JPH0440996B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

〔発明の目的〕 ＜産業上の利用分野＞ 本発明は２−オキソ−オキサゾリジン−４−カ
ルボン酸又はその塩（以下単にOOCと略記する）
から生化学的Ｌ−セリンを高収率に製造する方法
に関する。Ｌ−セリンは蛋白質を構成するアミノ
酸の一種で医薬，食品添加物あるいは化粧品の原
料として重要である。 ＜従来の技術＞ Ｌ−セリンは蛋白質構成成分として天然に広く
分布しているので、従来は比較的多量のＬ−セリ
ンを含有している絹糸，くずたま，セリシン，人
毛，豚毛等を加水分解し、遊離したＬ−セリンを
他のアミノ酸から分離精製することによつて製造
していた。しかしこの方法では収率が低く、また
原料面の制約を受け経済的でないことなどから必
ずしも有利な方法とは言えない。 Ｌ−セリンの化学合成法もいくつか知られてい
るが生産されるのは光学的に不活性なDL−体で
あつてこれからＬ−セリンを分離するには煩雑な
光学分割法などを適用せねばならず必ずしも工業
的なＬ−セリンの製造法とは言いがたい。 また醗酵法によるＬ−セリンを製造としては、
コリネバクテリウム属，シユードモナス属等の微
生物により、グリシンより製造する方法が知られ
ているが収率，経済性などの面から有利な方法と
は言えない。 一方、酵素を利用するＬ−セリンの製造法とし
ては、動物及び微生物起源のセリンハイドロキシ
メチルトランスフエラーゼを利用する方法がある
がこの方法ではグリシンとホルムアルデヒドの他
に、高価なテトラハイドロフオレート
（Tetrahydrofolate）を添加させねばならず、ま
た収率が悪いなどの難点がある。 ＜本発明が解決しようとする問題点＞ 本発明が解決しようとする問題点は化学的合成
法と酵素化学的な合成の組合せによる新規かつ効
率の良いＬ−セリンの製造法を確立することにあ
る。 〔発明の構成〕 ＜問題点を解決するための手段＞ 本発明者らは、化学合成法と酵素化学的な合成
法の組合わせによるＬ−セリンの製造法を種々研
究し、全く研究し、全く新しいＬ−セリン製造法
として本発明を完成した。 即ち、本発明はOOCを分解してＬ−セリンを
生成する能力を有する微生物を培養し、培養中も
しくは得られた培養液，菌体，菌体処理物、また
はこれらの精製処理物、あるいは菌体または精製
処理物の固定化物をOOCに作用せしめてＬ−セ
リンを生成せしめる方法である。 ＜作用＞ 本発明において用いるOOCを分解してＬ−セ
リンを生成せしめる能力を有する微生物として
は、例えば アルカリゲネス・フエカーリス AJ 2541 （Alcaligenes faecalis） FERM BP−940 アースロバクター・グロビフオルミス AJ 1422 （Arthrobacter grobiformis） ATCC 8010 バチルス・ズブチリス AJ 1922 （Bacillus subtilis） ATCC 13952 セルロモナス・フラビゲナ AJ 1568 （Cellulomonas flavigena） ATCC 491 コリネバクテリウム・ハイドロカーボクラスタス （Corynebacterium hydrocarboclastus） FERM−Ｐ 1097 エルビニア・カロトボーラ AJ 2954 （Erwinia carotovora） FERM−Ｐ 8031 フラボバクテリウム・アクアタイル AJ 2135 （Flavobaterium aquatile） ATCC 8375 ジエンセニア・カニクルリア AJ 3147 （Jensenia canicruria） ATCC 11048 ミコバクテリウム・アンモニアフイラム AJ 1977 （Mycobacterium ammoniaphilum）
ATCC 15354 ミクロコツカス・ロゼウム AJ 1006 （Micrococcus roseus） ATCC 9815 ロドコツカス・エリスロポリス AJ 9126 （Rhodococcus erytropolis） ATCC 4277 シユードモナス・テストステローニ AJ 2270 （Pseudomonas testosteroni） ATCC 17409 シユードモナス・アシドボランス AJ 3177 （Pseudomonas acidovorans） ATCC 15668 ザルチナ・ルテア AJ 1212 （Sarcina lutea） FERM−Ｐ 7049 ブルラ・アルバ AJ 4880 （Bullera alba） FERM−Ｐ 8032 キヤンデイダ・ゼイラノイデス AJ 4677 （Candida zeylanoides） IFO 0719 シテロマイセス・マトリテンシス AJ 4287 （Citeromyces matritensis） CBS 2764 クリプトコツカス・ウラレンテイ AJ 5225 （Cryptococcus laurentii） IFO 0609 デバイスマイセス・ハンゼニ AJ 4179 （Debaryomyces hansenii） OUT 6032 ジエオトリクム・フラグランス AJ 14298 （Geotricum fragrans） CBS 152.25 ハンゼヌラ・カリフオルニカ AJ 5573 （Hansenula californica） IFO 0800 クルイベロマイセス・マルキシアヌス AJ 4074 （Kluyveromy ces marxianus） IFO 0219 ナドソニア・フアルベセンス AJ 5332 （Nadosonia falvescens） IFO 0666 ロドトルラ・マリナ AJ 5014 （Rhodotorula marina） IFO 0879 トルロプシス・フアマータ AJ 4342 （Torulopsis famata） IFO 0623 トリコスポロン・フアーメンタンス AJ 5152 （Trichosporon fermentans） IFO 1199 ヴイツカーハミア・フルオレツセンス AJ 4285 （Wickerhamia fluorescens） IFO 1116 などがある。 また、上記以外の菌株でもOOCを分解してＬ
−セリンを生成する能力を有する微生物であれ
ば、すべて本発明の使用菌となり得るものであ
る。 本発明における出発物質は、化学合成で容易に
かつ大量に供給され得るものですでに周知の化合
物であるところの２−オキソ−オキサゾリジン−
４−カルボン酸又はその塩である。尚、本化合物
の光学活性については、Ｌ体又はDL体どちらで
も良い。 本発明においてはまずOOCを分解してＬ−セ
リンを生成する能力を有する前記の如き微生物が
培養されるが、培養は固体培地，液体培地のいず
れでもよく、また、培養にあたつてOOCを少量
培地に添加するることによつてOOCからＬ−セ
リンの生産能力の高い培養物または、菌体を取得
することができる。 前述の如き微生物を培養するための培地には通
常の栄養培地を適宜使用すればよく、たとえば、
炭素源としてグルコース、シユクロース、グリセ
ロール、糖蜜等の糖類、酢酸等の有機酸、エタノ
ール、メタノール等のアルコール類など、窒素源
として硫酸アンモニウム、塩化アンモニウムな
ど、有機栄養源として、酵母エキス、ペプトン、
肉エキス、コーン、ステイープリカーなど無機イ
オンとして、マグネシウム、鉄、マンガン、カリ
ウム、ナトリウム、リン酸などのイオン、ビタミ
ンとしてビリドキシン、ピリドキサルリン酸など
を用いることができる。培養は常法によればよ
く、たとえば培地のPHは６〜９とし、接種後、20
〜40℃で１〜３日好気的に培養する。 このようにして得られた培養物は、培養中もし
くは得られた培養液、分離菌体、洗滌生菌体、凍
結乾燥菌体、アセトン乾燥菌体、物理的、化学的
もしくは生化学的に破壊された菌体、抽出液、粗
精製物、精製物、精製蛋白標品、または菌体もし
くは精製処理物の固定化物などの状態において、
OOCと作用させることができる。 酵素反応液中の基質濃度はバツチ式、連続式に
よつても異なるが、バツチ式では一般に水性媒質
中0.1〜30％、好ましくは0.5〜10％程度で連続式
では、これよりやや濃度を低下させた方が好まし
い。 反応は、普通、水性媒質中で15〜60℃、好まし
くは30℃〜40℃附近で、PH＝４〜10、好ましくは
８附近で行なわれる。反応時間は、静置、撹拌、
流下等の手段あるいは酵素標品の形態、力価によ
つて異なつてくるので一様ではないが、バツチ法
では通常10分〜72時間程度である。 上記微生物の菌体を水溶性媒体中で培養しなが
ら菌体とOOCと接触せしめて作用させる場合に
はOOCを含みかつ微生物の生育に必要な炭素源，
窒素源、無機イオンなどの栄養源を含む水性媒体
が用いられる。更に、ビタミン，アミノ酸等の有
機微量栄養素を添加すると望ましい結果が得られ
る場合が多い。 炭素源としては、グルコース、シユクロース等
の炭水化物、酢酸等の有機酸、アルコール類、そ
の他が適宜使用される。窒素源としては、アンモ
ニアガス、アンモニア水、アンモニウム塩、その
他が用いられる。無機イオンとしては、マグネシ
ウムイオン、燐酸イオン、カリイオン、鉄イオン
その他が必要に応じて適宜使用される。 培養は、好気的条件下にPH４ないし８、温度25
ないし40℃の適当な範囲に制御しつつ行えば望ま
しい結果が得られる。 かくして、１ないし10日間も培養を行なえば
OOCはＬ−セリンのみに効率よく変換される。 本発明におけるOOCからの酵素反応生成物が
Ｌ体のセリンであることは、後記の実施例で得ら
れたセリンの結晶につき、NMRスペクトル、Ｘ
線回折像、液体クロマトグラフ、バイオアツセイ
の定量値、および比旋光度などのデータから決定
した。なお旋光度純度は95.6％であつた。 次に本発明の実施例を示す。 実施例 １ グリセロース２％、酵母エキス0.5％、ペプト
ン0.5％、NaCl0.25％、DL−OOC0.2％、炭酸カ
ルシウム4.0％（別殺菌）を含む培地（PH7.0）を
500ml容フラスコに50ml入れ、120℃15分間殺菌し
た。 これにブイヨン寒天培地で30℃にて24時間培養
した第１表に示した微生物を一白金耳接種し30℃
で20時間培養した。この培養液より菌体を遠心分
離により採取し、培養液と同量の生理食塩水で１
回洗浄し菌体を集めＬ−OOC1％を含みPH７又は
8.5に調整された反応液に、生菌体として５％と
なるように加え、30℃、48時間静置反応せしめ
た。反応終了後バイオアツセイにてＬ−セリンを
定量し、第１表に示した。

【表】

【表】

【表】 実施例 ２ 実施例１と同様に液体培地50ml／50mlフラスコ
にシユードモナス・テストステローニATCC
17409を接種し30℃、16時間培養したのち菌体を
遠心分離後洗浄し集め、Ｌ−又はDL−OOC1％
を含みPH７に調整された反応液に生菌体として５
％となるように加え、30℃、18時間静置反応せし
めた。反応終了後、バイオアツセイにて、Ｌ−セ
リンを定量し、第２表に示した。

【表】 実施例 ３ 実施例１と同様の培地50ml／500mlフラスコを
用いて30℃で12時間培養したシユードモナスアシ
ドボランスATCC 15668を培養液中にDL−
OOC500mgを含む水溶液10ml（PH7.0に調製）を無
菌的に投入し、無菌的に培養液のPHを7.0に調製
後更に10時間培養を行なつた。培養中は２時間お
きにPHを7.0になる様に無菌的に調製した。 この培養液中に一部を取り、適宜希釈してバイ
オアツセイにより生成したＬ−セリンを定量した
ところ、288.3mg／ｄのＬ−セリンが生成して
いた。 実施例 ４ 実施例１と同様の液体培地50ml／500mlフラス
コにシユードモナス・テストステローニATCC
17409を接種し30℃、16時間培養したのち、遠心
洗浄して凍結乾燥し、これを５％濃になるように
酵素反応液１に浮遊させた。酵素反応液はＬ−
OOC1％、KH₂PO₄1％より成りPH7.0で30℃、48
時間静置反応させた。反応終了後、遠心分離して
上清して取り、その一部を適宜希釈してバイオア
ツセイにより生成したＬ−セリンを定量した。 364.2ml／ｄ（モル収率45％）のＬ−セリン
が蓄積していた。 一方、反応終了液を遠心除菌して上清を得たの
ち、活性炭５ｇを加え加熱し、過して上液990
mlを得た。この液を減圧濃縮後、PHを3.0に調製
し、陽イオン交換樹脂ダイヤオンSK−1B 500ml
を詰めたカラムに通じ、蒸溜水2000mlで洗浄後、
次に2Nアンモニア水で溶出して、セリン画分を
集め減圧濃縮した。この濃縮液をPH5.7に調製後、
低温下で約２倍量のメタノールを徐々に添加し、
Ｌ−セリンの結晶を析出させ、さらに10℃で１日
放置した。この析出結晶を別、メタノール洗
浄、乾燥した結晶1.2ｇを得た。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. １ アルカリゲネス属、アースロバクター属、バ
   チルス属、セルロモナス属、コリネバクテリウム
   属、エルビニア属、フラボバクテリウム属、ジエ
   ンセニア属、ミコバクテリウム属、ミクロコツカ
   ス属、ロドコツカス属、シユードモナス属、ザル
   チナ属、ブルラ属、キヤンデイダ属、シテロマイ
   セス属、クリプトコツカス属、デバリオマイセス
   属、ジエオトリクム属、ハンゼヌラ属、クルイベ
   ロマイセス属、ナドソニア属、ロドトルラ属、ト
   ルロプシス属、トリコスポロン属またはヴイツカ
   ーハミア属に属し、２−オキソ−オキサゾリジン
   −４−カルボン酸又はその塩よりＬ−セリンを生
   成する能力を有する微生物を培養し、培養中もし
   くは得られた培養液、菌体、菌体処理物、または
   これらの精製処理物、あるいは菌体または精製処
   理物の固定化物を２−オキソ−オキサゾリジン−
   ４−カルボン酸又はその塩に作用せしめてＬ−セ
   リンを生成せしめることを特徴とするＬ−セリン
   の製造法。