KR102559355B1 - 항-taa 항체, 항-pd-l1 항체 및 il-2를 포함하는 융합단백질 및 이의 용도 - Google Patents

항-taa 항체, 항-pd-l1 항체 및 il-2를 포함하는 융합단백질 및 이의 용도 Download PDF

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Abstract

본 발명은 항-TAA 항체, 항-PD-L1 항체 및 IL-2를 포함하는 융합단백질 및 이의 용도에 관한 것이다. 보다 구체적으로는, 본 발명은 항-CEA 항체, 항-PD-L1 항체 및 IL-2를 포함하는 융합단백질 및 이의 용도에 관한 것이다. 본 발명의 융합단백질은 종양 관련 항원인 CEA와 면역 관문인 PD-L1과의 결합력이 우수하고, CEA 및/또는 PD-L1를 발현하는 종양세포와 특이적으로 결합할 수 있다. 또한, 본 발명의 융합단백질은 T세포 및 NK세포의 증식을 유도하고, 면역세포를 활성화시킬 수 있으며, 암 유발 마우스에 투여할 경우 우수한 항암효과를 나타낼 수 있다. 따라서, 본 발명의 융합단백질은 암 질환을 치료하는데 유용하게 사용될 수 있다.

Description

항-TAA 항체, 항-PD-L1 항체 및 IL-2를 포함하는 융합단백질 및 이의 용도{FUSION PROTEIN COMPRISING ANTI-TUMOR-ASSOCIATED ANTIGEN ANTIBODY, ANTI-PD-L1 ANTIBODY AND IL-2 AND USES THEREOF}
본 발명은 항-TAA 항체, 항-PD-L1 항체 및 IL-2를 포함하는 융합단백질 및 이의 용도에 관한 것이다. 보다 구체적으로는, 본 발명은 항-CEA 항체, 항-PD-L1 항체 및 IL-2를 포함하는 융합단백질 및 이의 용도에 관한 것이다.
항암치료제 시장은 전체 의약품 시장에서 가장 비중을 차지하고 있으며, 성장 가능성(CACR)도 11.6%로 가장 높아서 2020년에는 153조원 규모로 확대될 것으로 예상되고 있다. 그 중 면역항암제는 체내 면역시스템을 자극하여 면역시스템이 암세포를 공격하는 기작을 가지며, 최근 들어 항암제 분야에서 2세대 표적항암제보다 전이암에서도 효과가 크고 지속적이라고 알려져 있다.
이와 관련하여, 종양 특이적인 항원을 발현하는 종양세포는 발생 초기 단계에서는 개체의 면역시스템에 의해 제거될 수 있다. 그러나, 활발하게 증식하는 종양 세포들은 면역 감지 시스템(immune surveillance)을 회피하기 위해, PD-L1과 같은 면역관문(immune checkpoint) 단백질을 발현하게 된다. 이러한 면역관문 단백질은 항암 면역감시체계를 방해하여 종양 세포의 면역 반응을 회피하는 기전으로 알려져 있다.
면역관문 단백질 중에는 T세포에 발현되는 PD-1과 암세포에 발현되는 PD-L1이 결합하여 T세포의 기능을 억제하는 메커니즘이 알려져 있다. 이러한 PD-1과 PD-L1의 결합을 저해하는 기전으로 출시된 면역관문 억제제로는 펨브롤리주맙(Keytruda, pembrolizumab, anti-PD-1: Merck), 니볼루맙(Opdivo, nivolumab, anti-PD-1: BMS), 아테졸리주맙(Tecentriq, atezolizumab, anti-PD-L1: Roche) 등이 있다. PD-1과 PD-L1에 대한 면역관문 억제제에 앞서 세계 최초로 FDA 승인을 받은 면역관문 억제제인 이필리무맙(Yervoy, Ipilimumab, anti-CTLA4: BMS)은 T세포 표면의 CTLA-4와 결합하여 T세포가 무력화되는 것을 막아주고, T세포의 증식을 돕는 메커니즘으로 흑색종 환자 치료제로서 최초로 승인 받았다.
이러한 면역항암제는 환자의 전체적인 생존률(overall survival)과 병의 악화가 없는 상태의 생존률(progression free survival, PFS)을 개선시키는 등 단순 생존기간 연장에 그친 기존의 항암제보다 우수한 임상 시험 결과를 보여주었다. 뿐만 아니라, 기존 항암제의 구토, 탈모, 백혈구 감소 등과 같은 부작용과 내성 문제가 적어, 면역항암제는 항암 치료에서 큰 가능성을 보여주었다. 또한, 면역관문 억제제의 임상 결과는 말기암 환자의 거의 완치에 가까운 장기생존을 보여 세상을 놀라게 하였으나, 폐암, 피부암, 유방암 등의 여러 암 종에서 약 20% 내지 40%의 환자만이 반응을 보였다. 나머지 60% 내지 80%의 환자와 특히, 대장암 환자의 경우 치료 효능이 낮거나 없다는 한계점을 가지고 있다.
면역관문 억제제에 낮은 반응도 또는 무 반응도를 보이는 환자 군의 경우, 종양 조직 내 T세포의 수가 현저히 부족하였다. 즉, 환자의 면역 상태는 면역관문 억제제에 대한 반응도를 결정하는 중요한 요소 중 하나이다. 많은 암 환자의 경우 항암제 및 방사선 치료 등에 의해 면역체계에 교란이 생겨 'immune cold 혹은 immune desert' 상태가 되고, 이는 면역관문 억제제에 대한 낮은 반응도의 원인일 것이라고 추측하고 있다. 따라서, 환자의 면역체계를 활성화시키는 물질의 개발과 이를 기존의 면역관문 억제제와 병용하는 새로운 치료법에 대한 연구가 필요한 실정이다.
한편, 사이토카인은 다양한 면역반응을 조절하는 물질로, 종류 및 특성에 따라 면역세포의 발달 및 증식, 유지, 활성, 사멸 등을 결정하는 중요한 요소이다. 환자의 면역체계 활성화를 목적으로 다양한 사이토카인 치료제가 개발되고 있다. 특히, T세포 및 NK세포의 항상성에 중요한 IL-2 계열 사이토카인(IL-2, IL-7, IL-15, IL-21)의 개발이 활발히 이루어지고 있다. 그러나, 사이토카인 치료제는 짧은 생체 반감기로 인해 뚜렷한 치료 효능을 확인할 수 없다는 한계점을 가지고 있다.
이에 본 발명자들은 면역체계를 활성화시키면서 면역관문 단백질을 억제시킬 수 있는 효과적인 면역항암제를 개발하기 위해 연구한 결과, 항-CEA 항체, 항-PD-L1 항체 및 IL-2를 포함하는 융합단백질이 우수한 항암 효과를 나타냄을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.
상기 목적을 달성하기 위해, 본 발명의 일 측면은, 하기 구조식 1의 융합단백질을 제공한다.
[구조식 1]
N′-A-L1-B-L2-C-L3-D-C′
본 발명의 다른 측면은, 상기 융합단백질 2개가 결합된 융합단백질 이량체를 제공한다.
본 발명의 또 다른 측면은, 상기 융합단백질 또는 상기 융합단백질 이량체를 유효성분으로 포함하는 암의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.
본 발명의 융합단백질은 종양 관련 항원인 CEA와 면역 관문 단백질인 PD-L1과의 결합력이 우수하고, CEA 및/또는 PD-L1를 발현하는 종양세포와 특이적으로 결합할 수 있다. 또한, 본 발명의 융합단백질은 T세포 및 NK세포의 증식을 유도하고, 면역세포를 활성화시킬 수 있으며, 암 유발 마우스에 투여할 경우 우수한 항암효과를 나타낼 수 있다. 따라서, 본 발명의 융합단백질은 암 질환을 치료하는데 유용하게 사용될 수 있다.
도 1은 본 발명의 일 실시예인 αCEA-αPDL1-hyFc-IL2v 융합단백질 이량체를 정제한 후 SDS-PAGE로 분석한 결과를 나타낸 도면이다.
도 2는 본 발명의 일 실시예인 αCEA-αPDL1-hyFc-IL2v 융합단백질 이량체를 제형화시킨 후, SE-HPLC로 분석한 결과를 나타낸 도면이다.
도 3은 본 발명의 일 실시예인 αCEA-αPDL1-hyFc-IL2v 융합단백질 이량체와 CEA를 발현하는 세포와의 결합력을 측정한 도면이다.
도 4는 본 발명의 일 실시예인 αCEA-αPDL1-hyFc-IL2v 융합단백질과 PD-L1을 발현하는 세포와의 결합력을 측정한 도면이다.
도 5는 본 발명의 일 실시예인 αCEA-αPDL1-hyFc-IL2v 융합단백질 이량체와 CEA 및 PD-L1을 발현하는 세포와의 결합력을 측정한 도면이다.
도 6은 PD-1을 발현하는 세포와 PD-L1을 발현하는 세포에 본 발명의 일 실시예인 αCEA-αPDL1-hyFc-IL2v 융합단백질 이량체를 처리한 후, PD-1/PD-L1 결합 저해에 의한 NFAT-Luc 신호 변화를 확인한 도면이다.
도 7은 인간 유래의 말초혈액 단핵세포에 본 발명의 일 실시예인 αCEA-αPDL1-hyFc-IL2v 융합단백질 이량체를 처리한 후, T세포 및 NK세포와 같은 면역세포들의 증식률을 확인한 도면이다.
도 8은 본 발명의 일 실시예인 αCEA-αPDL1-hyFc-IL2v 융합단백질 이량체 또는 재조합 IL-2를 처리한 인간 유래의 말초혈액 단핵세포를 종양세포에 처리한 후, 종양세포의 사멸 정도를 비교한 도면이다.
도 9는 본 발명의 일 실시예인 αCEA-αPDL1-hyFc-IL2v 융합단백질 이량체의 체내 반감기를 측정한 도면이다.
도 10은 본 발명의 일 실시예인 αCEA-αPDL1-hyFc-IL2v 융합단백질 이량체의 조직별 체내 축적량을 나타낸 도면이다.
도 11은 본 발명의 일 실시예인 αCEA-αPDL1-hyFc-IL2v 융합단백질 이량체를 고형암 유발 마우스에 투여한 후, 시간에 따른 CD8+ T세포, NK세포 및 Treg 세포의 분포 정도를 나타낸 도면이다.
도 12는 본 발명의 일 실시예인 αCEA-αPDL1-hyFc-IL2v 융합단백질 이량체를 고형암 유발 마우스에 투여한 후, 종양의 크기 및 절대 림프구 수를 측정한 도면이다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
항-CEA 항체, 항-PD-L1 항체 및 IL-2를 포함하는 융합단백질
본 발명의 일 측면은, 하기 구조식 1의 융합단백질로서,
[구조식 1]
N′-A-L1-B-L2-C-L3-D-C′
상기 N′은 융합단백질의 N-말단이고,
상기 C′는 융합단백질의 C-말단이며,
상기 A는 종양 관련 항원(tumor-associated antigen)에 특이적으로 결합하는 항체의 scFv(Single-chain variable fragment)이고,
상기 B는 PD-L1(Programmed death-ligand 1)에 특이적으로 결합하는 항체의 scFv이며,
상기 C는 면역글로불린의 Fc 도메인, 이의 단편 또는 이의 변이체이고,
상기 D는 IL-2, 이의 단편 또는 이의 변이체이며,
상기 L1, L2 및 L3는 각각 펩타이드 링커인 융합단백질을 제공한다.
상기 A는 종양 관련 항원(tumor-associated antigen)로서, 상기 종양 관련 항원은 세포암화에 따라 발현하는 항원 중, 암세포특이적이 아니고, 대응하는 정상세포에도 미량으로 존재하는 항원을 의미한다. 구체적으로, 상기 A는 CEA(Carcinoembryonic antigen), AFP(α-fetoprotein) 및 MUC1(Mucin 1) 이들로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 종양 관련 항원에 특이적으로 결합하는 항체의 scFv일 수 있다. 구체적으로, 상기 A는 CEA에 특이적으로 결합하는 항체의 scFv일 수 있다.
상기 CEA는 대장암을 비롯한 유방암, 폐암, 간암 등의 암종과 비암성 질환 또는 흡연자에서 발견되는 혈액 내 존재하는 종양 관련 항원으로, 암의 치료 경과, 재발 여부를 확인하는데 이용될 수 있다.
상기 AFP는 간암을 비롯한 위암, 난소의 태아성 암 등의 암종과 간염, 간경변 질환 환자에서 발견되는 혈액 내 검출되는 종양 관련 항원이다. 일반적으로, AFP는 태아 혈청 단백으로 태생기에 생성되고 생후 감소하기 시작하여 18개월이 지나면 성인에서 관찰되는 수치까지 감소한다.
상기 MUC1은 특정한 상피세포에서 발견되는 단백질로서, 유방암, 난소암, 폐암, 전립선암 환자에서 정상인보다 높게 측정된다. 혈액에서 MUC1의 발현양을 측정하여 암의 치료, 재발 여부 등을 예측할 수 있다.
상기 A는 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 것일 수 있다.
상기 B는 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 것일 수 있다.
상기 C는 면역글로불린의 Fc 도메인, 이의 단편 또는 이의 변이체일 수 있다. 상기 Fc 도메인의 변이체는 변형된 면역글로불린의 Fc 도메인 또는 이의 단편일 수 있다. 이때, 변형된 면역글로불린의 Fc 도메인은 Fc 수용체 및/또는 보체(complement)와의 결합력이 변형되어 항체의존성세포독성(antibody-dependent cellular cytotoxicity, ADCC) 또는 보체의존성세포독성(complement-dependent cytotoxicity, CDC)이 약화된 것일 수 있다. 상기 변형된 면역글로불린은 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, IgA2, IgD, IgE 및 이의 조합으로 이루어진 군에서 선택될 수 있다.
본 발명에 사용하는 용어, "Fc 도메인", "Fc 단편" 또는 "Fc"란 면역글로불린의 중쇄 불변 영역 2(CH2) 및 중쇄 불변 영역 3(CH3)을 포함하나, 이의 중쇄 및 경쇄의 가변 영역 및 경쇄 불변 영역 1(CL1)은 포함하지 않는 단백질을 말한다. 이는 중쇄 불변 영역의 힌지 영역을 더 포함할 수 있다. 또한, 면역글로불린 Fc 도메인 단편은 항체의 CH2 및 CH3 도메인을 포함하는 것일 수 있다. 상기 CH2 및 CH3 도메인은 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, IgA2, IgD 또는 IgE로부터 유래된 것일 수 있다. 변형된 Fc 또는 변형된 Fc 단편은 본원에서 "hFc" 또는 "hyFc"로 지칭되기도 한다.
본 발명에 사용하는 용어, "Fc 도메인 변이체"는 Fc 도메인 중 일부 아미노산이 치환되거나, 서로 다른 종류의 Fc 도메인을 조합하여 제조된 것을 의미한다. 상기 Fc 도메인 변이체는 힌지 부위에서 절단되는 것을 예방할 수 있다. 구체적으로, 서열번호 9의 144번째 아미노산 및/또는 145번째 아미노산이 변형될 수 있다. 바람직하게는 서열번호 9의 144번째 아미노산인 K를 G 또는 S로 치환하고, 145번째 아미노산인 E를 G 또는 S로 치환한 변이체일 수 있다.
또한, 본 발명의 Fc 단편은 천연형 당쇄, 천연형에 비해 증가된 당쇄, 천연형에 비해 감소한 당쇄, 또는 당쇄가 제거된 형태일 수 있다. 화학적 방법, 효소적 방법 및 미생물을 사용한 유전공학적 엔지니어링 방법 등과 같이 통상적인 방법으로 면역글로불린 Fc 당쇄를 변형시킬 수 있다. Fc 단편으로부터 당쇄의 제거는 1차 보체 구성요소 C1의 C1q에의 결합 친화력을 급격하게 감소시키고, ADCC 또는 CDC의 감소 또는 소실을 가져오며, 그로 인하여 생체 내의 불필요한 면역반응을 유도하지 않는다. 이런 점에서, 당쇄가 제거되거나(deglycosylated) 비당쇄화된(aglycosylated) 형태에서의 면역글로불린 Fc 단편은, 약물의 담체로서 본 발명의 목적에 더 적합할 수 있다. 여기에서 사용된 용어 "당쇄의 제거(deglycosylation)"는 Fc 단편으로부터 효소적으로 당이 제거됨을 의미한다. 또한, 용어 "비당쇄화(aglycosylation)"는 Fc 단편이 원핵 생물, 바람직하게는 E.coli에 의하여 당쇄화 되지 않은(unglycosylated) 형태로 생성됨을 의미한다.
또한, 상기 변형된 면역글로불린의 Fc 도메인은 서열번호 9(hyFc), 서열번호 5(hyFcM1), 서열번호 12(hyFcM2), 서열번호 13(hyFcM3) 또는 서열번호 14(hyFcM4)의 아미노산 서열을 포함하는 것일 수 있다. 또한, 상기 변형된 면역글로불린의 Fc 도메인은 서열번호 5의 아미노산 서열(non-lytic mouse Fc)을 포함할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서, 상기 C는 면역글로불린의 Fc 도메인의 변이체인 변형된 면역글로불린의 Fc 도메인(hyFcM1)을 사용하였으며, 상기 C는 서열번호 5로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 것일 수 있다.
상기 D는 IL-2 또는 이의 변이체일 수 있다.
본 발명에 사용하는 용어, "IL-2"는 달리 언급되지 않는 한, 포유동물, 예를 들어, 영장류(예, 인간) 및 설치류(예, 마우스 및 래트)를 포함하여 임의의 척추동물 공급원으로부터 수득한 임의의 야생형 IL-2를 말한다. 상기 용어는 미처리된 IL-2, 및 세포에서의 처리로부터 수득된 IL-2의 임의의 형태를 포함한다. 또한, 상기 용어는 IL-2의 야생형 변이체, 예를 들면, 스플라이스 변이체 또는 대립형질 변이체를 포함한다. 구체적으로, 인간 IL-2는 서열번호 7로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 것일 수 있다.
본 발명에 사용하는 용어, "IL-2의 변이체"는 IL-2의 절단형(truncated form), 및 IL-2가 융합 또는 화학적 접합에 의해 또 다른 분자에 연결된 형태를 포함하고, IL-2의 다양한 형태의 임의의 돌연변이 형태를 포함할 수 있다. 또한, IL-2의 변이체는 야생형 IL-2의 아미노산 일부가 치환에 의해 수득된 돌연변이체 일 수 있다. 이때, 상기 IL-2의 변이체는 생체 내에서 낮은 독성을 가질 수 있도록 변형될 수 있다. 이때, 생체 내에서 독성이란, IL-2가 IL-2 수용체의 알파체인과 결합하여 유발하는 부작용을 의미할 수 있다. IL-2의 부작용을 약화시키기 위해서 다양한 IL-2의 변이체가 개발되었으며, 이러한 IL-2의 변이체는 미국특허 5,229,109 및 대한민국특허 1667096에 개시된 바와 같다.
상기 IL-2의 변이체는 서열번호 7의 38번째 또는 42번째의 아미노산이 치환될 수 있다. 구체적으로, IL-2의 변이체의 일 구체예는 야생형의 38번째 아르기닌이 알라닌으로 치환(R38A)된 것일 수 있다. 또한, IL-2의 변이체의 일 구체예는 야생형 42번째 페닐알라닌이 다른 아미노산으로 치환된 형태일 수 있으며, 구체적으로, 상기 IL-2의 변이체는 서열번호 7의 서열의 42번째 아미노산이 F42A, F42G, F42S, F42T, F42Q, F42E, F42N, F42D, F42R 및 F42K로 치환된 것일 수 있다.
또한, IL-2의 변이체는 야생형 IL-2에서 38번째 및 42번째 아미노산이 치환된 형태일 수 있다. 예를 들어, 상기 IL-2의 변이체는 서열번호 7로 표시되는 아미노산 서열에서 R38A, F42A 및 이의 조합으로부터 선택되는 어느 하나의 아미노산 치환을 포함하는 것일 수 있다. 상기 IL-2의 변이체는 서열번호 8의 아미노산 서열을 가질 수 있다.
상기 A와 B는 1개 내지 50개의 펩타이드 링커(제1링커, L1)를 통해 결합될 수 있다. 구체적으로, 상기 펩타이드 링커는 1개 내지 50개의 연속된 아미노산, 5개 내지 45개의 연속된 아미노산, 10개 내지 40개의 연속된 아미노산, 또는 15개 내지 35개의 연속된 아미노산, 또는 20개 내지 30개의 아미노산으로 이루어질 수 있다. 일 구체예로 상기 L1은 20개의 아미노산으로 이루어질 수 있다. 상기 A와 B는 서열번호 3으로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드 링커(제1링커, L1)를 통해 결합될 수 있다.
상기 B와 C는 1개 내지 50개의 펩타이드 링커(제2링커, L2)를 통해 결합될 수 있다. 상기 L1은 1개 내지 50개의 연속된 아미노산, 5개 내지 45개의 연속된 아미노산, 10개 내지 40개의 연속된 아미노산, 또는 15개 내지 35개의 연속된 아미노산, 또는 20개 내지 30개의 아미노산으로 이루어질 수 있다. 일 구체예로 상기 L2는 30개의 아미노산으로 이루어질 수 있다. 또한, 상기 L2는 적어도 하나의 시스테인을 포함할 수 있다. 구체적으로, 상기 L2는 하나, 두 개 또는 세 개의 시스테인을 포함할 수 있다. 또한, 상기 L2는 면역글로불린의 힌지에서 유래된 것일 수 있다. 일 구체예로서, 상기 L2는 서열번호 16으로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 것일 수 있다.
상기 C와 D는 1개 내지 50개의 펩타이드 링커(제3링커, L3)를 통해 결합될 수 있다. 구체적으로, 상기 펩타이드 링커는 1개 내지 50개의 연속된 아미노산으로 이루어질 수 있다. 일 구체예로 상기 L3은 4개의 아미노산으로 이루어질 수 있다. 상기 C와 D는 서열번호 6으로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드 링커(제3링커, L3)를 통해 결합될 수 있다.
상기 융합단백질은 서열번호 15로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 것일 수 있다.
본 발명의 다른 측면은, 상기 항-CEA 항체, 항-PD-L1 항체 및 IL-2를 포함하는 융합단백질 2개가 결합된 융합단백질 이량체를 제공한다. 상기 항-CEA 항체, 항-PD-L1 항체 및 IL-2를 포함하는 융합단백질은 상술한 바와 같다.
이때, 이량체를 구성하는 융합단백질 간의 결합은 링커 내에 존재하는 시스테인에 의해 이황화 결합에 의해 이루어진 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 이량체를 구성하는 융합단백질은 동일한 것일 수도 있으나, 서로 상이한 융합단백질일 수 있다. 바람직하게는, 상기 이량체는 동형이량체(homodimer)인 것일 수 있다.
융합단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드
본 발명의 또 다른 측면은 항-CEA 항체, 항-PD-L1 항체 및 IL-2를 포함하는 융합단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다. 구체적으로, 상기 폴리뉴클레오티드는 서열번호 15로 표시되는 아미노산 서열을 코딩하는 염기서열일 수 있다. 상기 항-CEA 항체, 항-PD-L1 항체 및 IL-2를 포함하는 융합단백질은 상술한 바와 같다. 상기 폴리뉴클레오티드는 동일한 아미노산 서열을 코딩하는 한, 하나 이상의 염기가 치환될 수 있다.
상기 폴리뉴클레오티드는 신호서열(signal sequence)을 코딩하는 핵산을 추가적으로 포함할 수 있다. 여기에서 사용된 용어 "신호서열"은 목적 단백질의 분비를 지시하는 신호펩타이드를 의미한다. 상기 신호펩타이드는 숙주 세포에서 번역된 후에 절단된다. 구체적으로, 상기 신호서열은 ER(endoplasmic reticulum) 막을 관통하는 단백질의 이동을 개시하는 아미노산 서열이다.
신호서열은 당업계에 그 특징이 잘 알려져 있으며, 통상 16 내지 30개의 아미노산 잔기를 포함하나, 그보다 더 많거나 적은 아미노산 잔기를 포함할 수 있다. 통상적인 신호 펩타이드는 기본 N-말단 영역, 중심의 소수성 영역, 및 보다 극성인(polar) C-말단 영역의 세 영역으로 구성된다. 중심 소수성 영역은 미성숙 폴리펩타이드가 이동하는 동안 막지질 이중층을 통하여 신호서열을 고정시키는 4 내지 12개의 소수성 잔기를 포함한다.
개시 이후에, 신호서열은 흔히 신호 펩티다아제(signal peptidases)로 알려진 세포 효소에 의하여 ER의 루멘(lumen) 내에서 절단된다. 이때, 상기 신호서열은 tPa(tissue Plasminogen Activation), HSV gDs(signal sequence of Herpes simplex virus glycoprotein D), 또는 성장 호르몬(growth hormone)의 분비신호서열일 수 있다. 바람직하게, 포유동물 등을 포함하는 고등 진핵 세포에서 사용되는 분비 신호서열을 사용할 수 있다.
융합단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드가 적재된 벡터
본 발명의 또 다른 측면은, 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 제공한다.
상기 벡터는 숙주 세포에 도입되어 숙주 세포 유전체 내로 재조합 및 삽입될 수 있다. 또는 상기 벡터는 에피좀으로서 자발적으로 복제될 수 있는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 수단으로 이해된다. 상기 벡터는 선형 핵산, 플라스미드, 파지미드, 코스미드, RNA 벡터, 바이러스 벡터 및 이의 유사체들을 포함한다. 바이러스 벡터의 예로는 레트로바이러스, 아데노바이러스, 및 아데노-관련 바이러스를 포함하나 이에 제한되지 않는다.
구체적으로, 상기 벡터는 플라스미드 DNA, 파아지 DNA 등이 될 수 있고, 상업적으로 개발된 플라스미드(pUC18, pBAD, pIDTSAMRT-AMP 등), 대장균 유래 플라스미드(pYG601BR322, pBR325, pUC118, pUC119 등), 바실러스 서브틸리스 유래 플라스미드(pUB110, pTP5 등), 효모-유래 플라스미드(YEp13, YEp24, YCp50 등), 파아지 DNA(Charon4A, Charon21A, EMBL3, EMBL4, λgt10, λgt11, λZAP 등), 동물 바이러스 벡터(레트로바이러스(retrovirus), 아데노바이러스(adenovirus), 백시니아 바이러스(vaccinia virus) 등), 곤충 바이러스 벡터(배큘로바이러스(baculovirus) 등)이 될 수 있다. 상기 벡터는 숙주 세포에 따라서 단백질의 발현량과 수식 등이 다르게 나타나므로, 목적에 가장 적합한 숙주세포를 선택하여 사용함이 바람직하다.
본 명세서에서 사용하는 용어, 목적 단백질의 "유전자 발현" 또는 "발현"은, DNA 서열의 전사, mRNA 전사체의 번역 및 융합단백질 생산물 또는 이의 단편의 분비를 의미하는 것으로 이해된다. 유용한 발현 벡터는 RcCMV(Invitrogen, Carlsbad) 또는 이의 변이체일 수 있다. 상기 발현 벡터는 포유류 세포에서 목적 유전자의 연속적인 전사를 촉진하기 위한 인간 CMV(cytomegalovirus) 프로모터, 및 전사 후 RNA의 안정상태 수준을 높이기 위한 우태 성장 인자(bovine growth hormone) 폴리아데닐레이션 신호서열을 포함할 수 있다.
융합단백질을 발현하는 형질전환된 세포
본 발명의 또 다른 측면은, 상기 벡터가 도입된 형질전환 세포를 제공한다.
상기 형질전환 세포의 숙주세포로서, 원핵세포, 진핵세포, 포유동물, 식물, 곤충, 균류 또는 세포성 기원의 세포를 포함할 수 있지만 이에 한정되지 않는다. 상기 원핵세포의 일 예로는 대장균을 사용할 수 있다. 또한, 진핵세포의 일 예로는 효모를 사용할 수 있다. 또한, 상기 포유동물 세포로 CHO 세포, F2N 세포, CSO 세포, BHK 세포, 바우스(Bowes) 흑색종 세포, HeLa 세포, 911 세포, AT1080 세포, A549 세포, HEK 293 세포 또는 HEK293T 세포 등을 사용할 수 있으나, 이에 한정되지 않으며, 당업자에게 알려진 포유동물 숙주세포로 사용 가능한 세포는 모두 이용 가능하다.
또한, 숙주세포로 발현벡터를 도입하는 경우, CaCl2 침전법, CaCl2 침전법에 DMSO(dimethyl sulfoxide)라는 환원물질을 사용함으로써 효율을 높인 Hanahan 방법, 전기천공법(electroporation), 인산칼슘 침전법, 원형질 융합법, 실리콘 카바이드 섬유를 이용한 교반법, 아그로박테리아 매개된 형질전환법, PEG를 이용한 형질전환법, 덱스트란 설페이트, 리포펙타민 및 건조/억제 매개된 형질전환 방법 등이 사용될 수 있다.
전술한 바와 같이, 융합단백질의 치료제로서의 특성을 최적하거나 기타 다른 목적을 위해 호스트 세포가 갖고 있는 당화(glycosylation) 관련 유전자를 당업자에게 알려져 있는 방법을 통해 조작하여 융합단백질의 당쇄 패턴(예를 들어, 시알산, 퓨코실화, 당화)을 조정할 수 있다.
융합단백질 생산 방법
본 발명의 또 다른 측면은, 상기 형질전환 세포를 배양하는 단계를 포함하는 항-CEA 항체, 항-PD-L1 항체 및 IL-2를 포함하는 융합단백질을 생산하는 방법을 제공한다. 구체적으로, 상기 생산방법은 상기 생산 방법은 i) 상기 형질전환 세포를 배양하여 배양물을 수득하는 단계; 및 ii) 상기 배양물로부터 융합단백질을 회수하는 단계를 포함할 수 있다.
상기 형질전환 세포를 배양하는 방법은 당업계에 널리 알려져 있는 방법을 이용하여 수행할 수 있다. 구체적으로, 상기 배양은 배치 공정 또는 주입 배치 또는 반복 주입 배치 공정(fed batch 또는 repeated fed batch process)에서 연속식으로 배양할 수 있다.
융합단백질 또는 이의 이량체의 용도
본 발명의 또 다른 측면은 포, 항-CEA 항체, 항-PD-L1 항체 및 IL-2를 포함하는 융합단백질 또는 상기 융합단백질 2개가 결합된 융합단백질 이량체를 유효성분으로 포함하는 암의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.
상기 항-CEA 항체, 항-PD-L1 항체 및 IL-2를 포함하는 융합단백질 또는 상기 융합단백질 2개가 결합된 융합단백질 이량체는 상술한 바와 같다.
본 발명의 융합단백질 또는 이의 이량체는 CEA에 특이적으로 결합하는 항체의 scFv를 포함함으로써, 종양 세포에 발현된 종양 관련 항원인 CEA에 특이적으로 결합할 수 있다. 또한, 본 발명의 융합단백질 또는 이의 이량체는 PD-L1에 특이적으로 결합하는 항체의 scFv를 포함함으로써, 종양세포에 발현된 PD-L1에 결합하여, PD-L1/PD-1 결합을 저해하여 종양세포의 면역회피 기작을 차단시킬 수 있다. 또한, 본 발명의 융합단백질 또는 이의 이량체는 IL-2 또는 이의 단편 또는 이의 변이체를 포함함으로써, 면역세포를 활성화시킬 수 있다. 즉, 본 발명의 융합단백질 또는 이의 이량체는 종양세포에 특이적으로 결합하고, 종양세포의 면역회피 기작을 차단시킬 수 있으며, 종양세포 주변의 면역세포를 활성화시킬 수 있으므로 암 질환의 예방 또는 치료에 유용하게 사용될 수 있다.
상기 암은 위암, 간암, 폐암, 대장암, 유방암, 전립선암, 난소암, 췌장암, 자궁경부암, 갑상선암, 후두암, 급성 골수성 백혈병, 뇌종양, 신경모세포종, 망막 모세포종, 두경부암, 침샘암 및 림프종으로 구성된 군에서 선택될 수 있다.
상기 약학 조성물의 바람직한 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 기간에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다. 본 발명의 암 또는 감염성 질환 치료용 또는 예방용 약학 조성물에서 그 유효성분은 항암 활성을 나타내거나, 감염성 질환에 치료 효과를 나타낼 수 있는 한, 용도, 제형, 배합 목적 등에 따라 임의의 양(유효량)으로 포함될 수 있는데, 통상적인 유효량은 조성물 전체 중량을 기준으로 할 때 0.001 중량 % 내지 20.0 중량% 범위 내에서 결정될 것이다. 여기서 "유효량"이란 항암 효과 또는 감염성 질환 치료(treatment) 효과를 유도할 수 있는 유효성분의 양을 말한다. 이러한 유효량은 당업자의 통상의 능력 범위 내에서 실험적으로 결정될 수 있다.
본 명세서에서 사용된 용어, "치료"는 치료학적 처리 및 예방적 처리를 모두 포함하는 의미로 사용될 수 있다. 이때, 예방은 개체의 병리학적 상태 또는 질환을 완화시키거나 감소시키는 의미로 사용될 수 있다. 일 구체예에서, 용어 "치료"는 인간을 포함한 포유류에서 질환을 치료하기 위한 적용이나 어떠한 형태의 투약을 모두 포함한다. 또한, 상기 용어는 질환 또는 질환의 진행을 억제하거나 늦추는 것을 포함하며; 손상되거나, 결손된 기능을 회복시키거나, 수리하여, 질환을 부분적이거나 완전하게 완화시키거나; 또는 비효율적인 프로세스를 자극하거나; 심각한 질환을 완화하는 의미를 포함한다.
본 명세서에서 사용된 용어, "효능(efficacy)"은 1년, 5년, 또는 10년과 같이 일정 기간에 걸쳐 생존 또는 질병이 없는 상태에서 생존(disease-free survival)과 같은 같은 하나 이상의 파라미터에 의해 결정될 수 있다. 뿐만 아니라, 상기 파라미터는 개체에서 적어도 하나의 종양의 크기가 억제되는 것을 포함할 수 있다.
생체이용률과 같은 약동학적 파라미터(Pharmacokinetic parameters) 및 클리어런스율(clearance rate)과 같은 기본적인 파라미터(underlying parameters)도 효능에 영향을 줄 수 있다. 따라서, "향상된 효능" (예를 들어, 효능의 개선)은 향상된 약동학적 파라미터 및 향상된 효능에 기인할 수 있으며, 시험 동물 또는 인간 대상체에서 클리어런스율 및 종양 성장을 비교하거나, 생존, 재발율 또는 질병이 없는 상태에서 생존과 같은 파라미터를 비교하여 측정될 수 있다.
여기서 "치료학적으로 유효한 양" 또는 "약학적으로 유효한 양"이란 대상 질환을 예방 또는 치료하는데 유효한 화합물 또는 조성물의 양으로서, 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분하며 부작용을 일으키지 않을 정도의 양을 의미한다. 상기 상기 유효량의 수준은 환자의 건강상태, 질환의 종류, 중증도, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 방법, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료 기간, 배합 또는 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 일 구체예에서 치료학적으로 유효한 양은 암을 치료하는데 효과적인 약물의 양을 의미한다.
이때, 상기 약학 조성물은 약학적으로 허용 가능한 담체를 더 포함할 수 있다. 상기 약학적으로 허용 가능한 담체는 환자에게 전달하기에 적절한 비-독성 물질이면 어떠한 담체라도 가능하다. 증류수, 알코올, 지방, 왁스 및 비활성 고체가 담체로 포함될 수 있다. 약물학적으로 허용되는 애쥬번트(완충제, 분산제) 또한 약학 조성물에 포함될 수 있다.
구체적으로, 상기 약학 조성물은 유효성분 이외에 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하여 당업계에 공지된 통상의 방법으로 투여 경로에 따라 비경구용 제형으로 제조될 수 있다. 여기서 "약제학적으로 허용되는" 의미는 유효성분의 활성을 억제하지 않으면서 적용(처방) 대상이 적응 가능한 이상의 독성을 지니지 않는다는 의미이다.
상기 약학 조성물이 비경구용 제형으로 제조될 경우, 적합한 담체와 함께 당업계에 공지된 방법에 따라 주사제, 경피 투여제, 비강 흡입제 및 좌제의 형태로 제제화될 수 있다. 주사제로 제제화할 경우 적합한 담체로서는 멸균수, 에탄올, 글리세롤이나 프로필렌 글리콜 등의 폴리올 또는 이들의 혼합물을 사용할 수 있으며, 바람직하게는 링거 용액, 트리에탄올 아민이 함유된 PBS(phosphate buffered saline)나 주사용 멸균수, 5% 덱스트로스 같은 등장 용액 등을 사용할 수 있다. 약제학적 조성물의 제제화와 관련하여서는 당업계에 공지되어 있으며, 구체적으로 문헌[Remington's Pharmaceutical Sciences(19th ed., 1995)] 등을 참조할 수 있다. 상기 문헌은 본 명세서의 일부로서 간주 된다.
상기 약학 조성물의 바람직한 투여량은 환자의 상태, 체중, 성별, 연령, 환자의 중증도, 투여 경로에 따라 1일 0.01 ug/kg 내지 10 g/kg 범위, 또는 0.01 mg/kg 내지 1 g/kg 범위일 수 있다. 투여는 1일 1회 또는 수회로 나누어 이루어질 수 있다. 이러한 투여량은 어떠한 측면으로든 본원 발명의 범위를 제한하는 것으로 해석되어서는 아니 된다.
상기 약학 조성물이 적용(처방)될 수 있는 대상은 포유동물 및 사람이며, 특히 사람인 경우가 바람직하다. 본원의 약학 조성물은 유효성분 이외에, 항암 활성의 상승·보강을 위하여 이미 안전성이 검증되고 항암 활성 또는 감염성 질환에 치료 효과를 갖는 것으로 공지된 임의의 화합물이나 천연 추출물을 추가로 포함할 수 있다.
상기 융합 단백질 또는 융합단백질 이량체의 투여경로, 투여량 및 투여횟수는 환자의 상태 및 부작용의 유무에 따라 다양한 방법 및 양으로 대상에게 투여될 수 있고, 최적의 투여방법, 투여량 및 투여횟수는 통상의 기술자가 적절한 범위로 선택할 수 있다. 또한, 상기 융합 단백질 또는 융합단백질 이량체는 치료하고자 하는 질환에 대하여 치료효과가 공지된 다른 약물 또는 생리학적 활성물질과 병용하여 투여되거나, 다른 약물과의 조합 제제 형태로 제형화될 수 있다.
이하, 본 발명을 하기 실시예에 의하여 더욱 상세하게 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 본 발명의 범위가 이들만으로 한정되는 것은 아니다.
실시예 1. αCEA-αPDL1-hyFc-IL2v 유전자 컨스트럭트 제조
항-CEA 항체의 scFv(αCEA), 항-PD-L1 항체의 scFv(αPDL1) 및 IL-2의 변이체(IL2v)가 결합된 융합단백질을 제조하기 위해, N-말단에서부터 C-말단 방향으로 αCEA, 제1링커, αPDL1, 제2링커, Fc 도메인(hyFc), 제3링커 및 IL2v 순서로 결합된 형태의 αCEA-αPDL1-hyFc-IL2v 유전자 컨스트럭트를 제조하였다.
구체적으로, 먼저, 공지된 아미노산 서열(Accession number: DB05097)인 hMN-14의 아미노산 서열을 이용해 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 항-CEA 항체의 scFv를 제작하였다. 또한, 항-PD-L1 항체의 아미노산 서열을 이용해 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 항-PD-L1 항체의 scFv를 제작하였다. 상기 제작한 항-CEA 항체의 scFv와 항-PD-L1 항체의 scFv를 서열번호 3으로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드 링커(제1링커)로 결합하였으며, 이를 FC 도메인의 N-말단 쪽에 서열번호 16으로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드 링커(제2링커)로 결합하였다.
또한, 상기 IL-2의 변이체는 IL-2 receptor α에 대한 결합력이 감소하는 동시에 NK세포에 대한 선택적 결합을 통해 치료 효능이 높아질 것으로 예상되는 2개의 변이부를 포함하도록 제작하였다. 상기 IL-2의 변이체는 인간 IL-2(서열번호 7)에서 R38A 및 F42A의 아미노산 치환을 갖는 것으로서, 서열번호 8로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 것을 사용하였다. IL-2의 변이체를 FC 도메인의 C-말단 쪽에 서열번호 6으로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드 링커(제3링커)로 결합하였다.
그 후, 각각의 아미노산 서열을 코딩하는 유전자를 합성하여 서브 벡터(sub-vector)로 제조하였다. 합성된 4개의 유전자를 하나의 유전자 컨스트럭트로 제조하기 위해, Golden GATEway assembly를 진행하여 pBispec vector로 발현벡터를 확보하였다.
상기 αCEA-αPDL1-hyFc-IL2v 유전자 컨스트럭트의 제조방법과 동일한 방법으로, N-말단에서부터 C-말단 방향으로 αPDL1, 제1링커, αCEA, 제2링커, hyFc, 제3링커 및 IL2v 순서로 결합된 형태의 αPDL1-αCEA-hyFc-IL2v 유전자 컨스트럭트를 포함하는 발현벡터를 제조하였다.
또한, 상기 αCEA-αPDL1-hyFc-IL2v 유전자 컨스트럭트의 제조방법과 동일한 방법으로, N-말단에서부터 C-말단 방향으로 αCEA, 제2링커 및 hyFc 순서로 결합된 형태의 αCEA-hyFc 유전자 컨스트럭트를 포함하는 발현벡터를 제조하였다. 나아가, N-말단에서부터 C-말단 방향으로 αCEA, 제2링커, hyFc, 제3링커 및 IL2v 순서로 결합된 형태의 αCEA-hyFc-IL2v 유전자 컨스트럭트를 포함하는 발현벡터를 제조하였다. 또한, N-말단에서부터 C-말단 방향으로 αPDL1, 제1링커, αCEA, 제2링커 및 hyFc 순서로 결합된 형태의 αPDL1-αCEA-hyFc 유전자 컨스트럭트를 포함하는 발현벡터를 제조하였다. 나아가, N-말단에서부터 C-말단 방향으로 hyFc, 제3링커 및 IL2v 순서로 결합된 형태의 hyFc-IL2v 유전자 컨스트럭트를 포함하는 발현벡터를 제조하였다.
실시예 2. αCEA-αPDL1-hyFc-IL2v 융합단백질 이량체 생산
αCEA-αPDL1-hyFc-IL2v 융합단백질 이량체를 생산하기 위해, suspension-adapted CHO 세포를 6×106 cells/㎖로 접종(seeding)한 후, 실시예 1에서 제작한 αCEA-αPDL1-hyFc-IL2v 유전자 컨스트럭트를 포함하는 발현벡터 200 ㎖ 및 ExpiFectamineTM CHO reagent를 처리하여 형질전환하였다. 많은 양의 αCEA-αPDL1-hyFc-IL2v 융합단백질 이량체를 확보하기 위해, 형질전환한 다음날 ExpiFectamineTM CHO 인핸서(enhancer)와 ExpiCHOTM 피드(feed)를 첨가하였고, 배양온도를 32℃ 온도로 시프트(shift)하였다. 7일 후 배양액을 수거하여 3,600 rpm에서 15분간 원심분리하여 상층액을 수득하였다. 그 후, 0.22 ㎛ 필터를 이용하여 상층액을 여과하였다.
상기 상층액으로부터 αCEA-αPDL1-hyFc-IL2v 융합단백질 이량체를 정제하기 위해, AKTA Prime(GE Healthcare Life sciences) 및 Protein A resin을 이용해 Fc 도메인을 포함하는 αCEA-αPDL1-hyFc-IL2v 융합단백질 이량체를 정제하였다. 용출 버퍼로는 100 mM Glycine-HCL, 50 mM L-Arginine 및 5% Glycerol(pH 3.0)를 사용하였다.
그 결과, Protein A resin을 이용해 정제하는 단계만으로도 순도 90% 이상의 융합단백질 이량체를 확보하였다. 순도가 높은 분획(fraction)만을 분리하여 50 mM hepes, 250 mM sucrose, pH 5.0로 제형화하였다. 제형화시킨 αCEA-αPDL1-hyFc-IL2v 융합단백질 이량체를 SDS-PAGE를 통해 확인한 결과, 비환원 조건(non-reducing condition)에서 약 250 kDa에서 확인되었고, 환원 조건(reducing condition)에서 약 100 kDa에서 확인되었다(도 1, 비환원: 융합단백질 이량체, 환원: 융합단백질 단량체). 또한, SE-HPLC 분석을 통해 순도를 확인한 결과, 90.22%의 순도를 확인하였다(도 2).
상기 실시예 1에서 제조한 αPDL1-αCEA-hyFc-IL2v 유전자 컨스트럭트를 포함하는 발현벡터, αCEA-hyFc 유전자 컨스트럭트를 포함하는 발현벡터, αCEA-hyFc-IL2v 유전자 컨스트럭트를 포함하는 발현벡터, αPDL1-αCEA-hyFc 유전자 컨스트럭트를 포함하는 발현벡터, hyFc-IL2v 유전자 컨스트럭트를 포함하는 발현벡터를 이용해 αCEA-αPDL1-hyFc-IL2v 융합단백질의 생산 방법과 동일한 방법으로 각각 αPDL1-αCEA-hyFc-IL2v 융합단백질 이량체, αCEA-hyFc 융합단백질 이량체, αCEA-hyFc-IL2v 융합단백질 이량체, αPDL1-αCEA-hyFc 융합단백질 이량체 및 hyFc-IL2v 융합단백질 이량체를 생산하였다.
실시예 3. CEA를 발현하는 세포와 αCEA-αPDL1-hyFc-IL2v 융합단백질 이량체의 결합 확인: in vitro
실시예 2에서 생산한 αCEA-αPDL1-hyFc-IL2v 융합단백질 이량체 및 αPDL1-αCEA-hyFc-IL2v 융합단백질 이량체가 종양 항원인 CEA와 결합하는지 확인하기 위해, CEA를 발현하는 MKN45 세포(한국세포주은행(KCLB), Cat.No. 80103)를 이용하여 결합 정도를 확인하였다.
구체적으로, MKN45 세포를 3×105 개의 세포수로 분주한 후, 각각의 융합단백질 이량체를 300 ㎍ 내지 0 ㎍까지 농도별로 희석해서 처리하고 4℃ 온도에서 30분 동안 배양하였다. 1% FBS(Hyclone, Cat.No. SH30084.03)를 포함하는 PBS(Welgene, Cat.No. LB004-02-500ml) 버퍼를 FACS assay 버퍼로 사용하기 위해 제조하였다. 그 후, FACS assay 버퍼로 세척한 후, 2차 항체인 PE-anti-human IgG antibody(Biolegend, Cat.No. 490304)를 각 샘플당 100 ㎕의 FACS assay 버퍼에 1.5 ㎕씩 처리하여 4℃ 온도에서 30분 동안 배양하였다. FACS assay 버퍼로 세척한 후, FACS 튜브로 옮겨 담아 FACS 분석을 진행하였다.
그 결과, MKN45 세포주와 αCEA-αPDL1-hyFc-IL2v 융합단백질 이량체의 EC50 값이 약 15.8 nM인 것을 확인하였다. 또한, MKN45 세포주와 αPDL1-αCEA-hyFc-IL2v 융합단백질 이량체의 EC50 값은 약 104.7 nM인 것을 확인하였다(도 3).
실시예 4. PD-L1를 발현하는 세포와 αCEA-αPDL1-hyFc-IL2v 융합단백질 이량체의 결합 확인: in vitro
실시예 2에서 생산한 αCEA-αPDL1-hyFc-IL2v 융합단백질 이량체 및 αPDL1-αCEA-hyFc-IL2v 융합단백질 이량체가 면역관문 단백질인 PD-L1과 결합하는지 확인하기 위해, PD-L1을 발현하는 MDA-MB-231세포주(한국세포주은행(KCLB), Cat.No. 30026)를 이용하여 결합 정도를 확인하였다.
구체적으로, MDA-MB-231 세포주를 5×105 개의 세포수로 분주한 후, 각각의 융합단백질 이량체를 12,000 ng/㎖에서 2배씩 희석하면서 농도별로 희석해서 처리하고 4℃ 온도에서 30분 동안 배양하였다. 그 후, FACS assay 버퍼로 세척한 후, 2차 항체인 PE-anti-human IgG antibody(Biolegend, Cat.No. 490304)를 각 샘플당 100 ㎕의 FACS assay 버퍼에 1.5 ㎕씩 처리하여 4℃ 온도에서 30분 동안 배양하였다. FACS assay 버퍼로 세척한 후, FACS 튜브로 옮겨 담아 FACS 분석을 진행하였다. 그 결과, MDA-MB-231 세포주와 αCEA-αPDL1-hyFc-IL2v 융합단백질 이량체의 EC50 값이 약 4.98 nM인 것을 확인하였다. 또한, MDA-MB-231 세포주와 αPDL1-αCEA-hyFc-IL2v 융합단백질 이량체의 EC50 값은 약 1.16 nM인 것을 확인하였다(도 4).
실시예 5. PD-L1 및 CEA를 발현하는 세포와 αCEA-αPDL1-hyFc-IL2v 융합단백질 이량체의 결합 확인: in vitro
실시예 2에서 생산한 αCEA-αPDL1-hyFc-IL2v 융합단백질 이량체 및 αPDL1-αCEA-hyFc-IL2v 융합단백질 이량체가 종양항원인 CEA와 면역관문 단백질인 PD-L1과 잘 결합하는지 확인하기 위해, 마우스 유래의 MC38 세포주(Kerafast, Cat.No. ENH204-FP)를 이용하여 결합 정도를 확인하였다. 인간 유래의 CEA 및 PD-L1을 발현하는 마우스 유래의 MC38 세포주를 제작하고, 이를 "C4 세포주(C4 cell line)"로 명명하였다.
상기 C4 세포주는 Lenti-X™ vector(Clontech, Cat.No. 632164)에 XhoI 및 XbaI 제한효소를 이용하여 서열번호 17로 표시되는 아미노산 서열을 코딩하는 유전자를 삽입하여 렌티바이러스(lentivirus)를 제작하였다. 그 후, 상기 렌티바이러스를 MC-38-CEA 세포주(Kerafast, Cat.No. ENH202)에 형질감염을 진행하였다.
구체적으로, 1.5 ㎖의 Transfection mixture(PLUS™ Reagent, Invitrogen, Cat.No. 11514015)와 1.5 ㎖의 plasmid DNA complex를 반응시킨 후, Lenti-X™ 293T 세포주(Clontech, Cat.No. 632180)에 해당 용액을 처리하여 6시간 동안 배양한 후, 기존 배지를 제거하고 배양 배지를 넣어 48시간 동안 배양하였다. 이때, 상기 plasmid DNA complex는 상기 Lenti-X™ vector(Clontech, Cat.No. 632164)에 XhoI 및 XbaI 제한효소를 이용하여 서열번호 17로 표시되는 아미노산 서열을 코딩하는 유전자를 삽입한 플라스미드 및 Lenti-X Packaging Single Shots 플라스미드(Clontech, Cat.No. 631275)이다. 그 후, 렌티바이러스를 생산한 Lenti-X™ 293T 세포주의 상층액만 수득하여, 0.45 ㎛ 필터에 여과하여 사용하였다.
상기 여과한 상층액을 MC-38-CEA에 처리하여 형질감염시켰다. 48시간 동안 배양한 후, hPD-L1가 발현됐는지 확인하기 위해, APC-anti human PD-L1 antibody(BD Bioscience, Cat.No. 563741)를 이용하여 발현 정도를 확인하였다. 또한, 단일 세포 선별(single cell selection)을 통해 hPD-L1를 잘 발현하는 세포주를 선별 및 저장하였다.
이때, 비교군으로 αCEA-hyFc 융합단백질 이량체, αCEA-hyFc-IL2v 융합단백질 이량체, αPDL1-hyFc-IL2v 융합단백질 이량체를 사용하였다.
구체적으로, C4 세포주를 5×105 개의 세포수로 분주한 후, 각각의 융합단백질 이량체를 12,000 ng/㎖에서 2배씩 희석하면서 농도별로 희석해서 처리하고 4℃ 온도에서 30분 동안 배양하였다. 그 후, FACS assay 버퍼로 세척한 후, 2차 항체인 PE-anti-human IgG antibody(Biolegend, Cat.No. 490304)를 각 샘플당 100 ㎕의 FACS assay 버퍼에 1.5 ㎕씩 처리하여 4℃ 온도에서 30분 동안 배양하였다. FACS assay 버퍼로 세척한 후, FACS 튜브로 옮겨 담아 FACS 분석을 진행하였다.
그 결과, αCEA-αPDL1-hyFc-IL2v 융합단백질 이량체는 단백질 분자량이 약 250 kDa임에도 불구하고 EC50 값이 약 2.6nM로 높음 결합력을 가지고 있는 것을 확인하였다(도 5).
실시예 6. αCEA-αPDL1-hyFc-IL2v 융합단백질 이량체의 PD-1/PD-L1 결합 저해 효과 확인: in vivo
αCEA-αPDL1-hyFc-IL2v 융합단백질 이량체가 PD-1/PD-L1 결합을 저해하는지 확인하였다. 이때, 비교군으로 αCEA-hyFc 융합단백질 이량체, αCEA-hyFc-IL2v 융합단백질 이량체, αPDL1-hyFc-IL2v 융합단백질 이량체를 사용하였다.
αCEA-αPDL1-hyFc-IL2v 융합단백질 이량체의 PD-1/PD-L1 결합 저해 효과를 확인하기 위해, PD-1 Effector Cells(Promega, Cat.No. J115A)과 PD-L1-aAPC/CHO-K1 cells(Promega, Cat.No. J109A)을 동시 배양하였다. 이 경우, 두 세포가 발현하는 PD-1/PD-L1 결합에 의해 TCR 신호가 차단된다. 상기 두 세포에 αCEA-αPDL1-hyFc-IL2v 융합단백질 이량체를 처리한 후, NFAT-Luc 형광 신호를 형광현미경을 이용하여 검출하였다. 상기 두 세포에 αCEA-αPDL1-hyFc-IL2v 융합단백질 이량체를 처리해줄 경우, PD-1/PD-L1 결합이 저해되면서 TCR 신호가 전달되어 하위 NFAT-Luc 신호가 활성화 될 수 있다.
이와 같은 방법을 통해 확인한 결과, αCEA-αPDL1-hyFc-IL2v 융합단백질 이량체의 EC50 값이 약 4.5 nM을 갖는 것을 확인하였다(도 6).
실시예 7. αCEA-αPDL1-hyFc-IL2v 융합단백질 이량체의 면역세포 증식효과 확인: in vitro
αCEA-αPDL1-hyFc-IL2v 융합단백질 이량체의 면역세포를 증식시키는지 확인하기 위해, 면역세포에 αCEA-αPDL1-hyFc-IL2v 융합단백질 이량체를 처리한 후, 각 면역세포의 증식률을 비교하였다. 이때, 재조합 IL-2(rhIL-2, Proleukin® Novartis, Cat.No. 653601261)를 처리한 그룹을 비교군으로 설정하였다.
구체적으로, 인간 유래의 말초혈액 단핵세포(peripheral blood mononuclear cell, PBMC)를 2×105 세포수로 분주한 후, 2.5 mM 농도의 Cell TraceTM violet을 이용하여 염색하였다. 그 후, 항-CD3 항체 자극과 함께 αCEA-αPDL1-hyFc-IL2v 융합단백질 이량체를 105.26 nM 농도에서부터 3배씩 희석하여 처리한 후, 5일 동안 배양하였다. 그 후, CD4+ T세포, CD8+ T세포, NK세포, 조절 T세포을 확인할 수 있는 FACS 항체로 염색하여 분석을 진행하였다.
구체적으로, 5일 동안 배양한 세포를 FACS assay 버퍼로 세척한 후 CD4+ T세포, CD8+ T세포, NK세포, 조절 T세포을 확인할 수 있는 FACS 항체()(PerCP/Cyanine5.5 anti-human CD3 Antibody (Biolegend, Cat.No. 300430), Brilliant Violet 650™ anti-human CD4 Antibody (Biolegend, Cat.No. 300536), Brilliant Violet 605™ anti-human CD8a Antibody (Biolegend, Cat.No. 301040), BV786 Mouse Anti-Human CD56 (BD Biosciences, Cat.No. 564058), (1) PE anti-mouse/rat/human FOXP3 Antibody (Biolegend, Cat.No. 320008))로 4℃ 온도에서 30분 동안 반응시킨 후, 2차 항체인 PE-anti-human IgG antibody(Biolegend, Cat.No. 490304)를 각 샘플당 100 ㎕의 FACS assay 버퍼에 1.5 ㎕씩 처리하여 4℃ 온도에서 30분 동안 반응시켰다. 그 후, FACS assay 버퍼로 세척한 후, FACS 튜브로 옮겨 담아 분석하였다.
그 결과, αCEA-αPDL1-hyFc-IL2v 융합단백질 이량체에 의한 NK세포와 CD8+ T세포의 증식률이 농도 의존적으로 증가하는 것을 확인하였다. 또한, 조절 T세포 (Treg)의 증식률은 재조합 IL-2 대비 αCEA-αPDL1-hyFc-IL2v 융합단백질 이량체에서 현저하게 감소한 것을 확인하였다(도 7). 이를 통해 αCEA-αPDL1-hyFc-IL2v 융합단백질 이량체가 종양을 사멸 시키는데 중요한 NK세포와 CD8+ T세포의 증식을 재조합 IL-2와 유사한 수준의 증가시키고, Treg의 경우 현저히 낮은 증식을 유도함으로써 재조합 IL-2보다 항암 효능이 우수한 것을 확인하였다.
실시예 8. αCEA-αPDL1-hyFc-IL2v 융합단백질 이량체의 면역세포 활성화 효과 확인: in vitro
αCEA-αPDL1-hyFcRn-IL2v 융합단백질 이량체의 면역세포 활성화 효과를 확인하기 위해, αCEA-αPDL1-hyFcRn-IL2v 융합단백질 이량체를 면역세포에 처리한 후, 면역세포에 의해 사멸한 종양세포 양을 통해 확인하였다. 사멸된 종양세포는 사멸된 세포의 DNA에 끼어들어 염색되는 7AAD+ 세포를 확인하는 방법과 죽은 세포에서 나오는 LDH의 양을 측정하는 방법을 통해 측정하였다. 인간 유래의 PBMC에 αCEA-αPDL1-hyFcRn-IL2v 융합단백질 이량체를 농도별로 처리하여 활성화시킨 후, 종양세포와 20:1 비율로 배양하였다. 이때, 재조합 IL-2(rhIL-2)를 처리한 그룹을 비교군으로 설정하였다.
먼저, 7-AAD+ 세포를 확인하기 위해, 인간 PBMC(Effector cell)와 종양세포(Target cell)를 각각 5:1, 20:1, 80:1의 비율(E:T)로 섞어 주고, 4시간 동안 37℃ 5% CO2 조건에서 배양하였다. 그 후, FACS assay 버퍼를 이용하여 세척한 후, FACS 분석 30분 전에 7-AAD(1000X stock) 용액을 1:1000으로 희석하여 세포에 처리하고 FACS 분석을 진행하였다.
또한, 죽은 세포에서 나오는 LDH의 양을 측정하기 위해, 인간 PBMC(Effector cell)와 종양세포(Target cell)를 각각 5:1, 20:1, 80:1의 비율(E:T)로 섞어 주고, 4시간 동안 37℃ 5% CO2 조건에서 배양하였다. 그 후, 세포 배양액으로부터 상청액을 수득하여 LDH measure reaction mixture(250 ㎕ 촉매제, 11.25 ㎖ 염료)를 각 웰당 100 ㎕씩 처리하고, 실온에서 30분 동안 차광하며 배양하였다. 그 후, 마이크로플레이트 리더(microplate reader)를 이용해 490 nm 내지 492 nm 및 620 nm 파장에서 흡광도를 측정하였다.
종양세포의 사멸정도를 확인한 결과, αCEA-αPDL1-hyFcRn-IL2v 융합단백질 이량체를 처리한 군의 종양세포 사멸정도는 농도에 비례하여 증가하였으며, 재조합 IL-2에 상응하는 면역세포 활성화 효과를 나타내는 것을 확인하였다(도 8).
실시예 9. CEA-αPDL1-hyFc-IL2v 융합단백질 이량체의 체내 반감기 확인
αCEA-αPDL1-hyFcRn-IL2v 융합단백질 이량체의 체내 흡수, 분포, 대사 및 배설의 패턴을 확인하고자, PK 분석을 진행하였다.
구체적으로, 8주령의 수컷 SD 래트에 αCEA-αPDL1-hyFc-IL2v 융합단백질 이량체를 1 ㎎/㎏으로 피하 투여하여 시간 별로 채혈하여 혈중의 αCEA-αPDL1-hyFc-IL2v 융합단백질의 농도를 ELISA를 통해 확인하였다.
Anti-human IgG Fc 항체를 ELISA 플레이트에 4℃온도에서 하룻밤 또는 25℃ 온도에서 2시간 동안 코팅한 후, 블로킹 버퍼(2.5% skim milk, 1% BSA in PBS)를 처리하고 25℃ 온도에서 1시간 동안 블로킹 과정을 진행하였다. 그 후, 적절한 농도로 희석한 교정 표준기(calibration standard)와 QC, 래트 혈청 시료를 각 웰에 로딩(loading)하고 37℃ 온도에서 1시간 동안 배양하였다.
Anti-human IgG Fc-HRP 항체(Abcam, ab97225)를 처리하고 25℃ 온도에서 30분 동안 반응시켰다. 그 후, TMB 기질(substrate) 넣어 발색 반응을 일으킨 후, 0.2 N H2SO4 용액을 처리하여 반응 정지시키고 450 nm 파장에서 흡광도를 측정하였다. 이때, 교정 표준기의 농도에 대한 흡광도를 4-parameter logistics 회귀방정식으로 그래프를 얻어 각 시료의 농도를 산출하였다.
그 결과, αCEA-αPDL1-hyFc-IL2v 융합단백질 이량체의 반감기가 재조합 IL-2의 반감기인 7분보다 현저히 증가된 7.2시간으로 확인되었다(도 9).
실시예 10. αCEA-αPDL1-hyFc-IL2v 융합단백질 이량체의 체내 축적량 확인
단일 또는 이중 특이적인 항체 대비 삼중 특이적인 융합단백질을 제작한 이유는 단일 또는 이중 특이적인 항체가 가지는 단점을 보안하고 안전하게 약물을 사용하기 위한 것이다. 이를 확인하기 위해, 고형암 동물 모델에서 αCEA-αPDL1-hyFc-IL2v 융합단백질 이량체를 투여한 후, 어떤 조직에 축적되는지 확인하였다. 이때, 비교군으로 hyFc-IL2v 융합단백질 이량체 및 hyFc-IL2wt 융합단백질 이량체를 사용하였다.
먼저, 각 융합단백질 이량체에 염료를 표지하기 위해, 각 융합단백질 이량체를 amine-containing chemical이 함유되지 않은 버퍼에 준비하고, DMSO에 녹인 CF™750 염료를 처리한 후, 상온에서 1시간 가량 천천히 흔들어 반응시켰다. 그 후, 원심분리를 통해 결합하지 않은 염료를 제거하고 염료가 표지된 각 융합단백질을 원하는 농도에 맞게 PBS를 희석하여 사용하였다. 이때, 반응의 수득률은 280 nm 파장과 CF™750의 최대 흡광 파장인 755 nm 파장에서 흡광도를 측정하여 확인하였다.
구체적으로, 8주령의 수컷 SD 래트에 C4 세포주를 이식하여 고형암 유발 마우스를 제조하였다. 고형함 유발 마우스에 hyFc-IL2v 융합단백질 이량체, hyFc-IL2wt 융합단백질 이량체 또는 αCEA-αPDL1-hyFc-IL2v 융합단백질 이량체를 염색한 후, 1 ㎎/㎏으로 단회 피하 투여하였다. 2일 후에 고형암 유발 마우스를 희생시켜 각 조직에 축적된 융합단백질 이량체의 양을 비교하였다.
그 결과, 도 10에 나타난 바와 같이, αCEA-αPDL1-hyFc-IL2v 융합단백질 이량체가 종양조직(C4)에 축적되었고 폐, 간, 신장 및 비장에 축적되는 정도는 비교군 대비 축적량이 적은 것을 확인하였다(도 10). 이를 통해, αCEA-αPDL1-hyFc-IL2v 융합단백질 이량체가 폐, 간, 비장으로 축적됨으로써 나타날 수 있는 독성을 낮출 수 있음을 확인하였다.
실시예 11. αCEA-αPDL1-hyFc-IL2v 융합단백질 이랑체에 의한 체내 면역세포 활성화 확인
C57BL/6 마우스에 상기 실시예 5에서 제작한 인간유래 CEA 및 PD-L1를 발현하는 C4 세포주를 이식하여 고형암 유발 마우스를 제조하였다. 상기 고형암 유발 마우스에 αCEA-αPDL1-hyFc-IL2v 융합단백질 이량체를 5 ㎎/㎏으로 피하 투여하였다. 0, 1일, 3일, 5일, 7일 및 9일째에 고형암 유발 마우스의 각 조직을 분리하여, 조직 내 면역세포를 유세포 분석기를 통해 분석하였다.
그 결과, NK 세포는 혈액과 비장에서 αCEA-αPDL1-hyFc-IL2v 융합단백질 이량체 주입 약 5일후에 가장 많은 증가를 보이다 감소하였으며, 종양 조직에서는 3일째에 가장 많은 증가를 보였으며 5일째까지 지속되다 감소하였다. 반면, CD8+ T세포는 혈액과 비장에서 5일째에 가장 많은 증가를 보였으며, 이후 천천히 감소하였고, 종양 조직에서는 9일째까지 증가된 상태로 지속되는 것을 확인하였다. Treg의 경우도 3일째 증가를 보였으나 유의미한 결과는 아니였다(도 11).
실시예 12. 고형암 유발 마우스를 이용한 αCEA-αPDL1-hyFc-IL2v 융합단백질 이량체의 항암 효과 확인
고형암 유발 마우스를 이용하여 αCEA-αPDL1-hyFc-IL2v 융합단백질 이량체의 항암 효과를 확인하였다. 구체적으로 5x105 세포수의 상기 실시예 5에서 제작한 인간유래 CEA 및 PD-L1를 발현하는 C4 세포주를 마우스의 오른쪽 옆구리에 이식한 후, αCEA-αPDL1-hyFc-IL2v 융합단백질 이량체를 5 mg/kg으로 1회 피하 주사한 그룹과 주 1회씩 2회 반복한 그룹의 시간에 따른 종양의 크기 및 절대 림프구 수를 측정하였다. 이때, PBS를 투여한 그룹을 음성 대조군으로 설정하였다.
그 결과, 음성 대조군 대비 αCEA-αPDL1-hyFc-IL2v 융합단백질 이량체를 투여한 그룹의 종양의 크기가 감소하였으며, 특히 반복 투여한 그룹의 종양 크기가 현저하게 감소하였다. 또한, 음성 대조군 대비 αCEA-αPDL1-hyFc-IL2v 융합단백질 이량체를 투여한 그룹의 절대 림프구 수가 증가하는 것을 확인하였다(도 12). 이를 통해, αCEA-αPDL1-hyFc-IL2v 융합단백질 이량체가 우수한 항암효과를 나타내는 것을 확인하였다.
<110> Genexine, Inc. <120> FUSION PROTEIN COMPRISING ANTI-TUMOR-ASSOCIATED ANTIGEN ANTIBODY, ANTI-PD-L1 ANTIBODY AND IL-2 AND USES THEREOF <130> FPD/201911-0092 <160> 17 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 240 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> anti-CEA antibody of scFv <400> 1 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ser Ala Ser Gly Phe Asp Phe Thr Thr Tyr 20 25 30 Trp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Glu Ile His Pro Asp Ser Ser Thr Ile Asn Tyr Ala Pro Ser Leu 50 55 60 Lys Asp Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Phe 65 70 75 80 Leu Gln Met Asp Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Gly Val Tyr Phe Cys 85 90 95 Ala Ser Leu Tyr Phe Gly Phe Pro Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly 100 105 110 Thr Pro Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly 115 120 125 Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser 130 135 140 Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser 145 150 155 160 Gln Asp Val Gly Thr Ser Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys 165 170 175 Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Thr Ser Thr Arg His Thr Gly Val 180 185 190 Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr 195 200 205 Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln 210 215 220 Tyr Ser Leu Tyr Arg Ser Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 225 230 235 240 <210> 2 <211> 241 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> anti-PD-L1 antibody of scFv <400> 2 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Asp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Ser Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Thr Ile Ser Asp Ala Gly Gly Tyr Ile Tyr Tyr Ser Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Ile Cys 85 90 95 Ala Arg Glu Phe Gly Lys Arg Tyr Ala Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly 100 105 110 Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly 115 120 125 Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser 130 135 140 Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser 145 150 155 160 Gln Asp Val Thr Pro Ala Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys 165 170 175 Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ser Thr Ser Ser Arg Tyr Thr Gly Val 180 185 190 Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr 195 200 205 Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln 210 215 220 His Tyr Thr Thr Pro Leu Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile 225 230 235 240 Lys <210> 3 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> linker 1 (L1) <400> 3 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly 1 5 10 15 Gly Gly Gly Ser 20 <210> 4 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> IgG1 hinge <400> 4 Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro 1 5 10 15 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Glu Leu Pro Leu Ala His 225 230 235 240 Pro Pro Asn Glu Arg Thr His Leu Val Ile Leu Gly Ala Ile Leu Leu 245 250 255 Cys Leu Gly Val Ala Leu Thr Phe Ile Phe 260 265

Claims (16)

  1. 하기 구조식 1의 융합단백질로서,
    [구조식 1]
    N′-A-L1-B-L2-C-L3-D-C′
    상기 N′은 융합단백질의 N-말단이고,
    상기 C′는 융합단백질의 C-말단이며,
    상기 A는 종양 관련 항원(tumor-associated antigen)에 특이적으로 결합하는 항체의 scFv(Single-chain variable fragment)이고,
    상기 B는 PD-L1(Programmed death-ligand 1)에 특이적으로 결합하는 항체의 scFv이며,
    상기 C는 면역글로불린의 Fc 도메인, 이의 단편 또는 이의 변이체이고,
    상기 D는 IL-2, 이의 단편 또는 이의 변이체이며,
    상기 L1, L2 및 L3는 각각 펩타이드 링커인 융합단백질로,
    상기 A는 CEA에 특이적으로 결합하는 항체의 scFv이며,
    상기 융합단백질은 서열번호 15로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 것인, 융합단백질.
  2. 삭제
  3. 삭제
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  12. 삭제
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  14. 제1항의 융합단백질 2개가 결합된 융합단백질 이량체.
  15. 삭제
  16. 삭제
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