JPH06269288A - トレハロースのアルコール晶析による単離精製法 - Google Patents
トレハロースのアルコール晶析による単離精製法Info
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- JPH06269288A JPH06269288A JP1561593A JP1561593A JPH06269288A JP H06269288 A JPH06269288 A JP H06269288A JP 1561593 A JP1561593 A JP 1561593A JP 1561593 A JP1561593 A JP 1561593A JP H06269288 A JPH06269288 A JP H06269288A
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- crystallization
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Abstract
(57)【要約】
【目的】トレハロース含有水溶液から、簡単に純度の高
いトレハロース・２水和物結晶が得られる方法を提供す
る。 【構成】トレハロース水溶液とアルコールを液量比例で
かつ同時に添加することを特徴とするトレハロースの晶
析法。
いトレハロース・２水和物結晶が得られる方法を提供す
る。 【構成】トレハロース水溶液とアルコールを液量比例で
かつ同時に添加することを特徴とするトレハロースの晶
析法。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明はトレハロースの製造法に
関するものである。トレハロースは、医薬品及び食品分
野において、細胞活性保持剤、耐寒性剤、不凍性剤等と
しての利用が期待されている。
関するものである。トレハロースは、医薬品及び食品分
野において、細胞活性保持剤、耐寒性剤、不凍性剤等と
しての利用が期待されている。
【０００２】
【従来の技術】従来、トレハロースの製造法としては、
乾燥酵母等の天然物から抽出する方法、マルトース、シ
ュクロース等を酵素処理してトレハロースに変える方
法、微生物を培養してトレハロースを生成蓄積させる方
法等が知られている。
乾燥酵母等の天然物から抽出する方法、マルトース、シ
ュクロース等を酵素処理してトレハロースに変える方
法、微生物を培養してトレハロースを生成蓄積させる方
法等が知られている。
【０００３】トレハロースの分離方法としては、乾燥酵
母等からの抽出法、酵素法でトレハロースを生成させ精
製する方法、微生物培養によりトレハロースを生成し精
製する方法がある。乾燥酵母からの抽出法の場合には、
エーテル、アルコール抽出し、アルコールとアセトンを
用いて晶析を繰り返す方法（Ｓcience、61(1587)、57
0、1925) 、酵母をＮＨ2ＳＯ4処理し、重金属のＨｇ、
Ｆｅによる沈澱後、濾液に多量の95％アルコールを添加
して晶析させる方法（Ｓcience、82(2131)、422、1935)
、酵母よりアルコール抽出し、イオン交換樹脂（Ａmbe
rlite ＩＲ−100、ＩＲ−４Ｂ）でイオン性物質を除去
してから多量の95％アルコールを添加して晶析させる方
法（Ｊ.Ａm.Ｃhem.Ｓoc.,72、2059、1950）等が報告さ
れている。
母等からの抽出法、酵素法でトレハロースを生成させ精
製する方法、微生物培養によりトレハロースを生成し精
製する方法がある。乾燥酵母からの抽出法の場合には、
エーテル、アルコール抽出し、アルコールとアセトンを
用いて晶析を繰り返す方法（Ｓcience、61(1587)、57
0、1925) 、酵母をＮＨ2ＳＯ4処理し、重金属のＨｇ、
Ｆｅによる沈澱後、濾液に多量の95％アルコールを添加
して晶析させる方法（Ｓcience、82(2131)、422、1935)
、酵母よりアルコール抽出し、イオン交換樹脂（Ａmbe
rlite ＩＲ−100、ＩＲ−４Ｂ）でイオン性物質を除去
してから多量の95％アルコールを添加して晶析させる方
法（Ｊ.Ａm.Ｃhem.Ｓoc.,72、2059、1950）等が報告さ
れている。
【０００４】一方、酵素法については、マルトースをマ
ルトースホスホリラーゼ及びトレハロースホスホリラー
ゼで処理してトレハロースを生成させ、酵素反応液から
沈澱物を除去後アニオン交換樹脂で精製する方法が知ら
れている（特開昭58−216695号公報）。アニオン交換樹
脂処理で精製した糖液は、ホウ酸型陰イオン交換樹脂に
流してトレハロースを吸着させ、ホウ酸カリウム溶液で
溶離分画し、得られたトレハロース画分はカチオン型イ
オン交換樹脂で処理し、濃縮後低級アルコールを加えて
蒸留することによりホウ酸を除去し、アルコール晶析を
繰り返してトレハロース結晶を得ている。また、シュク
ロースに固定化したグルコシル・トランスフェラーゼを
作用させてパラチノースを生成させ、これを晶析分離し
た残りの糖液には副生物であるトレハロースが存在して
いる。この糖液をまず亜硫酸型と亜硫酸水素型の混床の
強塩基性陰イオン交換樹脂でクロマトグラフィー処理
し、次いでＣａ型の強酸性陽イオン交換樹脂でクロマト
グラフィー処理してトレハロースを分離する方法が知ら
れている（特開平４−131090号公報）。
ルトースホスホリラーゼ及びトレハロースホスホリラー
ゼで処理してトレハロースを生成させ、酵素反応液から
沈澱物を除去後アニオン交換樹脂で精製する方法が知ら
れている（特開昭58−216695号公報）。アニオン交換樹
脂処理で精製した糖液は、ホウ酸型陰イオン交換樹脂に
流してトレハロースを吸着させ、ホウ酸カリウム溶液で
溶離分画し、得られたトレハロース画分はカチオン型イ
オン交換樹脂で処理し、濃縮後低級アルコールを加えて
蒸留することによりホウ酸を除去し、アルコール晶析を
繰り返してトレハロース結晶を得ている。また、シュク
ロースに固定化したグルコシル・トランスフェラーゼを
作用させてパラチノースを生成させ、これを晶析分離し
た残りの糖液には副生物であるトレハロースが存在して
いる。この糖液をまず亜硫酸型と亜硫酸水素型の混床の
強塩基性陰イオン交換樹脂でクロマトグラフィー処理
し、次いでＣａ型の強酸性陽イオン交換樹脂でクロマト
グラフィー処理してトレハロースを分離する方法が知ら
れている（特開平４−131090号公報）。
【０００５】更に、微生物を培養してトレハロースを生
成させる方法の場合には、ノカルディア属のトレハロー
ス生産菌の培養液を除菌し、メタノール処理して不溶物
を除去した濾液からトレハロースを分離する方法が知ら
れている（特開昭50−154485号公報）。この方法におい
ては濾液を陰イオン交換樹脂及び陽イオン交換樹脂でそ
れぞれ２回づつ処理し、ゲル濾過を行い、活性炭カラム
に吸着溶離後エタノール晶析を繰り返してトレハロース
結晶を得ている。リゾクトニア属、スクレロチウム属等
の菌を培養して得た菌体を粉砕してトリクロロ酢酸水溶
液で抽出し、この抽出液からトレハロースを分離する方
法も知られている（特開平３−130084号公報）。抽出液
はまずクロロホルムとエーテルで処理して脂質及びトリ
クロロ酢酸を除去し、イオン交換樹脂を通した後蒸発乾
固させ、これをアセトニトリル等で溶解してシリカゲル
クロマトグラフィーでトレハロースを分離しうることが
示されている。また、培養後菌体を分離し、上清を濃縮
後Ｂio−Ｇel Ｐ−２でクロマトグラフィーを行い、得
られたトレハロース画分をＤowex 50で処理し、再度Ｂi
o−Ｇel Ｐ−２クロマトグラフィーで精製し、このトレ
ハロース画分を濃縮乾固してトレハロースの乾燥物を得
る方法も知られている（Ａgric．Ｂiol．Ｃhem., 52
(3)、867−868、1988）。
成させる方法の場合には、ノカルディア属のトレハロー
ス生産菌の培養液を除菌し、メタノール処理して不溶物
を除去した濾液からトレハロースを分離する方法が知ら
れている（特開昭50−154485号公報）。この方法におい
ては濾液を陰イオン交換樹脂及び陽イオン交換樹脂でそ
れぞれ２回づつ処理し、ゲル濾過を行い、活性炭カラム
に吸着溶離後エタノール晶析を繰り返してトレハロース
結晶を得ている。リゾクトニア属、スクレロチウム属等
の菌を培養して得た菌体を粉砕してトリクロロ酢酸水溶
液で抽出し、この抽出液からトレハロースを分離する方
法も知られている（特開平３−130084号公報）。抽出液
はまずクロロホルムとエーテルで処理して脂質及びトリ
クロロ酢酸を除去し、イオン交換樹脂を通した後蒸発乾
固させ、これをアセトニトリル等で溶解してシリカゲル
クロマトグラフィーでトレハロースを分離しうることが
示されている。また、培養後菌体を分離し、上清を濃縮
後Ｂio−Ｇel Ｐ−２でクロマトグラフィーを行い、得
られたトレハロース画分をＤowex 50で処理し、再度Ｂi
o−Ｇel Ｐ−２クロマトグラフィーで精製し、このトレ
ハロース画分を濃縮乾固してトレハロースの乾燥物を得
る方法も知られている（Ａgric．Ｂiol．Ｃhem., 52
(3)、867−868、1988）。
【０００６】上記のようにトレハロースの分離には一般
にアルコール晶析法が組み込まれているが、アルコール
晶析法で得られるトレハロース・２水和物結晶は微細な
ため純度が低いという問題があった。
にアルコール晶析法が組み込まれているが、アルコール
晶析法で得られるトレハロース・２水和物結晶は微細な
ため純度が低いという問題があった。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は上記の
問題点を解決して、トレハロース含有水溶液から、簡単
に純度の高いトレハロース・２水和物結晶が得られる方
法を提供することである。
問題点を解決して、トレハロース含有水溶液から、簡単
に純度の高いトレハロース・２水和物結晶が得られる方
法を提供することである。
【０００８】
【課題を解決するための手段】本発明は上記目的を達成
したトレハロースの晶析法を提供するものであり、トレ
ハロース水溶液とアルコールを液量比例でかつ同時に添
加することによってかかる目的を達成したものである。
したトレハロースの晶析法を提供するものであり、トレ
ハロース水溶液とアルコールを液量比例でかつ同時に添
加することによってかかる目的を達成したものである。
【０００９】トレハロース水溶液の由来は問うところで
はなく、乾燥酵母、いわひば等の天然物の抽出液からト
レハロース精製品を得る中間工程の各種トレハロース水
溶液、マルトース、シュクロース等を酵素処理してトレ
ハロースに変える方法におけるトレハロース精製品を得
る中間工程の各種トレハロース水溶液、微生物を培養し
てトレハロースを生成蓄積させる方法におけるトレハロ
ース精製品を得る中間工程の各種トレハロース水溶液を
用いることができる。
はなく、乾燥酵母、いわひば等の天然物の抽出液からト
レハロース精製品を得る中間工程の各種トレハロース水
溶液、マルトース、シュクロース等を酵素処理してトレ
ハロースに変える方法におけるトレハロース精製品を得
る中間工程の各種トレハロース水溶液、微生物を培養し
てトレハロースを生成蓄積させる方法におけるトレハロ
ース精製品を得る中間工程の各種トレハロース水溶液を
用いることができる。
【００１０】上記の微生物を培養してトレハロースを生
成蓄積させる方法は公知のノカルディア属、リゾクトニ
ア属、スクレロチウム属の微生物のほか、本出願人が新
たに開発したものであってもよい。すなわち、従来より
Ｌ−グルタミン酸や各種アミノ酸の生産菌として知られ
ているブレビバクテリウム属、コリネバクテリウム属、
ミクロバクテリウム属またはアルスロバクター属に属す
る微生物をシュクロースまたはマルトース等を主炭素源
とする液体培地で培養することにより得られた発酵液由
来の水溶液であってもよい。これらの属に属する微生物
はトレハロース生産能を有する微生物であればいずれの
菌株でも使用できるが、具体的に例示すると以下の菌株
が挙げられる。
成蓄積させる方法は公知のノカルディア属、リゾクトニ
ア属、スクレロチウム属の微生物のほか、本出願人が新
たに開発したものであってもよい。すなわち、従来より
Ｌ−グルタミン酸や各種アミノ酸の生産菌として知られ
ているブレビバクテリウム属、コリネバクテリウム属、
ミクロバクテリウム属またはアルスロバクター属に属す
る微生物をシュクロースまたはマルトース等を主炭素源
とする液体培地で培養することにより得られた発酵液由
来の水溶液であってもよい。これらの属に属する微生物
はトレハロース生産能を有する微生物であればいずれの
菌株でも使用できるが、具体的に例示すると以下の菌株
が挙げられる。
【００１１】ブレビバクテリウム・ラクトフェルメンタ
ム ＡＴＣＣ 13869 ブレビバクテリウム・フラバム ＡＴＣＣ 14067 ブレビバクテリウム・ティバリカタム ＡＴＣＣ 21642 コリネバクテリウム・グルタミカム ＡＴＣＣ 13032 コリネバクテリウム・アセトアシドフィラム ＡＴＣＣ
13870 コリネバクテリウム・リリウム ＡＴＣＣ 15990 アルスロバクター・シトレウス ＡＴＣＣ 11624 アルスロバクター・スルフレイス ＡＴＣＣ 15170 ミクロバクテリウム・アンモニアフィラム ＡＴＣＣ 1
5354 さらには、これらの菌株の変異処理等を施すことにより
トレハロース生産能を向上させた変異株も使用すること
ができる。
ム ＡＴＣＣ 13869 ブレビバクテリウム・フラバム ＡＴＣＣ 14067 ブレビバクテリウム・ティバリカタム ＡＴＣＣ 21642 コリネバクテリウム・グルタミカム ＡＴＣＣ 13032 コリネバクテリウム・アセトアシドフィラム ＡＴＣＣ
13870 コリネバクテリウム・リリウム ＡＴＣＣ 15990 アルスロバクター・シトレウス ＡＴＣＣ 11624 アルスロバクター・スルフレイス ＡＴＣＣ 15170 ミクロバクテリウム・アンモニアフィラム ＡＴＣＣ 1
5354 さらには、これらの菌株の変異処理等を施すことにより
トレハロース生産能を向上させた変異株も使用すること
ができる。
【００１２】培養は好気的条件下で行うのがよく、培養
温度は20〜45℃、培養液のｐＨは5.0〜10.0に制御する
のがよく、ｐＨの調整には無機あるいは有機の酸性もし
くはアルカリ性物質、さらには尿素、炭酸カルシウム、
アンモニアガス等を使用することができる。
温度は20〜45℃、培養液のｐＨは5.0〜10.0に制御する
のがよく、ｐＨの調整には無機あるいは有機の酸性もし
くはアルカリ性物質、さらには尿素、炭酸カルシウム、
アンモニアガス等を使用することができる。
【００１３】上記発酵液は必要により公知の遠心分離法
あるいは濾過法等により予め菌体を分離しておくことが
できる。
あるいは濾過法等により予め菌体を分離しておくことが
できる。
【００１４】本発明の方法が適用されるトレハロース水
溶液は、上記各方法における中間工程液のものであり、
通常は粗結晶あるいは精製結晶を取得する際のものであ
る。これらの水溶液は天然物からの抽出液、酵素反応液
あるいは発酵液好ましくは除菌発酵液から得られるもの
であるが、その際、各種の精製が行なわれる。これはク
ロマトグラフィーなど各種の公知の手段を適用したもの
であってよいが、本発明者は限外濾過膜処理及びアニオ
ン交換樹脂とカチオン交換樹脂を組み合わせたイオン交
換樹脂処理が特に有効である。この限外濾過膜処理とイ
オン交換樹脂処理は前述のＬ−グルタミン酸や各種アミ
ノ酸の生産菌を用いて得られた発酵液に対して特に有効
である。
溶液は、上記各方法における中間工程液のものであり、
通常は粗結晶あるいは精製結晶を取得する際のものであ
る。これらの水溶液は天然物からの抽出液、酵素反応液
あるいは発酵液好ましくは除菌発酵液から得られるもの
であるが、その際、各種の精製が行なわれる。これはク
ロマトグラフィーなど各種の公知の手段を適用したもの
であってよいが、本発明者は限外濾過膜処理及びアニオ
ン交換樹脂とカチオン交換樹脂を組み合わせたイオン交
換樹脂処理が特に有効である。この限外濾過膜処理とイ
オン交換樹脂処理は前述のＬ−グルタミン酸や各種アミ
ノ酸の生産菌を用いて得られた発酵液に対して特に有効
である。
【００１５】限外濾過膜は高分子、具体的には分子量約
1000以上、例えば2000以上のものを除去できるものを使
用する。膜の材質はアセチルセルロースなどのセルロー
ス系のもののほか、ポリアミド、ポリエステル、ポリア
クリロニトリル、ポリビニルアルコール、ポリカーボネ
ート、ポリエチレンさらには無機材料など多種多様のも
のが知られているがその種類を問わず使用できる。膜形
状は、平膜型、モジュール型等あるが、処理性能の点か
らモジュール型が好ましい。
1000以上、例えば2000以上のものを除去できるものを使
用する。膜の材質はアセチルセルロースなどのセルロー
ス系のもののほか、ポリアミド、ポリエステル、ポリア
クリロニトリル、ポリビニルアルコール、ポリカーボネ
ート、ポリエチレンさらには無機材料など多種多様のも
のが知られているがその種類を問わず使用できる。膜形
状は、平膜型、モジュール型等あるが、処理性能の点か
らモジュール型が好ましい。
【００１６】発酵液等には相当量の無機塩類が存在しそ
の他各種イオン性物質も存在していて、これらが晶析の
際に析出してくるのでトレハロースを晶析する前に脱塩
しておくことが好ましい。脱塩手段としてはイオン交換
膜等を使用してもよいが、遊離型の陽イオン交換樹脂と
陰イオン交換樹脂を組み合わせて行う方法が簡便であ
る。陽イオン交換樹脂と陰イオン交換樹脂は脱塩能力の
あるものであればその種類を問わず使用できる。このイ
オン交換樹脂による脱塩処理は限外濾過膜処理を行う前
後のいずれに行ってもよい。
の他各種イオン性物質も存在していて、これらが晶析の
際に析出してくるのでトレハロースを晶析する前に脱塩
しておくことが好ましい。脱塩手段としてはイオン交換
膜等を使用してもよいが、遊離型の陽イオン交換樹脂と
陰イオン交換樹脂を組み合わせて行う方法が簡便であ
る。陽イオン交換樹脂と陰イオン交換樹脂は脱塩能力の
あるものであればその種類を問わず使用できる。このイ
オン交換樹脂による脱塩処理は限外濾過膜処理を行う前
後のいずれに行ってもよい。
【００１７】晶析に先立って溶液を活性炭等で脱色処理
しておくことが好ましい。
しておくことが好ましい。
【００１８】本発明で適用されるトレハロース水溶液の
トレハロース濃度としては25〜60ｇ／dl、好ましくは30
〜50ｇ／dl程度が適当である。
トレハロース濃度としては25〜60ｇ／dl、好ましくは30
〜50ｇ／dl程度が適当である。
【００１９】アルコールはメタノール、エタノール、プ
ロパノール、イソプロパノール、ブタノール等の低級ア
ルコールがよく、エタノールが特に好ましい。アルコー
ルの添加量はトレハロース水溶液の１〜10倍量程度、好
ましくは２〜５倍量程度が適当である。
ロパノール、イソプロパノール、ブタノール等の低級ア
ルコールがよく、エタノールが特に好ましい。アルコー
ルの添加量はトレハロース水溶液の１〜10倍量程度、好
ましくは２〜５倍量程度が適当である。
【００２０】本発明の方法においては、まず晶析槽は種
晶としてトレハロース・２水和物結晶が存在するトレハ
ロース水溶液あるいはトレハロース含水アルコール溶液
を形成する。この手段は問うところではなく、如何なる
手段によってもよい。次いで、この晶析槽にトレハロー
ス水溶液とアルコールを液量比例でかつ同時に添加して
いく（比例添加法という）。この「液量比例で」とは、
トレハロース水溶液の全添加量とアルコールの全添加量
との液量比で添加することを意味する。この液量比は厳
密なものではなく、±10％程度、好ましくは±５％程度
の変動が許容される。また、「同時に」の意も本発明の
効果を発揮しうる範囲での時間的ずれは許容される。ト
レハロース水溶液とアルコールの添加はいずれも連続的
であってもよく、間欠的であってもよい。晶析温度はア
ルコールの沸点以下であればよいが、20〜50℃程度が好
ましい。晶析中は攪拌を行なうことが好ましい。
晶としてトレハロース・２水和物結晶が存在するトレハ
ロース水溶液あるいはトレハロース含水アルコール溶液
を形成する。この手段は問うところではなく、如何なる
手段によってもよい。次いで、この晶析槽にトレハロー
ス水溶液とアルコールを液量比例でかつ同時に添加して
いく（比例添加法という）。この「液量比例で」とは、
トレハロース水溶液の全添加量とアルコールの全添加量
との液量比で添加することを意味する。この液量比は厳
密なものではなく、±10％程度、好ましくは±５％程度
の変動が許容される。また、「同時に」の意も本発明の
効果を発揮しうる範囲での時間的ずれは許容される。ト
レハロース水溶液とアルコールの添加はいずれも連続的
であってもよく、間欠的であってもよい。晶析温度はア
ルコールの沸点以下であればよいが、20〜50℃程度が好
ましい。晶析中は攪拌を行なうことが好ましい。
【００２１】添加後は必要により５〜10℃程度まで冷却
し、30分〜２時間程度放置して過飽和を解消させる。次
いで、固液分離後結晶を必要により含水アルコール等で
洗浄すればよい。
し、30分〜２時間程度放置して過飽和を解消させる。次
いで、固液分離後結晶を必要により含水アルコール等で
洗浄すればよい。
【００２２】次に、実施例により本発明をさらに詳細に
説明する。なお、トレハロースの定量は、高速液体クロ
マトグラフィー（使用カラム：山村化学研究所(株)製、
ＹＭＣ ＰＡ−03−Ｓ−５）により行った。トレハロー
スの量は全て２水和物の量で表示した。
説明する。なお、トレハロースの定量は、高速液体クロ
マトグラフィー（使用カラム：山村化学研究所(株)製、
ＹＭＣ ＰＡ−03−Ｓ−５）により行った。トレハロー
スの量は全て２水和物の量で表示した。
【００２３】
【実施例】 実施例１；比例添加法 グルコース４％、尿素0.5％、ＫＨ2ＰＯ4 0.1％、ＭgＳ
Ｏ4・７Ｈ2Ｏ 0.04％、サイアミン塩酸塩300μｇ／ｌ、
ビオチン300μｇ／ｌ、大豆分解濃縮液（全窒素とし
て）0.1％、ＦeＳＯ4・７Ｈ2Ｏ 0.001％、ＭnＳＯ4・４
Ｈ2Ｏ 0.001％（ｐＨ6.5）から成る液体培地を調製し、
その20mlずつを500ml容振盪フラスコに分注し、110℃，
10分間加熱殺菌した。この培地に予めブイヨン寒天斜面
培地にて31.5℃、48時間培養したコリネバクテリウム・
リリウム ＡＴＣＣ 15990を一白金耳接種し、往復振盪
培養機により31.5℃で24時間培養を行い、種培養液を調
製した。
Ｏ4・７Ｈ2Ｏ 0.04％、サイアミン塩酸塩300μｇ／ｌ、
ビオチン300μｇ／ｌ、大豆分解濃縮液（全窒素とし
て）0.1％、ＦeＳＯ4・７Ｈ2Ｏ 0.001％、ＭnＳＯ4・４
Ｈ2Ｏ 0.001％（ｐＨ6.5）から成る液体培地を調製し、
その20mlずつを500ml容振盪フラスコに分注し、110℃，
10分間加熱殺菌した。この培地に予めブイヨン寒天斜面
培地にて31.5℃、48時間培養したコリネバクテリウム・
リリウム ＡＴＣＣ 15990を一白金耳接種し、往復振盪
培養機により31.5℃で24時間培養を行い、種培養液を調
製した。
【００２４】シュクロース15％、ＫＨ2ＰＯ4 0.1％、Ｍ
gＳＯ4・７Ｈ2Ｏ 0.1％、サイアミン塩酸塩300μｇ／
ｌ、ビオチン300μｇ／ｌ、大豆分解濃縮液（全窒素と
して）0.05％、ＦeＳＯ4・７Ｈ2Ｏ 0.001％、ＭnＳＯ4
・４Ｈ2Ｏ 0.001％から成る培地（ｐＨ7.3）に塩化カリ
ウム、塩化アンモニウム等量混合物を２％添加した液体
培地を１ｌ容ジャーファーメンターに分注し、120℃，2
0分加熱殺菌後、上記種培養液15mlを接種し、31.5℃、
通気量１／２vvm、攪拌速度700rpmにて培養を開始し
た。培養中はアンモニアガスでｐＨ7.3に制御した。培
養開始後、培養液の26倍希釈液の562nmにおける濁度が
0.60に達した時点でポリオキシソルビタンモノパルミテ
ートを0.4％の濃度となるように添加してさらに培養を
続け、培養液中のシュクロースが消費された時点で培養
を終了した。
gＳＯ4・７Ｈ2Ｏ 0.1％、サイアミン塩酸塩300μｇ／
ｌ、ビオチン300μｇ／ｌ、大豆分解濃縮液（全窒素と
して）0.05％、ＦeＳＯ4・７Ｈ2Ｏ 0.001％、ＭnＳＯ4
・４Ｈ2Ｏ 0.001％から成る培地（ｐＨ7.3）に塩化カリ
ウム、塩化アンモニウム等量混合物を２％添加した液体
培地を１ｌ容ジャーファーメンターに分注し、120℃，2
0分加熱殺菌後、上記種培養液15mlを接種し、31.5℃、
通気量１／２vvm、攪拌速度700rpmにて培養を開始し
た。培養中はアンモニアガスでｐＨ7.3に制御した。培
養開始後、培養液の26倍希釈液の562nmにおける濁度が
0.60に達した時点でポリオキシソルビタンモノパルミテ
ートを0.4％の濃度となるように添加してさらに培養を
続け、培養液中のシュクロースが消費された時点で培養
を終了した。
【００２５】こうして得られたトレハロース88ｇ（トレ
ハロース・２水和物換算）を含む発酵ブロス（蛋白濃度
2.0％）約2.2ｌを遠心分離機で処理し、菌体を除いた
（ｐＨ7.8）。陽イオン交換樹脂ＳＫ１Ｂ Ｈ型２ｌカラ
ム（三菱化成(株)製）と陰イオン交換樹脂ＷＡ30 ＯＨ
型５ｌカラム（三菱化成(株)製）を直列に接続して、流
速２ｌ／Ｈrで除菌ブロスを通液し、脱塩処理液５ｌを
得た。該脱塩処理液を限外濾過膜ＳＩＰ−0013（分画分
子量3000、旭化成(株)製）を用いて透過し、透過液（蛋
白濃度0.01％以下）10ｌを得た。その後、該透過液を濃
縮し、トレハロース35ｇ／dlを含む濃縮液180mlとし
た。
ハロース・２水和物換算）を含む発酵ブロス（蛋白濃度
2.0％）約2.2ｌを遠心分離機で処理し、菌体を除いた
（ｐＨ7.8）。陽イオン交換樹脂ＳＫ１Ｂ Ｈ型２ｌカラ
ム（三菱化成(株)製）と陰イオン交換樹脂ＷＡ30 ＯＨ
型５ｌカラム（三菱化成(株)製）を直列に接続して、流
速２ｌ／Ｈrで除菌ブロスを通液し、脱塩処理液５ｌを
得た。該脱塩処理液を限外濾過膜ＳＩＰ−0013（分画分
子量3000、旭化成(株)製）を用いて透過し、透過液（蛋
白濃度0.01％以下）10ｌを得た。その後、該透過液を濃
縮し、トレハロース35ｇ／dlを含む濃縮液180mlとし
た。
【００２６】次に、晶析用容器に80％エチルアルコール
50mlを40℃に保ち、攪拌させておいた。これに、当該ト
レハロース濃縮液180mlと100％エチルアルコール720ml
を液量比例でそれぞれ50ml／ｈ、200ml／ｈの速度で同
時に添加した。約30分後、液が白濁したらすぐに、微粉
砕したトレハロース・２水和物の種晶約0.5ｇを添加
し、前記両液は更に同時添加を続行し3.6時間で添加を
終了した。その後、５℃／ｈの冷却速度で、５℃まで冷
却した。得られた結晶を遠心分離機で分離し、減圧乾燥
機で40℃，15時間乾燥後、高純度のトレハロース・２水
和物の結晶（純度99.5％）78ｇを得た。得られた結晶の
詳細な分析結果を次に示す。
50mlを40℃に保ち、攪拌させておいた。これに、当該ト
レハロース濃縮液180mlと100％エチルアルコール720ml
を液量比例でそれぞれ50ml／ｈ、200ml／ｈの速度で同
時に添加した。約30分後、液が白濁したらすぐに、微粉
砕したトレハロース・２水和物の種晶約0.5ｇを添加
し、前記両液は更に同時添加を続行し3.6時間で添加を
終了した。その後、５℃／ｈの冷却速度で、５℃まで冷
却した。得られた結晶を遠心分離機で分離し、減圧乾燥
機で40℃，15時間乾燥後、高純度のトレハロース・２水
和物の結晶（純度99.5％）78ｇを得た。得られた結晶の
詳細な分析結果を次に示す。
【００２７】
【表１】
【００２８】比較例１；正添加法 実施例１と同じ製法で得たトレハロース４ｇ（トレハロ
ース・２水和物換算）を含む発酵ブロス（蛋白濃度2.0
％）100mlを遠心分離機で菌体を除いた（ｐＨ7.8）。次
いで実施例１と同様にイオン交換樹脂（ＳＫ１Ｂ、ＷＡ
30）を通して、脱塩処理液500mlを得た。同様に、該脱
塩処理液を限外濾過膜で処理して透過液（蛋白濃度0.01
％）1000mlを得た。次いで該透過液をトレハロース約30
ｇ／dlまで濃縮し、濃縮液約10mlとした。該濃縮液を40
℃で攪拌しつつ、100％エチルアルコール40mlを約10分
間で添加し、その後５℃まで冷却した。得られた結晶を
減圧濾過法で分離し、減圧乾燥機で40℃，15時間乾燥
後、トレハロース・２水和物の結晶（純度95％）３ｇを
得た。
ース・２水和物換算）を含む発酵ブロス（蛋白濃度2.0
％）100mlを遠心分離機で菌体を除いた（ｐＨ7.8）。次
いで実施例１と同様にイオン交換樹脂（ＳＫ１Ｂ、ＷＡ
30）を通して、脱塩処理液500mlを得た。同様に、該脱
塩処理液を限外濾過膜で処理して透過液（蛋白濃度0.01
％）1000mlを得た。次いで該透過液をトレハロース約30
ｇ／dlまで濃縮し、濃縮液約10mlとした。該濃縮液を40
℃で攪拌しつつ、100％エチルアルコール40mlを約10分
間で添加し、その後５℃まで冷却した。得られた結晶を
減圧濾過法で分離し、減圧乾燥機で40℃，15時間乾燥
後、トレハロース・２水和物の結晶（純度95％）３ｇを
得た。
【００２９】比較例２；逆添加法 比較例１と同様に、実施例１と同じ製法で得たトレハロ
ース４ｇ（トレハロース・２水和物換算）を含む発酵ブ
ロス（蛋白濃度2.0％）100mlを実施例１と同様に処理
し、濃縮液10mlを得た。次に、比較例１とは逆に100％
エチルアルコール40mlを40℃で攪拌しつつ、この中に該
濃縮液10mlを10分間で添加し、その後５℃まで冷却し
た。得られた結晶はトレハロース・２水和物の微細晶と
なり、かつ該微細晶は集合晶となってしまい、純度も90
％であった。
ース４ｇ（トレハロース・２水和物換算）を含む発酵ブ
ロス（蛋白濃度2.0％）100mlを実施例１と同様に処理
し、濃縮液10mlを得た。次に、比較例１とは逆に100％
エチルアルコール40mlを40℃で攪拌しつつ、この中に該
濃縮液10mlを10分間で添加し、その後５℃まで冷却し
た。得られた結晶はトレハロース・２水和物の微細晶と
なり、かつ該微細晶は集合晶となってしまい、純度も90
％であった。
【００３０】
【発明の効果】本発明の方法により、純度の高いトレハ
ロース結晶を簡単に取得することができる。
ロース結晶を簡単に取得することができる。
【図１】 本発明の実施例で得られたトレハロース・２
水和物結晶の結晶構造を示す図面代用写真である。
水和物結晶の結晶構造を示す図面代用写真である。
Claims (1)
- 【請求項１】 トレハロース水溶液とアルコールを液量
比例でかつ同時に添加することを特徴とするトレハロー
スの晶析法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP1561593A JPH06269288A (ja) | 1993-02-02 | 1993-02-02 | トレハロースのアルコール晶析による単離精製法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP1561593A JPH06269288A (ja) | 1993-02-02 | 1993-02-02 | トレハロースのアルコール晶析による単離精製法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH06269288A true JPH06269288A (ja) | 1994-09-27 |
Family
ID=11893616
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP1561593A Pending JPH06269288A (ja) | 1993-02-02 | 1993-02-02 | トレハロースのアルコール晶析による単離精製法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH06269288A (ja) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN102924539A (zh) * | 2012-10-31 | 2013-02-13 | 南京工业大学 | 一种制备海藻糖晶体的方法 |
| CN109265495A (zh) * | 2018-11-22 | 2019-01-25 | 湖南汇升生物科技有限公司 | 一种生产高纯度结晶海藻糖的一步结晶工艺 |
-
1993
- 1993-02-02 JP JP1561593A patent/JPH06269288A/ja active Pending
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN102924539A (zh) * | 2012-10-31 | 2013-02-13 | 南京工业大学 | 一种制备海藻糖晶体的方法 |
| CN109265495A (zh) * | 2018-11-22 | 2019-01-25 | 湖南汇升生物科技有限公司 | 一种生产高纯度结晶海藻糖的一步结晶工艺 |
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