KR102313505B1 - 항-lag-3 항체 및 il-2를 포함하는 융합단백질 및 이의 용도 - Google Patents

항-lag-3 항체 및 il-2를 포함하는 융합단백질 및 이의 용도 Download PDF

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Abstract

본 발명은 항-LAG-3 항체 및 IL-2 또는 이의 변이체를 포함하는 융합단백질에 관한 것이다. 본 발명의 융합단백질에서 항-LAG-3 항체 부분이 LAG-3와 결합하여 LAG-3와 MHCⅡ와의 결합을 조절할 수 있다. 또한, IL-2 단백질 또는 이의 변이체는 T 세포의 활성을 조절할 수 있다. 따라서, 상기 융합단백질을 포함하는 약학 조성물은 체내의 면역활성을 증가시켜 항암제로 이용 가능하여 산업적으로 활용 가능성이 높다.

Description

항-LAG-3 항체 및 IL-2를 포함하는 융합단백질 및 이의 용도{FUSION PROTEIN COMPRISING ANTI-LAG-3 ANTIBODY AND IL-2 AND USE THEREOF}
본 발명은 항-LAG-3 항체 및 IL-2를 포함하는 융합단백질 및 이의 용도에 관한 것이다. 구체적으로, 본 발명은 암 치료 또는 예방 효능을 갖는 신규한 융합단백질에 관한 것이다.
암 면역요법(cancer immunotherapy)은 체내 면역 작용을 이용하여 암을 치료하는 방법이다. 암 면역요법은 면역계가 암 세포 표면 단백질과 같은 항원들을 표적으로 이용하여 암 세포를 공격하도록 유발할 수 있다. 특히, 면역 체크포인트 경로의 차단을 통해 항암 면역을 활성화시킬 수 있다는 점이 보고되었다. 면역 체크포인트는 종양 세포가 면역 회피를 초래하는 주요 메커니즘 중 하나이다. 따라서, 면역 체크포인트의 저해 또는 차단은 T 세포 활성화를 증가시킬 수 있고, 이에 의해 항-종양 면역을 강화할 수 있다.
한편, IL-2는 활성화된 T 세포 중 특히, CD4+ 헬퍼 T 세포(helper T cell)에 의해 주로 합성된다. IL-2는 T 세포의 증식 및 분화를 자극하고, 세포독성 T 림프구(cytotoxic T lymphocyte, CTL)의 생성 및 말초혈 림프구의 세포독성 세포 및 림포카인-활성화 살해 세포(lymphokine activated killer cell, LAK cell)로의 분화를 유도한다.
그러나, IL-2는 면역세포의 증가 및 활성을 매개할 뿐만 아니라, 면역 관용(immune tolerance)을 유지하는데 중요하다는 점에서 면역 반응에서 이중적 기능을 갖는다. 또한, IL-2는 종양의 성장을 억제하는데 최적이 아닐 수 있는 것으로 보고되었다. 그 이유는 IL-2의 존재 시, 생성된 세포독성 T 림프구에 AICD(activation-induced cell death)가 일어날 수 있고, 면역 반응이 IL-2 의존성 조절 T 세포(Treg)에 의해 억제될 수 있기 때문이다(Imai et al., Cancer Sci 98, 416-423, 2007).
한편, LAG-3는 PD-1과 유사한 기전을 가진다고 알려져 있다. LAG-3는 T 세포 및 NK 세포에서 발현하는 면역관문억제제로 CD4와 구조가 비슷하지만 D1 도메인에 30개의 추가적인 아미노산을 가지고 있어 MHC class II(MHCII)와 친화성이 높다고 알려져 있다.
Imai et al., Cancer Sci 98, 416-423, 2007
이에, 본 발명자들은 면역세포의 활성을 증진시키는 새로운 조합의 융합단백질을 개발하기 위해 연구한 결과, 항-LAG-3 항체 및 IL-2 변이체를 포함하는 융합단백질이 면역세포를 효과적으로 조절함을 확인하였다. 이를 기반으로, 상기 융합단백질이 항암제로 효과가 있다는 점을 확인하여 본 발명을 완성하였다.
상기 목적 달성을 위해, 본 발명의 일 측면은, LAG-3에 특이적으로 결합하는 항체 및 IL-2 단백질 또는 이의 변이체를 포함하는 융합단백질을 제공한다.
본 발명의 다른 측면은, 상기 융합단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터 및 상기 발현 벡터가 도입된 형질전환 세포를 제공한다.
본 발명의 또 다른 측면은, 상기 형질전환 세포를 배양하는 단계; 및 융합단백질을 회수하는 단계;를 포함하는 융합단백질을 제조 하는 방법을 제공한다.
본 발명의 또 다른 측면은, 상기 융합단백질 및 이의 약학적 용도를 제공한다.
본 발명에 따른 항-LAG-3 항체 및 IL-2 변이체를 포함하는 융합단백질은 LAG-3와 관련된 기작을 조절할 수 있을 뿐 아니라, IL-2와 동일 또는 유사한 기능을 할 수 있다. 즉, 상기 융합단백질은 LAG-3와 MHCII의 결합을 조절할 수 있을 뿐 아니라, 면역세포를 활성화시킬 수 있다. 따라서, 상기 융합단백질은 항암제로 활용이 가능하다.
도 1은 일 실시예인 항-hLAG-3 항체-hIgG4 Fc-hIL-2v2 융합단백질(GI-104E1)의 구조를 도식화한 것이다.
도 2는 일 실시예인 항-hLAG-3 항체-hIgG4 Fc-hIL-2v3 융합단백질(GI-104E2)의 구조를 도식화한 것이다.
도 3은 GI-104E1을 생산한 후 이를 SDS-PAGE로 확인한 그림이다.
도 4는 GI-104E2를 생산한 후 이를 SDS-PAGE로 확인한 그림이다.
도 5는 GI-104E1을 생산한 후 이를 웨스턴 블랏으로 확인한 그림이다.
도 6은 GI-104E2를 생산한 후 이를 웨스턴 블랏으로 확인한 그림이다.
도 7은 GI-104E1 또는 GI-104E2의 작용 기전 및 실험의 방법을 도식화한 것이다.
도 8은 LAG-3 blockade assay를 통해 GI-104E1이 LAG-3에 결합하여 LAG-3-MHCII 매개 신호전달을 억제하는지를 확인한 도면이다.
도 9는 LAG-3 blockade assay를 통해 GI-104E2가 LAG-3에 결합하여 LAG-3-MHCII 매개 신호전달을 억제하는지를 확인한 도면이다.
도 10은 CT26 암세포를 피하 이식한 마우스에 Vehicle(PBS), 항-LAG-3 항체, Fc-IL-2v2, 항-LAG-3 항체 및 Fc-IL-2v2의 병용투여, 및 항-LAG-3 및 IL-2v2를 포함하는 융합단백질(GI-104E1)을 각각 주 1회, 3주간 투여하며 관찰한 종양부피(tumor volume)를 나타내는 그래프이다.
도 11은 CT26 암세포를 피하 이식한 마우스에 Vehicle(PBS), 항-LAG-3 항체, Fc-IL-2v2, 항-LAG-3 항체 및 Fc-IL-2v2의 병용투여, 및 항-LAG-3 및 IL-2v2를 포함하는 융합단백질(GI-104E1)을 각각 투여한 후, 각 개체들의 종양부피를 나타내는 그래프이다.
도 12는 CT26 암세포를 피하 이식한 마우스에 Vehicle(PBS)을 투여한 군의 각 개체들의 종양부피를 나타내는 그래프이다.
도 13은 CT26 암세포를 피하 이식한 마우스에 항-LAG-3 항체를 투여한 군의 각 개체들의 종양부피를 나타내는 그래프이다.
도 14는 CT26 암세포를 피하 이식한 마우스에 Fc-IL-2v2를 투여한 군의 각 개체들의 종양부피를 나타내는 그래프이다.
도 15는 CT26 암세포를 피하 이식한 마우스에 항-LAG-3 항체 및 Fc-IL-2v2를 병용투여한 군의 각 개체들의 종양부피를 나타내는 그래프이다.
도 16은 CT26 암세포를 피하 이식한 마우스에 항-LAG-3 및 IL-2v2를 포함하는 융합단백질(GI-104E1)을 투여한 군의 각 개체들의 종양부피를 나타내는 그래프이다.
도 17은 CT26 암세포를 피하 이식한 마우스에 Vehicle(PBS), 항-LAG-3 항체, Fc-IL-2v2, 항-LAG-3 항체 및 Fc-IL-2v2의 병용투여, 및 항-LAG-3 및 IL-2v2를 포함하는 융합단백질(GI-104E1)을 각각 주 1회, 3주간 투여한 후, 첫 투여일로부터 32일 후, Vehicle을 투여한 군의 평균 종양부피 성장(mean tumor volume growth)을 기준으로 군당 개체들의 종양 성장 억제(tumor growth inhibition)가 30% 이상, 50% 이상, 80% 이상인 개체들의 수를 나타내는 그래프이다.
도 18은 CT26 암세포를 피하 이식한 마우스에 Vehicle(PBS), 항-LAG-3 항체, Fc-IL-2v2, 항-LAG-3 항체 및 Fc-IL-2v2의 병용투여, 및 항-LAG-3 및 IL-2v2를 포함하는 융합단백질(GI-104E1)을 각각 주 1회, 3주간 투여하며 관찰한 생존율을 나타내는 그래프이다.
도 19는 CT26 암세포를 피하 이식한 마우스에 Vehicle(PBS), 항-LAG-3 항체, Fc-IL-2v3, 항-LAG-3 항체 및 Fc-IL-2v3의 병용투여, 및 항-LAG-3 및 IL-2v3를 포함하는 융합단백질(GI-104E2)을 각각 주 1회, 3주간 투여하며 관찰한 종양부피를 나타내는 그래프이다.
도 20은 CT26 암세포를 피하 이식한 마우스에 Vehicle(PBS), 항-LAG-3 항체, Fc-IL-2v3, 항-LAG-3 항체 및 Fc-IL-2v3의 병용투여, 및 항-LAG-3 및 IL-2v3를 포함하는 융합단백질(GI-104E2)을 각각 투여 후, 투여군별 각 개체들의 종양부피를 나타내는 그래프이다.
도 21은 CT26 암세포를 피하 이식한 마우스에 Vehicle(PBS)를 투여한 군의 각 개체들의 종양부피를 나타내는 그래프이다.
도 22는 CT26 암세포를 피하 이식한 마우스에 항-LAG-3 항체를 투여한 군의 각 개체들의 종양부피를 나타내는 그래프이다.
도 23은 CT26 암세포를 피하 이식한 마우스에 Fc-IL-2v3를 투여한 군의 각 개체들의 종양부피를 나타내는 그래프이다.
도 24는 CT26 암세포를 피하 이식한 마우스에 항-LAG-3 항체 및 Fc-IL-2v3을 병용투여한 군의 각 개체들의 종양부피를 나타내는 그래프이다.
도 25는 CT26 암세포를 피하 이식한 마우스에 항-LAG-3 및 IL-2v3를 포함하는 융합단백질(GI-104E2)을 투여한 군의 각 개체들의 종양부피를 나타내는 그래프이다.
도 26은 CT26 암세포를 피하 이식한 마우스에 Vehicle(PBS), 항-LAG-3 항체, Fc-IL-2v3, 항-LAG-3 항체 및 Fc-IL-2v3의 병용투여, 및 항-LAG-3 및 IL-2v3를 포함하는 융합단백질(GI-104E2)을 각각 주 1회, 3주간 투여한 후, 첫 투여일로부터 32일 후, Vehicle을 투여한 군의 평균 종양부피 성장을 기준으로 군당 개체들의 종양 성장 억제가 30% 이상, 50% 이상, 80% 이상인 개체들의 수를 나타내는 그래프이다.
도 27은 CT26 암세포를 피하 이식한 마우스에 Vehicle(PBS), 항-LAG-3 항체, Fc-IL-2v3, 항-LAG-3 항체 및 Fc-IL-2v3의 병용투여, 및 항-LAG-3 및 IL-2v3를 포함하는 융합단백질(GI-104E2)을 각각 주 1회, 3주간 투여하며 관찰한 생존율을 나타내는 그래프이다.
항-LAG-3 항체 및 IL-2를 포함하는 융합단백질
본 발명의 일 측면은, LAG-3에 특이적으로 결합하는 항체 및 IL-2 단백질을 포함하는 융합단백질을 제공한다.
이때, 상기 항-LAG-3 항체에 IL-2 단백질은 적어도 하나가 결합된 형태일 수 있다. 일 구체예로, 상기 융합단백질은 IL-2 또는 이의 변이체를 한 개 또는 두 개 포함할 수 있다. 이때, 항-LAG-3 항체 및 IL-2는 링커를 통해 결합될 수 있다.
본 발명의 명세서에서 사용한 용어, "LAG-3"는 CD223 또는 림프구 활성화 유전자 3(Lymphocyte activation gene 3)으로 불린다. 상기 단백질은 LAG-3 유전자에 의해 코딩된다. LAG-3는 PD-1과 유사한 기전을 가진다고 알려져 있다. 또한, LAG-3는 T 세포 및 NK 세포에서 발현하는 면역관문억제제로 CD4와 구조가 비슷하지만 D1 도메인에 30개의 추가적인 아미노산을 가지고 있어 MHC class Ⅱ와 친화성이 높다. 이러한 구조적 특성 때문에 LAG-3도 T 세포 활성화를 억제시킨다고 알려져 있다.
본 발명에서 항-LAG-3 항체는 상기 LAG-3에 특이적으로 결합하는 항체일 수 있다. 또한, 항체의 단편은 LAG-3에 특이적으로 결합할 수 있는 항원결합도메인을 포함하는 한 어떠한 형태로도 이용될 수 있다. 이때, 항-LAG-3 항체의 중쇄가변영역의 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3는 각각 서열번호 1, 서열번호 2 및 서열번호 3의 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 이때, 항-LAG-3 항체의 경쇄가변영역의 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3는 각각 서열번호 5, 서열번호 6 및 서열번호 7의 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
일 실시예에서 상기 LAG-3에 특이적으로 결합하는 항체는 서열번호 4의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄가변영역 및 서열번호 8의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄가변영역을 포함할 수 있다.
본 명세서에서 사용하는 용어, "IL-2" 또는 "인터루킨-2"는 달리 언급되지 않는 한, 포유동물, 예를 들어, 영장류(예, 인간) 및 설치류(예, 마우스 및 래트)를 포함하여 임의의 척추동물 공급원으로부터 수득한 임의의 야생형 IL-2를 의미한다. 상기 IL-2는 동물 세포에서 수득된 것일 수도 있으나, IL-2를 생산할 수 있는 재조합 세포로부터 수득된 것도 포함한다. 또한, 상기 IL-2는 야생형 IL-2 또는 이의 변이체일 수 있다.
본 명세서에서는 IL-2 혹은 이의 변이체를 총칭하여 "IL-2 단백질" 혹은 "IL-2 폴리펩타이드"의 용어로 표현하기도 한다. IL-2, IL-2 단백질, IL-2 폴리펩타이드, 및 IL-2 변이체는 예를 들어 IL-2 수용체(receptor)에 특이적으로 결합한다. 이 특이적인 결합은 당업자에게 알려진 방법을 통해 확인할 수 있다.
상기 IL-2는 성숙된 형태일 수 있다. 구체적으로, 상기 성숙된 IL-2는 신호서열을 포함하지 않는 것일 수 있으며, 야생형 IL-2의 N-말단 또는 C-말단의 일부가 결실된(truncated) 단편을 포함할 수 있다. 이때, 상기 IL-2는 서열번호 22의 아미노산 서열을 가질 수 있다.
본 명세서에서 사용하는 용어, "IL-2 변이체"는 전장(full-length) IL-2 또는 IL-2의 단편의 아미노산 일부가 치환된 형태를 의미한다. 즉, IL-2 변이체는 야생형 IL-2 또는 이의 단편과 다른 아미노산 서열을 가질 수 있다. 그러나, 상기 IL-2 변이체는 야생형 IL-2와 동등하거나 유사한 활성을 가질 수 있다. 여기에서, "IL-2 활성"은 예를 들어 IL-2 수용체에 특이적으로 결합하는 것을 의미할 수 있으며, 이 특이적 결합은 당업자에게 알려진 방법을 통해 측정할 수 있다.
구체적으로, 상기 IL-2 변이체는 야생형 IL-2의 아미노산 일부가 치환된 것일 수 있다. 아미노산 치환에 의한 IL-2 변이체의 일 구체예로는 서열번호 22의 아미노산 서열에서 38번째, 42번째, 45번째, 61번째 및 72번째 아미노산 중 적어도 하나가 치환된 것일 수 있다.
구체적으로, 상기 IL-2 변이체는 서열번호 22의 아미노산 서열에서 38번째, 42번째, 45번째, 61번째 또는 72번째 아미노산 중 적어도 어느 하나가 다른 아미노산으로 치환된 것일 수 있다. 일 구체예에 따르면, IL-2 활성이 유지되는 한, 한 개, 두 개, 세 개의 아미노산이 치환될 수 있다.
일 구체예로 상기 IL-2 변이체는 두 군데의 아미노산이 치환된 형태일 수 있다. 구체적으로, 상기 IL-2 변이체는 서열번호 22의 아미노산 서열에서 38번째 및 42번째 아미노산이 치환된 것일 수 있다. 또한, 일 구체예로 상기 IL-2 변이체는 서열번호 22의 아미노산 서열에서 38번째 및 45번째 아미노산이 치환된 것일 수 있다. 또한, 일 구체예로 상기 IL-2 변이체는 서열번호 22의 아미노산 서열에서 38번째 및 61번째 아미노산이 치환된 것일 수 있다. 또한, 일 구체예로 상기 IL-2 변이체는 서열번호 22의 아미노산 서열에서 38번째 및 72번째 아미노산이 치환된 것일 수 있다. 또한, 일 구체예로 상기 IL-2 변이체는 서열번호 22의 아미노산 서열에서 42번째 및 45번째 아미노산이 치환된 것일 수 있다. 또한, 일 구체예로 상기 IL-2 변이체는 서열번호 22의 아미노산 서열에서 42번째 및 61번째 아미노산이 치환된 것일 수 있다. 또한, 일 구체예로 상기 IL-2 변이체는 서열번호 22의 아미노산 서열에서 42번째 및 72번째 아미노산이 치환된 것일 수 있다. 또한, 일 구체예로 상기 IL-2 변이체는 서열번호 22의 아미노산 서열에서 45번째 및 61번째 아미노산이 치환된 것일 수 있다. 또한, 일 구체예로 상기 IL-2 변이체는 서열번호 22의 아미노산 서열에서 45번째 및 72번째 아미노산이 치환된 것일 수 있다. 또한, 일 구체예로 상기 IL-2 변이체는 서열번호 22의 아미노산 서열에서 61번째 및 72번째 아미노산이 치환된 것일 수 있다.
나아가, 상기 IL-2 변이체는 세 군데의 아미노산이 치환된 형태일 수 있다. 구체적으로, 상기 IL-2 변이체는 서열번호 22의 아미노산 서열에서 38번째, 42번째 및 45번째 아미노산이 치환된 것일 수 있다. 또한, 일 구체예로 상기 IL-2 변이체는 서열번호 22의 아미노산 서열에서 38번째, 42번째 및 61번째 아미노산이 치환된 것일 수 있다. 또한, 일 구체예로 상기 IL-2 변이체는 서열번호 22의 아미노산 서열에서 38번째, 42번째 및 72번째 아미노산이 치환된 것일 수 있다. 또한, 일 구체예로 상기 IL-2 변이체는 서열번호 22의 아미노산 서열에서 38번째, 45번째 및 61번째 아미노산이 치환된 것일 수 있다. 또한, 일 구체예로 상기 IL-2 변이체는 서열번호 22의 아미노산 서열에서 38번째, 45번째 및 72번째 아미노산이 치환된 것일 수 있다. 또한, 일 구체예로 상기 IL-2 변이체는 서열번호 22의 아미노산 서열에서 38번째, 61번째 및 72번째 아미노산이 치환된 것일 수 있다. 또한, 일 구체예로 상기 IL-2 변이체는 서열번호 22의 아미노산 서열에서 42번째, 45번째 및 61번째 아미노산이 치환된 것일 수 있다. 또한, 일 구체예로 상기 IL-2 변이체는 서열번호 22의 아미노산 서열에서 42번째, 45번째 및 72번째 아미노산이 치환된 것일 수 있다. 또한, 일 구체예로 상기 IL-2 변이체는 서열번호 22의 아미노산 서열에서 45번째, 61번째 및 72번째 아미노산이 치환된 것일 수 있다.
이때, 상기 치환에 의해 도입되는 "다른 아미노산"은 알라닌(alanine), 아르기닌(arginine), 아스파라긴(Asparagine), 아스파르트산(aspartic acid), 시스테인(cysteine), 글루탐산(glutamic acid), 글루타민(glutamine), 히스티딘(histidine), 이소루신(isoleucine), 루신(leucine), 리신(lysine), 메티오닌(methionine), 페닐알라닌(phenyl alanine), 프롤린(proline), 세린(serine), 트레오닌(threonine), 트립토판(tryptophan), 티로신(tyrosine) 및 발린(valine)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나일 수 있다. 단, 상기 IL-2 변이체의 아미노산 치환에 있어서, 상기 서열번호 22의 아미노산 서열에서 38번째는 아르기닌으로 치환될 수 없으며, 42번째는 페닐알라닌으로 치환될 수 없고, 45번째는 티로신으로 치환될 수 없으며, 61번째는 글루탐산으로 치환될 수 없고, 72번째는 루신으로 치환될 수 없다.
상기 IL-2 변이체의 아미노산 치환에 있어서, 서열번호 22의 아미노산 서열에서 38번째 아미노산인 아르기닌은 아르기닌을 제외한 다른 아미노산으로 치환될 수 있다. 바람직하게는, 상기 IL-2 변이체의 아미노산 치환에 있어서, 서열번호 22의 아미노산 서열에서 38번째 아미노산인 아르기닌은 알라닌으로 치환(R38A)될 수 있다.
상기 IL-2 변이체의 아미노산 치환에 있어서, 서열번호 22의 아미노산 서열에서 42번째 아미노산인 페닐알라닌은 페닐알라닌을 제외한 다른 아미노산으로 치환될 수 있다. 바람직하게는, 상기 IL-2 변이체의 아미노산 치환에 있어서, 서열번호 22의 아미노산 서열에서 42번째 아미노산인 페닐알라닌은 알라닌으로 치환(F42A)될 수 있다.
상기 IL-2 변이체의 아미노산 치환에 있어서, 서열번호 22의 아미노산 서열에서 45번째 아미노산인 티로신은 티로신을 제외한 다른 아미노산으로 치환될 수 있다. 바람직하게는, 상기 IL-2 변이체의 아미노산 치환에 있어서, 서열번호 22의 아미노산 서열에서 45번째 아미노산인 티로신은 알라닌으로 치환(Y45A)될 수 있다.
상기 IL-2 변이체의 아미노산 치환에 있어서, 서열번호 22의 아미노산 서열에서 61번째 아미노산인 글루탐산은 글루탐산을 제외한 다른 아미노산으로 치환될 수 있다. 바람직하게는, 상기 IL-2 변이체의 아미노산 치환에 있어서, 서열번호 22의 아미노산 서열에서 61번째 아미노산인 글루탐산은 아르기닌으로 치환(E61R)될 수 있다.
상기 IL-2 변이체의 아미노산 치환에 있어서, 서열번호 22의 아미노산 서열에서 72번째 아미노산인 루신은 루신을 제외한 다른 아미노산으로 치환될 수 있다. 바람직하게는, 상기 IL-2 변이체의 아미노산 치환에 있어서, 서열번호 22의 아미노산 서열에서 72번째 아미노산인 루신은 글리신으로 치환(L72G)될 수 있다.
구체적으로, 상기 IL-2 변이체는 서열번호 22의 아미노산 서열에서 R38A, F42A, Y45A, E61R 및 L72G로 구성된 군으로부터 선택되는 적어도 어느 하나의 치환이 일어난 것일 수 있다. 바람직하게, 상기 IL-2 변이체는 R38A, F42A, Y45A, E61R 및 L72G로 구성된 군에서 선택되는 위치에서 두 군데 또는 세 군데의 위치에서 아미노산 치환이 일어날 수 있다.
상기 IL-2 변이체는 두 군데의 아미노산이 치환된 형태일 수 있다. 구체적으로, 상기 IL-2 변이체는 R38A 및 F42A로 치환이 일어난 것일 수 있다. 또한, 일 구체예로 상기 IL-2 변이체는 R38A 및 Y45A로 치환이 일어난 것일 수 있다. 또한, 일 구체예로 상기 IL-2 변이체는 R38A 및 E61R로 치환이 일어난 것일 수 있다. 또한, 일 구체예로 상기 IL-2 변이체는 R38A 및 L72G로 치환이 일어난 것 일 수 있다. 또한, 일 구체예로 상기 IL-2 변이체는 F42A 및 Y45A로 치환이 일어난 것일 수 있다. 또한, 일 구체예로 상기 IL-2 변이체는 F42A 및 E61R로 치환이 일어난 것일 수 있다. 또한, 일 구체예로 상기 IL-2 변이체는 F42A 및 L72G로 치환이 일어난 것일 수 있다. 또한, 일 구체예로 상기 IL-2 변이체는 E61R 및 L72G로 치환 이 일어난 것일 수 있다.
나아가, 상기 IL-2 변이체는 세 군데의 아미노산이 치환된 형태일 수 있다. 구체적으로, 상기 IL-2 변이체는 R38A, F42A 및 Y45A로 치환이 일어난 것일 수 있다. 또한, 일 구체예로 상기 IL-2 변이체는 R38A, F42A 및 E61R로 치환이 일어난 것일 수 있다. 또한, 일 구체예로 상기 IL-2 변이체는 R38A, F42A 및 L72G로 치환이 일어난 것일 수 있다. 또한, 일 구체예로 상기 IL-2 변이체는 R38A, Y45A 및 E61R로 치환이 일어난 것일 수 있다. 또한, 일 구체예로 상기 IL-2 변이체는 R38A, Y45A 및 L72G로 치환이 일어난 것일 수 있다. 또한, 일 구체예로 상기 IL-2 변이체는 F42A, Y45A 및 E61R로 치환이 일어난 것일 수 있다. 또한, 일 구체예로 상기 IL-2 변이체는 F42A, Y45A 및 L72G로 치환이 일어난 것일 수 있다. 또한, 일 구체예로 상기 IL-2 변이체는 F42A, E61R 및 L72G로 치환이 일어난 것일 수 있다. 또한, 일 구체예로 상기 IL-2 변이체는 Y45A, E61R 및 L72G로 치환이 일어난 것일 수 있다.
일 실시예에서, 상기 IL-2 변이체는 서열번호 20 또는 서열번호 21의 아미노산 서열을 가질 수 있다.
또한, 상기 IL-2 변이체는 생체 내에서 낮은 독성을 가지는 것을 특징으로 하는 것일 수 있다. 이때, 상기 생체 내에서 낮은 독성이란, IL-2가 IL-2 수용체의 알파 체인(IL-2Rα)과 결합하여 유발되는 부작용일 수 있다. 상기 IL-2와 IL-2Rα 결합에 의한 부작용을 개선시키기 위해서 다양한 IL-2 변이체가 개발되었으며, 이러한 IL-2 변이체는 미국특허 제5,229,109호 및 대한민국 등록특허공보 제10-1667096호에 개시된 것들을 사용할 수 있다. 특히, 본 출원에서 기술되는 IL-2의 변이체는 IL-2 수용체의 알파 체인(IL-2Rα)과 결합력이 낮아 생체내 독성이 야생형 IL-2에 비해 낮다.
상기 융합단백질은 면역글로불린 Fc 영역을 포함할 수 있다. 이때, 상기 면역글로불린의 Fc 도메인은 면역글로불린의 중쇄 불변 영역 2(CH2) 및 중쇄 불변 영역 3(CH3)을 포함한다. 상기 면역글로불린은 IgG, IgA, IgE, IgD 또는 IgM일 수 있으며, 바람직하게는 IgG4일 수 있다.
또한, 상기 면역글로불린의 Fc 도메인은 야생형 Fc 도메인뿐만 아니라, Fc 도메인 변이체일 수 있다. 또한, 본 명세서에서 사용하는 용어 "Fc 도메인 변이체"는 야생형 Fc 도메인의 당쇄 형태(glycosylation pattern)와 다르거나, 야생형 Fc 도메인에 비해 증가된 당쇄, 야생형 Fc 도메인에 비해 감소한 당쇄, 또는 당쇄가 제거(deglycosylated)된 형태일 수 있다. 또한, 무당쇄(aglycosylated) Fc 도메인도 포함된다. Fc 도메인 혹은 변이체는 배양조건 혹은 호스트의 유전자 조작을 통해 조정된 숫자의 시알산(sialic acid), 퓨코실화(fucosylation), 당화(glycosylation)를 갖도록 한 것일 수 있다.
또한, 화학적 방법, 효소적 방법 및 미생물을 사용한 유전공학적 엔지니어링 방법 등과 같이 통상적인 방법으로 면역글로불린의 Fc 도메인의 당쇄를 변형시킬 수 있다. 또한, 상기 Fc 도메인 변이체는 면역글로불린은 IgG, IgA, IgE, IgD 또는 IgM의 Fc 영역이 혼합된 형태일 수 있다. 또한, 상기 Fc 도메인 변이체는 상기 Fc 도메인의 일부 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된 형태일 수 있다.
일 실시예에서 상기 Fc 영역은 서열번호 14의 아미노산 서열을 가질 수 있다.
본 발명의 융합단백질은 항-LAG-3 항체의 경쇄 가변 영역 및 경쇄 불변 영역 1(CL1)을 포함하는 융합단백질과 항-LAG-3 항체의 중쇄 가변 영역, 중쇄 불변 영역 1(CH1), Fc 도메인 및 IL-2 단백질을 포함할 수 있다. 이때, 상기 IL-2 단백질은 항-LAG-3 항체에 적어도 1개가 포함될 수 있다. 일 구체예에서 상기 융합단백질은 IL-2 단백질을 2개 포함한다. 또한, 일 구체예에서 상기 IL-2 단백질은 항-LAG-3 항체의 C 말단에 결합된 형태일 수 있다.
구체적으로, 상기 Fc 도메인 및 IL-2 단백질을 포함하는 융합단백질은 하기 구조식 (1)의 융합단백질이 두 개 결합된 이량체일 수 있다:
N'-X-[링커(1)]o-Fc 영역 단편 또는 이의 변이체-[링커(2)]p-Y-C' (1)
이때, 상기 구조식 (1)에 있어서,
상기 N'은 융합단백질의 N-말단이고,
상기 C'는 융합단백질의 C-말단이며,
상기 X는 항-LAG-3 항체 또는 이의 단편이고,
상기 Y는 IL-2 단백질이며,
상기 링커(1) 및 링커(2)는 펩타이드 링커이고,
상기 o 및 p는 각각 독립적으로, O 또는 1이다.
이때, 항-LAG-3 항체 및 IL-2 단백질은 상술한 바와 같다. 또한, 상기 융합단백질에서 IL-2 또는 이의 변이체는 항-LAG-3 항체의 C-말단에 결합된 Fc 영역에 결합될 수 있다. 이때, 상기 IL-2 또는 이의 변이체와 Fc 영역은 링커를 통해 결합할 수 있다.
상기 펩타이드 링커(1)은 1 내지 50개의 연속된 아미노산, 또는 3 내지 30개의 연속된 아미노산, 또는 5 내지 15개의 아미노산으로 이루어질 수 있다. 일 구체예로 상기 펩타이드 링커(1)은 12개의 아미노산으로 이루어질 수 있다. 또한, 펩타이드 링커(1)은 적어도 하나의 시스테인을 포함할 수 있다. 구체적으로, 1개, 2개 또는 3개의 시스테인을 포함할 수 있다. 또한, 상기 펩타이드 링커(1)은 면역글로불린의 힌지에서 유래된 것일 수 있다. 일 구체예에서는, 상기 펩타이드 링커(1)이 서열번호 13의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드 링커일 수 있다.
상기 펩타이드 링커(2)는 1 내지 30개의 연속된 아미노산, 또는 2 내지 20개의 연속된 아미노산, 또는 2 내지 10개의 아미노산으로 이루어질 수 있다. 일 구체예로 상기 펩타이드 링커(2)는 (G4S)n(이때, n은 1 내지 10의 정수) 일 수 있다. 이때, (G4S)n에서 n은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10일 수 있다. 일 실시예로, 상기 펩타이드 링커는 서열번호 19의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드 링커일 수 있다.
또한, 상기 구조식 (1)의 융합단백질은 하기 구조식 (1-1) 및 구조식 (1-2)의 단백질을 포함할 수 있다:
N'-X'-[링커(1)]o-Fc 영역 단편 또는 이의 변이체-[링커(2)]p-Y-C' (1-1)
N'-X''-C' (1-2)
이때, 상기 구조식에 있어서,
상기 N'은 융합단백질의 N-말단이고,
상기 C'는 융합단백질의 C-말단이며,
상기 X'는 항-LAG-3 항체의 중쇄영역으로서, 중쇄가변영역 및 CH1을 포함하며,
상기 X''는 항-LAG-3 항체의 경쇄영역으로서, 경쇄가변영역 및 CL을 포함하며,
상기 Y는 IL-2 단백질이며,
상기 링커(1) 및 링커(2)는 펩타이드 링커이고,
상기 o 및 p는 각각 독립적으로, O 또는 1이다.
또한, 상기 중쇄가변영역 및 경쇄가변영역은 상술한 바와 같다.
상기 융합단백질을 구성하는 영역의 각각의 아미노산 서열은 하기 표 1 및 표 2에 나타내는 바와 같다. 구체적으로, 표 1은 항-hLAG-3(1E09)VL-kappa+CL에 대한 아미노산 서열을 기술한 것이다. 표 2는 항-hLAG-3(1E09)VH+CH1, hIgG4Fc 및 hIL-2v2/hIL-2v3의 아미노산 서열을 기술한 것이다.
구분 아미노산 서열 서열번호
항-hLAG-3(1E09)VL-kappa+CL DIQMTQSPSSLSPSVGDRVTITCQASQEISIYLNWYQQKPGKAPKLLIYDASNLETGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQTYITPYTFGQGTKLDIK RTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC 16
구분 아미노산 서열 서열번호
항-hLAG-3(1E09)VH+CH1 QVQLVQSGGDLVKPGGSLRLSCAASGFSFSDHYMNWIRQAPGKGLEWVAYIDTSATYIYYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDNWGSLDYWGQGALVTVSS ASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRV 12
제1링커 AESKYGPPCPPCP 13
F02(hIgG4Fc) APEAAGGPSVFLFPPKPKDQLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVLHEALHNHYTQKSLSLSLG 14
제2링커 GGGGS 19
hIL-2v2 APTSSSTKKTQLQLEHLLLDLQMILNGINNYKNPKLTAMLTAKFYMPKKATELKHLQCLEEELKPLEEVLNLAQSKNFHLRPRDLISNINVIVLELKGSETTFMCEYADETATIVEFLNRWITFCQSIISTLT 20
hIL-2v3 APTSSSTKKTQLQLEHLLLDLQMILNGINNYKNPKLTAMLTAKFYMPKKATELKHLQCLERELKPLEEVLNLAQSKNFHLRPRDLISNINVIVLELKGSETTFMCEYADETATIVEFLNRWITFCQSIISTLT 21
IL-2 APTSSSTKKTQLQLEHLLLDLQMILNGINNYKNPKLTRMLTFKFYMPKKATELKHLQCLEEELKPLEEVLNLAQSKNFHLRPRDLISNINVIVLELKGSETTFMCEYADETATIVEFLNRWITFCQSIISTLT 22
IgG4 Fc-linker-IL-2v2 AESKYGPPCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDQLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVLHEALHNHYTQKSLSLSLG
GGGGS
APTSSSTKKTQLQLEHLLLDLQMILNGINNYKNPKLTAMLTAKFYMPKKATELKHLQCLEEELKPLEEVLNLAQSKNFHLRPRDLISNINVIVLELKGSETTFMCEYADETATIVEFLNRWITFCQSIISTLT		 11
IgG4 Fc-linker-IL-2v3 AESKYGPPCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDQLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVLHEALHNHYTQKSLSLSLG
GGGGS
APTSSSTKKTQLQLEHLLLDLQMILNGINNYKNPKLTAMLTAKFYMPKKATELKHLQCLERELKPLEEVLNLAQSKNFHLRPRDLISNINVIVLELKGSETTFMCEYADETATIVEFLNRWITFCQSIISTLT		 24
융합단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드
본 발명의 또 다른 측면은, 상술한 융합단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다.
이때, 상기 폴리뉴클레오티드는 상술한 구조식 (1-1) 및 구조식 (1-2)의 융합단백질을 코딩하는 염기서열을 포함할 수 있다.
구체적으로, 상기 폴리뉴클레오티드 중 중쇄영역을 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 서열번호 17 또는 서열번호 23의 염기서열을 포함할 수 있다. 또한, 경쇄영역을 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 서열번호 18을 포함하는 것일 수 있다.
상기 폴리뉴클레오티드는 동일한 폴리펩타이드를 코딩한다면, 하나 이상의 염기가 치환, 결실, 삽입 또는 이들의 조합에 의해 변이될 수 있다. 폴리뉴클레오티드 서열을 화학적으로 합성하여 제조하는 경우, 당업계에 널리 공지된 합성법, 예를 들어 문헌(Engels and Uhlmann, Angew Chem IntEd Engl.,37:73-127, 1988)에 기술된 방법을 이용할 수 있으며, 트리에스테르, 포스파이트, 포스포르아미다이트 및 H-포스페이트 방법, PCR 및 기타 오토프라이머 방법, 고체 지지체상의 올리고뉴클레오티드 합성법 등을 들 수 있다.
일 구체예에 따르면, 상기 폴리펩타이드는 서열번호 17, 서열번호 18 또는 23의 염기서열과 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 86%, 적어도 약 87%, 적어도 약 88%, 적어도 약 89%, 적어도 약 90%, 적어도 약 91%, 적어도 약 92%, 적어도 약 93%, 적어도 약 94%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99%, 또는 적어도 약 100%의 동일성을 가지는 핵산 서열을 포함할 수 있다.
상기 폴리뉴클레오티드는 신호서열(signal sequence) 또는 리더 서열(leader sequence)을 코딩하는 핵산을 추가적으로 포함할 수 있다. 여기에서 사용된 용어 "신호서열"은 목적 단백질의 분비를 지시하는 신호펩타이드를 의미한다. 상기 신호펩타이드는 숙주 세포에서 번역된 후에 절단된다. 구체적으로, 상기 신호서열은 ER(endoplasmic reticulum) 막을 관통하는 단백질의 이동을 개시하는 아미노산 서열이다.
신호서열은 당업계에 그 특징이 잘 알려져 있으며, 통상 16 내지 30개의 아미노산 잔기를 포함하나, 그보다 더 많거나 적은 아미노산 잔기를 포함할 수 있다. 통상적인 신호 펩타이드는 기본 N-말단 영역, 중심의 소수성 영역, 및 보다 극성인(polar) C-말단 영역의 세 영역으로 구성된다. 중심 소수성 영역은 미성숙 폴리펩타이드가 이동하는 동안 막지질 이중층을 통하여 신호서열을 고정시키는 4 내지 12개의 소수성 잔기를 포함한다.
개시 이후에, 신호서열은 흔히 신호 펩티다아제(signal peptidases)로 알려진 세포 효소에 의하여 ER의 루멘(lumen) 내에서 절단된다. 이때, 상기 신호서열은 tPa(tissue Plasminogen Activation), HSV gDs(signal sequence of Herpes simplex virus glycoprotein D), IgG 신호서열 또는 성장 호르몬(growth hormone)의 분비신호서열일 수 있다. 바람직하게, 포유동물 등을 포함하는 고등 진핵 세포에서 사용되는 분비 신호서열을 사용할 수 있다. 또한, 상기 신호서열은 야생형 IL-2에 포함된 신호서열을 사용하거나, 숙주세포에서 발현 빈도가 높은 코돈으로 치환하여 사용할 수 있다. 일 구체예로 14.18 항체의 경쇄 신호서열(Gillies et al., J. Immunol. Meth 1989. 125:191-202), MOPC141 항체의 중쇄 신호서열(Sakano et al., Nature, 1980. 286: 676-683) 및 당업계에 알려진 다른 신호서열(예, Watson et al., Nucleic Acid Research, 1984. 12:5145-5164를 참조)을 포함할 수 있다.
융합단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드가 적재된 벡터
본 발명의 또 다른 측면은, 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 제공한다.
이때, 중쇄영역을 코딩하는 폴리뉴클레오티드와 경쇄영역을 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 서로 다른 벡터에 적재될 수 있다. 또는 중쇄영역을 코딩하는 폴리뉴클레오티드와 경쇄영역을 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 하나의 벡터에 적재될 수 있다
상기 폴리뉴클레오티드는 전술한 바와 같다. 이때, 폴리뉴클레오티드의 중쇄영역은 서열번호 17 또는 23의 염기서열을 포함하며, 경쇄영역은 서열번호 18을 포함하는 것일 수 있다. 일 구체예로 서열번호 17 및 서열번호 18을 포함할 수 있다. 일 구체예로 서열번호 23 및 서열번호 18을 포함할 수 있다. 이때, 벡터는 상기 중쇄 및 경쇄의 폴리뉴클레오티드 조합을 각각 포함하는 2개의 벡터, 또는 상기 조합의 폴리뉴클레오티드를 모두 포함하는 바이시스트로닉 벡터일 수 있다.
상기 벡터는 숙주 세포에 도입되어 숙주 세포 유전체 내로 재조합 및 삽입될 수 있다. 또는 상기 벡터는 에피좀으로서 자발적으로 복제될 수 있는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 수단으로 이해된다. 이때, 벡터는 숙주세포에서 상기 폴리뉴클레오티드가 발현될 수 있도록 적절한 프로모터에 작동가능하도록 연결된 것일 수 있으며, 선형 핵산, 플라스미드, 파지미드, 코스미드, RNA 벡터, 바이러스 벡터, 미니-염색체 및 이의 유사체들을 포함한다. 바이러스 벡터의 예로는 레트로바이러스, 아데노바이러스 및 아데노-관련 바이러스를 포함하나 이에 제한되지 않는다.
구체적으로, 상기 벡터는 플라스미드 DNA, 파아지 DNA 등이 될 수 있고, 상업적으로 개발된 플라스미드(pUC18, pBAD, pIDTSAMRT-AMP 등), 대장균 유래 플라스미드(pYG601BR322, pBR325, pUC118, pUC119 등), 바실러스 서브틸리스 유래 플라스미드(pUB110, pTP5 등), 효모-유래 플라스미드(YEp13, YEp24, YCp50 등), 파아지 DNA(Charon4A, Charon21A, EMBL3, EMBL4, λgt10, λgt11, λZAP 등), 동물 바이러스 벡터(레트로바이러스(retrovirus), 아데노바이러스(adenovirus), 백시니아 바이러스(vaccinia virus) 등), 곤충 바이러스 벡터(배큘로바이러스(baculovirus) 등) 등이 될 수 있다. 상기 벡터는 숙주 세포에 따라서 단백질의 발현량과 수식 등이 다르게 나타나므로, 목적에 가장 적합한 숙주세포를 선택하여 사용함이 바람직하다.
본 명세서에서 사용하는 용어, 목적 단백질의 "유전자 발현" 또는 "발현"은 DNA 서열의 전사, mRNA 전사체의 번역 및 융합단백질 생산물 또는 이의 단편의 분비를 의미하는 것으로 이해된다. 유용한 발현 벡터는 RcCMV(Invitrogen, Carlsbad) 또는 이의 변이체일 수 있다. 상기 발현 벡터는 포유류 세포에서 목적 유전자의 연속적인 전사를 촉진하기 위한 인간 CMV(cytomegalovirus) 프로모터 및 전사 후 RNA의 안정상태 수준을 높이기 위한 우태 성장 인자(bovine growth hormone) 폴리 아데닐레이션 신호서열을 포함할 수 있다.
융합단백질을 발현하는 형질전환된 세포
본 발명의 또 다른 측면은, 상기 벡터가 도입된 형질전환 세포를 제공한다.
상기 형질전환 세포의 숙주세포로서, 원핵세포, 진핵세포, 포유동물, 식물, 곤충, 균류 또는 세포성 기원의 세포를 포함할 수 있지만 이에 한정되지 않는다. 상기 원핵세포의 일 예로는 대장균을 사용할 수 있다. 또한, 진핵세포의 일 예로는 효모를 사용할 수 있다. 또한, 상기 포유동물 세포로 CHO 세포, F2N 세포, COS 세포, BHK 세포, 바우스(Bowes) 흑색종 세포, HeLa 세포, 911 세포, AT1080 세포, A549 세포, SP2/0 세포, 인간 림프아구(human lymphoblastoid), NSO 세포, HT-1080 세포, PERC.6 세포, HEK 293 세포 또는 HEK293T 세포 등을 사용할 수 있으나, 이에 한정되지 않으며, 당업자에게 알려진 포유동물 숙주 세포로 사용 가능한 세포는 모두 이용 가능하다.
또한, 숙주세포로 발현벡터를 도입하는 경우, CaCl2 침전법, CaCl2 침전법에 DMSO(dimethyl sulfoxide)라는 환원물질을 사용함으로써 효율을 높인 Hanahan 방법, 전기천공법(electroporation), 인산칼슘 침전법, 원형질 융합법, 실리콘 카바이드 섬유를 이용한 교반법, 아그로박테리아 매개된 형질전환법, PEG를 이용한 형질전환법, 덱스트란 설페이트, 리포펙타민 및 건조/억제 매개된 형질전환 방법 등 이 사용될 수 있다. 또한, 감염(infection)을 수단으로 하여 바이러스 입자를 사용하여 목적물을 세포 내로 전달시킬 수 있다. 또한, 유전자 밤바드먼트 등에 의해 벡터를 숙주세포 내로 도입할 수 있다.
전술한 바와 같이, 융합단백질의 치료제로서의 특성을 최적화하거나 기타 다른 목적을 위해, 호스트 세포가 갖고 있는 당화(glycosylation) 관련 유전자를 당업자에게 알려져 있는 방법을 통해 조작하여 융합단백질의 당쇄 패턴(예를 들어, 시알 산, 퓨코실화, 당화)을 조정할 수 있다.
융합단백질의 제조 방법
본 발명의 또 다른 측면은, 상기 형질전환 세포를 배양하는 단계; 상기 배양액으로부터 상술한 융합단백질을 수득하는 단계를 포함하는 항-LAG-3 항체 및 IL-2 또는 이의 변이체를 포함하는 융합단백질을 제조하는 방법을 제공한다.
본 명세서에서 사용하는 용어, "배양"이란, 미생물을 인공적으로 적당히 조절한 환경조건에서 생육시키는 방법을 의미한다.
상기 형질전환 세포를 배양하는 방법은 당업계에 널리 알려져 있는 방법을 이용하여 수행할 수 있다. 구체적으로, 상기 배양은 본 발명의 융합단백질을 발현시켜서 생산할 수 있는 한 특별히 이에 제한되지 않는다. 구체적으로, 상기 배양은 배치 공정 또는 주입 배치 또는 반복 주입 배치 공정(fed batch or repeated fed batch process)에서 연속식으로 배양할 수 있다.
또한, 배양물로부터 상기 융합단백질을 회수하는 단계는 당업계에 공지된 방법에 의해 수행될 수 있다. 구체적으로, 상기 회수 방법은 생산된 본 발명의 융합단백질을 회수할 수 있는 한, 특별히 이에 제한되지 않는다. 바람직하게는, 상기 회수 방법은 원심분리, 여과, 추출, 분무, 건조, 증발, 침전, 결정화, 전기영동, 분별용해(예를 들면 암모늄설페이트 침전), 크로마토그래피(예를 들면 이온 교환, 친화성, 소수성 및 크기배제) 등의 방법일 수 있다.
융합단백질의 용도
본 발명의 또 다른 측면으로, 상기 융합단백질을 포함하는 암 치료 또는 예방용 약학 조성물을 제공한다.
본 명세서에서 사용하는 용어, "암"은 정상인 조직세포가 어떤 원인으로 무제한 증식하여 그 생체의 생활현상이나 주위의 조직상태 등에 관계없이 급속한 발육을 계속하는 질환으로 구분되며, 본 발명에서의 암은 인체의 각종 암, 예컨대 위암, 간암, 폐암, 대장암, 유방암, 전립선암, 난소암, 췌장암, 자궁경부암, 갑상선암, 후두암, 급성 골수성 백혈병, 뇌종양, 신경모세포종, 망막 모세포종, 두경부암, 침샘암 및 림프종으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나의 암일 수 있으나, 상기 종류에 한정되지는 않는다. 또한, 본 발명의 목적상 방사선에 저항성을 가지는 암일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 용어 "예방"은 상기 약학적 조성물의 투여에 의해 암의 발생을 억제하거나 그의 발병을 지연시키는 모든 행위를 말한다. 상기 용어 "치료"는 상기 약학적 조성물의 투여에 의해 암의 증세가 호전되거나 이롭게 변경하는 모든 행위를 말한다.
상기 본 발명의 약학적 조성물은 약학적으로 허용가능한 담체를 추가로 포함할 수 있다. 상기 약학적으로 허용 가능한 담체는 환자에게 전달하기에 적절한 비-독성 물질이면 어떠한 담체라도 가능하다. 증류수, 알코올, 지방, 왁스 및 비활성 고체가 담체로 포함될 수 있다. 약물학적으로 허용되는 애쥬번트(완충제, 분산제) 또한 약학적 조성물에 포함될 수 있다.
구체적으로, 상기 약학적 조성물은 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하여 당업계에 공지된 통상의 방법으로 투여 경로에 따라 비경구용 제형으로 제조될 수 있다. 여기서 "약제학적으로 허용되는" 의미는 유효성분의 활성을 억제하지 않으면서 적용(처방) 대상이 적응 가능한 이상의 독성을 지니지 않는다는 의미이다.
상기 약학적 조성물이 비경구용 제형으로 제조될 경우, 적합한 담체와 함께 당업계에 공지된 방법에 따라 주사제, 경피 투여제, 비강 흡입제 및 좌제의 형태로 제제화될 수 있다. 주사제로 제제화할 경우 적합한 담체로서는 멸균수, 에탄올, 글리세롤이나 프로필렌 글리콜 등의 폴리올 또는 이들의 혼합물을 사용할 수 있으며, 바람직하게는 링거 용액, 트리에탄올 아민이 함유된 PBS(phosphate buffered saline)나 주사용 멸균수, 5% 덱스트로스 같은 등장 용액 등을 사용할 수 있다. 약제학적 조성물의 제제화와 관련하여서는 당업계에 공지되어 있으며, 구체적으로 문헌[Remington's Pharmaceutical Sciences(19th ed., 1995)] 등을 참조할 수 있다. 상기 문헌은 본 명세서의 일부로서 간주된다.
한편, 본 발명의 약학적 조성물은 약학적으로 유효한 양으로 투여한다. 본 명세서에서 사용하는 용어 "투여"란, 적절한 방법으로 개체에게 소정의 물질을 도입하는 것을 의미하며, 상기 조성물의 투여 경로는 목적 조직에 도달할 수 있는 한 어떠한 일반적인 경로를 통하여 투여될 수 있다. 복강내 투여, 정맥내 투여, 근육내 투여, 피하 투여, 피내 투여, 국소 투여, 비내 투여, 직장내 투여될 수 있으나, 이에 한정되지는 않는다.
상기 용어 "개체"란 인간을 포함한 쥐, 생쥐, 가축 등의 모든 동물을 의미한다. 바람직하게는, 인간을 포함한 포유동물일 수 있다.
상기 용어 "약학적으로 유효한 양"이란 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분하며 부작용을 일으키지 않을 정도의 양을 의미하며, 유효 용량 수준은 환자의 성별, 연령, 체중, 건강상태, 질병의 종류, 중증도, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 방법, 투여 시간, 투여 경로, 및 배출 비율, 치료 기간, 배합 또는 동시에 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다. 1일 0.01 ㎍/㎏ 내지 10 g/㎏ 범위, 또는 0.01 ㎎/㎏ 내지 1 g/㎏ 범위로 투여할 수 있다. 투여는 1일 1회 또는 수회로 나누어 이루어질 수 있다. 이러한 투여량은 어떠한 측면으로든 본 발명의 범위를 제한하는 것으로 해석되어서는 아니 된다.
본 발명의 또 다른 측면은, 암을 치료하거나 예방하기 위한 상기 융합단백질의 암 치료 또는 예방용 용도를 제공한다. 여기서 융합단백질, 암, 치료 및 예방은 전술한 바와 같다.
본 발명의 또 다른 측면은, 상기 융합단백질을 개체에 투여하는 단계를 포함하는 암 치료 또는 예방하는 방법을 제공한다. 여기서 융합단백질, 투여, 암, 치료 및 예방은 전술한 바와 같다. 상기 개체는 포유동물일 수 있으며, 바람직하게는 인간일 수 있다. 또한, 상기 개체는 암을 앓는 환자이거나 암을 앓을 가능성이 큰 개체일 수 있다.
상기 융합단백질의 투여경로, 투여량 및 투여횟수는 환자의 상태 및 바작용의 유무에 따라 다양한 방법 및 양으로 대상에게 투여될 수 있고, 최적의 투여방법, 투여량 및 투여횟수는 통상의 기술자가 적절한 범위로 선택할 수 있다. 또한, 상기 융합단백질은 치료하고자 하는 질환에 대하여 치료효과가 공지된 다른 약물 또는 생가학적 활성물질과 병용하여 투여되거나, 다른 약물과의 조합 제제 형태로 제형화될 수 있다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
I. 융합단백질의 제조
제조예 1. 항-hLAG-3 항체-hIgG4 Fc-hIL-2v2 융합단백질의 제조: GI-104E1
항-hLAG-3 항체 및 hIL-2v2를 포함하는 융합단백질을 생산하기 위하여, 항-hLAG-3VL(항-hLAG-3(1E09)VL-kappa+CL)을 N-말단으로부터 이 순서대로 포함하는 융합단백질(서열번호 16)을 코딩하는 염기서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드(서열번호 18)와 항-hLAG-3VH(항-hLAG-3(1E09)VH+CH1), Fc 도메인(F02(hIgG4Fc)), 링커(G4S linker) 및 인간 IL-2v2를 N-말단으로부터 이 순서대로 포함하는 융합단백질(서열번호 27)을 코딩하는 염기서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드(서열번호 17)를 GenScript사의 Expression and Optimization 서비스를 통해 pcDNA3.4 벡터(Invitrogen)에 적재하였다. 상기 벡터를 CHO 세포(HD CHO-S)에 도입한 후 37℃, CO2 8%, serum-free HD CHO-STM expression Medium에서 14일간 배양하였다. 배양액을 수거하여 MabSelect SuReTMLX가 포함된 친화크로마토그래피(Affinity purification column)를 이용하여 융합단백질을 정제하였다.
분리 정제된 융합단백질을 reduced(R) 또는 non-reduced(NR) 조건하에서 SDS-PAGE 및 western blot을 실행하였고 HPLC 분석을 통하여 분자량 및 순도를 확인하였다(도 3 및 도 5). Bradford assay를 통하여 농도를 측정하였으며 0.69 mg/㎖ 농도의 융합단백질이 포함된 것을 확인하였다.
제조예 2. 대조항체의 제조(항-hLAG-3 항체, α-LAG-3)
대조군인 항-hLAG-3 항체를 생산하기 위하여, 항-hLAG-3VL(항-hLAG-3(1E09)VL-kappa+CL)을 N-말단으로부터 이 순서대로 포함하는 융합단백질(서열번호 16)을 코딩하는 염기서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드(서열번호 18)와 항-hLAG-3VH(항-hLAG-3(1E09)VH+CH1) 및 Fc 도메인(F02(hIgG4Fc))을 N-말단으로부터 이 순서대로 포함하는 융합단백질(서열번호 15)을 코딩하는 염기서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드(서열번호 29)를 GenScript사의 Expression and Optimization 서비스를 통해 pcDNA3.4 벡터(Invitrogen)에 적재하였다. 상기 벡터를 CHO 세포(HD CHO-S)에 도입한 후 37℃, CO2 8%, serum-free HD CHO-STM expression Medium에서 14일간 배양하였다. 배양액을 수거하여 MabSelect SuReTMLX가 포함된 친화크로마토그래피(Affinity purification column)를 이용하여 융합단백질을 정제하였다.
제조예 3. hIgG4 Fc-hIL-2v2의 제조: Fc-IL-2v2
Fc 도메인 및 IL-2 변이체를 포함하는 융합단백질 이량체를 생산하기 위하여, Fc 도메인(서열번호 14), 링커(서열번호 19) 및 두 개의 아미노산이 치환된 IL-2 변이체(2M)(R38A, F42A)(서열번호 20)를 포함하는 융합단백질(서열번호 11)을 코딩하는 염기서열을 N-말단으로부터 이 순서대로 포함하는 폴리뉴클레오티드(서열번호 25)를 ThermoFisher Scientific사의 Invitrogen GeneArt Gene Synthesis 서비스를 통해 폴리뉴클레오티드를 합성하여 pcDNA3.4 벡터(Invitrogen)에 적재하였다. 또한, 상기 벡터를 CHO 세포(Expi-CHOTM)에 도입하여 서열번호 11의 융합단백질을 발현시켰다. 벡터를 도입한 후 37℃, 125 rpm, CO2 8%의 농도인 환경에서 7일 배양 후 배양액을 수거하여 융합단백질 이량체를 정제하였다.
제조예 4. hIgG4 Fc-hIL-2v3의 제조: Fc-IL-2v3
Fc 도메인 및 IL-2 변이체를 포함하는 융합단백질을 생산하기 위하여, Fc 도메인(서열번호 14), 링커(서열번호 19) 및 세 개의 아미노산이 치환된 IL-2 변이체(3M)(R38A, F42A, E61R)(서열번호 21)를 포함하는 융합단백질(서열번호 24)을 코딩하는 염기서열을 N-말단으로부터 이 순서대로 포함하는 폴리뉴클레오티드(서열번호 26)를 ThermoFisher Scientific사의 Invitrogen GeneArt Gene Synthesis 서비스를 통해 폴리뉴클레오티드를 합성하여 pcDNA3.4 벡터(Invitrogen)에 적재하였다. 또한, 상기 벡터를 CHO 세포(Expi-CHOTM)에 도입하여 서열번호 24의 융합단백질을 발현시켰다. 벡터를 도입한 후 37℃, 125 rpm, CO2 8%의 농도인 환경에서 7일 배양 후 배양액을 수거하여 융합단백질을 정제하였다.
제조예 5. 항-hLAG-3 항체-hIgG4 Fc-hIL-2v3 융합단백질 제조: GI-104E2
항-LAG-3 항체 및 hIL-2v3을 포함하는 융합단백질을 생산하기 위하여, 항-hLAG-3VL(항-hLAG-3(1E09)VL-kappa+CL)을 N-말단으로부터 이 순서대로 포함하는 융합단백질(서열번호 16)을 코딩하는 염기서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드(서열번호 18)와 항-hLAG-3VH(항-hLAG-3(1E09)VH+CH1), Fc 도메인(F02(hIgG4Fc)), 링커(G4S linker) 및 인간 IL-2v3을 N-말단으로부터 이 순서대로 포함하는 융합단백질(서열번호 28)을 코딩하는 염기서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드(서열번호 23)를 GenScript사의 Expression and Optimization 서비스를 통해 pcDNA3.4 벡터(Invitrogen)에 적재하였다. 상기 벡터를 CHO 세포(HD CHO-S)에 도입한 후 37℃, CO2 8%, serum-free HD CHO-STM expression Medium에서 14일간 배양하였다. 배양액을 수거하여 MabSelect SuReTMLX가 포함된 친화크로마토그래피(Affinity purification column)를 이용하여 융합단백질을 정제하였다.
분리 정제된 융합단백질을 reduced(R) 또는 non-reduced(NR) 조건하에서 SDS-PAGE 및 western blot을 실행하였고 HPLC 분석을 통하여 분자량 및 순도를 확인하였다(도 4 및 도 6). Bradford assay를 통하여 농도를 측정하였으며 0.51 mg/㎖ 농도의 융합단백질이 포함된 것을 확인하였다.
II. 융합단백질의 면역 활성 효과 확인
실험예 1. LAG-3 blockade assay를 통한 융합단백질의 T 세포 활성화 기능 확인
실험예 1.1. GI-104E1이 T 세포의 기능에 미치는 영향 확인
LAG-3는 T 세포 및 NK 세포에서 발현하는 면역관문억제제로 CD4와 구조가 유사하지만 D1 도메인에 30개의 추가적인 아미노산을 가지고 있어 MHC class II와 친화성이 높다. 이러한 구조적 특성 때문에 LAG-3는 T 세포 활성화를 억제시킨다고 알려져 있다.
본 실험에서는 융합단백질에 대한 T 세포 활성화 기능을 LAG-3 blockade bioassay system(Promega, JA1115)을 이용하여 확인하고자 하였다. 구체적으로, 액체질소에 보관 중인 MHCII APC 세포 1 vial을 37℃ 항온수조에서 2분 동안 녹인 후 TCR activating antigen이 들어있는 cell recovery medium(90% DMEM + 10% FBS) 14.5 ㎖에 넣고 잘 혼합해 주었다. MHCII APC 현탁액을 96-웰 white cell culture plate(Corning cat no. 3917)의 각 웰당 100 ㎕씩 넣고 37℃, 5% CO2 배양기에서 24시간 배양하였다.
24시간 배양한 MHCII APC 세포가 들어있는 96-웰 white culture plate을 꺼내어 plate 안의 배양액을 제거하였다. 이후, 다양한 농도로 양성대조군인 1E09(Relatlimab surrogates)과 GI-104E1을 웰당 40 ㎕씩 처리하였으며, 음성 대조군의 경우는 에세이 버퍼 40 ㎕를 넣었다. 이후 LAG-3 effector 세포가 준비되기 전까지 커버를 씌운 후 상온에 보관하였다.
액체질소에 보관 중인 LAG-3 effector 세포 1 vial을 37℃ 항온수조에서 2분 동안 녹인 후 7 ㎖의 에세이 버퍼(90% RPMI + 10% FBS)에 넣고 잘 혼합해 주었다. 혼합한 현탁액을 상온에 보관 중인 96-웰 white cell culture plate에 40 ㎕씩 넣고 37℃, 5% CO2 배양기에서 5시간 반응시켰다. 반응이 끝난 후 상온에 10분간 반응시킨 후 거품이 생기지 않게 주의하며 Bio-Glo reagent를 80 ㎕씩 넣었다. 백그라운드 신호를 보정하기 위하여 가장자리 바깥 웰 중 2군데에 Bio-Glo reagent를 넣은 후 5-10분간 상온에서 반응시켰다. 이후 GIoMax® Discover System(Promega, USA)을 이용하여 luminescence를 측정하였다.
그 결과, GI-104E1이 effector T 세포에서 발현하는 LAG-3와 결합하여 LAG-3의 기능을 억제시킴으로써 T 세포 기능을 활성화시킬 수 있음을 확인하였다(도 8).
실험예 1.2. GI-104E2가 T 세포의 기능에 미치는 영향 확인
상기 실험예 1.1과 동일한 방법으로 GI-104E2에 대하여 LAG-3 blockade assay를 수행한 결과, GI-104E2가 effector T 세포에서 발현하는 LAG-3와 결합하여 LAG-3의 기능을 억제시킴으로써 T 세포 기능을 활성화시킬 수 있음을 확인하였다(도 9).
실험예 2. 융합단백질의 항암효과 확인
실험예 2.1. 마우스 유래 대장암세포 식립 마우스에서의 GI-104E1의 항암효과 확인
오리엔트 바이오에서 분양 받은 BALB/c 마우스(암컷, 7주)를 7일의 적응기간을 거친 후에, CT26 암세포주(ATCC, U.S.A.) 5x106 세포를 1 ㎖ PBS에 희석하여 개체 당 100 ㎕씩 마우스의 우측 등 부위의 피하에 투여하여 동종이식하였다. 암세포를 이식하고 일정기간 경과 후에 종양의 부피를 측정하여 약 50 mm3 내지 120 mm3에 도달한 개체들을 선별한 후, 선별한 마우스의 종양의 크기 및 체중을 기초로 하여 균등하도록 각 군당 8마리씩 분류하였다. 그 다음, 표 3과 같이 시험군을 구성하고 시험물질을 복강으로 투여하였다. 첫 투여 이후 일주일에 한 번씩 총 3회 투여하였다. 이식된 종양 크기는 모두 주 2회, 4주간 종양부피를 측정하였다.
그룹 Drug 투여용량
(mg/kg)		 투여용량
(mL/kg)		 투여경로 투여횟수 N수
G1 Vehicle(PBS) - 5 복강 주 1회, 3주간 8
G2 항-LAG-3 항체 2.5 5 복강 주 1회, 3주간 8
G3 Fc-IL-2v2 1.4 5 복강 주 1회, 3주간 8
G4 항-LAG-3 항체 + Fc-IL-2v2 2.5+1.4 5 복강 주 1회, 3주간 8
G5 GI-104E1 3 5 복강 주 1회, 3주간 8
측정 결과는 각 군의 평균(mean) 및 표준편차(SD) 값을 이용하여 그래프로 나타내었다. 또한, 이중분산분석(Two-way analysis of variance)과 Dunnett T3 test를 사용하여, Vehicle에 대비하여 나타나는 종양부피 저하의 통계적 유의성(#p≤0.05, ####p≤0.0001) 및 GI-104E1 투여군에 대비하여 나타나는 tumor volume 차이의 통계적 유의성(*p≤0.05, **p≤0.01, ***p≤0.001, ****p≤0.0001)을 분석하였다.
그 결과, CT26 암세포주 식립 마우스에서 음성대조군에 비해 3 mg/kg 용량의 GI-104E1을 투여한 군이 중간관찰시점 및 실험종료시점에서 유의미하게 종양의 성장을 억제하였다(#p≤0.05, ####p≤0.0001, Two-way analysis of variance(ANOVA)). 또한, GI-104E1과 상등하는 몰(mole)수의 항-LAG-3 항체 투여 및 Fc-IL-2v2 투여와 비교시에도 GI-104E1 투여가 유의미하게 종양의 성장을 억제하였다. 특히, 항-LAG-3 항체 및 Fc-IL-2v2를 병용투여한 실험군에 비해서도 중간관찰시점과 실험종료시점에서 GI-104E1이 유의미한 종양 억제 효과를 나타냈다(*p≤0.05, **p≤0.01, ***p≤0.001, ****p≤0.0001, Two-way analysis of variance(ANOVA))(도 10 내지 도 16).
시험종료시점에 종양 성장률 변화를 관찰하였을 때, 50% 이상의 종양 성장률의 감소를 보이는 경우가 음성대조군에서 1 개체, 항-LAG-3 항체를 투여한 군에서 1개체, Fc-IL-2v2에서 0 개체, 및 항-LAG-3 항체와 Fc-IL-2v2를 병용투여한 군에서 0 개체였다. 그에 비해 GI-104E1을 투여한 실험군의 경우, 7 개체에서 50% 이상의 종양 성장률 감소를 보였으며, 80% 이상의 종양 성장률의 감소를 보인 개체가 5 인 것을 확인하였다(도 17).
또한, GI-104E1을 투여한 실험군과 다른 실험대조군 및 음성대조군을 투여한 실험군의 생존율을 실험개체의 폐사 또는 종양부피의 2,000 mm3를 개체의 발생을 기준으로 분석하였고, 실험군 간의 생존율 차이의 통계적 유의성은 Mantel-Cox test로 분석하였다. 그 결과, GI-104E1을 투여한 실험군에서 다른 실험대조군 및 음성대조군을 투여한 실험군보다 높은 생존율을 나타냄을 확인하였고 이러한 실험군간의 생존율 차이는 통계적으로 유의하였다(****p≤0.0001)(도 18).
실험예 2.2. 마우스 유래 대장암세포 식립 마우스에서의 GI-104E2의 항암효과 확인
오리엔트 바이오에서 분양 받은 BALB/c 마우스(암컷, 7주)를 7일의 적응기간을 거친 후에 CT26 암세포주(ATCC, U.S.A.) 5x106 세포를 1 ㎖ PBS에 희석하여 개체 당 100 ㎕씩 마우스의 우측 등 부위의 피하에 투여하여 동종이식하였다. 암세포를 이식하고 일정기간 경과 후에 종양의 부피를 측정하여 약 50 mm3 내지 120 mm3에 도달한 개체들을 선별한 후, 선별한 마우스의 종양의 크기 및 체중을 기초로 하여 균등하도록 각 군당 3마리씩 분류하였다. 그 다음, 표 4와 같이 시험군을 구성하고 시험물질을 복강으로 투여하였다. 첫 투여 이후 일주일에 한 번씩 총 3회 투여하였다. 이식된 종양 크기는 모두 주 2회, 4주간 종양부피를 측정하였다.
그룹 Drug 투여용량
(mg/kg)		 투여용량
(mL/kg)		 투여경로 투여횟수 N수
G1 Vehicle(PBS) - 5 복강 주 1회, 3주간 3
G2 항-LAG-3 항체 5 5 복강 주 1회, 3주간 3
G3 Fc-IL-2v3 2.8 5 복강 주 1회, 3주간 3
G4 항-LAG-3 항체 + Fc-IL-2v3 5 + 2.8 5 복강 주 1회, 3주간 3
G5 GI-104E2 6 5 복강 주 1회, 3주간 3
그 결과, CT26 암세포주 식립 마우스에서 음성대조군에 비해 6 mg/kg 용량의 GI-104E2를 투여한 군이 중간관찰시점 및 실험종료시점에서 종양의 성장을 억제하였다. 또한 같은 6 mg/kg의 GI-104E2와 상등하는 몰(mole)수의 항-LAG-3 항체 투여 및 Fc-IL-2v3 투여와 비교시에도 GI-104E2 투여군에서 우수한 종양 성장 억제 효과가 나타났다. 특히, 항-LAG-3 항체 및 Fc-IL-2v3를 병용투여한 실험군에 비해서도 중간관찰시점과 실험종료시점에서 GI-104E2가 우수한 종양 억제 효과를 나타냈다(도 19 내지 도 25).
또한, 시험종료시점에 종양 성장률 변화를 관찰하였을 때, 50% 이상의 종양 성장률의 감소를 보이는 경우가 음성대조군에서 1 개체, 항-LAG-3 항체를 투여한 군에서 0개체, Fc-IL-2v3에서 1 개체, 및 항-LAG-3 항체와 Fc-IL-2v3를 병용투여한 군에서 1 개체였다. 그에 비해 GI-104E2를 투여한 실험군의 경우 모든 개체에서 50% 이상의 종양 성장률 감소가 나타났으며, 80% 이상의 종양 성장률 감소가 나타난 개체도 1 인 것을 확인하였다(도 26).
GI-104E2를 투여한 실험군과 다른 실험대조군 및 음성대조군을 투여한 실험군의 생존율을 실험개체의 폐사 또는 종양부피의 2,000 mm3를 개체의 발생을 기준으로 분석하였다. 그 결과, GI-104E2를 투여한 실험군에서 다른 실험대조군 및 음성대조군을 투여한 실험군보다 높은 생존율을 나타냄을 확인하였다(도 27).
<110> GI Innovation, Inc. <120> FUSION PROTEIN COMPRISING ANTI-LAG-3 ANTIBODY AND IL-2 AND USE THEREOF <130> SPD21-054-GII <150> KR 10-2020-0079978 <151> 2020-06-30 <160> 29 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VH-CDR1 of anti-hLAG3 (1E09) <400> 1 Gly Phe Ser Phe Ser Asp His Tyr 1 5 <210> 2 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VH-CDR2 of anti-hLAG3 (1E09) <400> 2 Ile Asp Thr Ser Ala Thr Tyr Ile 1 5 <210> 3 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VH-CDR3 of anti-hLAG3 (1E09) <400> 3 Ala Arg Asp Asn Trp Gly Ser Leu Asp Tyr 1 5 10 <210> 4 <211> 117 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Variable heavy chain of anti-hLAG3 (1E09) <400> 4 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Asp Leu Val Lys Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ser Phe Ser Asp His 20 25 30 Tyr Met Asn Trp Ile Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Tyr Ile Asp Thr Ser Ala Thr Tyr Ile Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Asp Asn Trp Gly Ser Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Ala Leu 100 105 110 Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 5 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VL-CDR1 of anti-hLAG3 (1E09) <400> 5 Gln Glu Ile Ser Ile Tyr 1 5 <210> 6 <211> 3 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VL-CDR2 of anti-hLAG3 (1E09) <400> 6 Asp Ala Ser 1 <210> 7 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VL-CDR3 of anti-hLAG3 (1E09) <400> 7 Gln Gln Thr Tyr Ile Thr Pro Tyr Thr 1 5 <210> 8 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Variable light chain of anti-hLAG3 (1E09) <400> 8 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Pro Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Gln Ala Ser Gln Glu Ile Ser Ile Tyr 20 25 30 Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 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attacctgcc aggccagcca agagatctcc atctacctga actggtatca gcagaagccc 120 ggcaaggccc ctaagctgct gatctacgac gcctccaatc tggaaacagg cgtgccctcc 180 agattctccg gctctggctc tggcacagac tttaccctga ccatctccag cctccagcct 240 gaggatttcg ccacctacta ctgccagcag acctacatca ccccttacac ctttggccag 300 ggcaccaagc tggacatcaa g 321 <210> 11 <211> 367 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Fc-hIL-2v2 <400> 11 Ala Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu 1 5 10 15 Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp 20 25 30 Gln Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp 35 40 45 Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly 50 55 60 Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn 65 70 75 80 Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp 85 90 95 Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro 100 105 110 Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu 115 120 125 Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn 130 135 140 Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile 145 150 155 160 Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr 165 170 175 Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg 180 185 190 Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys 195 200 205 Ser Val Leu His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu 210 215 220 Ser Leu Ser Leu Gly Gly Gly Gly Gly Ser Ala Pro Thr Ser Ser Ser 225 230 235 240 Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His Leu Leu Leu Asp Leu Gln 245 250 255 Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys Asn Pro Lys Leu Thr Ala 260 265 270 Met Leu Thr Ala Lys Phe Tyr Met Pro Lys Lys Ala Thr Glu Leu Lys 275 280 285 His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys Pro Leu Glu Glu Val Leu 290 295 300 Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu Arg Pro Arg Asp Leu Ile 305 310 315 320 Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu Lys Gly Ser Glu Thr Thr 325 330 335 Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala Thr Ile Val Glu Phe Leu 340 345 350 Asn Arg Trp Ile Thr Phe Cys Gln Ser Ile Ile Ser Thr Leu Thr 355 360 365 <210> 12 <211> 215 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> anti-hLAG3(1E09)VH+CH1 <400> 12 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Asp Leu Val Lys Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ser Phe Ser Asp His 20 25 30 Tyr Met Asn Trp Ile Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Tyr Ile Asp Thr Ser Ala Thr Tyr Ile Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Asp Asn Trp Gly Ser Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Ala Leu 100 105 110 Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu 115 120 125 Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys 130 135 140 Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser 145 150 155 160 Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser 165 170 175 Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser 180 185 190 Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn 195 200 205 Thr Lys Val Asp Lys Arg Val 210 215 <210> 13 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> linker 1 <400> 13 Ala Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro 1 5 10 <210> 14 <211> 216 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> hIgG4Fc <400> 14 Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys 1 5 10 15 Pro Lys Asp Gln Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val 20 25 30 Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr 35 40 45 Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu 50 55 60 Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His 65 70 75 80 Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys 85 90 95 Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln 100 105 110 Pro Arg 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Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Asp Asn Trp Gly Ser Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Ala Leu 100 105 110 Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu 115 120 125 Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys 130 135 140 Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser 145 150 155 160 Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser 165 170 175 Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser 180 185 190 Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn 195 200 205 Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro 210 215 220 Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe 225 230 235 240 Pro Pro Lys Pro Lys Asp Gln Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val 245 250 255 Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe 260 265 270 Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro 275 280 285 Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr 290 295 300 Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val 305 310 315 320 Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala 325 330 335 Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln 340 345 350 Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly 355 360 365 Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro 370 375 380 Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser 385 390 395 400 Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu 405 410 415 Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Leu His Glu Ala Leu His Asn His 420 425 430 Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly 435 440 <210> 16 <211> 214 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> anti-hLAG3(1E09)VL-kappa+ CL <400> 16 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Pro Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Gln Ala Ser Gln Glu Ile Ser Ile Tyr 20 25 30 Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Asp Ala Ser Asn Leu Glu Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Thr Tyr Ile Thr Pro Tyr 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Asp Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala 100 105 110 Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly 115 120 125 Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala 130 135 140 Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln 145 150 155 160 Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser 165 170 175 Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr 180 185 190 Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser 195 200 205 Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 <210> 17 <211> 1746 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> polynucleotides coding anti-hLAG3HC(1E09, hIgG4Fc)_hIL2v2 <400> 17 caggttcagt tggttcagtc tggcggcgac ctggttaagc 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900 gtgtccgtgc tgaccgtgct gcaccaggat tggctgaacg gcaaagagta caagtgcaag 960 gtgtccaaca agggcctgcc ttccagcatc gaaaagacca tctccaaggc caagggccag 1020 cctagggaac cccaggttta caccctgcct ccaagccaag aggaaatgac caagaaccag 1080 gtgtccctga cctgcctggt caagggcttc tacccttccg acattgccgt ggaatgggag 1140 agcaatggcc agcctgagaa caactacaag accacacctc ctgtgctgga ctccgacggc 1200 tccttctttc tgtactcccg cctgaccgtg gacaagtcca gatggcaaga gggcaacgtg 1260 ttctcctgct ctgtgctgca cgaggccctg cacaatcact acacccagaa gtccctcagc 1320 ctgtcccttg gcggaggcgg tggatccgct cctacctcct ccagcaccaa gaaaacccag 1380 ttgcagctgg aacatctgct gctggacctc cagatgatcc tgaacggcat caacaactac 1440 aagaacccca agctgaccgc catgctgacc gctaagttct acatgcccaa gaaggccacc 1500 gagcttaagc acctccagtg cctggaagag gaacttaagc ccctggaaga agtgctgaat 1560 ctggcccagt ccaagaactt ccacctgagg cctcgggacc tgatctccaa catcaacgtg 1620 atcgtgctgg aactcaaggg ctccgagaca accttcatgt gcgagtacgc cgacgagaca 1680 gctaccatcg tggaatttct gaatcggtgg atcaccttct gccagtccat catcagcacc 1740 ctgacc 1746 <210> 18 <211> 642 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> polynucleotides coding anti-hLAG3(1E09) light chain <400> 18 gacattcaga tgacccagtc tccatcctct ctgagcccat ccgtgggcga cagagtgacc 60 attacctgcc aggccagcca agagatctcc atctacctga actggtatca gcagaagccc 120 ggcaaggccc ctaagctgct gatctacgac gcctccaatc tggaaacagg cgtgccctcc 180 agattctccg gctctggctc tggcacagac tttaccctga ccatctccag cctccagcct 240 gaggatttcg ccacctacta ctgccagcag acctacatca ccccttacac ctttggccag 300 ggcaccaagc tggacatcaa gagaaccgtg gccgctcctt ccgtgttcat cttcccacct 360 tccgacgagc agcttaagtc tggcacagcc tctgtcgtgt gcctgctgaa caacttctac 420 cctcgggaag ccaaggtgca gtggaaggtg gacaatgccc tccagtccgg caactcccaa 480 gagtctgtga ccgagcagga ctccaaggac agcacctaca gcctgtcctc cacactgacc 540 ctgtccaagg ccgactacga gaagcacaag gtgtacgcct gcgaagtgac ccaccaggga 600 ctgtctagcc ctgtgaccaa gtctttcaac cggggcgagt gc 642 <210> 19 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> linker 2 <400> 19 Gly Gly Gly Gly Ser 1 5 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Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Cys Gln Ser Ile 115 120 125 Ile Ser Thr Leu Thr 130 <210> 23 <211> 1746 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> polynucleotides coding anti-hLAG3HC(1E09, hIgG4Fc)_hIL2v3 <400> 23 caggttcagt tggttcagtc tggcggcgac ctggttaagc ctggcggatc tctgagactg 60 tcttgtgccg cctccggctt ctccttctcc gaccactaca tgaactggat cagacaggcc 120 cctggcaaag gcctggaatg ggtcgcctac atcgatacct ccgccaccta catctactac 180 gccgactccg tgaagggcag attcaccatc tccagagaca acgccaagaa ctccctgtac 240 ctccagatga acagcctgag agccgaggac accgccgtgt actactgcgc cagagataac 300 tggggctccc tggattattg gggccagggc gctctggtca cagtgtcctc tgcttctacc 360 aagggaccca gcgtgttccc tctggctcct tgctccagat ccacctccga gtctacagct 420 gctctgggct gcctggtcaa ggactacttt cctgagcctg tgaccgtgtc ctggaactct 480 ggcgctctga catctggcgt gcacaccttt ccagctgtgc tccagtcctc cggcctgtac 540 tctctgtcct ctgtcgtgac cgtgccttcc tctagcctgg gcaccaagac ctacacctgt 600 aatgtggacc acaagccttc caacaccaag gtggacaagc gcgtggccga gtctaagtat 660 ggccctcctt gtcctccatg tcctgctcca gaagctgctg gcgggccctc cgtgtttctg 720 ttccctccaa agcctaagga ccagctgatg atctctcgga cacccgaagt gacctgcgtg 780 gtggtggatg tgtctcaaga ggaccctgag gtgcagttca attggtacgt ggacggcgtg 840 gaagtgcaca acgccaagac caagcctaga gaggaacagt tcaactccac ctacagagtg 900 gtgtccgtgc tgaccgtgct gcaccaggat tggctgaacg gcaaagagta caagtgcaag 960 gtgtccaaca agggcctgcc ttccagcatc gaaaagacca tctccaaggc caagggccag 1020 cctagggaac cccaggttta caccctgcct ccaagccaag aggaaatgac caagaaccag 1080 gtgtccctga cctgcctggt caagggcttc tacccttccg acattgccgt ggaatgggag 1140 agcaatggcc agcctgagaa caactacaag accacacctc ctgtgctgga ctccgacggc 1200 tccttctttc tgtactcccg cctgaccgtg gacaagtcca gatggcaaga gggcaacgtg 1260 ttctcctgct ctgtgctgca cgaggccctg cacaatcact acacccagaa gtccctcagc 1320 ctgtcccttg gcggaggcgg tggatccgct cctacctcct ccagcaccaa gaaaacccag 1380 ttgcagctgg aacatctgct gctggacctc cagatgatcc tgaacggcat caacaactac 1440 aagaacccca agctgaccgc catgctgacc gctaagttct acatgcccaa gaaggccacc 1500 gagcttaagc acctccagtg cctggaacgt gaacttaagc ccctggaaga agtgctgaat 1560 ctggcccagt ccaagaactt ccacctgagg cctcgggacc tgatctccaa catcaacgtg 1620 atcgtgctgg aactcaaggg ctccgagaca accttcatgt gcgagtacgc cgacgagaca 1680 gctaccatcg tggaatttct gaatcggtgg atcaccttct gccagtccat catcagcacc 1740 ctgacc 1746 <210> 24 <211> 367 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Fc-hIL-2v3 <400> 24 Ala Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu 1 5 10 15 Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp 20 25 30 Gln Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp 35 40 45 Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly 50 55 60 Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn 65 70 75 80 Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp 85 90 95 Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro 100 105 110 Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu 115 120 125 Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn 130 135 140 Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile 145 150 155 160 Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr 165 170 175 Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg 180 185 190 Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys 195 200 205 Ser Val Leu His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu 210 215 220 Ser Leu Ser Leu Gly Gly Gly Gly Gly Ser Ala Pro Thr Ser Ser Ser 225 230 235 240 Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His Leu Leu Leu Asp Leu Gln 245 250 255 Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys Asn Pro Lys Leu Thr Ala 260 265 270 Met Leu Thr Ala Lys Phe Tyr Met Pro Lys Lys Ala Thr Glu Leu Lys 275 280 285 His Leu Gln Cys Leu Glu Arg Glu Leu Lys Pro Leu Glu Glu Val Leu 290 295 300 Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu Arg Pro Arg Asp Leu Ile 305 310 315 320 Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu Lys Gly Ser Glu Thr Thr 325 330 335 Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala Thr Ile Val Glu Phe Leu 340 345 350 Asn Arg Trp Ile Thr Phe Cys Gln Ser Ile Ile Ser Thr Leu Thr 355 360 365 <210> 25 <211> 1101 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> polynucleotides coding GI-101C2(hIgG4Fc-hIL2v2) <400> 25 gccgagtcta agtatggccc tccttgtcct ccatgtcctg ctccagaagc tgctggcggc 60 ccttccgtgt ttctgttccc tccaaagcct aaggaccagc tgatgatctc tcggacccct 120 gaagtgacct gcgtggtggt ggatgtgtcc caagaggacc ctgaggtgca gttcaattgg 180 tacgtggacg gcgtggaagt gcacaacgcc aagaccaagc ctagagagga acagttcaac 240 tccacctaca gagtggtgtc cgtgctgacc gtgctgcacc aggattggct gaacggcaaa 300 gagtacaagt gcaaggtgtc caacaagggc ctgccttcca gcatcgaaaa gaccatctcc 360 aaggccaagg gccagcctag ggaaccccag gtttacaccc tgcctccaag ccaagaggaa 420 atgaccaaga accaggtgtc cctgacctgc ctggtcaagg gcttctaccc ttccgacatt 480 gccgtggaat gggagagcaa tggccagcct gagaacaact acaagaccac acctcctgtg 540 ctggactccg acggctcctt ctttctgtac tcccgcctga ccgtggacaa gtccagatgg 600 caagagggca acgtgttctc ctgctctgtg ctgcacgagg ccctgcacaa tcactacacc 660 cagaagtccc tgtctctgtc ccttggcgga ggcggaggat ccgcccctac cagctcctct 720 accaagaaaa cccagctcca gttggagcat ctgctgctgg acctccagat gattctgaac 780 gggatcaaca actataagaa ccccaagctg accgccatgc tgaccgctaa gttctacatg 840 cccaagaagg ccaccgagct gaagcacctc cagtgcctgg aagaagaact gaagcccctg 900 gaagaggtgc tgaatctggc ccagtccaag aacttccacc tgaggccacg ggacctgatc 960 agcaacatca acgtgatcgt gctggaactg aagggctccg agacaacctt tatgtgcgag 1020 tacgccgacg agacagccac catcgtggaa tttctgaacc ggtggatcac cttctgccag 1080 agcatcatct ccacactgac c 1101 <210> 26 <211> 1101 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> polynucleotides coding GI-101C3(hIgG4Fc-hIL2v3) <400> 26 gccgagtcta agtatggccc tccttgtcct ccatgtcctg ctccagaagc tgctggcggc 60 ccttccgtgt ttctgttccc tccaaagcct aaggaccagc tgatgatctc tcggacccct 120 gaagtgacct gcgtggtggt ggatgtgtcc caagaggacc ctgaggtgca gttcaattgg 180 tacgtggacg gcgtggaagt gcacaacgcc aagaccaagc ctagagagga acagttcaac 240 tccacctaca gagtggtgtc cgtgctgacc gtgctgcacc aggattggct gaacggcaaa 300 gagtacaagt gcaaggtgtc caacaagggc ctgccttcca gcatcgaaaa gaccatctcc 360 aaggccaagg gccagcctag ggaaccccag gtttacaccc tgcctccaag ccaagaggaa 420 atgaccaaga accaggtgtc cctgacctgc ctggtcaagg gcttctaccc ttccgacatt 480 gccgtggaat gggagagcaa tggccagcct gagaacaact acaagaccac acctcctgtg 540 ctggactccg acggctcctt ctttctgtac tcccgcctga ccgtggacaa gtccagatgg 600 caagagggca acgtgttctc ctgctctgtg ctgcacgagg ccctgcacaa tcactacacc 660 cagaagtccc tgtctctgtc ccttggcgga ggcggaggat ccgctcctac ctccagctcc 720 accaagaaaa cccagttgca gctggaacat ctgctgctgg acctccagat gatcctgaat 780 ggcatcaaca attacaagaa ccccaagctg accgccatgc tgaccgctaa gttctacatg 840 cccaagaagg ccaccgagct gaagcacctc cagtgcctgg aacgggaact gaagcctctg 900 gaagaggtgc tgaatctggc ccagtccaag aacttccacc tgaggcctcg ggacctgatc 960 tccaacatca acgtgatcgt gctggaactc aagggctccg agacaacctt catgtgcgag 1020 tacgccgacg agacagctac catcgtggaa tttctgaatc ggtggatcac cttctgccag 1080 tccatcatca gcaccctgac c 1101 <210> 27 <211> 582 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Anti-hLAG3HC(1E09, hIgG4Fc)_hIL2v2 <400> 27 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Asp Leu Val Lys Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ser Phe Ser Asp His 20 25 30 Tyr Met Asn Trp Ile Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Tyr Ile Asp Thr Ser Ala Thr Tyr Ile Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Asp Asn Trp Gly Ser Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Ala Leu 100 105 110 Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu 115 120 125 Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys 130 135 140 Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser 145 150 155 160 Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser 165 170 175 Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser 180 185 190 Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn 195 200 205 Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Ala Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys 210 215 220 Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu 225 230 235 240 Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Gln Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu 245 250 255 Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln 260 265 270 Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys 275 280 285 Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu 290 295 300 Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys 305 310 315 320 Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys 325 330 335 Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser 340 345 350 Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys 355 360 365 Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln 370 375 380 Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly 385 390 395 400 Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln 405 410 415 Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Leu His Glu Ala Leu His Asn 420 425 430 His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Gly Gly Gly Gly 435 440 445 Ser Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu 450 455 460 His Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr 465 470 475 480 Lys Asn Pro Lys Leu Thr Ala Met Leu Thr Ala Lys Phe Tyr Met Pro 485 490 495 Lys Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu 500 505 510 Lys Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His 515 520 525 Leu Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu 530 535 540 Leu Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr 545 550 555 560 Ala Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Cys Gln Ser 565 570 575 Ile Ile Ser Thr Leu Thr 580 <210> 28 <211> 582 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Anti-hLAG3HC(1E09, hIgG4Fc)_hIL2v3 <400> 28 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Asp Leu Val Lys Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ser Phe Ser Asp His 20 25 30 Tyr Met Asn Trp Ile Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Tyr Ile Asp Thr Ser Ala Thr Tyr Ile Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Asp Asn Trp Gly Ser Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Ala Leu 100 105 110 Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu 115 120 125 Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys 130 135 140 Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser 145 150 155 160 Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser 165 170 175 Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser 180 185 190 Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn 195 200 205 Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Ala Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys 210 215 220 Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu 225 230 235 240 Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Gln Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu 245 250 255 Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln 260 265 270 Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys 275 280 285 Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu 290 295 300 Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys 305 310 315 320 Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys 325 330 335 Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser 340 345 350 Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys 355 360 365 Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln 370 375 380 Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly 385 390 395 400 Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln 405 410 415 Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Leu His Glu Ala 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cctccggctt ctccttctcc gaccactaca tgaactggat cagacaggcc 120 cctggcaaag gcctggaatg ggtcgcctac atcgatacct ccgccaccta catctactac 180 gccgactccg tgaagggcag attcaccatc tccagagaca acgccaagaa ctccctgtac 240 ctccagatga acagcctgag agccgaggac accgccgtgt actactgcgc cagagataac 300 tggggctccc tggattattg gggccagggc gctctggtca cagtgtcctc tgcttctacc 360 aagggaccca gcgtgttccc tctggctcct tgctccagat ccacctccga gtctacagct 420 gctctgggct gcctggtcaa ggactacttt cctgagcctg tgaccgtgtc ctggaactct 480 ggcgctctga catctggcgt gcacaccttt ccagctgtgc tccagtcctc cggcctgtac 540 tctctgtcct ctgtcgtgac cgtgccttcc tctagcctgg gcaccaagac ctacacctgt 600 aatgtggacc acaagccttc caacaccaag gtggacaagc gcgtggagtc taagtatggc 660 cctccttgtc ctccatgtcc tgctccagaa gctgctggcg ggccctccgt gtttctgttc 720 cctccaaagc ctaaggacca gctgatgatc tctcggacac ccgaagtgac ctgcgtggtg 780 gtggatgtgt ctcaagagga ccctgaggtg cagttcaatt ggtacgtgga cggcgtggaa 840 gtgcacaacg ccaagaccaa gcctagagag gaacagttca actccaccta cagagtggtg 900 tccgtgctga ccgtgctgca ccaggattgg ctgaacggca aagagtacaa gtgcaaggtg 960 tccaacaagg gcctgccttc cagcatcgaa aagaccatct ccaaggccaa gggccagcct 1020 agggaacccc aggtttacac cctgcctcca agccaagagg aaatgaccaa gaaccaggtg 1080 tccctgacct gcctggtcaa gggcttctac ccttccgaca ttgccgtgga atgggagagc 1140 aatggccagc ctgagaacaa ctacaagacc acacctcctg tgctggactc cgacggctcc 1200 ttctttctgt actcccgcct gaccgtggac aagtccagat ggcaagaggg caacgtgttc 1260 tcctgctctg tgctgcacga ggccctgcac aatcactaca cccagaagtc cctcagcctg 1320 tcccttggc 1329

Claims (15)

  1. LAG-3에 특이적으로 결합하는 항체 및 IL-2 단백질을 포함하는 융합단백질.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 LAG-3에 특이적으로 결합하는 항체는
    서열번호 1의 HCDR1, 서열번호 2의 HCDR2, 및 서열번호 3의 HCDR3을 포함하는 중쇄가변영역; 및
    서열번호 5의 LCDR1, 서열번호 6의 LCDR2, 및 서열번호 7의 LCDR3을 포함하는 경쇄가변영역을 포함하는 것인, 융합단백질.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 LAG-3에 특이적으로 결합하는 항체는 서열번호 4의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄가변영역 및 서열번호 8의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄가변영역을 포함하는 것인, 융합단백질.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 융합단백질은 2개의 IL-2 단백질을 포함하는 것인, 융합단백질.
  5. 제1항에 있어서,
    상기 IL-2 단백질은 IL-2 변이체인 것인, 융합단백질.
  6. 제5항에 있어서,
    상기 IL-2 변이체는 R38A, F42A, Y45A, E61R, L72G 및 이의 조합으로 구성된 군에서 선택되는 위치에서 아미노산 치환이 일어난 것인, 융합단백질.
  7. 제5항에 있어서,
    상기 IL-2 변이체는 서열번호 20 또는 서열번호 21의 아미노산 서열을 가지는 것인, 융합단백질.
  8. 제1항에 있어서,
    상기 LAG-3에 특이적으로 결합하는 항체 및 IL-2 단백질은 링커에 의해 결합된 것인, 융합단백질.
  9. 제8항에 있어서,
    상기 링커는 펩타이드 링커인, 융합단백질.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항의 융합단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드.
  11. 제10항의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터.
  12. 제11항의 벡터가 도입된 형질전환 세포주.
  13. 제12항의 형질전환 세포주를 배양하는 단계; 및
    배양액으로부터 융합단백질을 회수하는 단계;를 포함하는 융합단백질을 제조하는 방법.
  14. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항의 융합단백질을 포함하는 암 치료 또는 예방용 약학 조성물.
  15. 제14항에 있어서,
    상기 암은 위암, 간암, 폐암, 대장암, 유방암, 전립선암, 난소암, 췌장암, 자궁경부암, 갑상선암, 후두암, 급성 골수성 백혈병, 뇌종양, 신경모세포종, 망막 모세포종, 두경부암, 침샘암 및 림프종으로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나인, 약학 조성물.
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