JPH03505976A - 多重突然変異スブチリシン - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】

重７然亦　スブチリシン 本発明は改良された酸化安定性と、標準洗剤調合物に加えた場合に汚れた衣類の 洗浄に優れた性能とを有する新規類の熱安定且つｐｉ（安定性スブチリシン類似 体、及びこのような類似体を製造するための方法に係る。特に、本発明は改良さ れたカルシウム結合能力を提供するように修飾されたカルシウム結合部位と、ス ブチリシンに存在する八ｓｎ−に１ｙ配列のいずれかの残基の欠失及び／又は置 換と、酸化安定性を改良するための１個以上のメチオニン残基の修飾とを含むス ブチリシン類似体の類に係る０本発明は更に、このようなスブチリシンを含有す る洗剤組成物及び洗浄用途におけるこのようなスブチリシン及び組成物の使用に 係る。 １Ａ１１ スブチリシンなる用語は、種々のＢａｃｉｌｌｕｓ種により産生される細胞外ア ルカリ性セリンプロテアーゼの群を意味する。これらの酵素はＢａｃｉｌｌｕｓ セリンプロテアーゼ、Ｂａｃｉｌｌｕｓスブチリシン又は細菌性アルカリ性プロ テアーゼとも呼称！ｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓにより産生されるＣａｒｌｓｂｅ ｒｇ型のスブチリシン及びＢａｃｉ！ｌｕｓ　５ｕｂｔｉｌｉｓａＤＹにより産 生されるスブチリシンの場合）又は２７５個の残基（Ｂａｃｉ　ｌ　ｌ　ｕｓ惺 荘紅匡匹匡住姐スブチリシン及びＢａａ　ｉ　ｌムユ５ｕｂｔｉｌｉｓ　ｖａｒ 、先見１」互し■上エロエｊｉｃｕｓのスブチリシンの場合）からなる単一のポ リペプチド鎖から構成される９種々のＢａｃ　ｉ　ｌ　ｌ　ｕｓ株に由来するス ブチリシンのアミノ酸配列を比較する場合、ＢＰＮ’スブチリシンの配列が標準 として使用される０例えば、、　ＣａｒｌｓｂｅｒｇスブチリシンとＢＰＮ’ス ブナリシンとの間に最高の相同度を与えるような配列の整列に基づき、　Ｃａｒ ｌｓｂｅｒｇスブチリシンの活性部位のセリンはアミノ酸配列の２２０位に位置 する場合であってもセリン２２１と呼称される。同一の基準に基づいてＣａｒｌ ｓｂｅｒｇスブチリシンのアミノ酸配列の２２０位は［ｌＰＮ’スブチリシンの ２２１位に「対応する４ｊということができる。これについては例えばＮｅｄｋ ｏｖ他、Ｈｏ　　ｅ−５ｅ　ｌｅｒ’ｓ　Ｚ、　Ｐｈ　５ｉｏｌ。 Ｃｈｅ＠、、　３６４．１５３７−１５４０（１９８３）を参照されたい。 ＢＰＮ’スブチリジンのＸ線楕３ｆｉ［Ｗｒｉｇｈｔ他、Ｎａｔｕｒｅ、　２２ １．２３５（１９６９）］によるど、＾ｓ　ｐ　３２、ｔｌ　ｉ　ｓ　６１及び Ｓｅ、２月を含むスブチリシンの触媒部位の幾何的形態は残基＾５ｐ１０２、） ｌｉｓ”及び５ｅｒｕｓを含む哺乳動物セリンプロテアーゼ（例えばキモトリプ シン）の活性部位とほぼ同一であることが判明した。 しかしながら、Ｂａｃｉｌｌｕｓセリンプロテアーゼと哺乳動物セリンプロテア ーゼとの間の全体的な相違は、これらが２つの無関傷なタンパク分解酵素の群に 属することを示している。 Ｂａｃｉｌｌｕｓスブチリシン群において完全なアミノ酸配列は６種のスブチリ シン、即ちＣａｒｌｓｂｅｒｇ［５ｖｉｔｈ他、、　Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅ ｍ、、　２４３．２１８４−２１９１（１９６Ｂ）］、ＢＰＮ’　［Ｍａｒｋｌ ａｔ＋ｄ他、Ｊ、　Ｂｉ。 コニ、　２４２．５１９８−５２１１＜１９６７）］、ｄ遺伝子産物［５ｔａｈ １他、Ｊ、　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、、　１５８．４１１−４１８（１９８４）］ 、ＤＹ［Ｎｅｄｋｏｖ他、前出］、Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｍｅｓｅｎｔｅｒｉｃｕ ｓ［５ｖｅｎｄｓｅｎ他、ＦＥＢＳ　Ｌｅ工見」−り、　１９１３．２２０−２ ３２＜１９８６）：］及びＢａｃｉｌ！ｕｓ　５ｕｂｔｉｌｉｓ　ｖａｒ、　１ ｌ−１ｏｓａｃｃｈａｒｉｔｉｅｕｓ［Ｙｏｓｈｉｍｏｔｏ他、　、Ｌ、　　Ｂ ｉｏｃｈｅｍ、、　　１０３．　１０６０−１０［３５（１９８８）］で入手可 能である。ＣａｒｌｓｂｅｒｇスブチリシンとＢｌ’Ｎ“スブチリシン（Ｎｏν ０スブチリシンとも呼称する）とは、８４個のアミノ酸とＢＰＮ’の１個の付加 的な残基が異なる（ＣａｒｌｓｂｅｒｇスブチリシンはＢＰＮ’スブチリシンの 残基５６に対応するアミノ酸残基を欠失する）。ＤＹスブチリシンは２７４個の アミノ酸を含み、３２個のアミノ酸位置において（ａｒｌｓｂｅｒｇスブチリシ ンと異なり、８２個のアミノ酸置換と１個の欠失においてＢＰＮ’スブチリシン と異なる（ＤＹスブチリジンはＢＰＮ’スブチリシンの残基５６に対応するアミ ノ酸残基を欠失する）。Ｌ位遺伝子産物のアミノ酸配列はＢ　Ｐ　Ｎ　’スブチ リシンのアミ、ノ酸配列に対して８５％の相同度を有する。このように、種々の ！□、山旦株からのスブチリシンのアミノ酸配列には広い相同が存在することが 明らかである。この相同は分子の特定の領域、特に触媒機構及び基質結合に関与 するような領域において完全である。このような不変の配列の例は一次及び二次 基質結合部位夫々５ｅｒＩ２”Ｌｅｕ”’−Ｃ：ｌｙ”’−ｔｌ：１ｙ）２８及 びＴｙ　ｒ　ｌ　０４ど反応性セリン（２２１）の付近の配列へ５０２１１１． ．（：１ｙ２１９４１，２２０．．５ｅｒ２２１−７４ｅｊ２２２−＾１　ａ２ ２　：ｉである。 スブチリシン分子は独自の安定性を示す。スブチリシンは広いｐ１１範囲にわた って完全に安定ではないが、尿素及びグアニジン溶液による変性に対して比較的 耐性であり、その酵素活性は８Ｍ尿素中で所定時開維持される。４未満の１３８ を有する溶液中でスブチリシンは迅速且つ非可逆的にそのタンパク分解活性を失 う。Ｇｏｕｎａｒｉｓ他、恒１工Ｒｅ　ｎ　４工と１ｖ、　ｌ、ａｂ、　Ｃ−ユ 、　３５．３７（ゴ９６５）は、スブチリシンの酸失活は一般的な電荷効果によ るのでなく、分子中の他の変化（例えば分子の内部疎水性部分におけるヒスチジ ン残基のプロトン化）によることご立証した。　Ｂａｃｉｌｌｕｓスブチリシン 類は温度及びｐＨに大幅に依存する速度で水溶液中で可逆的に失活する。４未満 又は１１以上のｐ）ｌ値で失活速度は非常に迅速であり、４．５〜１０．５のｐ ｈ＋では速度は著１．　＜遅いが、溶液のアルカリ度が増すにしたがって増加す る。この失活のメカニズムは完全には解明されていないが、自己消化がこのｐＨ 範囲で酵素不安定性に少なくとも部分的に関与していること示す資料は存在して いる。一般に、任意のｐｉｌ値では温度が高ければ高いほどスブチリシン失活速 度は速（嘱。 タンパク質の加水分解を必要とする工業プロセスにおけるプロテアーゼの使用は 操作条件下の酵素の不安定により制限されてきた。ちなみに、例えばタンパク質 性の染みを除去し易くするために洗濯用洗剤にトリプシンを配合する（例えばス イス、５ｃｈｎｙｄｅｒ社のＢｌｏ−３８）と、洗濯条件下で明らかに酵素不安 定の結果として非常に制限された成果しか得られなかった。更に、洗剤に適合性 の細菌性アルカリプロテアーゼが洗剤調合物中で使用されている。 多くの工業プロセスはほとんどの酵素の安定性範囲よりも高い温度で実施される ので、熱安定性の高いブロテアーゼは既に安定なプロテアーゼを必要とする洗剤 及び皮革脱毛のような所定の産業に有利であるばかりでなく、タンパク質を加水 分解するための化学的手段、例えば固形スープの製造のための植物及び動物タン パク質の加水分解を使用するような産業でも有用であり得る。 熱失活は酵素の産業上の使用を制限する最も重要な因子であり得るが、広いｐＨ 範囲にわたる有効性の必要や、変性剤及び酸化剤の使用といった他の因子も工業 プロセスにおけるプロテアーゼの使用に悪影響を与え得る。したがって、温度、 ｐＨ１変性剤及び酸化剤並びに種々の産業により必要とされる他の条件に関して 改良された安定性を有する１０テアーゼの頚を得ることが望ましい。 過去数年間の間に洗剤調合物には大きな変革があり、特に環境及び消費者の要求 を満たすために、リン酸が代替ビルグーに置換され、液体洗濯用洗剤が開発され た。これらの変革は従来の洗剤酵素に改変の必要を生じた。より具体的には、液 体洗濯用調合物中でより高い貯蔵安定性と、種々の市販洗剤調合物中でより広い 範囲のｐＨ及び温度安定性及び活性を有するタンパク分解酵素を使用することが 望まれるようになった。 洗剤調合物中で有用な修飾スブチリシンを製造する１つのアプローチは米国特許 第４７６００２５号に開示されており、この文献によると、Ｂａｃｉｌｌｕｓ　 ０１１１１犯」工牡ユｅｎｓ（Ｂ、　！Ｌ！ＬＬｏ１ｉ　ｕｅｆａｃｉｅｎｓ） のスブチリシンの＾、ｐ）２、Ａ　ｓ　ｎ　ｌ　％　％、７．ｒ＋６４、Ｍ　ｅ 　１２２２、に１．＋Ｉ−Ｈｉｓ＠４、に１，１１１１、ｐｈｅＩＩＩ、５ｅｔ ３コ、７）、、２１７及び／又はに１．Ｉｓ？位置における突然変異は安定性の 変化、配座の変化をもたらすか又は酵素の「処理」を変化させることが認識され た。特に、ｌ＋ｌ　ｅ　ｔ２２２を＾ｌａ又はＳｅｒに突然変異させると確実に 酸化安定性の改良が得られたが、合成ペプチド基質スクシニル−Ｌ−アラニル− Ｌ−アラニル−Ｌ−プロリル−し−フェニルアラニル−ｐ−二トロアニリド（Ｓ ＾＾ＰＦｐＮ）に対する酵素の比活性は非突然変異酵素に比較すると減少した。 Ｇｌｙ’ｓｓを＾ｌａ、＾ｓｐ、１ｄｌｙ、Ｐｈｅ、　Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、Ａｓｎ 、＾ｒｇ又はＶａｌに置換すると、酵素の動力学的パラメータが変化することが 示された。しかしながら、開示されている突然変異のうちで野生型酵素よりも高 い高温安定性又は野生型よりも広いｐｌ！範囲にわたる安定性を有する類似体を もたらすものは皆無である。 別のアプローチとしてＴｈｏｍａｓ他、Ｎａｔｕｒｅ、　３１８．３７５−３７ ６（１９８５）は、ＢＰＮ’スブチリシンの＾ｓｐＩを＾ｓｐからＳｅｔに変更 することによりスブチリシンのｐ８依存性が改変され得ることを開示した。この 変更は活性部位から１４〜１５人の表面電荷の変化を意味する。しかしながら、 Ｔｈｏｍａｓ他は１個の非帯電残基を相互に置換する場合のように表面電荷が変 化ししない場合には改良を表明するに至っていない。 米国特許出願第８１９２４１号及び同７７１８８３号に記載されている第３のア プローチは、プロテアーゼに存在するＡｓｎ−Ｇｌｙ配列の欠失及び／又は修飾 により特徴付けられるｈ！■Ｉｕｓセリンプロテアーゼ頚似体の類類似る。 Ｔａｋａｇｉ他、Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｗ、　２６３．１９５９２−１９５ ９６（１９８８）は、イソロイシン３１をロイシンに変更すると、野生型酵素に 比較してスブチリシンの活性を増加できることを開示している。 １１Δｉ扛 本発明は改良されたｐＨ安定性、熱安定性及び酸化安定性を有することを特徴と するスブチリシン類似体の類を提供し、その結果、このような類似体を特に洗剤 調合物及び安定プロテアーゼを必要とする他のプロセスで有用にするものである ０本発明のスブチリシン類似体は、（１）天然に産生するＢａｃｉｌｌｕｓスブ チリシンのアミノ酸配列中に存在するカルシウム結合部位の１個以上のアミノ酸 残基を負に帯電されたアミノ酸で置換し、（２）天然に産生するＢａｃｉｌｌｕ ｓスブチリシンのアミノ酸配列中に存在する任意の＾５ｎ−Ｇｌｙ配列のいずれ かの残基を欠失又は置換させ、（３）１個以上のメチオニン残基を別のアミノ酸 残基、好ましくはアラニン又はロイシンで置換し、（４）触媒トライアト（＾ｓ 　ｐ　２２、Ｈｉ　ｓ　ｌ　４、Ｓｅ、２ｍ＋）の周囲の１個以上のアミノ酸残 基を別のアミノ酸で置換することにより修飾された天然に産生するＢａｃｉｌｌ ｕｓスブチリシンのアミノ酸配列を有することを特徴とする０本発明は更に、本 発明のスブチリシン類似体を含有する洗剤組成物と、このようなスブチリシン票 似体及び組成物の洗浄用途における使用にも係る。 本発明のスプチリシン類似体は改良された熱安定性、ｐＴＩ安定性、酸化安定性 、改良された比活性及び広い基質特異性を示し、したがってこのような類似体を 含む洗剤調合物の洗浄力を増加させるものである。特に、本発明のスブチリシン 類似体は「野生型」スブチリシンに改良された熱安定性、高いｐｕ安定性、高い 酸化安定性及び高い比活性を実現する。 更に、本発明は上記のようなスブチリシン類似体をコードするコドンを有するＤ ＮＡ配列にも係る。 本発明は更に、上記のようなスズチリシン類似体をコードする核酸を有する宿主 細胞・を含むスズチリシン類似体の製造方法を提供する。このような細胞におい て、スズチリシン類似体をコードする核酸は染色体又は染色体外であり得る。宿 主′ＭＥ胞は好ましくは本発明の類似体を単離し易くするようにプロテアーゼを 分泌！７ない株から選択される。 更に、本発明はカルシウム結合部位を修飾するか及び、／又はＡｓｎ−Ｇｌｙ配 列中のアスパラギン　特に表１に開示するようなアミノ酸配列中の１０９及び２ １８位に対応するスズチリシンのアミノ酸配列中の位置におけるアスパラギン残 基をアスパラギン以外のアミノ酸に１換し、表１に開示するようなアミノ酸配列 中の１２４及び２２２位に対応するスズチリシン以外のアミノ酸に置ｔａ　Ｌ、 酵素の活性部位の周囲のアミノ酸残基を天然に産生するアミノ酸以外のアミノ酸 に１換することにより、スズチリシンの熱、ｐＨ及び酸化安定性を改良するため の方法と提供する。 ＠１ム里員全ユ乳 図１はアンヒドロアスパルチルグリシンを形成するために表１に示すようなスズ チリシンの２１８及び２１９位に見出されるようなＡｓｎ−にｌｙ残基の環化を 概略的に示すと共に、その塩基触媒加水分解を示す模式図、図２はＢａｃｃｉｌ ｕｓ証ｊ工Ｕユ（枯草菌）株Ｑ　Ｂ　＋、　２７の魁Ｅ−＾遺伝子を含むＥｅｏ ＲＩ　−ＫＢｇ　Ｉ遺伝子フラグメントの部分的制限地図を、旺二Δ遺伝子及び フランキング配列の部分的制限地図と共に示し、図３はプラスミドρ＾ＭＢＩＩ の部分的制限地図、区４は枯草菌宿主細胞から［Ｓｅｔ］２′”−スズチリシン の合成を導くプラスミドｐＡＭＢ１１３の構築における種々の段階を示すフロー チャート、図５はｐ＾ＭＢ３０プラスミドの部分的制限地図、図６はｐＡＭＢ１ ０６の構築を示ず説明図１１図７はＭ１３　ｍｐ１９　ａｐｒ八１へ４３の構築 を示ず説明図、図８は漂白剤中における［Ａｓ、７ｇ、Ｓｅｒ’°９、Ｓ　ｅ　 ｒ　２１１、＾Ｉ＆２２２］スブチリシンの安定性を示すグラフ、図９及び図１ ０は［八５ｐ７１、Ｓｅ　ｒ　ｌ　Ｑ　ｌ、Ｓｅ、２１１．　Ａｌａ２２２］ス ブチリシンの洗濯性能を示すグラフである。 口の−　ｆＩ＋ 本明細書中で使用される「スズチリシン」なる用語は、分泌以前又は分泌時に成 熟酵素から切断されるリーダー配列を欠失する酵素の成熟分泌形を意味する１本 発明にしたがって修飾され得るスズチリシンの非限定的な例は、Ｃａｒｌｓｂｅ ｒｇスブチリシン、ＢＰＮ’スブチリシン、枯草菌のａｌｒＡ遺伝子産物、ＤＹ スブチリシン、Ｂａｃｍｊ」…懸μ工ｔｅｒｉｃｕｓのスズチリシン及びＢ、５ ｕｂｔｉｌｉｓ　ｖａｒ、　Ａ−シーＬ９ｓａｅｃｈａｒｉｔ、１ｃｕｓのスズ チリシンのアミノ酸配列により表される天然に産生ずるスズチリシンである。Ｃ ａｒｌｓｂｅｒｇスブチリシンのアミノ酸配列は鐘コ上他、む−Ｄｉ旦。ユニ旺 ｍ、、　２４３．２１８４−２］、９１（１９６８）に記載されている。　１３ ＰＮ’スブチリシンのアミノ酸配列はＭａｒｋ！ａｎｄ他、ム、」■９上工Ｌす Ａ−９旺ｇ、　５１９８−５２１Ｈ１９６７）に記載されている。ＤＹスブチリ シンのアミノ酸配列はＮｅｄｌｏｖ他、Ｌｏ−ｙ−ｉｒ’ｓ、、Ｚ、、−１旦Ｌ シｊ−幻１工旦ｅｍ、、　３６４．１５３７−ｔ５４０（１９８３）に記載され ている。１３弘虫、、Ｌ二重−江吐弘匡ｙ凡のスズチリシンのアミノ酸配列は５ ｖｅｄｓｅｎ他、ＦＥＢＳ　ｊ、ｅｔ、ｔｅｒｓ、　Ｌ９６．２２０−２３２（ １，９８６＞に記載されている。Ｂａｃｉｌｌｕｓ　５ｕｂｔｉｌｉｓ　ｙａｒ 、−」Ｌ佳ｏ　ｓ　ａ　ｃ　ｃ　ｈ　ａ、Ｌｉ壜ｕ　ｓのスズチリシンのアミノ 酸配列はＹｏｓｈ　ｉ論Ｏ１炙）他２Ｊ、、ユＪ亘旦ａ−２１世、　１０６０− １０６５（１９８８）に記載されている。枯草菌の仕込遺伝子産物のアミノ酸配 列は５ｔａｈ　ｌ他、ジューバーＣ」−ｉロユ１区、　４１１−４１８（１９８ ４）に記載されている。このようなスズチリシンのアミノ酸配列はプ考として本 明細書の一部に加える。このようなスズチリシンは分子を安定化するために必要 なカルシウム結き部位を有することを特徴どする。 本発明によると、カルシウムに結合する改良された能力を有するスズチリシン類 似体の類が提供される。特に高温を必要とするような用途では粉末及び液体洗剤 中でスズチリシンを安定化させるためにカルシウムが使用されている。 本発明はカルシウム結合を増加するためにスズチリシン分子のカルシウム結合部 位の修飾に係る。本明細書中で使用される「カルシウム結合部位の修飾」なる用 語は、スズチリシンのアミノ酸配列中に存在するカルシウム結合部位の領域にお ける１個以上のアミノ酸を、負に帯電されたアミノ酸で置換し、その結果、形成 されるスズチリシン類似体が付加的な負の電荷を有するようにすることを意味す る。スズチリシン中の１つのカルシウム結合部位は表１に示すアミノ酸配列に関 して次のアミノ酸、即ちＧｌｕ２、＾５ｐ４１、Ｌｅｕテ５、　＾５ｎ７６、　 Δｓｎ’フ、　５ｅｒ７ａ、　　ｌｉｅ’ラ　　Ｇｌｙ”、　　Ｖａｌ”、、　 　Ｔｈｒ””及び７．ｒ２１４を含むことが知見された。本発明は好ましくは。 カルシウム結合部位に存在するアミノ酸の１個以上を＾ｓｐ及びＣ１ｕ、より好 ましくはΔｓｐのような「負に帯電された」アミノ酸で置換することを含む。カ ルシウム結合部位のＡ　Ｓ　Ｉｌ＋　４１は負に帯電されたアミノ酸であるが、 本発明のＩＲ様は＾ｓｐ４１をＧｌｕ”に置換することを含む、別の！ｇ様は＾ ｓ　ｐ　４１以外のアミノ酸への置換に係る。 本発明の１好適態様は＾ｓｎｎが＾ｓｐＩに置換されたスブチリシン類似体を含 む、別の態様ではＩｌｅ”が＾ｓ　ｐ　？　ｍに置換される。別の態様はカルシ ウム結合部位の上記好適修飾と、＾ｓｎｔｏｗ及びＡｓｎ”噛・の５ｅｒｔｏ會 及びＳｅｒ”欄への置換とを含み、こうして２つの不安定な＾５ｎ−Ｇｌｙ配列 を除去する。本発明のより好適な態様は、カルシウム結合部位及び＾５ｎ−Ｇｌ ｙ配列の上記好適修飾と、メチオニン２２２がらアラニンへの置換との組み合わ せを含む、別の好適態様はカルシウム結合部位、Ａｓｎ−（：Ｉｙ配列及びＮｅ ｔ−２２２の上記好適修飾と、アゾカゼイン基質又はＳ＾＾ＰＦｐＮ基質に対す るスブチリシンの特異性を増加するようなアミノ酸修飾、即ちメチオニン１２４ をロイシン又はアラニン及び／又はイソロイシン３１をロイシン、及び／又はセ リン３３をスレオニン、及び／又はセリン６２をアスパラギン、及び／又はセリ ン６３をグリシン、及び／又はチロシン２１７をロイシン及び／又はアルギニン ２４７をロイシン又はメチオニンに変更するような置換との組み合わせを含む。 上記カルシウム結合部位以外に、スブチリシンは１個以上の別のカルシウム結合 部位をもち得る１本発明の範囲は、スブチリシンに存在し得る全カルシウム結合 部位の１個以上の修飾を包含する。修飾可能な任意の特定のスブチリシンにおけ るカルシウム結合部位の数は多くの因子、即ち特定のスブチリシン、スブチリシ ン類似体の個々の用途に依存する。スブチリシンに存在し得る他の潜在的カルシ ウム結合部位は（１）＾５ｐ１４０及びＰｒｏ　’フ２、（２）Ｐｒｏ”及びＧ １ｎ２マ１、並びに（３）Ｐｒｇ””及びに１ｕＩＩ％又は＾ｓ　ｐ　ｌ　＠　 ？を含む、各分子に存在する個々のカルシウム結合部位は、修飾すべき個々のス ブチリシンに依存する。上述のように、上記潜在的カルシウム結合部位における アミノ酸の１個以上の置換は改良された熱及びｐＨ安定性を有するスブチリシン をもたらす。 置換の例は＾ｓｐ　ｌ　４　Ｑをに１ｕ１４０．ｐｒ０１？２を＾ｓ　ｐ　ｌ　 ７２、Ｐｒ　ｏ　＋　４を＾５ｐ１４、Ｇｉｎ’〒１を（１ｕ２７１、に１ｕ１ ！？を＾ｓｐＩ！？への置換を含む。 スブチリシン分子のカルシウム結合部位の修飾に加えて、スブチリシンに存在す る任意のＡｓｎ−Ｇｌｙ配列が欠失又は置換されていると好適である。米国特許 出願第８１９２４１号に既に開示されているように、Ｂａｃｉｌｌｕｓスブチリ シンの１０９−１１０位、特に２１８−２１９位に維持される配列へ５ｎ−Ｇｌ ｙはこれらの物質のｐｎ不安定性に関与する主要な因子であることが確認された く図１）、スブチリシン分子がら不安定な要素＾ｓ　ｎ　２　ｌ　＠−に１，２ １１を除去するために、＾ｓ　ｎ　２１　ｅをアスパラギン以外の任意のアミノ 酸に置換するが及び／又は（１，２１％をグリシン以外の任意のアミノ酸に置換 することが開示された。同様に、１０９−１１０位の不安定な＾５ｎ−Ｇｌｙ要 素を修飾することにより、この文献に記載されている類似体に安定性を与えるこ とができると記載された。 更に、既に指摘したように、本発明のＢａｃｉ　ｌ　ｌ　ｕｓスブチリシンの類 似体の好適類は、カルシウム結合部位が修飾されている上に、Ｂａｃｉｌｌｕｓ スブチリシン中の＾５ｎ−Ｃ１ｙ配列を含む位置が類似体中で＾５ｎ−Ｇｌｙを 含まず、特にＢａｃｉｌｌｕｓスブチリシンよりも＾５ｎ−Ｇｌｙ配列が少ない ようなアミノ酸配列を有する。最適には、表１に示すようなアミノ酸配列中の２ １８位に対応する位置はアスパラギニル残基を含まず、別のアミノ酸、好ましく はセリン、バリン、スレオニン、システィン、グルタミン及びイソロイシンから 選択されるアミノ酸の残基を含む。アスパラギンを所定のアミノ酸に置換した結 果として（例えば芳香族アミノ酸の存在により導入され得るような立体障害又は プロリンの存在により導入され得るような３次構造の変化により）活性部位配座 に影響し得るような程度まで、このようなアミノ酸で置換することは通常あまり 好ましくない。同様に、アスパラギンを他のアミノ酸に置換する結果として活性 部位の近傍に帯電基（例えばアスパラギン酸）が導入され得るような程度までこ のような置換を行うことは好ましくない０本発明の好適態様の例は修飾されたカ ルシウム結合部位と、スブチリシンの＾５ｎ−ＣＩ’ｙ配列のｌ：５ｅｒ２１＠ ］修飾とを有する類似体である。 本発明から予想される類似体の別の態様は、修飾されたカルシウム結合部位を有 しており、スブチリシンＢＰＮ’又は４値遺伝子産物の八５ｎＩ０Ｉが好ましく はセリンにより置換されており、１１０及び／又は２１９位のグリシン残基が種 々のアミノ酸残基により置換されているような類似体である。他のスブチリシン では、１又は複数のカルシウム結合部位の修飾及びＣａｒｌａｂｅｒｇ又はＤＹ スブチリシンの残基６２のＡｓｎ又は残基６３のＧｌｙの置換も本発明に含まれ る。 更に、既に明記したように、本発明のＢａｃ　ｉ　ｌ　ｌ　ｕｓスブチリシンの 類似体の好適類は、カルシウム結合部位及びＡｓｎ−Ｇｌｙ配列の修飾に加えて 、スブチリシン類似体の酸化安定性を改良するために２２２位のＭｅｔ残基が別 のアミノ酸、好ましくは＾ｌａに置換されているようなアミノ酸配列を有する。 本発明に含まれる類似体の別の態様は、アゾカゼイン及び合成ベアチド（例えば ５ＡＡｌ’ＦｐＮ）基質に対する酵素の比活性を増加するために、活性部位残基 〈＾Ｓ、＋２、Ｈｉｓ’“及び５ｅｒ２２１）の周囲のアミノ酸を置換を含む。 このような修飾はＭｅ１２２２をＡｌａに置換した類似体で特に重要であり、こ れは、上述のように、＠　ｅ　Ｉ：　２２２をＡｌａに置換した類似体が非突然 変異酵素よりもＳ＾ΔＰＦｐＮ基質に対して低い比活性を有するためである　Ｍ 　ｅ　Ｌ？２２−Ａｌａの置換を含む任意の類似体の比活性は、、Ｎｅｔ、”’ −１，ｅｕ、Ｎｅｔ”’−八へａ、　　ｌｉｅ”−Ｌｅｕ、Ｓｅｒ”−Ｔｈｒ、 Ｓｅ、６２−＾ｓｎ、、　Ｓｅｒ”−Ｇｉｙ、Ｔｙｒ”’−Ｌｅ＋、＋、＾ｒ　 ｇ　２″”Ｌｅｕ又はＮｅｔの１換の１以上を組み込むことにより増加すること ができる。 実質的な１のタンパク質３分ｉ・ビする能力と、洗剤プロテアーゼと製造するた めに慣用されているという事実とにより、　Ｂａｃｉｌｌｕｓ微生物は本発明の スブチワシン類似体の組換製造のための好適宿主を表す９はとＸ７どのＢａＣ１ １１，１５種はアルカリ性及び中性ブ１１テアーゼを汁泌するので、枯草菌の内 因性アルカリ性及び中性プロテアーゼに突然変異を導入し、突然変異１７たスブ チリンンが他のプロテアーゼを含まない媒質中て゛枯草菌により産生及び分泌さ れ得るようにすると好適である。したがって本発明は更に、内因性プロテアーゼ の合成を阻止され且つ本発明のスブチリシン類似体を合成及び分泌する能力を維 持するような枯草菌の突然変異株を提供する。 以下に詳述するように、本発明のスブチリシン類似体のｐＨ安定性、熱安定性、 酸化安定性及び洗剤調合物中における安定性は野生型り粒遺伝子産物スブチリシ ン及びＣａｒｌｓｂｅｒｇスプチリシンよりも著１．　＜高いことが知見された 。 本発明の全スブチリシン類似体は以下の手順にしたがって製造され得る。 ］〉枯草菌から代表的なスブチリシン遺伝子り値の単離。 ２）所望の修飾を行うためにオリゴヌクレオチド部位特異的突然変異誘発を使用 できるようなベクターで仕込遺伝子のクローニング。 ３）形成されたＤＮＡを部位特異的突然変異誘発及び配列決定し、所望の突然変 異の存在を確認。 ４）枯草菌で突然変異誘発酵素の合成を導くための発現ベクターの構築。 ５）スブチリシン及び中性プロテアーゼを合成しない突然変異枯草菌株の構築。 ６）：ａ胞外増殖培地中で酵素の単離とその精製。 ７）内因性プロテアーゼの合成を阻止するために予め突然変異させた枯草菌株の 染色体に、改良された酵素をコードする遺伝子を挿入するための手順の実施。 本明細書中、特定のスブヅーリシン想似体は括弧内に置換アミノ酸を表すことに より示される０例えば。Ｊ：Ｓｅｒ”’］スダチリシンはアミノ酸１０９位にセ リンを有するスブチリシン分子を表し、ｒＳｅ　ｒ　ｌ　Ｏ９Ｓｅ　ｒ　２１１ 　］スプチリシンはアミノ酸の１．０９及び２１８位にセリンを有するスブチリ シン分子を表す、実施例１では、スブチリシンをコードする己遺伝子を枯草菌ゲ ノムから単離する。実施例２ではＵ■−Δ、遺伝子に部位特異的突然変異を誘発 する。実施例３では突然変異した引肛入遺伝子を大む発現ベクタ・−を構築する 。実施例４では［Ｓｅｒ”’］スブチリシン類似体を製造する。実施例５は［５ ｅｒ１０Ｊ、、、２＋−スブチリシン叩似体の製造について記載する。 実施例６は口＾Ｆｉ　ｐ　′’　＋　Ｓ　ｅ　ｒ　”　’　、Ｓｅ　ｒ　２’　 ８］スブチリシン類似体のＷ　ｍについて記載する。実施例７は［八ｃ　ｐ　？ 　＆　、　Ｇ　ｌ　、　７９　、　Ｓ　ｅ　ｒ　ｌ　Ｑ　９゜Ｓ、ｒ２１リスブ チリジン間似体の製造について記載する。 実施例８て゛は［八ｓ　ｐ７６　、　Ｓｅ　ｒ　ｌ　Ｏ！　、　Ｓｅ　ｒ　２１ ６．＾１ａ２２”］スブチリンン顎似体を製造する。実施例９では［八ｓ　ｐ　 ７も３　ｅ　ｒ　ｌｏ　Ｓ　、　Ｓ　ｅ　ｒ　２１　ａ。 ＾１ａ２２７］スブチリシン類似体遺伝子を部位特異的突然変異誘発のためにバ クテリオファージ８１３ｍρ１３に移す。実施例１０てはｊｌｅｕ３１．＾ｓｐ ７＋ｉ、５ｅｒ１０９．３ｅ、２０．＾１ａ２２２］スブチリシン雇似体を製造 する。実施例１１は［八ｓｐ　１６　、　Ｓｅ　ｒ　ｌ　Ｏ！ｌ　、　Ｉ−ｅ　 ｕ　ｌ　２４　、　Ｓｅ　ｒ″′、Ａｌａ２２２］スブチリシン顛似体の製造に ついて記載する。 実施例１２では検出可能な細胞外プロテアーゼを産生じない枯草菌の２つの突然 変異株を構築する。実施例１３は突然変異旺植遺伝子を枯草菌の染色体に組み込 むための手順を記載する。実施例ゴ４では野生型及び突然変異ｍスブチリンンを 単離及び精製する９実施例１５．１６．１７．１８及び１９は安定性、活性及び 洗濯性能に関する本発明のスブチリシン類似体の特徴について記載する。 本発明の７．ブチリシン類似体以外に本発明の洗剤組成物は以下の成分を含有し 得る。 （ａ）アニオン性、非・イオン性もしくは両性であり得る少なくとも１種の界面 活性剤又は水溶性石鹸、典型的には夫々洗剤組成物の５−３０及び１〜５重１％ の割合でアニオン性界面活性剤（例えば直鎖アルキルアリールスルホネ−１・） と非イオン性界面活性剤（例えばアルキルフェニルポリグリコールエーテル）と の混合物を使用する。 （ｂ）好ましくは共在金属・ｆオン封鎖ｍ能を有する１種以上のビルダー、トリ ポリリン酸ナトリウム、クエン酸ナトリウム、ケイ酸ナトリウム及びゼオライト がこのような化合物の例であり、通常洗剤組成物の１０〜７０重量％を構成する 。 （ｃ）典型的には組成物の３０重量％まで配合される漂白剤、好ましくはペルオ キシ化合物〈例えば過ホウ酸ナトリウム）。 （ｄ）カルボキシメチルセルロース、光学増白剤及び香料のような助剤、必要に 応じて洗濯媒質のｐＨを７．０〜１０．５の範囲にするようにｐｎ調整剤を加え る。 洗剤組成物は１種以上の本発明のスブチリシン類似体を有効量含む０本明細書の 記載において「スブチリシン顛似体の有効量」なる用語は特定の洗剤組成物中で 必要な酵素活性に到達するために必要なスブチリシン類似体の量を表す、このよ うな有効量は当業者に容易に確認され、使用される特定のスブチリシン顛似体、 洗浄用途、洗剤組成物の特定の組成、液体又は乾燥組成物のいずれが必要か等の 多くの因子に基づく。 本発明の粒状スブチリジン類似体調製物は、洗剤組成物１ｏｏｆ１当たり少なく とも０．１＾ｎ５ｏｎ単位（以下、＾Ｕと呼称する）、好ましくは０．５〜２． ５ＡＵの酵素活性を与えるように計算された量を添加される。必要に応じて１０ ０％までは無機充填剤、好ましくは硫酸ナトリウムを加えてもよい。 液体洗剤組成物は好ましくは非水性媒質中の酵素スラリーから調製され得る。典 型的には、このようなスラリーは液体非イオン性界面活性剤（例えばＴｅｒｇｉ ｔｏｌ　１５　Ｓ　９又はこのような界面活性剤の混合物）中の微粉砕スプチリ シン麗似体濃１ｆｉ！物の懸濁液から構成され得る６通常、スラリーは更に、場 合により懸濁安定剤（例えばヒユームドシリカ（＾ｅｒｏｓｉｌ　２００））と 混合した１種以上の無機充填剤（例えば微粉砕硫酸ナトリウム）を含有している 。　Ｔｅｒｇｉｔｏｌ及び＾ｅｒｏｓｉｌは登録商標である。 本発明のスブチリシン類似体は、液体洗剤組成物１００．当たり少なくとも０， １＾Ｕ、好ましくは０．５〜２．５＾Ｕのプロテアーゼ活性を与えるように計算 された量を添加される。 洗剤組成物は通常通り、例えば成分を相互に混合することにより調製され得る。 あるいは、プレミックスを形成し、これをその後、残りの成分と混合してもよい 。 上記良好な安定性及び活性特性により、本発明のスブチリシン頂似体はタンパク 分解酵素が一般に使用される全分野で使用され得る０本発明のスブチリシン類似 体は特に、洗剤及びクレンザ−又は染み抜き剤、製革用脱毛剤として、食品産業 でタンパク質加水分解物の製造用として、更に血清学分野で不完全抗体の検出用 として使用され得る１食品産業及び血清学で使用する場合、本発明のスブチリシ ン類似体は他の酵素調製物とは対照的に、固体又は溶解形態ですぐれた安定性を 有しており、スブチリシン類似体を水溶液中で安定化するために生理学的に許容 可能なＩのカルシライオンが必要でないという点で特に有利である。 以下の実施例は本発明を更に説明するものであるが、本発明はこれらの個々の実 施例に限定されないものと理解されたい。 支ｍ 枯草菌株ＱＢ１２７（ｋハ又１ｅｕＡ旦５ａｃｌｌ”−２００）［Ｌｅｐｅｓａ ｎｔ他、町ｏ１ｅｃ、　Ｇｅｎ、　Ｇｅｎｅｔ、、　１１８．１３５−１６０（ １９８２）１はオハイオ州、コロンブスに所在のオハイオ州立大学のＢａｃｉｌ ｌｕｓ　　Ｇｅｎｅｔｉｃ　５ｔｏｃｋ　Ｃｅｎｔｅｒから入手した。この株は 、５ａｃＵｈ２００突然変異の多面的効果により同一遺伝子５ａｃＬ二株に比較 して細胞外セリンプロテアーゼ、金属プロテアーゼ、α−アミラーゼ及びレバン スクラーゼを過剰に産生する［Ｌｅｐｅｓａｎｔ他、辷ｎ　Ｓｃｈｌｅｓｓｉｎ ｇｅｒ、　Ｄ、編、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏ　　、　１９７６、　Ａｍｅｒｉｃａ ｎ　５ｏｃｉｅｔｙ　ｆｏｒ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ、　Ｗａｓｈｉｎｇｔ ｏｎ、　Ｄ、Ｃ，、ｐ、　６５（１９７６）１．　したかって、株ＱＢ１２７は スブチリシンをコードする仕込遺伝子を単離するための適切なりＮＡソースであ る。 ５ａｉｔｏ他、　Ｂｉｏｃｈｉｍ、一旦ユｏ　　ｈ　　ｓ、　　Ａｃｔａ、　　 乙ζ、　　６１９−６２９（１９６３）の手順にしたがって枯草菌株ＱＢ１２７ からゲノムＤＮＡを単離した。精製した染色体ＤＮＡをＥｅｏＲＩ制限エンドヌ クレアーゼで完全に消化した。 形成されたＤＮＡフラグメントを低融点アガロースゲル上で電気泳動により分解 し、４．４〜８．０キロベース（ｋｂ）範囲のフラグメントを単離した。これら のフラグメントを、高温でより高いコピー数を示し且つカナマイシン耐性を与え る大腸菌（Ｅ、　ｃｏｌｉ）プラスミドであるｐｃＦＭ９３６　（Ａｍｅｒｉｃ ａｎ　ＴｙｐｅＣｕｌｔｕｒｅ　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎ、　１２３０１　Ｐａｒ ｋｌａｗｎ　Ｄｒｉｖｅ、　Ｒｏｃｋｖｉｌｌ。 Ｍａｒｙｌａｎｄから入手した八、Ｔ、Ｃ，Ｃ，Ｎｏ、　５３，４１３）に連結 した。 ベクターをＥｅｏＲｌで消化し、連結前に子ウシ腸アルカリホスファターゼで脱 リン酸化した。 連結産物を大腸菌Ｃ６００（八ｍｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ　Ｃ ｏ１１ｅｃｔｉｏｎ、　１．２３０１　Ｐａｒｋｌａｗｎ　Ｄｒｉｖｅ、　Ｒｏ ｅｋｖｉｌｌ、　Ｍａｒｙｌａｎｄからの八。 Ｔ、Ｃ，Ｃ，Ｎｏ、　２３７２４）に導入し、１０μｇ／ｙ（！カナマイシンを 補充したし一寒天培地で一晩インキュベーション後、カナマイシン耐性宿主細胞 を選択した。選択した宿主細胞を４２℃で４時間・インキュベートすることによ りプラスミドＤＮＡを増幅した。次にコロニーをニトロセルロースフィルターに 移し、ＧｒｕｎｓＬｅｉｎ池、ｍら」へ佳、＾ｃａｄ、５ｃ１−（ＩＪｓＡ）、 　７２−、３９６１（１９７５）により記載されているコロニーハイブリダイゼ ーション手順にしたがって処理した９ オリゴヌクレオチドプローブを使用してｐｃＦ８９３６Ｊ二でスブチリンン遺伝 子念生息させるコロニーをスクリーニング［−入？　、　ＢｅａｕｃａＨｅ他、 ＴｅＬｒａｈｅｄｒｏｎ　１．ｅｔｔ、ｅｒｓ、　２２．１８５９−１８６２（ １，９８１）により記載されでいる亜リン酸法により合成したプローブは、＆、 ！９ＬＮ遺伝子産物のアミノ末端に対応するヌクレオチド配列： ５’　　ＧＣＧＣΔ＾ＴＣＴにＴＴＣＣＴＴ＾丁Ｇｆ；Ｃ３′を有していた（Ｗ ｏｎｇ池、ヒどｊ±□〜■ｊ−一旺辷」賂２υ−９影１、１＋８４−１１８８（ Ｎ９８４）；　５ｔａｈｌ他、。シ」ｙ」ｅｒｉｏｌ、−、１５旦、４１１−４ １８（１９８４））。５５°Ｃのハイブリダイゼーション温度を使用（２、合計 ４００の′：ｌｌコニ−から５個の陽性のコロニーを確認した。陽性コロニーの １つからのプラスミドＤＮ＾をｐｃＦＭ９３６　吐ｄと命名した。 プラスミドｐｃＦＭ９３６　吐ｄをＥｃｏＲｌ単独、ｆｌｉｎｄＩｌｌ単独及び ンン遺伝子のＥｃｏＲｌフラグメントの寸法は５ｔａｈｌ他の前出の文献中に記 載されている寸法に合致したが、その他に記載されていない数個のｔｌｉｎｄ１ 部位も発見された。実施例３に記載するように、）Ｉｉｎｄ１部位の２つをスブ チリシン遺伝子の遺伝子操作で使用した。 制限酵素消化物が５ｔａ１１１他の前出の文献により報告されている結果に一致 することを確認するごとにより、枯草菌ＱＢ１２７ゲノム［ｌｌＮΔの大きい６ ．５ｋｂ　匹且Ｒｌフラグメントは祉工に遺伝子、その調節配列及び無関係なフ ランキング配列と有すると判断された。このことは、Ｓａｎｇｅｒ他、Ｊ、　Ｍ ｏ１．　Ｂｉ±Ｌ、辷１３．１６ｉ−１７８（１９８０）により記載されている ジデオキシチェーンターミネーション法を使用するＤＮＡ配列決定により確証さ れた。図２に示すような６．５ｋｂ　ＥｃｏＲｌフラグメントの３、Ｏｋｂ　Ｅ ｃｏＲＩ−…−１サブフラグメントも吐Δ遺伝子、その調節配列及び無関係のフ ランキング配列を含むことが判明した。　ヘ、Ｌ！！ｊ　−ＥｃｏＲｌフラグメ ントは５ｔａｂｌ他により２．５ｋｂの長さであると報告されているが、この文 献図１の説明において図１の目盛りと図中に示されたフラグメンｌ〜とを比較す ると、５ｔａｈｌ他においてさえも石１−ＥｃｏＲＩフラグメントは２　、５　 ｋ　ｂより実質的に大きいことが明らかである。 Ｂａ仕ｊｌｕｓ宿主系のクローニングベクターであるプラスミドトムＭＢ１１を 次のように構築しブご、１プラスミドｐＴｃ４０２＜Ｎｏｒ口］ｅｒｎ　Ｒｅｇ ｉｏｎａｌ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、　Ｕｎｉｔｅｄ　 ５ｔａｔｅｓ　Ｄｅｐａｒｔ、ｍｅｎｊ、ｏｆ　Ａｓｒｉｃｕｌｔｕｒｅ、　Ｐ ｅｏｒｉａ、　１ｌｌｉｎｏｉｓ、株番号ＮＲＲＬ　Ｂ−１５２６４）をＲｓａ 、！制限エンＩζヌクレアーゼで部分的に消化［、）２゜予めしｎｃ、ｌｌで消 化しておいたＮ１３　吐１８（Ｂｅｔ、）＋ｅｓｄａＲｅｓｅａｒｃｈ　Ｌａ１ ｒｏｒａＬｏｒｉｅｓ、　Ｇａ１ｔｈｅｒ！３ｂｕｒ＆、　Ｍａｒｙｌａｎｄか らカタログ番号８２２７Ｓ＾として入手用＠、）にフラグメントを連結した。、 Ｍａｈｄｅｌ他、し止りよ−氾−悼−，，５３，１５４（１９７０）の手順にし たがって連結産物を大腸菌、１Ｍ１０３（Ｐｉｓｃａｊａｗａｙ、　Ｎ１．！ｗ 　Ｊｅｒｓｅｙに所在のｌａｒｍａｅｉａ社からカタログ番号２’７−１５４５ −０１として入手可能）に形質転換により導入しフ、：。バクテリオファー・ン プラークに０．５Ｍカテコー／ｌべ蒸留水で調製）を噴霧し、ｐＴＧ４０２から 誘導される広ＬＥ遺伝子の機能的発現を検出した。 団１−Ｅｆｉ伝子はカテコール２，３−ジオキシゲナーゼをコードし、種々の生 物中でプロモーターを検出するプ、こめに有用であるｒＺｕｋｏｗｓｋｉ他、Ｑ ”　ｒ　ｏ　ｃ　、　Ｎ　ａ　ｔ　ｌ、＾ｃａｄ、　Ｓｅ−＜１４ｓ７：し８０ ．１１．０ｌ−１１０５（１９８３＞１］。 次に匡Ｅ遺伝子を１．Ｏｋｂ　ＥｃｏＲＩ−Ｐｓ土ＩフラグメントどＩ７て、Ｒ ，Ｄｅｄｏｎｄｅｒ（ｌｎｓｔｉｔｕｔ　Ｐａ５Ｌｅｕｒ、　Ｐａｒｉｓ、　Ｆ ｒａｎｃｅ）から入手した大腸菌／枯草菌プラスミドｐＨＶ３３（Ａ−ｅｒｉｃ ａｎ　ＴｙｐｅＣｕｌｔｕｒｅ　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎから八、Ｔ、Ｃ，Ｃ，３ ９２１７どして入手可能）［Ｐｒｊｌ＊ｒＯ３ｅ他、Ｐｌａｓｍｉｄ、　６．１ ９３−２０１（１９８１）コに移した。ｐｌ（Ｖ３３プラスミドは予めむ且Ｒ１ 及びＰ　ｓ　ｔ−１で消化しておき、直Ｅを含むフラグメントがこの領域に連結 するとアンピシリン耐性をコードする遺伝子を失活させるようにしておいた。 形成されたプラスミドｒ＋ＡＭＢ２１は大腸菌宿主細胞中に機能的ｘＬＬＥ遺伝 子を含むが、枯草菌宿主細胞中でＵ土Ｅを発現させるためにプロモーターを加え る必要がある。　ｐＡＭＩ３２１を生息させる大腸菌細胞はテＩ・ラサイクリン （ｌｈｙ／ｘｉり及びクロラムフェニコール（２０ｕｆｆ／＋ｗ１）に対して耐 性であり、一方、ｐ／１ＭＢ２１を生、苧、させる枯草菌細胞はクロラムフエニ コ・−ル（５−ｇ／ｘ１）のみに耐性である。 バクテリオファージλの１１転写終結配列をプラスミドｐＣＦＭ９３６（４００ 塩基対し肚１−ｂ１−１１７ラグメント上）からｐΔＮＢ２１の単独Ｐｑｔ　１ 部位に移した。配列５°Ｃ＾ＴＣＴＧＣＡ　３’を有する合成ヌクレオチドを構 築！７、［ユフラグメントの７−ｎ末端をベクターｐ静Ｂ２ｉのｂ工１部位に結 合した。形成されたプラスミドをρ＾Ｍ８２２と命名し、このグラスミドは転写 ターミネータ−を含む以外はｐＡＭＢ２１と同一の特性を有していた。 ｐＡＮＢ２２プラスミドは枯草菌において機能的な強力なプロモーターを検出す るために有用である。 ソ弓−Ｅ及びＬＬＬＬを含むｐＡＭＢ２２からのＤＮＡの１．４ｋｂ巨Ｆｔｉｉ ｉＶ■フラグメントを、制限されたフラグメントの電気泳動後に低融点アガロー スゲルから単離した。　ＤＮＡの１．４ｋｂフラグメントを、予めＥｃｏＲｌ及 びＢａｍＨＩで消化しておいたプラスミドｐＢＤ６４（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　Ｇｅ ｎｅｔｉｃ　５ｔｏｃｋ　ＣｅｎｔｅｒがらＮｏ、　ＩＥ２２で入手可能）に連 結した。形成された５、３ｋｂプラスミドｐＡＮＢ１１は、図３に示すようにｘ ＬＬＥ遺伝子の上流の８１３！ＪＬ１８のポリリンカー配列（ＥｃｏＲＩ　、鎧 ｔｌ、Ｘｍａｌむ工、ｂ見ＩＩＩ及びＸｂａ　Ｉ　）と、下流のｔｍを含む。ｐ ＡＭＢ１１プラスミドは枯草菌中で複製する能力があり、宿主細胞にクロラムフ ェニコール（５ｕｉ＋＃／）及びカナマイシン（ｈｙ／ｚ１）耐性を与える。 図４に示すように、組込を含む精製ヒ且ＲＩ　−−１フラグメントをｐＡＭＢｌ ｌにクローニングしてｐＡＭＢｌｌｌを形成した。Ｃｈａｎｇ他、Ｍｏ１．　Ｇ ｅｎ、　Ｇｅｎｅｔ、、　１６８．１１１４１５（１９７９）により記載されて いるプロトプラスト形質転換法により連結産物を枯草菌旧１１２（＆ＬＬ−１５ １ｅｕＢ　ｔｈｒ５　ｒｅｃＥ４）（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ＧｅｎｅｔｉｃＳｔｏ ｃｋ　ＣｅｎｔｅｒからＮ００１八４２３として入手可能）に導入した。 プラスミドＤＮＡを含まない枯草菌Ｍ１１１２はプロテアーゼープロフィシエン ト（Ｐｒｔ”表現型）であるが、スブチリシンの分泌レベルはかなり低い、１． ５％（ｗ／ｖ）スキムミルク及び５ｕｙ／１１クロラムフエニコールを補充した し一寒天培地にクロラムフェニコール耐性（Ｃ１）形質転換細胞を移し、その後 、３７℃でインキュベートした。 ３７℃で約１６時間インキュベーション後、プラスミドｐＡＭ８．１１１を生息 させるＭ１１１２のコロニーは各コロニーの周囲に鮮明なハローを形成した。ハ ローはスキムミルクを補充した培地のカゼイン成分に対するスブチリシンのタン パク質分解作用により形成された。　ｐＡＭＢ１１ベクター単独を生息させる旧 １１２は１６時間インキュベーション後に可視ハローを示さなかったが、３７℃ で４０時間インキュベーション後に僅かなハローが広がる場合もあった。　ｐＡ ＮＢｌｌｌを担持する細胞はハローの寸法の相異によりｐＡＭＢｌｌを担持する 細胞から明確に区別された。こうして組法遺伝子を完全に機能形でクローニング すると、枯草菌により高レベルのスブチリシンが産生及び分泌された。 えｍ 図４に示すように、実施例１に記載したように単離した３、Ｏｋｂ　ＥｃｏＲＩ 　−ＫＨ２ＴゲノムフラグメントをＨｉｎｄｌｎで消化し、３つのフラグメント 、即ち（１）仕込遺伝子発現のための遺伝子調節配列、スブチリシンの細胞外移 送に必要な遺伝子のρｒｅ−ｐｒｏ領域、及び成熟スブチリシンの最初の４９個 のアミノ酸をコードするＤＮＡ配列を担持する１、１ｋｂ　Ｅｃ且ＲＩ　−ｔｌ ｉｎｄｌ［フラグメントと、（２）スブチリシンの５０〜２７５（カルボキシル 末端）のアミノ酸をコードするＤＮＡ配列、転写終結配列及び３′非コ一デイン グ配列を担持する１、１ｋｂ　Ｔｌ１ｎｄｌＩ［−ＨｌｎｄｌＩ［フラグメント と、（３）３’非コ一デイング配列を含む０．８ｋｂＨｉｎｄＩ［Ｉ−巨Ｔフラ グメントとを形成した。 Ｈｉｎｄ１１１部位により挟まれた１、１ｋｂフラグメントを、ＤＮＡ配列決定 及び部位特異的突然変異誘発の目的でバクテリオファージＮ１３　吐１８の単一 のＢｉｎｄｌ［部位にクローニングした。組換体の１つを８１３　Ｉ！ＪＬ１８ 　Ｌ２二２と命名し、ａＪＬｊ−遺伝子の部位特異的突然変異誘発に必要な一重 鎖鋳型ＤＮＡとして用いた。 己遺伝子のコーディング領域を配列決定し、配列の結果な下記表１に示す。留意 すべき点として、リーダー領域の最初の５個のコドンの特定の存在は組法遺伝子 の配列情報に関する５ｔａｈｌ他、前出及び−ｏｎｇ他、前出の報告に一致して おり、アミノ酸８４及び８５位には５ｔａｈｌ他の前出の文献とのコドン配列の 相違が認められる。具体的に説明すると、５ｔａｈｌ他の前出の文献ではアミノ 酸８４位に（バリンをコードする）コドンＧＴＴを報告しているが、表１ではく 同様にバリンをコードする）コドンＧ　Ｔ　局’認められる。　５ｔａｈｌ他の 前出の文献は同様にアミノ酸８５位に（セリンをコードする）コドン八ＧＣを報 告しているが、表１では（アラニンをコードする）コドンＧＣＧが認められる。 轟」− Ｇｉｎ　　Ａｌａ　　八ｉａ　　Ｇｌｙ　　Ｌｙｓ　　Ｓｅｒ　　釦ｒ　　Ｔｈ ｒ　　Ｇｌｕ　　Ｌｙｉ　　Ｌｙｓ　　Ｔｙｒ　　１１ｓ　@Ｖａｌ ＣＡＧ　　ＧＣＴ　　ＧＣＣＣＧＡ　　ＡＡＡ　　ＡＧＣＡＧＴ　　ＡＣＡ　　 ＧＭ　　ＡＡＧ　　ＭＡ　　ＴＡＣＡ↑Ｔ　　ＣＴＣＧｌｙ　　Ｐｈｅ　　Ｌｙ ｓ　　Ｇｌｎ　　Ｔｈｒ　　Ｍｅｔ　　Ｓｅｒ　　Ａｌａ　　Ｍ＠セ　Ｓｅｒ　 　Ｓｅｒ　　Ａｌａ　　Ｌｙｓ　@Ｌｙｓ ＧＧＡ　　ＴＴＴ　　ＡＡＡ　　ＣＡＧ　　ＡＣＡ　　ＡＴＧ　　ＡＧＴ　　Ｇ ＣＣＡＴＧ　　ＡＣＴ　　ＴＣＣＧＣＣＡＡＧ　　八ＡＡＬｙｓ　Ａｓｐ　Ｖａ ｌ　Ｉｌｅ　Ｓｅｒ　Ｇｌｕ　Ｌｙｓ　Ｇｌｙ　Ｇｌｙ　Ｌｙｓ　ＶａＩＧｉｎ 　Ｌｙｓ　ＧｉｎＡＡＧ　ＧＡＴ　ＧＴＴ　ＡＴＴ　ＴＣＴ　ＧＡＡ　ＡＡＡ　 ＧＧＣＧＧＡ　ＡＡＧ　ＧＴＴ　ＣＡＡ　ＡＡＧ　ＣＪ％ＡＰｈｅ　　Ｌｙｓ　 　Ｔｙｒ　　Ｖａｌ　　Ａｓｎ　　Ａｌａ　　八ｌａ　　Ａｌａ　　Ａｌａ　　 Ｔｈｒ　　Ｌｅｕ　　Ａｓｐ　　にｍｕ@　Ｌｙｓ ＴＴＴ　　入ＡＧ　　ＴＡＴ　　ＧＴＴ　　ＭＣＧＣＧ　　ＧＣＣＧＣＡ、ＧＣ Ａ　　ＡＣＡ　　ＴＴＧ　　ＧＡＴ　　ＧＡＡ　　ＡＡＡＡｌａ　　Ｖａｌ　　 Ｌｙｉ　　Ｇｌｕ　　Ｌｅｕ　　Ｌｙｓ　　Ｌｙｓ　　Ａｓｐ　　Ｐｒｏ　　Ｓ ｅｒ　　Ｖａｌ　　八ｌａ　　Ｔｙｒ@　Ｖａｌ ＧＣＴ　ＧＴＡ　ＡＡＡ　ＧＡＡ　ＴＴＧ　ＡＡＡ　ＡＡＡ　ＧＡＴ　ＣＣＧ　 ＡＧＣＧＴＴ　ＧＣＡ　ＴＡＴ　ＧＴＧ艮ユニ区ｌ上 宍」−（続き） ＧＣＡ　　ＧＣＴ　　ＧＣＡ　　ＣＪ％Ａ　　ＴＡＡ、ＴＡＧＴＡＡＡＡＡＧＡ ＡＧＣＡＧＧＴＴＣＣτＣＣＡＴＡＣＣＴＧＣＴＴＣＴＴＴＴＴＡ？ＴＴＧＴＣ ＡＧＣＡ、ＴＣＣＴＧＡ↑ＧＴＴＣＣＧＧＣＧＣＡＴＴＣＴＣ呼Ｑ−スブチリシ ンの５０〜２７５位（カルボキシル末端）のアミノ酸をコードするヌクレオチド 配列、転写終結配列及び３“非コーディング配列を担持する枯草菌ＱＢ１．２７ ゲノムＤＮＡの１．１ｋｂ　１（ｉｎｄＴｆｆ−）１ｉｎｄｌ［Ｉフラグメント をバクテリオファージＨ１３！ｉｉ、８の単独［１ｉｎｄｌ１部位に挿入するこ とにより、バクテリオファージＭ１３　阻１８　Ｃを横築した。３′非コ一デイ ング配列を除去するために、部位特異的突然変異誘発により転写終結配列の直後 の位置に顕！制限エンドヌクレアーゼ部位を導入した。 Ｎｏｒｒａｎｄｅｒ他、Ｇｅｎｅ、　２６．１０１−１０６（１９８３）により 記載されている手順に１７たがって部位特異的突然変異誘発を実施した。　Ｍｔ ３　＠Ｌ１．８　吐シからの一重鎖ＤＮＡを、Ｂｅａｕｃａｇｅ他、Ｔｅｔｒ− ａｈｅｄｏｎ　Ｌｅｔｔｅｒｓ　２２．１８５９−１８６２（１９８１）により 記載されている亜リン酸法により合成したブライマー：にアニールした。プライ マーはチミン（Ｔ）がグアニン（Ｇ）に置換され、別のチミンぐ丁）がアデニン （八）に置換された２つの塩基（アステリスクで示す）を除いてこの領域のヌク レオチドに相同であり、こうして、この領域に１ユＩ部位（下線部）を形成した 。 プライマーを６５℃で８１３　！ＪＬ１８川２　ＤＮＡにアニールし、約２２℃ までゆっくりと冷却し、その後、アニールしたＤＮＡ溶液１２．５．ｆ、夫’２ １０ｍＨのｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ及びｄＧＴＰ　１．５ｕｆ、１２ｍＭ＾ＴＰ　２ ０，１、Ｋｌｅｎｏｗ　ＤＮＡポリメラーゼ０．１ハ、Ｔ４　ＤＮＡリガーゼ０ ．１ｕ１及び無菌蒸留水１３ｕｆｆｉから構成される反応混合物中で２時間１５ ℃で重合した。形成された二重鎖の閉環状ＤＮＡをトランスフェクションにより 大腸菌ＪＭ１０３に導入した。 次にバクテリオファージプラークをＧｅｎｅ　５ｃｒｅｅｎ（登録商標）（Ｎｅ ＠Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｎｕｃｌｅａｒ、　Ｂｅｖｅｒｌｙ、　Ｍａｓｓａｃｈｕｓ ｅｔｔｓ）ハイブリダイゼーションメンプランに移した。上記突然変異誘発開始 反応に使用した放射線標諏（γ−３２Ｐ）合成オリゴヌクレオチドにハイブリダ イズすることにより、所望の塩基置換を有するＤＮＡを含むプラークを認識した 。ｍＩ突然変異を有するＤＮＡのみが合成オリゴヌクレオチドにハイブリダイズ するように制限温度（６５℃）でハイブリダイゼーションを実施した。Ｓａｎｇ ｅｒ他、前出の文献により記載されている手順によるＤＮＡ配列決定及び制限酵 素分析により、単一の精製プラーク（Ｈ１３吐１８祉二２　顕１　）からのＤＮ Ａ上の組込遺伝子の下流の１」−■突然変異の存在を確認した。 ８１３　！ＪＬ１８　弘２１リー１を−Ｉで消化し、５００ｎｇ　ＤＮ＾／ｘｉ の濃度で消化産物を再連結し、その後、トランスフェクションにより連結産物を 大腸菌ＪＭ１０３に導入することにより、３゛非コーデイング領域の大部分を担 持する１、１ｋｂセグメントを除去した。所望の０．３５ｋｂ欠失を有するＤＮ Ａを含むバクテリオファージプラークを制限エンドヌクレアーゼ分析によりＥＺ Ｗａした。１つのこのようなプラークからのバクテリオファージをＭ１３　ＬＬ １８　ｕト−４（図７）と命名した。　８１３１１８　阻Ｌ４を後述するｍ遺伝 子の部位特異的突然変異誘発のための一重鎖鋳型ＤＮＡとじて用いた。 及１１１ 枯草菌中で突然変異スブチリシン遺伝子を発現させるために、プラスミドｐＡＭ Ｂ１０６を突然変異遺伝子のベクターとして次のように構築した。 １）　ｐＡＭＢｌｌｌをユ■で消化した。約１ｕｙ／贋ｌの濃度でｐＡＭＢｌｌ ｌのＨｉｎｄ［［消化産物を再結合することにより、住込遺伝子の大部分を担持 する１、１ｋｂセグメントを欠失させた。こうして図４に示すようにｐＡＭＢｌ ｌｏを形成した。　ｐＡＮＢ１１０プラスミドはスブチリシン遺伝子の発現のた めの遺伝子調節配列と、スブチリシンの分泌に必要なｐｒｅ−ｐｒｏ領域と、成 熟スブチリシンの３゛非コーデイング領域及び成熟スブチリシンの最初の４９個 のアミノ酸をコードするＤＮＡ配列とを担持する。 ２）プラスミドｐＡＭＢ１１０をＢａｍＨｌとＰｓｔ　ｌの組み合わせにより消 化した。こうして６．２ｋｂ及び１．Ｏｋｂとの２つの寸法のＤＮＡフラグメン トを形成した。　１．Ｏｋｂフラグメントは、ｈ↓旦ｏｍｏｎａｓ　ト［１」ｈ ２ｍｔ−２（Ｚｕｋｏｗｓｋｉ他、前出）のＴＯＬプラスミドからのカテコール ２．３−ジオキシゲナーゼをコードするＵ上Ｅ遺伝子を担持する。 ３）　Ｂｅａｕｃａｇｅ他、前出の文献により記載されている亜リン酸法により 合成した一重鎖オリゴヌクレオチド５’　ＧＡＴＣＴＧＣ＾３゛及びＴ４　ＤＮ Ａリガーゼを用いて、より大きい６．２ｋｂ　ＢａｍＨ１−Ｐｓ工！フラグメン トを自己連結した。連結産物をＣｈａｎｇｅ他、Ｍｏ１．　Ｇｅｎ、　Ｃｅｎｅ ｔ、　１６８．１１１−１１５（１９７９）により記載されているプロトプラス ト形質転換法により枯草菌ＭＴ１１２（ａｒＪＬ−１５１ｅｕＢ堕ｒ５　ｒｅｃ Ｅ４（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　Ｇｅｎｅｔｉｃ　５ｔｏｃｋ　ＣｅｎｔｅｒからＮｏ 、　１＾４２３として入手可能））に導入した。 プラスミド内容のクロラムフェニコール耐性（Ｃｍ’）コロニーをスクリーニン グした。制限エンドヌクレアーゼ分析により６．２ｋｂプラスミドｐＡＭＢ１０ ６を認識した。このプラスミドは！ＬＬＥを欠失している点を除いてプラスミド ｐＡＭＢ１１０と同一である（図６）。 ｐＡＭＢ１０６は任」λｒＡニスブチリシンの５０〜２７５のアミノ酸をコード するＤＮＡを欠失しているため、枯草菌宿主細胞に導入してもスブチリシンを合 成しない、スブチリシンが合成されるのは、スブチリシン遺伝子の残余、即ち天 然のＤＮＡ配列又は類似体をコードする配列のいずれかを挿入後のみである。 え東九先 セｉン１０９スブ　１シン　　０体！バ

【４−バクテリオファージＭ１３ａ２１ ８　二４からの一重鎖ＤＮＡを、Ｂｅａｕｅｌ１ｇｅ他、前出の文献に記載され ている亜リン酸法により合成したプライマー： ５°　ＴＧに　　ＡＴＴ　　ＡＴＴ　　Ａ（：Ｃ（：にＣＡＴＴ　　（：ＡＣＴ ｆ；［；　　３’ＴＲＰ　ＩＬＥ　ＴＬＥ　ＳＥＲＧＬＹ　ＩＬＥ　ＧＬＵ　Ｔ ＲＰにアニールした。プライマーは、＾ｓ　ｎ　ｌ　０１　（コドン＾＾Ｃ）か らＳｅｒｌｏｇ（コドン＾ＧＣ）へのトランジションを実現するように八がＧに 置換された１つの塩基置換（アステリスクで示す〉を除いてＬ区スブチリシンの １０６〜１１３位のアミノ酸のコドンを含むヌクレオチドと相同であった。 プライマーを６５℃でＭ１３Ｉ−１８＆ｉＬ４　ＤＮＡにアニールし、アニール したＤＮＡを約２２℃までゆっくりと冷却し、その後、実施例２に記載したよう に重合、連結及びトランスフェクトした。 バクテリオファージプラークをハイブリダイゼーションメンブランに移し、そ、 の後、上記突然変異誘発開始反応に使用した放射線標識（α−３２Ｐ）オリゴヌ クレオチドにハイブリダイズすることにより、所望の塩基置換を有するＤＮＡを 含むプラークを認識した。ハイブリダイゼーションは６５℃で実施した。１つの 陽性のプラークはＭ１３Ｔｉ］８生、旺４［Ｓｅｒ募ａｓ］と命名されるバクテ リオファージを陰んでいた。このバクテリオファージからの二重鎖ＦＩＮ八をｌ １ｉｎｄＩＩと顕ｔとの組み合わせにより消化し、その後５吐已スブチリンン遺 伝子の突然変異部分を担持する７５０ｂｐフラグメントをＨｉｎｄｌｌ及び（眩 Ｉで予め消化しておいたｐＡＨｆ３１０６に連結した。形成されたプラスミドｐ ΔＨＢ１２９を［５ｅｒ１０９］−スブチリシンの合成及び分泌のための適切な 枯草菌宿主細胞に導入することができる。 ス１ヱ１Σ セリン１０９セリン２目スブチリシン　　イの　′Ｍ１３＋＋＋ｐ１８　ａｐｒ ４［５ｅｒ１０”］からの−重ｌＤＮＡを、ＢｅａｕｃａＢｅ他、。 前出の文献に記載されている亜リン酸法により合成したブ５’　ＧＧＣＣＣＴ　 ＴＡＴ　Ａ（：ＣＣＣＡ　ＡＣ３’ＧＬＹ　　ＡＬＡ　　ＴＹＲＳＥＲＧＬＹ　 　Ｔｌ（Ｒにアニールした。プライマーは、八５ｎ２１′′（コドン＾＾Ｃ）を ５ｅｒ２０（コドン＾ＧＣ）に置換するトランジションを可能とするように八が Ｃに置換された１つの塩装置ｌｌ＆（アステリスクで示す）を除き吐吐−スブチ リシンの２１５〜２２０位のアミノ酸のコド〉・を含むヌクレオチドと相同であ った。アニーリング、重合、連結、トランスフェクション及び陽性のプラークの 認識のための条件は実施例２に記載した通りである。１制の精製プラークはＭ１ ３ｗｚ１８　リニ４　［Ｓｅｒ”’、Ｓｅｒ””］と命名されるバクテリオファ ージを含んでいた。このバクテリオファージからの二重鎖ＤＮ＾をＨｉｎｄＩ［ Ｉ及びＵリーｌの組み合わせにより消化し、その後、２つの突然変異を有する７ ５０ｂｐフラグメントを、Ｆｌｉｎｄｌ及び馳ユＩで予め消化！７ておいた１５ Ｍ　Ｂ　１．０６に連結した。形成されたプラスミドｐＡＭＢ１．３０を［Ｓ、 、＋　０９　、Ｓｅ、２１６〕−スブチリシンの合成及び分泌のための枯草菌宿 主細胞に導入することができる。 ｍ乱り しし」ニー５ｅｒ１０−１−シ、＝、２１１ユ２ヨ１−ヨ’ｊＪＬＬ停」グＪＥ Ｌ８１．３ｇＬ１８　ｕ二４［Ｓｅｒ’　”　’　、Ｓｅｒ”　’　”］からの −重鎮ＤＮＡを、Ｂｅａｕｃａ［ｉｅ他、前出の文献に記載されている亜リン酸 法により合成したプライマー： ５“　ＧＣＴ　　ＣＴＴ’　　［；へ丁　＾ΔＣＴＣ八　八ＴＣ３’＾ＬＡ　Ｌ ＥＵＡＳＰ　ＡＳＮ　ＳＥＲＩＬＥにアニールした。プライマーは＾、ｎ？８（ コドン＾＾丁）を＾ｓ　ｐ　７１　（コドンＧＡＴ）　［こ置換するトランジシ ョンを可能にするための八がＧに置換された１つの塩基置換くアステリスクで示 す）を除き、己−スブチリシンの７４〜７９位のアミノ酸をコードするコドンを 含むヌクレオチドと相同であった。 プライマーを６５℃でＭ　１３　吐１８　［Ｓ　ｅ　ｒコ”、Ｓｅｔ”］ＤＮＡ にアニールし、アニールしたＤＮＡをゆっくりと約２２℃まで冷却し、実施例２ に記載したように重合、連結及びトランスフェクトした。 バクテリオファージプラークをハイブリダイゼーションメンブランに移し、ハイ ブリダイゼーションを４６℃で実施した以外は実施例２に記載したようにハイブ リダイゼーションにより、所望の塩基置換を有するＤＮＡを含むプラークを認識 した。１つの陽性のプラークはＮ１５Ｔ！ＪＬ１８弘４［八ｓ　ｐ　？　ｍ　、 　Ｓｐ、１０９．５ｅｒ２１ｓ］と命名されるバクテリオファージを含んでいた 。バクテリオファージからの二重鎖ＤＮＡをＨｉｎｄｌＩ［及びしユＩの組み合 わせで消化し、その後、吐匝−スブチリシン遺伝子の３つの突然変異を有する７ ５０ｂｐフラグメントを、Ｈｉｎｄ■及び１」−■で予め消化しておいたｐ＾Ｍ ８１０６に連結したゆ形成されたプラスミドｐＡＭＢ１３１を［Δ５９７１Ｊｅ 、１０！、５ｅｒ２＋ａ’ｌ−スブチリシンの合成及び分泌のために枯草菌宿主 細胞に導入することができる。 Ｋ１λＬ 血７−ＧＩｕ）鴨５ｅｒＩｎ！　Ｓ、「２１８スブ　１シン　　　のＬｊｆｉＭ １３Ｉ！ｉ１８　シＥ−４［＾ｓｐ〒６．Ｓｅ、ｌ０Ｊｅｒ２１１］からの一重 鎖［］Ｎ＾を、Ｂｅａｕｃａｇｅ他、前出の文献に記載されている亜リン酸法に より合成したプライマー： ５°　Ｔ　ＧＡＴ＾ＡＣＴＣＡ　ＧＡＡ　ＧＧＴ　ＣＴＴ　ＣＴに　ＩＩ；　　 　３’ＡＳＰ　ＡＳＮ　ＳＥＲＧＬＵ　ＧＬＹ　ＶＡＬ　ＬＥＵにアニールした 。プライマーはＩｌｅ”（コドン＾ＴＣ）をＧｌｕ”（：１トンＧ＾＾）に１換 するように＾がＧに置換され、Ｔが＾に置換され、Ｃが＾に置換された３つの塩 基置換（アステリスクで示す）を除き、［＾ｓｐ？！、５ｅｒ１０１，５ｅｒ２ １８コースブチリシンの７５〜８３位のアミノ酸をコードする部分的コドン、７ ６〜７５位及び８３位のアミノ酸をコードするコドン全体及び７６〜８２位のア ミノ酸をコードするコドン全体を含むヌクレオチドと相同であった。 プライマーを６５℃でＭ１３吐１８　弘４　［＾ｓｐ）’　、Ｓｅｔ’　”　、 Ｓｅｔ”　’’］ＤＮＡにアニールし、アニールしたＤＮＡをゆっくりと約２２ ℃まで冷却し、実施例２に記載したように重合、連結及びトランスフェクトした 。 バクテリオファージプラークをハイブリダイゼーションメンプランに移し、ハイ ブリダイゼーションを４５℃で実施した以外は実施例２に記載したように、所望 の塩基１換を有するＤＮＡを含むプラークをハイブリダイゼーションにより認識 した。１つの陽性のプラークはＭ１３！ＪＬ１８　Ｌ！ＪＬ４［＾５ｐ）−Ｇ　 Ｉｕ”、５ｅｔＩｏ’、５ｅｔ２目］と命名されるバクテリオファージを含んで いた。このバクテリオファージからの二重鎖ＤＮ＾を」１ｎｄｌｌｌ及び石ｌの 組み合わせで消化し、その後、ｍ−スブチリシン遺伝子の４つの突然変異を有す る７５０ｂｐフラグメントを、ＨｉｎｄＩ［［及びＫＩｌ！ｉＩで予め消化して おいたｐ＾ＭＢ１０６に連結した。形成されたプラスミドｐＡＭＢ１３３を［八 ｓ、７ｇ　、にｌｕ？Ｉ。 ５ｅｒ１６１，５ｅｒ２１コースブチリシンの合成及び分泌のために枯草菌宿主 細胞に導入することができる。 及Ｕ影 八ｓ？＠　５ｅｒ１６１５ｅｒ２目＾１ａ２２２スブ　Ｉシン　　　の　Ｍ１３ 　吐１８　丑４［八ｓ　ｐ　？　Ｉ　、　Ｓ　ｅ　ｒ　１°％、Ｓｅ、２＋＠］ からの一重鎖ＩＩＮ＾を、Ｂｅａｕｃａｇｅ他、前出の文献に記載されている亜 リン酸法により合成したプライマー： ５°ＧＣ＾＾Ｃ（：　ＴＣＣＧＣｔｌ；　にＣに　ＡＣＴ　　３’Ｇｌｙ　Ｔｈ ｒ　Ｓｅｒ　Ａｌａ　Ａｌａ　Ｔｈｒにアニールした。プライマーはＮｅｔ”” （コドン八ＴＧ）を＾１ａ２２２（コドンＧＣに）に置換するようにアデニン（ ＾）がグアニン（Ｇ）に置換され、チミン（Ｔ）がシトシン（Ｃ）に置換された ２つの塩基置換（アステリスクで示す）を除き、［八ｓ　ｐ７　Ｇ　、　Ｓ　ｅ ｒ　ｌ　６　ｔ　、　Ｓ　ｅｔ　２１・］−スブチリジンの２１９〜２２４位の アミノ酸をコードするコドンを含むヌクレオチドと相同であった。プライマーを ６５℃でＮ１３１１８　ｕＥ−４［＾ｓｐ）’、Ｓｅｔ”’、Ｓｅｒ”目コ１１ Ｎ八にアニールし、アニールしたＤＮＡをゆっくりと約２２℃まで冷却し、実施 例２に記載したように重合、連結及びトランスフェクトした。 バクテリオファージプラークをハイブリダイゼーションメンプランに移し、ハイ ブリダイゼーションを５８℃で実施した以外は実施例２に記載したように、所望 の塩基置換を有するＤＮＡを含むプラークをハイブリダイゼーションにより認識 した。１つの陽性のプラークはＭ１３Ｉ！ｉ１８　！Ｊ工４［＾ｓ　ｐ　？　＠ 。 Ｓｅ、１０！、Ｓｅ、２１＠、＾１ａ２２２］と命名されるバクテリオファージ を含んでいた。このバクテリオファージからの二重鎖ＤＮ＾をＨｉｎｃｌＩ［ｌ 及び石１の組み合わせで消化し、その後、吐堕−スブチリシン遺伝子の４つの突 然変異を有する７５０ｂｐフラグメントを、Ｈｉｎｄｌｌ及び’Ｊｎｌで予め消 化しておいたｐＡＭＢ１０６に連結した。形成されたプラスミドｐＡＭＢ１４３ を［＾ｓ　ｐ　？　ｍ　、　Ｓｅ　ｒ　１１１１Ｊ、、２１１．＾１，２２Ｊ− スブチリシンの合成及び分泌のために枯草菌宿主細胞に導入することができる。 えＩ隨Ｌ Ｍｆ３　　ｍ　　１９　　ａ　　ｒ＾１４３の　　゛プラスミドｐＡＭ［１１４ ３をＥｃｏＲＩ及び’ｉａｌの組み合わせで消化した。［＾ｓｐ”　、Ｓｅｒ’ 　”　、Ｓｅｒ”目、＾１，４２２］−スブチリシンの遺伝子全体と、転写及び 翻訳開始並びに転写及び翻訳終結に必要なそのフランキング配列とを有するＤＮ Ａの１．８ｋｂフラグメントを、ＥｃｏＲｌ及びＫｗｒで消化しておいたバクテ リオファージＭ１３吐１９（Ｂｅｔｈｅｓｄａ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　Ｌａｂｏｒ ａｔｏｒｉｅｓ、　Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、　ＭＤ、からカタログ番号８２ ２９Ｓ＾とじて入手可能）に移した。この手順によって得られた組換バクテリオ ファージＤＮＡの１つをＭ１３！１１９ｕ■人１４３−と命名し、［＾ｓ　ｐ　 ？　＠　、　５　ｅ　ｒ　ｌ　Ｏ＊。 Ｓｅ、２１１．Δ１ａ２２２］−スブチリシン遺伝子の部位特異的突然変異誘発 に必要な一重鎖鋳型ＤＮＡとして用いた。 ＩＩｌ副 ５＾Ｓテロ　Ｓｅ、ＩＯ＠　５ｅｒ２１＠＾１，２２２−スブ　リシン　ノ船へ １１ Ｎ１３Ｔ！ＪＬ１９ｕＥ五１４３−からの−重鎖ＤＮＡを、Ｂｅａｕｃａｇｅ他 、前出の文献に記載されている亜リン酸法により合成したプライマー： ５’　　（：ＴＡ　　ＧＣＴ　　ＧＴＴ　　丁ＴＡ　　ＧＡＣＡＧＣＣ［；＾　 ３′Ｖａｌ　　＾ｌａ　　Ｖａｌ　　Ｌｅｕ　　Ａｓｐ　　Ｓｅｒ　　Ｃ１ｙに アニールした。ブライマーはＴｌｅ”（コドン八ＴＣ）をＬｅｕ”（コドンＴＴ へ）に置換するようにアデニン（＾）がチミン（Ｔ）に置換され、シトシン（Ｃ ）がアデニン（＾）に置換された２つの塩基置換（アステリスクで示す）を除き 、［＾ｓ　ｐ　？　＠、　Ｓ　ｅ　ｒ　ｌ　Ｏｔ　、　Ｓ　ｅ　ｒ　２　ｌ　１ ゜＾１ａ２２２］−スブチリシンの２８〜３４位のアミノ酸をコードするコドン を含むヌクレオチドと相同であった。ブライマーを６５℃で８１３　吐１９　ｕ ■入１４３　ＤＮＡにアニールし、アニールしたＤＮＡをゆっくりと約２２℃ま で冷却し、実施例２に記載したように重合、連結及びトランスフェクトした。 バクテリオファージプラークをハイブリダイゼーションメンプランに移し、ハイ ブリダイゼーションを５７°Ｃで実施した以外は実施例２に記載したように、ハ イブリダイゼーションにより所望の塩基置換を有するＤＮＡ　を含むプラークを 認識した。１つの陽性のプラークはＭ１３１！ｉ１９　ａｌば人トリーと命名さ れるバクテリオファージを含んでおり、［Ｌｅｕ”、＾５１７６゜５ｅｒｌｏｓ 、５ｅｒ２１ａ、Ａｌａ２２リースブチリシンをコードするＤＮＡを担持してい た。このバクテリオファージからの二重鎖ＤＮＡをむ且Ｒ１及びしユ■の組み合 わせで消化し、その後、仕込−スブチリシン遺伝子の５つの突然変異を有するＯ Ｎへの１．８ｋｂフラグメントを、ＥｃｏＲｉ及びし！Ｉで予め消化しておいた ｐ＾ＭＢ１０６に連結した。形成されたプラスミドｐＡＭＢ１４４を［Ｌｅｕ″ １、＾、ｐ〒’、Ｓｅｒ”’、Ｓｅｒ”−へ１ａ２２２’ｌ−スブチリシンの合 成及び分泌のために枯草菌宿主細胞に導入することができる。 えａ ＾Ｓテロ　Ｓｅ、１０９　Ｌｅｕ１２４５ｅｒ２１ａ＾１ａ２２２−スブ　１シ ン飢α１１ Ｍ１３　Ｉ！！１９　月狂人辷り一からの一重鎖ＤＮ＾を、Ｂｅａｕｃａｇｅ他 、前出の文献に記載されている亜リン酸法により合成したブラ５′　へ丁　にＴ Ｔ　　ＡＴＣ＾＾ＣＴＴ八　ＡＧＣＣＴＴ　　Ｇ［；　　３’Ｖａｔ　Ｉｌｅ　 Ａｓｎ　Ｌｅｕ　Ｓｅｒ　Ｌｅｕにアニールした。ブライマーはＮ　ｅ　ｔ＋　 ２４　（コドン＾ＴＣ）をＬｅｕ”４（コドンＴＴ＾）に置換するようにアデニ ン（＾）がチミン（Ｔ）に置換され且つグアニン＜Ｃ＞がアデニン（＾）に置換 された２つの塩基置換（アステリスクで示す）を除き、［八、、７１．５ｅｒｌ 　０９゜Ｓｅ　ｒ　２１８．へ１ａ２２２］−スブチリシンの１２０〜１２７位 のアミノ酸をコードする部分的コドン及び１２１〜１２６位のアミノ酸をコード するコドン全体を含むヌクレオチドと相同であった。 ブライマーを６５℃でＭ１３　吐１９　ｕホ人にリーＤＮ＾にアニールし、アニ ールしたＤＮＡをゆっくりと約２２°Ｃまで冷却し、実施例２に記載したように 重合、連結及びトランスフェクトした。 バクテリオファージプラークをハイブリダイゼーションメンブランに移し、ハイ ブリダイゼーションを５９℃で実施した以外は実施例２に記載したようにハイブ リダイゼーションにより所望の塩基置換を有するＤＮＡを含むプラークを認識し た。１つの陽性のプラークはＭ１３吐１９す■入日−５七−命名されるバクテリ オ７７−ジを含んでおり、［Ａｓｐ”、５ｅｒｊ６’、Ｌｅ、１２＋、５ｅｒ２ １Ｂ、＾１ａ２２２コースブチリシンをコードする［ｌＮＡを担持していた。こ のバクテリオファージからの二重ｌＤＮＡを１ｃｏＲｉ及び【吐Ｉの組み合わせ で消化し、その後、弧已−スブチリジン遺伝子の５つの突然変異を有するＤＮＡ の１．．８ｋｂフラグメンＩ・を、ヒｏＲ１及びｊ工ｌで予め消化しておいたｐ Ａ８１１１０６に連結した。形成されたプラスミドｐＡＭＢ１４５を［８５１７ Ｍ。 ５ｅｒＩＯ’、Ｌｅｕ””、Ｓｅｒ””、＾ｌ、Ｌ２２２］−スブチリシンの合 成及び分泌のために枯草菌宿主細胞に導入することができる。 及１ｉＲ はとんどのＢａｃｉｌｌｕｓ種は周囲の増殖培地にアルカリ性及び／又は中性プ ロテアーゼを分泌するので、アルカリ性及び中性プロテアーゼの合成を阻止する ために枯草菌の内因性アルカリ及び中性プロテアーゼに突然変異を導入し、突然 変異したスブチリシン遺伝子が突然変異細胞に導入されると突然変異スブチリシ ンを産生じ、この突然変異スブチリシンがその後、無傷のスブチリシン想似体の 単離を妨げ得る他のプロテアーゼを含まない培地中に分泌されるようにすること が好ましい。検出可能な細胞外プロテアーゼを産生しない２つの突然変異枯草菌 株ＢＺ２４及びＢＺ２５３次の手順に１．たがって構築！、た。 まず、大腸菌で複製することが可能であり且つ相同組換により枯草菌染色体に組 み込まれない限り枯草菌では複製することができないプラスミドベクターを次の ように構築した。プラスミドｐＢＤ６４（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　Ｇｅｎｅｔｉｃ　 Ｓｔ、ｏｃｋ　Ｃｅｎ１．ｅｒ。 Ｎｏ、ＩＥ２２）を石ＩＩで完全に消化し、２．９５ｋｂ、ｉ、ｏｋｂ及び０． ７５ｋｂの寸法の３つのフラグメントを生成した。次にこれらのフラグメントを 混合物として、予めＣｌａ　ｌで消化しておいたプラスミドｐＢＲ３２２（Ａ、 Ｔ、Ｃ，Ｃ，３７０１７）ニ連結した。連結産物を形質転換により大腸菌Ｃ６０ ０（＾ＩＩｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎか ら＾、Ｔ、Ｃ，Ｃ，２３７２４として入手可能）に導入した［Ｍａｎｄｅｌ他、 Ｊ、　Ｍｏ１．　Ｂｉｏｌ、、　５３．１５４（１９７０）］、クロラムフェニ コール（２０ｕｙ／ｉ１）及びアンピシリン（５０ｎ／ｉ１）に耐性の細胞を選 択した。Ｂｉｒｎｂｏｉｍ他、Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、、７．１ ５１３−１５２３（１９７９）により記載されているアルカリ抽出手順により１ ２個の形質転換細胞からのプラスミドＤＮＡを作成し、Ｂｉｎ↓■及びＥｃｏＲ Ｉの組み合わせで消化し、挿入されたフラグメントの存在を確認した。１つのこ のようなプラスミド（ｐへＭ８３０と命名）はｐＢＲ３２２のＣ１ａ　１部位に ｐＢＤ６４の１．０及び０．７５１１眩■フラグメントを担持することが判明し た。これらのフラグメントは大腸菌及び枯草菌で機能的なりロラムフェニコール アセチルトランスフェラーゼ（９工）を含む、［！ＪＬＬＩＩ及ｐＡＭＢ３０は 枯草菌において機能的な複製配列の起点を欠失しているので、枯草菌宿主細胞中 で自律的レプリコンとして複製することができない。他方、ｐＡＭＢ３０は大腸 菌において機能的なｐＢＲ３２２から誘導された複製起点を含んでおり、したが って、プラスミドは大腸菌宿主細胞で増殖され得る。 プラスミドｐＡＭＢ３０は少なくとも２つの点で有用である。第１に、枯草菌に 機能的複製起点を含むＤＮ＾フラグメントはｐ＾ＭＢ３０にクローニングすると 検出され得、プラスミドは染色体外状態で自律的に複製する。第２に、プラスミ ドｐＡＭＢ３０は染色体とｐＡＭＢ３０にクローニングした枯草菌ＯＮ八との開 の相同部位で枯草菌のゲノムに組み込むことができる。このことは、ｐＡＭＢ３ ０に類似するがこれと同一ではないプラスミドベヒクルを使用してＨａｌｄｅｎ ｗａｎｇ他、Ｊ、Ｌ８Ｉｃｔｅｒｉｏ１８．１４２、９Ｏ−９８（１９８０）及 びＹｏｕｎｇ、　Ｊ、　Ｇｅｎ、　ＭｉｃｒｏｂｉｏＬ２．１２９．１４９７− １５１２（１９８３）により立証されている。 プラスミドｐＡＭＢ２１　（実施例１に記載〉をＥｃｏＲｌ及びｂ工Ｉで消化し 　１．Ｏｋｂフラグメント上でｕ土Ｅ遺伝子を単離した。 フラグメントを予めＥｃｏＲｌ及びｂ工Ｉで消化しておいたｐ＾ＨＢ３０に連結 した。連結産物を形質転換により大腸菌Ｃ６００に導入した。ｐＡＭＢ３０のア ンピシリン耐性をコードする構造遺伝子にｐＡＭＢ２１のｘＬＬＥフラグメント を挿入する結果としてアンピシリン（５０ｕｙ／ｌｆ）にＳ受性なりロラムフェ ニコール耐性（２０ｕｙ＃１）宿主細胞を選択した。形成されたプラスミドｐＡ ＭＢ３０／２１はｐＡＭＢ３０と同一の特性を有するが、その他に機能的なり± Ｅ遺伝子を有する。 成熟スブチリシンの最後の２２６個のアミノ酸をコードする領域を欠損する吐已 遺伝子を担持するプラスミドｐＡＭＢ１１０を陸！Ｒ１及び石Ｉで消化した。己 遺伝子発現のための遺伝子調節配列、ｐｒｅ−ｐｒｏ領域、成熟スブチリシンの 最初の４９個のアミノ酸をコードするＤＮ＾配列及び３゛非コ一デイング配列を 含む枯草菌ＤＮ＾の１．９ｋｂフラグメントを、予め【ｃｏＲｌ及び１立１で消 化しておいたｐ＾Ｍ　Ｂ　３０　／　２１に連結した。 連結産物を形質転換により大腸菌Ｃ６００に導入した。数個の形質転換細胞から のプラスミドＤＮ＾をＢｉｒｎｂｏｉ−他、前出の文献に記載のアルカリ抽出手 順により単離し、挿入した１゜９ｋｂフラグメントの存在を多重制限エンドヌク レアーゼ消化により確認した。１つのこのようなプラスミドをｐＡＭＢ３０１と 命名し、これをその後の使用のために保存しｔ：。 枯草菌株ＢＧＳＣＩＡ２７４（Ｂａｅｉｌｌｕｓ　Ｇｅｎｅｔｉｃ　５ｔｏｃｋ 　Ｃｅｎｔｅｒ）は！ｌ！Ｊ２二遺伝子座に突然変異を有しており、細胞外中性 プロテアーゼを産生ずることができない。プラスミドｐ／１ＭＢ５０１をコンピ テント細胞の形質転換により枯草菌Ｂ（：ＳＣ１＾２７４のゲノムに組み込んだ ［５ｐｉｚｉｚｅｎ、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、ｌｖ部 ｌ、　４４．１０７２−１０７８（１９５８）コ、クロラムフェニコール耐性（ ５１１？＃／）宿主細胞を選択し、１．５％（ｗ／ｖ）脱脂粉乳及び（ｈＩ？／ ｚ１）を補充したＬ〜寒天培地に滅菌爪楊枝でこれを移１７た。コロニーの周囲 に鮮明なハローを形成することができなかった細胞は、に突然変異と新たに導入 された吐己、突然変異の組み合わせにより細胞外中性及びセリンプロテアーゼを 産生ずる能力をもたない。ｄ然変異は野生型己遺伝子をｐＡＭＢ３０１に担持さ れる欠失型で置換することにより成熟スブチリシンの最後の２２６個のアミノ酸 を欠失させることであった。ＢＺ２４と命名されるこのような１つの株はＮｐｒ −Ａｐｒ”Ｃｍ’表現型を有しており、したがって、検出可能な細胞外中性プロ テアーゼも細胞外アルカリ性プロテアーゼも産生ぜず、クロラムフェニコール（ ５ｕｙ／ｚｆ）に耐性である。サザンブロッティング［５ｏｕｔｈｅｒｎ、　昌 ｈ１．Ｂｉｏ１．．旺、　５０３−５１７（１９”１５）］を使用し、て枯草菌 ＢＺ２４の染色体上の吐堕遺伝子の欠失を確認した。抗生物質選択の不在下に枯 草菌ＢＺ３５を抗生物質培地Ｎｏ、３（Ｐｅｎａｓｓａｙ　Ｂｒｏｔｈ、　Ｄｉ ｒｃｏ、　Ｄｅｔｒｏｉｔ、　Ｍｉｃｈｉｇａｎ）で約３２世代培養した処、Ｂ Ｚ２４染色体中で不安定にために宿主細胞にクロラムフェニコール耐性を与える 匡遺伝子を喪失したＢＺ２４の誘導株が単離された。このような現象は先に５ｔ ａｈｌ他、Ｊ、　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、、　！５８．４１１−４１８（１９８４ ）により記載されている。ＢＺ２４のクロラムフェニコール怒受性誘導株をＢＺ ２５と命名した。枯草菌ＢＺ２５はＮｐｒ−＾ｐｒ−表現型を有しており、した がって、検出可能な細胞外中性プロテアーゼも細胞外アルカリ性プロテアーゼも 産生じない、サザンブロツティングを使用して枯草菌ＢＺ２’５の染色体上の阻 堕遺伝子の欠失を確認１−な。 枯草菌ＢＺ２５は検出可能な細胞外中性プロテアーゼもスブチリシンも産生じな いので、他のプロテアーゼを含まない周囲の増殖培地に分泌され得る突然変異ス ブチリシンを産生するためのプラスミドＤＮＡ　（例えばｐＡＭＢ１ユ３）を導 入するために有用な宿主株である。 枯草菌ＢＺ２５は培養上清を下記のようにアッセイした場合に検出可能な［取外 プロテアーゼを産生しない。（ＣｈａＢ他、前出の文献のプロトプラスト形質転 換法により導入された）７　ラスミドｐＡＭＢ１１３ヲ生廖、させる枯草菌ＢＺ ２５／ｐＡＭＢ１１．３は、培養上清を下記のようにアッセイすると十分な量の ［Ｓｅｒ”リースブチリシンを産生する。 及１１ユ 枯草菌の染色体への［Ｓｅｒ””］−スブチリシン遺伝子の組み込みは、この突 然変異遺伝子の遺伝子安定性を増加する有効な方法であると確信された。他の方 法ではプラスミドＤＮ＾を染色体外状態に維持するように選択的圧力を加えるた めに発酵培地が必要とされるが、このようなアプローチは、発酵培地中のクロラ ムフェニコールの必要をなくすこともできる。したがって、遺伝子調節配列及び 枯草菌染色体に相同のフランキングＤＮＡを有する［Ｓｅｒ””：ｌ−スブチリ シン遺伝子は、予めＥｃｏＲｌ及びｂ工Ｉの組み合わせで消化しておいたｐＡＭ Ｂ１１３の電気泳動後に低融点アガロースゲルがら単離された０次に４．０ｋｂ 　ＥｃｏＲＩ−Ｐｓ工■フラグメント（図４）をＥｃｏＲＩ及びＰｓｔ　Ｉの組 み合わせで予め消化しておいたｐＮ８３０（図５）に連結した。連結産物を形質 転換により大腸菌１１ＢＩＯＩ　（＾、Ｔ、Ｃ，Ｃ，３３６９４）に導入した。 クロラムフェニコール（２０１／μｙ＃Ｚ）に耐性の細胞を選択した。上記基準 に合致する４つの形質転換細胞からのプラスミドＤＮＡをＢｉｒｎｂｏｉ−他、 前出の文献に記載のアルカリ抽出手順により単離し、その後、ＥｃｏＲｌ及びｂ 土Ｉの組み合わせで消化した。４つのプラスミドはいずれも４．０ｋｂのインサ ートと５．６ｋｂのｐＡＭＢ３０の残りの部分とを含んでいた。１つのこのよう なプラスミド（ｐ＾ＮＢ５０２と命名）を精製し、後で使用するために保存した 。 コンビテンス法［５ｐｉｚｉｚｅΩ、前出］によりプラスミドｐＡＭ１３３０２ を枯草菌ＢＺ２５の染色体に組み込むように繰り返し試みたが不首尾に終わった 。これは、ＢＺ２５［胞が使用した方法によりコンピテントになることができな かったためであると思われる。したがってｌＣｈａｎｇ池、前出のプロトプラス ト形質転換法によりｐＡＭＢ３０２を枯草菌ＢＺ２５細胞に導入した。 この結果は、組込みが得られた被験株をコンビテンス法により形質転換に基づい て選択したという点において特に重要である。コンピテントになり得ないと思わ れる株、特にコンピテント法により形質転換に基づいて選択されなかった商用株 はコンピテントになり得ない傾向が大きいと思われる。 タロラムフェニコール耐性細胞（５μｓ／ｍｌ’）を選択し、１．５％＜＋１１ ７’Ｖ）スキムミルク及び５１１）ｌ／ＩＩ！クロラムフェニコールを補充した ｌ、−寒天培地に該細胞を滅菌爪楊枝で移した。細胞を一晩３′７°Ｃでインキ ュベ−１・しカニ。Ｃ１コロニーの周囲に種々の直径の鮮明なハローが観察され た。これは、これらの細胞によりスブチリシンが産生及び分泌されたことを示す 。アルカリ抽出法によりこれらのコロニーの８個からプラスミドＤＮＡを単離す る試みを行った。電気泳動後にＤＮＡを可視化するためにエチジウムプロミド（ １μｇ／ｍｌ）で染色したアガロースゲル上にプラスミドＤＮＡは検出されなか った。 スブチリシンを産生したＣ１細胞における染色体外プラスミドＤＮＡの不在は、 ｐＡＭ８３０２が枯草菌の染色体に組み込まれたことを示す強力な証拠であった 。 この実験の結果と１−で得られた数個のコロニーを単離し、ＢＺ２８、ＢＺ２９ 、ＢＺ３０．Ｂ２Ｓ３、Ｂ２Ｓ３及び１３ｚ３３ト命名した。各様を、５μｇ／ ＩＩＩＩ！クロラムフェニコールを補充した脳培地（ＢＨＩ。 Ｄｉｒｃｏ）で激しく撹拌しながら３７℃で一晩増殖した。培養上清のスブチリ シン活性をアッセイした。枯草菌株ＢＺ２８、ＢＺ２９、ＢＺ３０、Ｂ２Ｓ３、 Ｂ２Ｓ３及びＢＺ３３はいずれもスブチリシンを産生じ、周囲の増殖培地に分泌 し、産生量は株によって異なった。液体培地中に観察されたスブチリシンの量は 、スキムミルク１、−寒天培地上に観察されるハローの寸法に正比例していた。 これらの細胞により分泌されるスブチリシンの量は異なるので、ｐＡＭＢ３０２ の多重コピーを染色体に組み込むか又は遺伝子増幅［Ｙｏｕｎ８．　Ｊ、　Ｇｅ ｎｅ、　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、、　１２９゜１４９７４５１２（１，９８３）　 ；　　Δ１ｂｅｒｔｉｎｉ　池　、　Ｍ、　　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、、　　＋６ ２．、　　＋２０３−１２１１０９８５）］を行った。 ４１匝■ 野生型スブチリシン及びスブチリシン類似体を次のように単離及び精製した。各 培養培地を１５（＋００８で３０分間遠心分離し、透明上清中のタンパク質を（ ＮＨ−）２ｓｏ４（６００ｇ＃）で沈殿させた。沈殿を遠心分離により集め、２ ０ｍＭの２［Ｎ−モルホリノコニタンスルホン酸（ＭＥＳ）ｐｉ（６，４に溶解 させた９溶液をア七トンで３０％にし、３０％アセトン上清を遠心分離により集 めた。次に上清をγ七トンで７５％にし、３０〜７５％アセ）・ンベレットを濾 過及び真空乾燥した。 酵素を更に精製するために、乾燥沈殿を水に溶解させ、溶液をｐＨ６，４の５ｍ Ｍ　ＭＥＳ緩衝液で透析した。透析した溶液を２ｍＮ／ｍｉｎの割合でＳ−５ｅ ｐｈａｒｏｓｅ　ＦＦのカラム（２，５ｘ　１５ｃｍ）に通した。　０．０２Ｍ 　ＭＥＳでカラムを洗浄後、酵素を同一［１ｉ液中のＮａＣｌの線形勾配で０． ５Ｍ　ＮａＣｌまで溶離した。ピークフラクションをプールし、酵素を含むフラ クションからのタンパク質（アゾカゼインと混合したフラクションのサンプル中 の変色により認識〉を４℃で５ｍＭ　ＭＥＳ　ｐＨ６，３で透析し、その後、凍 結乾燥した。 大１」シリ− 純粋なスブチリシン又はスブチリシン想似体をＰｈａｒｍａｃ　ｉａ　ＦＰＬＣ ５ｕｐｅｒｒｏｓｅ　１２カラムに加え、無傷（非開裂状態）のタンパク質とし て溶出する材料を２０ｍＭ　ＭＥＳ、　０．ＩＭ　ＮａＣｌ、　ｐＨ６，４中に プールした。野生型スブチリシン又は本発明のスブチリシン類似体の被算定サン プルを同一緩衝液中、Ｍ衝液＋３％ＳＤＳ中、又は２０ｍＭ　ＭＥＳ、　０．Ｉ Ｍ　ＮａＣｌ、　５ｗ１Ｍ　ＣａＣｌ□及び１５ｍＭ　ＥＤＴΔ中で１０分間指 定温度でインキュベートした。サンプルを５分間で室温（２０°Ｃ）まで冷却し 、その後、０．６％アゾカゼインを加えたＴｒｉｓ−）ＩＣ！、　ｐＨ８，０中 で２０分間室温（２０℃）でアッセイし、タンパク質分解活性を決定した。２０ ℃、〕ＯＩＭＣａＣ１，中の野生型又は類似体の初期活性の百分率として各サン プルのタンパク質分解活性を表し、表２に示す。 Ｌ ２０　　　１００　　　　８　　　　　　　１．００７０　　　［４０１４ 例６の＾Ｓ）ｇ＝３　、、　Ｉ　Ｑ　Ｉ　、　Ｓ　、、　２１　！スブ　リシン 　伊　の孟１− １１０％　ＳＤＳ　　　　ｕ１呟０％　ＳＤＳ　＋　１５ｍ？■Ｔｌ２Ｏ１００ ５５９１ 夾１」１亙 ５ｕｐｅｒｒｏｓｅ　１．２カラム上でＦＰＬＣにより無傷のスブチリシンを得 た。無傷のスブチリシンを、４ｍＭＣａＣｌ２又は４ｖａＨＥＤＴ八と種々の量 のＳＤＳとを含有する１５ｎＭ　ＭＥＳ、　０．０５Ｍ　ＮａＣｌ、　ｐＨ６゜ ３中で３０分間室温（２０℃）でインキュベートした。次にＴｒｉｓ−ＣＩ、　 ｐＨ８゜Ｏ中の０．６％アゾカゼイン中で２０分間インキュベートすることによ り酵素のタンパク質分解活性を決定した。 算定した各サンプルのタンパク質分解活性を、０％ＳＤＳ及び１０ＩｍＭＣａ２ ′″中のサンプルの初期活性の百分率として表３に示す。 宍」Ｌ ０．１　　　　　　　　　　　１００　　　　　　　　　　　　　７６０．２５ 　　　　　　　　　　１００　　　　　　　　　　　　　　４５０．５０　　　 　　　　　　　　７６　　　　　　　　　　　　　１３０．７５　　　　　　　 　　　　６３　　　　　　　　　　　　　　３１．０　　　　　　　　　　　６ ０　　　　　　　　　　　　　　０２．０　　　　　　　　　　　２９　　　　 　　　　　　　　　　０３．０　　　　　　　　　　　１７　　　　　　　　　 　　　　　００．１　　　　　　　　　　　１００　　　　　　　　　　　　　 ９５０．２５　　　　　　　　　１．００　　　　　　　　　　　　　８６０． ５０　　　　　　　　　１００　　　　　　　　　　　　　８１０．７５　　　 　　　　　　　　９６　　　　　　　　　　　　　７９１．０　　　　　　　　 　　９６　　　　　　　　　　　７８２．０　　　　　　　　　　８６　　　　 　　　　　　　６９３．０　　　　　　　　　７１　　　　　　　　　　　６５ Ｘ１Ｊｕヱ この実験にあたり、スブチリシンを下記のように精製した。 各培養培地を１５０００．で３０分間遠心分離し、透明上清中のタンパク質を（ Ｎｉｌｓ）ｚｓＯ，（６００ｇ／ｊ’）で沈殿させた。沈殿を遠心分離により集 め、７５％アセトンと共に微粉砕し、ｒ過及び真空乾燥した。 酵素を更に精製するために、乾燥した沈殿を水に溶解させ、溶液をア過し、その 後、０．０２Ｍリン酸ナトリウム緩衝液、ｐｉ（６，３で透析した。透析した溶 液を２瀧β／ｍｉｎの速度でカルボキシメチルセルロースのカラム（２，５ｘ　 、１５ｃｍ）に通した。 カラムを０．０２Ｎリン酸すＩ〜リウム（ｐｉ（６，３）で洗浄後、０．１５Ｍ のＮａＣＩを含有する同一緩衝液で酵素を溶離した。ピークフラクションをプー ルし、酵素を含むフラクションからのタンパクａ＜スクシニル−し−アラニル− し−アラニル−Ｌ−プロリル−Ｌ−フェニルフェニルアラニル−ｐ−ニトロアニ リド（Ｖｃ４ａ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ）と混合したフラクションのサンプ ル中の変色により認識）を２．５容のアセトンの添加により沈殿させた。 沈殿を遠心分離により集め、その後、０．００５Ｍ酢酸カルシウムに溶解（約１ ｚ１／１０ｉｙ）させた、形成された溶液を４℃で水で透析し、その後、凍結乾 燥した。 ［Ａｓｐ”、５ｅｒ１０’、Ｓｅｒ”ｌ′］スブチリシン類似体、［Ａｓｐ”、 Ｃ１ｕ　？　Ｉ　、　Ｓ　ｅ　ｒ　ｌ　Ｏ＠　、　Ｓ　ｅ　ｒ　２１１　］スブ チリシン類似体及びＣａｒｌｓｂｅｒｇスブチリシンの安定性を３種の温度（２ ５℃、３７℃及び５０℃）で２種ノｖＬ衝溶ｉ（０，０６Ｎｌ、Ｊ　７酸＋　） 　！Ｊ　ｒ７ム、ｐＨ９，０又ハ０．１２Ｍグリシン酸ナトリウム、ｐＨ１１， ０＞中で算定した。結果を特定条件下の酵素の半寿命として表４に示す。 表土 Ａ、　０．１２Ｍグリシン酸す）　’）　ラムｐＨ１１，Ｏ＋　０．２％ＳＤＳ 中エヱ九止２Ｚ　　　　　　　　　　　　廊但バユ　　店（ト）互江　　代但味 ユ［Ａｓｐ２６．５ｅｒｌ　０９　、Ｓｅ、２１　！コ類似体　　　　　１１０ 日　　　３５．２時間　　６．７時間ＣａｒｌｓｂｅｒＢスブチリシン　　　　 　　　　　２日　　　８，４時間　　０．５３時間［Ａｓｐ”、Ｇｌｕ７ｇ、Ｓ ｅｒ”’、Ｓｅｒ””］ｉ似体　　１５４日　　　３５．３時間　　７．８時間 Ｂ、　０．０６Ｍリン酸ナトリウムｐＨ９，０＋０．０２％ＳＯＳ中ム１九丈ン Ｚ　　　　　　　　　　　廊佳打Ｊ　惑胆乃ｎ　　昏但虹ユ「＾５ｐ７５　、Ｓ ｅ、＋　０９　、Ｓｅ、２　＋　８コ類似体　　　　７９．２時間　　１６．０ 時間　　０．５２時間Ｃａｒｌｓｂｅｒ８スブチリシン　　　　　　　１７，３ 時間　　２．４時間　　０，１８時間「＾５ｐ７６、（：ｌｕ”、Ｓｅｒ’°ｇ 、５ｅｒ２１１１類似体　８６．３時間　　２２．０時間　　０．９６時１Ｃ， ０，１，２Ｍグリシン酸ナトリウムｐｌｉ１１．０＋５＋６Ｍ　ＥＤＴＡ中ム１ カム１土法ンＺ　　　　　　　　　廊佳罫ユ　　葺但乃は　　賃Ω味ユ［Ａｓｐ ”、Ｓｅｒ”’、Ｓｅｒ””］類似体　　　　２８，７時間　　１．８７時間　 　０．２５時１間ａｒｌｓｂｅｒ６スブチリシン　　　　　　　２４時間　　　 １，７１時間　　０．４５時間［Ａｓｐ”、Ｇｌｕ”、５ｅｒ１０’、Ｓｅｒ” ”：ｌｉ似体　２１．５時間　　１．４２時間　　０．２０時間り、　０．０６ Ｍリン酸六ト・リウムｐＨ９，Ｏ＋５加Ｍ　ＥＤＴＡ中ムヱカ迭ンＺ　　　　　 　　　　　　　立塁巧−ら（ト）＝ユ　　１源ｙ仄］［＾５ｐ７６．５ｅｒｌ０ ％、Ｓｅ％＋８］類似体　　　　２７４時間　　１７５時間　　０．２３時間Ｃ ａｒｌｓｌＪｅｒ８スブチリシンＣａｒｌｓｂｅｒｇ　　　　２６．３時１’ｆ ｉ　　　１．６８時間　　０．３２時口［＾ｓ　ｐ　７Ｇ　、　Ｇ　ｌ　ｕ　７ 　％　、　Ｓｅ　ｒ　ｌ　Ｏ９、Ｓ　ｅ　ｒ　２　ｌ　８　’ｊ　Ｍ似体　１９ ７時間　　１．３６條■@　０．１７時間 Ｗ互 八ｓ７６５ｅｒ１０９．５ｅｒ２１！、八１ａ２２２−スブ　リ各コニ≦ヒニー 二Ｔ１：σスーΔｍ畝困」Ｌ 実施例１４に記載したように枯草菌ＢＺ２５／ｐＡＭＢ１４３発酵培地から［＾ ５ｐ７ｓ、５ｅｒ１０！、Ｓｅｒ？Ｉｓ、へ１ａ２２２］−スブチリシンを精製 した。このスダチリジン類似体の熱安定性、漂白剤中の安定性及び比活性を以下 に記載するように試験した。 １、熱安定性 （：１ｌｆｏｒｄ　Ｍｏｄｅｌ　Ｒｅ５ｐｏｎｓｅＩＩ　５ｐｅｃｔｒｏ−ｐｈ ｏｔ、ｏｍｅｔ、ｅｒの熱プログラムを使用して［＾５ｐｙｓ、Ｓｅ、＋ｏ＊、 Ｓ、、ｉｔ−＾１ａ２２２］−スブチリシン及び［＾ｓｐ？　ｉ　、　Ｓ　ｅｒ ｌ　Ｏ９、Ｓｅ　ｒ　２１１’コースブチリシン及び野生型酵素（＾ｐｒ＾）の 熱安定性を法定した。２０ｎＮ　ＮＥＳ、　Ｏ，ゴＮ　ＮａＣ１ｐｌ＋６．３中 の精製プロテアーゼのサンプルを種々の濃度のＣａ２″′の存在下で２５°Ｃか ら９５℃に加熱した。２８７ｎｍの吸光度の減少を追跡しながら０．５℃／＋ｃ ｉｎの速度で温度を増加した。 敵点（Ｔ翰）は非折り畳み状態と折り畳み状態との集団が等しいような温度、即 ち折り畳み状態から非折り畳み状態のタンパク質への遷移の中間の温度として規 定される。熱変性はスブチリシンの不可逆的反応であって、プロテアーゼインヒ ビターの不在下で無傷の酵素消化物は非折り畳み形を消化し、インヒビターの存 在下でタンパク質は非折り畳み状態で沈殿する。したがって、Ｔｌａは安定性の 相対比較を与える。この方法を使用して決定した融点を下記に示す。 」１ １支ＬＩ ＮＤ・測定せず ２種の類似体スブチリシンの融点は試験した全カルシウム４度で非常に双似して おり、また、八ｐ「−Δ−スブチリシンの融点よりも高い。これは、残基２２２ のＭｅｔがらΔｌａへのＩ換が７６．１０９及び２１８位の置換で達せられる高 い安定性及び高いカルシウム結合アティニティーに悪影響を与えなかったことを 示す。 ■、漂白剤中の安定性 ２２２位のＮｅｔを除去する目的は酵素の酸化傾向を減少させることであったの で、［＾Ｓｐ　７　Ｇ　、　Ｓ　ｐ　ｒ　ｌ　０″、５ｅｒ２１１１−スブチリ シン及び［＾ｓｐ？＠ｊｅｒ１０１，５ｅｒ２１３．Ａｌａ２２２コースブチリ シンの漂白剤中の安定性を比較した。第］の実験では２種の類似体を５０℃でｌ ０ｍＭ　Ｔｒｉｓ　０．ＩＭ　ＮａＣｌ　ｐＨ７，５中で２％クロロックス又は ２％タロロックス＋１％ＳＤＳの存在下、又は緩衝液単独でインキュベートした 。２％クロロツクス漂白剤は繊維製品を洗濯するために消費者により一般に使用 されている量に比較して著しく過剰であることに留意すべきである０種々の時刻 でアリコートを取り出し、アゾカゼインアッセイを使用して残余１０テアーゼ活 性を決定した。結果を図８に示す。実験中一定に維持した緩＠液単独の存在下の 活性の百分率として両者の類似体の活性を表す、２％漂白剤の存在下で［八５ｐ ７１　、Ｓｅ、Ｉ　Ｏ！　、５ｅｒ２１　ＲＪｌａ２２２］は［＾５ｐ７Ｊｅ、 １°５゜Ｓｅ　ｒ　２　ｌ　ｎ］よりも高活性を維持し、一方、両者の類似体は ２％クロロックス及び】％ＳＯＳの存在下で５０℃で迅速に活性を失うことが判 明した。この実験の間に観察された興味深い知見として、同一条件下で同一量の タンパク質を使用した場合、［＾ｓｐ？６．５ｅｒ１０う５　ｅ　ｒ　２１８　 ］は［＾５ｐ）６．Ｓｅ、１０９．５ｅｒ２１Ｎ、＾１ａ２２２コよりも著しく 高い活性を有していた。これについては以下により詳細に説明する。 ［八ｓｐ”、Ｓｅｒ”’、５ｅｒ２目、八ｌａ’）２〕及び［八ｓｐ”、Ｓｅｒ ”９，５ｅｔ２１′］の構造に対する漂白剤の効果を同様に５ＯＳ−ＰＡ（：Ｅ を使用して調べた。両方の類似体を５０℃で２０ＩＩＩＭ　Ｔｒｉｓ、　０．Ｉ Ｍ　ＮａＣ１゜１ｍＭ　ＰＭＳＦ、　ｐＨ７，５中で２％クロロックス又は２％ クロロックス＋１％ＳＯＳの存在下でインキュベートした。種々の時刻で３０μ ！を取り出し、１　ｍ　Ｍ　Ｐ　Ｍ　Ｓ　Ｆを含有する冷温（４°Ｃ）サンプル 緩衝液１５μｇと混合し、実験が完了するまで４℃で保存した。 次にサンプルを１２．５％ポリアクリルアミド分解ゲル上で５ＤＳ−ＰＡＧＥに かけた。クーマシーブルー染料で染色することによりタンパク質を可視化し、レ ーザーデンシトメトリーを使用して無傷の折り畳７ノ状態のタンパク質（ゲルの 頂部）、無傷の非折り畳み状態のタンパク質（ゲルの中間）及びタンパク質分解 産物（ゲルよりも更に下）の量を定量した。類似体［Δ５ｐ７６．５ｅｒｌ　０ ９．５ｅｒ２１１１］では２％クロロックス中で１時間後にタンパク質の４５％ が正確に折り畳まれており、漂白剤中で２時間後には全タンパク質が非折り畳み 状態となり１、その大部分が消化された。想似体［＾５ｐ７１，５ｅｒＩＯＪｅ ｒ２１８１Δ１．２２２］では漂白剤中で１時間後にプロテアーゼの５６％がま だ折り畳み状態であり、２％クロロックス中で５０℃で２時間インキュベーショ ン後でさえもタンパク質全体の２０％が無傷であった。２％漂白剤、１％ＳＤＳ 中で両者の類似体の挙動は非常に類似しており、５分間インキュベーション後に ７５％が依然として無傷の折り畳み状態であり、１５分後に依然と１．て折り畳 み状態のタンパ′り質全体は２７％まで減少した。 ［八ｓｐ７＠、５ｅｒ１０９．５ｅｒ２１Ｑ、八１ａ２２２］はこの特定のア’ ンセイのために使用した濃度で変性剤く漂白剤及び５ＤＳ）の組み合わせに対し てさ程の安定性の増加は示さないが、漂白剤変性に対して高い耐性を示す。 ■、活性 上述したように、類似体［＾ｓ　ｐ　”　＋　Ｓ　ｅ　ｒ　”　”　＋　Ｓｅ　 ｒ　２’　”　＋＾１ａ２２すは類似体［Ａｓｐ７ｇ、５ｅｒ１０９，５ｅｒ２ １１］よりもアゾカゼインに対して低い比活性を有しており、Ｖｍの概数値は［ ＾５ｐ７ｒ′Ｊ、、ｒ１６’、５ｅｒ２目コの０．０８ｄ＾／（ｗｉｎ−ｍｇ／ ｘｉりに対して約０．０２ｄΔ／（ｗｉｎ−１ｍｇｈｌ＞である、この活性の低 下がアゾカゼインに特異的であるのか又は［Ａｓｐ７Ｇ、５ｅｒＩＯ！、Ｓｅ、 ２１ｎ、へ１ａ２２２］類似体の一般特徴であるのかを知るなめに、人工ペブチ ドスクンニル＾１ａ−八Ｉａ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−バラ−ニトロアニリドの加水分 解の動力学を［＾ｓ　ｐ　７　Ｇ　、　ｓｅ　ｒ　ｌ　Ｏ！　、　ｓｅ　ｒ　２ １　ｍ９層＆２２２］及び［＾ｓｐ”、Ｓｅｒ””、５ｅｒ２Ｉｓ］について分 析した。類似体［＾Ｓｐ７′、５ｅｒＩ０Ｊｅｒ２１″］は４４ＯｕＭのに−及 び７，９ｄ＾／（ｗｉｎ−ｎｍｏｌｅ＞のＶ＋ａｘを有していた。これらの両方 の値は先の分析で得られた値に一致している。基質の［＾ｓ　ｐ　？　＠　、　 Ｓｅ　ｒ　ｌ　Ｇ　％　、　Ｓｅ　ｒ　２　ｌ　８．＾１ａ１’ｉ’２］のＫ１ １は１．４ｍＭであり、Ｖｎａｘは１．１ｄ＾／（ｓｉｎ−ｎｍｏｌｅ）であっ た、これは基質親和性の３分の１の減少と比活性の７分の１の減少を表す、この 比活性はａｐｒ＾−スブチリシンの４分の１である。触媒Ｓｅｒは２２１位にあ り、２２２位の置換は基質結合及びタンパク質分解の律速段階に干渉することが 判明した。 Ｉｌｌ 実施例１８に既に明記したように、［＾５ｐ７ＧＪｅｒＩＯＩ、５ｅｒ２１！。 ＾１ａ２２リースブチリシンは［＾５ｐ７Ｊｅ、ＩＱ″、５ｅｒ２１Ｊ−スブチ リシンよりもアゾカゼインに対して低い比活性を有しており、同様に合成ペプチ ド５ＡＡＰＦｐＮ基質に対して低い比活性を有する。この結果はＥｓｔｅｌｌ他 、Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、　２６０．６５６４−６５７０、１９８６によ り記載されているようにＢａｃｉｌｌｕｓ　７ｕｅｆａｃｉｅｎｓに由来する１ ３ＰＮ’スブチリシンの＾ｊａ２２２類似体における活性の損失に一致する。カ ゼイン又はアゾカゼインは洗剤酵素製造業者及び洗剤調合業者によりプロテアー ゼの活性を決定するための基質として常用されているので、［八ｓ　ｐ　’　＠ 　、　Ｓ　ｅ　ｒ　＋　’　％　、　Ｓ　ｅ　ｒアＩモ、へ１ａ２２２］−スブ チリシンは汚染した衣料で実施される洗濯試験で改良された性能を示すとは予想 されなかった。 本実施例に示すように、［＾５ｐ７６．５ｅｒ１ｏ’、Ｓｅｔ””、へ１＆２２ ２コースブチリシン類似体は予想外の結果を生じ、数種の条件下で汚染した衣料 から汚れを除去するにあたり終始一貫して改良された性能を示した１図９及び図 １０の条件は以下の通りである。 一丸洗い条件、１０分間洗濯、 一、ｐＨ約７のリン酸入りＦｒｅｓｈ　５ｔａｒｔ（登録商標）、ｐＨ約９の無 リン酸Ｆｒｅｓｈ　５ｔａｒｔ（登録商標）、−８０°及び１２０°Ｆの洗濯温 度、 −１５０ｐｐＭの水硬度、 一綿布に血液／ミルク／インク（ＢＮＩ）及び６５％ダクロン／３５％綿布にチ ョコレートファツジプディング（ＣＦＰ）の２種の染みをつけた布を夫々３片、 一対照：　Ｆｒｅｓｈ　５ｔａｒｔ（登録商標）中の１．５％＾１ｃａｌｓｅ（ 登録商標）、 Ｆｒｅｓｈ　５ｔａｒｔ（登録商標）中の１．５％７ｅｒｍａＢＩ（登録商標） 、 一プロテアーゼについてはアゾカゼイン単位／屑（、アミラーゼについてはジニ トロサリチル酸単位／口に基づいて等活性で酵素を試験した。 図１０の凡例を以下に示す。 １生−Ｌ！！Ｌｉ　　？ＬＬ　　　　　１良＾　無リン酸　　８０″Ｆ　血液／ ミルク／インクＢ　無リン酸　８０″Ｆ　チョコレートファツジプディングＣ無 リン酸　１２０”Ｆ　　血液／ミルク／インクＤ　無リン酸１２０°Ｆ　チョコ レートファツジプディングＥ　リンｉｊｌ！２８０°Ｆ　血液／ミルク／インク Ｆ　リンｕ　　　８０＠Ｆ　　チョコレートファツジプディングＧ　リン酸　　 １２０″Ｆ　血液／ミルク／インクＨリン酸　　１２０″Ｆ　チョコレートファ ツジプディング［＾ｓｐ？Ｊｅ、１０９，５ｅｒ２１８．へ１ａ２２２］−スブ チリシンの量をＮｏｖＯΔ１ｅａｌａｓｅ対照の３分の１の活性で使用した場合 にも、本発明の類似体は依然と１．て表６の性能において優れていた。 表Ｌ １００’Ｆにおする＾ｓ７８５ｅｒ１０！　Ｓｅ、２１！＾１，２２２−スブ　 １シン１ン　　　Ｆｒｅｓｈ　５ｔａｒｔ　　　　　の１１１Ｙ旺 Ｎｏｖｏ　　　　１４３ バラスＩ一本なし　　　　　　　　　７２．６　　　７６．６バラストあり　　 　　　　　　　　４４．０　　　５６．４バラストによる合計Ｒｄ損失　　　２ ８．６　　　２０．２Ｎｏｖｏ使用量は９ａｚｏ／Ｌ、１４３使用量は３ａｚｏ ／Ｌとしした。 本バラストは染みをつけた布片サンプル以外に洗濯機に入れた別の汚れた衣類を 意味する。 以上、本発明を好適態様について説明したが、当業者には変形及び改良が予想さ れるものと理解されたい。例えば、本明細書中に記載した特定のカルシウム以外 のカルシウム結合部位の残基を置換しても同様に安定性３更に改良できることが 予想される。＾５ｎ−Ｃ１ｙ配列を有する他の酵素及びこの配列を含む他の酵素 にこのような置換を行うと、安定性を更に改良できることが予想される。他の酵 素にこのような置換を行うと共に活性部位のアミノ酸の周囲のアミノ酸の修飾を タンパク質に組み込むと、比活性を更に改良できることも予想される。夫々１つ の置換により、各単一置換は安定性、カルシウム結合又は酵素の比活性を改良す ることができるが、商用酵素を製造するためには１つの酵素に数個の修飾を組み 合わせることが必要である。更に、各アミノ酸置換は酵素の一次構造を改質させ 、静電効果を介して隣接するアミノ酸残基、水素結合等に影響し得るので、置換 の組み合わせが必ずしも酵素に付加的な改良を加えるとは限らない０本発明の適 正な組み合わせにより、優れた特性を有するスブチリシンを製造することができ る。更に、本発明のスブチリシン類似体は例えばいずれも９考資料として本明細 書の一部に加える米国特許第３７３２１７０号、米国特許第３７４９６７１号及 び米国特許第３７９０４８２号に開示されているような洗剤調合物中で野生型ス ブチリシンよりも優れた特性を有することが予想される。 更に、実用上の理由で多くの工業的プロセスはほとんどの酵素の安定性温度範囲 よりも高い温度で実施される。したがって、本明細書中では洗剤への適用を強調 したが、本発明のスブチリシンはかねてより安定なスブチリシンを必要としてい る洗剤産業のような所定の産業に有利であるばかりでなく、タンパク質を加水分 解するための化学的手段、例えば植物及び動物タンパク質の加水分解を使用する 産業でも有用であると考えられる７ したがって、本発明は請求の範囲に記載するような本発明の範囲に該当する限り このような全変形及び改良を包含すると意図される。 ＦＩＧ、１ ＦＩＧ、　３ 二：］　ＦＢＤ＆４　ＤＮＡ Ｐｅ１Ｌ″！１２２嗅 ＦＩＧ−４ ＦＩＧ、５ ＝コｒ６０−ロＮ１ｋ −Ｐｂｔ’ｓｌυ嚇 Ｆｌ、Ｇ、　６ ＦＩＧ、　７ 海辺Ｉ　　　　　　　　　　　　　　　　　　）ｌ　ｉ　ｎｄ　Ｘ　工ＸＭ１３ 　Ｉ１８工４ ％　５〜″タケ品十メ Ｆｌ、ダ排宏庚 国際調査報告

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．（１）天然に産生するＢａｃｉｌｌｕｓスブチリシンのカルシウム結合部位 に存在するアミノ酸の１個以上を負に帯電されたアミノ酸により置換し、（２） 天然に産生するＢａｃｉｌｌｕｓスブチリシンの任意のＡｓｙ−Ｇｌｙ配列の１ 個以上を欠失又は別のアミノ酸により置換し、（３）１個以上のメチオニン残基 を別のアミノ酸により置換し、（４）触媒トライアドの周囲の１個以上のアミノ 酸残基を別のアミノ酸により置換することにより修飾された天然に産生するＢａ ｃｉｌｌｕｓスブチリシンのアミノ酸配列を有することを特徴とするスブチリシ ン類似体。 ２．類似体がＣａｒｌｓｂｅｒｇスブチリシン、ＤＹスブチリシン、ＢＰＮ′ス ブチリシン、枯草菌のａｐｒＡスブチリシン及びＢａｃｉｌｌｕｓ　ｍｅｓｅｎ ｔｅｒｉｃｕｓ由来のスブチリシンから選択される天然に産生するＢａｃｉｌｌ ｕｓスブチリシンの類似体であることを特徴とする請求項１に記載のスブチリシ ン類似体。 ３，Ａｓｐ４１、Ｌｅｕ７５、Ａｓｎ７６、Ａｓｎ７７、Ｓｅｒ７８、Ｉｌｅ７ ９、Ｃｌｙ８０、Ｖａｌ８１、Ｔｈｒ２０８及びＴｙｒ２１４により表されるカ ルシウム結合部位のアミノ酸の１個以上が負に帯電されたアミノ酸で置換されて いることを特徴とする請求項１に記載のスブチリシン類似体。 ４．負に帯電されたアミノ酸がＡｓｐ又はＧｌｕであることを特徴とする請求項 ３に記載のスブチリシン。 ５．Ａｓｎ７６がＡｄｐ７６で置換されていることを特徴とする請求項４に記載 のスブチリシン類似体。 ６．Ｉｌｅ７９がＧｌｕ７９で置換されていることを特徴とする請求項４に記載 の類似体。 ７．Ａｓｎ７６がＡｓｐ７６で置換されており、Ｉｌｅ７９がＧｌｕ７９で置換 されていることを特徴とする請求項４に記載のスブチリシン類似体。 ８．Ａｓｎ−Ｇｌｙ配列中のＡｓｎ残基が別のアミノ酸の残基により置換されて いることを特徴とする請求項１に記載のスブチリシン類似体。 ９．該Ａｓｎ−Ｇｌｙ配列中のＡｓｎ残基がＳｅｒ、Ｖａｌ、Ｔｈｒ、Ｃｙｓ、 Ｇｌｕ及びＩｌｅから構成される群から選択されるアミノ酸の残基により置換さ れていることを特徴とする請求項８に記載の類似体。 １０．Ａｓｎ−Ｇｌｙ配列中のＡｓｎ残基がＳｅｒにより置換されていることを 特徴とする請求項９に記載のスブチリシン類似体。 １１．１０９位のＡｓｎ残基がＳｅｒにより置換されていることを特徴とする請 求項１０に記載のスブチリシン類似体。 １２．２１８位のＡｓｎ残基がＳｅｒにより置換されていることを特徴とする請 求項１０に記載のスブチリシン類似体。 １３．１０９及び２１８位のＡｓｎ残基がＳｅｒにより置換されていることを特 徴とする請求項１０に記載のスブチリシン類似体。 １４．［Ａｓｐ７６，Ｓｅｒ１０９，Ｓｅｒ２１８］スブチリシン、［Ｇｌｕ７ ９，Ｓｅｒ１０９，Ｓｅｒ２１８］スブチリシン及び［Ａｓｐ７６，Ｇｌｕ７９ ，Ｓｅｒ１０９，Ｓｅｒ２１８］スブチリシンから構成される群から選択される 請求項１３に記載のスブチリシン類似体。 １５．該１個以上のメチオニン残基がアラニン又はロイシンにより置換されてい ることを特徴とする請求項１に記載のスブチリシン類似体。 １６．Ｍｅｔ２２２がＡｌａにより置換されていることを特徴とする請求項１５ に記載のスブチリシン類似体。 １７．Ｍｅｔ１２４がＬｅｕ又はＡｌａにより置換されていることを特徴とする 請求項１５に記載のスブチリシン類似体。 １８．触媒トライアドの周囲の該１個以上のアミノ酸がＩｌｅ３１、Ｓｅｒ３３ 、Ｓｅｒ５２、Ｓｅｒ６３、Ｔｙｒ２１７及びＡｒｇ２４７であることを特徴と する請求項１に記載のスブチリシン類似体。 １９．Ｌｅｕ３１、Ｔｈｒ３３、Ａｓｎ６２、Ｇｌｙ６３、Ｌｅｕ２１７及びＬ ｅｕ２４７の置換の１個以上を含む請求項１８に記載のスブチリシン類似体。 ２０．Ｂａｃｉｌｌｕｓスブチリシンが表１に示す天然に産生するアミノ酸配列 を有することを特徴とする請求項１に記載のスブチリシン類似体。 ２１．Ｃｌｕ７９、Ｌｅｕ１２４又はＡｌａ１２４、Ｌｅｕ２１７、Ｔｈｒ３３ 、Ａｓｎ６２、Ｌｅｕ３１、Ｌｅｕ２４７及びＧｌｙ６３から構成される群から 選択される置換の１個以上を更に有する［Ａｓｐ７６，Ｓｅｒ１０９，Ｓｅｒ２ １８，Ａｌａ２２２］スブチリシン。 ２２．［Ａｓｐ７６，Ｓｅｒ１０９，Ｓｅｒ２１８，Ａｌａ２２２］スブチリシ ン、［Ｌｅｕ３ｌ，Ａｓｐ７６，Ｓｅｒ１０９，Ｓｅｒ２１８，Ａｌａ２２２］ スブチリシン、［Ａｓｐ７６，Ｓｅｒ１０９，Ｌｅｕ１２４，Ｓｅｒ２１８，Ａ ｌａ２２２］スブチリシン及び［Ａｓｐ７６，Ｓｅｒ１０９，Ａｌａ１２４，Ｓ ｅｒ２１８，Ａｌａ２２２〕スブチリシンから構成される群がら選択される請求 項１に記載のスブチリシン類似体。 ２３．カルシウム結合部位を含むアミノ酸配列とＡｓｎ−Ｇｌｙ配列とを有する Ｂａｃｉｌｌｕｓスブチリシンの類似体をコードするＤＮＡ配列であって、（１ ）カルシウム結合部位のアミノ酸の１個以上をコードするコドンが欠失又は負に 帯電されたアミノ酸をコードするコドンにより置換されており、（２）Ａｓｎ− Ｇｌｙ配列中のアミノ酸の１個以上をコードするコドンが欠失又は別のアミノ酸 残基をコードするコドンにより置換されており、（３）１個以上のメチオニン残 基をコードするコドンが別のアミノ酸をコードするコドンにより置換されており 、（４）触媒トライアドの周囲の１個以上のアミノ酸残基をコードするコドンが 別のアミノ酸をコードするコドンにより置換されていることを特徴とするＤＮＡ 配列。 ２４．カルシウム結合部位を有するＢａｃｉｌｌｕｓスブチリシンの熱、酸化及 びｐＨ安定性を改良するための方法であって、カルシウム結合部位におけるアミ ノ酸残基を負に帯電されたアミノ酸で置換する段階と、Ａｓｎ−Ｇｌｙ配列中の アミノ酸の１個以上を置換又は欠失させる段階と、１個以上のメチオニン残基を 別のアミノ酸で置換する段階と、触媒トライアドの周囲の１個以上のアミノ酸残 基を別のアミノ酸により置換する段階とを含む方法。 ２５．請求項１に記載のスブチリシン類似体の有効量を洗剤調合物中に含有する 組成物。