FI89805B - Foerfarande foer framstaellning av terapeutiskt anvaendbara, substituerade purinarabinosider - Google Patents

Description

B 9 8 05

Menetelmä terapeuttisesti käyttökelpoisten, substituoitu-jen puriiniarabinosidien valmistamiseksi Tämä keksintö koskee tiettyjen substituoitujen pu-5 riiniarabinosidien ja niiden fysiologisesti hyväksyttävien johdannaisten, erityisesti estereiden valmistusta. Yhdisteet ovat käyttökelpoisia tiettyjen DNA-virussairauksien hoidossa.

Varicella-herpes zostervirus (VZV), joka aiheuttaa 10 vesirokkoa ja vyöruusua, on herpessukuun kuuluva DNA-vi-rus. Varicella (vesirokko) on primaarinen sairaus, jonka VZV aiheuttaa isännässä, jolla ei ole immuniteettia, ja se on yleensä pienten lasten lievä sairaus, joka ilmenee kuumeena ja kutisevana ihottumana. Herpes zoster (vyöruusu) 15 on sairauden uusiutuva muoto, joka esiintyy aikuisilla, jotka ovat aikaisemmin saaneet varicella zoster-infektion. Tämän infektion kliinisille ilmenemismuodoille on tunnusomaista hermosärky ja ihon rakkulainen ihottuma, joka on jakautunut toispuoleisesti iholla. Tulehduksen leviäminen 20 voi johtaa halvaukseen tai kouristuksiin ja koomaan, jos tauti etenee aivo- ja selkäydinkalvoihin.

Potilailla, joilla on heikentynyt immuniteetti, virus voi hajakylväytyä aiheuttaen vakavia, usein kohtalokkaita sairauksia. Heikentyneen immuniteetin syy voi 25 olla lääkkeet, joita on käytetty kudos- tai elinsiirtopo-tilailla tai pahanlaatuisten kasvainten hoidossa, tai sairaudet, kuten AIDS, jotka tuhoavat immuunijärjestelmän jättäen uhrin haavoittuvaksi infektioille, jotka eivät muuten olisi vaarallisia.

30 Sytomegalovirus (CMV) on toinen herpessukuun kuulu va virus. Infektio voidaan saada lapsuudessa tai varhaisessa aikuisiässä ja sikiövaiheessa, kohdunsisäinen infektio on todennäköisesti yleisin tartuntamuoto, mutta aina 90 % saakka synnynnäisistä tartunnoista on syntyessä oi-35 reettomia. Äidin raskauden aikaisen primaarinfektion aja- 2 82005 teilaan yleensä aiheuttavan suurimman riskin syntymättömälle lapselle, kun taas sikiökautisten infektioiden uudelleen aktivoituminen on yleensä kliinisesti hiljainen. Kliiniset vaikutukset vaihtelevat kuolemasta ja vaikeista sairauksista (pienipäisyys, maksan ja pernan suurentuma, keltaisuus, henkinen jälkeenjääneisyys) kehityshäiriöiden ja rinta- ja korvainfektioalttiuden kautta kaikkien näkyvien sairausvaikutusten puuttumiseen. Nuorilla aikuisilla infektio voi hyvin mennä huomaamatta tai ilmetä rauhaskuu-^ , meen kaltaisena sairautena, joka aiheutuu läheisestä fyysisestä kontaktista.

Samalla tavalla vakavia infektioita voi myös sattua piilevän viruksen uudelleenaktivoitumisen seurauksena potilailla, joilla on vajavainen immuniteetti, kuten on esi-^ j tetty VZV-infektioille. Tällaiset infektiot johtavat verkkokalvon tulehdukseen, keuhkokuumeeseen ja gastrointes-tinaalisiin häiriöihin sairastumisen tiheyden kasvuun ja niiden tuhoisuuden lisääntymiseen.

Nyt on todettu, että tietyillä puriiniarabinonuk-L ) leosideilla, joita alla esitetään ja joille on tunnusomaista puriinirenkaan 2- ja 6-asemaan substituoidut ryhmät, on tehokas vaikutus ihmisen virusinfektioita vastaan, erityisesti niitä, jotka ovat varicella zosterviruksen (VZV) tai sytomegaloviruksen (CMV) aiheuttamia.

. 5 Tiettyjä substituoituja puriiniarabinonukleoside- ja, erityisesti 9-B-D-arabinofuranosyyli-6-metoksi-9H-pu-riini, 9-B-D-arabinofuranosyyli-6-pyrrolidino-9H-puriini, 9-B-Darabinofuranosyyli-6-metyyliamino-9H-puriini ja 9-B-D-arabinofuranosyyli-6-dimetyyliamino-9H-puriini, joita . 0 seuraavassa esitetään niiden käytön kannalta VZV- ja CMV-infektioiden hoidossa, on aikaisemmin esitetty julkaisuissa J. Org. Chem. Voi 27, 3274-9 (1962); Cancer Treatment Rep. 60(10), 1567-84 (1976); Tetrahedron 40(4), 709-13 (1984); Canada J. Biochem. 43(1), 1-15 (1965); J. Med.

5 Chem. 12, 498-504 (1969); J. Biol. Chem. 251 (13), 3 ;;π Π 5 4055-61 (1976); Ann. N.Y. Acad. Sci. 284, 81-90 (1977); EP002192; US3666856; US4371613; US3758684.

Keksinnön kohteena on menetelmä kaavan (I) mukaisten, terapeuttisesti käyttökelpoisten substituoitujen pu-5 riiniarabinosidien ja niiden farmaseuttisesti hyväksyttävien johdannaisten, kuten farmaseuttisesti hyväksyttävien eettereiden, suolojen, estereiden tai tällaisten esterei-den suolojen valmistamiseksi,

Ri

10 I

X /N

I \

HO \ J

15 yv

OH

jossa Rx on metoksi, etoksi, propoksi tai jodi; halogeenilla substituoitu C^-a lkoksi ryhmä; aminoryhmä, joka on mono-20 substituoitu metyylillä, C1.5-alkyylillä, joka on substituoitu yhdellä tai useammalla fluoriatomilla, tai C3_6-syk-loalkyylillä tai joka on disubstituoitu C^-alkyylillä, C^-alkyylillä, joka on substituoitu yhdellä tai useammalla fluoriatomilla, tai C3_6-sykloalkyylillä; tai on aminoryhmä, 25 joka on osa rengasta, jossa on 4-7 hiiliatomia ja mahdollisesti kaksoissldos ja/tai toinen typpiatomi; ja R2 on vety, halogeeni tai amino, edellyttäen, että silloin kun yhdiste ei ole farmaseuttisesti hyväksyttävän johdannaisen muodossa ja R2 on vety, Rx ei ole metoksi, dimetyyliamino, 30 piperidino tai pyrrolidino.

Edellä esitetyssä kaavassa (I) alkyyliryhmät (mukaan lukien ne, jotka ovat alkoksi-, alkyyliamino- tai dialkyyliaminoryhmissä) ovat edullisesti metyyli-, etyyli-tai propyyliryhmiä.

35 Edullisiin kaavan (I) mukaisiin yhdisteisiin kuulu vat ne, joissa

: :) o n C

4 : J c 1 O

(a) R2 on vety, ja (b) Rx on metoksi, tai (c) Ra on Cj.s-alkyyliamino, erityisesti dimetyyliamino, tai (d) Rx on jodi.

Seuraavat yhdisteet ovat edullisia tämän keksinnön mukaisia yhdisteitä johtuen niiden tehokkaasta virusvas-taisesta vaikutuksesta VZV:a tai CMV:a vastaan 1) 9-B-D-arabinofuranosyyli-6-metyyliamino-9H-puriini, 2) 9-B-D-arabinofuranosyyli-6-dimetyyliamino-9H-puriini, 1/ 3) 9-B-D-arabinofuranosyyli-6-metoksi-9H-puriini.

4) 9-B-D-arabinofuranosyyli-6-etoksi-9H-puriini, 5) 9-B-D-arabinofuranosyyli-6-jodi-9H-puriini, 6) 9-B-D-arabinofuranosyyli-2-amino-6-jodipuriini.

7) 9-B-D-arabinofuranosyyli-6-pyrrolidino-9H-puriini.

8) 9-B-D-arabinofuranosyyli-2-kloori-6-metyyliamino-9H-puriini.

9) 9-B-D-arabinofuranosyyli-6-syklopropyyliamino-9H-pu-riini.

10) 9-B-D-arabinofuranosyyli-6-etyylimetyyliamino-9H- 1j puriini.

11) 9-B-D-arabinofuranosyyli-2-amino-6-metoksi-9H-puriini.

12) 9-B-D-arabinofuranosyyli-6-n-propoksi-9H-puriini.

Edellä olevista numeroiduista yhdisteistä yhdisteet 2, 3 ja 5 ovat erityisen edullisia. Tämä keksintö käsit-i i tää myös uusia kaavan (I) mukaisia yhdisteitä ja niiden fysiologisesti hyväksyttäviä johdannaisia, erityisesti edellä luetellut yhdisteet 4, 5, 6, 8, 9, 10, 11 ja 12.

Kaavan I mukaisia yhdisteitä käytetään erityisesti ihmisen VZV:n tai CMV:n aiheuttamien virusinfektioiden .3 hoidossa.

Kaavan (I) mukaisten yhdisteiden farmaseuttisesti hyväksyttävillä johdannaisilla tarkoitetaan farmaseuttisesti hyväksyttäviä eettereitä, suoloja, estereitä tai tällaisen esterin suoloja tai mitä tahansa muita yhdistei-5 tä, jotka ihmiselle annettuna pystyvät aikaansaamaan (suo- 5 /) :: 5 rasti tai epäsuorasti) kaavan (I) mukaisen yhdisteen tai sen virusvastaisesti vaikuttavan aineenvaihduntatuotteen tai jäännöksen.

Edellä esitettyjen kaavan (I) mukaisten yhdisteiden 5 farmaseuttisesti hyväksyttävät esterit ovat erityisen edullisia, koska ne kykenevät aikaansaamaan suuria pitoisuuksia alkuperäistä yhdistettä potilaan plasmassa oraalisen annon jälkeen. Tämä keksintö tuo esiin erityisen edullisena uusien yhdisteiden luokkana edellä esitetyn yhdis-10 teen 3 farmaseuttisesti hyväksyttävät esterit, jotka ovat muodostuneet arabino-sokeriosan 2'-, 3'- ja/tai 5'-hyd-roksyyliryhmän esteröitymisellä.

Erityisen edullisiin kaavan (I) mukaisten yhdisteiden johdannaisiin kuuluvat arabino-sokerijäännöksen 15 mono-, di- ja triesterit, jotka on substituoitu mainitun jäännöksen 2’-, 3'- ja 5’-asemaan.

Tällaisiin edullisiin estereihin kuuluvat karbok-syylihappoesterit, joissa esterin karbonyylitön osa voi olla suoraketjuinen tai haaroittunut alkyyli (esim. n-20 propyyli, t-butyyli, n-butyyli), alkoksialkyyli (esim. metoksimetyyli), aralkyyli (esim. bentsyyli), aryyliok-sialkyyli (esim. fenoksimetyyli), aryyli (esim. fenyyli), joka on mahdollisesti substituoitu halogeenilla, C^-alkyylillä tai C^-alkoksilla, nitrolla tai aminolla; 25 sulfonaattiesterit kuten alkyylisulfonyyli- tai aryylial-kyylisulfonyyliesteri (esim. metaanisulfonyyli- tai tosyy-lisulfonyyliesteri); aminohappoesterit (esim. L-valyyli); ja mono-, di- tai trifosfaattiesterit. Näiden estereiden farmaseuttisesti hyväksyttäviin suoloihin kuuluvat nat-30 rium-, kalium-, NR4+-, jossa R on H tai C1_6-alkyyli, ja happoadditiosuolat. Edellä esitetyissä esteriryhmissä alkyyliryhmät (mukaan lukien alkoksiryhmissä olevat) sisältävät 1-12 hiiliatomia ja aryyliryhmät ovat edullisesti fenyylejä.

35 Seuraavat esterit ja eetterit ovat edullisia, uusia tämän keksinnön mukaisia yhdisteitä: 6 ;: 9 η Ί 5 13. 9-(5-0-bentsoyyli-B-D-arabinofuranosyyli)-6-metoksi-9H-purii.nl 14. 6-metoksi-9-[5-0-(4-metyylifenyylisulfonyyli ^B-D-arabinofuranosyyli] -9H-puriini .

, 15. 6-metoksi-9-(5-0-metyylisulfonyyliJ-B-D-arabinofura- nosyyli )-9H-puriini.

16. 9-(5-0-(4-metyylibentsoyyli)-B-D-arabinofuranosyyli)- 6-metoksi-9H-puriini.

17. 9-(5-0-(4-klooribentsoyyli)-B-D-arabinofuranosyyli)- 1J 6-metoksi-9H-puriini.

18. 9-(5-0-(4-metoksibentsoyyli)-B-D-arabinofuranosyyli)- 6-metoksi-9H-puriini.

19. 6-metoksi-9-(5-0-fenyyliasetyyli-B-D-arabinofurano-syyli)-9H-puriini.

. j 20. 6-met:oksi-9-( 5-0-fenyylioksiasetyyli-B-D-arabinofura- nosyyli)-9-H-puriini.

21. 6-metoksi-9-(5-0-metoksiasetyyli-B-D-arabinofurano-syyli)-9H-puriini.

22. 9-[5-0-(4-nitrobentsoyyli)-B-D-arabinofuranosyyli]-6- . J metoksi-9H-puriini.

23. 6-metoksi-9-(5-0-pentanoyyli-B-D-arabinofuranosyyli)-9H-puriini.

24. 9-[5-0-(4-aminobentsoyyli)-B-D-arabinofuranosyyli]-6-metoksi-9H-puriini.

.i 25. 6-metoksi-9-(5-0-propionyyli-B-D-arabinofuranosyyli)- 9H-puriini.

26. 9-(5-0-butanoyyli-B-D-arabinofuranosyyli)-6-metoksi-9H-puriini.

27. 9-[5-0-(2,2-dimetyylipropionyyli)-B-D-arabinofuranos- . 0 yyli]-6-metoksi-9H-puriini.

28. 9-(5-0-asetyyli-B-D-arabinofuranosyyli)-6-metoksi-9H-puriini.

29. 6-metoksi-9-[5-0-(2-metyylipropionyyli)-B-D-arabinofuranosyyli ] -9H-puriini.

5 30. 6-metoksi-9-[2-0-(2,2-dimetyylipropionyyli)-B-D-ara- binofuranosyyli]-9H-puriini.

7 m 9 8 0 5 31. 6-metoksi-9-[(2,3,5-tri-O-asetyyli)-β-D-arabinofura-nosyyli]-9H-puriini.

32. 6-metoksi-9-(2-0-pentanoyyli-B-D-arabinofuranosyyli)-9H-puriini.

5 33. 9-(2-0-butanoyyli-B-D-arabinofuranosyyli)-6-metoksi- 9H-puriini.

34. 6-metoksi-9-[2-0-(2-metyylipropionyyli)-B-D-arabino-furanosyyli]-9H-puriini.

35. 9-(3-0-bentsoyyli-B-D-arabinofuranosyyli)-6-metoksi- 10 9H-puriini.

36. 9-( 2,3-anhydro-B-D-lyksof uranosyyli )-6-met:oksipurii-ni.

37. 6-metoksi-9-[(2-0-(4-metoksibentsoyyli)-8-D-arabi-nofuranosyyli]-9H-puriini.

15 38. 6-metoksi-9-t(2-0-(4-metyylibentsoyyll)-β-D-arabi nof uranosyyli] -9H-puriini .

39. 9-[2-0-(4-klooribentsoyyli)-β-D-arabinofuranosyyli]- 6-metoksi-9H-puriini.

40. 6-metoksi-9-[3,5-0-(1,1,3,3-tetraisopropyyli-l,3- 20 disiloksan-l,3-diyyli)-β-D-arabinofuranosyyli] -9H-puriini.

41. 6-metoksi-9-[2-0-(2-aminobentsoyyli)-β-D-arabinofuranosyyli] -9H-puriini.

42. 6-metoksi-9-[2-(4-metyylibentsoyyli)-3,5-0-(1,1,3,3-tetraisopropyylidisiloksan-1,3-diyyli)-β-D-arabinofurano- 25 syyli]-9H-puriini.

43. 6-metoksi-9-[2-(4-metoksibentsoyyli)-3,5-0-(1,1,3,3-tetraisopropyylidisiloksan-1,3-diyyli)-β-D-arabinofurano-syyli]-9H-puriini.

44. 9-[2—(4-klooribentsoyyli)-3,5-0-(1,1,3,3-tetraisopro- 30 pyylidisiloksan-1,3-diyyli)-β-D-arabinofuranosyyli]-6- metoksi-9H-puriini.

45. 9-B-D-arabinofuranosyyli-6-dimet:yyliamiini-9H-purii-nin 5'-monofosfaattiesteri.

46. 6-metoksipuriiniarabinosidl-5'-monofosfaatti.

35 47. 6-metoksipuriiniarabinosidi-5'-trifosfaatti.

'} Γ! Π C

8 · ·' ' ' o

Erityisen edullisia ovat yhdisteet 16, 24 ja 32 edellä.

Kaavan (I) mukaisiin puriininukleosideihin ja niiden johdannaisiin viitataan tästä eteenpäin keksinnön mukaisina yhdisteinä tai vaikuttavina aineosina.

Kaavan (I) mukaisia yhdisteitä käytetään ihmisen VZV:n tai CMV:n aiheuttamien virusinfektioiden hoitoon tai ennaltaehkäisyyn tarkoitetun lääkkeen valmistuksessa.

Kaavan (I) mukaisilla yhdisteillä esitetään VZV-1 tai CMV-virusten replikaatio nisäkkään isäntäsoluissa käyttämällä infektoituneisiin soluihin vaikuttava, viruksen replikoitumisen estävä määrä kaavan (I) mukaista yhdistettä tai sen farmaseuttisesti hyväksyttävää johdannaista .

λ , Kaavan (I) mukainen yhdiste ja sen farmaseuttisesti hyväksyttävät johdannaiset (joihin tämän jälkeen viitataan kollektiivisesti vaikuttavina aineosina), voidaan antaa käyttäen mitä tahansa hoidettavaan tilaan sopivaa tietä, jolloin sopiviin teihin kuuluvat oraalinen, rektaalinen, _ j nasaalinen, paikallinen (mukaan lukien posken kautta tai kielenalaisesti), emättimen kautta ja parenteraalisesti (mukaan lukien ihon alle, lihakseen, suonensisäisesti, ihonsisäisesti, intratekaalisesti tai epiduraalisesti). On syytä huomata, että edullinen tie voi vaihdella, esimer-. j kiksi, vastaanottajan tilan mukaan.

Kussakin edellä mainitussa käyttötarkoituksessa ja indikaatiossa vaadittava vaikuttavan aineosan (kuten edellä on määritelty) määrä riippuu lukuisista tekijöistä mukaan lukien hoidettavan tilan vakavuus ja vastaanottajan 0 identiteetti, ja se on viime kädessä hoitavan lääkärin harkinnan varassa. Kuitenkin yleensä kuhunkin näistä käyttötarkoituksista ja indikaatioista sopiva, tehokas annos on välillä 0,1-250 mg vastaanottajan ruumiin painokiloa kohti päivässä, edullisesti välillä 0,1-100 mg ruumiin 5 painokiloa kohti ja edullisimmin välillä 1-20 mg ruumiin 9 ' Ί Ρ Η ζ painokiloa kohti päivässä, optimiannos on noin 15 mg ruumiin painokiloa kohti päivässä (ellei toisin mainita, kaikki vaikuttavan aineosan painot on laskettu alkuperäisenä kaavan (I) mukaisena yhdisteenä, suoloille ja este-5 reille luvut kasvaisivat vastaavassa suhteessa). Haluttu annos annetaan edullisesti kahtena, kolmena, neljänä tai useampana osaannoksena antaen sopivin aikavälein koko päivän kuluessa. Nämä osa-annokset voidaan antaa annosyksik-kömuotoina, jotka sisältävät esimerkiksi 5-1000 mg, edul-10 lisesti 20-500 mg ja edullisimmin 100-400 mg vaikuttavaa aineosaa annosyksikössä.

Samalla kun on mahdollista antaa vaikuttavat aineosat yksin, on edullista antaa ne farmaseuttisina valmisteina. Nämä valmisteet sisältävät vähintään yhtä edellä 15 määriteltyä vaikuttavaa aineosaa yhdessä yhden tai useamman hyväksyttävän kantajan ja mahdollisesti muiden terapeuttisten aineosien kanssa. Kantajan (kantajien) on oltava "hyväksyttäviä" siinä mielessä, että ne sopivat yhteen valmisteen muiden aineosien kanssa eivätkä ne ole vahin-20 gollisia niiden vastaanottajalle.

Valmisteisiin kuuluvat ne, jotka ovat sopivia oraaliseen, rektaaliseen, nasaaliseen, paikalliseen (mukaan lukien posken kautta tai kielenalaisesti), emättimen kautta tapahtuvaan ja parenteraaliseen (mukaan lukien ihon al-25 le, lihakseen, suonensisäisesti, ihonsisäisesti, intrate- kaalisesti tai epiduraalisesti) antotapaan. Valmisteet voidaan käytännöllisesti antaa annosyksikkömuotoina, ja ne voidaan valmistaa millä tahansa farmasian alalla hyvin tunnetulla menetelmällä. Tällaisiin menetelmiin kuuluu 30 vaihe, jossa vaikuttava aineosa yhdistetään kantajaan, joka koostuu yhdestä tai useammasta apuaineesta. Yleensä valmisteet valmistetaan yhdistämällä vaikuttava aineosa tasaisesti ja perinpohjaisesti nestemäisten kantajien tai hienoksi jauhettujen kiinteiden kantajien tai niiden mo-35 lempien kanssa ja sitten, jos on tarpeen, muovaamalla tuote.

! '} one

10 ' -•O

Tämän keksinnön mukaiset valmisteet, jotka soveltuvat oraalisesti annettaviksi, voidaan antaa erillisinä yksikköinä kuten kapseleina, tärkkelyskapseleina tai tabletteina, joista kukin sisältää ennalta määrätyn määrän vaikuttavaa aineosaa, jauheena tai rakeina, liuoksena tai suspensiona vesipitoisessa nesteessä tai vedettömässä nesteessä, tai nestemäisenä öljy-vesiemulsiona tai nestemäisenä vesi-öljyemulsiona. Vaikuttava aineosa voi olla myös boluksena, lääkepuurona tai pastana.

Tabletti voidaan tehdä puristamalla tai muottiin valamalla, mahdollisesti yhden tai useamman lisäaineen kanssa. Puristetut tabletit voidaan valmistaa puristamalla vaikuttava aine, joka on vapaasti virtaavassa muodossa, kuten jauheena tai rakeina, mahdollisesti sekoitettuna 1 sideaineen (esim. providoni, gelatiini, hydroksipropyyli- metyyliselluloosa), liukastavan aineen, inertin laimen-timen, säilytysaineen, paakkuuntumisenestoaineen (esim. natriumtärkkelysglykolaatti, ristisidottu providoni, ristisidottu natriumkarboksimetyyliselluloosa), pinta-^ aktiivisen aineen tai dispergoivan aineen kanssa sopivassa laitteessa. Valamalla valmistetut tabletit voidaan tehdä valamalla muottiin sopivassa koneessa seos, jossa on jauhettua yhdistettä, joka on kostutettu inertillä nestemäisellä laimentimella. Tabletit voidaan mahdollisesti päällystää tai loveta ja ne voidaan valmistaa niin, että saadaan aikaan hidas tai säädelty vaikuttavan aineosan vapautuminen käyttämällä niissä esimerkiksi hydroksipropyylime-tyyliselluloosaa vaihtelevissa suhteissa, niin että saadaan aikaan haluttu vapautumisprofiili.

. ) Silmän tai muiden ulkoisten kudosten, esim. suun ja ihon, infektioihin valmisteita käytetään edullisesti paikallisena voiteena tai emulsiovoiteena, jotka sisältävät vaikuttavaa aineosaa määrän, joka on esim. 0,075-20 pai-no-%, edullisesti 0,2-15 paino-% ja edullisimmin 0,5-10 . ) paino-%. Kun valmiste on voide, vaikuttava aineosa voi- i

XX

daan käyttää joko paraffUnisessa tai veteen sekoittuvan voidepohjan kanssa. Vaihtoehtoisesti vaikuttavat aineosat voidaan valmistaa emulsiovoiteeksi öljy-vesivoidepohjan kanssa.

5 Jos halutaan, emulsiovoiteen vesifaasi voi sisäl tää, esimerkiksi, vähintään 30 paino-% moniarvoista alkoholia eli alkoholia, jossa on kaksi tai useampi hydroksyy-liryhmä, kuten propyleeniglykoli, butaani-1,3-dioli, man-nitoli, sorbitoli, glyseroli ja polyetyleeniglykoli, ja 10 niiden seoksia. Paikalliset valmisteet voivat haluttaessa sisältää yhdistettä, joka parantaa vaikuttavan aineosan absorptiota tai tunkeutumista ihon tai muiden affektoitu-neiden alueiden läpi. Esimerkkejä tällaisista ihoon tunkeutumista edistävistä aineista ovat dimetyylisulfoksidi 15 ja sen kaltaiset analogit.

Tämän keksinnön mukaisten emulsioiden öljyfaasi voidaan muodostaa tunnetuista aineosista tunnetulla tavalla. Joskin faasi voi sisältää yksinomaan emulgoimisainetta (tunnettu toisella nimellä emulgaattori), se toivottavasti 20 sisältää seosta, jossa on ainakin yhtä emulgoimisainetta yhdessä rasvan tai öljyn kanssa tai sekä rasvan että öljyn kanssa. Edullisesti mukana on hydrofiilistä emulgaattoria yhdessä lipofiilisen emulgaattorin kanssa, joka toimii stabiloimisaineena. On myös edullista, että mukana on sekä 25 öljyä että rasvaa. Yhdessä emulgoimisaine (aineet) stabi- loimisaineen (aineiden) kanssa muodostavat niin kutsutun emulgoimisvahan, ja vaha yhdessä öljyn ja/tai rasvan kanssa muodostavat niin kutsutun perusemulsiovoiteen joka muodostaa emulsiovoidevalmisteiden öljymäisen dispergoidun 30 faasin.

Emulgaattoreita ja emulsion stabiloimisaineita, jotka soveltuvat käytettäväksi tämän keksinnön mukaisessa valmisteessa, ovat Tween 60 ja Span 80, setostearyylial-koholi, myristyylialkoholi, glyseryylimonostearaatti ja 35 natriumlauryylisulfaatti.

12 : >005

Valmisteeseen sopivien öljyjen ja rasvojen valinta perustuu haluttujen kosmeettisten ominaisuuksien aikaan saamiseen, koska vaikuttavan yhdisteen liukoisuus useimpiin farmaseuttisissa emulsiomuodosteluissa todennäköisesti käytettyihin öljyihin on hyvin pieni. Siten voiteen tulisi olla edullisesti rasvaton, tahraamaton ja pestävä tuote, jolla on sopiva konsistenssi vuotojen välttämiseksi putkiloista tai muista astioista. Voidaan käyttää suora-ketjuisia tai haaroittuneita yksi- tai kaksiemäksisiä al-kyyliestereitä kuten di-isoadipaatti, isosetyylistearaat-ti, kookospähkinän rasvahappojen propyleeniglykolidieste-ri, isopropyylimyristaatti, dekyylioleaatti, isopropyyli-palmitaatti, butyylistearaatti, 2-etyyliheksyylipalmitaat-ti tai haaroittuneiden estereiden seos tunnettu nimellä Crodamol CAP, joista kolme viimeistä ovat edullisia este-reitä. Näitä voidaan käyttää yksin tai yhdistelminä riippuen vaadituista ominaisuuksista. Vaihtoehtoisesti voidaan käyttää korkealla sulavia lipidejä kuten valkoista pehmeää paraffiiniä ja/tal nestemäistä paraffiiniä tai muita mineraaliöljyjä.

Valmisteisiin, jotka soveltuvat paikallisesti annettavaksi silmään, kuuluvat silmätipat, joissa vaikuttava aineosa on liuotettu tai suspendoitu sopivaan kantajaan, erityisesti vaikuttavaa aineosaa varten olevaan vesipitoi-j seen liuottimeen. Vaikuttavaa aineosaa on edullisesti tällaisissa koostumuksissa pitoisuuksina 0,5-20 paino-%, edullisemmin 0,5-10 paino-%, erityisesti noin 1,5 paino-%.

Valmisteisiin, jotka soveltuvat paikallisesti an-J nettaviksi suuhun, kuuluvat tabletit, jotka sisältävät vaikuttavan aineosan makuainetta sisältävässä pohja-aineessa, yleensä sakkaroosi ja arabikumi tai tragantti; pastillit, jotka sisältävät vaikuttavan aineen inertissä pohja-aineessa kuten gelatiini ja glyseriini tai sakkaroo-5 si ja arabikumi; ja suuhuuhteet, jotka sisältävät vaikuttavan aineosan sopivassa nestemäisessä kantajassa.

ρ, η c 13 · ’ ^

Rektaalista antoa varten olevat koostumukset voidaan antaa peräpuikkoina, jossa on sopiva pohja-aine, joka koostuu esimerkiksi kaakaovoista tai salisylaatista.

Nasaalisesti annettaviksi soveltuviin valmistei-5 siin, joissa kantaja on kiinteä aine, kuuluvat karkea jauhe, jonka partikkelikoko on esimerkiksi välillä 20-500 mikronia ja joka annetaan nuuhkaisemalla, eli nopealla sisäänhengityksellä nenäkäytävien läpi, jauhetta sisältävästä astiasta, jota pidetään lähellä nenää. Sopivia valio misteita, joissa kantaja on neste, annettavaksi esimerkiksi nenäsuihkeena tai nenätippoina ovat vaikuttavaa aineosaa sisältävät vesi- tai öljypitoiset liuokset.

Valmisteet, jotka soveltuvat annettavaksi emättimen kautta, voidaan antaa pessaari-, tamponi-, emulsiovoide, 15 geeli-, pasta-, vaahto- tai suihkevalmisteina, jotka sisältävät vaikuttavan aineosan lisäksi sellaisia kantajia, jotka tiedetään alalla sopiviksi.

Parenteraaliseen antoon sopiviin valmisteisiin kuuluvat vesipitoiset ja vedettömät steriilit injektioliuok-20 set, jotka voivat sisältää hapettumisenestoaineita, puskureita, bakteerien kasvua ehkäiseviä aineita ja liuenneita aineita, jotka säätävät valmisteen isotoniseksi aiotun vastaanottajan veren kanssa; vesipitoiset ja vedettömät steriilit suspensiot, jotka voivat sisältää suspen-25 doivia aineita ja paksunnosaineita. Valmisteet voivat olla annosyksikön tai useita annosyksikköjä sisältävissä astioissa, esimerkiksi suljetuissa ampulleissa ja lääkepul-loissa, ja ne voidaan varastoida pakastekuivatussa (lyofi-lisoidussa) tilassa, jolloin vaaditaan ainoastaan sterii-30 Iin nestemäisen kantajan, esimerkiksi injektioihin tarkoitetun veden, lisääminen välittömästi ennen käyttöä. Sellaisenaan valmiit injektioliuokset ja suspensiot voidaan valmistaa edellä kuvatun kaltaisista steriileistä jauheista, rakeista ja tableteista.

35 Edullisia annosyksikkövalmisteita ovat ne, jotka sisältävät vaikuttavaa aineosaa päivittäisannoksen tai 14 ' 9 p. ns päivittäisannoksen osa-annoksen, kuten tässä edellä selostettiin, tai sopivan osan siitä.

On syytä huomata, että erityisesti edellä mainittujen aineosien lisäksi tämän keksinnön mukaiset valmisteet voivat sisältää muita alalla tyypillisiä aineita, jotka liittyvät kyseessä olevan tyyppiseen valmisteeseen, esimerkiksi ne, jotka sopivat oraaliseen antoon, voivat sisältää makuaineita.

Kaavan I mukaisia yhdisteitä tai sen farmaseuttisesti hyväksyttäviä johdannaisia valmistetaan siten, että A. annetaan yhdisteen, jolla on kaava (II)

Ri Α,Χ) u"

H

jossa Rj ja R2 ovat edellä määriteltyjä, reagoida yhdisteen kanssa, jolla on kaava (III) i H°—l^0 \ (III)

OH

i jossa X on pyrimidiini- tai puriiniemäs (muu kuin kaavan (II) mukainen yhdiste), tai B. annetaan yhdisteen, jolla on kaava (IV) z

J 1 /N

r Ύ \ A/vv ,,v’

OH

i , . ' o c 15 · - ·.: Ο jossa Z on poistuva ryhmä ja R2 on edellä määritelty, reagoida yhdisteen kanssa, joka kykenee tuomaan vaadittavan ryhmän 6-asemaan, ja mahdollisesti sen jälkeen tai samanaikaisesti sen kanssa, silloin kun saatu yhdiste on kaavan 5 (I) mukainen, muutetaan se farmaseuttisesti hyväksyttäväk si johdannaisekseen, tai silloin kun saatu yhdiste on farmaseuttisesti hyväksyttävä johdannainen, muutetaan se toiseksi farmaseuttisesti hyväksyttäväksi johdannaiseksi tai kaavan (I) mukaiseksi yhdisteeksi.

10 Menetelmässä A X on edullisesti urasiiliemäs. Reak tio voidaan suorittaa, esimerkiksi, käsittelemällä kaavan (II) ja (III) mukaisia yhdisteitä 1 entsyymillä kuten fos-forylaasientsyymillä, esimerkiksi, uridiinifosforylaasilla tai puriininukleosidifosforylaasilla tai niiden seoksella, 15 edullisesti fosfaattisuolan läsnä ollessa pH:ssa 5,0-9,0 ja lämpötilassa 15-90 °C, edullisesti 40-60 eC.

Mitä tulee menetelmään B, se voidaan suorittaa julkaisussa Reist E.J. et ai., J. Org. Chem. 27 (1962) 3274-3279 esitetyn menettelyn mukaisesti. Kätevä poistuva ryhmä 20 on halogeeniatomi esimerkiksi kloori, ja reaktio suoritetaan edullisesti orgaanisessa liuottimessa, esim. absoluuttisessa metanolissa, aineen avulla, joka kykenee tuomaan vaadittavan ryhmän 6-asemaan, esimerkiksi sopivalla amiinilla siinä tapauksessa, että Rj on alkyyli- tai dial- 25 kyyliaminoryhmä.

Kaavan (I) mukaisten yhdisteiden fysiologisesti hyväksyttävät esterit ja suolat voidaan valmistaa tavanomaisella tavalla, esimerkiksi esterit voidaan valmistaa esteröimällä alkuperäinen yhdiste sopivalla asyylihaloge-30 nidilla tai anhydridillä. Vaihtoehtoisesti esterit voidaan valmistaa korvaamalla sopiva poistuva ryhmä, esim. haloge-nidi, sopivalla karboksyylihapolla tai avaamalla sopiva alkuperäisen yhdisteen anhydronukleosidi sopivalla karboksyylihapolla tai sen suolalla.

35 Seuraavat esimerkit kuvaavat tätä keksintöä, mutta niitä ei tulisi pitää millään tavalla keksintöä rajoittavina.

16 :, 9 8 j 5

Esimerkki 1 9-B-D-arabinofuranosyyli-6-metyyliamino-9H-puriini 6-tioli-9-(B-D-arabinofuranosyyli)-9-H-puriini (Reist. E. J. et. ai., J. Org. Chem. 27 (1962) 3274-3279) (0,35 mmol, 100 mg) ja 5 ml absoluuttista metanolia yhdistettiin ja jäähdytettiin lämpötilaan -10 °C suojaten samalla kosteudelta. Kloorikaasua kuplitettiin varovasti suspension läpi kaksi minuuttia. Saatua liuosta sekoitettiin viisi minuuttia -10 °C:ssa, ja sitten kuuplitettiin kuivaa typpeä kylmän liuoksen läpi 15 minuuttia, kunnes liika kloori oli poistunut. Lisättiin 2 ml 40 % metyyliamiinin vesiliuosta reaktioseokseen, jota kuumennettiin sitten ruostumattomasta teräksestä tehdyssä pommissa 115 °C:ssa 4,5 tuntia. Pommi jäähdytettiin 0 "C:een, ja sisältö haihdutettiin kuiviin, jolloin saatiin otsikon yhdistettä saannolla 88 %. Vedestä suoritetun uudelleenkiteytyksen jälkeen näytteen sulamispiste oli 201,5-202,5 °C.

Analyysi CnH13N504: lie laskettu: C: 47,0, H: 5,38, N: 24,9 havaittu: C: 47,2, H: 5,72, N: 25,2 Esimerkki 2 9-B-D-arabinofuranosyyli-6-dimetyyliaminopuriini

6-dimetyyliaminopuriini (Sigma Chemical Co. St. Louis, MO) (6,4 mmol, 1,04 g) ja urasiiliarabinosidi - (Torrence, P.F. et ai., J. Med. Chem., 22(3) (1979) 316-319) (8 mmol, 1,96 g) yhdistettiin 0,412 litrassa 5 mM

kaliumfosfaattia, jonka pH oli 8,0 ja jossa oli 0,02 % kaliumatsidia. Lisättiin puhdistettua puriininukleosidi-fosforylaasia (3260 yksikköä) ja uridiinifosforylaasia ) (810 yksikköä), ja liuosta sekoitettiin 35 °C:ssa. 59 päi vän kuluttua reaktioseos kylmäkuivattiin. Jäännös suspen-doitiin 250 ml:aan vettä, ja sekoitettiin huoneen lämpötilassa yksi tunti. Kiinteät aineet erotettiin suodattamalla, ja suodos varastoitiin 3 "0:533. 72 tunnin kuluttua 5 saostuma kerättiin Ja yhdistettiin aiemmin saatuun suoda-

Cl o O Γ 17 v J b ·,.· 0 tinkakkuun. Se lisättiin 100 ml:aan 95 % etanoli/vesiseos-ta, kuumennettiin kiehuvaksi ja suodatettiin. Liuotin poistettiin vakuumissa ja jäännös kromatografioitiin BioRad P-2-hartsilla, joka oli 30 % n-propanoli/vesiseoksessa 5 (V/V) kerran käyttäen 7,5 x 90 cm kolonnia ja vielä kah desti 5 x 90 cm kolonnilla. Tämä menettely antoi 0,12 g 6-dimetyyliaminopuriini-9-8-D-arabinofuranosidia hydraatti-na, jossa on 0,5 kidevettä.

Analyysi C12H17N504*0 , 5 H20:lle 10 laskettu: C: 47,36, H: 5,96, N: 23,01 havaittu: C: 47,23, H: 5,59, N: 22,75 NMR- ja massaspektrit olivat yhdenmukaisia rakenteen kanssa.

Esimerkki 3 15 9-fl-D-arabinofuranosyyli-6-metoksipuriini 6-metoksipuriini (Sigma Chemical Co. St. Louis, MO) (6,6 mmol, 1 g) ja urasiiliarabinosidi (Torrence, P.F. et ai., J. Med. Chem., 22(3) (1979)) (10,1 mmol, 2,45 g) sus-pendoitiin 575 ml:aan 10 niM kaliumfosfaatti- ja 0,04 % 20 kaliumatsidiliuosta, jonka pH oli 7,8 ja joka sisälsi 10% n-propanolia (V/V). Lisättiin puhdistettua uridiinifos-forylaasia (560 I.U.) ja puriininukleosidifosforylaasia (10000 I.U.) (Krenitsky, T.A. et ai., Biochemistry, 20, 3615, 1981 ja US-patenttijulkaisu 4,381,444), ja liuosta 25 sekoitettiin 35 °C:ssa. Kolmenkymmenen päivän kuluttua reaktioseos suodatettiin. Suodoksen pH säädettiin arvoon 10,5 ammoniumhydroksidilla, ja se kromatografioitiin 2,5 x 7 cm kolonnilla, joka sisälsi Dowex-1-formiaattihartsia. Hartsia eluoitiin 30 % n-propanoli/vesiseoksella (V/V). 30 Tuotetta sisältävät fraktiot yhdistettiin, ja liuotin poistettiin vakuumissa. Jäännös liuotettiin 30 % n-propa-noli/vesiseokseen ja kromatografioitiin BioRad P-2-kolon-nilla (7,5 x 90 cm). Tuotetta sisältävät fraktiot yhdistettiin ja kylmäkuivauksen jälkeen saatiin 0,922 g 6-me-35 toksipuriini-9-B-D-arabinofuranosidia dihydraattina.

= ) η π q 18 - - 1

Analyysi C11H14N405 · 2H20: lie laskettu: C: 41,51, H: 5,70, N: 17,60 havaittu: C: 41,46, H: 5,74, N: 18,13 NMR- ja massaspektrit olivat yhdenmukaisia rakenteen kanssa.

Esimerkki 4 9-8-D-arabinofuranosyyli-6-etoksipuriini 6-etoksipuriini (Sigma Chemical Co. St. Louis, MO) (3,05 mmol, 0,5 g) ja urasiiliarabinosidi (6,09 mmol, 1,48 g) suspendoitiin 100 ml:aan 10 mM kaliumfosfaatti- ja 0,04 % kaliumatsidiliuosta, jonka pH oli 7,4. Lisättiin puhdistettua uridiinifosforylaasia (6000 I.U.) ja puriini-nukleosidifosforylaasia (8400 I.U.) (Krenitsky, T.A. et ai., Biochemistry. 20, 3615, 1981 ja US-patenttijulkaisu 4 381 444), ja suspensiota sekoitettiin 35 °C:ssa.

168 tunnin kuluttua lisättiin vielä 18000 yksikköä uridiinifosforylaasia ja 75600 yksikköä puriininukleosidi-fosforylaasia. Seitsemän päivän kuluttua reaktioseos suodatettiin, ja suodos kromatografioitiin kolonnilla, joka / sisälsi Dowex-1-hydroksidihartsia (2,5 x 8 cm). Kolonnia eluoitiin 90 % metanoli/vesiseoksella (V/V), tuotetta sisältävät fraktiot yhdistettiin, ja liuotin poistettiin vakuumissa. Jäännös liuotettiin 30 % n-propanoli/vesiseok-seen (V/V) ja kromatografioitiin kolonnilla, joka sisälsi ) BioRad P-2-hartsia (5 x 90 cm). Tuote eluoitiin 30 % n-propanoli/vesiseoksella (V/V). Tuotetta sisältävät fraktiot yhdistettiin, ja liuotin poistettiin vakuumissa, jolloin saatiin 0,363 g 6-etoksipuriini-9-8-Darabinofuranosi-dia, jonka analysoitiin olevan 0,3-hydraattina.

1 Analyysi C12H16N4O5*0,3H20: lie laskettu: C: 47,78, H: 5,55, N: 18,57 havaittu: C: 47,99, H: 5,54, N: 18,40 NMR- ja massaspektrit olivat yhdenmukaisia rakenteen kanssa.

19 G 5

Esimerkki 5 9-B-D-arabinofuranosyyli-6-jodipuriini 6-jodipuriini (Sigma Chemical Co. St. Louis, MO) (4 mmol, 1 g) liuotettiin kuumentaen 15 ml:aan 1,2-dime-5 toksietaania. Lisättiin viisikymmentä millilitraa liuosta, jossa oli urasiiliarabinosidia (10,1 mmol) 10 mM kalium-fosfaatti- ja 0,04 % kaliumatsidiliuoksessa, jonka pH oli 7,4. Lisättiin puhdistettua uridiinifosforylaasia (6800 I.U.) ja puriininukleosidifosforylaasia (12000 I.U.) ja 10 reaktioseosta sekoitettiin 35 °C:ssa. 21 päivän kuluttua lisättiin vielä 4800 yksikköä uridiinifosforylaasia ja 20000 yksikköä puriininukleosidifosforylaasia. Yhdeksän-kymmenen päivän kuluttua reaktioseos suodatettiin, ja liuotin poistettiin vakuumissa. Jäännös liuotettiin 100 15 ml:aan vettä, sitä kuumennettiin höyryllä, ja sitten se suodstettiin. Suodos kromatografioitiin kolonnilla, joka sisälsi XAD-2-hartsia (5 x 35 cm). Tätä kolonnia eluoitiin 2 1:11a vettä ja sen jälkeen 2 1:11a etanolia. Tuotetta sisältävät fraktiot yhdistettiin, ja liuotin poistettiin 20 vakuumissa. Jäännös liuotettiin 30 % n-propanoli/vesi-seokseen (V/V) ja kromatografioitiin kolonnilla, joka sisälsi BioRad P-2:a (5 x 90 cm). Tuote eluoitiin 30 % n-propanoli/vesiseoksella (V/V). Tuotetta sisältävät fraktiot yhdistettiin ja liuotin poistettiin vakuumissa. Jään-25 nös liuotettiin 30 % n-propanoli/vesiseokseen (V/V) ja kromatografioitiin Sephadex G10-kolonnilla (5 x 90 cm). Tätä kolonnia eluoitiin 30 % n-propanoli/vesiseoksella (V/V). Tuotetta sisältävät fraktiot yhdistettiin, ja kun liuotin oli poistettu vakuumissa, saatiin 0,253 g 6-jodi-30 puriini-9-B-D-arabinofuranosidia, jonka analysoitiin olevan 1,5-hydraattina.

Analyysi C10HnIN4O4 · 1,5H20: lie laskettu: C: 29,65, H: 3,48, N: 13,83, I: 31,32 havaittu: C: 29,43, H: 3,53, N: 13,66, I: 31,20 35 NMR- ja massaspektrit olivat yhdenmukaisia raken teen kanssa.

20 ' > 0 5

Esimerkki 6 9-B-D-arabinofuranosyyli-2-amino-6-jodipuriini 2-amino-6-jodipuriini (Sigma Chemicals St. Louis, Mo) (25,5 mmol, 6,75 g) ja urasiiliarabinosldi (61,9 mmol, 15,1 g) yhdistettiin 0,31 l:ssa 10 mM kaliumfosfaattia, jonka pH oli 6,9 ja jossa oli ja 0,02 % kaliumatsidia. Lisättiin puhdistettua puriininukleosidifosforylaasia (17000 yksikköä) ja uridiinifosforylaasia (2000 yksikköä), ja liuosta sekoitettiin 37 eC:ssa. 18 päivän kuluttua lisättiin vielä 5700 yksikköä uridiinifosforylaasia. Viidenkymmenenseitsemän päivän kuluttua reaktioseos suodatettiin, ja suodos kromatografioitiin kolonnilla, joka sisälsi XAD-2-hartsia (8 x 11 cm). Tuote eluoitiin etano-li/vesiseoksen (V/V) porrasgradientilla seuraavasti: 0,35 1 10 %, 1 1 20 %, 11 50%, 0,2 1 95%. Tuotetta sisältävät fraktiot yhdistettiin, ja etanoli poistettiin vakuu-missa. Jäännös liuotettiin 30 % n-propanoli/vesiseokseen (V/V) ja kromatografioitiin 7,5 x 90 cm kolonnilla, joka sisälsi BioRad P-2-hartsia. Tämä menettely antoi 1,1 g 2-amino-6-jodipuriini-9-B-D-arabinofuranosidia 0,5-hydraat-tina.

Analyysi C10H12N504 · 0, 5H20: lie laskettu: C: 29,87, H: 3,26, N: 17,41 havaittu: C: 29,86, H: 3,29, N: 17,39 * NMR- ja massaspektrit olivat yhdenmukaisia raken teen kanssa.

Esimerkki 7 9-B-D-arabinofuranosyyli-6-pyrrolidinopuriini 6-pyrrolidinopuriini (Sigma Chemical Co. St. Louis, ) MO) (2,6 mmol, 0,5 g) ja urasiiliarabinosldi (5,29 mmol, 1,29 g) suspendoitiin 100 ml:aan 10 mM kaliumfosfaattia ja 0,04 % kaliumatsidiliuosta, jonka pH oli 7,4. Lisättiin puhdistettua uridiinifosforylaasia (6000 I.U.) ja puriininukleosidifosforylaasia (8400 I.U.) (Krenitsky, T.A. et 5 ai., Biochemistry, 20, 3615, 1981 ja US-patenttijulkaisu 2i * o n 5 4 381 444), ja suspensiota sekoitettiin 35 °C:ssa. Kahdenkymmenen päivän kuluttua reaktioseos suodatettiin, ja suodos kromatografioitiin kolonnilla, joka sisälsi Dowex-1-hydroksidihartsia (2,5 x 8 cm). Tuote eluoitiin 90 % 5 metanoli/vesiseoksella (V/V). Tuotetta sisältävät fraktiot yhdistettiin, ja liuotin poistettiin vakuumissa. Jäännös liuotettiin 50 ml:aan 30 % n-propanoli/vesiseokseen (V/V) ja kromatografioitiin BioRad P-2-kolonnilla (5 x 90 cm). Tuote eluoitiin 30 % n-propanoli/vesiseoksella (V/V).

10 Tuotetta sisältävät fraktiot yhdistettiin ja liuotin poistettiin vakuumissa, jolloin saatiin 0,573 g 6-pyrrolidino-puriini-9-B-D-arabinofuranosidia.

Analyysi C14H19N504:lle laskettu: C: 52,33, H: 5,96, N: 21,79 15 havaittu: C: 52,60, H: 6,09, N: 21,51 NMR- ja massaspektrit olivat yhdenmukaisia rakenteen kanssa.

Esimerkki 8 9-B-D-arabinofuranosyyli-2-kloori-6-metyyliaminopu-20 riini

Liuosta, jossa oli 2,6-dikloori-2',3',5'-tri-0-bentsyyli-9-(β-D-arabinofuranosyyliJpuriinia (Keller, F. et ai., J. org. Chem., 32 1644 (1967); Montgomery, J.A. ja Hewson, K.J., J. Med. Chem. 12, 498 (1967)) (5,92 g, 25 10 mmol) bentseenissä (35 ml liuosta, jossa oli 0,6 g me- tyyliamiinia 10 ml:ssa bentseeniä) pidettiin huoneen lämpötilassa, suljetussa pommissa neljä päivää. Pommi jäähdytettiin perinpohjin jäissä, avattiin, ja sisältö suodatettiin metyyliamiinihydrokloridin poistamiseksi. Liuotin 30 poistettiin vakuumissa, jolloin saatiin öljyä, joka yhdistettiin öljyn kanssa, joka oli saatu samankokoisesta reak-tioseoksesta, mutta reaktio oli suoritettu 125 °C:ssa. Kokonaispaino oli 11,4 g. TLC osoitti sen olevan lähtöaineen sekä mono- ja dimetyyliaminoyhdisteiden seos. Öljy 35 kromatografioitiin 285 g:11a silikageeliä käyttäen liuosta, jossa oli 30 tilavuus-% asetonia ja 70 tilavuus-% syk- 22 ··; '·) <·. η ς loheksaania. Lähtöaineen edellä virtaava komponentti (TLC, silikageeli, asetoni:sykloheksaani = 3:7) kerättiin, ja liuotin poistettiin vakuumissa. Saanto 4,8 g 2-kloori-6-metyyliamino-2',3',5'-tri-0-bentsyyli-9-(B-D-arabinofu-ranosyyli)puriinia öljynä. Siitä 1,1 g annos, joka oli 40 ml:ssa 2-metoksietanolia, lisättiin palladiumkloridiin (0,87 g), joka oli esipelkistetty Parrin laitteessa. Sitä hydrattiin 345 kPa:ssa 30 minuuttia vaihtaen vetykehää ensimmäisen 15 minuutin jälkeen. Katalysaattori poistettiin suodattamalla seliittikerroksen läpi ja pestiin meta-nolilla. Suodos neutraloitiin lisäämällä Dowex-l (HC03). Hartsi poistettiin suodattamalla ja pestiin metanolilla. Suodos haihdutettiin vakuumissa, ja jäännöstä hierrettiin trikloorimetaanin kanssa. Raakatuotetta pestiin kuumalla vedellä, se liuotettiin kuumaan metanoliin, suodatettiin, jäähdytettiin, ja kiinteä aine kerättiin. Kiteyttäminen kiehuvasta vedestä antoi tuotteen hydraattina.

Saanto 44,5 mg, sp. 224-225 "C.

Analyysi CnHX4N504Cl · H20: lie / laskettu: C: 39,58, N: 20,98, H: 4,84 havaittu: C: 39,27, N: 20,83, H: 5,16

Esimerkki 9 9-B-D-arabinofuranosyyli-6-syklopropyyliaminopurii- ni > 6-syklopropyyliaminopuriini (valmistettu 6-kloori-

puriinista (Sigma Chemicals St. Louis, MO) nukleofiili-sellä klooriryhmän korvauksella syklopropyyliamiinilla asetonitriilissä) (2,85 mmol, 0,5 g) ja urasiiliarabinosi-di (Torrence, P.F. et ai., J. Med. Chem., 22(3) (1979)316-3 319) (5,71 mmol, 1,39 g) suspendoitiin 100 ml:aan 10 mM

kaliumfosfaatti- ja 0,04 % kaliumatsidiliuosta, jonka pH oli 7,4. Lisättiin puhdistettua uridiinifosforylaasia (6000 I.U.) ja puriininukleosidifosforylaasia (8400 I.U.) (Krenitsky et ai., Biochemistry, 20, 3615, 1981 ja US-pa-5 tenttijulkaisu 4 381 444), ja suspensiota sekoitettiin 35 i 23 °C:ssa. 120 tunnin kuluttua reaktioseos suodatettiin ja suodos kromatografioitiin kolonnilla, joka sisälsi Dowex-1-hydroksidihartsia (2,5 x 10 cm). Kolonnia eluoitiin 90 % metanoli/vesiseoksella (V/V). Tuotetta sisältävät frak-5 tiot yhdistettiin, ja liuotin poistettiin vakuumissa. Jäännös liuotettiin 30 % n-propanoli/vesiseokseen (V/V) ja kromatografioitiin BioRad P-2:a (5 x 90 cm). Kolonnia eluoitiin 30 % n-propanoli/vesiseoksella (V/V). Reaktio-seoksesta saatu saostuma uudelleenkiteytettiin kuumasta 10 metanolista, jolloin saatiin 0,0352 g ainetta, joka analysoitiin 6-syklopropyyliaminopuriini-9-B-D-arabinofurano-sidimonohydraatiksi. Uudelleenkiteytyksestä saatua suodos-ta kromatografioitiin BioRad P-2:lla (5 x 90 cm), kuten edellä on esitetty. Molemmista kolonneista saadut tuotetta 15 sisältävät fraktiot yhdistettiin ja liuotin poistettiin vakuumissa, jolloin saatiin 0,342 g 6-syklopropyyliamino-puriini-9-B-D-arabinofuranosidia, jonka analysoitiin olevan 0,8-hydraattina ja sisältävän 0,3 C3H80.

Analyysi C13H17N504*1 H20:lle 20 laskettu: C: 48,00, H: 5,89, N: 21,53 havaittu: C: 48,05, H: 5,89, N: 21,55 NMR- ja massaspektrit olivat yhdenmukaisia rakenteen kanssa.

Esimerkki 10 25 9-B-D-arabinofuranosyyli-6-etyyli(metyyli)aminopu- riini 6-etyyli(metyyli)aminopuriini oli valmistettu 6-klooripuriinista (Sigma Chemicals St. Louis, MO) nukleo-fiilisellä klooriryhmän korvauksella 6-etyyli(metyyli)-30 amiinilla asetonitriilissä. 6-etyyli(metyyli)aminopuriini (2,8 mmol, 0,5 g) ja urasiiliarabinosidi (5,6 mmol, 1,38 g) suspendoitiin 575 ml:aan 10 mM kaliumfosfaatti- ja 0,04 % kaliumatsidiliuosta, jonka pH oli 7,4 ja joka sisälsi 10 % n-propanolia (V/V). Lisättiin puhdistettua uri-35 diinifosforylaasia (6000 I.U.) ja puriininukleosidifosfo- 24 '0 9 8 05 rylaasia (8400 I.U.) (Krenitsky et al., Biochemistry, 20, 3615, 1981 ja US-pa tentti julkaisu 4 381 444), ja liuosta sekoitettiin 37 °C:ssa. Yhdeksäntoista päivän kuluttua reaktioseos suodatettiin, ja suodos kromatografioitiin 2,5 x 13 cm kolonnilla, joka sisälsi Dowex-1-hydroksidihart-sia. Hartsia eluoitiin 90 % metanoli/vesiseoksella (V/V). Tuotetta sisältävät fraktiot yhdistettiin, ja liuotin poistettiin vakuumissa. Jäännös liuotettiin 30 % n-propa-noli/vesiseokseen (V/V) ja kromatografioitiin BioRad P-2-kolonnilla (7,5 x 90 cm). Tuotetta sisältävät fraktiot yhdistettiin ja kylmäkuivauksen jälkeen saatiin 0,680 g 6-etyyli(metyyli )aminopuriini-9-8-D-arabinofuranosidia. Analyysi C13H19N504: lie laskettu: C: 50,48, H: 6,19, N: 22,64 havaittu: C: 50,36, H: 6,25, N: 22,52 NMR- ja massaspektrit olivat yhdenmukaisia rakenteen kanssa.

Esimerkki 11 9-8-D-arabinofuranosyyli-2-amino-6-metoksipuriini 2-amino-6-metoksipuriini (valmistettu 2-amino-6-klooripuriinista (Sigma Chemicals St. Louis MO) nukleofii-lisellä klooriryhmän korvauksella metanolilla natriumhyd-ridin avulla tetrahydrofuraanissa) (6,4 mmol, 1,05 g) yhdistettiin 35 ml:n kanssa urasiiliarabinosidiliuosta (7,04 mmol, 1,75 g) 10 mM kaliumfosfaatissa, jossa oli 7 % n-propanolia (V/V). pH säädettiin arvoon 6,75. Lisättiin puhdistettua puriininukleosidifosforylaasia (18000 yksikköä) ja uridiinifosforylaasia (1020 yksikköä), ja liuosta inkuboitiin 37 °C:ssa. 26 päivän kuluttua reaktioseos suo-) datettiin ja suodos kromatografioitiin kolonnilla, jossa oli Dowex-1-formiaattihartsia (2x7 cm), sen jälkeen, kun pH oli säädetty arvoon 10,5 väkevällä ammoniumhydroksidil-la. Kolonnia eluoitiin 7 % n-propanoli/vesiseoksella (V/V). ja tuotetta sisältävät fraktiot yhdistettiin, ja 5 liuotin poistettiin vakuumissa. Jäännöstä uutettiin 25 -.-/805 25 ml:11a vettä, ja suodos erotettiin kiinteistä aineista sentrifugoimalla. Seisoessa ympäristön lämpötilassa super-natantissa muodostui 2-amino-6-metoksipuriini-9-B-D-arabi-nofuranosidikiteitä, joista vakuumissa kuivauksen jälkeen 5 saatiin 0,327 g tuotetta.

Analyysi C11H15N505: lie laskettu: C: 44,44, H: 5,09, N: 23,56 havaittu: C: 44,49, H: 5,13, N: 23,52 NMR- ja massaspektrit olivat yhdenmukaisia raken-10 teen kanssa.

Esimerkki 12 9-B-D-arabinofuranosyyli-6-n-propoksipuriini 6-n-propoksipuriini (5,6 mmol, 1 g, Sigma Chemicals, St. Louis MO) yhdistettiin 545 ml:n kanssa urasiili-15 arabinosidiliuosta (10,1 mmol) 10 mM kaliumfosfaatissa, jossa oli 7 % n-propanolia (V/V). Lisättiin puhdistettua uridiinifosforylaasia (680 I.U.) ja puriininukleosidifos-forylaasia (12000 I.U.), ja liuosta sekoitettiin 35 °C:s-sa. Reaktioseos suodatettiin 58 päivän kuluttua, ja suo-20 dosta varastoitiin 3 eC:ssa 20 tuntia. Saatu saostuma otettiin talteen sentrifugoimalla, liuotettiin 30 % n-pro-panoli/vesiseokseen (V/V), ja kromatografioitiin kolonnilla, jossa oli Dowex-1-formiaattihartsia (2,5 x 5 cm), sen jälkeen, kun pH oli säädetty arvoon 10,5 väkevällä ammo-25 niumhydroksidilla. Kolonnia eluoitiin 30 % n-propanoli/-vesiseoksella (V/V), ja tuotetta sisältävät fraktiot yhdistettiin, ja liuotin poistettiin vakuumissa. Jäännös liuotettiin n-propanoliin ja kromatografioitiin kolonnilla, joka sisälsi BioRad P-2:a (5 x 90 cm). Kolonnia eluoi-30 tiin 30 % n-propanoli/vesiseoksella (V/V). Tuotetta sisältävät fraktiot yhdistettiin, ja sen jälkeen kun liuotin oli poistettu vakuumissa, jäännös liuotettiin veteen ja kromatografioitiin kolonnilla, joka sisälsi BioRad P-2:a (5 x 90 cm). Kolonnia eluoitiin vedellä. Tuotetta sisältä-35 vät fraktiot yhdistettiin, ja kylmäkuivauksen jälkeen saa- ; ί n n 5 26 ' ^ tiin 0,758 g 6-n-propoksipuriini-9-B-D-arabinofuranosidia, jonka analysoitiin olevan monohydraattina.

Analyysi ^13^18^4^5 · 1,0H2O: lie laskettu: C: 47,56, H: 6,14, N: 17,06 havaittu: C: 47,63, H: 6,13, N: 17,11 NMR- ja massaspektrit olivat yhdenmukaisia rakenteen kanssa.

Esimerkki 13 9-(5-0-bentsoyyli-B-D-arabinofuranosyyli)-6-metok-si-9H-puriini 9-(B-D-arabinofuranosyyli)-6-metoksi-9H-puriini esimerkistä 3 (0,283 g, 1,0 mmol) liuotettiin vedettömään dimetyyliasetamidiin (5,0 ml), jäähdytettiin 4 ®C:een, ja lisättiin bentsoyylikloridia (0,155 g, 1,1 mmol). Seosta sekoitettiin 24 tuntia argonkehässä antaen sen lämmitä hitaasti huoneen lämpötilaan, ja sekoitusta jatkettiin vielä toiset 24 tuntia. Reaktio sammutettiin kaatamalla 50 ml:aan jäävettä, uutettiin CHCl3:lla (3 x 30 ml), ja orgaaniset uuttoliuokset kuivattiin (MgS04). Haihdutuksen jälkeen saatu jäännös puhdistettiin flash-kromatografises-ti silikageelillä (25,0 g, 2,5 x 15 cm) käyttäen porras-gradienttia, joka vaihteli CHCl3:n ja CHCl3:n ja asetonin seoksen (1:1) välillä. Ne fraktiot, jotka sisälsivät tuotetta, jonka Rf oli 0,21 (silikageeli, CHC13 : asetoni = i 1:1) yhdistettiin, jolloin saatiin 92 mg haluttua yhdistettä : sp. 202-204 eC,

Analyysi Ci8H18N406: lie laskettu: C: 55,96, H: 4,70, N: 14,50.

) havaittu: C: 56,04, H: 4,74, N: 14,40.

NMR- ja massaspektrit olivat yhdenmukaisia rakenteen kanssa.

Esimerkki 14 6-metoksi-9-[5-0-(4-metyylifenyylisulfonyyli)-B-D-5 arabinofuranosyyli]-9H-puriini

Juuri uudelleenkiteytetty 4-tolueenisulfonyyliklo-ridi (0,312 g, 1,63 mmol) ja 9-(B-D-arabinofuranosyyli)- : · f η ς

27 ' " " ‘ J

6-metoksi-9H-puriini esimerkistä 3 (0,308 g, 1,09 mmol) suspendoitiin vedettömään asetonitriiliin (25 ml), seos jäähdytettiin 3 eC:een jäähauteessa, ja lisättiin pyridii-niä (5,0 ml) nukleosidin liuottamiseksi. Liuosta sekoitet-5 tiin argonkehässä 3 eC:ssa tunnin ajan, sitten sitä pidettiin -15 °C:ssa 42 tuntia. Reaktio sammutettiin 5 % NaHC03:lla (3 ml), seos haihdutettiin noin 10 ml:ksi, sitten sitä haihdutettiin yhdessä 95 % etanolin kanssa. Jäännös absorboitiin mahdollisimman pieneen määrään silika-10 geeliä ja lisättiin silikageeliflashkolonniin (25,0 g, 2,5 x 15 cm) CH2Cl2/MeOH-seoksessa (15:1). Eluointi tällä liuottimena (450 ml) ja sen jälkeen CH2Cl2/Me0H-seoksella (10:1, 550 ml) antoi kolmea UV-säteilyä absorboivaa ainetta. Ne fraktiot, jotka sisälsivät ainetta, jonka Rf-arvo 15 oli 0,42 (silikageeli, CH2Cl2:MeOH = 10:1) yhdistettiin ja puhdistettiin vielä kolmella peräkkäisellä preparatiivi-sella silikageelikromatografialevyllä käyttäen ensin CH2Cl2/MeOH-seosta (10:1) ja kahdella seuraavalla levyllä asetonin ja CH2Cl2:n seosta (1:1), jolloin saatiin 88 mg 20 haluttua ainetta kirkkaana lasina: sp. 177-181 °C,

Analyysi CieH20N4O7S*0,15H20: lie laskettu: C: 49,23, H: 4,66, N: 12,76 havaittu: C: 49,28, H: 4,71, N: 12,71 25 NMR- ja massaspektrit olivat yhdenmukaisia raken teen kanssa.

Esimerkki 15 6-metoksi-9-( 5-0-metyylisulfonyyll-B-D-arabinofura-nosyyli)-9H-puriini 30 9-(fl-D-arabinofuranosyyli) - 6-metoksi-9H-puriini esimerkistä 3 (0,600 g, 2,13 mmol) suspendoitiin kuivaan asetonitriiliin (40 ml), ja lisättiin vedetöntä pyridiiniä (8 ml). Pulloa jäähdytettiin -3 °C:ssa jää/suolahauteessa, ja lisättiin metaanisulfonyylikloridia (0,16 ml, 2,13 mmo-35 1). 25 minuutin kuluttua liuos sammutettiin H20:lla (3 ml) 28 r. n c ja väkevöitiin 10 ml:ksi, ja sitten haihdutettiin yhdessä etanolin kanssa lisäämällä etanolia useita kertoja ja pitäen kaiken aikaa lämpötila alle 38 °C:ssa. Jäljelle jäänyt pyridiini poistetiin vakuumipumpulla. Jäännös vietiin silikageeliflashkolonniin (25,0 g, 2,5 x 15 cm), joka oli tasapainotettu CH2Cl2/MeOH-seoksessa (15:1). Kolonnia elu-oitiin ensin 150 ml:11a tätä liuotinta ja sitten CH2C12/-MeOH-seoksella (10:1, 450 ml). Niistä fraktioista, jotka sisälsivät ainetta, jonka Rf-arvo oli 0,34 (silikageeli, CH2Cl2:MeOH = 10:1), saatiin 0,448 g tuotetta (57 %) valkoisena vaahtona: sp. 177-181 eC (hajoaa).

Analyysi C12H16N407S*0, 5H20: lie laskettu: C: 39,02, H: 4,64, N: 15,17 havaittu: C: 39,02, H: 4,66, N: 15,08.

NMR- ja massaspektrit olivat yhdenmukaisia rakenteen kanssa.

Esimerkki 16 9-(5-0-(4-metyylibentsoyyli)-8-D-arabinofuranosyy-li)-6-metoksi-9H-puriini 9-(β-D-arabinofuranosyyli)-6-metoksi-9H-puriini esimerkistä 3 (0,283 g, 1,0 mmol) suspendoitiin vedettömään asetonitriiliin (10,0 ml), ja lisättiin pyridiiniä (2,3 ml) täydellisen liukenemisen aikaansaamiseksi ja sen jälkeen 4-metyylibentsoyylikloridia (0,170 g, 1,1 mmol). Seosta sekoitettiin huoneen lämpötilassa 24 tuntia argon-kehässä, reaktio sammutettiin lisäämällä isopropanolia (5 ml) ja haihduttamalla kuiviin, ja sen jälkeen haihdutettiin yhdessä etanolin kanssa (2 x 10 ml). Jäännös puh-) distettiin sitten flashkromatografisesti silikageelillä (25,0 g, 2,5 x 15 cm) käyttäen porrasgradienttia, joka vaihteli CHCl3:n ja CHCl3:n ja asetonin seoksen (1:1) välillä. Ne fraktiot, jotka sisälsivät tuotetta, jonka Rf oli 0,41 (silikageeli, CHC13 : asetoni = 1:1) yhdistettiin, j jolloin saatiin 132 mg haluttua yhdistettä: sp. 127-128 °C,

1 ') r · H Q

29 7 ;j J ^

Analyysi C19H20N4O6*0,5H20:lle laskettu: C: 55,74, H: 5,17, N: 13,69. havaittu: C: 55,48, H: 5,36, N: 13,64.

NMR- ja massaspektrit olivat yhdenmukaisia raken-5 teen kanssa.

Esimerkki 17 9-( 5-0-( 4-klooribentsoyyli )-β-D-arabinofuranosyy-li)-6-metoksi-9H-puriini 9-(β-D-arabinofuranosyyli)-6-metoksi-9H-puriini 10 esimerkistä 3 (0,283 g, 1,0 mmol) suspendoitiin vedettömään asetonitriiliin (10,0 ml), ja lisättiin pyridiiniä (2,3 ml) täydellisen liukenemisen aikaansaamiseksi ja sen jälkeen 4-klooribentsoyylikloridia (0,193 g, 1,1 mmol). Seosta sekoitettiin huoneen lämpötilassa 24 tuntia argon- 15 kehässä, reaktio sammutettiin lisäämällä isopropanolia (5 ml) ja haihduttamalla kuiviin, ja sen jälkeen haihdutettiin yhdessä etanolin kanssa (2 x 10 ml). Jäännös puh-disttettiin sitten flash-kromatografisesti silikageelillä (25,0 g, 2,5 x 15 cm) käyttäen porrasgradienttia, joka 20 vaihteli HCl3:n ja CHCl3:n ja asetonin seoksen (1:1) välillä. Ne raktiot, jotka sisälsivät tuotetta, jonka Rf oli 0,37 silikageeli, CHC13 : asetoni =1:1) yhdistettiin, jolloin saatiin 105 mg haluttua yhdistettä: sp. 122-124 eC, 25 Analyysi CieH17ClN406·0, 5H20: lie laskettu: C: 50,30, H: 4,22, N: 13,04. havaittu: C: 50,20, H: 4,28, N: 12,94.

NMR- ja massaspektrit olivat yhdenmukaisia rakenteen kanssa.

30 Esimerkki 18 9-(5-0-(4-metoksibentsoyyli)-β-D-arabinofuranosyy-li)-6-metoksi-9H-puriini 9-(β-D-arabinofuranosyyli)-6-metoksi-9H-puriini esimerkistä 3 (0,283 g, 1,0 mmol) suspendoitiin vedettö-35 mään asetonitriiliin (10,0 ml), ja lisättiin pyridiiniä · ί n n 5

30 O

(2,3 ml) täydellisen liukenemisen aikaansaamiseksi ja sen jälkeen 4-metoksibentsoyylikloridia (1,1 mmol). Seosta sekoitettiin huoneen lämpötilassa 24 tuntia argonkehässä, reaktio sammutettiin lisäämällä isopropanolia (5 ml) ja haihduttamalla kuiviin, ja sen jälkeen haihdutettiin yhdessä etanolin kanssa (2 x 10 ml). Jäännös puhdistettiin sitten flash-kromatografisesti silikageelillä (25,0 g, 2,5 x 15 can) käyttäen porrasgradienttia, joka vaihteli CHCl3:n ja CHCl3:n ja asetonin seoksen (1:1) välillä. Ne fraktiot, jotka sisälsivät tuotetta, jonka Rf oli 0,30 (silikageeli, CHC13 : asetoni = 1:1) yhdistettiin, jolloin saatiin 110 mg haluttua yhdistettä: sp. 195-197 °C,

Analyysi C19H20N407 · 0, 25H20: lie laskettu: C: 54,22, H: 4,91, N: 13,31. havaittu: C: 54,22, H: 4,94, N: 13,30 NMR- ja massaspektrit olivat yhdenmukaisia rakenteen kanssa.

Esimerkki 19 6-metoksi-9-( 5-0-fenyyliasetyyli-B-D-arabinofurano-syyli)-9H-puriini 9-(β-D-arabinofuranosyyli)-6-metoksi-9H-puriini esimerkistä 3 (0,300 g, 1,06 mmol) suspendoitiin asetonit-riiliin (25 ml), ja sen jälkeen lisättiin pyridiiniä > (5,0 ml). Liuos jäähdytettiin 3 eC:een jäähauteessa, ja lisättiin fenyyliasetyylikloridia (0.20 ml, 1,5 mmol). Tunnin sekoituksen jälkeen 3 °C:ssa, liuos jäähdytettiin -15 ®C:een 40 tunniksi. Reaktio sammutettiin 5 % NaHC03:lla (3 ml), seos väkevöitiin 10 ml:ksi, ja sitten sitä haihdu-) tettiin lisäten etanolia useita kertoja. Jäännös laitettiin CH2Cl2/MeOH-seokseen (15:1) ja vietiin silikageeli-flashkolonniin (25,0 g, 2,5 x 15 cm), joka oli pakattu samaan liuottimeen, eluoiden 500 ml:11a tätä liuotinta ja sen jälkeen CH2Cl2/Me0H-seoksella (15:1, 500 ml). Niistä 5 fraktioista, joiden Rf-arvo oli 0,38 (silikageeli, CH2C12:- l 31 ' ·; r n c.

. K · metanoli = 10:1)), saatiin 0,128 g raakatuotetta, joka oli kontaminoitunut suuremman Rf-arvon omaavalla epäpuhtaudella. Lisäpudistus preparatiivisella levykromatografiällä CH2Cl2/MeOH-seoksella (10:1) ja sen jälkeen toisella levy-5 llä käyttäen asetoni/C2Cl2-seosta (1:1) antoi 0,102 g haluttua tuotetta valkoisena vaahtona: sp. 74-75 °C,

Analyysi C19H20N4O6*0,1H20: lie laskettu: C: 56,74, H: 5,06, N: 13,93.

10 havaittu: C: 56,74, H: 5,11, N: 13,90.

NMR- ja massaspektrit olivat yhdenmukaisia rakenteen kanssa.

Esimerkki 20 6-metoksi-9-( 5-0-fenyyliasetyyli-B-D-arabinofura-15 nosyyli)-9H-puriini 9-(β-D-arabinofuranosyyli)-6-metoksi-9H-puriini esimerkistä 3 (0,322 g, 1,14 mmol) suspendoitiin kuivaan asetonitriiliin (25 ml), ja sen jälkeen lisättiin vedetöntä pyridiiniä (5 ml). Liuos jäähdytettiin 3 eC:een jää-20 hauteessa, ja lisättiin fenoksiasetyylikloridia (0,24 ml, 1,7 mmol). Kahden tunnin sekoituksen jälkeen 3 °C:ssa reaktio sammutettiin 5 % NaHC03:lla (2 ml), seos väkevöi-tiin 10 ml:ksi ja haihdutettiin lisäämällä etanolia useita kertoja. Jäännös puhdistettiin flashkromatografisesti si-25 likageelillä (25,0 g, 2,5 x 15 cm) CH2Cl2:n ja metanolin seoksessa (15:1). Eluointi 400 ml:11a tätä liuotinta ja sitten CH2Cl2:n ja metanolin seoksella (10:1, 500 ml) ja CH2Cl2:n ja metanolin seoksella (9:1, 300 ml) antoi 0,213 g raakatuotetta. Tämä aine uudelleenkiteytettiin 30 metanolista, jolloin saatiin 0,101 g (20 %) valkoista kiteistä ainetta: sp. 193-195 °C,

Analyysi C19H20N4O7*0, 05H20: lie laskettu: C: 54,69, H: 4,85, N: 13,43.

35 havaittu: C: 54,69, H: 4,89, N: 13,40.

32 ^ · 9 8 n s NMR- ja massaspektrit olivat yhdenmukaisia rakenteen kanssa.

Esimerkki 21 6-metoksi-9- (5-0-metoksiasetyyli-B-D-arabinof ura-nosyyli)-9H-puriini 9-(8-D-arabinofuranosyyli) -6-metoksi-9H-puriini esimerkistä 3 (0,300 g, 1,06 mmol) suspendoitiin asetonit-riiliin (25 ml), ja sen jälkeen lisättiin vedetöntä pyri-diiniä (5 ml). Liuos jäähdytettiin -3 eC:een jää/suolahau-teessa, ja lisättiin metoksiasetyylikloridia (0,10 ml, 1,1 mmol). Kahden tunnin sekoituksen jälkeen jää/suolahau-teessa reaktio sammutettiin 5 % NaHC03:lla (2 ml), seos väkevöitiin 10 ml:ksi ja haihdutettiin sitten lisäämällä etanolia useita kertoja. Jäännös vietiin silikageeliflash-kolonniin (25,0 g, 2,5 x 15 cm), joka oli pakattu CH2Cl2:n ja metanolin seokseen (10:1). Eluointi 500 ml:11a tätä liuotinta ja sitten CH2Cl2/MeOH seoksella (9:1, 300 ml) antoi 0,086 g raakatuotetta. Tämä aine uudelleenkiteytet-tiin metanolista ja vedestä, jolloin saatiin 0,035 g (9,3 %) valkoisia kiteitä: sp. 137-139 °C,

Analyysi C14H18N4O7*0, 5H20: lie laskettu: C: 46,28, H: 5,27, N: 15,42. havaittu: C: 46,33, H: 5,27, N: 15,37.

NMR- ja massaspektrit olivat yhdenmukaisia rakenteen kanssa.

Esimerkki 22 9- [5-0- (4-nitrobentsoyyli)-β-D-arabinofuranosyyli] -6-metoksi-9H-puriini i 9-(β-D-arabinofuranosyyli) -6-metoksi-9H-puriini esimerkistä 3 (0,283 g, 1,0 mmol) suspendoitiin vedettömään asetonitriiliin (10,0 ml), ja lisättiin pyridiiniä (2,3 ml) täydellisen liukenemisen aikaansaamiseksi ja sen jälkeen 4-nitrobentsoyylikloridia (0,205 g, 1,1 mmol). j Seosta sekoitettiin huoneen lämpötilassa 24 tuntia argon- 33 ') r H 5 kehässä, reaktio sammutettiin lisäämällä isopropanolia (5 ml) ja haihduttamalla kuiviin, ja sen jälkeen haihdutettiin yhdessä etanolin kanssa (2 x 10 ml). Jäännös puhdistettiin sitten flash-kromatografisesti silikageelillä 5 (25,0 g, 2,5 x 15 cm) käyttäen porrasgradienttia CHCl3:n ja CHCl3:n ja asetonin seoksen (1:1) välillä. Ne fraktiot, jotka sisälsivät tuotetta, jonka Rf oli 0,37 silikageeli, CHC13 : asetoni = 1:1) yhdistettiin, jolloin saatiin 105 mg haluttua yhdistettä: 10 sp. 202-203 °C,

Analyysi C18H17N508: lie laskettu: C: 50,12, H: 3,97, N: 16,24. havaittu: C: 50,21, H: 4,02, N: 16,16.

NMR- ja massaspektrit olivat yhdenmukaisia raken- 15 teen kanssa.

Esimerkki 23 6-metoksi-9-(5-0-pentanoyyli-8-D-arabinofuranosyy-li)-9H-puriini 9-(β-D-arabinofuranosyyli)-6-metoksi-9H-puriini 20 esimerkistä 3 (0,852 g, 3,01 mmol) suspendoitiin kuivaan asetonitriiliin (75 ml), ja lisättiin kuivaa pyridiiniä (15 ml). Liuosta jäähdytettiin jää/vesihauteessa, ja lisättiin pentanoyylikloridia (0,4 ml, 3,31 mmol). Kahden tunnin jälkeen reaktio sammutettiin lisäämällä 3 ml meta-25 nolia ja haihduttamalla kirkkaaksi, viskoosiksi öljyksi.

Jäännös puhdistettiin flash-romatografisesti silikageelillä käyttäen porrasgradienttia CHCl3:n ja CHCl3:n ja meta-nolin seoksen (9:1) välillä. Tämä antoi 330 mg tuotetta, joka oli kontaminoitunut vastaavalla 2'-esterillä (katso 30 esimerkki 32) ja tuntemattomalla aineella, jolla oli pienempi Rf. Jäännöstä puhdistettiin vielä preparatiivisella käänteisfaasi-HPLC:11a (Alltech C18, 10 mm x 25 cm, partikkelikoko 10 mikronia, 70 % H20/30 % CH3CN, 4,0 ml/min) valmistamalla samaan liuottimeen 10 mg/ml liuoksen, jonka 35 injektiotilavuus oli 1,0 ml. Jäännöstä haihdutettiin yh- 34 ^ ί?5 dessä asetonin kanssa, jolloin saatiin 260 mg valkoista haurasta vaahtoa (24 %): sp. 85-95 °C,

Analyysi C16H22N406 · 0,05 (CH3)2C0 · 0,55H20:1 le laskettu: C: 51,16, H: 6,22, N: 14,78. havaittu: C: 50,98, H: 6,03, N: 14,63.

NMR- ja massaspektrit olivat yhdenmukaisia rakenteen kanssa.

Esimerkki 24 9- [ 5-0- (4-aminobentsoyyli-B-D-arabinofuranosyyli) ] -6-metoksi-9H-puriini 9- ( 5-0- (4-nitrobentsoyyli)-β-D-arabinofuranosyyli)-6-metoksi-9H-puriini esimerkistä 22 (0,350 g, 0,81 mmol) suspendoitiin etanoliin (100,0 ml), ja lisättiin 10 % pal-ladioitua hiiltä (0,100 g). Sen jälkeen, kun on vuoroin imetty vakuumi ja ladattu systeemi vedyllä, reaktioseosta ravistellaan Parrin laitteessa 345 kPa:ssa kolme tuntia. Sitten seos suodatetaan seliitin läpi, ja suodos haihdutetaan kuiviin. Haihdutuksen jälkeen saatu jäännös suspendoitiin metanoliin ja suodatettiin, jolloin saatiin haluttu yhdiste valkoisena kiinteänä aineena (0,285 g, 88 %): sp. 198-200 eC,

Analyysi C18H19N506*0,3H20:lle laskettu: C: 53,15, H: 4,86, N: 17,22. havaittu: C: 52,96, H: 4,64, N: 17,07.

NMR- ja massaspektrit olivat yhdenmukaisia rakenteen kanssa.

Esimerkki 25 6-metoksi-9-(5-0-propionyyli-B-D-arabinofuranosyy-) li]-9H-puriini 9-(β-D-arabinofuranosyyli)-6-metoksi-9H-puriini esimerkistä 3 (0,847 g, 3,0 mmol) suspendoitiin vedettömään asetonitriiliin (30,0 ml), ja lisättiin pyridiiniä (9,0 ml) täydellisen liukenemisen aikaansaamiseksi. Sen j jälkeen kun oli jäähdytetty 5 °C:een, lisättiin propionyy- ; 'i :· Π 5 35 -..0 likloridia (0,305 g, 3,3 mmol), ja seosta sekoitettiin yön yli argonkehässä lämmittäen samalla 13 °C:een. Kun reaktio oli sammutettu isopropanolilla (5 ml) ja haihdutettu kuiviin ja sen jälkeen haihdutettu yhdessä etanolin kanssa 5 (2 x 10 ml), jäännös puhdistettiin flash-kromatografisesti silikageelillä (25,0 g, 2,5 x 15 cm) käyttäen porrasgra-dienttia CHCl3:n ja CHCl3:n ja asetonin seoksen (1:1) välillä. Ne fraktiot, jotka sisälsivät tuotetta, jonka Rf oli 0,38 (silikageeli, CHC13 : asetoni = 1:1) yhdistet-10 tiin, ja tätä ainetta puhdistettiin vielä keskipainekroma-tografiällä silikageelillä (kaksoiskolonnit, 1,5 x 25,0 cm ja 1,5 x 100,0 cm, CHCl3:asetoni = 3:1), jolloin saatiin 0,114 g haluttua yhdistettä valkoisena kiinteänä aineena: sp. 62-64 °C, 15 Analyysi C14H18N406 · 0, 5CH30:1 le laskettu: C: 50,68, H: 5,76, N: 15,25. havaittu: C: 50,72, H: 5,80, N: 15,28.

NMR- ja massaspektrit olivat yhdenmukaisia rakenteen kanssa.

20 Esimerkki 26 9-(5-0-butanoyyli-B-D-arabinofuranosyyli)-6-metok-si-9H-puriini 9-(β-D-arabinofuranosyyli)-6-metoksi-9H-puriini esimerkistä 3 (0,847 g, 3,0 mmol) suspendoitiin vedettö-25 mään asetonitriiliin (30,0 ml), ja lisättiin pyridiiniä (9,0 ml) täydellisen liukenemisen aikaansaamiseksi. Sen jälkeen kun liuos oli jäähdytetty 5 °C:een, lisättiin bu-tyryylikloridia (0,352 g, 3,3 mmol), ja seosta sekoitettiin yön yli argonkehässä lämmittäen samalla 13 °C:een. 30 Kun reaktio oli sammutettu isopropanolilla (5 ml) ja seos haihdutettu kuiviin ja sen jälkeen haihdutettu yhdessä etanolin kanssa (2 x 10 ml), jäännös puhdistettiin flash-kromatografisesti silikageelillä (25,0 g, 2,5 x 15 cm) käyttäen porrasgradienttia CHCl3:n ja CHCl3:n ja asetonin 35 seoksen (1:1) välillä. Ne fraktiot, jotka sisälsivät tuo- (· *: (*' Γ", r* 36 -, J b L‘ 5 tetta, jonka Rf oli 0,38 (silikageeli, CHC13 : asetoni = 1:1) yhdistettiin, ja tätä ainetta puhdistettiin vielä keskipainekromatografisesti silikageelillä (kaksoiskolon-nit, 1,5 x 25,0 cm ja 1,5 x 100,0 cm, CHC13:asetoni = 2:1), jolloin saatiin 267 mg haluttua yhdistettä valkoisena kiinteänä aineena: sp- 108-110 ®C,

Analyysi ^15^20^4^6 · He laskettu: C: 51,13, H: 5,72, N: 15,90. havaittu: C: 51,21, H: 5,73, N: 15,81.

NMR- ja massaspektrit olivat yhdenmukaisia rakenteen kanssa.

Esimerkki 27 9-[5-0-(2,2-dimetyylipropionyyli)-B-D-arabinofura-nosyyli]-6-metoksi-9H-puriini 9-(β-D-arabinofuranosyyli)-6-metoksi-9H-puriini esimerkistä 3 (0,850 g, 3,01 mmol) suspendoitiin kuivaan asetonitriiliin (75 ml), ja lisättiin vedetöntä pyridiiniä (15 ml). Liuos jäähdytettiin 3 eC:een jäähauteessa, ja lisättiin 2,2-dimetyylipropionyylikloridia (0,41 ml, 3,3 mmol). Kuuden tunnin sekoituksen jälkeen 3 ®C:ssa reaktio sammutettiin MeOH:lla (2 ml), seos väkevöitiin 10 ml:ksi, ja haihdutettiin sitten yhdessä etanolin kanssa lisäämällä etanolia useita kertoja. Jäännös vietiin sili-kageeliflashkolonniin (20,0 g, 2,5 x 12,0 cm), joka oli pakattu CH2C12:n ja metanolin seokseen (10:1). Eluointi 300 ml:11a tätä liuotinta antoi 0,464 g lähtöainetta ja 0,553 g raakatuotetta. Lisäpuhdistus flash-kromatografi-sesti (silikageeli, 2,5 x 10,0 cm) eluoiden gradientilla, joka vaihteli CH2Cl2:n ja CH2Cl2/MeOH-seoksen (1:9) välillä, ) jolloin saatiin 0,419 g (38 %) kirkasta lasia: sp. 73-76 °C,

Analyysi C16H22N406·0, 5H20: lie laskettu: C: 51,19, H: 6,18, N: 14,93. havaittu: C: 51,43, H: 6,06, N: 14,91.

5 NMR- ja massaspektrit olivat yhdenmukaisia raken teen kanssa.

37 ·" ;; f; n 5

Esimerkki 28 9-(5-0-asetyyli-B-D-arabinofuranosyyli)-6-metoksi-9H-puriini 9-(β-D-arabinofuranosyyli)-6-metoksi-9H-puriini 5 esimerkistä 3 (0,850 g, 3,01 mmol) suspendoitiin kuivaan asetonitriiliin (75 ml), ja sen jälkeen lisättiin vedetöntä pyridiiniä (15 ml). Liuos jäähdytettiin 3 °C:een jääh-auteessa, ja lisättiin asetyylikloridia (0,24 ml, 3,4 mmol). Puolen tunnin sekoituksen jälkeen jää/suola-10 hauteessa reaktio sammutettiin metanolilla (2 ml), seos väkevöitiin 10 ml:ksi, ja haihdutettiin sitten lisäten etanolia useita kertoja. Jäännös puhdistettiin flashkroma-tografisesti silikageelillä (25,0 g, 2,5 x 15,0 cm) eluoi-den CH2Cl2:n ja Me0H:n seoksella (10:1, 300 ml), jolloin 15 saatiin 0,710 g raakatuotetta. Toisesta kolonnista (25,0 g, 2,5 x 15,0 cm) eluoiden CH2Cl2:n ja MeOH:n seoksella (15:1) saatiin 0,610 g kirkasta lasia, joka yhä sisälsi pienen määrän suuremman Rf-arvon omaavaa epäpuhtautta. Tuotteen lisäpuhdistus preparatiivisella levykromato-20 grafialla CH2Cl2:n ja MeOH:n seoksella (9:1) ja sen jälkeen lataamalla levylastut flashkolonniin (20,0 g, 2,5 x 12 cm) CH2Cl2:ssa ja eluoiden MeOH-gradientilla CH2Cl2:ssa antoi haluttua tuotetta valkoisena vaahtona: sp. 64-67 ‘C, 25 Analyysi C13H16N406*0,5H20: lie laskettu: C: 46,85, H: 5,14, N: 16,81. havaittu: C: 47,04, H: 5,12, N: 16,72.

NMR- ja massaspektrit olivat yhdenmukaisia rakenteen kanssa.

30 Esimerkki 29 6-metoksi-9-[5-0-(2-metyylipropionyyli)-β-D-arabinofuranosyyli] -9H-puriini 9-(β-D-arabinofuranosyyli)-6-metoksi-9H-puriini esimerkistä 3 (0,500 g, 1,77 mmol) suspendoitiin kuivaan 35 asetonitriiliin (25 ml), ja sen jälkeen lisättiin vedetöntä pyridiiniä (5 ml). Liuos jäähdytettiin 3 °C:een jäähau- 38 ° 9 Π n 5 teessä, ja lisättiin isobutyryylikloridia (0,21 ml, 2,0 mmol). Kolmen tunnin sekoituksen jälkeen 3 eC:ssa reaktio sammutettiin MeOH:lla (2 ml), seos väkevöitiin 10 ml:ksi, ja haihdutettiin sitten yhdessä etanolin kanssa lisäten etanolia useita kertoja. Jäännös vietiin silika-geeliflashkolonniin (25,0 g, 2,5 x 15,0 cm), joka oli pakattu CH2Cl2:n ja MeOH:n seokseen (10:1). Eluointi 300 ml:11a tätä liuotinta antoi 0,167 g lähtöainetta ja 0,221 g raakatuotetta. Tuotteen lisäpuhdistus preparatii-visella levykromatografiällä CH2Cl2:n ja Me0H:n seoksella (9:1) ja sen jälkeen lataamalla levylastut silikageeli-flashkolonniin (16,0 g, 2,5 x 10 cm), joka oli pakattu CH2Cl2:iin. Kolonnia eluoitiin MeOH-gradientilla CH2Cl2:ssa, jolloin saatiin 0,127 g kirkasta lasia (20 %): sp. 68-71 °C,

Analyysi C15H20N406 · 0, 25H20 · 0,05Me0H: lie laskettu: C: 50,43, H: 5,82, N: 15,63. havaittu: C: 50,49, H: 5,83, N: 15,62.

NMR- ja massaspektrit olivat yhdenmukaisia rakenteen kanssa.

Esimerkki 30 6-metoksi-9-[2-0-(2,2-dimetyylipropionyyli)-β-D-arabinofuranosyyli]-9H-puriini 9- ( β-D-arabinofuranosyyli)-6-metoksi-9H-puriinia > esimerkistä 3 (298,5 mg, 1,06 mmol), 4-dimetyyliaminopyri-diiniä (1 mg, 10 pmol), asetonitriiliä (20 ml) ja pyri-diiniä (5 ml) lisättiin kolmikaulaiseen pyöröpohjakolviin, joka oli varustettu lämpömittarilla, argonin syöttövent-tiilillä, magneettisekoittajalla, jäähdyttimellä ja kuu-) mennusvaipalla. Lisättiin trimetyylietikkahappoanhydridiä (0,22 ml, 1,06 mmol), ja liuosta kuumennettiin 40 eC:ssa 26 tuntia. Tässä vaiheessa reaktio sammutettiin lisäämällä 2 ml vettä ja haihduttamalla kirkkaaksi öljyksi. Jäännös puhdistettiin flashkromatografisesti silikageelillä käyt-5 täen porrasgradienttia CHCl3:n ja CHC13/MeOH-seoksen (9:1) 39 -:9805 välillä. Tätä ainetta puhdistettiin vielä preparatiivisel-la levykromatografiällä CHCl3:n ja MeOHrn seoksella (9:1) ja haihdutettiin yhdessä hiilitetrakloridin ja asetonin kanssa, jolloin saatiin 90 mg valkoista haurasta vaahtoa.

5 Analyysi C16H22N406*0,05(CH3)2CO‘0,45CCl4:lle laskettu: C: 45,47, H: 5,13, N: 12,78. havaittu: C: 45,67, H: 5,27, N: 12,67.

NMR- ja massaspektrit olivat yhdenmukaisia rakenteen kanssa.

10 Esimerkki 31 6-metoksi-9-[(2,3,5-tri-0-asetyyli)-β-D-arabinofu-ranosyyli]-9H-puriini 9-(B-D-arabinofuranosyyli)-6-metoksi-9H-puriinia esimerkistä 3 (1,009 g, 3,57 mmol), 4-dimetyyliaminopyri-15 diiniä (0,0098 g, 80 pmol), trietyyliamiinia (0,59 ml, 4,2 mmol) ja vedetöntä asetonitriiliä (52 ml) lisättiin kolmikaulaiseen pyöröpohjakolviin, joka oli varustettu lämpömittarilla, argonin syötöllä, magneettisekoittajalla ja kuivalla jää/asetonihauteella. Sen jälkeen kun maito-20 mainen liuos oli Jäähdytetty -20 eC:een, lisättiin etikka-happoanhydridiä (2,4, 25,4 mmol). Liuos muuttui välittömästi kirkkaaksi. Viiden minuutin kuluttua reaktio sammutettiin MeOH:lla (5 ml), ja seos haihdutettiin kirkkaaksi viskoosiksi öljyksi. Flashkromatografiointi silikageelillä 25 käyttäen CHCl3:n ja Me0H:n gradienttia antoi tuotteen kirkkaana viskoosina öljynä. Liuottamalla tämä aine mahdollisimman pieneen määrään asetonia, laimentamalla vedellä ja kylmäkuivaamalla eristettiin 1,03 g (71 %) tuotetta valkoisena jauheena.

30 Analyysi C17H20N408: lie laskettu: C: 50,00, H: 4,94, N: 13,72. havaittu: C: 49,80, H: 5,09, N: 13,50.

NMR- ja massaspektrit olivat yhdenmukaisia rakenteen kanssa.

40 -: 9 '] Π ζ

Esimerkki 32 6-metoksi-9-(2-0-pentanoyyli-8-D-arabinofuranosyy-li)-9H-puriini Menetelmä 1 5 9-( 8-D-arabinofuranosyyli)-6-metoksi-9H-puriinia esimerkistä 3 (283 mg, 1,0 mmol), asetonitriiliä (20 ml) ja pyridiiniä (5 ml) lisättiin kolmikaulaiseen pyöröpohja-kolviin, joka oli varustettu lämpömittarilla, argonin syöttöventtiilillä ja magneettisekoittajalla. Lisättiin j valeriaanahappoanhydridiä (0,2 ml, 1,0 mmol), ja liuoksen annettiin sekoittua 20 °C:ssa kolme tuntia. Reaktio sammutettiin vedellä (2 ml), ja seos haihdutettiin kirkkaaksi öljyksi ja puhdistettiin sitten flashkromatografisesti silikageelillä käyttäen porrasgradienttia CHCl3:n ja CHCl3/MeOH-seokseen (9:1) välillä. Näin saatiin 110 mg 2’-esteriä, joka oli kontaminoitunut 5'-esterillä (katso esimerkki 23), jolla on pienempi Rf-arvo. Tätä ainetta puhdistettiin vielä preparatiivisella levykromatografialla silikageelillä käyttäen CHCl3/MeOH-seosta (9:1), ja sitä haihdutettiin yhdessä asetonin kanssa, jolloin saatiin 70 mg 2'-esteriä kirkkaana lasina.

Analyysi C16H22N406 *0, 5( CH3 )2CO: lie laskettu: C: 53,16, H: 6,37, N: 14,17. havaittu: C: 52,89, H: 6,37, N: 13,96.

NMR- ja massaspektrit olivat yhdenmukaisia rakenteen kanssa.

Menetelmä 2 6-metoksi-9- [3,5-0-( 1,1,3,3-tetraisopropyylidisi-loksan-1,3-diyyli)-β-D-arabinofuranosyyli]-9H-puriinia esimerkistä 40 (2,5 g, 4,8 mmol) lisättiin 250 ml:n pyörö-pohjakolviin yhdessä 4-dimetyyliaminopyridiinin (0,06 g, 0,47 mmol) kanssa. Lisättiin kuivaa asetonitriiliä (30 ml) ja trietyyliamiinia (2,65 ml), ja vakionopeudella lisäävä tiputussuppilo täytettiin asetonitriilillä (20 ml) ja va-leriaanahappoanhydridillä (1,13 ml, 5,7 mmol). Reaktio- '9805 seosta jäähdytettiin 3 eC:ssa jäähauteessa argonvirrassa. Valeriaanahappoanhydridiliuoksen hidas lisääminen suoritettiin kahden tunnin kuluessa. Sitten reaktioseosta käsiteltiin metanolilla (10 ml), ja se väkevöitiin alipainees-5 sa. Jäännös laitettiin CHCl3:iin (200 ml), ja sitä uutettiin H20:lla (2 x 50 ml). Yhdistettyjä vesikerroksia ta-kaisinuutettiin CHCl3:lla (25 ml), ja yhdistetyt orgaaniset kerrokset kuivattiin (McjSO«), suodatettiin ja väkevöitiin, jolloin saatiin 3,44 g raakatuotetta.

10 Raaka 6-metoksi-9-[2-0-pentanoyyli-3,5-0-(1,1,3,3- tetraisopropyylidisiloksan-1,3-diyyli)-8-D-arabinofura-nosyyli]-9H-puriini liuotettiin tetrahydrofuraaniin (120 ml) ja veteen (3 ml). Liuos jäähdytettiin 3 eC:een jäähauteessa, ja lisättiin 1,0 M tetrabutyyliammoniumfluo-15 ridin tetrahydrofuraaniliuosta (6,0 ml). 1,5 tunnin kuluttua lisättiin kylläistä ammoniumkloridiliuosta (2 ml), ja reaktioseos johdettiin välittömästi silikageelikaasunpesu-kolonniin (5,0 x 8,0 cm), joka oli pakattu trikloorimetaa-niin. Kolonnia eluoitiin trikloorimetaanilla (200 ml) ja 20 sitten asetonin ja trikloorimetaanin 1:1-seoksella (400 ml), ja kaikki tuotetta sisältävät fraktiot yhdistettiin ja väkevöitiin. Lopullinen puhdistus suoritettiin silikageeliflashkolonnilla (5,0 x 15 cm) eluoiden CHCl3:iin liuotetun asetonin porrasgradientilla, jolloin saatiin 25 1,17 g (67 %) kirkasta, tahmeaa lasia, joka oli kontami- noitu valeriaanahapolla:

Analyysi C16H22N406*0,2C5H10O2: lie laskettu: C: 52,79, H: 6,25, N: 14,48. havaittu: C: 52,97, H: 6,38, N: 14,60.

30 Esimerkki 33 9-(2-0-butanoyyli-B-D-arabinofuranosyyli)-6-metoksi -9H- puri ini 9 - ( 8-D-arabinofuranosyyli)-6-metoksi-9H-puriinia esimerkistä 3 (283 mg, 1,0 mmol), asetonitriiliä (20 ml) 35 ja kuivaa pyridiiniä (5 ml) lisättiin kolmikaulaiseen pyö- 42 , r\ r : J L ·.· 5 röpohjakolviin, joka oli varustettu lämpömittarilla, ar-gonsyötöllä ja magneettisekoittajalla, ja jäähdytettiin 4 °C:een. Lisättiin voihappoanhydridiä (170 μΐ, 1,0 mmol), ja liuoksen annettiin sekoittua 5 eC:ssa kuusi tuntia ar-ό gonkehässä. Tässä vaiheessa reaktio sammutettiin lisäämällä 2 ml vettä ja haihduttamalla kirkkaaksi öljyksi. Reaktioseosta puhdistettiin flashkromatografisesti käyttäen porrasgradienttia CHCl3:n ja CHCl3:n ja asetonin seoksen (1:1) välillä. Tätä ainetta puhdistettiin vielä j preparatiivisella levykromatografialla silikageelillä käyttäen CHCl3:n ja MeOH:n 9:l-seosta, jolloin saatiin 90 mg 2’-esteriä kirkkaana öljynä.

Analyysi C15H20N4O6*0,3H20: lie laskettu: C: 50,36, H: 5,80, N: 15,66. havaittu: C: 50,36, H: 5,81, N: 15,66.

NMR- ja massaspektrit olivat yhdenmukaisia rakenteen kanssa.

Esimerkki 34 6-metoksi-9-[2-0-(2-metyylipropionyyli)-fi-D-arabi-nofuranosyyli]-9H-puriini 9-(β-D-arabinofuranosyyli )-*6-metoksi-9H-puriinia esimerkistä 3 (290,0 mg, 1,03 mmol), asetonitriiliä (20 ml) ja pyridiiniä (5 ml) lisättiin kolmikaulaiseen pyöröpohjakolviin, joka oli varustettu lämpömittarilla, argonsyötöllä, magneettisekoittajalla, jäähdyttimellä ja kuumennusvaipalla. Lisättiin isovoihappoanhydridiä (170 μΐ, 1,0 mmol), ja liuosta kuumennettiin 30 eC:ssa neljä tuntia. Tässä vaiheessa reaktio sammutettiin lisäämällä 2 ml vettä ja haihduttamalla kirkkaaksi öljyksi. Jäännös puhdistettiin flashkromatografisesti silikageelillä käyttäen porrasgradienttia CHCl3:n ja CHCl3/MeOH-seoksen (9:1) välillä. Niitä fraktioita, jotka sisälsivät tuotetta, jonka R-arvo oli 0,54 (piihappo, CHCl3:MeOH = 20:1) puhdistettiin edelleen preparatiivisella levykromatografialla silikageelillä käyttäen CHCl3:n ja MeOH:n seosta o r; c n r 43 ./ v . 0 (9:1). Näin saatiin 90,0 mg 2'-esteriä kirkkaana lasina. Analyysi C15H20N4O6*0,1C3H60: lie laskettu: C: 51,31, H: 5,80, N: 15,64. havaittu: C: 51,41, H: 5,81, N: 15,72.

5 NMR- ja massaspektrit olivat yhdenmukaisia raken teen kanssa.

Esimerkki 35 9-(3-0-bentsoyyli-B-D-arabinofuranosyyli)-6-metok-si-9H-puriini 10 9-(2,3-anhydro-B-D-lyksofuranosyyli)-6-metoksi- 9H-puriinia (katso valmistus esimerkissä 36) (0,264 g, 1,0 mmol), liuotettiin vedettömään etanoliin (20,0 ml), kuumennettiin refluksoituvaksi, ja lisättiin argonkehässä am-moniumbentsoaattia (0,209 g, 1,5 mmol). Lisättiin vielä 15 1,5 mmol ammoniumbentsoaattia 24 ja 35 tunnin kuluttua.

Reaktioseos haihdutettiin kuiviin 48 tunnin palautusjäähdytyksen jälkeen. Haihdutuksesta saatu jäännös puhdistettiin flashkromatografisesti silikageelillä (25,0 g, 2,5 x 15 cm) käyttäen CHCl3:n ja asetonin seosta 3:1. Ne frak-20 tiot, jotka sisälsivät tuotetta, jonka Rf-arvo oli 0,52 (silikageeli, CHC13:asetoni = 1:1), yhdistettiin, jolloin saatiin 138 mg haluttua yhdistettä, sp. 180-182 eC,

Analyysi C10HiaN4O6: lie 25 laskettu: C: 55,96, H: 4,70, N: 14,50.

havaittu: C: 55,90, H: 4,71, N: 14,44.

NMR- ja massaspektrit olivat yhdenmukaisia rakenteen kanssa.

Esimerkki 36 30 9- ( 2,3-anhydro-B-D-lyksofuranosyyli )-6-metoksipu- riini

Trifenyylifosfiini (5,902 g, 22,5 mmol) liuotettiin 1,4-dioksaaniin (138 ml) ja kuumennettiin 70 °C:een. Siihen lisättiin 9-(β-D-arabinofuranosyyli)-6-metoksi-9H-35 puriinia esimerkistä 3 (4,234 g, 15,0 mmol), seosta sekoi- 44 ;9o05 tettiin 10 minuuttia, ja lisättiin pisaroittain 10 minuutin kuluessa dietyyliatsodikarboksylaattia (3,919 g, 22,5 mmol) 1,4-dioksaanissa (50 ml). Reaktioseosta sekoitettiin 70 °C:ssa tunnin ajan, se jäähdytettiin huoneen j lämpötilaan ja haihdutettiin raskaaksi ruskeaksi öljyksi. Tämä aine puhdistettiin flashkromatografisesti silikagee-lillä (188,0 g, 5,0 x 21,0 cm) eluoiden CHCl3:n ja asetonin seoksella (5:1, 3,6 litraa) ja CHCl3:n ja asetonin seoksella (3:1, 2,0 litraa). Ne fraktiot, jotka sisälsivät j ainetta, jonka Rf-arvo oli 0,24 (silikageeli, CHC13:asetoni = 1:1), yhdistettiin ja haihdutettiin kuiviin. Jäännöstä puhdistettiin vielä flashkromatografisesti silikagee-lillä (250,0 g, 5,0 x 28,0 cm) eluoiden EtOAc:lla, jolloin saatiin 2,452 g (62 %) haluttua ainetta valkoisena vaahtona: sp. 144-145,5 °C,

Analyysi CuH12N404 · 0,25C3H60· 0,05CHC13: lie laskettu: C: 49,78, H: 4,80, N: 19,68. havaittu: C: 49,80, H: 4,95, N: 19,87.

NMR- ja massaspektrit olivat yhdenmukaisia rakenteen kanssa.

Esimerkki 37 6-metoksi-9-[ 2-0-( 4-metoksi.bentsoyyli )-B-D-arabino-furanosyyli]-9H-puriini 6-metoksi-9-[2-(4-metoksibentsoyyli)-3,5-0-(1,1,3, 3-tetraisopropyylidisiloksan-l,3-diyyli)-B-D-arabinofura-nosyyli]-9H-puriini (katso valmistus esimerkissä 40 alla) (0,86 g, 1,3 mmol), liuotettiin THF:iin (40 ml), ja lisättiin vettä (1 ml). Liuos jäähdytettiin 3 eC:een, ja lisättiin 1,0 M tetrabutyyliammoniumfluoridin THF-liuosta (6,3 ml). 30 minuutin kuluttua lisättiin vielä 5 ml H20, reaktioseoksen tilavuus pienennettiin puoleen, ja se johdettiin välittömästi silikageeliflashkolonniin (25,0 g, 2,5 x 15 cm), joka oli pakattu CH2Cl2:iin. Kolonnia eluoi-tiin CH2Cl2:lla (200 ml) ja sen jälkeen CH2Cl2:n ja metano-lin seoksella (20:1, 400 ml), ja kalkki fraktiot. Jotka 45 / ' '· 5 sisälsivät ainetta, jonka Rf-arvo oli 0,20 (silikageeli, CH2Cl2:MeOH = 20:1) yhdistettiin, jolloin saatiin 0,570 g valkoista vaahtoa. Lopullinen puhdistaminen suoritettiin silikageeliflashkolonnilla (5,0 x 15 cm), joka oli pakattu 5 CHCl3:iin. Eluointi trikloorimetaaniin liuotetun asetonin porrasgradientilla antoi 0,325 g (60 %) tuotetta valkoisena vaahtona: sp. 71-75 °C,

Analyysi C19H20N4O7 · 0,3CKC13 «0,25C3H60: lie 10 laskettu: C: 51,60, H: 4,71, N: 12,00.

havaittu: C: 51,56, H: 4,70, N: 11,95.

NMR- ja massaspektrit olivat yhdenmukaisia rakenteen kanssa.

Esimerkki 38 15 6 -metoksi - 9- [2-0-( 4 -metyylibent soyyli) -β-D-arabino- furanosyyli]-9H-puriini 6-metoksi-9-[2-(4-metyylibentsoyyli)-3,5-0-(1,1,3, 3-tetraisopropyylidisiloksan-l,3-diyyli)-8-D-arabinofurano-syyli]-9H-puriini (katso valmistus esimerkissä 42 alla) 20 (0,85 g, 1,3 mmol), liuotettiin THF:iin (40 ml) ja veteen (1 ml). Liuos jäähdytettiin 3 °C:een, ja lisättiin 1,0 M tetrabutyyliammoniumfluoridin THF-liuosta (5,0 ml). 30 minuutin kuluttua lisättiin vielä 5 ml H20, reaktioseoksen tilavuus pienennettiin puoleen, ja se Johdettiin välit-25 tömästi silikageeliflashkolonniin (20,0 g, 2,5 x 12 cm), joka oli pakattu CH2Cl2:iin. Kolonnia eluoitiin CH2Cl2:lla (200 ml) ja sen jälkeen CH2Cl2:n ja metanolin seoksella (15:1, 400 ml), ja kaikki fraktiot, jotka sisälsivät ainetta, jonka Rf-arvo oli 0,20 (silikageeli, CH2Cl2:MeOH = 30 20:1), yhdistettiin. Raakatuote vietiin toiseen silika geeliflashkolonniin (25,0 g, 2,5 x 18 cm), joka oli pakattu asetonin ja CH2Cl2:n seokseen (1:1). Eluointi samalla liuottimena antoi 0,633 g tuotetta, jota puhdistettiin vielä preparatiivisella levykromatografiällä (silikageeli, 35 asetoni:CH2C12 = 1:1) ja flashkromatografiällä (25,0 g.

46 ; 9 0 0 5 2.5 χ 15 cm). Kolonnia eluoitiin CHCl3:iin liuotetun asetonin porrasgradientilla, jolloin saatiin 0,243 g (47 %) kirkasta lasimaista ainetta: sp. 69-73 °C, o Analyysi C19H20N4O6*0,4C3H60*0, 25CHC13: lie laskettu: C: 54,17, H: 5,03, N: 12,36. havaittu: C: 54,00, H: 5,08, N: 12,30.

NMR- ja massaspektrit olivat yhdenmukaisia rakenteen kanssa.

j Esimerkki 39 9-[(2-0-(4-klooribentsoyyli)-S-D-arabinofuranosyy-li]-6-metoksi-9H-puriini 9-[2-(4-klooribentsoyyli)-3,5-0-(1,1,3,3-tetraiso-propyylidisiloksan-1,3-diyyli)-8-D-arabinofuranosyyli]-6-metoksi-9H-puriini (katso valmistus esimerkissä 44 alla) (1,07 g, 1,7 mmol), liuotettiin THF:iin (40 ml) ja veteen (1 ml). Liuos jäähdytettiin 3 °C:een, ja lisättiin 1,0 M tetrabutyyliammoniumfluoridin THF-liuosta (4,5 ml). 30 minuutin kuluttua lisättiin vielä 5 ml H20, ja reaktioseos johdettiin välittömästi silikageeliflashkolonniin (20,0 g, 2.5 x 12 cm), joka oli pakattu CH2Cl2:iin. Kolonnia eluoitiin CH2Cl2:lla (200 ml) ja sen jälkeen CH2Cl2:n ja MeOH:n seoksella (20:1, 400 ml), ja kaikki fraktiot, jotka sisälsivät ainetta, jonka Rf-arvo oli 0,20 (silikageeli, CH2Cl2:MeOH = 20:1), yhdistettiin. Raakatuote vietiin silikageeliflashkolonniin (30,0 g, 2,5 x 18 cm), joka oli pakattu asetonin ja CHCl3:n seokseen (1:1). Eluointi samalla liuottimena antoi 0,269 g tuotetta, jota puhdistettiin vielä preparatiivisella levykromatografiällä (silikageeli, asetoni:CHC13 = 2:3) ja flashkromatografialla (25,0 g, 2.5 x 15 cm). Kolonnia eluoitiin CHCl3:iin liuotetun asetonin porrasgradientilla. Analyysinäyte valmistettiin viemällä tuote vedettömään eetteriin ja seostamalla petro-lieetterillä (40-60 °C) ja kylmäkuivaamalla saostuma, jolloin saatiin 0,082 g (12 %) valkoista jauhetta: sp. 76-81 °C, i 47 ) ο η 5

Analyysi CieH17N406· 1,20H20 * 0,35C3H60: lie laskettu: C: 49,45, H: 4,68, N: 12,11. havaittu: C: 49,78, H: 4,38, N: 11,88.

NMR- ja massaspektrit olivat yhdenmukaisia raken-5 teen kanssa.

Esimerkki 40 6-metoksi-9- [3,5-0-(1,1,3,3-tetraisopropyyli-l, 3-disiloksan-1,3-diyyli)-B-D-arabinofuranosyyli]-9H-puriini 10 9-(β-D-arabinofuranosyyli) -6-metoksi-9H-puriini esimerkistä 3 (1,0 g, 3,54 mmol) ja imidatsoli (0,965 g, 14,2 mmol) liuotettiin kuivaan dimetyyliformamidiin (10 ml), ja liuos jäähdytettiin 3 °C:een. Sitten lisättiin 1,3-dikloori-l,1,3,3-tetraisopropyylidisiloksaania 15 (1,35 ml, 3,90 mmol), ja seosta sekoitettiin argonkehässä kolme tuntia. Sitten reaktio sammutettiin H20:lla (1 ml), ja reaktioseos väkevöitiin alipaineessa. Jäännöksen annettiin jakautua etyyliasetaatin (150 ml) ja HzO:n (50 ml) välillä, ja etyyliasetaattikerros kuivattiin (MgS04), suo-20 datettiin ja väkevöitiin. Raakatuote laitettiin etyyliasetaattiin ja puhdistettiin flashkromatografisesti silika-geelillä (25,0 g, 2,5 x 15 cm). Niistä fraktioista, joiden Rf-arvo oli 0,70 (silikageeli, etyyliasetaatti), saatiin 1,48 g (80 %) haluttua ainetta valkoisena, kiinteänä ai-25 neena. UVBajl, EtOH: 248,4 nm.

NMR- ja massaspektrit olivat yhdenmukaisia rakenteen kanssa.

Esimerkki 41 6-metoksi-9- [2-0- ( 2-aminobentsoyyli ) -B-D-arabino-30 furanosyyli]-9H-puriini 9- ( B-D-arabinofuranosyyli)-6-metoksi-9H-puriinia esimerkistä 3 (0,283 g, 1,0 mmol), asetonitriiliä (15 ml), N-karboksiantraniilihappoanhydridiä (0,189 g, 1,1 mmol) ja natriumvetykarbonaattia (84 mg, 1,0 mmol) lisättiin kol-35 mikaulaiseen pyöröpohjakolviin, joka oli varustettu lämpömittarilla, argonin syöttöventtiilillä, magneettisekoit- o p π ς 48 ' c 3 tajalla, jäähdyttimellä ja kuumennusvaipalla. Suspensiota palautusjäähdytettiin 3,5 tuntia, ja lisättiin toinen ekvivalentti N-karboksiantraniilihappoanhydridiä. Vielä tunnin palautusjäähdytyksen jälkeen reaktioseos jäähdytet-o tiin huoneen lämpötilaan, suodatettiin, ja suodos haih dutettiin huokoiseksi lasimaiseksi aineeksi. Jäännös puhdistettiin flashkromatografisesti silikageelillä käyttäen porrasgradienttia CHCl3:n ja CHCl3/MeOH-seoksen (9:1) välillä. Näin saatiin 53,1 mg 2’-esteriä hauraana lasimai-0 sena aineena: sp. 91-93 °C.

Analyysi C18H19N5O5*0,3H2O-0,2CH40:lle laskettu: C: 52,90, H: 4,98, N: 16,95. havaittu: C: 53,23, H: 4,98, N: 17,21.

5 NMR- ja massaspektrit olivat yhdenmukaisia raken teen kanssa.

Esimerkki 42 6-metoksi-9-[2-0-(4-metyylibentsoyyli)-3,5-0-(1,1, 3,3-tetraisopropyylidisiloksan-l, 3-diyyli )-B-D-ara-.0 binofuranosyyli]-9H-puriini 6-metoksi-9-[3,5-0-( 1,1,3,3-tetraisopropyylidisiloksan-l, 3-diyyli)fl-D-arabinofuranosyyli]-9H-puriiniaesi-merkistä 40 (1,0 g, 1,9 mmol), lisättiin kolmikaulaiseen 100 ml pyöröpohjakolviin 4-dimetyyliaminopyridiinin -5 (0,02 g, 0,16 mmol), asetonitriilin (25 ml) ja trietyyli- amiinin (0,4 ml) kanssa, ja liuosta jäähdytettiin jäähau-teessa 3 °C:ssa viisi minuuttia. Lisättiin toluoyyliklori-dia (0,30 ml, 2,3 mmol), ja seosta sekoitettiin 3 °C:ssa kolme tuntia. Sitten lisättiin vielä trietyyliamiinia ό0 (0,5 ml) ja toluoyylikloridia (0,5 ml), ja seos lämpeni huoneen lämpötilaan. Seitsemän tunnin kuluttua seosta käsiteltiin metanolilla (2 ml), se väkevöitiin alipaineessa, ja jäännös laitettiin silikageeliflashkolonniin (2,5 x 15 cm) CH2Cl2:ssa. Kolonnia eluoitiin CH2Cl2:n ja MeOH:n 35 seoksella (10:1, 400 ml), jolloin saatiin 0,90 g (74 %) haluttua tuotetta: 49 -9805

Analyysi C31H46N407Si2: lie laskettu: C: 57,92, H: 7,21, N: 8,71. havaittu: C: 57,69, H: 7,43, N: 8,40.

NMR- ja massaspektrit olivat yhdenmukaisia raken-5 teen kanssa.

Esimerkki 43 6-metoksi-9-[2-0-(4-metoksibentsoyyli)-3,5-0-(1,1,3,3-tetraisopropyylidisiloksan-l,3-diyyli)-8-D-arabinofuranosyyli]-9H-puriini 10 6-metoksi-9 -[3,5-0-( 1,1,3,3-tetraisopropyylidisi- loksan-1,3-diyyli)B-D-arabinofuranosyyli]-9H-puriiniaesi-merkistä 40 (1,0 g, 1,9 mmol), lisättiin kolmikaulaiseen 100 ml pyöröpohjakolviin 4-dimetyyliaminopyridiinin (0,02 g, 0,16 mmol), asetonitriilin (25 ml) ja trietyyli-15 amiinin (0,4 ml) kanssa, ja sen jälkeen lisättiin anisoyy-likloridia (0,35 ml, 2,5 mmol). Kun seos oli ollut neljä tuntia huoneen lämpötilassa, sitä käsiteltiin metanolilla (2 ml), ja se väkevöitiin alipaineessa. Jäännös laitettiin silikageeliflashkolonniin (25,0 g, 2,5 x 15 cm) CH2Cl2:n ja 20 MeOHtn seoksessa (20:1). Eluointi samalla liuottimena antoi 0,930 g (74 %) haluttua tuotetta:

Analyysi C31H46N4O8Si2*0,35H20:lie laskettu: C: 55,97, H: 7,08, N: 8,42. havaittu: C: 56,02, H: 7,01, N: 8,32.

25 Esimerkki 44 9-[2-0-( 4-klooribentsoyyli )-3,5-0- (1,1,3,3-tetraisopropyylidisiloksan-l, 3-diyyli)-B-D-arabinofura-nosyyli]-6-metoksi-9H-puriini 6-metoksi-9 - [3,5-0-( 1,1,3,3-tetraisopropyylidisi-30 loksan-1,3-diyyli)-β-D-arabinofuranosyyli]-9H-puriinia esimerkistä 40 (1,0 g, 1,9 mmol), lisättiin kolmikaulaiseen 250 ml pyöröpohjakolviin 4-dimetyyliaminopyridiinin (0,02 g, 0,16 mmol), asetonitriilin (25 ml) ja trietyyli-amiinin (0,4 ml) kanssa, ja liuosta jäähdytettiin jäähau-35 teessä 3 eC:ssa viisi minuuttia. Lisättiin 4-klooribentso- 50 :B B O 5 yylikloridia (0,31 ml, 2,5 mmol), ja reaktioseos poistettiin jäähauteesta. Kun liuos oli ollut kahdeksan tuntia huoneen lämpötilassa, sitä käsiteltiin MeOH:lla (3 ml), ja se väkevöitiin alipaineessa. Jäännös laitettiin CH2Cl2:iin 5 ja vietiin silikageeliflashkolonniin (25,0 g, 2,5 x 15 cm) samassa liuottimessa. Kolonnia eluoitiin CH2Cl2:lla (200 ml), ja sitten CH2Cl2:n ja MeOHrn seoksella (20:1, 400 ml), jolloin saatiin 1,05 g 1.82 %) tuotetta, joka oli saatu homogeenisena ohutkerroskromatografiän avulla (sili-0 kageeli, CH2Cl2:Me0H = 20:1, Rf = 0,44):

Analyysi C30H43N407ClSi2: lie laskettu: C: 54,32, H: 6,53, N: 8,45. havaittu: C: 54,48, H: 6,72, N: 8,28.

Esimerkki 45 .5 9-B-D-arabinofuranosyyli-6-dimetyyliamiini-9H-pu- riinin 5'-monofosfaattiesteri 9-B-D-arabinofuranosyyli-6-dimetyyliamiini-9H-pu-riinin 5'-monofosfaattiesteri syntetisoitiin siirtämällä adenosiini-5'-trifosfaatin (ATP) päätefosfaattiryhmä 9-8-.0 D-arabinofuranosyyli-6-dimetyyliamiini-9H-puriinin 5ΌΗ- ryhmään, jota reaktiota katalysoi tymidiinikinaasi (TK) varicella zosterviruksesta (VZV) (Fyfe, Molecular Pharmac.

21 432, 1982).

0,5 ml:aan 0,02 M tris(hydroksimetyyli)aminometaani-/5 HCl-puskuria, pH 7,5, lisättiin 50 nmol 9-B-D-arabinofura- nosyyli-6-dimetyyliamiini-9H-puriinia, 55 nmol ATP (Sigma Chemicals, St. Louis, MO), 55 nmol MgCl2 ja 0,005 I.U. VZV TK. Liuosta inkuboitiin 21 °C:ssa 2,5 tuntia, ja sitten se suodatettiin "Centricon 10"-suodattimen läpi (YM-membraa-30 ni, jossa on 10K molekyylipainon aukko, Amicon Inc., Danvers, MA) proteiinin poistamiseksi. Tuote tunnistettiin anioninvaihto-ohutkerroskromatografialla UV-valoa absorboivana täplänä, joka liikkui monofosfaatille tyypillisellä Rf-arvolla.

'γ· η ς 51 ' ^ ~

Esimerkki 46 6-metoksipuriiniarabinosidi-5'-monofosfaatti 1,5 g (4,9 mmol) nukleosidia, 6-metoksipuriiniara-binosidia, liuotettiin 15 ml:aan trietyylifosfaattia ja 5 4,8 ml:aan trietyyliamiinia. Tämä liuos jäähdytettiin -10 °C:een. Lisättiin sekoittaen 0,91 ml fosforioksikloridia. 10 minuutin kuluttua lisättiin vielä 0,3 ml fosforioksikloridia. Toisen 10 minuutin jälkeen reaktio päätettiin lisäämällä 100 ml jääkylmää 0,5 M trietyyliamiinin vesi-10 liuosta. Kaikki edellä mainitut reagenssit oli ostettu Aldrichilta.

Lopullisen reaktioseioksen komponentit erotettiin ioninvaihtokromatografisesti QAE-Sephadexilla (Pharmacia). Komponentit eluoitiin 50 mM - 1 M anunoniumvetykarbonaat-15 tigradientilla. 6-metoksipuriiniarabinosidi-5’-monofos- faattia oli vain noin 10 % kolonnista eluoituvasta aineesta. Epäorgaanisen ortofosfaatin poistamiseksi yhdisteestä käytettiin ioninvaihtokromatografiaa BioRad AG-lX8-hart-silla ja 100 mM - 750 mM ammoniumvetykarbonaattiporrasgra-20 dienttia. Yhdistettä sisältävät fraktiot haihdutettiin kerran vakuumissa ylimääräisen ammoniumvetykarbonaatin poistamiseksi, ja sitten suoritettiin kylmäkuivaus.

6-metoksipuriiniarabinosidi-5'-monofosfaatti saatiin 3 % saannolla (0,14 mmol, 50 mg). UV-spektri 25 (max 250 nm ja min 221 nm pHrssa 7) ja emäs/fosfaattisuhde (1,00/1,08) olivat yhdenmukaisia yhdisteen rakenteen kanssa. Yhdiste voitaisiin lohkaista nukleosidiksi alkalisella fosfataasilla ja 5'-nukleotidaasilla.

Esimerkki 47 30 6-metoksipuriiniarabinosidi-5'-trifosfaatti 6-metoksipuriiniarabinosidi-5'-monofosfaattia esimerkistä 46 (36 mg, 93 pmol) liuotettiin 2 ml:aan hek-sametyylifosforamidia. Lisättiin karbonyylidi-imidatsolia (82 mg, 506 pmol), ja seosta sekoitettiin kaksi tuntia 35 huoneen lämpötilassa. Lisättiin metanolia (0,032 ml.

' ;· r c.

52 v ^ 800 pmol), ja seosta sekoitettiin 20 minuuttia. Lisättiin tributyyliammoniumpyrofosfaattia (220 mg, 470 μπιοί, Sigmalta), joka oli liuotettu 1,5 ml:aan heksametyylifosfor-amidia, ja seosta sekoitettiin 18 tuntia huoneen lämpö-5 tilassa. Reaktio päätettiin lisäämällä 50 ml vettä. Edellä mainitut reagenssit oli ostettu Aldrichilta, paitsi ne joista on toisin mainittu. 5’-trifosfaatti puhdistettiin ioninvaihtokromatografisesti QAE--Sephadex A-25:lla (Pharmacia ), eluoiden 50 mM - 800 mM ammoniumvetykarbonaatin 0 porrasgradientilla. Yhdistettä sisältäviä fraktioita haihdutettiin kerran vakuumissa ylimääräisen ammoniumvetykar-bonaatin poistamiseksi, ja sitten ne liuotettiin uudelleen veteen ja varastoitiin pakastettuna -20 °C:ssa.

6-metoksipuriiniarabinosidi-5'-trifosfaattisaatiin 5 60 % saannolla (57 μπιοί, 30 mg). UV-spektri (max 250 nm ja min 223 nm pH:ssa 7) ja emäs/fosfaattisuhde (1,00/3,10) olivat yhdenmukaisia yhdisteen rakenteen kanssa. Yhdiste voitaisiin lohkaista nukleosidiksi alkalisella fosfataa-silla ja monofosfaatiksi fosfodiesteraasi 1:11a.

-0 Esimerkki 48 6-dimetyyliamino-9-(2-0-valeryyli)-β-D-arabinosyy- li-9H-puriini 6-dimetyyliaminopuriiniarabinosidi (0,501 g, 1,67 mmol) liuotettiin 20 ml:aan pyridiiniä ja 20 ml:aan .5 DMF:a. Liuos jäähdytettiin 4 °C:een, ja lisättiin hitaasti valeraanahappoanhydridiä (0,43 ml, 2,17 mmol, Aldrich Chemical Co., Milwaukee, Wi), joka oli liuotettu 5 ml:aan pyridiiniä ja 5 ml:aan DMF. Liuos lämmitettiin 40 eC:een, ja kahden tunnin kuluttua liuotin poistettiin vakuumissa. iO Jäännös flashkromatografioitiin silikageelikolonnilla, 4,8 x 20 cm, 150 ml:11a kutakin seuraavista dikloorimetaa-nin ja metanolin seoksista (V:V) 100:0, 98:2, 96:4, 94:6, 92:8, 90:10. Tuotetta sisältävät fraktiot yhdistettiin ja kylmäkuivaus antoi 0,195 g 6-dimetyyliamino-9-(2-0-vale-o5 ryyli)-B-D-arabinosyyli-9H-puriinia: TLC Rf = 0,55 (sili- i ί: o n c 53 U 5 kageeli, dikloorimetaani:metanoli = 9:1).

Analyysi C17H25N505 · 0, 5H20: lie laskettu: C: 52,57, H: 6,75, N: 18,03 havaittu: C: 52,61, H: 6,77, N: 17,99 5 NMR- ja massaspektrit olivat yhtäpitäviä rakenteen kanssa.

Esimerkki 49 6-dimetyyliamino-9-(2,3,5-triasetyyli-B-D-arabino-syyli)-9H-puriini 10 6-dimetyyliaminopuriiniarabinosidi (3,00 g, 10,0 irnnol) liuotettiin 20 ml:aan asetonitriiliä ja 45 ml:aan pyridiiniä, jotka oli tasapainotettu 4 °C:een. Reaktioseokseen lisättiin pisaroittaan asetyylikloridia (2,85 ml, 40,08 mmol, Aldrich Chemical Co., Milwaukee, 15 Wi), joka oli 7 ml:ssa asetonitriiliä. Viiden tunnin kuluttua liuotin poistettiin vakuumissa alle 45 °C:ssa, ja jäljelle jäävä aine vietiin suurtyhjöpumppuun 24 tunniksi. Sitten kuivattu jäännös flashkromatografioitiin silikagee-likolonnilla, 4,8 x 20 cm, dikloorimetaanin ja metanolin 20 seoksella 9:1. Tuotetta sisältävät fraktiot yhdistettiin, ja kylmäkuivaus antoi 0,445 g 6-dimetyyliamino-9-(2,3,5-triasetyyli-B-D-arabinosyyli)-9H-puriinia: TLC Rf = 0,61 (silikageeli, dikloorimetaani:metanoii = 9:1).

Analyysi C18H23N507: lie 25 laskettu: C: 51,30, H: 5,50, N: 16,62 havaittu: C: 51,40, H: 5,55, N: 16,54 NMR- ja massaspektrit olivat yhtäpitäviä rakenteen kanssa.

Valmiste-esimerkkej ä 30 Tablettivalmisteet

Seuraavat valmisteet A ja B valmistetaan aineosien märkärakeistuksella käyttäen providoniliuosta ja sen jälkeen lisäämällä magnesiumstearaattia ja puristamalla.

35 Valmiste A

54 S ' ^ ^ 5 mg/tabletti mg/tabletti (a) vaikuttava aineosa 250 250 (b) laktoosi B.P. 210 26 (c) providoni B.P. 15 9 3 (d) natriumtärkkelysglykolaatti 20 12 (e) magnesiumstearaatti 5 3 500 300

Valmiste B

mg/tabletti mg/tabletti 0 (a) vaikuttava aineosa 250 250 (b) laktoosi 150 (c) Avicel PH 101 60 26 (d) providoni B.P. 15 9 (e) natriumtärkkelysglykolaatti 20 12 .5 (f) magnesiumstearaatti 5 3 500 300

Valmiste C

mg/tabletti vaikuttava aineosa 100 :0 laktoosi 200 tärkkelys 60 providoni B.P. 5 magnesiumstearaatti 4 359 -5

Tabletit valmistetaan edellä esitetyistä aineosista (C) märkärakeistamalla ja sen jälkeen puristamalla. Vaihtoehtoisessa menetelmässä providoni B.P. voidaan korvata polyvinyylipyrrolidonilla.

30 Seuraavat valmisteet D ja E valmistetaan purista malla suoraan yhdistetyt aineosat. Laktoosi valmisteessa E on suoraan puristettavaa tyyppiä (Dairy Crest- "Zeparox").

55 '·’ J ~ ^ 5

Valmiste D

mg/kapseli vaikuttava aineosa 250 pregelatinoitu tärkkelys NF15 150 5 400

Valmiste E

mg/kapseli vaikuttava aineosa 250 laktoosi 150 10 Avicel 100 500

Valmiste F (säädellysti vapauttava valmiste)

Valmiste valmistetaan märkärakeistamalla aineosat 15 (alla) providoniliuoksen kanssa ja sen jälkeen lisäämällä magnesiumstearaatti ja puristamalla mg/tabletti (a) vaikuttava aineosa 500 (b) hydroksipropyylimetyyliselluloosa 112 20 (Methocel K4M Premium) (c) laktoosi B.P. 53 (d) providoni B.P. 28 (e) magnesiumstearaatti 7 700 25 Lääkkeen vapautuminen tapahtuu noin 6-8 tunnin aikana, ja se on tapahtunut loppuun 12 tunnin kuluttua.

Kapselivalmisteet Valmiste A

30 Kapselivalmiste valmistetaan yhdistämällä edellä olevan esimerkin 48 valmisteen D aineosat ja täyttämällä niillä kaksiosainen kova gelatiinkapseli. Valmiste B (infra) valmistetaan samalla tavalla.

·, r* 56 , JV: 5

Valmiste B

mg/kapseli (a) vaikuttava aineosa 250 (b) laktoosi B.P. 143 ό (c) natriumtärkkelysglykolaatti 25 (d) magnesiumstearaatti 2 420

Valmiste C

mg/kapseli 0 (a) vaikuttava aineosa 250 (b) polyetyleeniglykoli 4000 B.P. 350 600

Kapselit valmistetaan sulattamalla polyetyleeniglykoli 4000 B.P., dispergoimalla vaikuttava aineosa sulaan 5 ja täyttämällä kaksiosainen kova gelatiinikapseli tällä sulalla.

Valmiste D

mg/kapseli vaikuttava aineosa 250 .0 lesitiini 100 maapähkinäöljy 100 450

Kapselit valmistetaan dispergoimalla vaikuttava aineosa lesitiiniin ja maapähkinäöljyyn ja täyttämällä -5 disperio pehmeisiin, elastisiin gelatiinikapseleihin. Valmiste E (säädellysti vapauttava kapseli)

Seuraava säädellysti vapauttava kapselivalmiste valmistetaan suulakepuristamalla aineosat a, b ja c suulakepuristinta käyttäen, ja sen jälkeen pelletoimalla eks-trudaatti ja kuivaamalla. Sitten kuivatut pelletit päällystetään vapautumista säätelevällä kalvolla (d) ja ne täytetään kaksiosaiseen kovaan gelatiinikapseliin.

ί :) c n c 57 ' * Kj ' u mg/kapseli (a) vaikuttava aineosa 250 (b) mikrokiteinen selluloosa 125 (c) laktoosi B.P. 125 5 (d) etyyliselluloosa 13 513

Sllmäliuos vaikuttava aineosa 0,5 natriumkloridi, analyysipuhdas 0,9 g 10 tiomersaali 0,001 g puhdistettua vettä niin, että tilavuudeksi tulee 100 ml pH säädetään arvoon 7,5

Injektoitava valmiste 15 vaikuttava aineosa 0,200 g steriili, pyrogeeniton fosfaattipuskuri (pH 9,0), niin, että tilavuudeksi tulee 10 ml

Vaikuttava aine liuotetaan enimpään osaan fosfaattipuskuria (35-40 °C), sitten tilavuus säädetään, ja liuos 20 suodatetaan steriilin mikroporesuodattimen läpi steriiliin 10 ml:n ruskeaan lasiseen lääkepulloon (tyyppi 1), ja se suljetaan steriileillä sulkimilla ja suojapäällysteillä. Lihakseen annettava injektio vaikukttava aineosa 0,20 g 25 bentsyylialkoholi 0,10 g glykofurfuraali 75 1,45 g injektiota varten tarkoitettua vettä niin, että kokonaistilavuudeksi tulee 3,00 ml

Vaikuttava aineosa liuotetaan glykofurfuraaliin. 30 Sitten lisätään ja liuotetaan bentsyylialkoholi ja lisätään vettä niin, että tilavuudeksi tulee 3 ml. Sitten seos suodatetaan steriilin mikroporesuodattimen läpi ja suljetaan steriileihin 3 ml ruskeisiin lasisiin lääkepulloihin (tyyppi 1).

58 :8 "ί 5

Siirappisuspensio vaikukttava aineosa 0,25 g sorbitoliliuos 1,50 g glyseroli 2,00 g 3 dispergoituva selluloosa 0,075 g natriumbentsoaatti 0,005 g makuaine, persikka 17.42.3169 0,0125 ml puhdistettua vettä niin, että kokonaistilavuudeksi tulee 5,00 ml 0 Natriumbentsoaatti liuotetaan osaan puhdistettua vettä, ja lisätään sorbitoliliuos. Vaikuttava aineosa lisätään ja dispergoidaan. Paksunnosaine (dispergoituva selluloosa) dispergoidaan glyseroliin. Nämä kaksi dispersiota sekoitetaan, ja tilavuus säädetään vaadittuun arvoon puh-d distetulla vedellä. Lisäpaksuuntuminen saadaan vaadittaessa aikaan suspension ylimääräisellä hiertämisellä. Peräpuikko mg/peräpuikko

Vaikuttava aineosa (63 pm)* 250 .0 Hard Fat, B.P. (Witepsol H15 - Dynamit Nobel) 1700 1950 ♦Vaikuttava aineosa käytetään jauheena, jossa vähintään 90 % partikkeleista on halkaisijaltaan 63 pm tai alle sen.

Yksi viidesosa Witepsol H15:a sulatetaan höyryvai-.o pallisessa kattilassa lämpötilassa enintään 45 eC. Vaikuttava aineosa seulotaan 200 pm:n seulan läpi ja lisätään sulaan pohjaan sekoittaen käyttäen silversonia, jossa on leikkaava pää, kunnes saadaan aikaan tasainen dispersio. Jäljellä oleva Witepsol H15 lisätään suspensioon pitäen jJ seosta 45 °C:ssa, ja sekoitetaan homogeenisen sekoittumisen varmistamiseksi. Koko suspensio lasketaan 250 pm:n ruostumattoman terässeulan läpi, ja jatkuvasti sekoittaen sen annetaan jäähtyä 40 °C:een. Lämpötilassa 38-40 9C

2,02 g seosta täytetään sopiviin muovimuotteihin. Peräkö puikkojen annetaan jäähtyä huoneen lämpötilaan.

59

Pessaarit mg/pessaari vaikuttava aineosa 63 pm 250 vedetön dektroosi 380 5 perunatärkkelys 363 magnesiumstearaatti 7 1000

Edellä esitetyt aineosat sekoitetaan suoraan, ja pessaarit valmistetaan puristamalla suoraan saadusta seok-10 sesta.

Biologiset ominaisuudet

Virusvastaisen toksisuuden ja hyötyosuuden testaus Väreellä zosterviruksen vastaisen vaikutuksen määrittäminen 15 Yhdisteiden estävä vaikutus VZV:n (Oka-kanta) rep likoi tumiseen määritettiin ELISA-menetelmällä (Berkowitz, F.E. ja Levin, M.J. (1985), Antimicrob. Agents and Chemother. 28, 207-210), jota modifioitiin seuraavasti.

Infektiot aloitettiin lääkkeen läsnä ollessa mielummin 20 kuin ennen lääkkeen lisäämistä. Lääkkeen ja viruksen yh dessä infektoitumattomien solujen (ihmisen diploidit fib-roblastit, kanta MRC-5) kanssa suoritetun kolmen päivän inkuboinnin lopussa 96-kuoppaisia kuoppalevyjä sentrifu-goitiin viisi minuuttia kiihtyvyydellä 200 x g irtonaisten 25 solujen sedimentoimiseksi ennen glutaarialdehydikiinnitys- tä. Kyseinen ELISA käytti toisena vasta-aineena alkalisel-la fosfataasilla konjugoitua anti-humaania IgG:a. p-nitro-fenyylifosfaatin lohkeamisnopeus sidotun alkalisen fosfa-taasin avulla määritettiin niin kuin on esitetty toisaalla 30 (Tadepalli, S.M., Quinn, R.P. ja Averett, D.R. 1986.

Antimicrob Agents ja Chemother. 29, 93-98). Infektoitumattomia soluja käytettiin O-reaktionopeuksien saamiseksi, jotka vähennettiin viruksen läsnä ollessa saaduista nopeuksista. Tämä määritysmenetelmä oli sopiva progeniavi-35 ruksen toteamiseksi viljelmissä, jotka oli alussa infektoi tu 153600 infektoivalla partikkelilla kuoppaa kohti.

·. · r: ς 60 31

Ehdolla olevien yhdisteiden kyky estää D98-solujen (ihminen) ja L-solujen (hiiri) kasvua mitattiin määrittämällä solujen lukumäärä sen jälkeen, kun standardimäärää soluja oli altistettu yhdisteen erialaisille laimennoksille kolme päivää (Rideout, J.L., Krenitsky, T.A., Koszalka, G.W., Cohn, N.K., Chao, E.Y., Elion, G.B., Latter, V.S. ja Williams, R.B. (1982) J. Med. Chem. 25, 1040-1044). Solujen lukumäärää verrattiin sitten ilman yhdistettä saatuun lukumäärään. Solujen laskeminen suoritettiin joko suoralla j partikkelilaskulla yksittäiskerroksen (mono-layer) tryp-siinikäsittelyn jälkeen tai solujen ottaman vitaalin väriaineen spektrofotometrisella määrityksellä. Molemmilla menetelmillä saatiin vertailukelpoisia tuloksia.

Yhdisteen konsentraatio, jolla saadaan 50 % estoar-„ vot (IC50) laskettiin joko interpoloimalla suoraan kuvaajista, joissa oli prosentuaalinen estoarvo yhdisteen kon-sentraation logaritmin funktiona, tai tietokoneohjelmalla, joka analysoi tuloksia saman algoritmin mukaisesti. Näissä laskuissa käytettiin estoarvoja välillä 20-80 %.

sJ

Esimerkki VZV(IC^pM) Toksisuus soluille_ (esto (%) pitoisuudella 100 μΜ) _D-98-solut_L-solut_ 1 3 93 87 o 2 1 85 69 3 0,8 96 72 4 6 107 97 5 1 50 50 6 3 61 47 j>0 (asykloviiri) 20 100 50

Kahdelle Long-Evansin rotalle annosteltiin letku-ruokinnalla käyttäen mahalaukun sisäistä letkua annos 10 mg/kg esimerkin 3 yhdistettä tai sama moolimäärä esi-„5 merkkien 16, 24 ja 32 yhdisteitä. Eläimet laitettiin aineenvaihdunnan seurantahäkkeihin ja virtsa kerättiin aikaväleillä 0-24 tuntia ja 24-48 tuntia annostuksen jäi-

J

'.2805 61 keen. Virtsat analysoitiin käänteisfaasi-HPLC:11a. Tulokset on ilmoitettu virtsasta 48 tunnissa talteen otettuna prosentuaalisena annoksena esimerkin 3 yhdisteenä.

5 Esimerkki__Annos (%} 3 4,9/2,5 16 11,7 24 7,9 32 15,9 10

Claims (4)

62 P 9 p ii ς

1. Menetelmä kaavan (I) mukaisten, terapeuttisesti käyttökelpoisten substituoitujen puriiniarabinosidien ja niiden farmaseuttisesti hyväksyttävien johdannaisten, kuten farmaseuttisesti hyväksyttävien eettereiden, suolojen, estereiden tai tällaisten estereiden suolojen valmistamiseksi, Ri XX) 0 OH jossa Rx on metoksi, etoksi, propoksi tai jodi; halogeenilla substituoitu C1.5-alkoksiryhmä; aminoryhmä, joka on mono-j substituoitu metyylillä, C^-alkyylillä, joka on substituoitu yhdellä tai useammalla fluoriatomilla, tai C3_6-syk-loalkyylillä tai joka on disubstituoitu C^-alkyylillä, C^-alkyylillä, joka on substituoitu yhdellä tai useammalla fluoriatomilla, tai C3_6-sykloalkyylillä; tai on aminoryhmä, .o joka on osa rengasta, jossa on 4-7 hiiliatomia ja mahdollisesti kaksoissidos ja/tai toinen typpiatomi; ja R2 on vety, halogeeni tai amino, edellyttäen, että silloin kun yhdiste ei ole farmaseuttisesti hyväksyttävän johdannaisen muodossa ja R2 on vety, R3 ei ole metoksi, dimetyyliamino, .0 piperidino tai pyrrolidino; tunnettu siitä, että A. annetaan yhdisteen, jolla on kaava (II) Ri N ' \ .5 / / X (M) ^\n/ II jossa Rj ja R2 ovat edellä määriteltyjä, reagoida yhdis teen kanssa, jolla on kaava (III) ·< r; >' r; ς 63 ' ~ ~

5 HY°VX \ ho/ (III) OH 10 jossa X on pyrimidiini- tai puriiniemäs (muu kuin kaavan (II) mukainen yhdiste), tai B. annetaan yhdisteen, jolla on kaava (IV) z

15. Na il \ . ! / (iv) 20 γ όη jossa Z on poistuva ryhmä ja R2 on edellä määritelty, reagoida yhdisteen kanssa, joka kykenee tuomaan vaadittavan 25 ryhmän 6-asemaan, ja mahdollisesti sen jälkeen tai samanaikaisesti sen kanssa, silloin kun saatu yhdiste on kaavan (I) mukainen, muutetaan se farmaseuttisesti hyväksyttäväksi johdannaisekseen, tai silloin kun saatu yhdiste on farmaseuttisesti hyväksyttävä johdannainen, muutetaan se toi-30 seksi farmaseuttisesti hyväksyttäväksi johdannaiseksi tai kaavan (I) mukaiseksi yhdisteeksi.

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että valmistetaan kaavan (I) mukaisen yhdisteen farmaseutti se.st 1 hyväksyttävä Johdannainen, joka 3b on karboksyylihapon esteri. Jossa esterin ei-karbonyyliosa on suoraketjuinen tai haaroittunut alkyyli, alkoksialkyy-li, aralkyyli, aryylioksialkyyli tai aryyli, jotka ovat ) Ρ Γ: ς mahdollisesti substituoituja halogeenilla, C1.4-alkyylillä tai C1.4-alkoksilla, nitrolla tai aminolla; sulfonaatties-teri, kuten alkyylisulfonyyli- tai alkyyliaryylisulfonyy-liesteri; aminohapon esteri; tai mono-, di- tai trifos-j faattiesteri.

3. Patenttivaatimuksen 1 tai 2 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että valmistetaan 9-fl-D-arabinofu-ranosyyli-6-metoksi-9H-puriinin farmaseuttisesti hyväksyttävä johdannainen.

4. Patenttivaatimuksen 3 mukainen menetelmä, tun nettu siitä, että valmistetaan 6-metoksi-9-(2-0-pen-tanoyyli-B-D-arabinofuranosyyli)-9H-puriini. 65 fJ') 8 O 5