処理し、再度Ｂi
o−Ｇel Ｐ−２クロマトグラフィーで精製し、このトレ
ハロース画分を濃縮乾固してトレハロースの乾燥物を得
る方法も知られている（Ａgric．Ｂiol．Ｃhem., 52
(3)、867−868、1988）。これらの方法はいずれもクロ
マトグラフィーによる精製を行っているので大量生産に
は不向きであり、さらに精製工程数も多い。
成させる方法の場合には、ノカルディア属のトレハロー
ス生産菌の培養液を除菌し、メタノール処理して不溶物
を除去した濾液からトレハロースを分離する方法が知ら
れている（特開昭50−154485号公報）。この方法におい
ては濾液を陰イオン交換樹脂及び陽イオン交換樹脂でそ
れぞれ２回づつ処理し、ゲル濾過を行い、活性炭カラム
に吸着溶離後エタノール晶析を繰り返してトレハロース
結晶を得ている。リゾクトニア属、スクレロチウム属等
の菌を培養して得た菌体を粉砕してトリクロロ酢酸水溶
液で抽出し、この抽出液からトレハロースを分離する方
法も知られている（特開平３−130084号公報）。抽出液
はまずクロロホルムとエーテルで処理して脂質及びトリ
クロロ酢酸を除去し、イオン交換樹脂を通した後蒸発乾
固させ、これをアセトニトリル等で溶解してシリカゲル
クロマトグラフィーでトレハロースを分離しうることが
示されている。また、培養後菌体を分離し、上清を濃縮
後Ｂio−Ｇel Ｐ−２でクロマトグラフィーを行い、得
られたトレハロース画分をＤowex 50で処理し、再度Ｂi
o−Ｇel Ｐ−２クロマトグラフィーで精製し、このトレ
ハロース画分を濃縮乾固してトレハロースの乾燥物を得
る方法も知られている（Ａgric．Ｂiol．Ｃhem., 52
(3)、867−868、1988）。これらの方法はいずれもクロ
マトグラフィーによる精製を行っているので大量生産に
は不向きであり、さらに精製工程数も多い。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は上記の
問題点を解決して、トレハロース含有発酵液から大量生
産に適する方法で、簡単に純度の高いトレハロース結晶
が得られる方法を提供することである。
問題点を解決して、トレハロース含有発酵液から大量生
産に適する方法で、簡単に純度の高いトレハロース結晶
が得られる方法を提供することである。
【０００７】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、トレハロ
ース含有発酵液から工業的に大量生産可能な安価かつ効
率的なトレハロースを単離精製する方法を開発するため
に鋭意研究を重ねた結果、トレハロース含有発酵液から
トレハロースを単離精製するに際し、限外濾過膜処理し
た後に濃縮晶析せしめることによってトレハロースを簡
単に高純度かつ高収率で得られることを見出し、本発明
を完成するに至った。
ース含有発酵液から工業的に大量生産可能な安価かつ効
率的なトレハロースを単離精製する方法を開発するため
に鋭意研究を重ねた結果、トレハロース含有発酵液から
トレハロースを単離精製するに際し、限外濾過膜処理し
た後に濃縮晶析せしめることによってトレハロースを簡
単に高純度かつ高収率で得られることを見出し、本発明
を完成するに至った。
【０００８】本発明の適用されるトレハロース含有発酵
液の種類は問わないが、例えば、従来よりＬ−グルタミ
ン酸や各種アミノ酸の生産菌として知られているブレビ
バクテリウム属、コリネバクテリウム属、ミクロバクテ
リウム属、ノカルディア属、リゾクトニア属、スクレロ
チウム属またはアルスロバクター属に属する微生物をシ
ュクロースまたはマルトース等を主炭素源とする液体培
地で培養することにより得られた発酵液を挙げることが
できる。これらの属に属する微生物はトレハロース生産
能を有する微生物であればいずれの菌株でも使用できる
が、例示すると以下の菌株が挙げられる。
液の種類は問わないが、例えば、従来よりＬ−グルタミ
ン酸や各種アミノ酸の生産菌として知られているブレビ
バクテリウム属、コリネバクテリウム属、ミクロバクテ
リウム属、ノカルディア属、リゾクトニア属、スクレロ
チウム属またはアルスロバクター属に属する微生物をシ
ュクロースまたはマルトース等を主炭素源とする液体培
地で培養することにより得られた発酵液を挙げることが
できる。これらの属に属する微生物はトレハロース生産
能を有する微生物であればいずれの菌株でも使用できる
が、例示すると以下の菌株が挙げられる。
【０００９】ブレビバクテリウム・ラクトフェルメンタ
ム ＡＴＣＣ 13869 ブレビバクテリウム・フラバム ＡＴＣＣ 14067 ブレビバクテリウム・ティバリカタム ＡＴＣＣ 21642 コリネバクテリウム・グルタミカム ＡＴＣＣ 13032 コリネバクテリウム・アセトアシドフィラム ＡＴＣＣ
13870 コリネバクテリウム・リリウム ＡＴＣＣ 15990 アルスロバクター・シトレウス ＡＴＣＣ 11624 アルスロバクター・スルフレイス ＡＴＣＣ 15170 ミクロバクテリウム・アンモニアフィラム ＡＴＣＣ 1
5354 さらには、これらの菌株の変異処理等を施すことにより
トレハロース生産能を向上させた変異株も使用すること
ができる。
ム ＡＴＣＣ 13869 ブレビバクテリウム・フラバム ＡＴＣＣ 14067 ブレビバクテリウム・ティバリカタム ＡＴＣＣ 21642 コリネバクテリウム・グルタミカム ＡＴＣＣ 13032 コリネバクテリウム・アセトアシドフィラム ＡＴＣＣ
13870 コリネバクテリウム・リリウム ＡＴＣＣ 15990 アルスロバクター・シトレウス ＡＴＣＣ 11624 アルスロバクター・スルフレイス ＡＴＣＣ 15170 ミクロバクテリウム・アンモニアフィラム ＡＴＣＣ 1
5354 さらには、これらの菌株の変異処理等を施すことにより
トレハロース生産能を向上させた変異株も使用すること
ができる。
【００１０】培養は好気的条件下で行うのがよく、培養
温度は20〜45℃、培養液のｐＨは5.0〜10.0に制御する
のがよく、ｐＨの調整には無機あるいは有機の酸性もし
くはアルカリ性物質、さらには尿素、炭酸カルシウム、
アンモニアガス等を使用することができる。
温度は20〜45℃、培養液のｐＨは5.0〜10.0に制御する
のがよく、ｐＨの調整には無機あるいは有機の酸性もし
くはアルカリ性物質、さらには尿素、炭酸カルシウム、
アンモニアガス等を使用することができる。
【００１１】上記発酵液は必要により公知の遠心分離法
あるいは濾過法等により予め菌体を分離しておくことが
できる。
あるいは濾過法等により予め菌体を分離しておくことが
できる。
【００１２】菌体分離を中心に行う場合は、通常の遠心
分離操作でよく、菌体とともに可溶性蛋白質等の高分子
を除去する場合は、限外濾過膜による処理を付すことが
できる。遠心分離による処理に付した場合は、続いて、
あるいは、イオン交換樹脂による脱塩処理の後に限外濾
過膜による処理に付すことができる。
分離操作でよく、菌体とともに可溶性蛋白質等の高分子
を除去する場合は、限外濾過膜による処理を付すことが
できる。遠心分離による処理に付した場合は、続いて、
あるいは、イオン交換樹脂による脱塩処理の後に限外濾
過膜による処理に付すことができる。
【００１３】限外濾過膜は高分子、具体的には分子量約
1000以上、例えば2000以上の物質を除去できるものが適
用される。膜の材質はアセチルセルロースなどのセルロ
ース系のもののほか、ポリアミド、ポリエステル、ポリ
アクリロニトリル、ポリビニルアルコール、ポリカーボ
ネート、ポリエチレンさらには無機材料など多種多様の
ものが知られているがその種類を問わず使用できる。膜
形状は、平膜型、モジュール型等あるが、処理性能の点
からモジュール型が好ましい。
1000以上、例えば2000以上の物質を除去できるものが適
用される。膜の材質はアセチルセルロースなどのセルロ
ース系のもののほか、ポリアミド、ポリエステル、ポリ
アクリロニトリル、ポリビニルアルコール、ポリカーボ
ネート、ポリエチレンさらには無機材料など多種多様の
ものが知られているがその種類を問わず使用できる。膜
形状は、平膜型、モジュール型等あるが、処理性能の点
からモジュール型が好ましい。
【００１４】発酵液には培地成分として添加されあるい
は不純物として相当量の無機塩類が存在しその他各種イ
オン性物質も存在していて、これらが晶析の際に析出し
てくるのでトレハロースを晶析する前に脱塩しておくこ
とが好ましい。脱塩手段としてはイオン交換膜等を使用
してもよいが、遊離型の陽イオン交換樹脂と陰イオン交
換樹脂を組み合わせて行う方法が簡便である。陽イオン
交換樹脂と陰イオン交換樹脂は脱塩能力のあるものであ
ればその種類を問わず使用できる。このイオン交換樹脂
による脱塩処理は限外濾過膜により処理を行う前後のい
ずれに行ってもよい。
は不純物として相当量の無機塩類が存在しその他各種イ
オン性物質も存在していて、これらが晶析の際に析出し
てくるのでトレハロースを晶析する前に脱塩しておくこ
とが好ましい。脱塩手段としてはイオン交換膜等を使用
してもよいが、遊離型の陽イオン交換樹脂と陰イオン交
換樹脂を組み合わせて行う方法が簡便である。陽イオン
交換樹脂と陰イオン交換樹脂は脱塩能力のあるものであ
ればその種類を問わず使用できる。このイオン交換樹脂
による脱塩処理は限外濾過膜により処理を行う前後のい
ずれに行ってもよい。
【００１５】晶析に先立って溶液を活性炭等で脱色処理
しておくことが好ましい。晶析はトレハロースの高純度
品を得る場合には水晶析法、晶析率を高めさらにスラリ
ー粘度を下げて操作性を良好にする点ではアルコール晶
析法がそれぞれ好ましいが、特に限定されるものではな
い。
しておくことが好ましい。晶析はトレハロースの高純度
品を得る場合には水晶析法、晶析率を高めさらにスラリ
ー粘度を下げて操作性を良好にする点ではアルコール晶
析法がそれぞれ好ましいが、特に限定されるものではな
い。
【００１６】水晶析法の場合には液温40〜80℃程度でト
レハロース濃度を70〜75ｇ／dl程度まで濃縮して微粉砕
したトレハロース２水和物結晶を接種して起晶を待つ。
その後更に濃縮してトレハロース濃度を85〜93ｇ／dl程
度とし、20〜５℃程度まで徐冷して結晶を成長させる。
この濃度で30分〜２時間程度放置して過飽和を解消さ
せ、固液分離後結晶を少量の水で水洗すればよい。これ
によりトレハロースの純度が99％以上の高純度を取得す
ることが可能である。
レハロース濃度を70〜75ｇ／dl程度まで濃縮して微粉砕
したトレハロース２水和物結晶を接種して起晶を待つ。
その後更に濃縮してトレハロース濃度を85〜93ｇ／dl程
度とし、20〜５℃程度まで徐冷して結晶を成長させる。
この濃度で30分〜２時間程度放置して過飽和を解消さ
せ、固液分離後結晶を少量の水で水洗すればよい。これ
によりトレハロースの純度が99％以上の高純度を取得す
ることが可能である。
【００１７】一方、アルコール晶析法の場合にはトレハ
ロース濃度を25〜60ｇ／dl程度まで濃縮し、次いで攪拌
しながらアルコールを沸点以下、好ましくは20〜50℃程
度で１〜10倍量程度、好ましくは２〜５倍量程度を徐々
に添加してトレハロース２水和物結晶を析出させる。そ
の際、途中でトレハロース２水和物結晶を接種すること
が好ましい。アルコールの種類はメタノール、エタノー
ル、プロパノール、イソプロパノール、ブタノール等の
低級アルコールがよく、エタノールが特に好ましい。ア
ルコール投入後は必要により５〜10℃程度まで冷却し、
30分〜２時間程度放置して過飽和を解消させる。次い
で、固液分離後結晶を必要により含水アルコール等で洗
浄すればよい。
ロース濃度を25〜60ｇ／dl程度まで濃縮し、次いで攪拌
しながらアルコールを沸点以下、好ましくは20〜50℃程
度で１〜10倍量程度、好ましくは２〜５倍量程度を徐々
に添加してトレハロース２水和物結晶を析出させる。そ
の際、途中でトレハロース２水和物結晶を接種すること
が好ましい。アルコールの種類はメタノール、エタノー
ル、プロパノール、イソプロパノール、ブタノール等の
低級アルコールがよく、エタノールが特に好ましい。ア
ルコール投入後は必要により５〜10℃程度まで冷却し、
30分〜２時間程度放置して過飽和を解消させる。次い
で、固液分離後結晶を必要により含水アルコール等で洗
浄すればよい。
【００１８】
【作用】本発明法を適用することによりトレハロース２
水和物結晶を容易に析出させ、結晶成長性も良好なとこ
ろから容易に高純度品を得ることができる。その理由
は、限外濾過膜処理によって晶析阻害物質を除去し、イ
オン交換樹脂処理によってイオン性物質さらにはその他
の有害物質を効率よく除去できるからである。特に、発
酵にＬ−グルタミン酸や各種アミノ酸の生産菌を用いた
場合には発酵液中に多量のＬ−グルタミン酸あるいはそ
の他のアミノ酸が副生するが、本発明法においてはこれ
らのアミノ酸はイオン交換樹脂膜処理で除かれるため、
これらによる純度低下の問題がない。
水和物結晶を容易に析出させ、結晶成長性も良好なとこ
ろから容易に高純度品を得ることができる。その理由
は、限外濾過膜処理によって晶析阻害物質を除去し、イ
オン交換樹脂処理によってイオン性物質さらにはその他
の有害物質を効率よく除去できるからである。特に、発
酵にＬ−グルタミン酸や各種アミノ酸の生産菌を用いた
場合には発酵液中に多量のＬ−グルタミン酸あるいはそ
の他のアミノ酸が副生するが、本発明法においてはこれ
らのアミノ酸はイオン交換樹脂膜処理で除かれるため、
これらによる純度低下の問題がない。
【００１９】
【実施例】次に、実施例により本発明をさらに詳細に説
明する。なお、トレハロースの定量は、高速液体クロマ
トグラフィー（使用カラム：山村化学研究所(株)製、Ｐ
Ａ−03−Ｓ−５）により行った。トレハロースの量は全
て２水和物の量で表示した。
明する。なお、トレハロースの定量は、高速液体クロマ
トグラフィー（使用カラム：山村化学研究所(株)製、Ｐ
Ａ−03−Ｓ−５）により行った。トレハロースの量は全
て２水和物の量で表示した。
【００２０】〔実施例１〕グルコース４％、尿素0.5
％、ＫＨ2ＰＯ4 0.1％、ＭgＳＯ4・７Ｈ2Ｏ 0.04％、サ
イアミン塩酸塩300μｇ／ｌ、ビオチン300μｇ／ｌ、大
豆分解濃縮液（全窒素として）0.1％、ＦeＳＯ4・７Ｈ2
Ｏ 0.001％、ＭnＳＯ4・４Ｈ2Ｏ 0.001％（ｐＨ6.5）か
ら成る液体培地を調製し、その20mlずつを500ml容振盪
フラスコに分注し、110℃，10分間加熱殺菌した。この
培地に予めブイヨン寒天斜面培地にて31.5℃、48時間培
養したコリネバクテリウム・リリウム ＡＴＣＣ 15990
を一白金耳接種し、往復振盪培養機により31.5℃で24時
間培養を行い、種培養液を調製した。
％、ＫＨ2ＰＯ4 0.1％、ＭgＳＯ4・７Ｈ2Ｏ 0.04％、サ
イアミン塩酸塩300μｇ／ｌ、ビオチン300μｇ／ｌ、大
豆分解濃縮液（全窒素として）0.1％、ＦeＳＯ4・７Ｈ2
Ｏ 0.001％、ＭnＳＯ4・４Ｈ2Ｏ 0.001％（ｐＨ6.5）か
ら成る液体培地を調製し、その20mlずつを500ml容振盪
フラスコに分注し、110℃，10分間加熱殺菌した。この
培地に予めブイヨン寒天斜面培地にて31.5℃、48時間培
養したコリネバクテリウム・リリウム ＡＴＣＣ 15990
を一白金耳接種し、往復振盪培養機により31.5℃で24時
間培養を行い、種培養液を調製した。
【００２１】シュクロース15％、ＫＨ2ＰＯ4 0.1％、Ｍ
gＳＯ4・７Ｈ2Ｏ 0.1％、サイアミン塩酸塩300μｇ／
ｌ、ビオチン300μｇ／ｌ、大豆分解濃縮液（全窒素と
して）0.05％、ＦeＳＯ4・７Ｈ2Ｏ 0.001％、ＭnＳＯ4
・４Ｈ2Ｏ 0.001％から成る培地（ｐＨ7.3）に塩化カリ
ウム、塩化アンモニウム等量混合物を２％添加した液体
培地を１ｌ容ジャーファーメンターに分注し、120℃，2
0分加熱殺菌後、上記種培養液15mlを接種し、31.5℃、
通気量１／２vvm、攪拌速度700rpmにて培養を開始し
た。培養中はアンモニアガスでｐＨ7.3に制御した。培
養開始後、培養液の26倍希釈液の562nmにおける濁度が
0.60に達した時点でポリオキシソルビタンモノパルミテ
ートを0.4％の濃度となるように添加してさらに培養を
続け、培養液中のシュクロースが消費された時点で培養
を終了した。
gＳＯ4・７Ｈ2Ｏ 0.1％、サイアミン塩酸塩300μｇ／
ｌ、ビオチン300μｇ／ｌ、大豆分解濃縮液（全窒素と
して）0.05％、ＦeＳＯ4・７Ｈ2Ｏ 0.001％、ＭnＳＯ4
・４Ｈ2Ｏ 0.001％から成る培地（ｐＨ7.3）に塩化カリ
ウム、塩化アンモニウム等量混合物を２％添加した液体
培地を１ｌ容ジャーファーメンターに分注し、120℃，2
0分加熱殺菌後、上記種培養液15mlを接種し、31.5℃、
通気量１／２vvm、攪拌速度700rpmにて培養を開始し
た。培養中はアンモニアガスでｐＨ7.3に制御した。培
養開始後、培養液の26倍希釈液の562nmにおける濁度が
0.60に達した時点でポリオキシソルビタンモノパルミテ
ートを0.4％の濃度となるように添加してさらに培養を
続け、培養液中のシュクロースが消費された時点で培養
を終了した。
【００２２】こうして得られたトレハロース88ｇ（トレ
ハロース・２水和物換算）を含む発酵ブロス（蛋白濃度
2.0％）2.2ｌを遠心分離機で菌体を除いた（ｐＨ7.
8）。
ハロース・２水和物換算）を含む発酵ブロス（蛋白濃度
2.0％）2.2ｌを遠心分離機で菌体を除いた（ｐＨ7.
8）。
【００２３】直列にした陽イオン交換樹脂ＳＫｌＢ Ｈ
型２ｌカラム（三菱化成(株)製）と陰イオン交換樹脂Ｗ
Ａ30 ＯＨ型５ｌカラム（三菱化成(株)製）に流速２ｌ
／Ｈrで除菌ブロスを通液し、脱塩処理液５ｌを得た。
該脱塩処理液を限外濾過膜ＳＩＰ−0013（分画分子量30
00、旭化成(株)製）を用いて透過し、透過液（蛋白濃度
0.01％以下）10ｌを得た。次いで、該透過液をトレハロ
ース35ｇ／dlまで濃縮し、トレハロース溶液中に攪拌し
ながら徐々に100％エチルアルコール900mlを加えて、途
中、トレハロース・２水和物の種晶を添加しつつ結晶化
し、５℃まで冷却した。得られた結晶を遠心分離機で分
離し、減圧乾燥機で40℃，15時間乾燥して、高純度のト
レハロース・２水和物結晶（純度95％、柱状晶、旋光度
〔α〕20（ＮaＤ線）＝＋178.9度）75ｇを得た。
型２ｌカラム（三菱化成(株)製）と陰イオン交換樹脂Ｗ
Ａ30 ＯＨ型５ｌカラム（三菱化成(株)製）に流速２ｌ
／Ｈrで除菌ブロスを通液し、脱塩処理液５ｌを得た。
該脱塩処理液を限外濾過膜ＳＩＰ−0013（分画分子量30
00、旭化成(株)製）を用いて透過し、透過液（蛋白濃度
0.01％以下）10ｌを得た。次いで、該透過液をトレハロ
ース35ｇ／dlまで濃縮し、トレハロース溶液中に攪拌し
ながら徐々に100％エチルアルコール900mlを加えて、途
中、トレハロース・２水和物の種晶を添加しつつ結晶化
し、５℃まで冷却した。得られた結晶を遠心分離機で分
離し、減圧乾燥機で40℃，15時間乾燥して、高純度のト
レハロース・２水和物結晶（純度95％、柱状晶、旋光度
〔α〕20（ＮaＤ線）＝＋178.9度）75ｇを得た。
【００２４】〔実施例２〕ブレビバクテリウム・ラクト
フェルメンタム ＡＴＣＣ 13869を用い実施例１と同様
にして得たトレハロース80ｇ（トレハロース・２水和物
換算）を含む発酵ブロス（蛋白濃度2.0％）2.2ｌを限外
濾過膜ＳＩＰ−0013（分画分子量3000、旭化成(株)製）
を用いて透過し、透過液（蛋白濃度0.01％）５ｌを得
た。次いで、除菌ブロスを、直列にした陽イオン交換樹
脂ＳＫｌＢ Ｈ型２ｌ（三菱化成(株)製）と陰イオン交
換樹脂ＷＡ30 ＯＨ型５ｌ（三菱化成(株)製）に流速２
ｌ／Ｈrで通液して、脱塩処理液10ｌを得た。次いで、
該透過液を、トレハロース35ｇ／dlまで濃縮し、トレハ
ロース溶液中に攪拌しながら徐々に100％エチルアルコ
ール900mlを加えて、途中、トレハロース・２水和物の
種晶を添加しつつ結晶化し、５℃まで冷却した。得られ
た結晶を遠心分離機で分離し、減圧乾燥機で40℃，15時
間乾燥後、高純度のトレハロース・２水和物結晶（純度
95％、柱状晶）75ｇを得た。
フェルメンタム ＡＴＣＣ 13869を用い実施例１と同様
にして得たトレハロース80ｇ（トレハロース・２水和物
換算）を含む発酵ブロス（蛋白濃度2.0％）2.2ｌを限外
濾過膜ＳＩＰ−0013（分画分子量3000、旭化成(株)製）
を用いて透過し、透過液（蛋白濃度0.01％）５ｌを得
た。次いで、除菌ブロスを、直列にした陽イオン交換樹
脂ＳＫｌＢ Ｈ型２ｌ（三菱化成(株)製）と陰イオン交
換樹脂ＷＡ30 ＯＨ型５ｌ（三菱化成(株)製）に流速２
ｌ／Ｈrで通液して、脱塩処理液10ｌを得た。次いで、
該透過液を、トレハロース35ｇ／dlまで濃縮し、トレハ
ロース溶液中に攪拌しながら徐々に100％エチルアルコ
ール900mlを加えて、途中、トレハロース・２水和物の
種晶を添加しつつ結晶化し、５℃まで冷却した。得られ
た結晶を遠心分離機で分離し、減圧乾燥機で40℃，15時
間乾燥後、高純度のトレハロース・２水和物結晶（純度
95％、柱状晶）75ｇを得た。
【００２５】〔比較例１〕実施例１のトレハロース4.4
ｇ（トレハロース・２水和物換算）を含む発酵ブロス
（蛋白濃度2.0％）110mlを実施例１と同様に遠心分離機
による除菌処理・イオン交換樹脂処理した後、限外濾過
膜処理工程を省略した以外は実施例１と同様に濃縮、晶
析を試みた。結晶はトレハロース・２水和物結晶として
得られた。該結晶は実施例１で取得した結晶と比較して
明らかに微細晶であり、しかも該微細晶は集合晶を形成
した。純度は90％、収量は3.3ｇで実施例１や実施例２
に比較して低かった。
ｇ（トレハロース・２水和物換算）を含む発酵ブロス
（蛋白濃度2.0％）110mlを実施例１と同様に遠心分離機
による除菌処理・イオン交換樹脂処理した後、限外濾過
膜処理工程を省略した以外は実施例１と同様に濃縮、晶
析を試みた。結晶はトレハロース・２水和物結晶として
得られた。該結晶は実施例１で取得した結晶と比較して
明らかに微細晶であり、しかも該微細晶は集合晶を形成
した。純度は90％、収量は3.3ｇで実施例１や実施例２
に比較して低かった。
【００２６】
【発明の効果】本発明の方法により、トレハロース含有
発酵液からトレハロース・２水和物結晶を大量生産に適
する方法で簡単に高純度で得ることができる。
発酵液からトレハロース・２水和物結晶を大量生産に適
する方法で簡単に高純度で得ることができる。
Claims (2)
- 【請求項１】 トレハロース含有発酵液からトレハロー
スを単離精製するに際し、限外濾過膜処理した後に濃縮
・晶析せしめることを特徴とするトレハロースの単離精
製法。 - 【請求項２】 トレハロース含有発酵液からトレハロー
スを単離精製するに際し、限外濾過膜処理及びイオン交
換樹脂処理した後に濃縮・晶析せしめることを特徴とす
るトレハロースの単離精製法。
Priority Applications (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP1561493A JPH06225782A (ja) | 1993-02-02 | 1993-02-02 | トレハロースの単離精製法 |
| BR9400368A BR9400368A (pt) | 1993-02-02 | 1994-01-27 | Processo para isolamento e purificação de trehalose |
| EP94101379A EP0609801A1 (en) | 1993-02-02 | 1994-01-31 | Method of isolation and purification of trehalose |
| US08/190,449 US5441644A (en) | 1993-02-02 | 1994-02-02 | Method of isolation and purification of trehalose |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP1561493A JPH06225782A (ja) | 1993-02-02 | 1993-02-02 | トレハロースの単離精製法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH06225782A true JPH06225782A (ja) | 1994-08-16 |
Family
ID=11893588
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP1561493A Pending JPH06225782A (ja) | 1993-02-02 | 1993-02-02 | トレハロースの単離精製法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH06225782A (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR100479240B1 (ko) * | 1996-12-10 | 2005-06-20 | 가부시끼가이샤 하야시바라 세이부쓰 가가꾸 겐꾸조 | 결정질당분말,그제조방법및용도 |
-
1993
- 1993-02-02 JP JP1561493A patent/JPH06225782A/ja active Pending
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR100479240B1 (ko) * | 1996-12-10 | 2005-06-20 | 가부시끼가이샤 하야시바라 세이부쓰 가가꾸 겐꾸조 | 결정질당분말,그제조방법및용도 |
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