NL8801516A

NL8801516A - Werkwijze voor de fermentatieve bereiding van organische zuren.

Info

Publication number: NL8801516A
Application number: NL8801516A
Authority: NL
Original assignee: Suiker Unie
Priority date: 1988-06-14
Filing date: 1988-06-14
Publication date: 1990-01-02
Also published as: EP0346983B1; EP0346983A2; ATE102653T1; DE68913595D1; US5002881A; DE68913595T2; JPH0327291A; EP0346983A3; ES2061940T3

Description

Werkwijze voor de fermentatieve bereiding van organische zuren.

De uitvinding heeft betrekking op een werkwijze voor de fermentatieve bereiding van de organische zuren: melkzuur azijnzuur citroenzuur propionzuur pyrodruivenzuur oxaalzuur fumaarzuur appelzuur -ketoglutaarzuur itaconzuur gluconzuur 2- ketogluconzuur 2,5-diketo-D-gluconzuur glucuronzuur mannonzuur galactonzuur arabonzuur xylonzuur kojizuur galluszuur us t i1aginzuur urocanzuur salicylzuur 3- ethylsalicylzuur muconzuur shikimizuur mevalonzuur boterzuur door in een reactievat een gesteriliseerd, voor dit doel gebruikelijk, groeimedium, continu te laten fermenteren door een cultuur van bacteriën, die de betreffende organische zuren vormen met een oplossing van XOH in water (waarbij X NH4 of een metaal is, waarvan het hydroxide en het zout van de bovenstaande organische zuren in water oplosbaar zijn) de pH van het reactiemengsel op 3 tot 9 te houden, het gefermenteerde reactiemengsel te onderwerpen aan een ultrafiltratie, het retentaat naar het reactievat te recirculeren, het permeaat te electrodialyseren, waarbij het gevormde zout in het overeenkomstige organische zuur en XOH ontleed wordt.

Uit Chem. Ing. Tech, 59, 952-954 (1987) is een werkwijze bekend voor de continue fermentatie van glucose voor de bereiding van melkzuur in een fermenteerinrichting en winning van het gevormde melkzuur door toepassing van electrodialyse. Bij deze bekende werkwijze wordt een stam van Lactobacillus casei als melkzuur vormend microorganisme gebruikt, die in een geconcentreerde oplossing van glucose, bij aanwezigheid van gistextract en anorganische zouten, glucose tot melkzuur fermenteert. Het fermentatiemedium wordt door een electrodialyse inrichting gerecirculeerd. Door meting van de pH in de fermentor wordt de stroomsterkte in de electrolyse-inrichting bestuurd, (zie Europese octrooiaanvrage 230021, kolom 3, regels 31-33: "Der Fermentor (2) kann mit einer pH-Elektrode ausgerüstet sein, durch die die Stromstarke in der Elektrodialyse-Einheit (4) gesteuert wird"). Hierdoor is het mogelijk het gevormde melkzuur met dezelfde snelheid uit de fermentatievloeistof te verwijderen als het in de fermentor gevormd wordt. Het is opmerkelijk dat ook zonder bijzondere maatregelen het systeem niet door vreemde microorganismen wordt besmet; dit schijnt overigens toegeschreven te kunnen worden aan het feit dat het electrodialyse systeem, besmettende microorganismen selectief inactiveert, doordat hun groeisnelheid in vergelijking met die van de melk-zuurvormende microorganismen te klein is.

Als nadelen van dit bekende systeem worden genoemd het verlies van ongeveer 7% van het geproduceerde melkzuur door diffusie door het kation uitwisselende membraan in de oplossing van zwavelzuur van de anode recirculatie. Een deel van dit melkzuur wordt geoxideerd tot pyrodruivenzuur én diffundeert naar het zuurkompartiraent zodat de produktstroom ca. 5,2 mg pyrodruivenzuur per gram melkzuur bevat.

Een ander nadeel betreft de toename in electrische weerstand, ten gevolge van de aanhechting van bacteriën aan het membraan, die na 30-100 h. zo groot kan zijn, dat de bereiding onderbroken moet worden. Dit nadeel kan opgelost worden door microfïltratie van de fermentatievloeistof, waarbij het retentaat met de biomassa naar de fermentor gerecirculeerd wordt, terwijl het permeaat geelectrodialyseerd wordt.

Reeds eerder was een poging om het zuiver fermentatieve deel van de melkzuurbereiding continu uit te voeren door E. Ohleyer, H.W. Blanch en C.R. Wilke "Continuous production of lactic acid in a cell recycle reactor" Applied Biochem. Biotechnol. 11, 317-332 (1985) op laboratoriumschaal uitgevoerd. Bij deze verbeterde werkwijze wordt de pH van de fermentatievloeistof met NH4OH op de gewenste waarde gehouden. Aangezien ammoniumlactaat in water oplosbaar is, kan het fermentatiemedium onderworpen worden aan een ultrafiltratie waarbij het retentaat met de biomassa weer naar het reactievat gerecirculeerd kan worden, terwijl het permeaat direct verkregen wordt. Door op deze manier te werk te gaan behoeft het volume van het reactievat slechts klein te zijn, omdat de volumetrische produktiesnelheid, die met een celrecycling behaald kan worden, groot is. Die grote snelheid is een gevolg van de hoge biomassaconcentratie in het reactievat en de grote doorvoersnelheid van het medium.

Verrassenderwijs werd gevonden, dat - een eenvoudige procesvoering mogelijk is doordat het cellrecycling systeem en de electrodialyse inrichting niet meer direkt met elkaar verbonden zijn - een efficiënte werking wordt verkregen doordat in de electrodialyse inrichting bij een hogere geleidbaarheid wordt gewerkt, waardoor ook minder membraanoppervlak nodig is - bij melkzuurbereiding het boven beschreven verlies aan melkzuur en de oxidatie van een deel van het melkzuur tot pyrodruivenzuur kan worden voorkomen, indien het bij de ultrafiltratie verkregen permeaat, eerst aan een concentreringstrap (reversed osmosis, RO) wordt onderworpen en het permeaat pas daarna in een drie-compartimenten cel aan een electrodialyse met bipolaire membranen wordt onderworpen.

Dergelijke bipolaire membranen bestaan uit een aantal lagen van speciaal geformuleerde selectief doorlatende membranen. Aan het grensvlak van de membranen worden watermolekulen ontleed in hydroxyl-ionen en waterstofionen, zoals is aangegeven in fig. 1

Water diffundeert vanuit de omgevende waterrijke oplossing in het membraan grensvlak. Onder invloed van electrische gelijkstroom vindt krachtige dissociatie van water in H+- en OH“-ionen plaats. De electrodialyse met bipolaire membranen maakt het mogelijk uit zouten van organische zuren de zuren te winnen en te concentreren zonder vreemde anionen in het systeem te brengen. Het bipolaire membraan verschaft derhalve bijvoorbeeld de mogelijkheid in een organisch zout Na+-ionen en/of K+-kationen te vervangen door H+-ionen. Bij een dergelijke vervanging van Na+ en/of K+ door H+-ionen ontstaat veelvuldig als bijprodukt NaOH en/of KOH.

Een "drie compartimenten cel" omvat drie zones die door afzonderlijke bipolaire membranen worden gescheiden.

In een dergelijke cel bevindt zich een bipolair membraan tussen de anode en een anion selectief monopolair membraan, voorts een bipolair membraan tussen de kathode en een kation selectief monopolair membraan, terwijl zich tussen de genoemde monopolaire membranen de zout toe- en afvoer bevindt.

De hydroxyl- en waterstofionen bewegen zich in tegenovergestelde richtingen door de bipolaire membranen. Aan de kation-seleetieve zijde van de bipolaire membranen verbinden zich de waterstofionen met het electronegatieve deel van opgeloste zouten onder vorming van zuren. Aan de anion-selectieve zijde verbinden de hydroxylionen zich met de electropositieve ionen onder vorming van basen.

Ionen migreren door de monopolaire membranen naar de zure en basische zones die zich dicht bij de bipolaire membranen bevinden.

In figuur 2 wordt de werking van een dergelijk drie compartimenten cel schematisch toegelicht.

Een dergelijke drie-compartimenten cel werkt in het algemeen met een potentiaal verschil van 1,5-2,5 V/cel en 700 tot 1000 k/τΡ membraan oppervlakte.

Het verkregen hittestabiele organische zuur heeft een concentratie van ongeveer 30 gew.%.

Extra voordelen zijn nog, dat bij de electrodialyse de fermenta-tievloeistof niet suikervrij behoeft te zijn, terwijl de base en de resterende groeistoffen gerecirculeerd kunnen worden, waardoor met name het loogverbruik zeer klein kan zijn.

Met betrekking tot de reversed osmosis inrichting wordt opgemerkt, dat daarin membranen worden toegepast van het type dat ook voor zeewater ontzouting wordt gebruikt, bijvoorbeeld polyamide of cellulose acetaat. De druk bij de reversed osmosis bedraagt 40 tot 60 bar.

Afgezien van het bovenstaande werd eveneens verrassenderwijs gevonden, dat de bij de fermentatieve bereiding van melkzuur toegepaste groeimedia geen gistextract en maisweekwater behoeven te bevatten indien in plaats van de algemeen gebruikelijke lactobacilli, bacillen van het geslacht Bacillus, in het bijzonder Bacillus coagu-lans als fermenterend microorganisme wordt gebruikt. Het geslacht Bacillus vertoont onafhankelijk van de groeisnelheid een lagere behoefte aan groeifactoren dan het geslacht Lactobacillus.

De werkwijze volgens de uitvinding wordt aan de hand van het proces-schema van fig. 3 toegelicht.

Door toevoerleiding 1 wordt continu het fermentatiemedium in het reactievat CSTR gebracht. De doorstroomsnelheid wordt bijvoorbeeld zo ingesteld dat het produkt dat door leiding 2 naar de ultrafiltratie inrichting UF wordt gevoed ongeveer 6 gew.% zout van het betreffende organische zuur bevat, wat in het geval van kaliumlactaat overeenkomt met 0,66 N melkzuurionen.

In de ultrafiltratie inrichting wordt het reaktiemedium gesplitst in retentaat dat door leiding 9 teruggevoerd wordt in CSTR en permeaat dat door leiding 3 in de reversed osmosis inrichting RO wordt geleid, waarin door de druk die op het permeaat wordt uitgeoefend, het in het permeaat aanwezige oplosmiddel tegen de osmotische druk in door een semi-permeabel membraan wordt geperst; door de filtrerende werking wordt enerzijds een meer geconcentreerd permeaat en anderzijds het oplosmiddel verkregen. De bovengenoemde melkzuur-ionen zouden bijvoorbeeld tot 1,32 N worden geconcentreerd. Alsdan stroomt door leiding 4 het geconcentreerde zout, door leiding 5 H2O naar de electrodialyse inrichting waarin het zout ontleed wordt in XOH en organisch zuur. Door leiding 5 gaat %0 terug in de toevoerleiding 1. In het bovenvermelde geval van melkzuur zou de concentratie dan tot 4 N toenemen; dit zou worden afgevoerd door leiding 6. Verdund zout van het organische zuur wordt door leiding 7 teruggeleid in de RO inrichting en XOH wordt door leiding 8 teruggeleid in CSTR.

Indien de concentratie van in stroom 7 opgehoopte grondstoffen te groot wordt, kan een deel van deze stroom door leiding 10, waarin een afsluiter is aangebracht, in de ^O-stroom van leiding 5 geleid worden.

Voorbeeld I

Onderstaand melkzuurproductie werd uitgevoerd met het in iig. 3 weergegeven systeem.

De CSTR werd gevuld met gesteriliseerd medium van de volgende samenstelling: 6 gew.% glucose 2.5 gew.% gistextract 0.05 gew.% CNH4)2S04 0.03 gew.% MgS04 0.02 gew.% KH2PO4 0.02 gew.% K2HPO4

De reactor had een werkvolume van 5 1 en werd geënt met 100 ml kuituur van Bacillus coagulans DSM 2311 welke in een schudkolf bij 45°C op voedingsbouillon was voorgekweekt. De fermentatie werd gedurende 24 uren onder aerobe omstandigheden ladingsgewijs uitgevoerd.

Vervolgens werd de continue anaërobe fermentatie gestart. Het Het produktiemedium had de volgende samenstelling: 6.6 gew.% glucose 0.1 gew.% gistextract 0.1 gew.% diammoniumfosfaat

De pH werd met ammoniumhydroxide ingesteld op 6,0. De temperatuur werd op 50°C ingesteld.

Als ultrafiltratie-eenheid werd een biopilot Carbosep PSV 3 R (SFEC) gebruikt met M6-membranen met een totale oppervlakte van 0.1 m2. Er werd gewerkt onder een druk van 2.2 bar bij de ingang en 1.8 bar bij de uitgang van de module. De RO was een tubulair systeem uitgerust met organische membranen type APO 99 (PCI) met een oppervlakte van 0,85 m^. Ër werd gewerkt bij een druk van 60 bar en 35°C.

De electrodialysestack bevatte 8 cellen (3 compartimenten) opgebouwd uit anionselectieve, kationselectieve en bipolaire membranen (Aquatech) met een totale oppervlakte van 0,10 m^. De toegepaste ’ spanning bedroeg 25 V bij een stroomsterkte van 100 mA/cm^.

De niet omgezette zoutoplossing uit de electrodialysestack werd naar de RO gerercirculeerd. Het in de electrodialysestack geproduceerde loog werd naar het loogvat getransporteerd en voor neutralisatie in de fermentor hergebruikt.

In steady state werden de volgende resultaten verkregen:

De lactaatconcentratie in de fennentor was 0,63 N. De volumetrische produktiviteit van de fermentor bedroeg 60 g/(lh) bij de toegepaste verdunningssnelheid van 1 h~*. De biomassaconcentratie was ca. 40 g/1 (drooggewicht). De opbrengst voor de omzetting van glucose naar melkzuur bedroeg 95%.

In de RO-module werd de ammoniumlactaatoplossing geconcentreerd tot 1,2 N. De produktstroom uit de ED-stack bedroeg 0,85 1/h en bevatte 36% melkzuur. Het electrisch rendement was 85%.

Voorbeeld II

Het experiment van voorbeeld I werd uitgevoerd met een gedefinieerd medium als produktiemedium met de volgende samenstelling: glucose : 6.6 gew.% diammoniumfosfaat: 0.2 gew.% KH2PO4 : 0.1 gew.% K2HPO4 : 0.1 gew.%

MgS04 : 0.1 gew.% biotine : 0.15 /ug/1 thiamine : 75 /ug/1 foliumzuur : 15 /ug/1 niacine : 1 mg/1 arginine : 5 mg/1 asparagine : 100 mg/1 cysteine : 3 mg/1 glutamine : 20 mg/1 histidine : 3 mg/1 methione : 10 mg/1 proline : 15 mg/1 serine : 20 mg/1

De condities waren verder gelijk aan die van voorbeeld I. De resultaten waren identiek aan voorbeeld I.

Voorbeeld III

Met de in voorbeeld I beschreven opstelling werd een produktie van het zuur 2-ketogluconzuur uitgevoerd.

De CSTR werd hiertoe gevuld met gesteriliseerd medium van de volgende samenstelling: 0,1 gew.% glucose 0,5 gew.% gistextract 0,5 gew.% bactopepton 0,1 gew.% K2HP04

De fermentor werd geënt met 100 ml cultuur van Serratia marces-cens NRLL B-486, welke in een schudkolf bij 28°C gedurende 24 h op bovenvermeld medium was voorgekweekt. Hierna werd onder aerobe condities verder gefermenteerd. Het produktiemedium had de volgende samenstelling: 7.2 gew.% glucose 0.5 gew.% gisthydrolysaat

De pH werd met een natriumhydroxideoplossing op 6,0 ingesteld. De temperatuur werd ingesteld op 29°C. De RO-condities waren als volgt: 45 bar en 38°C. De ED-stack (3 compartimenten) bestond uit 8 cellen met een totale oppervlakte van 0,10 m^. De spanning bedroeg 100 V bij een stroomsterkte van 30 mA/cm^.

In steady state werden de volgende resultatwn verkregen:

De ketogluconzuurconcentratie in de fermentor bedroeg 0,30 N. De volumetrische produktiviteit was ca. 60 g/(l.h) bij de töegepaste verdunningssnelheid van 1 h-·*·. De biomassaconcentratie was ca. 15 g/l (drooggewicht). De opbrengst voor de omzetting van glucose naar ketoglucosezuur bedroeg 83%.

In de K0-module werd het gluconaat geconcentreerd tot 0,57 N. De produktstroom uit de ED-stack bedroeg 1,20 1/h met een concentratie aan 2-ketogluconzuur van 25%. Het electrisch rendement bedroeg 85%.

Conclusies ...

Claims

1. Werkwijze voor de fermentatieve bereiding van de organische zuren melkzuur azijnzuur citroenzuur propionzuur pyrodruivenzuur oxaalzuur fumaarzuur appelzuur -ketoglutaarzuur itaconzuur gluconzuur 2- ketogluconzuur 2,5-diketo-D-gluconzuur glucuronzuur mannonzuur galactonzuur arabonzuur xylonzuur kojizuur galluszuur ustilaginzuur urocanzuur salicylzuur 3- ethylsalicylzuur muconzuur shikimizuur mevalonzuur boterzuur door in een reactievat een gesteriliseerd, voor dit doel gebruikelijk, groeimedium, continu te laten fermenteren door een cultuur van bacteriën, die het gewenste organische zuur kunnen vormen met een oplossing van XOH in water (waarbij X NH4 of een metaal is, waarvan het hydroxide en het zout van het organische zuur in water oplosbaar zijn) de pH van het reactiemengsel op 3 tot 9 te houden, het gefermenteerde reactiemengsel te onderwerpen aan een ultrafiltratie, het retentaat naar het reactievat te recirculeren, het permeaat te electrödialyseren, waarbij het zout van het organische zuur in het organische zuur en XOH, waarbij X de opgémelde betekenis heeft, ontleed wordt, met het kenmerk, dat men het bij de ultrafiltratie verkregen permeaat eerst aan een concentreringstrap (reversed osmosis RO) onderwerpt en het permeaat pas daarna in een drie-compartimenten cel aan een electrodialyse met bipolaire membranen onderwerpt.

2. Werkwijze volgens conclusie 1, m e t het kenmerk, dat men bij de bereiding van melkzuur als fermentatieve bacterie Bacillus coagulans gebruikt.

3. Werkwijze volgens conclusie 2,met het kenmerk, dat men voor het electrodialyseren van het lactaat een drie compartimenten cel gebruikt waarin zich een bipolair membraan bevindt tussen de anode en een anion-selectief monopolair membraan, voorts een bipolair membraan tussen de kathode en een. kation-selectief monopolair membraan aanwezig is, terwijl zich tussen de genoemde monopolaire membranen de zout toe- en afvoer bevindt.