ES2880310T3 - Composición y método para estabilizar ácidos nucleicos en muestras biológicas - Google Patents

Abstract

Un método para estabilizar el ácido nucleico contenido en una muestra biológica a la temperatura ambiental que comprende las etapas de: a) poner en contacto una muestra biológica, tal como una muestra fecal, una muestra de suelo, una muestra de aguas residuales domésticas, una muestra de aguas residuales o una muestra de agua, con una composición acuosa que comprende un agente quelante, en donde el agente quelante está presente a una concentración de al menos aproximadamente 150 mM, y en donde la composición tiene un pH de al menos 9,5, para formar una mezcla; b) homogeneizar la mezcla de (a) para formar una mezcla homogénea; y c) almacenar la mezcla homogénea a la temperatura ambiental.

Description

DESCRIPCIÓN

Composición y método para estabilizar ácidos nucleicos en muestras biológicas

Campo de la invención

La presente solicitud pertenece al campo de la estabilización de ácidos nucleicos en muestras biológicas. Más particularmente, la presente invención se relaciona con métodos y composiciones para estabilizar el ácido desoxirribonucleico (DNA) tanto humano como microbiano presentes en muestras biológicas complejas, tales como las heces.

Antecedentes

Las heces se han clasificado durante mucho tiempo como un producto de desecho potencialmente infeccioso del tracto digestivo de un animal que se obtienen para evaluar los parásitos, como lombrices intestinales y/o sus huevos, o para detectar bacterias y hongos patógenos en animales y seres humanos sintomáticos. Sin embargo, recientemente, con el auge de la medicina personalizada y la comercialización a gran escala de pre y probióticos, el valor diagnóstico y, en particular, pronóstico de este producto "de desecho" ha aumentado. Se ha demostrado que simplemente un cambio en el hábito dietético influye en la microbiota o la composición de la comunidad microbiana en las heces (Walker y otros, 2011; Wu y otros, 2011) lo que, a su vez, puede afectar la salud y reducir la incidencia de ciertas enfermedades.

La colonización del tracto gastrointestinal (GI) comienza al nacer, y la comunidad microbiana que se desarrolla con el tiempo se conforma por muchas influencias, que incluyen la información genética del individuo, la edad, el sexo, la nutrición, el uso de antibióticos y otros fármacos que se consumen, el estado patológico, el estilo de vida, la ubicación geográfica/medio ambiente, la exposición a sustancias químicas, las intervenciones quirúrgicas y más. Una comunidad microbiana diversa coloniza el intestino que consiste en aproximadamente 100 billones de bacterias que desempeñan un papel importante en la salud humana, en particular, la digestión de los alimentos, el metabolismo energético del huésped, la síntesis de vitaminas esenciales, la maduración del epitelio, la degradación de las sales biliares, el metabolismo de los fármacos y carcinógenos dietéticos, así como también de proteger al intestino de la colonización de patógenos.

El 'microbioma intestinal' es el término dado para describir esta vasta colección de microorganismos simbióticos en el sistema GI humano y sus genomas que interactúan colectivamente. Sin embargo, la comprensión de estas interacciones funcionales entre la microbiota intestinal y la fisiología del huésped está en sus inicios. El Proyecto del microbioma humano reveló que el microbioma intestinal es aproximadamente 150 veces más grande que el genoma humano, y consiste en entre 300 y 1000 especies bacterianas y más de 7000 cepas. En la mayoría de los mamíferos, cuatro filos bacterianos predominan en el microbioma intestinal: Firmicutes, Bacteroidetes, Actinobacteria y Proteobacteria (Ley y otros, 2007). Una nueva área de trabajo se relaciona con el análisis de la interacción del microbioma intestinal con parásitos intestinales, virus, levaduras y numerosos hongos, tales como Candida, Saccharomyces, Aspergillus y Penicillium. Algunos expertos sugieren que la información total codificada por el genoma humano por sí sola no es suficiente para llevar a cabo todas las funciones biológicas del cuerpo (Lee y Mazmanian, 2010) y señalan a la simbiosis entre bacterias y humanos como una explicación. Dado que solo aproximadamente el 10 por ciento de las células de un ser humano son realmente humanas, y los microbios constituyen el 90 por ciento restante, puede pensarse en los humanos como huésped de nuestros microbios invitados o superorganismos.

Durante muchas décadas, los microbios intestinales han sido implicados en el inicio del cáncer de colon (Aries y otros, 1969; Moore y Moore, 1995). Más recientemente, la infección por Helicobacterpylori se identificó como una de las principales causas de cáncer gástrico (de estómago), linfoma gástrico y úlcera péptica (Parsonnet y otros, 1991). Sin embargo, resulta que los microbios intestinales tienen más influencia de lo que conocemos, en cómo nos sentimos y nos comportamos. Debido a la creciente evidencia de que existe comunicación entre el intestino y el cerebro, el intestino se denomina el "segundo cerebro". La evidencia sugiere que numerosas enfermedades, tales como enfermedades cardiovasculares, diabetes, estrés/ansiedad, autismo, enfermedad de Crohn, enfermedad del colon irritable (IBD), trastornos alérgicos, síndrome metabólico e inflamación neurológica pueden resultar de la desregulación del microbioma intestinal. Sin embargo, los investigadores apenas empiezan a descifrar lo que ahora se denomina 'eje microbioma-intestino-cerebro', es decir, cómo los microorganismos que colonizan el tracto GI pueden influir en las funciones biológicas más allá del intestino, en particular, los mecanismos moleculares o de comunicación mediante los cuales el microbioma intestinal tiene impacto en las enfermedades inmunológicas, endocrinas y neurológicas en su huésped (Grenham y otros, 2011; Kinross y otros, 2011). Por ejemplo, muchos microbios producen neurometabolitos que son neurotransmisores o moduladores de la neurotransmisión, incluidos GABA, noradrenalina, serotonina, dopamina y acetilcolina, que actúan directamente sobre las terminales nerviosas del intestino o a través de las células enterocromafines presentes en todo el tracto GI. Los microbios también degradan a los carbohidratos de la fibra dietética, lo que da como resultado la producción de productos químicos neuroactivos, tales como n-butirato, acetato, sulfuro de hidrógeno y propionato. Además, los microbios eliminan metabolitos, tales como proteínas, carbohidratos y otras moléculas, que pueden salir del intestino y desempeñar un papel en la señalización de enfermedades en todo el cuerpo.

Tanto en individuos sanos como enfermos, así como también identificar los cientos de especies diferentes que constituyen la comunidad microbiana intestinal, es fundamental ganar en comprensión de la funcionalidad de los consorcios de bacterias en su conjunto. Por ejemplo, la composición de la microbiota determina la competencia por los ingredientes dietéticos como sustratos de crecimiento, la conversión de azúcar en productos de fermentación inhibitoria, la producción de sustratos de crecimiento, la liberación de bacteriocinas (moléculas tóxicas para otras especies bacterianas), la estimulación del sistema inmunológico innato, la competencia contra los microbios que colonizan la pared intestinal y la función de barrera intestinal, y más. Desafortunadamente, las técnicas tradicionales de cultivo microbiológico han demostrado ser en gran parte infructuosas para ayudar a determinar la identidad y función de los miembros del microbioma intestinal, debido a limitaciones significativas que se derivan de su dependencia de nutrientes de crecimiento apropiados y de condiciones complejas para que toda la microflora intestinal crezca in vitro. Los estimados indican que solo del 20-40 % (Apajalahti y otros, 2003) de la microflora intestinal total puede cultivarse mediante técnicas de cultivo estándar, por lo que la gran mayoría de la biodiversidad microbiana se pierde en los métodos basados en el cultivo. Este factor se ve agravado por la necesidad de asegurar la viabilidad de la microflora intestinal in vitro, muchas de las cuales son anaeróbicas (O'Sullivan, 2000).

Numerosos medios de cultivo seleccionan intrínsecamente contra algunas bacterias, en particular, aquellas que requieren agentes adicionales o selectivos o bacterias en un estado fisiológico que no es propicio para cultivar directamente a partir de heces o material intestinal. Además, el examen morfológico y las pruebas bioquímicas tradicionales para identificar y caracterizar la microflora intestinal son extremadamente laboriosas, requieren mucho tiempo y carecen de precisión, lo que limita su eficacia para analizar muestras de un gran número de individuos y comparar la relación de parentesco entre especies bacterianas de diferentes individuos. Por lo tanto, los métodos rápidos para capturar y estabilizar o "tomar instantáneas" del microbioma en el punto de obtención, junto con las herramientas moleculares independientes del cultivo, tales como enfoques basados en genes de ARN ribosómico 16S, sondas TaqMan, PCR digital y LATE, y la secuenciación metagenómica, son necesarios para superar estas limitaciones y sesgos, de modo que se pueda revelar una imagen verdadera y detallada de este rico ecosistema.

En la actualidad, aproximadamente 1 de cada 20 pacientes hospitalizados contraerá una infección adquirida en el hospital (HAI). Si bien la mayoría de los tipos de HAI están disminuyendo, los brotes provocados por Clostridium difficile, un patobionto conocido, son un problema creciente que afecta a los pacientes en hospitales y centros de atención médica a largo plazo. Se cree que la infección por C. difficile (CDI) es el resultado de una disbiosis gastrointestinal, es decir, la alteración de la microbiota residente. El tratamiento con antibióticos destruye a la mayoría de las bacterias en el tracto GI que habitualmente controlan C. difficile. En este ambiente modificado, C. difficile se replica y produce toxinas que atacan el revestimiento del intestino, lo que causa síntomas que van desde la diarrea hasta la inflamación potencialmente mortal y el sangramiento del revestimiento del colon. De acuerdo con los Centros para el Control y la Prevención de Enfermedades (CDC), C. difficile por sí solo se relaciona con la muerte de 14 000 personas al año en los Estados Unidos. En los hospitales, las esporas de C. difficile que se eliminan en las heces se transfieren a los pacientes y las superficies principalmente a través de las manos del personal sanitario que ha tocado una superficie o un artículo contaminado. No se dispone de un tratamiento eficaz contra la infección recurrente por C. difficile. Paradójicamente, el tratamiento primario para la infección por C. difficile es la administración de más antibióticos y aproximadamente el 20 % de los pacientes tienen recaídas en un mes y muchos de ellos tienen crisis repetidas.

Un procedimiento alternativo poco ortodoxo, el trasplante de microbiota fecal (FMT), en el que se infunden las heces de un "donante" en los intestinos de un paciente, ha demostrado ser mucho más eficaz que los antibióticos para tratar las infecciones GI recurrentes. Tras restaurar las alteraciones del equilibrio microbiano, una infusión de heces de donantes sanos parece mantener bajo control a las bacterias dañinas, tales como C. difficile, lo que erradica la enfermedad incluso en pacientes que han sufrido episodios repetidos de infecciones debilitantes. En un estudio holandés pequeño en la Universidad de Amsterdam, 15 de 16 pacientes con infección recurrente por C. difficile se curaron con infusión duodenal de heces de donantes, en comparación con solo el 27 % de los pacientes que recibieron un tratamiento de 2 semanas con el antibiótico vancomicina (van Nood, Els y otros (2013)). Se demostró que la infusión de heces de donantes dio como resultado una mejora en la diversidad microbiana en el tracto GI del paciente y esta diversidad persistió en el tiempo. Recientemente, Song y otros (2013) confirmaron informes anteriores de que se restauró una reducción en la diversidad y riqueza de la microbiota en muestras fecales de pacientes con infección recurrente por C. difficile (RCDI) después del FMT para volverse similar a la de un donante sano. En este estudio longitudinal, el FMT afectó predominantemente a Firmicutes y Proteobacteria y la microbiota fecal continuó cambiando en pacientes después del FMT durante al menos 16 semanas.

De manera importante, el mecanismo de acción exacto responsable del éxito del FMT para tratar la RCDI sigue sin conocerse y no existe un conjunto de parámetros clínicamente validado para definir un donante adecuado o una microbiota ideal del donante. Se necesita un medio fácil y eficaz para obtener muestras de heces en el campo y tomar instantáneas del microbioma objeto de muestreo en una composición a la temperatura ambiental de un gran número de individuos, tanto donantes sanos como pacientes RCDI, en múltiples puntos de tiempo, para mapear el microbioma 'central' que se encuentra en el tracto GI de individuos sanos en una población, sobre el cual puede superponerse el microbioma cambiante de los pacientes con RCDI. En última instancia, los pacientes con RCDI en el futuro se tratarán, no con antibióticos, sino con probióticos personalizados (una preparación/suplemento que contiene bacterias vivas que se toman por vía oral para restaurar las bacterias beneficiosas al cuerpo) y prebióticos (componentes de alimentos no digeribles, como oligosacáridos, que promueven la actividad de grupos diana seleccionados de la microflora GI) o simbióticos (combinaciones sinérgicas de probióticos y prebióticos) para devolver su microbioma a un estado saludable.

Para evitar el riesgo de introducir microbios no identificados y potencialmente dañinos, algunos hospitales comienzan a construir sistemas de bancos propios. Las heces de un paciente pueden almacenarse en bancos para usarlas en el futuro como antídotos contra una posible infección con "superbichos" adquiridos en el hospital. El uso de las propias heces del paciente para el trasplante reduce en gran medida el riesgo de introducción de microbios dañinos y evita la selección de las heces de donantes no emparentados para detectar enfermedades transmisibles, lo que es costoso y requiere mucho tiempo. Desafortunadamente, parece que el "ecosistema" de ciertas personas, sin embargo, las hace más susceptibles a las enfermedades que otras. Por lo tanto, un posible inconveniente asociado con la reintroducción de las propias heces de un paciente es que solo puede proporcionar beneficios a corto plazo y no curarlos de microbios perjudiciales, como C. difficile. Con el tiempo, la investigación del microbioma puede conducir a la identificación de especies bacterianas 'centrales' o 'clave' que ayudan a definir la salud humana y después desarrollar una "bacterioterapia" personalizada, que consiste en "cócteles" bacterianos beneficiosos completamente caracterizados, para suplantar este método burdo de trasplantar heces "crudas". De hecho, ahora se han propuesto terapias con probióticos para una gran variedad de trastornos relacionados con el intestino, como la IBD y el síndrome inflamatorio del intestino. Fundamentalmente, los investigadores y clínicos que intentan caracterizar todas las especies de la microbiota de un donante, identificar marcadores de diagnóstico para predecir la susceptibilidad a la enfermedad y, en última instancia, brindar atención médica 'personalizada', deben estar seguros de que las muestras fecales que se analizan brindan una representación real o "instantánea" del microbioma del donante in vivo, no una representación "degradada" o artificial de la comunidad microbiana. Por lo tanto, es fundamental contar con un medio eficaz para capturar y estabilizar o tomar instantáneas del microbioma de las heces en el punto de obtención.

El cáncer colorrectal (CCR) tiene las tasas de mortalidad por cáncer más altas en Europa y Estados Unidos. Se conoce que el CCR es altamente curable (> 90 %) si se detecta en sus primeras etapas, lo que hace que la selección precoz del cáncer sea una herramienta valiosa. A lo largo de los años, se han ideado varios métodos de examen sensibles para detectar el cáncer, tales como el enema de bario de doble contraste, la colonoscopia y la sigmoidoscopia flexible. Sin embargo, los costos financieros, la infraestructura y los requisitos de mano de obra asociados con estos procedimientos presentan obstáculos formidables, sin mencionar que son incómodos e invasivos para el paciente. Además de los costos, la naturaleza de bajo rendimiento de estos métodos de examen impide su implementación para la selección primaria en todo el país.

Actualmente, otro método para seleccionar el cáncer colorrectal es la prueba de sangre oculta en heces (FOBT). Esta prueba detecta la presencia de hemoglobina en muestras de heces para determinar la presencia o ausencia de sangrado en el tracto GI, como un predictor indirecto de CCR. Si bien esta prueba no es costosa, su sensibilidad y valor predictivo positivo es muy bajo y la incidencia de falsos positivos es alta. Por lo tanto, un método sensible, confiable, rentable y escalable es de gran necesidad tanto para el diagnóstico de la enfermedad en individuos en riesgo y/o sintomáticos, así como también para la selección de diagnóstico de rutina de la población asintomática. Idealmente, una persona obtendría y estabilizaría rutinariamente una porción de sus heces en la privacidad de su hogar y después la enviaría por correo a un centro de pruebas para que se seleccionen en busca de CRC y otras enfermedades.

Ya se acepta que la detección y el examen directos de las células tumorales desprendidas en la luz del colon y recuperadas de las heces es un predictor más positivo de cáncer colorrectal que la sangre oculta. Sin embargo, el ADN humano "diana" o mutante, indicativo de cáncer u otras enfermedades, habitualmente está presente en la muestra biológica con una frecuencia baja (por ejemplo, 1 % del ADN humano total para el CRC) frecuentemente en un contexto elevado de ADN de tipo salvaje (por ejemplo, ADN bacteriano y ADN humano de células normales del colon) y expuestos a ADNasas humanas endógenas (por ejemplo, desoxirribonucleasa I) y/o nucleasas bacterianas (por ejemplo, nucleasa microcócica). En esta muestra compleja, el poco ADN humano "diana" que existe en una muestra fecal puede degradarse rápidamente por nucleasas y condiciones ambientales antes de que llegue al laboratorio y afecta negativamente la sensibilidad clínica de las pruebas de diagnóstico. Adicionalmente a la abundancia de nucleasas, las bacterias anaeróbicas, que constituyen más del 99 % de las bacterias en el intestino, quedan expuestas al aire tan pronto como se eliminan las heces del tracto digestivo. El aire, específicamente el oxígeno, es un ambiente tóxico para las bacterias anaeróbicas que destruye el 50 % en 4-5 minutos y el 95-97 % de los anaerobios después de solo 20 minutos (Brusa y otros, 1989). Nuevamente, adquirir una vista representativa o "instantánea" de todo el microbioma y el ADN humano en las heces es un desafío si se considera que la mayoría de las muestras fecales se obtienen en casa, no en un laboratorio o centro de atención médica.

Es imperativo estabilizar el ácido nucleico total en las muestras biológicas de manera que no se degrade durante la manipulación, el transporte y el almacenamiento de la muestra. Para minimizar la degradación del ácido nucleico en muestras biológicas, es una práctica estándar transportar muestras enteras o porciones de estas en hielo seco (78 °C) a instalaciones de análisis centralizadas donde se descongelan y procesan inmediatamente o se mantienen congeladas en almacenamiento (-80 °C a -20 °C). Los costos, la logística y la infraestructura necesarios para garantizar que las muestras obtenidas se congelen de inmediato, se mantengan congeladas durante el transporte a las instalaciones de análisis y se almacenen en condiciones óptimas antes del análisis, plantean desafíos y riesgos importantes, especialmente en aplicaciones de selección basadas en la población y a gran escala. Puede ser aún más desafiante proporcionar muestras 'representativas' para el análisis de muestras descentralizado y aun así conservar la máxima integridad de la muestra. Es muy deseable desarrollar una composición y un método de manipulación de muestras más robusto y estandarizado que capture y mantenga una representación fiel del perfil de ácido nucleico de cada muestra.

El estudio de la relación entre el microbioma y su huésped humano en la salud y la enfermedad se basa en la identificación y el seguimiento de las comunidades microbianas durante un período de tiempo. Los descubrimientos recientes demuestran la utilidad de estos perfiles microbianos como biomarcadores con valor pronóstico y diagnóstico. Se está volviendo evidente en la literatura que, debido a la naturaleza dinámica del microbioma intestinal, el muestreo repetido de grandes poblaciones a lo largo del tiempo es esencial para el desarrollo de dichos biomarcadores. Estos estudios, conocidos como estudios de asociación en todo el microbioma (MWAS), se ven desafiados por el bajo cumplimiento de los donantes, la obtención de muestras biológicas por sí mismos poco confiable, los procedimientos de envío y manipulación costosos y engorrosos.

Los métodos actuales para el muestreo de las heces y el análisis de la microbiota implican el transporte de las muestras en condiciones que tienen el potencial de exponer las muestras a temperaturas incompatibles con la estabilización del microbioma. Si no se estabiliza adecuadamente el microbioma durante la obtención, el transporte, el procesamiento y el análisis de las muestras, se corre el riesgo de ocultar el significado biológico y clínico del perfil del microbioma. En consecuencia, son necesarios procedimientos preanalíticos adecuados para garantizar la mejor representación posible del perfil del microbioma in vivo.

Existe una necesidad de composiciones y métodos para estabilizar ácidos nucleicos, en particular ADN tanto humano como microbiano, en muestras biológicas complejas tales como heces, durante el transporte y almacenamiento a la temperatura ambiental.

El documento WO 2012/018639 se refiere a composiciones para estabilizar ADN, ARN y proteínas en saliva y otras muestras biológicas durante el transporte y almacenamiento a la temperatura ambiental.

Esta información de antecedentes se proporciona con el propósito de dar a conocer información que el solicitante cree que sea relevante para la presente invención. No se pretende admitir necesariamente, ni se debe interpretar, que cualquier información anterior forma parte del estado de la técnica con respecto a la presente invención.

Resumen de la invención

La presente invención se define por las reivindicaciones.

Un objeto de la presente invención es proporcionar una composición, un método y un kit para estabilizar el ácido nucleico contenido en una muestra biológica a la temperatura ambiental.

En un aspecto, se proporciona un método para estabilizar el ácido nucleico contenido en una muestra biológica a la temperatura ambiental que comprende las etapas de: a) obtener una muestra biológica; b) poner en contacto la muestra biológica con una composición acuosa que comprende un agente quelante, en donde el agente quelante está presente a una concentración de al menos aproximadamente 150 mM y en donde la composición tiene un pH de al menos aproximadamente 9,5, para formar una mezcla; c) homogeneizar la mezcla de (b) para formar una mezcla homogénea; y d) almacenar la mezcla homogénea a la temperatura ambiental.

En otro aspecto, se proporciona una composición acuosa para estabilizar el ácido nucleico contenido en una muestra biológica a la temperatura ambiental, que comprende un agente quelante en donde el agente quelante está presente a una concentración de al menos aproximadamente 150 mM, en donde la composición tiene un pH de al menos aproximadamente 9,5

Aún en otro aspecto, se proporciona un kit para estabilizar el ácido nucleico contenido en una muestra biológica a la temperatura ambiental, cuyo kit comprende: a) un recipiente de muestras que tiene un cierre resellable; b) una composición acuosa que comprende un agente quelante en donde el agente quelante está presente a una concentración de al menos aproximadamente 150 mM, en donde la composición tiene un pH de al menos aproximadamente 9,5, en donde dicha composición está contenida opcionalmente dentro del recipiente de la muestra; c) un medio de homogeneización, contenido opcionalmente dentro del recipiente de la muestra; d) un medio para transferir la muestra biológica, o una porción de esta, al recipiente de la muestra; y d) las instrucciones de uso.

En una modalidad, el ácido nucleico es ácido desoxirribonucleico (ADN).

En otra modalidad, la muestra biológica se selecciona de una muestra fecal, una muestra de suelo, una muestra de aguas residuales domésticas, una muestra de aguas residuales o una muestra de agua. En otra modalidad, la muestra biológica es una muestra fecal. En otra modalidad, la muestra fecal se obtiene de un mamífero. Todavía en otra modalidad, el mamífero es un ser humano.

En otra modalidad, el agente quelante se selecciona de ácido 1,2-ciclohexanodiaminotetraacético (CDTA), ácido dietilentriaminopentaacético (DTPA), ácido tetraazaciclododecanotetraacético (DOTA), ácido tetraazaciclotetradecanotetraacético (TETA), desferioximina o análogos quelantes de estos. En otra modalidad, el agente quelante es CDTA.

En otra modalidad, la concentración del agente quelante es de aproximadamente 150 mM a aproximadamente 500 mM o de aproximadamente 250 mM a aproximadamente 350 mM. Aún en otra modalidad, la concentración del agente quelante es aproximadamente 300 mM.

Todavía en otra modalidad, la composición tiene un pH de aproximadamente 9,5 a aproximadamente 11,5 o de aproximadamente 10,5 a aproximadamente 11,5. En otra modalidad, la composición tiene un pH de aproximadamente 11.

Aún en otra modalidad más, la composición comprende además al menos un agente tamponante capaz de tamponar en el intervalo de pH de 9,5 a 11,5. En otra modalidad, el agente tamponante es beta-alanina.

Aún en otra modalidad, la composición comprende además un solvente orgánico soluble en agua, tal como un alcanol C1-C6. En otra modalidad, el solvente orgánico soluble en agua es etanol. Todavía en otra modalidad, el etanol está presente en la composición a una concentración de menos de aproximadamente el 30 % en volumen. Aún en otra modalidad más, el etanol está presente en la composición a una concentración de menos de aproximadamente el 24 % en volumen.

En otra modalidad, la composición comprende además un detergente, tal como dodecilsulfato de sodio. Todavía en otra modalidad, la composición comprende además un agente antiespumante, tal como Antiespumante A. Aún en otra modalidad más, la composición comprende además un agente antimicrobiano, tal como triclosán o proclin. Todavía en otra modalidad, el ácido nucleico es ADN microbiano.

Aún en otra modalidad, el ácido nucleico es ADN microbiano y el método estabiliza un perfil del microbioma de la muestra biológica. Todavía en otra modalidad, el método hace que el perfil del microbioma de la muestra biológica sea estable durante al menos 7 días, al menos 14 días, al menos 30 días o al menos 60 días a la temperatura del local; al menos 7 días, o al menos 14 días a una temperatura de aproximadamente 37 °C a aproximadamente 50 °C; y/o al menos 30 días a -20 °C.

Aún en otra modalidad, el ácido nucleico es ADN microbiano y la composición/kit es para estabilizar un perfil del microbioma de la muestra biológica.

Aún en otra modalidad, el ácido nucleico es ADN humano. Todavía en otra modalidad, el método hace que el ADN humano sea estable durante: al menos 7 días, al menos 14 días, al menos 30 días o al menos 60 días a la temperatura del local; al menos 7 días, o al menos 14 días a una temperatura de aproximadamente 37 °C a aproximadamente 50 °C; y/o al menos 30 días a -20 °C.

Aún en otra modalidad más, el método comprende homogeneizar la mezcla de la muestra biológica y la composición acuosa mediante el uso de un medio de homogeneización.

En otra modalidad, el medio de homogeneización del método y el kit descritos anteriormente es al menos una bola mezcladora. Todavía en otra modalidad, la al menos una bola mezcladora es una bola mezcladora de acero inoxidable o una bola mezcladora de carburo de tungsteno. Aún en otra modalidad, la al menos una bola mezcladora es una bola mezcladora de acero inoxidable que tiene un diámetro de alrededor de 5,6-11,1 mm y una densidad de al menos aproximadamente 7,6 g/cm3. Aún en otra modalidad más, la bola mezcladora de acero inoxidable tiene un diámetro de aproximadamente 7,1-8,7 mm y el recipiente de muestras es un tubo de fondo redondo que tiene un diámetro interno de aproximadamente 12,9 mm.

En otra modalidad, el método comprende formar la mezcla de la muestra biológica y la composición acuosa en un recipiente de muestras que contiene al menos una bola mezcladora, sellar el recipiente de muestras y homogeneizar la mezcla mediante agitación de la mezcla en presencia de al menos una bola mezcladora. Todavía en otra modalidad, la agitación se realiza manualmente.

En otras modalidades, estabilizar el ácido nucleico comprende preservar la abundancia relativa del ácido nucleico contenido en la muestra biológica durante el almacenamiento a la temperatura ambiental.

Aún en otra modalidad, se proporciona un método para estabilizar el ADN contenido en una muestra fecal a la temperatura ambiental que comprende las etapas de: a) obtener una muestra fecal de un mamífero; b) poner en contacto la muestra fecal con una composición acuosa que tiene un pH de aproximadamente 10,5 a aproximadamente 11,5 y en donde la composición comprende, consiste esencialmente en, o consiste en: CDTA en una cantidad de aproximadamente 250 mM a aproximadamente 350 mM; (3-alanina en una cantidad de aproximadamente 30 mM a aproximadamente 70 mM; etanol en una cantidad de aproximadamente 21,5 % a aproximadamente 23,5 % en volumen; dodecilsulfato de sodio en una cantidad de aproximadamente 0 a aproximadamente 1 % (p/v); y Antiespumante A en una cantidad de aproximadamente 0 a aproximadamente 0,2 % (v/v); c) homogeneizar la mezcla de (b) para formar una mezcla homogénea; y d) almacenar la mezcla homogénea a la temperatura ambiental. Todavía en otra modalidad, la composición acuosa tiene un pH de aproximadamente 11 y comprende, consiste esencialmente en, o consiste en: CDTA en una cantidad de aproximadamente 300 mM; |3-alanina en una cantidad de aproximadamente 50 mM; etanol en una cantidad de aproximadamente el 23,5 % en volumen; dodecilsulfato de sodio en una cantidad de aproximadamente 0,5 % (p/v); y Antiespumante A en una cantidad de aproximadamente 0,1 % (v/v). Todavía en otra modalidad, el método comprende formar la mezcla de la muestra fecal y la composición acuosa en un tubo de fondo redondo que tiene un diámetro interno de aproximadamente 12,9 mm y que contiene al menos una bola mezcladora de acero inoxidable que tiene un diámetro de aproximadamente 5,6-11,1 mm y una densidad de al menos aproximadamente 7,6 g/cm3, sellar el tubo de fondo redondo y homogeneizar la mezcla mediante agitación de la mezcla manualmente en presencia de la al menos una bola mezcladora de acero inoxidable. En otra modalidad, el ADN es ADN microbiano y el método estabiliza un perfil del microbioma de la muestra fecal.

Aún en otra modalidad, se proporciona una composición acuosa para estabilizar el ADN contenido en una muestra fecal a la temperatura ambiental, en donde la muestra fecal se obtiene de un mamífero, en donde la composición tiene un pH de aproximadamente 10,5 a aproximadamente 11,5 y comprende, consiste esencialmente en, o consiste en: CDTA en una cantidad de aproximadamente 250 mM a aproximadamente 350 mM; (3-alanina en una cantidad de aproximadamente 30 mM a aproximadamente 70 mM; etanol en una cantidad de aproximadamente 21,5 % a aproximadamente 23,5 % en volumen; dodecilsulfato de sodio en una cantidad de aproximadamente 0 a aproximadamente 1 % (p/v); y Antiespumante A en una cantidad de aproximadamente 0 a aproximadamente 0,2 % (v/v). Todavía en otra modalidad, la composición acuosa tiene un pH de aproximadamente 11 y comprende, consiste esencialmente en, o consiste en: CDTA en una cantidad de aproximadamente 300 mM; (3-alanina en una cantidad de aproximadamente 50 mM; etanol en una cantidad de aproximadamente el 23,5 % en volumen; dodecilsulfato de sodio en una cantidad de aproximadamente 0,5 % (p/v); y Antiespumante A en una cantidad de aproximadamente 0,1 % (v/v). En otra modalidad, el ADN es ADN microbiano y la composición es para estabilizar un perfil del microbioma de la muestra fecal.

Aún en otra modalidad más, se proporciona un kit para estabilizar el ácido nucleico contenido en una muestra biológica a la temperatura ambiental, cuyo kit comprende: a) un recipiente de muestras que tiene un cierre resellable; b) una composición acuosa que tiene un pH de aproximadamente 10,5 a aproximadamente 11,5 y que comprende, que consiste esencialmente en, o consiste en: CDTA en una cantidad de aproximadamente 250 mM a aproximadamente 350 mM; (3-alanina en una cantidad de aproximadamente 30 mM a aproximadamente 70 mM; etanol en una cantidad de aproximadamente 21,5 % a aproximadamente 23,5 % en volumen; dodecilsulfato de sodio en una cantidad de aproximadamente 0 a aproximadamente 1 % (p/v); y Antiespumante A en una cantidad de aproximadamente 0 a aproximadamente 0,2 % (v/v), en donde dicha composición está contenida opcionalmente dentro del recipiente de la muestra; c) un medio de homogeneización, contenido opcionalmente dentro del recipiente de la muestra; d) un medio para transferir la muestra biológica, o una porción de esta, al recipiente de la muestra; y d) las instrucciones de uso. En otra modalidad, la composición acuosa tiene un pH de aproximadamente 11 y comprende, consiste esencialmente en, o consiste en: CDTA en una cantidad de aproximadamente 300 mM; (3-alanina en una cantidad de aproximadamente 50 mM; etanol en una cantidad de aproximadamente el 23,5 % en volumen; dodecilsulfato de sodio en una cantidad de aproximadamente 0,5 % (p/v); y Antiespumante A en una cantidad de aproximadamente 0,1 % (v/v). Aún en otra modalidad, el ácido nucleico es ADN microbiano y el kit es para estabilizar un perfil del microbioma de la muestra biológica. Aún en otra modalidad más, el medio de homogeneización es al menos una bola mezcladora de acero inoxidable que tiene un diámetro de aproximadamente 5,6-11,1 mm y una densidad de al menos aproximadamente 7,6 g/cm3 y el recipiente de muestras es un tubo de fondo redondo que tiene un diámetro interno de aproximadamente 12,9 mm.

Breve descripción de las figuras

Para una mejor comprensión de la presente invención, así como también de otros aspectos y características adicionales de esta, se hace referencia a la siguiente descripción que se usará junto con los dibujos adjuntos, donde:

La Figura 1 representa gráficamente las diferencias en el perfil del microbioma de las muestras fecales de 2 donantes (análisis PCR-DGGE);

La Figura 2 muestra un gel de agarosa que demuestra la calidad del ADN de alto peso molecular en muestras fecales a T = 0 y después de 14 días a la temperatura del local en 1) composiciones que contienen diferentes concentraciones de CDTA (150-500 mM), 2) composiciones que contienen diferentes concentraciones de EDTA (150-500 mM), y 3) heces almacenadas sin solución estabilizadora (no estabilizadas);

La Figura 3 representa gráficamente la dependencia de la estabilidad del perfil del microbioma en la homogeneización y el pH de la muestra de la presente composición;

La Figura 4 muestra el análisis de DGGE de muestras fecales almacenadas en diversas composiciones durante 14 días a la temperatura del local;

La Figura 5 muestra el análisis de DGGE de muestras fecales almacenadas en diferentes composiciones durante 4 días a la temperatura del local;

La Figura 6 muestra un gel de agarosa que demuestra la calidad del ADN de alto peso molecular en muestras fecales almacenadas en composiciones a diferentes valores de pH durante 9 días a la temperatura del local; La Figura 7 muestra un gel de agarosa que demuestra los resultados de mezclar muestras fecales con (A) múltiples perlas de vidrio y (B) bola de acero inoxidable en la presente composición;

La Figura 8 representa geles de agarosa que muestran la calidad del ADN tras el almacenamiento en la presente composición a la temperatura del local en (A) el día 0, (B) el día 6, (C) el día 7, (D) el día 14, (E) un mes y (F) 2 meses;

La Figura 9 muestra geles DGGE de alícuotas de muestras fecales por triplicado a partir de la misma muestra de donante almacenada en la presente composición;

La Figura 10 muestra un gel DGGE representativo y un % de similitud (parte inferior del gel) del perfil del microbioma de las muestras fecales almacenadas en la presente composición durante (A) 14 días a la temperatura del local y (B) 7 días y 2 meses a la temperatura del local;

Las Figuras 11A y 11B muestran geles de agarosa de muestras fecales de 2 donantes almacenadas a 37 °C en las presentes composiciones;

Las Figuras 12A y 12B muestran el análisis de DGGE de muestras fecales de 2 donantes almacenadas a 37 °C en las presentes composiciones;

Las Figuras 13A-E muestran geles de agarosa de muestras fecales de 3 donantes almacenadas en la presente composición a -20 °C, temperatura del local y 50 °C;

Las Figuras 14A-D muestran la electroforesis en gel de agarosa de muestras fecales de 3 donantes almacenadas en las presentes composiciones a 50 °C y -20 °C;

Las Figuras 15A-B muestran el análisis de DGGE de muestras fecales de 2 donantes almacenadas en las presentes composiciones a 50 °C durante 14 días;

Las Figuras 16A-B muestran el análisis de DGGE de muestras fecales de 2 donantes almacenadas en la presente composición a -20 °C durante 11 días;

La Figura 17 muestra un gel de agarosa de muestras fecales en la presente composición y expuestas a 5 ciclos de congelación/descongelación;

La Figura 18 muestra el análisis de DGGE de muestras fecales en la presente composición y expuestas a 5 ciclos de congelación/descongelación;

La Figura 19 muestra el análisis de coordenadas principales (PCoA) que demuestra que las muestras almacenadas en solución de estabilización durante varias temperaturas y tiempos (3 y 14 días) exhiben un alto nivel de similitud en la abundancia de OTU; y

La Figura 20 muestra la abundancia proporcional a nivel familiar de muestras almacenadas con y sin solución de estabilización a varias temperaturas y tiempos (3 y 14 días).

La Figura 21 muestra las distancias de disimilitud de Bray-Curtis dentro y entre muestras recientes y estabilizadas con 104B a pH 11. La prueba de Mann-Whitney mostró una disimilitud comparable en todas las condiciones, no se observó ninguna diferencia estadística.

La Figura 22 ilustra que las muestras estabilizadas con 104B a pH 11 conservan la riqueza. La riqueza se evaluó tras asignar presencia/ausencia a OTU individuales y se comparó mediante el uso del índice de Shannon. La prueba de Mann-Whitney no mostró diferencias significativas entre las muestras recientes y con 104B a pH 11. La Figura 23 ilustra que las muestras con 104B a pH 11 producen perfiles del microbioma altamente reproducibles. Las pruebas de Mann-Whitney en distancias de Bray-Curtis mostraron disimilitudes comparables en muestras por triplicado.

La Figura 24 muestra la disimilitud de distancia de Bray-Curtis entre muestras fecales no estabilizadas y con 104B a pH 11 (14 días a 23 °C) y congeladas (14 días a -80 °C) en comparación con muestras recientes. La disimilitud significativa se evaluó mediante el uso de Mann-Whitney ( *PS 0,05).

La Figura 25 muestra un dendrograma de similitud Unifrac % ponderada en microbioma de un donante representativo. Se realizaron extracciones a partir de tres réplicas biológicas para cada condición. El bajo % de similitud con la muestra reciente indica cambios en el perfil del microbioma a lo largo del tiempo.

La Figura 26 ilustra la integridad del ADN de las muestras con 104B a pH 11 sometidas a condiciones de transporte simuladas. Las muestras representativas de los donantes se almacenaron a 23 °C durante 14 días, 50 °C durante 1 día, 37 °C durante 3 días o se expusieron a ciclos múltiples de congelación-descongelación. También se almacenaron muestras recientes a -80 °C durante 14 días como control.

La Figura 27 ilustra la disimilitud de distancia Bray-Curtis de muestras con 104B a pH 11 expuestas a condiciones de envío simuladas. La prueba de Mann-Whitney no mostró diferencias entre las muestras con 104B a pH 11 almacenadas a varias temperaturas y las almacenadas a -80 °C. Se observó una disimilitud significativa en muestras no estabilizadas mantenidas a 37 °C o sometidas a condiciones de congelación-descongelación (F/T) en comparación con muestras pareadas a -80 °C (P < 0,05 y P < 0,01, respectivamente).

La Figura 28 muestra el análisis DGGE del perfil de la comunidad bacteriana de una muestra fecal de 2 donantes tratados con la presente composición que contiene concentraciones variadas de CDTA, y con una composición que no contiene CDTA, durante 5 días a 40 °C.

La Figura 29 muestra el análisis DGGE de los perfiles de la comunidad bacteriana de muestras fecales de 2 donantes tratados con la presente composición "104B a pH 11" o tampón TEN durante 21 días a la temperatura ambiental.

Descripción detallada

Se debe señalar que el papel de las composiciones para estabilizar el ácido nucleico descritas en la presente es estabilizar el ácido nucleico y "tomar instantáneas" de los perfiles de ADN total en muestras biológicas, tales como muestras fecales, a la temperatura ambiental durante períodos de tiempo prolongados. La extracción y el aislamiento de ácidos nucleicos, tales como ADN, se llevan a cabo en etapas posteriores mediante el uso de kits de extracción disponibles comercialmente después de la estabilización de los ácidos nucleicos contenidos en muestras fecales mediante el uso de las composiciones descritas en la presente. Preferentemente, las composiciones para estabilizar el ácido nucleico descritas en la presente no contienen sales caotrópicas (por ejemplo, sales de guanidinio como tiocianato de guanidinio (GuSCN) o clorhidrato de guanidinio (GuHCI)), urea, fijadores (por ejemplo, formalina, paraformaldehído, etcétera), agentes reductores, policationes (como polilisina o poliacrilamida), fenol o cloroformo. No se necesitan enzimas tales como proteasas (por ejemplo, proteinasa K), lisozima, etcétera para efectuar la estabilización de los ácidos nucleicos contenidos en muestras fecales mediante el uso de las composiciones descritas en la presente y por lo tanto, preferentemente no se incluyen en las composiciones descritas en la presente. Por tanto, las presentes composiciones y métodos de estabilización de ácidos nucleicos evitan el uso de compuestos costosos y/o tóxicos que frecuentemente requieren condiciones especiales de almacenamiento y transporte.

A menos que se defina de otro modo, todos los términos técnicos y científicos usados en la presente descripción tienen el mismo significado que el que entiende comúnmente un experto en la técnica a la que pertenece esta invención.

Como se usa en la especificación y las reivindicaciones, las formas singulares "un", "una" y "el" incluyen referencias al plural a menos que el contexto indique claramente lo contrario.

El término "que comprende", como se usa en la presente descripción, se entenderá que significa que la siguiente lista no es exhaustiva y puede incluir o no cualquier otro elemento adicional adecuado, por ejemplo, una o más característica(s), componente(s) y/o ingrediente(s) según sea apropiado.

El término "muestra" como se usa en la presente descripción se entenderá que significa cualquier espécimen que potencialmente contiene una sustancia de interés, en particular un ácido nucleico, y opcionalmente una proteína u otras biomoléculas de interés. El término "muestra" puede abarcar una solución, tal como una solución acuosa, célula, tejido, biopsia, polvo o población de uno o más de los mismos. La muestra puede ser una muestra biológica, como saliva, esputo, muestra de exudado bucal, suero, plasma, sangre, capa leucocitaria, exudados o secreciones faríngeas, nasales/nasofaríngeas o de los senos nasales, exudados o raspados de garganta, orina, mucosas, heces/deposición/excremento, exudados rectales, exudados de lesiones, bolo alimenticio, vómito, jugos gástricos, jugos pancreáticos, líquidos o sólidos del tracto gastrointestinal (GI), semen/esperma, exudados y secreciones uretrales, líquido cefalorraquídeo, productos de la lactancia o la menstruación, yema de huevo, líquido amniótico, humor acuoso, humor vítreo, secreciones o exudados cervicales, líquido/secreciones/ exudados o raspados vaginales, muestras y aspirados de médula ósea, líquido y derrames pleurales, sudor, pus, lágrimas, lavados o aspirados linfáticos, bronquiales o pulmonares, derrames peritoneales, cultivos celulares y suspensiones celulares, tejido conjuntivo, epitelio, exudados y frotis epiteliales, membrana mucosa, tejido muscular, tejido placentario, biopsias, exudados, tejido orgánico, tejido nervioso, cabello, piel o uñas, en donde las muestras de lo anterior puede obtenerse, por ejemplo, de un vertebrado, que incluye un mamífero. Un mamífero puede ser, por ejemplo, un ser humano, un primate no humano, ganado (como vaca, cabra u oveja), así como también un perro, gato, caballo, etcétera.

En una modalidad, la muestra biológica es una muestra fecal y el sujeto es un mamífero. En otra modalidad, la muestra biológica es una muestra fecal y el sujeto es un ser humano.

Otros tipos de muestras biológicas incluyen plantas, extractos de plantas, algas, muestras de suelo, aguas residuales domésticas, aguas residuales, agua, muestras ambientales, productos alimenticios, alimento para ganado, alimento para peces, alimento para animales, hisopos de superficies o equipos contaminados o potencialmente infecciosos (por ejemplo, superficies de procesamiento de carne), hisopos de superficies 'táctiles' en hospitales, hogares de ancianos, instalaciones para pacientes ambulatorios, instituciones médicas o similares. En otras modalidades más, la muestra biológica se selecciona de una muestra de suelo, una muestra de aguas residuales domésticas, una muestra de aguas residuales o una muestra de agua, cualquiera de las cuales puede estar contaminada con heces.

El término "microorganismo" o "microbio" como se usa en la presente descripción, se entenderá que significa cualquier organismo microscópico y esporas, que incluye todos los procariotas, es decir, las eubacterias y arqueabacterias, y diversas formas de eucariotas, que comprenden los protozoos, hongos (por ejemplo, levadura), algas y animales como rotíferos y planarias. Por ejemplo, los grupos de bacterias que se detectan con más frecuencia en las heces humanas mediante el uso de la secuenciación del gen ARNr 16S incluyen Firmicutes, Bacteroidetes, Spirochaetes, Fusobacteria, Deltaproteobacteria, Epsilonproteobacteria, Alphaproteobacteria, Betaproteobacteria, Gammaproteobacteria, Euryarchaeota, Eukarya, Desulfothiovibrio, Tm7, Cyanobacteria, Actinobacteria, Verrucomicrobia y Lentisphaerae.

Se entenderá que el término "virus" o "viriones" como se usa en la presente descripción significa cualquier pequeño agente infeccioso que se replica solo dentro de las células vivas de otros organismos. Los virus pueden infectar todo tipo de formas de vida, desde animales y plantas hasta bacterias y arqueas, y viven en casi todos los ecosistemas. Actualmente, hay 21 familias de virus que se conoce que provocan enfermedades en los seres humanos: Adenoviridae, Herpesviridae, Papillomaviridae, Polyomaviridae, Poxviridae, Hepadnaviridae, Parvoviridae, Astroviridae, Caliciviridae, Picomaviridae, Coronaviridae, Flaviviridae, Togaviridae, Hepeviridae, Retroviridae, Orthomyxoviridae, Arenaviridae, Bunyaviridae, Filoviridae, Paramyxoviridae, Rhabdoviridae, Reoviridae (y Hepatitis D, actualmente sin asignar). El material genético de un virus puede ser ácido desoxirribonucleico (ADN) o ácido ribonucleico (ARN).

El ácido nucleico a estabilizar mediante las composiciones descritas en la presente puede ser ADN o ARN, que incluye ARNm o ARN viral. En una modalidad, el ácido nucleico es ADN. En otra modalidad, el ADN es de origen humano, viral y microbiano. Todavía en otra modalidad, el ácido nucleico a estabilizar mediante las composiciones descritas en la presente comprende ADN humano y ADN microbiano.

El término "temperatura ambiental" como se usa en la presente descripción se refiere a un intervalo de temperaturas que podría encontrarse mediante la mezcla de una muestra biológica (por ejemplo, muestra fecal) y las composiciones estabilizadoras de ácido nucleico descritas en la presente desde el punto de obtención, durante el transporte (que puede implican temperaturas relativamente extremas, aunque habitualmente durante períodos de tiempo más cortos (por ejemplo, < 5 días), así como también durante el almacenamiento prolongado antes del análisis. En una modalidad, la temperatura es la temperatura ambiental que varía de aproximadamente -20 °C a aproximadamente 60 °C. En otra modalidad, la temperatura ambiental es la temperatura del local y varía de aproximadamente 15 °C a aproximadamente 30 °C.

La etapa de poner en contacto la muestra fecal con las composiciones acuosas descritas en la presente para formar una mezcla debe realizarse lo antes posible después de la evacuación de las heces, y la homogeneización de la mezcla para formar una mezcla homogénea debe realizarse lo antes posible, preferentemente inmediatamente, para estabilizar los ácidos nucleicos contenidos en la muestra fecal.

En general, la estabilización química del ADN y el ARN en una muestra biológica, como saliva, sangre, esputo, heces/deposiciones y orina, se logra mediante el uso de tampones para mantener un pH apropiado, así como también el uso de agentes quelantes para evitar el fenómeno del ciclo redox del metal o la unión de iones metálicos a la cadena principal de fosfato de los ácidos nucleicos. El término "quelante" o "agente quelante" como se usa en la presente descripción se entenderá que significa una sustancia química que formará un complejo soluble, estable con ciertos iones metálicos (por ejemplo, Ca2+ y Mg2+), tras secuestrar los iones de modo que normalmente no pueden reaccionar con otros componentes, como desoxirribonucleasas (ADNasa) o endonucleasas (por ejemplo, endonucleasas de restricción de tipo I, II y III) y exonucleasas (por ejemplo, exonucleasa 3'a 5'), enzimas que abundan en el tracto GI. La principal fuente de ADNasa en el tracto GI son las secreciones del páncreas, así como también los microorganismos residentes. En la presente composición, los agentes quelantes participan en la inhibición de la ADNasa y el crecimiento microbiano en muestras biológicas. Un quelante puede ser, por ejemplo, ácido etilenglicol tetraacético (EGTA), ácido(2-hidroxietil)etilendiaminotriacético (HEDTA), ácido dietilentriaminopentaacético (DTPA), ácido nitrilotriacético (NTA), ácido etilendiaminotriacético (EDTA), ácido 1,2-ciclohexanodiaminotetraacético (CDTA), N,N-bis(carboximetil)glicina, trietilentetraamina (TETA), ácido tetraazaciclododecanotetraacético (DOTA), desferioximina, citrato anhidro, citrato de sodio, citrato de calcio, citrato de amonio, bicitrato de amonio, ácido cítrico, citrato de diamonio, citrato de amonio férrico y citrato de litio. Estos agentes quelantes pueden usarse solos o en combinación de dos o más de estos. En una modalidad preferida, son deseables los quelantes más fuertes que el EDTA (es decir, los quelantes con una constante de disociación mayor que el EDTA cuando se unen a un metal), usados solos o en combinación, que incluyen, pero no se limitan a, CDT^a , DTPA, DOTA, TETA y desferioximina, o análogos quelantes de estos, en una cantidad de aproximadamente 150 mM a aproximadamente 600 mM, preferentemente en una cantidad de aproximadamente 150 mM a aproximadamente 500 mM, aún más preferentemente en una cantidad de aproximadamente 250 mM a aproximadamente 350 mM, y lo más preferentemente en una cantidad de aproximadamente 300 mM. Más deseablemente, el agente quelante en la presente composición es CDTA.

El EDTA es una sustancia química que se usa ampliamente en la industria, laboratorios, cosméticos, medicina y en algunos productos alimenticios. Su utilidad se basa en su capacidad para 'quelar' iones metálicos, particularmente valencias bivalentes y mayores. El CDTA se usa con menos frecuencia en estos campos, pero comparte con el EDTA la capacidad de quelar los iones metálicos. De manera importante, la afinidad de ambos quelantes por diferentes iones metálicos varía considerablemente. K1, una medida de afinidad expresada en una escala logarítmica se muestra en la Tabla 1 (a continuación). Los primeros 5 quelantes enumerados tienen diferentes números y configuraciones de grupos carboxilato (R-COO-) unidos a grupos nitrógeno. En la Tabla 1, OPT se presenta para comparación como un quelante basado solo en grupos de nitrógeno.

Una comparación de CDTA y EDTA en la Tabla 1 muestra que son muy diferentes. Las diferencias en los valores de log K1 son 2,3 (Mg2+); 2,6 (Ca2+); 2,4 (Mn2+); aproximadamente 3 (Fe3+); 3,6 (Co2+); 0,8 (Cu2+); 2,9 (Zn2+). Es decir, CDTA une la mayoría de los metales de 200 a 4000 veces más firmemente que el EDTA.

Tabla 1. Afinidad de los quelantes por diferentes iones metálicos

Una consecuencia de esta mayor capacidad de CDTA para formar complejos con metales es que la concentración de cualquier ion metálico libre será menor en presencia de concentraciones iguales de CDTA o EDTA. Sin embargo, de manera más importante, la cantidad de iones metálicos que pueden formar complejos con biomoléculas, tales como ácidos nucleicos o proteínas, será apreciablemente menor. Se conoce que los ácidos nucleicos en solución se unen a iones metálicos y es probable que la eliminación de dichos metales mejore su estabilidad química. Esto puede ser particularmente importante para metales de transición como Mn, Fe, Co y Cu, que pueden existir en diferentes estados de oxidación al ganar o perder electrones de especies, como oxígeno bimolecular, anión superóxido y peróxido de hidrógeno. Finalmente, la mayor capacidad del CDTA para formar complejos con metales es muy beneficiosa en las composiciones desarrolladas para suprimir la degradación del ácido nucleico en muestras biológicas, como las heces, que se conoce que contienen de forma natural grandes cantidades de ADNasa que requieren Ca2+ y Mg2+ para estabilizar su conformación activa.

Tabla 2: Valores de pK para CDTA y EDTA

Existen otras diferencias entre CDTA y EDTA que tienen consecuencias prácticas en un laboratorio o entorno de investigación. Posiblemente debido a los valores menores de pKa k y k2 de EDTA (véase la Tabla 2 anterior), es apreciablemente más difícil preparar la forma disódica a pH 7,0 (se comienza con la forma ácida). Pueden prepararse soluciones más concentradas de CDTA que EDTA. Finalmente, la forma disódica de CDTA es altamente soluble en etanol, en comparación con la solubilidad limitada de la forma disódica de EDTA. Estas diferencias hacen que CDTA sea la mejor opción de quelante desde una perspectiva de fabricación.

En general, el pH de la presente composición puede mantenerse en el intervalo alcalino deseado mediante el uso de uno o más tampones apropiados; en donde la composición está tamponada para mantener el pH de la muestra biológica a un pH adecuado, y dicha composición estabiliza dicho ácido nucleico a la temperatura ambiental. De acuerdo con una modalidad, la composición comprende uno, dos o más agentes tamponantes (se proporcionan ejemplos no limitantes, véase la Tabla 3) con valores de pKa, constantes de disociación de ácido logarítmico, a 25 °C que varían de 8,0 a 12,5 para mantener el pH dentro del intervalo preferido de aproximadamente 9,5 a aproximadamente 11,5. Una constante de disociación ácida, Ka, es una medida cuantitativa de la concentración de un ácido en solución. Cuanto mayor sea el valor de Ka, mayor será la disociación de las moléculas en solución y, por tanto, más fuerte será el ácido. Debido a los muchos órdenes de magnitud abarcados por los valores de Ka, en la práctica se usa más comúnmente una medida logarítmica de la constante de disociación ácida, pKa. Cuanto mayor sea el valor de pKa, menor será el grado de disociación a cualquier pH dado, es decir, más débil será el ácido. En los organismos vivos, la homeostasis ácido-base y la cinética enzimática dependen de los valores de pKa de muchos ácidos y bases presentes en la célula y en el cuerpo. En química, es necesario el conocimiento de los valores de pKa para la preparación de soluciones tampón y también es un requisito previo para una comprensión cuantitativa de la interacción entre ácidos o bases e iones metálicos para formar complejos. Un experto en la técnica entenderá que un compuesto/tampón dado puede tamponar el pH de una solución sólo cuando su concentración es suficiente y cuando el pH de la solución está cerca (dentro de aproximadamente una unidad de pH) a su pKa. En una modalidad, el pH de la presente composición está en el intervalo de aproximadamente 9,5 a aproximadamente 11,5. En una modalidad preferida, el pH de la composición está en el intervalo de aproximadamente 10,5 a aproximadamente 11,5, y preferentemente el pH es aproximadamente 11. La cantidad de agente(s) tamponante(s) puede estar entre aproximadamente 1 mM y aproximadamente 1 M, por ejemplo.

De acuerdo con ciertas modalidades, la composición comprende beta-alanina como agente tamponante principal para mantener el pH dentro del intervalo deseado de aproximadamente 9,5 a aproximadamente 11,5. Para mantener el pH en aproximadamente 11, puede seleccionarse un tampón de la Tabla 3 con una pKa en el intervalo de 10-12. Vale la pena señalar que los agentes quelantes de carboxilato, como CDTA y EDTA, también pueden contribuir a la capacidad tamponante en este intervalo. Sin embargo, los valores de pKa (k4) de CDTA y EDTA (Tabla 2) difieren significativamente. El valor de pKa (k4) menor de EDTA (Tabla 2) lo hace potencialmente útil para ayudar a mantener la presente composición en el extremo inferior del intervalo de pH deseado. Sin embargo, el valor de pKa (k4) mayor de CDTA lo hace más adecuado para fortalecer la capacidad tamponante de beta-alanina (u otros tampones enumerados en la Tabla 3) en el extremo superior del intervalo deseado (es decir, pH 11).

Tabla 3. Tampones adecuados de la presente composición

Continuación

La p-alanina es un tampón particularmente adecuado para las composiciones de la presente solicitud. En una modalidad, el pH de la composición es de aproximadamente 10,5 a aproximadamente 11,5, y la p-alanina está presente en una cantidad de aproximadamente 10 mM a aproximadamente 100 mM, o de aproximadamente 30 mM a aproximadamente 70 mM, y lo más preferentemente en una cantidad de aproximadamente 50 mM.

El término "soluble en agua" o "solvente orgánico miscible en agua" como se usa en la presente descripción se entenderá que significa cualquier sustancia o compuesto que contiene carbono, comúnmente un líquido, que disuelve un soluto, un líquido, sólido o gas químicamente diferente. Un solvente orgánico soluble en agua puede ser, por ejemplo, uno o más alcanoles de cadena corta (por ejemplo, C1-C6) que pueden ser de cadena lineal o ramificada, como metanol, etanol, propanol, isopropanol, butanol, n- butanol, pentanol, hexanol o cualquier combinación de estos. En una modalidad de la presente composición, el alcohol preferido es el etanol. En otra modalidad, el solvente orgánico soluble en agua (por ejemplo, etanol) está presente en la composición a una concentración de menos de aproximadamente 30 % en volumen, preferentemente menos de aproximadamente 24 % en volumen, tal como de aproximadamente 21,5 % a aproximadamente 23,5 % en volumen, lo más preferentemente alrededor de 23,5 % en volumen. En otras modalidades, el solvente orgánico miscible en agua puede estar ausente.

Generalmente, en la técnica, se conoce que se requiere más del 30 % de etanol para desnaturalizar la mayoría de las proteínas. Se necesita más del 60 % de etanol o el 50 % de isopropanol para precipitar el ADN de la solución. El etanol o metanol absoluto se usa comúnmente como fijador en histología, patología y biología celular para terminar reacciones bioquímicas. Algunas proteínas pueden precipitarse mediante la adición de solventes orgánicos miscibles en agua, como etanol y acetona, en el intervalo de 20-50 % (volumen/volumen). El etanol provoca la deshidratación de las proteínas o una reducción de la actividad del agua, seguida de atracción electrostática entre las proteínas, agregación e insolubilización. Sin desear estar ligado a ninguna teoría, los inventores creen que el porcentaje relativamente pequeño de solventes orgánicos miscibles en agua en la presente composición tiene poca o ninguna propiedad de fijación, sino que facilita la mezcla y dispersión de la muestra biológica (por ejemplo, fecal) y mejora la solubilidad de otros compuestos químicos que pueden incluirse en la presente composición. Además, para el envío/transporte de líquidos inflamables, es deseable mantener los solventes orgánicos, como el etanol, por debajo del 24 % en volumen en soluciones para exención de las regulaciones de transporte de mercancías peligrosas (TDG) (Naciones Unidas (UN) número 1170); de lo contrario, una solución con > 24 % de etanol se clasifica como clase 3 (líquidos inflamables), se exige un embalaje especial y la complejidad y los costes del transporte aumentan.

El término "detergente" o "tensioactivo", como se usa en la presente descripción, se entenderá que significa cualquier compuesto orgánico que sea anfifílico, que pueda romper enlaces no covalentes en proteínas, desnaturalizarlas y provocar que las moléculas pierdan su estructura secundaria, terciaria y/o cuaternaria nativas. Un detergente adecuado puede ser, por ejemplo, un detergente aniónico (como, por ejemplo, dodecilsulfato de sodio (SDS), dodecilsulfato de litio, laurilsulfato de sodio (SLS), laurilsulfato de amonio), un detergente catiónico (sales de amonio cuaternario, tales como, por ejemplo, bromuro de cetrimonio/bromuro de cetiltrimetilamonio/bromuro de hexadecil-trimetilamonio o CTAB, cloruro de cetiltrimetilamonio (CTAC), cloruro de cetilpiridinio (CPC), cloruro de benzalconio (BAC)), un tensioactivo zwiteriónico (por ejemplo, betaínas, 3-[(3-colamidopropil)dimetilamonio]-1-propanosulfonato (CHAPS), lecitina) o un detergente no iónico (como, por ejemplo, Tween, Triton X o Brij). CTAb , sin embargo, es menos ideal cuando se trabaja con ADN. Los detergentes pueden inhibir la acción de la ADNasa tras destruir la estructura compleja de estas enzimas, facilitar la dispersión de la muestra biológica en la presente composición y ayudar a solubilizar una variedad de especies químicas. En ciertas modalidades de la presente composición, el detergente es SDS. En otras modalidades, el detergente (por ejemplo, SDS) puede estar presente en la composición acuosa en una cantidad de aproximadamente 0-4 % (p/v), preferentemente aproximadamente 0­ 1 % (p/v), lo más preferentemente aproximadamente 0,5 % (p/v).

El término "agente antiespumante" o "antiespumante" como se usa en la presente descripción se entenderá que significa un aditivo químico que reduce o dificulta la formación de espuma. Los inventores observaron la formación de espuma durante la agitación vigorosa necesaria para dispersar rápida y completamente algunas muestras biológicas, en particular heces, en un tubo que contiene ciertas modalidades de la presente composición, que comprende un detergente. Dicha espuma dificultó y, en algunas muestras, evitó el mezclado completo, con y sin un medio de homogeneización. Los agentes antiespumantes, como el Antiespumante A concentrado (Sigma-Aldrich; núm. de cat. A-5633), un polímero de silicona activo, redujo significativamente la formación de espuma durante dicha mezcla de muestra biológica y la presente composición. Por tanto, el agente antiespumante debería incluirse preferentemente en las composiciones que contienen detergente para minimizar la formación de espuma. Otros ejemplos de agentes antiespumantes apropiados que pueden usarse solos o en combinación de dos o más incluyen aceites insolubles, polidimetilsiloxanos y otras siliconas, ciertos alcoholes, estearatos y glicoles. En otras modalidades, el agente antiespumante (por ejemplo, Antiespumante A) puede estar presente en la composición acuosa en una cantidad de aproximadamente 0-1 % (v/v), preferentemente aproximadamente 0-0,2 % (v/v).

El término "agente antimicrobiano" como se usa en la presente descripción se entenderá que significa una sustancia o grupo de sustancias que reduce la tasa de crecimiento de un organismo, en comparación con la tasa de crecimiento del organismo en su ausencia. Una reducción en la tasa de crecimiento de un organismo puede ser de al menos 5 %, más deseablemente, de al menos 10 %, incluso más deseablemente, de al menos 20 %, 50 % o 75 %, y más deseablemente, de 90 % o más. La definición también se extiende a sustancias que afectan la viabilidad, virulencia o patogenicidad de un organismo. Un agente antimicrobiano puede ser natural (por ejemplo, derivado de bacterias), sintético o recombinante. Un agente antimicrobiano puede ser bacteriostático, bactericida o ambos. Un agente antimicrobiano es bacteriostático si inhibe la división celular, sin afectar la viabilidad de la célula inhibida. Un agente antimicrobiano es bactericida si provoca la muerte celular. La muerte celular se detecta comúnmente por la ausencia de crecimiento celular en el medio de crecimiento líquido (por ejemplo, ausencia de turbidez) o en una superficie sólida (por ejemplo, ausencia de formación de colonias en agar). Los expertos en la técnica conocen que una sustancia o grupo de sustancias que es bacteriostático a una concentración dada puede ser bactericida a una concentración mayor. Los agentes antimicrobianos comunes conocidos en la técnica incluyen ciertos alcoholes, triclosán o irgasan y Proclin 950. Opcionalmente, la presente composición puede incluir un agente antimicrobiano como triclosán. En otras modalidades, el agente antimicrobiano (por ejemplo, triclosán) puede estar presente en la composición acuosa en una cantidad de aproximadamente 0-2 % (p/v), preferentemente de aproximadamente 0­ 0,5 % (p/v).

Las composiciones descritas en la presente, cuando se mezclan con una muestra biológica, en particular una muestra fecal, estabilizan los ácidos nucleicos contenidos en las mismas a la temperatura ambiental de manera que los ácidos nucleicos se estabilizan tras el almacenamiento de la mezcla homogeneizada durante períodos de tiempo prolongados.

En una modalidad, la muestra biológica es una muestra fecal obtenida de un sujeto humano y el ácido nucleico es ADN.

Los expertos en la técnica apreciarán que la presencia de ADN de alto peso molecular en una muestra puede dar una indicación general de la estabilización del ADN dentro de la muestra en las condiciones de almacenamiento. Esto puede evaluarse mediante electroforesis en gel de agarosa, que puede proporcionar una indicación de la calidad del ADN de alto peso molecular (por ejemplo, una banda nítida contra una mancha), así como también una medida cuantitativa de la cantidad de ADN de alto peso molecular (mediante análisis de densitometría).

Además de estabilizar el ADN de alto peso molecular, las composiciones descritas en la presente, cuando se mezclan con una muestra biológica, en particular una muestra fecal, estabilizan los ácidos nucleicos contenidos en la misma a la temperatura ambiental de manera que se mantiene la abundancia relativa de ácidos nucleicos microbianos y/o humanos tras el almacenamiento de la mezcla homogeneizada durante períodos de tiempo prolongados. Pueden usarse varias técnicas conocidas por los expertos en la técnica para determinar si se mantiene la abundancia relativa de ácidos nucleicos microbianos y/o humanos, por ejemplo técnicas que utilizan amplificación o hibridación de ácidos nucleicos. Otra técnica que puede usarse para evaluar si la abundancia relativa de ácidos nucleicos microbianos y/o humanos se mantiene tras el almacenamiento de la mezcla homogeneizada durante períodos de tiempo prolongados es el análisis PCR-DGGE, que se describe con más detalle a continuación. También pueden usarse perfiles 16S dirigidos (para determinar la abundancia relativa de unidades taxonómicas operativas (OTU)), así como también la secuenciación metagenómica masiva de escopeta del ADN genómico (WMS; para determinar la abundancia relativa de genes microbianos/ácidos nucleicos).

En una modalidad ilustrativa, la estabilización del ADN humano en particular puede evaluarse tras determinar si el ADN obtenido de muestras biológicas, tales como muestras fecales, incubadas con las composiciones y de acuerdo con los métodos descritos en la presente durante un período de tiempo (talmacenamiento) retiene el capacidad para soportar la amplificación por PCR de un gen humano diana en un producto detectable, y más particularmente si el nivel de amplificación del producto de PCR es similar al del ADN extraído y purificado de la misma mezcla homogénea u otra mezcla de control en el tiempo cero. Como se describe con más detalle en los ejemplos a continuación, el ADN humano purificado de muestras fecales incubadas con las composiciones y de acuerdo con los métodos descritos en la presente en T = 0 y T = talmacenamiento puede amplificarse en tiempo real, PCR cuantitativa (qPCR) mediante el uso de cebadores dirigidos a un gen humano, y el cambio en los valores de Ct (ACt) que resulta de T = 0 y T = talmacenamiento de las alícuotas de ADN purificado puede proporcionar una medida cuantitativa de la estabilidad del ADN humano. Un valor de ACt de menos de aproximadamente 2 Indica que el ADN humano se ha vuelto estable durante el período de tiempo de almacenamiento. Un valor de ACt de menos de aproximadamente 1 indica una estabilización excelente.

En una modalidad, el ADN humano contenido en una muestra fecal incubada con las composiciones y de acuerdo con los métodos descritos en la presente se vuelve estable a la temperatura del local durante al menos 7 días, al menos 14 días, al menos 21 días, al menos 30 días, o al menos 60 días. En otra modalidad, el ADN humano contenido en una muestra fecal incubada con las composiciones y de acuerdo con los métodos descritos en la presente se vuelve estable a temperaturas elevadas tales como 37 °C o 50 °C durante al menos 7 días, o al menos 14 días. Todavía en otra modalidad, el ADN humano contenido en una muestra fecal incubada con las composiciones y de acuerdo con los métodos descritos en la presente se vuelve estable a -20 °C durante al menos un mes (es decir, 30 días).

En otra modalidad, el ácido nucleico es ADN microbiano y el método estabiliza un perfil del microbioma de la muestra biológica (por ejemplo, muestra fecal). Como se usa en la presente descripción, el término "perfil del microbioma" generalmente se refiere a la comunidad microbiana y las biomoléculas totales dentro de un entorno definido, y sus cantidades relativas.

Como se describe con más detalle a continuación, la estabilidad de un perfil del microbioma puede determinarse, por ejemplo, tras realizar PCR en ADN que se ha extraído y purificado a partir de mezclas homogéneas de la muestra biológica y las composiciones descritas en la presente tras el almacenamiento de las mezclas homogéneas a la temperatura ambiental durante un período de tiempo particular (talmacenamiento), mediante el uso de pares de cebadores dirigidos a genes bacterianos de ARNr 16S y análisis de electroforesis en gel de gradiente desnaturalizante (DGGE). Los expertos en la técnica apreciarán que pueden dirigirse a otros genes bacterianos con regiones variables y no variables, siempre que haya una diferencia entre las especies de interés. El perfil de PCR-DGGE resultante se compara después con el obtenido al realizar el análisis de PCR-DGGE de la misma manera en el ADN que se ha extraído y purificado a partir de la misma mezcla homogénea u otra mezcla de control de la muestra biológica y las composiciones en el tiempo cero. En una modalidad, puede considerarse que un perfil del microbioma de una muestra biológica, como una muestra fecal, se ha estabilizado a la temperatura ambiental durante un cierto período de tiempo (talmacenamiento) si el perfil de PCR-DGGE después (talmacenamiento) a la temperatura ambiental presenta al menos un 75 % de similitud con el perfil de PCR-DGGE en T = 0, y más preferentemente al menos un 82 % de similitud con el perfil de PCR-DGGE en T = 0.

En otra modalidad, la estabilidad de un perfil del microbioma puede determinarse, por ejemplo, tras amplificar y secuenciar una región variable del gen del ARNr 16S bacteriano (como la región hipervariable V4) del ADN que se ha extraído y purificado a partir de mezclas homogéneas de la muestra biológica y las composiciones descritas en la presente después del almacenamiento de las mezclas homogéneas a la temperatura ambiental durante un período de tiempo particular. La información de secuenciación resultante se compara después con la obtenida tras realizar la amplificación y secuenciación de la región variable del gen del ARNr 16S bacteriano de la misma manera en el ADN que se ha extraído y purificado a partir de la misma mezcla homogénea en el tiempo cero u otro control. Pueden usarse diversas formas de análisis bioinformático de los datos de secuenciación obtenidos conocidos por los expertos en la técnica para evaluar la estabilidad del microbioma en las condiciones de almacenamiento, como se detalla adicionalmente en los ejemplos.

En una modalidad, el perfil del microbioma de una muestra fecal incubada con las composiciones y de acuerdo con los métodos descritos en la presente se vuelve estable a la temperatura del local durante al menos 7 días, al menos 14 días, al menos 21 días, al menos 30 días, o al menos 60 días. En otra modalidad, el perfil del microbioma de una muestra fecal incubada con las composiciones y de acuerdo con los métodos descritos en la presente se vuelve estable a temperaturas elevadas tales como 37 °C o 50 °C durante al menos 7 días, o al menos 14 días. Todavía en otra modalidad, el perfil del microbioma de una muestra fecal incubada con las composiciones y de acuerdo con los métodos descritos en la presente se vuelve estable a -20 °C durante al menos un mes (es decir, 30 días).

Los inventores han descubierto sorprendentemente que concentraciones extraordinariamente altas de un agente quelante de uso menos común, CDTA, tamponado a pH alcalino (pH £ 9,5, preferentemente pH 11), pueden usarse para capturar y estabilizar rápida y eficazmente el ácido nucleico y 'tomar instantáneas' de los perfiles de ADN total en muestras biológicas a la temperatura ambiental durante períodos prolongados.

En particular, los inventores han descubierto sorprendentemente que las composiciones tamponadas a un pH alcalino más fuerte (aproximadamente pH 10,5-11,5, preferentemente aproximadamente pH 11) muestran una estabilidad mejorada del ADN del microbioma con respecto a las composiciones estabilizadoras tamponadas a valores de pH menores. Esto no se pudo haber previsto y, de hecho, fue inesperado en vista de lo siguiente. En general, se conoce que a un pH mayor, se acelerará la desaminación de la citosina. También se conoce que el ADN se desnaturaliza más fácilmente a un pH mayor. Los sitios apurínicos en el ADN (que aparecen con baja frecuencia) también se escindirán más fácilmente. Por tanto, es sorprendente que los inventores hayan observado que el ADN/perfil del microbioma parece ser más estable, sobre la base de la electroforesis en gel de agarosa, la secuenciación del gen ARNr 16S bacteriano y DGGE, a los valores de pH mayores.

Sin estar ligado a ninguna teoría, se cree que la razón de la aparente mejora de la estabilidad no es puramente "química". Es decir, el pH alcalino más fuerte muestra una estabilidad mejorada del ADN del microbioma quizás por una combinación de razones, algunas de las cuales se sugieren a continuación.

Se ha observado que el CDTA funciona mucho mejor que el EDTA en las composiciones descritas en la presente para la estabilización del ADN/microbioma. Los 4 pKa para EDTA y CDTA se muestran en la Tabla 2 anterior. Con base en estos valores, esto significa que, a pH alcalino, CDTA tendrá 3 cargas negativas, mientras que EDTA tendrá 4 cargas negativas cuando el pH se acerque a 11. Nuevamente, sin estar ligado a ninguna teoría, se piensa que quizás la razón del desempeño mucho mejor de CDTA, en comparación con EDTA, se debe a la carga negativa menor.

El objetivo de un estudio del microbioma es estabilizar y, finalmente, liberar ADN de todas las células en igual relación, preferentemente el 100 % del ADN del 100 % de las células. La estabilidad del "perfil" del ADN liberado puede ser mejor a un pH mayor porque esto puede acercarse más a alcanzar este objetivo. En otras palabras, una mayor extensión del ADN bacteriano puede estabilizarse y finalmente liberarse a pH 11, en comparación con pH 9,5. Una vez que se libera el ADN, debe protegerse de la degradación por la ADNasa en las muestras fecales. Algunas ADNasas requieren iones metálicos como cofactores; otros no. Nuevamente, sin estar ligado a ninguna teoría, es posible que el pH mayor pueda ser más eficaz para inhibir la segunda clase de ADNasa.

Los factores desconocidos (por ejemplo, inhibidores) en las heces pueden unirse al ADN y secuestrarlo o bloquear la amplificación por PCR. Es posible que un pH mayor pueda aliviar una o ambas de estas posibilidades.

Finalmente, debe evitarse el crecimiento de bacterias después de la obtención de muestras de heces en composiciones estabilizadoras. De lo contrario, el "perfil" del ADN/microbioma cambiará. Un pH mayor puede ser más eficaz para inhibir el crecimiento de algunas especies microbianas que un pH menor (9,5).

Para tipos de muestras complejas, altamente variables, sólidas y semisólidas, como las heces, también es necesario proporcionar un medio mecánico o físico para mezclar inmediatamente las muestras con la composición en el punto de obtención. La homogeneización rápida y la desagregación completa de la muestra biológica recién obtenida en la presente composición aseguran la estabilización de una instantánea representativa de los perfiles de ADN total en la muestra durante períodos prolongados de tiempo a la temperatura ambiental. Como se ilustra en los ejemplos siguientes, si la presente composición se añade a una muestra obtenida de heces sólidas, pero no se mezcla adecuadamente, la calidad del ADN se ve comprometida en relación con las muestras que se mezclan hasta que se homogeneicen. Por lo tanto, la mezcla adecuada de las muestras es crucial para estabilizar el ADN de manera que sea representativo del estado in vivo (T = 0). Por ejemplo, el ADN extraído de dichas muestras, seguido de electroforesis en gel de agarosa, puede mostrar degradación del ADN de alto peso molecular en muestras de algunos donantes. Además, como se observa en los ejemplos siguientes, la mezcla inadecuada de muestras de heces de algunos donantes conduce a cambios perjudiciales en el perfil del microbioma, medido con los análisis de PCR y DGGE de ARNr 16S bacteriano.

En muchos casos, la obtención de muestras biológicas, en particular la obtención de heces, la realizan mejor los donantes en la privacidad de su propio hogar. En este contexto, el donante se siente más cómodo y, si se le brindan instrucciones y un dispositivo o kit de obtención de muestras biológicas apropiado que contenga una química o solución de estabilización, el donante puede obtener y estabilizar inmediatamente muestras biológicas recientes. La obtención de muestras de esta manera ayuda a garantizar el ácido nucleico de la mejor calidad para la extracción y el análisis posteriores, con perfiles de a Dn que se emparejen lo más posible al estado in vivo. Sin embargo, para obtener y estabilizar una muestra biológica en el hogar o en un lugar de obtención distante, debe proporcionarse al donante un medio simple, seguro e intuitivo, pero altamente efectivo, para mezclar manual o físicamente su muestra obtenida con la solución estabilizadora. Preferentemente, este medio de mezcla es económico y no requiere electricidad, equipo o entrenamiento especializado.

El ADN puede degradarse rápidamente en muestras biológicas (por ejemplo, heces) tras exponerse al aire, si no se mezcla con una solución estabilizadora o cuando no se congela inmediatamente en hielo seco en el punto de obtención. Con muestras biológicas líquidas y homogéneas, como sangre y orina, la mezcla no es un problema importante; sin embargo, la desagregación de muestras biológicas sólidas y semisólidas, no homogéneas, tales como heces, en una cantidad limitada de solución y tiempo puede ser sumamente problemática. A través de mucha experimentación con numerosos medios de mezcla (por ejemplo, partículas de vidrio/sílice (á 1 mm; 2,65 g/cm3), perlas de vidrio/sílice (2-4 mm; 2,65 g/cm3), mármoles (12,7 mm), bolas de óxido de alúmina (7,9 mm; 3,95 g/cm3) y bolas de nitruro de silicio (7,1-7,9 mm; 3,21 g/cm3), los inventores descubrieron que la desagregación y homogeneización completa de todos los tipos de muestras de heces (1-7 en la escala de heces de Bristol), obtenidas en tubos de transporte o de laboratorio estándar disponibles comercialmente (por ejemplo, tubo de fondo redondo de 10 ml (92 x 15,3 mm), núm. de cat. 60.610; Sarstedt) que contiene la presente composición, puede conseguirse mediante mezcla simple manual con la inclusión en el tubo de al menos una bola de metal grande (5,6­ 11,1 mm, preferentemente 7,9 mm), densa (7,6-15,63 g/cm3) de tamaño más pequeño que el diámetro interior del tubo (por ejemplo, 12,9 mm).

Los inventores determinaron la selección óptima de un medio de homogeneización para un tubo de laboratorio estándar disponible comercialmente, que incluye: 1) emparejar la forma del tubo (por ejemplo, el fondo o la base dentro del tubo) con la forma del medio de homogeneización (por ejemplo, un tubo de fondo redondo para un medio de homogeneización que es al menos una bola mezcladora, tal como una bola mezcladora de acero inoxidable) para evitar la compactación y/o el atrapamiento de material sólido en áreas de difícil acceso del tubo o recipiente; 2) seleccionar el material más denso posible para los medios de homogeneización (por ejemplo, carburo de tungsteno (15,63 g/cm3), acero inoxidable (7,6-8,0 g/cm3); 3) seleccionar un medio de homogeneización con un diámetro exterior ligeramente menor que el diámetro interno del tubo o recipiente (por ejemplo, cuando el medio de homogeneización es una bola mezcladora, la bola mezcladora tendría un diámetro de aproximadamente 4-6 mm, preferentemente de aproximadamente 4-5 mm, y lo más preferentemente de aproximadamente 5 mm menos que el diámetro interno del tubo de mezcla); y 4) seleccionar un tubo o recipiente con "espacio vació" por encima de la muestra y la solución estabilizadora para permitir que los medios de homogeneización ganen impulso durante la agitación manual. Se debe señalar que la bola mezcladora puede ser de forma regular o irregular (por ejemplo, podría tener protuberancias, picos, etcétera y no es necesario que sea perfectamente esférica) y, como se señaló anteriormente, preferentemente tiene una densidad de al menos 5,0 g/cm3, más preferentemente al menos 7,6 g/cm3.

Si el medio/la bola de homogeneización es demasiado pequeño con respecto al tubo, la muestra pasa alrededor del medio/la bola de homogeneización sin dispersarse en la solución estabilizadora. Por el contrario, si el medio/la bola de homogeneización es demasiado grande (por ejemplo, > 11,1 mm) con respecto al tubo (diámetro interno de 12,9 mm), la muestra no se dispersa ni se 'aplasta' entre el medio/la bola de homogeneización y las paredes del tubo, el medio/la bola de homogeneización no gana suficiente impulso y la muestra se compacta en uno o ambos extremos del tubo. Idealmente, cuando el diámetro exterior de los medios de homogeneización (por ejemplo, una bola de acero inoxidable o carburo de tungsteno de 7,9 mm) simplemente despeja las paredes verticales internas del tubo (por ejemplo, un tubo Sarstedt de 10 ml que tiene un diámetro interno de 12,9 mm, arriba) en aproximadamente 5 mm (2,5 mm a cada lado de la bola), el medio de homogeneización funciona eficazmente como un homogeneizador, tras romper o desagregar rápidamente las muestras de heces sólidas y semisólidas (por ejemplo, 400 mg; tipo 1-7), obtenidas en la presente composición (por ejemplo, 2 ml), para formar una muestra líquida homogénea que puede transferirse con pipeta o manipularse y procesarse fácilmente en el laboratorio. Este medio de homogeneización asegura que la muestra biológica obtenida, incluso las heces sólidas, se desagreguen rápida y completamente y, al hacerlo, se exponga rápidamente a la presente composición. De manera importante, los inventores determinaron que la densidad de los medios de homogeneización, no solo su diámetro, en comparación con el tubo/el recipiente, fue fundamental para lograr la desagregación completa de la muestra de manera oportuna (20-30 segundos) simplemente con agitación del tubo manualmente. Debido a la naturaleza frecuentemente pegajosa y maleable de las heces (por ejemplo, tipo 4), la homogeneización completa de esta muestra fue difícil de lograr en tubos de fondo plano o cónico cuando se utilizó un medio de homogeneización esférico. Por lo tanto, un tubo de fondo redondo funcionó mejor para un medio de homogeneización esférico.

La presente invención proporciona un método y una composición novedosos y de aplicación universal para estabilizar el ADN total en muestras biológicas particularmente complejas y no homogéneas a la temperatura ambiental para su uso posterior en diagnósticos médicos e investigación clínica en seres humanos y animales (por ejemplo, diagnóstico de enfermedades e infecciones, papel de los microbios en la salud humana, genómica de poblaciones para estudiar la evolución de microorganismos, virulencia, farmacorresistencia y epidemiología), seguridad alimentaria (plantas de procesamiento de alimentos/carne), muestreo de suelos y aguas residuales (pruebas ambientales), bioseguridad o biodefensa (armas biológicas), pruebas de alimentos para animales, ciencia/industria de plantas y animales, etcétera). Un enfoque nuevo y en rápida expansión tanto de investigadores como de médicos es la microbiota intestinal o microbioma intestinal. ¿En qué se diferencia el perfil de los microbios en las heces de donantes sanos del de las personas enfermas? ¿Puede la manipulación del microbioma intestinal humano beneficiar la salud? Por razones de investigación, ambientales y económicas, también existe un interés inmenso en el análisis de los miles de microorganismos diferentes en el rumen de muchos animales, especialmente aquellos que se crían para carne y productos lácteos.

La presente invención simplifica y agiliza la obtención y preparación de muestras biológicas, tras proporcionar muestras de calidad para la posterior detección de ADN humano, animal y microbiano, sin necesidad de mantener la cadena de frío durante el transporte o almacenamiento. La invención puede usarse en a) laboratorios centrales o instalaciones de prueba con sistemas automatizados o de alto rendimiento, b) clínicas rurales o móviles con una infraestructura y equipos de laboratorio mínimos, y c) ubicaciones distantes sin electricidad. Además, las personas enfermas y potencialmente infecciosas no tienen que viajar a clínicas u hospitales para proporcionar una muestra biológica, lo que minimiza la propagación de enfermedades infecciosas, facilita el control y la vigilancia de los brotes y permite una evaluación y un seguimiento rápidos de la respuesta del paciente al tratamiento.

El kit/sistema de obtención y homogeneización cerrado como se describe en la presente es económico de fabricar y no es necesario adquirir equipo de laboratorio adicional (por ejemplo, vórtice). De manera más importante, la agitación manual del tubo tapado que contiene la presente composición, una o más bolas de homogeneización e incluso una muestra de heces duras (tipo 1-2, escala de heces de Bristol), puede lograr la desagregación completa de la muestra en segundos, lo que da como resultado una mezcla homogénea. La obtención del donante por sí mismo reduce la propagación de la infección y la posible contaminación cruzada con las muestras de otros donantes. En particular, este proceso de obtención y homogeneización de muestras puede ser realizado por personas no profesionales, sin experiencia clínica o de laboratorio, en la privacidad de su propio hogar, lo que mejora en gran medida la participación y el cumplimiento de los donantes. Con importancia para la calidad de los resultados de las pruebas posteriores, la presente invención permite la obtención y estabilización seguras de muestras biológicas "recientes", lo que reduce drásticamente la degradación observada durante el tránsito de muestras biológicas crudas o no tratadas a instalaciones de prueba y/o condiciones de almacenamiento variables.

Fundamentalmente, la presente invención proporcionará a los investigadores y médicos muestras biológicas estabilizadas y representativas que se necesitan desesperadamente de las que puede extraerse ADN no sesgado. La entrada de ADN no sesgado, es decir, una instantánea representativa del microbioma intestinal en el punto de obtención de la muestra, mejorará la calidad y precisión de los análisis posteriores, permitirá evaluaciones comparativas más precisas de las diferencias entre e intraindividuales, así como también las diferencias entre estudios, para estudiar las variaciones en las comunidades microbianas intestinales humanas, en la salud y la enfermedad. El ADN de alto peso molecular, intacto, no sesgado y rico es fundamental para la construcción de bibliotecas metagenómicas y la caracterización de vías genéticas intactas, ya sea mediante enfoques basados en secuencias o basados en selecciones funcionales. Además, la degradación excesiva del ADN en las muestras biológicas reduce la eficiencia de la secuenciación escopeta.

Solo en los últimos años se ha prestado una atención significativa a la composición filogenética del ADN extraído de las heces, en relación con la comunidad bacteriana en las heces recientes. Es una práctica común, principalmente por razones prácticas, congelar muestras de heces después de la obtención y, después de un período de tiempo muy variable, extraer el ADN para análisis posteriores, como secuenciación o PCR cuantitativa (qPCR). Sin embargo, de manera crítica, entre los estudios publicados y dentro de ellos parece haber una variabilidad considerable en: 1) el período de tiempo entre la defecación y la congelación de las heces "recientes"; 2) condiciones y duración del transporte; 3) período de tiempo que se congelaron las heces antes del análisis; 4) el tiempo y la temperatura empleados para descongelar las heces congeladas; y 5) tiempo variable desde la obtención antes de que la primera alícuota se aísle y procese para el ADN. En estos estudios, T = 0 representa el momento en que estas muestras obtenidas, congeladas y, frecuentemente, almacenadas, se han descongelado para su procesamiento, no el momento de la defecación.

Sin embargo, en estudios metagenómicos de la microbiota humana, los estudios han demostrado claramente que las condiciones de almacenamiento de las muestras de heces pueden afectar adversamente la composición comunitaria inferida. Por ejemplo, Bahl y otros (2012), demostraron mediante el uso de qPCR y 6 pares de cebadores diferentes dirigidos a genes de ARNr 16S de grupos bacterianos significativos, que la congelación de muestras de heces a -20 °C durante 53 ± 5 días antes de la extracción afectaba la relación entre los dos filos más predominantes, a saber, el Firmicutes y Bacteroidetes, un biomarcador de uso frecuente en microbiología intestinal. Específicamente, la relación de genes de ARNr 16S de Firmicutes a Bacteroidetes fue significativamente mayor en las muestras fecales que habían sido congeladas, en comparación con muestras idénticas que no lo habían hecho. Se necesita desesperadamente un medio para capturar o tomar instantáneas de al menos tres aspectos clave de la comunidad microbiana original o in vivo en muestras de heces obtenidas, tras estabilizar i) la abundancia de cada microbio, ii) la riqueza de toda la comunidad, y iii) perfiles de ADN microbiano total.

La estabilización (y extracción) eficiente y no sesgada del ADN bacteriano genómico total de muestras fecales complejas es una primera etapa crucial para los estudios de base molecular de la comunidad bacteriana en el intestino, por ejemplo, la generación de perfiles del microbioma que representan el estado in vivo del donante. En particular, el estudio de las comunidades microbianas requiere capturar una "instantánea" del perfil de la microbiota inmediatamente después de la obtención. Está claro que la obtención actual de muestras fecales en el campo es no práctica, costosa y no escalable (McLnnes y Cutting, 2010). También se conoce bien en el campo que los problemas relacionados con la obtención de muestras provocan resultados inconsistentes y baja reproducibilidad. Además, el manejo de muestras sólidas plantea un desafío para la automatización, lo que aumenta el costo y limita el tamaño de los estudios longitudinales.

Para eliminar los sesgos fuertes entre y dentro de los estudios entre los laboratorios, es necesario desarrollar e implementar un método estandarizado o universal para la obtención y estabilización de muestras biológicas en el punto de obtención, antes de ser sometidas a temperaturas desfavorables, frecuentemente extremas, durante el transporte y el almacenamiento prolongado. El presente método de homogeneización de muestras biológicas, en particular, muestras de tipo muy variable, complejas y no homogéneas, que van desde líquidos a sólidos duros, en una composición estabilizadora eficaz del a Dn en el punto de obtención de la muestra, garantiza la máxima integridad del ADN en toda la muestra, lo que representa lo más posible al estado in vivo.

Actualmente, muchos estudios reclutan donantes para obtener muestras de heces y no proporcionan ningún medio de estabilización o requieren el uso de bolsas de hielo durante el transporte. El Proyecto del Microbioma Humano (HMP), un programa iniciado bajo la hoja de ruta del National Institutes of Health (NIH), patrocina estudios para caracterizar el microbioma humano y analizar su papel en la salud y las enfermedades humanas. Todos los miembros que participan en el estudio HMP Core Microbiome Sampling deben seguir el Manual de procedimientos (Mclnnes & Cutting, 2010) que describe, entre otras cosas, la obtención de muestras del tracto GI (véase la sección 7.3.3). A los sujetos se les proporciona un kit de obtención de heces y se les exige que obtengan muestras de heces dentro de un período de 24 horas antes de llevar las muestras a la clínica. Los kits de HMP incluyen dos recipientes de obtención de heces (uno es de respaldo) que se asemejan a grandes botes de margarina, un recipiente de envío Thermosafe (una caja grande de espuma de poliestireno dentro de una caja de cartón), 8-10 paquetes polares para el transporte de la muestra (a aproximadamente 4 °C), instrucciones, etiquetas y otros materiales de embalaje. Antes de obtener una muestra, los sujetos deben colocar los paquetes de gel en su congelador durante al menos 12 horas. Las heces se depositan directamente en el recipiente de obtención, se coloca la tapa y todo el recipiente se sella en una bolsa Ziplock, antes de empaquetarlas en la caja de poliestireno, completamente rodeada por 8-10 paquetes de gel congelado. La caja de poliestireno se cierra, se sella dentro de una caja de cartón y el sujeto transporta este voluminoso paquete al laboratorio clínico.

Los requisitos existentes de la cadena de frío para enviar muestras recientes empaquetadas en hielo o hielo seco, selladas en recipientes y cajas de poliestireno y cartón voluminosas/neveras, son muy costosos, incluso prohibitivos para los investigadores que realizan estudios que requieren un número de moderado a grande de donantes. Simplemente, el envío de un recipiente de obtención de heces disponible comercialmente, rodeado de bolsas de hielo congeladas, en un recipiente de poliestireno, dentro de una caja de envío de cartón o sobreembalaje (16 x 13 x 14 pulgadas), cuesta aproximadamente $ 175 cada uno con el servicio de entrega al día siguiente de u Ps dentro de Estados Unidos. Esta estimación no tiene en cuenta el costo del recipiente de obtención de heces ni los materiales de envío. Además, muchas instalaciones de prueba requieren que las muestras biológicas se envíen en hielo seco, lo que añade un costo considerable a esta estimación de envío. Una vez que el laboratorio recibe estos grandes recipientes de envío, el personal debe desempacar inmediatamente y procesar rápidamente las muestras biológicas o colocar los recipientes de obtención en grandes congeladores de almacenamiento hasta que pueda realizarse el procesamiento por lotes. Por el contrario, la presente invención alivia la mayor parte de los costes de envío y los inconvenientes actuales y, de manera más importante, asegura que el ADN de las muestras biológicas obtenidas se estabilice en el punto de obtención a la temperatura ambiental. Desde la perspectiva del donante, la muestra biológica se obtiene en la privacidad de su hogar, una pequeña porción de la muestra se transfiere a un tubo o recipiente familiar que ya contiene solución estabilizadora, se aplica una tapa al tubo y se agita manualmente para mezclar, el tubo se sella en una bolsa de riesgo biológico y se envía por correo a la instalación de prueba en un sobre de burbujas o en una caja pequeña a una fracción de los costos actuales.

Ejemplos

Materiales y métodos

Los siguientes materiales y métodos generales se usan en los ejemplos que siguen, excepto cuando se especifican diferentes condiciones en los mismos.

Obtención de muestras de heces

Cada uno de los donantes sanos recibió los siguientes suministros para una obtención: a) un recipiente de obtención de heces (se sienta en el inodoro); b) una jeringa para la obtención volumétrica de heces de aproximadamente 400 mg (es decir, una jeringa de 3 ml con la punta cortada, el émbolo ajustado a un volumen de obtención de 400 mg); c) un tubo Sarstedt de fondo redondo (tubo de fondo redondo de 10 ml (92 x 15,3 mm), núm. de cat. 60.610; Sarstedt) que contiene la presente composición (2 ml) y varios medios de homogeneización (por ejemplo, cojinete de bolas de acero inoxidable de 7,9 mm, 420/440 SS Grado 25, Aimark Travers LTD, u otros como se señala a continuación); y d) instrucciones de obtención de heces. Los tubos se pesaron antes y después de la obtención para determinar la cantidad real de muestra de heces obtenida. A cada donante se le pidió que llenara la punta de la jeringa con heces hasta el volumen marcado (400 mg) y transfiriera la muestra de heces al tubo. Para una completa homogeneización de las muestras, los tubos se agitaron manualmente durante 20-30 segundos.

Extracción de ADN a partir de muestras de heces en la presente composición

A menos que se indique lo contrario, se transfirieron 400 mg de heces a un tubo Sarstedt (tubo de fondo redondo de 10 ml (92 x 15,3 mm), núm. de cat. 60.610; Sarstedt) que contiene 2 ml de la presente composición (especificada en los ejemplos siguientes) y un cojinete de bolas de acero inoxidable de 7,9 mm. El ADN se extrajo fácilmente de alícuotas de 250 |jl de muestras de heces obtenidas y almacenadas en la presente composición mediante el uso de varios kits de aislamiento de ADN disponibles comercialmente. Se encontró que las muestras de heces en las presentes composiciones eran compatibles con el kit de aislamiento de ADN PowerSoil® (MO BIO Laboratories, Inc., núm. de cat. 12888-100), kit de aislamiento de ADN PowerFecal™ (MO BIO Laboratories, Inc., núm. de cat. 12830­ 50), Zymo Research Fecal DNA MiniPrep que incorpora el batidor de perlas (Zymo Research, núm. de cat. D6010), QlAamp DNA Feces Mini Kit (Qiagen, núm. de cat. 51504) y el kit PSP Spin Feces DNA Plus (Invitek, núm. de cat.

1038110200).

De acuerdo con las instrucciones del kit de aislamiento de ADN PowerFecal®, se siguió el siguiente procedimiento [Nota: se eliminó la etapa de calentamiento a 65 °C]:

1. Al tubo PowerBead provisto, se le añadieron 750 |jl de solución de perlas y 250 |jl de muestra de heces en la presente composición. El tubo se agitó suavemente para mezclar.

2. Se añadieron 60 j l de Solución C1 y el tubo se invirtió varias veces o se agitó brevemente en vórtice. 3. El tubo PowerBead se aseguró en el adaptador del vórtice y se agitó durante 10 minutos a la velocidad máxima.

4. El tubo PowerBead se centrifugó a 10000 x g durante 30 segundos.

5. El sobrenadante se transfirió a un tubo de obtención limpio de 2 ml (incluido).

6. Se añadieron 250 j l de Solución C2 y el tubo se agitó con vórtice durante 5 segundos, después se incubó a 4 °C durante 5 minutos.

7. El tubo de obtención se centrifugó a la temperatura del local durante 1 minuto a 13000 x g.

8. Se evitó el sedimento, se transfirieron hasta, pero no más de, 600 j l de sobrenadante a un tubo limpio de 2 ml.

9. Se añadieron 200 j l de Solución C3 y el tubo se agitó con vórtice brevemente, después se incubó a 4 °C durante 5 minutos.

10. El tubo se centrifugó a la temperatura del local durante 1 minuto a 13000 x g.

11. Se evitó el sedimento, se transfirió hasta, pero no más de, 750 j l de sobrenadante a un tubo limpio de 2 ml.

12. La solución C4 se mezcló antes de su uso. Se añadieron 1200 j l de Solución C4 al sobrenadante y el tubo se agitó con vórtice durante 5 segundos.

13. Se cargaron 675 j l en un filtro giratorio y se centrifugaron a 13000 x g durante 1 minuto. Se descartó el flujo a través y se añadieron 675 j l adicionales de sobrenadante al filtro giratorio y se centrifugó a 13000 x g durante 1 minuto. El sobrenadante restante se cargó en el filtro giratorio y se centrifugó a 13000 x g durante 1 minuto.

14. Se añadieron 500 j l de solución C5 al filtro giratorio y se centrifugó a la temperatura del local durante 30 segundos a 13000 x g. Se descartó el flujo a través.

15. Se centrifugó nuevamente a la temperatura del local durante 1 minuto a 13000 x g.

16. El filtro giratorio se colocó cuidadosamente en un tubo de obtención limpio de 2 ml (incluido).

17. Se añadieron 100 j l de Solución C6 al centro de la membrana de filtro blanca.

18. El tubo se centrifugó a la temperatura del local durante 30 segundos a 13000 x g.

19. El ADN se almacenó congelado (de -20 a -80 °C).

Determinación de la concentración de ADN en muestras purificadas

A. Determinación de la absorbancia de la concentración de ADN

La medición de la absorbancia a 260 nm (A260 nm) se usa comúnmente para la cuantificación de ADN. Una absorbancia de 1,0 a 260 nm corresponde a una concentración de 50 ng/jl para ADN bicatenario puro. Los rendimientos de ADN de muestras de heces purificadas, tratadas con o sin las presentes composiciones en diversas condiciones, se determinaron mediante el uso de un espectrofotómetro NanoDrop 2000c (Thermo Fisher Scientific Inc.). Se colocó un volumen de 2 j l de cada muestra de ADN en el pedestal y se exploró de 220 nm a 350 nm con absorbancias medidas a 230 nm, 260 nm y 280 nm. La concentración de ADN de la muestra (ng/jl), la relación A260/A280 y la relación A260/A230 se informaron mediante el programa NanoDrop 2000c. El rendimiento total de ADN por muestra se calculó tras multiplicar la concentración de la muestra por el volumen de elución de ADN respectivo.

B. Determinación fluorométrica de la concentración de ADN

Las desventajas de usar A260nm incluyen (i) insensibilidad del ensayo e (ii) interferencia por componentes que no son de ADN, como ARN, particularmente en muestras que no están muy purificadas. Los rendimientos de ^a Dⁿ a partir de las muestras purificadas también se cuantificaron mediante el uso del colorante fluorescente PicoGreen® (200x; Invitrogen, núm. de cat. P7581); ADN Lambda (Invitrogen, núm. de cat. 25250-010) se usó para generar una curva estándar [por triplicado; 0-50 ng/|jl]. PicoGreen® es un colorante fluorescente de unión al ADN de doble hebra (excitación de 485 nm/emisión de 535 nm) que permite la cuantificación sensible de cantidades de sub-nanogramos de ADN de doble hebra (dsDNA). Se procesaron alícuotas triplicadas de cada muestra purificada y estándares de ADN Lambda en una microplaca negra de 96 pocillos de fondo plano (Greiner Bio-One, núm. de cat. 655209) y la fluorescencia se midió mediante el uso de un lector de microplacas Infinite M200 (TECAN).

Integridad del ADN en muestras almacenadas en composiciones estabilizadoras

Se diluyó una alícuota de cada muestra purificada a 10 ng/jl, sobre la base de la concentración determinada por PicoGreen (arriba). Para evaluar la integridad del ADN, se separaron aproximadamente 80 ng de cada muestra de heces purificada y diluida en un gel de agarosa al 1 % mediante electroforesis durante 30 minutos a 100 voltios. El gel se tiñó con 1 jg/ml de bromuro de etidio (EtBr) en agua destilada durante 15 minutos a la temperatura del local, se enjuagó y fotografió en un transiluminador UV mediante el uso de un sistema de formación de imágenes DigiDoc-IT™ (UVP LLC). Se determinó que el ADN estaba estabilizado e intacto cuando la banda teñida en el gel era nítida y > 23 Kb, en comparación con la escalera de ADN. Escalera de ADN de 1Kb+ (Life Technologies, núm. de cat. 10787­ 018) o fragmentos de ADN Lambda/Hind III (Life Technologies, núm. de cat. 15612-013) se usaron como referencias de tamaño.

a. Se preparó gel de agarosa al 1 % (80 ml de TAC 1x 0,8 g de agarosa).

b. Se añadieron 2 j l de tampón de carga 5x a 8 j l de 10 ng/jl de muestra purificada.

c. En los pocillos de un gel de agarosa al 1 % preparado se cargaron 10 j l de muestra preparada (etapa b); 5 j l de ADN Lambda/fragmentos Hind III y/o 5 j l de escalera de ADN de 1 Kb.

d. El gel se corrió a 100 V durante 30 minutos.

e. El gel se tiñó en EtBr (500 j l 1 mg/ml de EtBr 500 ml de agua) durante 15 minutos.

f. El gel se destiñó en agua durante 5 minutos.

g. Las imágenes se tomaron bajo luz ultravioleta.

Electroforesis en gel de gradiente desnaturalizante (DGGE)

Para evaluar de manera precisa y reproducible la estabilidad de varios microbiomas (heces, saliva, esputo, piel, etcétera) en la presente composición, se utilizó un nuevo método llamado Electroforesis en gel de gradiente desnaturalizante (DGGE). Este método se basa en la idea de que si uno toma una región variable del gen del ARNr 16S bacteriano (en este caso la región V3) y la amplifica mediante el uso de PCR y cebadores en la región conservada flanqueante, los amplicones tendrán un punto de fusión único para la especie de bacteria (incluso las diferencias de nucleótidos afectarán la masa fundida y, por lo tanto, darán un perfil diferente).

Cuando este método se aplica a una muestra que contiene múltiples especies de bacterias, la amplificación mediante el uso de cebadores conservados dará como resultado una matriz de amplicones, todos los cuales tienen aproximadamente la misma longitud, pero tienen una composición de nucleótidos diferente en el área no conservada. A continuación, estos amplicones se corren en un gel que contiene un gradiente de solución desnaturalizante (urea y formamida). Los amplicones se desnaturalizarán en diferentes etapas del gel, en dependencia de su composición de nucleótidos, lo que da así una resolución de todas las especies que estaban presentes en la muestra.

Para que los amplicones de ADN no se desnaturalicen a una forma monocatenaria, se añadió una abrazadera CG de ~30 nucleótidos al cebador directo que retarda la migración de los amplicones en el gel una vez que la sección variable se ha desnaturalizado. En general, un gradiente desnaturalizante del 40 %-60 % en el gel proporciona una buena resolución de las bandas, mientras captura la mayoría de las especies intestinales. El gel se corre a una temperatura constante de 60 °C para facilitar la desnaturalización de los amplicones y también mantener el gel a la misma temperatura durante toda la corrida.

Las imágenes de gel DGGE se analizaron mediante el uso del programa Syngene GeneTools (versión 4.03.00, Syngene). El fondo de la imagen se restó mediante el uso del método de disco rodante con un radio de 30 píxeles. Los carriles se detectaron y configuraron manualmente. La ubicación y el ángulo de inicio y final de Rf se establecieron en manual para ajustar la "sonrisa" en el gel. Las bandas para el análisis se detectaron automáticamente para cada carril; la detección de picos se estableció por defecto (ancho mínimo de 7 píxeles, altura de pico mínima de 3 y volumen de pico mínimo de 1 %). Los perfiles se emparejaron mediante el uso del tipo "perfil" en el menú de parámetros de emparejamiento con una tolerancia establecida del 1 %. La comparación de perfiles dio como resultado una matriz de similitud generada automáticamente, con valores de similitud que van de 0 a 100. En términos generales, para el % de similitud, esto se refiere a cualquier cambio entre 2 perfiles, habitualmente diferencias en las intensidades de banda. Por tanto, el % de similitud proporciona una medida de la diferencia en abundancia de especies. Cuando no hay una banda entre los perfiles, el impacto en el % de similitud es mayor que cuando esa banda simplemente se reduce en intensidad.

El gel DGGE que se muestra en la Figura 1 ilustra cuán diferente puede aparecer el perfil del microbioma de las muestras de heces de dos donantes diferentes; sólo existe un 22 % de similitud entre la primera muestra de heces (donante A) y la segunda muestra (donante B).

La PCR-DGGE se realizó de acuerdo con el procedimiento que se describe a continuación.

Amplificación por PCR para DGGE (mediante el uso de cebadores 16S con pinza 5 'en cebador directo)

a. Se añadieron 2 |jl de 10 ng/|jl de ADN a tubos de PCR de 12 tiras.

b. Se preparó la mezcla maestra (98 jl/reacción): 76,7 j l de agua, 10 j l de tampón PCR 10x, 4 j l de MgCh 50 mM, 2,5 j l de dNTP 10 mM, 2 j l de cebador inverso (PPUN518R, 5'-ATTACCGCGGCTGCTGG -3') 10 pmol, 2 j l de cebador directo 10 pmol (PRBA338F, 5'-CGCCCGCGCGCGGCGGGCGGGGCGGGGGCACGGGGGGACTCCTACGGGAGGCA GCAG-3'), y 0,8 j l de Taq 5 U/jl.

c. Se añadieron 98 j l de mezcla maestra a cada tubo.

d. La PCR se ejecutó en una máquina de PCR convencional: 1 ciclo a 92 °C durante 2 minutos; 28 ciclos a 92 °C durante 60 segundos, 55 °C durante 30 segundos, 72 °C durante 60 segundos; seguido de 1 ciclo a 72 °C durante 6 minutos.

DGGE de amplicones de PCR

a. Se prepararon soluciones madre para un gel de acrilamida/bis al 8 % en soluciones desnaturalizantes al 40 % y al 60 %:

40 % 60 %

Acrilamida/bis 40 % 20 ml 20 ml

Tampón TAE 50x 2 ml 2 ml

Formamida (desionizada) 16 ml 24 ml

Urea 16,8 g 25,2 g

ddH2O Hasta 100 ml Hasta 100 ml

b. Las placas de vidrio y los espaciadores se ensamblaron de acuerdo con el manual de instrucciones del sistema DCode (Bio-Rad).

c. Para preparar y verter un gel de acrilamida/bis al 8 % con un gradiente paralelo mediante el uso de soluciones desnaturalizantes al 40 % y al 60 %, se usó el siguiente procedimiento:

• Se midieron 20 ml de soluciones desnaturalizantes al 40 % y 60 % en 2 vasos separados etiquetados como "baja densidad" y "alta densidad", respectivamente;

se añadieron 200 j l de persulfato de amonio (APS) al 10 % a cada solución;

se añadieron 20 j l de TEMED a cada solución;

Las soluciones se mezclaron bien mediante agitación;

Cada solución se introdujo en una jeringa separada de 20 ml;

Las jeringas se unieron al aparato de carga de gel donde se especificó "baja densidad" o "alta densidad" para el llenado superior;

Nota: La configuración de ajuste de volumen para un gel de 16 x 16 cm con espaciadores de 1,0 mm fue de 18,5 ml;

El tubo en Y se unió a cada una de las jeringas, con una aguja en el otro extremo del tubo;

La aguja se colocó entre las placas de vidrio;

El gel se vertió lenta y constantemente tras girar la rueda para que el gradiente tuviera tiempo de nivelarse; Se dejó polimerizar el gel durante algunas horas;

El tubo en Y se lavó con agua.

d. El sistema de corrida en gel se precalentó con tampón TAE 1x a 55 °C.

e. Se añadieron 8 j l de colorante de carga Fermentas 6x a 42 j l de producto de PCR.

f. El gel se corrió durante 5 minutos a 200 V antes de encender la bomba de recirculación para sacar las muestras de los pocillos y meterlas en el gel.

g. El gel se corrió durante 14 horas a 70 V con la bomba de recirculación encendida.

h. El gel se tiñó con Sybr Gold 1x durante 30 minutos (250 ml IxTAE 25 |jl 10,000x SybrGoId). i. El gel se destiñó en TAE 1x durante 5 minutos.

j. Las imágenes se tomaron bajo luz ultravioleta.

La PCR de ARNr 16S se realizó mediante el uso de cebadores universales (región V3) seguido de DGGE mediante el uso del Sistema de Detección de Mutación Universal DCode (Bio-Rad).

Secuenciación de ARNr 16S

Se llevaron a cabo la preparación, la secuenciación y la bioinformática de la biblioteca de secuenciación de ARNr 16S. La secuenciación de amplicones de extremos pareados de la región hipervariable V4 se realizó mediante el uso de Illumina® MiSeq® (250 ciclos). Mediante el uso de QIIME y scripts personalizados, las secuencias se filtraron por calidad. Las lecturas de los extremos pareados se reunieron y se buscaron en la base de datos de referencia de Greengenes, agrupadas al 97 % por UCLUST. Después de la normalización de los datos, la distancia de muestra a muestra se midió mediante el uso de Unifrac ponderado en datos de abundancia de OTU (unidades taxonómicas operativas) (utiliza diferencias de abundancia de taxón entre muestras, mediante el empleo de una normalización por pares tras dividir la suma de diferencias por la suma de todas las abundancias) y datos de incidencia de Unifrac no ponderados (considera solo la presencia/ausencia de taxones).

Amplificación de ADN humano a partir de muestras de heces purificadas almacenadas en la presente composición La estabilidad del ADN humano en muestras de heces obtenidas en la presente composición (detallada a continuación) y almacenadas a la temperatura del local durante 2 semanas, antes de la extracción total del ADN (MoBio PowerSoil o PowerFecal DNA Isolation Kit), se evaluó en PCR en tiempo real o cuantitativa (qPCR) mediante el uso de cebadores que se dirigen al gen de la timidilato sintasa humana de copia única (locus TYMS; NM001071.2). Para cada reacción, se amplificaron 50 ng de ADN purificado en un volumen de 25 j l que contenía: tampón de PCR 1x (Tris 20 mM, KCI 50 mM), MgCh 2 mM, dNTp 200 jM (Invitrogen), BSA 50 jg/ml (Sigma Aldrich), colorante SYTO9 1 jM (Invitrogen), 0,4 jM de cada cebador hTSm143F (5'-GCCCTCTGCCAGTTCTA-3') y hTSm143R (5'-TTCAGGCCCGTGATGT-3'; Invitrogen), polimerasa Taq 1U (Invitrogen). Las condiciones de amplificación para la diana TS143 fueron: 1 ciclo a 95 °C durante 5 minutos; 35 ciclos a 95 °C durante 20 segundos, 55 °C durante 20 segundos, 72 °C durante 30 segundos; seguido de 1 ciclo a 72 °C durante 10 minutos. Se incluyó un programa de curva de fusión y consistió en: 1 ciclo a 95 °C durante 30 segundos a una velocidad de rampa de 4,4 °C/segundo (sin adquisición), 72 °C durante 10 minutos a una velocidad de rampa de 2,2 °C/segundo (sin adquisición), 95 °C a una velocidad de rampa de 0,11 °C/segundo (adquisición continua). Las muestras de ADN se corrieron por triplicado en un Corbett Rotorgene RG-6000 y los valores de Ct para cada muestra se calcularon mediante el uso del programa Rotorgene serie 60001.7. El valor Ct se refiere al número de ciclo fraccional en el punto donde la curva de amplificación cruza un umbral de detección. Tras establecer una línea de umbral y calcular la intersección con cada una de las curvas de muestra, se establecen los valores de Ct para cada muestra. La línea de umbral se establece en la fase exponencial de la corrida, significativamente por encima del nivel de fondo para evitar ruido y por debajo del inicio de la meseta de la señal en ciclos posteriores. Generalmente, el valor de Ct es inversamente proporcional a la cantidad de ADN en la muestra ACt, representa la diferencia en los valores de Ct que resultan de dos alícuotas tomadas de la misma muestra en diferentes momentos, por ejemplo, T = 0 y T = 14 días después la obtención de la muestra.

EJEMPLO 1 - Comparación de diferentes agentes quelantes en composiciones para estabilizar el ADN en muestras fecales

Debido a las grandes cantidades de nucleasas en las heces, principalmente de origen bacteriano, los inventores experimentaron con diferentes agentes quelantes y concentraciones de estos, durante el desarrollo de la presente composición.

Las composiciones descritas en el ejemplo actual contenían etanol al 23,5 %, SDS al 0,5 % y Antiespumante A al 0,1 %, junto con EDTA o CDTA en cantidades variables, tamponadas a pH 11 con P-alanina 50 mM. Los porcentajes de etanol y Antiespumante A son (v/v %) en este y los siguientes ejemplos, y los porcentajes de otros componentes (SDS, triclosán) están en (p/v %).

Con referencia a la Figura 2, las heces se obtuvieron por un donante sano y las muestras de 400 mg se homogeneizaron en varias soluciones de estabilización o se almacenaron en ausencia de tampón de estabilización (no estabilizadas) durante 14 días a la temperatura del local (RT, 19-23 °C) antes de la extracción de ADN con un kit disponible comercialmente (PowerSoil o PowerFecal DNA Isolation Kit, MoBio). Al comparar la calidad o integridad del ADN purificado en T = 0 y T = 14 días, el gel de agarosa muestra claramente que el ADN de alto peso molecular en las heces no tratadas se degrada significativamente durante el almacenamiento a RT (control, últimos 2 carriles de gel de agarosa), mediante la formación de una mancha en el gel. También se homogeneizaron muestras (400 mg) de las heces del mismo donante en: 1) la presente composición, que incluye cantidades crecientes de CDTA (150, 300, 500 mM); y 2) la presente composición en la que se reemplazó CDTA por EDTA (150, 300, 500 mM).

Sorprendentemente, en todas las concentraciones analizadas (150, 300, 500 mM) con muestras fecales, el CDTA se desempeñó significativamente mejor que el EDTA para estabilizar el ADN de alto peso molecular tanto en muestras recién obtenidas (T = 0) como después de la exposición a RT durante 14 días (Figura 2). De hecho, EDTA, pero no CDTA, fue inesperadamente perjudicial para la estabilización (y extracción) de ADN de alto peso molecular a concentraciones superiores a 150 mM.

Además, una comparación de concentraciones mayores (150, 300 y 500 mM) de EDTA y CDTA (Tabla 4), respalda el sorprendente descubrimiento de que el CDTA es superior al EDTA para estabilizar los perfiles del microbioma, como se ejemplifica a través de la ^pC^r del gen ARNr 16S bacteriano y análisis DGGE de los amplicones, como se describe en la sección de Materiales y métodos anterior. Después de 14 y 30 días a RT, el ^a Dⁿ a partir de las muestras fecales almacenadas en la presente composición con CDTA mantuvo un alto por ciento de similitudes con las muestras de control procesadas a T = 0. En contraste, el perfil del microbioma del ADN de las mismas heces almacenadas en la presente composición sustituida con EDTA mostró una disimilitud creciente con el tiempo a RT, en comparación con las muestras de control (procesadas en T = 0; Tabla 4).

Tabla 4. Estabilidad del microbioma de las heces almacenadas en composiciones con concentraciones crecientes de agentes quelantes.

Por lo tanto, el CDTA superó sorprendentemente al EDTA en su capacidad para estabilizar el ADN de alto peso molecular, intacto, de alta calidad y tomar una instantánea del perfil del microbioma en heces complejas y no homogéneas. Por tanto, los quelantes tales como CDTA, con una constante de disociación mayor que el EDTA, proporcionan la mejor estabilización del ADN en muestras biológicas, tales como muestras fecales, y son particularmente preferidos para su uso en las composiciones descritas en la presente. Esta capacidad de estabilizar las muestras en el punto de obtención de muestras ayudará a eliminar los fuertes sesgos que se observan actualmente entre los estudios y dentro de ellos en los laboratorios.

EJEMPLO 2 - Papel del pH y los agentes quelantes en la estabilidad de la muestra fecal en la presente composición Se investigaron las relaciones complejas entre la mezcla de la muestra fecal, el pH y la concentración del agente quelante por sus efectos sobre la estabilidad del perfil del microbioma, como se ejemplifica a través de la PCR del gen de ARNr 16S bacteriano y el análisis de DGGE de los amplicones.

En el primero de cuatro experimentos, un donante sano obtuvo heces y transfirió 400 mg de heces a cuatro tubos que contenían cada uno una bola de acero inoxidable de 7,9 mm y 2 ml de cualquier composición "104B a pH 9,5" (CDTA 300 mM, etanol al 23,5 %, SDS al 0,5 %, Antiespumante A al 0,1 %, pH 9,5) o "104B a pH 11" (CDTA 300 mM, P-alanina 50 mM, etanol al 23,5 %, SDS al 0,5 %, Antiespumante A al 0,1 %, pH 11). Las muestras en los tubos se dejaron en reposo (sin mezcla) o se homogeneizaron con agitación manual (mezcla) y después se devolvieron al laboratorio en las condiciones de temperatura ambiental. Dentro de las 3-4 horas posteriores a la obtención de la muestra, se extrajo una alícuota de 250 |jl de cada tubo para la extracción de ADN (T = 0) y después las muestras se estresaron tras almacenarlas a 30 °C durante 24 horas, seguido de -20 °C durante 11 días (T = 11), antes de la extracción de ADN de una segunda alícuota. El ADN purificado se cuantificó y después se determinaron los perfiles o huellas de la comunidad bacteriana mediante el uso de DGGE para separar los amplicones de PCR del gen del ARNr 16S. El por ciento de similitud entre las muestras (carriles en gel de DGGE), en comparación con la muestra de control en T = 0 para cada composición, se calculó por separado mediante el uso del programa Syngene GeneTools (véase Materiales y métodos).

La Figura 3 ilustra el por ciento mejorado de similitudes o la estabilidad del perfil del microbioma entre las muestras de 'sin mezcla del día 11' y las muestras de 'mezcla del día 0' cuando el pH de la presente composición aumenta de 9,5 a 11, lo que indica que el pH 11 ofrece una estabilidad adicional del ADN que el pH 9,5. Además, las muestras de 'mezcla del día 11', en tubos que usan los medios de homogeneización presentes, una bola de acero densa, condujeron constantemente a una estabilidad mejorada del perfil del microbioma en comparación con las muestras de 'mezcla del día 11', a ambos valores de pH analizados y, en particular, a pH 11.

En un segundo experimento, se abordó la relación entre el pH y la concentración de CDTA. Se transfirieron alícuotas (400 mg) a partir de las heces de un donante sano a tubos que contenían una bola de metal de acero inoxidable de 7,9 mm y 2 ml de una de tres composiciones: 1) 104B a pH 9,5 (como anteriormente); 2) CDTA 50 mM, 3-alanina 50 mM, etanol al 23,5 %, SDS al 0,5 %, triclosán al 0,2 %, Antiespumante A al 0,1 %, a pH 11,5; y 3) c DtA 50 mM, etanol al 23,5 %, SDS al 0,5 %, triclosán al 0,2 %, Antiespumante A al 0,1 %, a pH 9,5. Las muestras se homogeneizaron mediante mezcla manual y se devolvieron al laboratorio en las condiciones de temperatura ambiental donde se obtuvo una alícuota de T = 0 (250 |jl) y se extrajo el ADN. El resto de las muestras se almacenaron a la temperatura del local durante 4 y 14 días, se extrajeron alícuotas y extrajo el ADN en cada momento.

La electroforesis en gel de agarosa reveló que la composición de CDTA 300 mM a pH 9,5 (104B a pH 9,5) estabilizó el ADN de alto peso molecular durante al menos 14 días, y mostró una estabilización superior del ADN de alto peso molecular que las otras dos composiciones que contenían una composición de CDTA 50 mM ya sea a pH 9,5 o 11,5 (datos no mostrados). Sin embargo, la presencia de ADN de alto peso molecular, intacto, no indica de manera confiable que se haya logrado tomar una instantánea del microbioma. En ausencia de una solución de estabilización eficaz, las especies bacterianas pueden replicarse o morir, sin alterar la cantidad total de ADN, así como también su calidad. Por lo tanto, los perfiles del microbioma de las muestras se examinaron mediante PCR del gen de ARNr 16S bacteriano y análisis de DGGE de los amplicones, como se describió en la sección de Materiales y métodos anterior. Con referencia a la Figura 4 y la Tabla 5, el análisis de DGGE reveló que la composición de CDTA 300 mM a pH 9,5 exhibió una excelente estabilización del perfil del microbioma (similitud del 94-96 % en comparación con el control t = 0) durante al menos 14 días a la temperatura del local. La eficacia de la composición de CDTA 300 mM a pH 9,5 para estabilizar el perfil del microbioma fue sorprendentemente superior a la de la composición de CDTA 50 mM a pH 9,5, que exhibió solo un 15 % de similitud en comparación con el control t = 0 después de 14 días a la temperatura del local. La composición de pH 11,5 con CDTA 50 mM pareció "rescatar" algo la degradación considerable del ADN según el perfil del microbioma observado en la composición de pH 9,5 con CDTA 50 mM. Por lo tanto, se requiere una combinación de alta concentración de CDTA y pH considerablemente alcalino para estabilizar el perfil del microbioma de las muestras fecales.

Tabla 5: Análisis del perfil del microbioma de muestras fecales almacenadas en diversas composiciones durante 14 días a la temperatura del local.

En un tercer experimento, se abordó más la relación entre el pH y la concentración de CDTA en la presente composición. Se transfirieron alícuotas (400 mg) de las heces de un donante sano a tubos que contenían una bola metálica de acero inoxidable de 7,9 mm y 2 ml de una de dos composiciones: 1) CDTA 300 mM, etanol al 23,5 %, SDS al 0,5 %, triclosán al 0,2 %, Antiespumante A al 0,1 %, a pH 9,5; y 2) CDtA 50 mM, etanol al 23,5 %, SDS al 0,5 %, triclosán al 0,2 %, antiespumante A al 0,1 %, pH 7,4. Las muestras se homogeneizaron mediante mezcla manual y se devolvieron al laboratorio en condiciones ambientales donde se obtuvo una alícuota de T = 0 (250 jl) y se extrajo el ADN. El resto de las muestras se almacenaron a la temperatura del local durante 4 días antes de extraer y procesar una segunda alícuota.

La electroforesis en gel de agarosa reveló que la composición de CDTA 300 mM a pH 9,5 estabilizó el ADN de alto peso molecular, intacto, en las heces en mayor medida que la composición de CDTA 50 mM a pH 7,4 durante 4 días a RT, y el análisis de DGGE indicó que esta composición también exhibió una estabilización superior del perfil del microbioma fecal (97 % de similitud con T = 0 contra 10 % de similitud con T = 0, respectivamente - véanse la Figura 5 y la Tabla 6). La estabilidad del perfil del microbioma de las heces homogeneizadas con la composición de pH 7,4 (10 % de similitud con T = 0 después de 4 días a RT) también fue considerablemente menor que la estabilidad del perfil del microbioma de las heces homogeneizadas con la composición de CDTA 50 mM a pH 9,5 (91 % similitud con T = 0 después de 4 días a RT, como se señaló anteriormente).

Tabla 6: Análisis del perfil del microbioma de muestras fecales almacenadas en diversas composiciones durante 4 días a la temperatura del local.

En un cuarto experimento, se abordó la relación entre el pH a una concentración alta y fija de CDTA en la presente composición. Se transfirieron alícuotas (400 mg) de las heces de un donante sano a tubos que contenían una bola metálica de acero inoxidable de 7,9 mm y 2 ml de una de dos composiciones: 1) CDTA 300 mM, etanol al 23,5 %, SDS al 0,5 %, triclosán al 0,2 %, Antiespumante A al 0,1 %, a pH 7,4; y 2) CDTA 300 mM, etanol al 23,5 %, SDS al 0,5 %, triclosán al 0,2 %, Antiespumante A al 0,1 %, a pH 9,5. Las muestras se homogeneizaron mediante mezcla manual y se devolvieron al laboratorio en condiciones ambientales donde a un T = 0, 24 horas y 9 días se obtuvo una alícuota (250 |jl) y se extrajo el ADN.

La electroforesis en gel de agarosa demostró que las muestras fecales mezcladas con una composición a pH 9,5 exhiben una estabilización superior del ADN de alto peso molecular en comparación con las muestras fecales mezcladas con una composición en condiciones de pH cercano al neutro (pH 7,4), incluso en presencia de concentraciones altas (300 mM) de CDTA (véase la Figura 6).

Tomados junto con los resultados mostrados en el ejemplo 1, estos experimentos indican que existen condiciones óptimas para preservar el ADN de alto peso molecular, intacto y los perfiles del microbioma estables durante el almacenamiento a la temperatura del local cuando el pH de la composición es mayor o igual a 9,5, preferentemente de aproximadamente pH 10,5-11,5 o aproximadamente pH 11, y la concentración de CDTA es superior a 50 mM, preferentemente al menos aproximadamente 150 mM, lo más preferentemente aproximadamente 300 mM.

Ejemplo 3 - Estabilización de las heces después de la mezcla con perlas de vidrio y perlas de acero inoxidable Las heces de un donante sano se transfirieron en alícuotas de 400 mg a cuatro tubos que contenían: 1) 2 ml de solución estabilizadora 104B a pH 9,5 (como se definió anteriormente) y cuatro perlas de vidrio de 4 mm más diez de 2 mm; 2) 2 ml de solución estabilizadora 104B a pH 11 (como se definió anteriormente) y cuatro perlas de vidrio de 4 mm más diez de 2 mm; 3) 2 ml de solución estabilizadora 104B a pH 9,5 y una bola de acero inoxidable de 6 mm; 4) 2 ml de solución estabilizadora 104B a pH 11 y una bola de acero inoxidable de 6 mm. El donante agitó los cuatro tubos manualmente hasta que se mezclaron y se llevaron al laboratorio en condiciones ambientales. Dentro de las 3­ 4 horas posteriores a la obtención de la muestra, se extrajo el ADN, se cuantificó y se corrieron 80 ng de cada muestra purificada en un gel de agarosa (véase Materiales y métodos y la Figura 7). Las muestras de perlas de vidrio se agitaron con vórtice y las muestras que contenían bolas de acero se agitaron antes de extraer una alícuota. Este ejemplo demuestra el beneficio de usar una bola mezcladora de acero inoxidable para estabilizar el ADN de alto peso molecular (> 23 Kb), intacto, en heces recién obtenidas a la temperatura del local. Mezclar muestras de heces en tubos de laboratorio que contienen las presentes composiciones, tanto a pH 9,5 como 11, y una sola bola, densa de acero inoxidable (Figura 7B) demostró ser superior a mezclar con múltiples perlas de vidrio pequeñas de dos tamaños (Figura 7A) al comparar la calidad del a Dn de alto peso molecular en geles de agarosa. La mezcla manual de heces con múltiples perlas de vidrio y la presente composición (104B a pH 9,5) tomó significativamente más tiempo que la mezcla con una bola de acero inoxidable, y esta última demostró un resultado superior en términos de preservación del ADN de alto peso molecular, intacto. Sorprendentemente, se observó una mejora en la integridad del ADN en muestras mezcladas con perlas de vidrio con una composición aún más alcalina (pH 11), lo que sugiere que tanto los medios de mezcla/homogeneización como el pH de la solución estabilizadora son críticos. Ejemplo 4 - Tolerancia de volumen de la presente composición

Las heces son una muestra biológica no homogénea que puede variar significativamente en apariencia o dureza, de acuerdo con el estado del sistema digestivo, la dieta y la salud general. Normalmente, las heces son semisólidas, con una cubierta de moco. La escala o tabla de heces de Bristol es una ayuda médica diseñada para clasificar la forma de las heces humanas en siete categorías, que van desde el tipo 1 (grumos duros separados, como nueces) al tipo 7 (completamente líquida, sin trozos sólidos, más del 90 % de agua). En general, las heces consisten en aproximadamente 70-80% de agua, 20-30 % de materia sólida, pero este porcentaje varía de acuerdo con el tipo de muestra (1-7) o el tiempo de residencia de las heces en el intestino. La variabilidad entre la dureza y el contenido de agua de las heces representa un desafío significativo para la obtención de heces y la mezcla completa y consistente con una solución estabilizadora. Las muestras de tipo 1-3 son particularmente difíciles de dispersar por completo en una solución estabilizadora para producir un líquido homogéneo, sin diluir la muestra (y por lo tanto el ADN) demasiado para el análisis posterior. Además, las muestras de tipo 1-3 tienen una mayor tendencia que otros tipos de muestras a absorber líquido lentamente, por ejemplo, solución estabilizadora, lo que da lugar a una suspensión semisólida espesa que puede ser difícil de pipetear en el laboratorio. El mayor contenido de agua de las muestras de tipo 4-7 y la consistencia más suave hacen que estas muestras sean más fáciles de mezclar en una solución estabilizadora y con pipeta. Durante el procesamiento, también puede introducirse variabilidad mediante el método (o el kit comercial) usado para extraer ADN de muestras fecales.

Dada la naturaleza no homogénea de las heces, se comparó la robustez de la presente composición para estabilizar el ADN de alto peso molecular, total, intacto, en los siguientes experimentos de relación. En dos experimentos separados, tres donantes sanos obtuvieron muestras de heces (400 mg) en tubos que contenían una bola de acero inoxidable de 7,9 mm y varios volúmenes de la solución estabilizadora 104B a pH 11 (definida anteriormente), para lograr las siguientes relaciones de heces:solución estabilizadora -1:3, 1:4, 1:5, 1:6, 1:8 y 1:10. Tenga en cuenta que tanto la "relación real" como la "relación" dirigida se indican en los geles, ya que es muy difícil obtener repetidamente con precisión 400 mg de heces con un instrumental rudimentario. Los tubos se pesaron antes y después de la obtención de la muestra para determinar la cantidad exacta de heces obtenidas por volumen de la composición. Los tubos se agitaron manualmente y se extrajeron alícuotas de 250 |jl en T = 0 (Figura 8A) y después de 6 días (Figura 8B), 7 días (Figura 8C), 14 días (Figura 8D), 1 mes (Figura 8E) y 2 meses (Figura 8F) a la temperatura del local. En algunos casos, se extrajeron dos alícuotas para demostrar la reproducibilidad de las réplicas (Figura 8A, C-F). Se extrajo el ADN y se corrieron 80 ng en geles de agarosa al 1 % (Figuras 8A-F). En los carriles marcados con un asterisco (*), se cargó menos de 80 ng de ADN debido al hecho de que algunas muestras tenían una concentración de ADN inferior a 10 ng/jl una vez purificadas. En estos experimentos también se realizaron geles de DGGE (Figura 10A y 10B) y se analizaron los por cientos de similitud para determinar la estabilidad del perfil del microbioma en estas muestras.

Este ejemplo demuestra que una amplia gama de heces: relaciones de solución estabilizadora dieron como resultado ADN de alto peso molecular, intacto, en muestras desde T = 0 hasta al menos 2 meses de almacenamiento a la temperatura del local (Figuras 8A-F). Tan solo 0,8 ml hasta 5,4 ml de la presente composición estabilizaron con éxito los perfiles de ADN y microbioma contenidos en 400 mg de heces durante al menos 2 meses en estas condiciones (Figuras 8A-F y 10A-B). Este amplio intervalo de "trabajo" brinda al investigador la tranquilidad de que los donantes pueden transferir cantidades muy variables de muestra fecal a tubos que contienen un volumen fijo de solución estabilizadora y la muestra permanecerá estable durante al menos 2 meses a la temperatura del local. Las alícuotas de muestra por triplicado (Figura 9) analizadas con DGGE demostraron que el perfil del microbioma entre las alícuotas tomadas de la misma muestra de heces era muy consistente (£ 97 %). Además, el análisis de geles de DGGE para las muestras de los experimentos de relación mostró que los perfiles del microbioma estaban altamente estabilizados (£ 88 % a los 7 días; £ 91 % a los 14 días; £79 % a los 2 meses) en una amplia gama de heces:solución estabilizadora de la presente composición (1:1,8 a 1:10,6) durante períodos prolongados a la temperatura del local (Figura 10A y 10B).

Por lo tanto, las relaciones preferidas de heces:solución estabilizadora pueden variar de aproximadamente 1:1 a 1:20, preferentemente de 1:1 a 1:10, más preferentemente de 1:3 a 1:8, y lo más preferentemente la relación de heces:solución estabilizadora es aproximadamente 1:5.

Las composiciones descritas en la presente permiten a los investigadores revolucionar la forma en que obtienen un gran número de muestras fecales. Ya no necesitan limitar los estudios debido a los costos y la logística de enviar muestras en hielo seco o almacenar cientos de miles de muestras fecales en congeladores durante meses. Las muestras obtenidas en tubos que contienen la presente composición pueden enviarse a la temperatura ambiental en un sobre de burbujas y almacenarse a la temperatura del local en el laboratorio para su procesamiento por lotes a conveniencia del investigador.

Ejemplo 5 - Estabilización de muestras en la presente composición y a temperaturas extremas

Las diversas composiciones descritas en la presente estabilizan rápida y eficazmente los perfiles del microbioma y ADN de alto peso molecular en las heces de donantes humanos sanos a temperatura "ambiente". Como se señaló anteriormente, "ambiente" significa temperaturas de exposición típicas observadas durante la obtención, transporte, almacenamiento y procesamiento de muestras biológicas. En dependencia del lugar del mundo en el que se obtenga/transporte/almacene la muestra biológica, las temperaturas pueden oscilar fácilmente entre -20 °C y 50 °C, a veces en un período de tiempo corto. Se conoce en la técnica que las muestras biológicas no tratadas se degradan con estas temperaturas, particularmente temperaturas elevadas. Existe la necesidad de una solución estabilizadora de muestras biológicas robusta y universal para mantener el ADN en las muestras obtenidas lo más cercano posible al estado in vivo, es decir, evitar la degradación del ADN de alto peso molecular existente, intacto y/o evitar una degradación adicional de ácido nucleico parcialmente degradado, tal como ADN humano en muestras fecales y estabilizar el perfil del microbioma de las muestras fecales.

Tabla 7. Composiciones analizadas.

Se analizó el rendimiento de 6 composiciones estabilizadoras de ADN (Tabla 7), desarrolladas por los inventores, y se comparó en un intervalo amplio de temperaturas ambientales, por ejemplo, -20 °C, temperatura del local (generalmente 19-23 °C), 37 °C, y 50 °C, con muestras fecales complejas, no homogéneas y variables. En el primer experimento, 2 donantes sanos transfirieron cada uno 400 mg de heces en 6 tubos que contenían 2 ml de las diferentes composiciones (Tabla 7) y una bola de acero inoxidable de 7,9 mm. Los tubos se agitaron manualmente para homogeneizar las muestras fecales, se extrajo inmediatamente una alícuota (250 |jl) para extracción de ADN (T = 0) y después los tubos se almacenaron a 37 °C durante 7 y 21 días.

Las Figuras 11A y 11B demuestran que todas las composiciones analizadas estabilizaron el ADN de alto peso molecular, intacto, durante al menos 3 semanas cuando las muestras fecales se almacenaron a 37 °C. Después de 21 días a 37 °C, la concentración de ADN recuperado a partir de las muestras de heces almacenadas en las composiciones de CBS, CBSA1 y CBSA2 fue menor que las muestras en las otras composiciones, lo que provocó bandas más débiles en los geles de agarosa para los donantes A y B (Figura 11A y 11B). Sorprendentemente, el análisis de DGGE (Figura 12A y 12B) mostró que el perfil del microbioma en estas muestras también fue estable durante la primera semana a 37 °C, una temperatura óptima para el crecimiento de bacterias fecales, y comenzó a cambiar antes del punto de tiempo de 21 días. Además del c DtA 300 mM, tamponado a pH 11, el etanol parece ser beneficioso para la estabilización o recuperación tanto del ADN de alto peso molecular como del perfil del microbioma.

En el segundo experimento, 3 donantes sanos transfirieron cada uno 400 mg de heces en 3 tubos que contenían 2 ml de 104B y una bola de acero inoxidable de 7,9 mm. Los tubos se agitaron manualmente para homogeneizar las muestras fecales, se extrajo inmediatamente una alícuota (250 jl) para extracción de ADN (T = 0), y después los tubos se almacenaron a 50 °C durante 3 y 5 días, a la temperatura del local durante 1 mes, y a -20 °C durante 1 mes (Figuras 13A-E). Las Figuras 13A-E demuestran que 104B estabilizó el ADN de alto peso molecular durante 5 días a 50 °C (Figura 13B-C), 1 mes a la temperatura del local (Figura 13D) y 1 mes a -20 °C (Figura 13E). Las muestras fecales obtenidas por triplicado por cada donante contenían ADN de alto peso molecular, intacto, independientemente de la temperatura o el período de tiempo analizado.

En el tercer experimento, 3 donantes sanos transfirieron cada uno 400 mg de heces en 3 tubos; 2 tubos contenían 2 ml de 104B y CBE (Tabla 7) y una bola de acero inoxidable de 7,9 mm cada uno; el tercer tubo estaba vacío (ninguno). Los tubos con solución estabilizadora se agitaron manualmente para homogeneizar las muestras fecales, se extrajo inmediatamente una alícuota (250 j l o 250 mg) de cada tubo para la extracción de ADN (T = 0), y después los tubos se almacenaron a 50 °C durante 5 y 14 días o a -20 °C durante 11 días (Figura 14 A-D). Las Figuras 14A-C demuestran que tanto 104B como CBE mantuvieron el ADN de alto peso molecular, intacto, durante al menos 2 semanas a 50 °C, mientras que las muestras de control (ninguno) mostraron signos de degradación con el tiempo. Sorprendentemente, el análisis de DGGE (Figura 15A y 15B) mostró que el perfil del microbioma en estas muestras también fue estable durante 2 semanas a 50 °C, una temperatura extrema para biomoléculas como el ADN. De manera interesante, el por ciento de similitudes fue mayor en las muestras almacenadas a 50 °C durante 5 días, no 14 días, lo que indica que la exposición prolongada a una temperatura tan extrema puede conducir a cierta inestabilidad química del propio ADN.

La Figura 14D muestra que tanto 104B como CBE mantuvieron ADN de alto peso molecular en muestras congeladas a -20 °C (y posteriormente descongeladas) durante al menos 11 días. Sin embargo, en ausencia de la solución estabilizadora, las heces mostraron signos característicos de degradación del ADN a -20 °C. En la muestra del donante A (ninguno), la mayoría del ADN de alto peso molecular se degradó y apareció como una mancha en el gel de agarosa. Por el contrario, todavía pudo detectarse una pequeña cantidad de ADN de alto peso molecular en las muestras de los donantes B y C, lo que indica la variabilidad del donante. El análisis de DGGE de las muestras sin solución estabilizadora confirmó que el perfil del microbioma no era estable a -20 °C; el % de similitud con el control T = 0 fue 52 y 69 % para los donantes A y C, respectivamente. Por el contrario, el perfil del microbioma fue estable en 104B y c Be durante 11 días a -20 °C, como lo indica el alto por ciento de similitudes con las muestras de control (ninguno) (Figura 16A y 16B).

Tomados en conjunto, estos ejemplos demuestran que tanto 104B como CBE estabilizan el ADN en muestras fecales almacenadas a temperaturas extremas durante períodos de tiempo prolongados.

Ejemplo 6 - Estabilidad con ciclos de congelación/descongelación de muestras de heces incubadas en la presente composición

Como se discutió anteriormente, se conoce en la técnica que el perfil del microbioma cambia cuando las heces se exponen a una sola ronda de congelación y descongelación con fines de almacenamiento o preparación de bancos. Esta degradación añade un sesgo innecesario a todas las muestras obtenidas transportadas y/o almacenadas a temperaturas bajo cero. En el presente ejemplo, se obtuvieron heces de 3 donantes sanos y se transfirieron muestras de 400 mg a tubos vacíos y tubos que contenían 2 ml de la presente composición ("104B a pH 9,5"; como se define anteriormente) con perlas de vidrio (cuatro perlas de 4 mm y diez de 2 mm). Los tubos que contenían la solución estabilizadora y las perlas de vidrio se agitaron vigorosamente con vórtice hasta que se mezclaron por completo. Después de extraer una alícuota de 250 mg o |jl para la extracción de ADN el día 0, los tubos de muestra se almacenaron en un congelador a -20 °C y, en el transcurso de diez días, se sometieron a cinco ciclos entre el congelador y la temperatura del local con 24 horas a cada temperatura. Los tubos de muestra se descongelaron a 50 °C durante 3 horas, un método estándar de la industria.

El análisis en gel de agarosa de las alícuotas del día 0 demuestra que las heces de cada donante contenían ADN de alto peso molecular cuando se obtuvieron en la presente composición (Figura 17). Sorprendentemente, después de 5 ciclos de congelación/descongelación (F/T), el ADN permaneció intacto (Figura 17). El análisis de DGGE confirmó que el perfil del microbioma de las muestras en la presente composición se mantuvo estable al 94 % después de 5 ciclos F/T (Figura 18). En marcado contraste, las muestras sin protección mostraron una degradación considerable del perfil del microbioma. Después de solo un ciclo F/T, el perfil fue solo un 52 % similar al perfil de la muestra 'recién obtenida' del día 0, antes de la exposición a -20 °C. Por lo tanto, la presente composición no solo conserva el ADN de alto peso molecular, intacto, con múltiples rondas de congelación y descongelación, sino que también estabiliza el perfil del microbioma, lo que reduce drásticamente el sesgo asociado con estas condiciones de almacenamiento.

Ejemplo 7 - Homogeneización de muestras fecales obtenidas en la presente composición

Como se describió anteriormente, los inventores experimentaron con numerosos materiales diferentes que podrían usarse en tubos de transporte y/o de laboratorio de 10 ml, disponibles comercialmente, estándar (92 mm x 15,3 mm, diámetro interno de aproximadamente 12,9 mm) para homogeneizar las muestras fecales de todo tipo de manera completa y confiable (1-7, escala de heces de Bristol). Se determinó que la mezcla debe hacerse manualmente y en un período de tiempo relativamente corto (dentro de los 180 segundos) para garantizar que los donantes cumplan y proporcionen muestras biológicas estabilizadas de manera constante. Un experto en la técnica comprenderá cómo seleccionar un medio de homogeneización apropiado para recipientes más grandes o más pequeños que el usado en los presentes ejemplos (véase la descripción detallada).

Se modificó una jeringa estándar desechable de 3 ml para obtener y transferir una pequeña cantidad volumétrica de heces al tubo de obtención anterior, que contiene la presente composición ("104B a pH 11"; definido anteriormente) y medios de homogeneización. Se cortó la punta cónica o accesorio de la aguja de la jeringa para exponer el cilindro de diámetro uniforme. El émbolo estaba preestablecido en una posición que facilitaba la obtención de una cantidad constante de heces, por ejemplo, 400 mg, cuando se empujaba a un recipiente que contenía heces. Se perforó un pequeño orificio de ventilación en el cilindro de la jeringa para que el aire escapara durante la obtención de la muestra fecal. La jeringa con la muestra cargada se transfirió a la abertura del tubo y se presionó el émbolo, se depositó así la muestra de 400 mg en el tubo que contenía 2 ml de solución estabilizadora y los medios de homogeneización (por ejemplo, bola de homogeneización, especificada a continuación). El tubo se tapó y se agitó manualmente durante aproximadamente 20-40 segundos, más tiempo (1-3 minutos) para muestras duras de tipo 1 (véase más abajo). Después de agitar vigorosamente la muestra con un movimiento de ida y vuelta, en presencia de los medios de homogeneización, la muestra fecal se distribuyó en la solución estabilizadora.

Cuando el recipiente seleccionado es un tubo/vial de transporte o de laboratorio, una "bola" o "esfera" de homogeneización del tamaño, forma y densidad apropiados es crítica para la dispersión completa de muestras complejas, no homogéneas en la presente composición. La homogeneización completa de la muestra obtenida en el momento de la obtención también es fundamental para la estabilización óptima del ADN humano y microbiano, como lo demuestra la presencia de ADN de alto peso molecular, intacto, así como también la estabilización del perfil del microbioma como se ejemplifica a través de PCR del gen de ARNr 16S bacteriano y análisis de DGGE de los amplicones. Como se describió anteriormente, para un medio de homogeneización esférico, el fondo del tubo/vial de transporte también debe ser redondo, lo que refleja la forma del medio de homogeneización, para evitar que la materia sólida se compacte en espacios muertos dentro del tubo. Por ejemplo, la homogeneización óptima de muestras fecales (particularmente de tipo 1-3) con medios de homogeneización esféricos es muy difícil de lograr con tubos de fondo plano o cónico. Un medio de homogeneización esférico no puede hacer contacto directo con la superficie cónica ni ángulos de 90 grados donde las paredes del tubo vertical se cruzan con la base, lo que provoca la compactación de la materia fecal en estos espacios/áreas muertas.

Las siguientes Tablas 8-10 ilustran algunos de los diferentes materiales disponibles comercialmente analizados por los inventores para encontrar el medio de homogeneización óptimo para un tubo de transporte/laboratorio estándar (por ejemplo, núm. de cat. 60.610, Sarstedt).

Tabla 10. Tiempo de mezcla (segundos) para bolas de acero inoxidable de diferente diámetro y número.

Las heces de los tipos de muestra 1 y 2 son muy densas y contienen poca agua, lo que las hace impenetrables para la dispersión manualmente en la presente composición dentro de un período de tiempo razonable (< 3 minutos), sin un medio de homogeneización. Para heces más blandas (tipo 3-6) todavía se requería un medio de homogeneización y la duración del mezclado manual del tubo se reducía considerablemente al aumentar el tipo de muestra (Tablas 8-10). Un medio de homogeneización no fue esencial para dispersar la muestra de tipo 7 o la diarrea con la presente composición. En este contexto, el propósito del "homogeneizador" era desagregar y dispersar completamente una muestra sólida o semisólida no homogénea por toda la solución de estabilización, sin el uso de electricidad o baterías.

Las características importantes de los medios de homogeneización incluyen 1) densidad del material, 2) tamaño con respecto al diámetro interno del recipiente para la muestra biológica y 3) forma con respecto al recipiente. Las partículas (<1,2 mm) y las perias pequeñas (< 4 mm) de vidrio (aproximadamente 2,0-4,5 g/cm3)/poli(metacrilato de metilo o PMMA (aproximadamente 1,2 g/cm3)/sílice (aproximadamente 1,6-2,0 g/cm3)/zirconia (aproximadamente 6,02 g/cm3)/acetato de celulosa (aproximadamente 1,3 g/cm3)/polietileno (aproximadamente 0,9-1,3 g/cm3) no tenían el tamaño, ni la densidad suficiente, para funcionar como homogeneizador de heces tipo 1 -4 dentro de un tubo de laboratorio estándar que tiene un diámetro interno de 12,9 mm (Tabla 8). De manera importante, incluso las bolas grandes de 7,9 mm hechas de óxido de alúmina (3,95 g/cm3) o nitruro de silicio de 7,1-7,9 mm (3,21 g/cm3) y las canicas de vidrio de 12,7 mm no pudieron dispersar las muestras de heces de tipo 1-3 (400 mg) en 2 ml de la presente composición en menos de 180 segundos (Tabla 8). Sorprendentemente, incluso después de 180 segundos de agitar el tubo con fuerza, la materia sólida permaneció intacta en la presente composición. Estos resultados experimentales llevaron a evaluar materiales más densos, es decir, con densidades > 3,95 g/cm3. Desafortunadamente, las bolas con densidades entre 3,95 g/cm3 y 7,6 g/cm3 no estaban disponibles comercialmente y, por lo tanto, no pudieron analizarse con muestras fecales.

A continuación, se analizaron bolas de acero inoxidable (7,6-7,9 g/cm3, Tablas 9 y 10) y de carburo de tungsteno (15,63 g/cm3, Tabla 8) con 400 mg de muestras fecales en 2 ml de la presente composición dentro de un tubo de fondo redondo. Sorprendentemente, incluso las muestras fecales duras tipo 1 similares a nuez se homogeneizaron con carburo de tungsteno de 7,1-7,9 mm y bolas de acero inoxidable de 7,1-8,7 mm en < 140 y <180 segundos, respectivamente. Las muestras de tipo 2 se homogeneizaron con bolas de carburo de tungsteno de 7,1-7,9 mm y acero inoxidable de 7,1-8,7 mm en á 40 segundos y S 80 segundos, respectivamente. Las bolas de carburo de tungsteno (7,1-7,9 mm) y acero inoxidable (7,1-8,7 mm) homogeneizaron muestras tipo 3 en i 30 y i 80 segundos, muestras tipo 4 en i 15 y i 55 segundos, muestras tipo 5 en á 15 y 50 segundos y muestra tipo 6 en i 10 y i 22 segundos, respectivamente.

De manera similar, las bolas con densidades entre 7,9 g/cm3 y 15,63 g/cm3 no pudieron obtenerse ni analizarse; sin embargo, un experto en la técnica esperaría que tales medios de homogeneización desagregaran las muestras fecales ciertamente en menos de 180 segundos en el intervalo de tamaño de 7,1-8,7 mm. Únicamente por el costo y la facilidad de abastecimiento, se prefirieron las bolas de acero inoxidable a las de carburo de tungsteno y el diámetro óptimo fue de 7,1-8,7 mm de diámetro. En general, la adición de una segunda bola del mismo tamaño resultó beneficiosa para reducir el tiempo de mezclado (Tablas 8 y 9). En algunos casos, las combinaciones de bolas de más de un tamaño fueron beneficiosas para reducir el tiempo requerido para homogeneizar las muestras fecales (Tabla 10).

Dado que las bolas de 7,1-8,7 mm se comportaron mejor en tubos con un diámetro interno de 12,9 mm, un espacio libre de aproximadamente 2,1-2,9 mm a cada lado de la bola proporcionó el ajuste óptimo en el tubo para homogeneizar la muestra en un corto período de tiempo. Cuando las bolas de acero inoxidable tenían S 5,6 mm o £ 9,5 mm de diámetro, aumentaba el tiempo de mezcla para las muestras fecales de tipo duro (1 -4). Por tanto, dados estos resultados para muestras fecales que varían en consistencia de sólidas a líquidas, se han empleado preferentemente bolas de acero inoxidable de 7,9 mm como medio de homogeneización en los ejemplos descritos en la presente, a menos que se indique lo contrario.

Ejemplo 8 - Estabilización del perfil de la microbiota intestinal mediante el uso de la presente composición

El análisis de la microbiota intestinal ha sido de creciente interés para los investigadores que investigan las funciones beneficiosas y perjudiciales de los microorganismos en la salud humana. Para cualquier análisis de la microbiota intestinal, es esencial capturar con precisión una "instantánea" del perfil de la microbiota (es decir, garantizar que la abundancia relativa de Unidades Taxonómicas Operativas [OTU] permanezca sin cambios desde el momento de la obtención hasta el momento del procesamiento y análisis de la muestra) que representa el estado in vivo; por lo tanto, la estabilización de la muestra en el momento de la obtención es de suma importancia para tales estudios. Los métodos actuales para la obtención de muestras de heces y el análisis de la microbiota implican el transporte de muestras a la temperatura ambiental, a 4 °C o congeladas. Sin embargo, estos métodos tienen el potencial de exponer las muestras a temperaturas incompatibles con la estabilización del microbioma y la congelación de las muestras de heces se ha demostrado previamente que altera la relación de Firmicutes a Bacteroides ( Bahl y otros, (2012) FEMS Microbiol Letters 329: 193-197).

En este ejemplo, se evaluó la estabilidad del microbioma mediante el uso de un método sensible disponible comercialmente, la secuenciación de ARNr 16S de la región hipervariable V4. Para este estudio, cuatro donantes obtuvieron cada uno una muestra de heces y colocaron cantidades iguales de muestra (400 mg) en tres tubos sin solución estabilizadora y seis tubos con solución estabilizadora (CDTA 300 mM, SDS al 0,5 %, etanol al 23,5 %, Antiespumante A al 0,1 %), triclosán al 0,2 %, a pH 9,5) y una bola mezcladora de acero inoxidable de 7,9 mm. Los donantes transportaron las muestras al laboratorio a la temperatura ambiental, donde se extrajo una alícuota T = 0 (250 pl o 250 mg) y se extrajo el ADN mediante el uso del kit de aislamiento de ADN PowerFecal™ (MoBio Laboratories). Se almacenó una muestra por donante por condición de estabilización a cada una de las temperaturas de análisis (-20 °C, 4 °C, 23 °C, 37 °C - solo en la solución de estabilización) durante 3 y 14 días, seguido de extracción de ADN. Una muestra en la solución de estabilización se expuso a cinco ciclos de congelación-descongelación.

En los puntos de tiempo indicados, se extrajo el ADN de las alícuotas y se envió para la preparación de la biblioteca de secuenciación, secuenciación y bioinformática de ARNr 16S. La secuenciación de amplicones de extremos pareados de la región hipervariable V4 se realizó mediante el uso de IIIumina® MiSeq® (250 ciclos).

Las Figuras 19 y 20 presentan datos que indican que las muestras completamente conservadas en solución de estabilización tienen un alto grado de similitud en la abundancia de OTU.

En la Figura 19, el análisis de coordenadas principales (PCoA) sobre la base de valores de disimilitud unifrac ponderados demuestra en dos donantes (B y D) que las muestras almacenadas en solución de estabilización a varias temperaturas (-20 °C, 4 °C, temperatura ambiental, 37 °C) y el tiempo (3 y 14 días) exhiben un alto nivel de similitud en la abundancia de OTU, como lo muestra la agrupación ajustada en la gráfica PCoA (las muestras almacenadas en el tampón de estabilización tienen números de identificación de muestra con un 4-9 como primer dígito, por ejemplo, D4 y B4, y se agrupan en los círculos "Con estabilizador" para cada donante). Por el contrario, las muestras almacenadas sin solución de estabilización (muestras con números de identificación con un 0-3 como primer dígito, por ejemplo, D3-1 y B3-1, y agrupadas en los círculos "Sin estabilización" para cada donante) demostraron una pérdida de similitud en abundancia de OTU como se muestra por las mayores distancias entre muestras. De manera importante, al evaluar la presencia o ausencia de OTU, hubo una diferencia estadísticamente significativa entre las muestras estabilizadas y aquellas sin solución estabilizadora en los cuatro donantes (p = 0,002, 0,002, 0,002 y 0,009 respectivamente, medición Unifrac). Los mayores cambios de perfil se observaron en muestras almacenadas a -20 °C sin solución de estabilización (muestras B2-1, B2-2, D2-1 y D2-2 en las gráficas de PCoA), que fueron significativamente diferentes de las muestras almacenadas a -20 °C en solución de estabilización (p = 0,028, medición Unifrac ponderada); por consiguiente lo que demuestra que almacenar muestras en la solución de estabilización novedosa puede evitar cambios en el perfil microbiano observados en muestras congeladas no estabilizadas (Figura 19).

En la Figura 20, la abundancia proporcional a nivel familiar demuestra un cambio en la composición de las muestras almacenadas sin la presente solución de estabilización a varias temperaturas a lo largo del tiempo (3 y 14 días). En particular, se observa un aumento de Lachnospiraceae, Ruminococcaceae y Prevotellaceae y una pérdida de Bacteroidaceae en las muestras del donante D sin solución estabilizadora en comparación con la situación inicial. Por el contrario, las muestras almacenadas con la solución de estabilización a diversas temperaturas y tiempo mantuvieron la composición microbiana de la muestra en comparación con la muestra inicial.

Estos datos sugieren que para correlacionar de manera sólida los cambios en la microbiota intestinal con el fenotipo de interés, es importante tener una forma reproducible de estabilizar el perfil en el punto de obtención, algo que los métodos actuales de estabilización basados en la temperatura no pueden lograr con eficacia. La química de estabilización demostrada aquí tiene la capacidad de mantener el perfil in vivo de la microbiota intestinal (es decir, agrupación apretada de OTU) a varias temperaturas de transporte, lo que permite a los investigadores mejorar la confiabilidad de los datos y la comparación entre estudios. Esta química de estabilización también aumentará la facilidad de la obtención por los propios pacientes sin supervisión y permitirá de manera única estudios de grandes poblaciones que actualmente son logísticamente difíciles.

Ejemplo 9 - Estabilización de ADN humano en la presente composición

Véase la sección Materiales y métodos para obtener más detalles sobre la obtención de muestras fecales, la extracción y cuantificación de ADN y la amplificación de ADN humano.

A tres donantes sanos se les proporcionaron instrucciones y materiales para obtener una muestra fecal en casa. Después de defecar en un recipiente grande unido al inodoro, se transfirieron inmediatamente aproximadamente 400 mg de heces a un tubo de fondo redondo de 10 ml que contenía 2 ml de la presente composición ("104B a pH 11"; definida anteriormente) y una bola de acero inoxidable de 7,9 mm. Después de tapar el tubo, los donantes agitaron el tubo sellado durante aproximadamente 20 segundos para homogeneizar la muestra en la composición. Los donantes generalmente devolvieron las muestras homogeneizadas al laboratorio a la temperatura ambiental dentro de las 3-4 horas posteriores a la obtención. En el laboratorio, se extrajo una alícuota T = 0 (250 |jl) de cada tubo y el resto se almacenó a la temperatura del local (RT) durante 14 días, momento en el que se extrajo una segunda alícuota (250 jl).

El ADN se purificó de cada alícuota mediante el uso del kit de aislamiento de ADN PowerFecal®; el rendimiento de ADN se cuantificó mediante el uso del colorante fluorescente PicoGreen® y un método fluorimétrico (véase Materiales y métodos). El ADN humano purificado a partir de muestras fecales de T = 0 y T = 14 días se amplificó en PCR cuantitativa o en tiempo real (qPCR) mediante el uso de cebadores dirigidos al gen de la timidilato sintasa humana de copia única. El cambio en los valores de Ct (ACt), es decir, la diferencia en los valores de Ct por triplicado resultantes de T = 0 y T = 14 días de alícuotas purificadas tomadas de la misma muestra, se muestra en la Tabla 11 a continuación. Para cada donante, la cantidad de ADN humano detectada en muestras purificadas en T = 0 y T = 14 días es equivalente. Con menos de un ciclo de diferencia en el ADN de las muestras fecales procesadas inmediatamente o almacenadas durante 2 semanas a RT, este ejemplo demuestra que el ADN humano es estable en la presente composición para los tres donantes.

Tabla 11. Cambio en los valores de Ct para el ADN humano en muestras fecales almacenadas a la temperatura del local durante 14 días o procesadas a T = 0.

Ejemplo 10 - La presente composición estabiliza el perfil del microbioma a la temperatura del local durante 14 días y en condiciones de transporte simuladas

La presente composición permite la obtención por el propio paciente de manera fácil y la estabilización del ADN microbiano a partir de las heces para la elaboración de perfiles del microbioma intestinal. Es excepcionalmente capaz de tomar una instantánea del perfil microbiano en el momento de la obtención y mantenerlo durante 14 días a la temperatura del local.

En este ejemplo, seis donantes sanos recibieron instrucciones y materiales para obtener una muestra fecal en casa. Después de defecar en un recipiente grande unido al inodoro, se transfirieron inmediatamente aproximadamente 400 mg de heces a un tubo de fondo redondo de 10 ml que contenía 2 ml de la presente composición ("104B a pH 11"; definido anteriormente) y una bola de acero inoxidable de 7,9 mm. Después de tapar el tubo, los donantes agitaron el tubo sellado durante aproximadamente 20 segundos para homogeneizar la muestra en la composición. Cada uno de los 6 donantes obtuvo 3 muestras de la misma muestra fecal global (n = 18 en total) en la presente composición. Además, cada donante obtuvo alícuotas de 400 mg de heces recientes de la misma muestra fecal global y las transportó en tubos vacíos de 10 ml en una caja de espuma de poliestireno con paquetes fríos congelados según el procedimiento estándar del Proyecto de Microbioma Humano (Manual of Procedures - Human Microbiome Project, 2010).

Las extracciones de ADN iniciales se realizaron dentro de las 3 horas posteriores a la obtención. Para el análisis inicial, se tomó una alícuota de 0,25 ml de muestras de 104B a pH 11 y se extrajo con el kit de aislamiento de ADN PowerFecal® (MO BIO Laboratories, Inc.). Cada muestra de 0,25 ml contenía aproximadamente 50 mg de heces y 200 j l del líquido estabilizador, 104B a pH 11. Se extrajeron cantidades equivalentes de heces (aproximadamente 50 mg) a partir de muestras recientes, no estabilizadas. Las muestras con 104B a pH 11 y recientes, no estabilizadas restantes se dividieron en alícuotas y se almacenaron a la temperatura del local (23 ± 3 °C) durante 14 días o se expusieron a condiciones de transporte simuladas (50 °C durante 1 día, 37 °C durante 3 días o 3 ciclos de congelación descongelación donde un ciclo consistió en un mínimo de 3 horas a -20 °C y un mínimo de 3 horas a 30 °C). Además, se almacenó una alícuota de heces recientes de cada donante a -80 °C como control. Después del mantenimiento de 14 días a la temperatura del local, condiciones de transporte simuladas o -80 °C, se extrajo una segunda alícuota de todas las muestras mediante el uso del kit de aislamiento de ADN PowerFecal.

La concentración y el rendimiento de ADN se determinaron mediante el uso del reactivo Quant-iT™ PicoGreen® (Life Technologies). Se evaluó la integridad y estabilidad del ADN a lo largo del tiempo tras correr aproximadamente 50 ng de ADN purificado en un gel de agarosa al 0,8 % y teñir con bromuro de etidio. Se usó una escalera Lambda Hind III para determinar el tamaño del ADN purificado.

La preparación de la biblioteca de secuenciación, la secuenciación y la bioinformática de ARNr 16S se realizaron por Metanome, Microbiome Discovery Service. La secuenciación de amplicones de extremos pareados de la región hipervariable V4 se realizó mediante el uso de Illumina® MiSeq®. Mediante el uso de QIIME y scripts personalizados, las secuencias se filtraron por calidad. Las lecturas de los extremos pareados se ensamblaron y se compararon con la base de datos de Greengenes, agrupada al 96 % por UCLUST. Después de la normalización de los datos, se midió la distancia de muestra a muestra mediante el uso de UniFrac ponderado en datos de abundancia de unidades taxonómicas operativas (OTU) (utiliza diferencias de abundancia de taxón entre muestras, mediante el empleo de una normalización por pares tras dividir la suma de diferencias por la suma de todas las abundancias). Las distancias de Bray-Curtis se midieron mediante el uso de la normalización por pares tras dividir la suma de las diferencias por la suma de todas las abundancias de OTU detectadas. En todas las mediciones de Bray-Curtis, una muestra reciente emparejada del donante que se había extraído poco después de la obtención se usó como un lado de la comparación por pares. El análisis del índice de Shannon (SI) para cada método de estabilización se realizó tras medir la relación de cada OTU en relación con el número total de OTU, y después se multiplicó por el logaritmo natural de esta relación. La suma del producto resultante en todas las OTU produjo el SI para cada muestra. Los métodos de obtención de muestras se compararon mediante la prueba de Mann-Whitney.

Resultados

La presente composición mantiene la neutralidad del perfil del microbioma en el punto de obtención

El estudio del microbioma requiere que el perfil generado represente las comunidades microbianas in vivo presentes en el donante; por lo tanto, el método de obtención y estabilización no debería introducir cambios en el microbioma. El uso de tampones de estabilización química puede modificar potencialmente la composición microbiana de la muestra tras acelerar el crecimiento de algunos microbios mientras permite la descomposición de otros. En condiciones ideales, el líquido de estabilización debe ser neutro (es decir, no debe introducir ningún sesgo en el microbioma). La comparación del perfil del microbioma de ARNr 16S a partir de muestras t = 0 recientes y estabilizadas con 104B a pH 11 mostró que la presente composición mantiene un perfil neutro y no introduce sesgos (Figura 21).

El estudio de la abundancia relativa de OTU mediante diferentes métodos estadísticos (por ejemplo, UniFrac ponderado) proporciona una descripción valiosa de la comunidad microbiana; sin embargo, puede ocultar la comprensión de la comunidad microbiana tras minimizar la contribución de microbios de baja abundancia. El estudio adecuado del perfil del microbioma requiere la preservación de la "riqueza" de las comunidades microbianas. La riqueza se define como la enumeración de especies microbianas (OTU) presentes en la muestra y es altamente susceptible a las condiciones ambientales, que incluye los cambios de temperatura, pH, concentración de oxígeno y composición química. Estos y otros factores pueden inducir el crecimiento o la descomposición bacteriana, lo que altera por consiguiente el número de OTU detectadas en la muestra.

Se extrajeron muestras recientes y estabilizadas con 104B a pH 11 de 6 donantes poco después de la obtención. Las OTU microbianas identificadas en las muestras con 104B a pH 11 se compararon con las OTU presentes en las muestras recientes correspondientes. El índice de Shannon (SI) para la diversidad se calculó tras convertir los datos de abundancia de OTU en llamadas de presencia/ausencia. La prueba de Mann-Whitney en los valores de SI no mostró diferencias significativas entre muestras recientes y con 104B a pH 11, lo que indica que 104B a pH 11 no tuvo impacto en la riqueza de las muestras (Figura 22).

Fuentes de variabilidad en la obtención de muestras fecales

El análisis de Bray-Curtis mostró una disimilitud sistemática dentro de las réplicas de muestras t = 0 recientes y con 104B a pH 11. Para comprender las fuentes de tal disimilitud, se evaluó la variabilidad introducida durante la obtención y procesamiento de muestras fecales. La variabilidad biológica se evaluó tras generar perfiles del microbioma a partir de tres muestras recientes y tres con 104B a pH 11 obtenidas a partir de diferentes sitios dentro de la misma muestra global. La variabilidad técnica se abordó mediante el uso de muestras obtenidas con 104B a pH 11 porque este sistema de obtención proporciona muestras líquidas homogeneizadas, lo que reduce los errores experimentales durante el procesamiento. Se compararon los perfiles de extracciones de ADN replicadas del mismo tubo (variabilidad de la extracción) y la secuenciación/PCR replicada del mismo ADN (variabilidad de la secuenciación). Las distancias de disimilitud de Bray Curtis se generaron dentro de los grupos replicados y se muestran en la Figura 23.

Se observó una variabilidad similar en réplicas biológicas de muestras recientes y obtenidas con 104B a pH 11 (distancias Bray-Curtis 0,14 ± 0,01 y 0,11 ± 0,01, respectivamente). El análisis mostró que la variabilidad técnica y biológica introduce cierta disimilitud en el perfil del microbioma del ARNr 16S (variabilidad biológica de las distancias Bray-Curtis 0,11; variabilidad de extracción 0,09 y variabilidad de secuenciación 0,08). En conclusión, la fuente de disimilitud observada puede explicarse por la variabilidad técnica o biológica y que con 104B a pH 11 no introduce ningún sesgo.

104B a pH 11 preserva eficazmente los perfiles del microbioma durante al menos 14 días a la temperatura del local Además de mantener la neutralidad del perfil, el estudio del microbioma requiere la preservación precisa de la estructura de la comunidad microbiana a lo largo del tiempo. Evaluamos la capacidad de 104B a pH 11 para estabilizar muestras durante el almacenamiento a 23 °C durante 14 días.

Se extrajeron muestras pareadas recientes y estabilizadas con 104B a pH 11 en el tiempo cero (T0) y nuevamente después de almacenarlas a la temperatura del local (23 °C) durante 14 días. También se almacenaron muestras recientes a -80 °C durante 14 días como control. La similitud de las muestras se evaluó mediante el uso de las distancias de Bray-Curtis. El análisis de Mann-Whitney no mostró diferencias significativas entre las muestras con 104B a pH 11 a 23 °C durante 14 días y las muestras a -80 °C, en comparación con las muestras recientes correspondientes (Figura 24). Por el contrario, las muestras no estabilizadas mostraron una disimilitud significativa cuando se compararon con las controles a -80 °C o con 104B a pH 11 almacenadas a la temperatura del local. Con el fin de comprender la reproducibilidad entre réplicas, se realizó un análisis de agrupamiento de Unifrac ponderado mediante el uso de muestras recientes, obtenidas con 104B a pH 11 (días T0 y T14) y muestras no estabilizadas (días T14). El dendrograma resultante (Figura 25) muestra un agrupamiento estrecho entre muestras recientes y muestras estabilizadas con 104B a pH 11, incluso después de 14 días (96 % de similitud). Las muestras no estabilizadas agrupadas junto con una alta separación del perfil reciente (~63 % de similitud). Por lo tanto, una estabilización adecuada tiene un gran efecto en la agrupación de perfiles a lo largo del tiempo.

104B a pH 11 preserva eficazmente el perfil del microbioma en condiciones de transporte simuladas

Las muestras se exponen comúnmente a condiciones indeseables durante el transporte desde el punto de obtención hasta el laboratorio de procesamiento. Para simular las condiciones de envío estándar, las muestras no estabilizadas y estabilizadas con 104B a pH 11 se expusieron a 50 °C durante 1 día, a 37 °C durante 3 días o a múltiples ciclos de congelación-descongelación (F/T). 104B a pH 11 conservó bandas de ADN de alto peso molecular, mientras que las muestras no estabilizadas mostraron varios grados de degradación, particularmente cuando se expusieron a 50 °C o a ciclos de congelación-descongelación (Figura 26).

Finalmente, el análisis de ARNr 16S confirmó que 104B a pH 11 conserva la estructura de la comunidad microbiana incluso a temperaturas extremas. La prueba de Mann-Whitney que comparó las distancias de Bray-Curtis de muestras de 104B a pH 11 sometidas a temperaturas de envío comunes y muestras pareadas mantenidas a -80 °C no mostró diferencias significativas. Por el contrario, las muestras no estabilizadas mantenidas a 37 °C o sometidas a ciclos de congelación-descongelación mostraron diferencias significativas en comparación con las muestras mantenidas a -80 °C (Figura 27).

Conclusiones

La estabilización, en el contexto de la metagenómica, es un atributo multidimensional que abarca: a) neutralidad (capacidad para capturar perfiles no sesgados), b) reproducibilidad (material de muestra homogéneo del cual pueden tomarse alícuotas altamente concordantes), y c) integridad (peso molecular), medido a lo largo del tiempo. Basado en experimentos estrictamente controlados y análisis rigurosos, 104B a pH 11 estabilizó eficazmente la microbiota intestinal en heces humanas a través de condiciones de envío y manipulación de la vida real. Esto es de suma importancia para el escalado rentable de MWAS, así como también para optimizar la calidad de los datos para el descubrimiento y desarrollo de biomarcadores.

Ejemplo 11 - Estudios adicionales sobre el papel de los agentes quelantes en la estabilización de muestras a temperaturas elevadas

La estabilidad del perfil microbiano dentro de la muestra también es sensible a temperaturas elevadas. En estas condiciones, no solo pueden activarse potencialmente nucleasas nocivas, sino que también algunas especies pueden comenzar a proliferar. La presencia de un agente quelante (CDTA) es especialmente beneficiosa en este caso para detener la acción de las ADNasas, así como también inhibir el crecimiento bacteriano.

En este experimento, donantes sanos obtuvieron heces y transfirieron 400 mg de heces a un tubo que contenía una sola bola de acero inoxidable de 7,9 mm y 2 ml de la presente composición con concentraciones finales variadas del agente quelante CDTA: a) CDTA 300 mM, (B-alanina50 mM, etanol al 23,5 %, SDS al 0,5 %, Antiespumante A al 0,1 %, a pH 11 ("104B a pH 11"); b) CDTA 150 mM, P-alanina 50 mM, etanol al 23,5 %, SDS al 0,5 %, Antiespumante A al 0,1 %, a pH 11, o c) |3-alanina 50 mM, etanol al 23,5 %, SDS al 0,5 %, Antiespumante A al 0,1 %, a pH 11 (sin agente quelante). Las muestras se homogeneizaron con agitación manual (mezcla) y después se devolvieron al laboratorio en condiciones de temperatura del local. Dentro de las 24 horas posteriores a la obtención de la muestra, se extrajo una alícuota de 250 pl de cada tubo para la extracción de a Dn (T = 0). Las muestras obtenidas se almacenaron después a 40 °C durante 5 días (T = 5) antes de la extracción de ADN de una segunda alícuota. El ADN purificado se cuantificó y después se determinaron los perfiles o huellas de la comunidad bacteriana mediante el uso de DGGE para separar los amplicones de PCR del gen del ARNr 16S. El por ciento de similitud entre las muestras (carriles en gel de DGGE), en comparación con la muestra de control en T = 0 para cada composición, se calculó por separado mediante el uso del programa Syngene GeneTools (véase Materiales y métodos).

La Figura 28 demuestra por cientos de similitudes o estabilidad del perfil del microbioma superiores a temperaturas elevadas entre las muestras del "día 5" y el "día 0" para la presente composición cuando c DtA está presente a una concentración de 150 mM o 300 mM en comparación con la composición sin CDTA. Esto indica que se requiere un agente quelante en la presente composición para mantener la estabilidad del perfil microbiano a temperaturas elevadas. Para las composiciones con CDTA 300 mM y 150 mM, los perfiles microbianos en el "día 5" fueron similares en 96 % y 95 %, respectivamente, en comparación con el "día 0" cuando las muestras de heces se almacenaron a 40 °C. En comparación, el perfil microbiano en el "día 5" en la composición sin CDTA fue del 71 %, en comparación con el "día 0" cuando las muestras de heces se almacenaron a 40 °C.

Ejemplo 12 - Estabilización superior de muestras en la presente composición en comparación con las composiciones de la técnica anterior

Los ácidos nucleicos en las muestras de pacientes tienden a degradarse después de que se han extraído del paciente. Esta degradación puede disminuir la eficacia de un ensayo de integridad de ácido nucleico que puntúa una muestra como enferma (por ejemplo, cancerosa) sobre la base de la presencia de ácidos nucleicos intactos. AP Shuber y DH Whitney (US 2008/0124714) describen un método para estabilizar ácidos nucleicos en muestras de tejidos y fluidos corporales mediante el cual la solución de estabilización incluye un tampón, una sal y un agente quelante (por ejemplo, "Tampón TEN").

En este experimento, donantes sanos obtuvieron heces y transfirieron 400 mg de heces a un tubo que contenía una sola bola de acero inoxidable de 7,9 mm y 2 mi de la presente composición (Composición 1; CDTA 300 mM, (3-alanina 50 mM, etanol al 23,5 %, SDS al 0,5 %, Antiespumante A al 0,1 %, a pH 11 ("104B a pH 11")) o ii) aproximadamente 400 mg de heces en un tubo que contiene 2 ml de "Tampón TEN" (Composición 2; Tris-HCl 10 mM, EDTA 1 mM, NaCl 150 mM, a pH 8, US2008/0124714). Las muestras en ambos tubos se homogeneizaron con agitación manual (mezcla) y después se devolvieron al laboratorio en condiciones de temperatura del local. Dentro de las 24 horas posteriores a la obtención de la muestra, se extrajo una alícuota de 250 pl de cada tubo para la extracción de ADN (T = 0) y después se almacenó a la temperatura del local durante 21 días (T = 21) antes de la extracción de ADN a partir de una segunda alícuota. El ADN purificado se cuantificó y después se determinaron los perfiles o huellas de la comunidad bacteriana mediante el uso de DGGE para separar los amplicones de PCR del gen del ARNr 16S. El por ciento de similitud entre las muestras (carriles en gel de DGGE), en comparación con la muestra de control en T = 0 para cada composición, se calculó por separado mediante el uso del programa Syngene GeneTools (véase Materiales y métodos).

La Figura 29 ilustra un por ciento de similitudes o estabilidad del perfil del microbioma superiores entre las muestras del 'día 21' y el 'día 0' para la presente composición en comparación con la composición de tampón TEN, lo que indica que la presente composición ofrece una estabilidad del ADN mejorada sobre otras composiciones conocidas en la técnica. Los perfiles microbianos de los donantes A y B en el "día 21" fueron 82 % y 94 % similares, respectivamente, en comparación con el "día 0" cuando las muestras de heces se almacenaron en la presente composición "104B a pH 11". En comparación, los perfiles microbianos de los donantes A y B en el 'día 21' fueron 70 % y 50 % similares, respectivamente, en comparación con el 'día 0' cuando las muestras de heces se almacenaron en la composición del documento US 2008/0124714.

US2008/0124714 también hace referencia a un "tampón de estabilización" que consiste en Tris 0,5 M, EDTA 0,15 M y NaCl 10 mM (pH 9,0) en la sección Materiales y métodos en [0059]. Sin embargo, se observa que el único tampón/solución estabilizador(a) referenciado con especificidad en los ejemplos siguientes es el "tampón TEN" mencionado anteriormente, y las reivindicaciones y la enseñanza de la descripción en torno a la solución estabilizadora también están dirigidas a modalidades que abarcan el "tampón TEN". Como tal, no es evidente que se haya analizado el "tampón de estabilización", o que funcione en los métodos enseñados en el documento US2008/0124714. No obstante, se realizó un estudio comparativo que compara el desempeño del "tampón de estabilización" anterior del documento US2008/0124714 con respecto a la presente composición que contiene CDTA 150 mM, (3-alanina 50 mM, etanol al 23,5 %, SDS al 0,5 %, Antiespumante A al 0,1 %, a pH 11, en las mismas condiciones que se describen en el ejemplo 1.

Durante la evaluación de la estabilidad del microbioma con composición y tiempo, la amplificación mediante el uso de PCR del gen de ARNr 16S bacteriano y el análisis de DGGE de los amplicones mostraron que la presente composición con CDTA 150 mM a pH 11 mantuvo un por ciento mayor de similitud (86 %) con el control (T = 0) después de una incubación de 30 días que el "tampón de estabilización" del documento US 2008/0124714 que contiene EDTA 150 mM a pH 9,0 (79 %).

Por lo tanto, las composiciones de la presente solicitud proporcionan una estabilización superior de los perfiles del microbioma en muestras fecales con relación a las composiciones descritas en el documento US 2008/0124714.

Referencias

1. Lee YK y Mazmanian SK (2010) Has the microbiota played a critical role in the evolution of the adaptive immune system? Science 24: 1768-1773.

2. Aries V, Crowther JS, Drasar BS, Hill MJ, Williams REO (1969) Bacteria and the aetiology of cancer of the large bowel. Gut 10: 334-335.

3. Moore WEC y Moore LH (1995) Intestinal floras of populations that have a high risk of colon cancer. Applied Envir Microbiol 61 (9): 3202-3207.

4. Parsonnet J, Friedman GD, Vandersteen DP, Chang Y, Vogelman JH, Orentreich N, Sibley RK (1991) Helicobacter pylori infection and the risk of gastric carcinoma. N Engl J Med 325: 1127-1131.

5. Grenham S, Clarke G, Cryan JF, Dinan TG (2011) Brain-gut-microbe communication in health and disease. Front Physio 2: 94.

6. Kinross JM, Darzi AW, Nicholson JK (2011) Gut microbiome-host interactions in health and disease. Genome Medicine 3:14.

7. Van Nood Els y otros (2013) Duodenal infusion of donor feces for recurrent Clostridium difficile. N Engl J Med 368 (5): 407-415.

8. Apajalahti JHA, Kettunen A, Nurminen PH, Jatila H, Holben WE (2003) Selective plating underestimates abundance and shows differential recovery of Bifidobacterial species from human feces. Appl Environ Microbiol 69(9): 5731-5735.

9. O'Sullivan D (2000) Methods for analysis of the intestinal microflora. Current Issues in Intestinal Microbiology 1(2): 39-50.

10. Walker AW, Ince J, Duncan SH, Webster LM, Holtrop G, Ze X, Brown D, Stares MD, Scott P, Bergerat A, Louis P, McIntosh F, Johnstone AM, Lobley GE, Parkhill J, Flint HJ (2011) International Society for Microbial Ecology Journal 5: 220-230.

11. Wu GD, Chen J, Hoffmann C, Bittinger K, Chen Y-Y, Keilbaugh SA, Bewtra M, Knights D, Walters WA, Knight R, Sinha R, Gilroy E, Gupta K, Baldassano R, Nessel L, Li H, Bushman FD, Lewis JD (2011) Linking long-term dietary patterns with gut microbial enterotypes. Science 334: 105-108.

12. Ley RE, Knight R, Gordon JI (2007) The human microbiome: eliminating the biomedical/environmental dichotomy in microbial ecology. Environ Microbiol 9: 3-4.

13. Bahl Mi, Bergstrom A, Licht TR (2012) Freezing fecal samples prior to DNA extraction affects the Firmicutes to Bacteroidetes ratio determined by downstream quantitative ^pC^r analysis. FEBS Microbiol Lett 329: 193-197. 14. Olson J, Whitney DH, Durkee K, Shuber AP (2005) DNA stabilization is critical for maximizing performance of fecal DNA-based colorectal cancer tests. Diagn Mol Pathol 14(3): 183-191.

15. Song Y, Garg S, Girotra M, Maddox C, von Rosenvinge eC, Dutta A, Dutta S, Fricke WF (2013) Microbiota dynamics in patients treated with fecal microbiota transplantation for recurrent Clostridium difficile infection. PLOS ONE 8(11): 1-11.

16. Van der Giessen JWB, Eger A, Haagsma J, Haring RM, Gaastra W, van der Zeijst BAM (1992) Amplification of 16S rRNA sequences to detect Mycobacterium paratuberculosis. J Med Microbiol 36: 255-263.

17. Hurley SS, Splitter GA, Welch rA. Test for Johne's Disease. US 4,918,178

18. Kojima K. Process of extracting nucleic acid and process of simultaneously carrying out extraction and purification of nucleic acid. US 6,852,495

19. Ariefdjohan MW, Savaiano DA, Nakatsu CH (2010) Comparison of DNA extraction kits for PCR-DGGE analysis of human intestinal microbial communities from fecal specimens. Nutr J 9: 23.

20. Smith B, Li N, Andersen AS, Slotved HC, Krogfelt KA (2011) Optimising bacterial DNA extraction from faecal samples: comparison of three methods. Open Microbiol J 5: 14-17.

21. Mclnnes P, Cutting M (2010) Manual of procedures for human microbiome project. Protocolo central de muestreo del microbioma A; Protocolo núm. 07-001 (versión 12.0)

22. Brusa T, Canzi E, Pacini N, Zancho R, Farrari A (1989) Oxygen tolerance of anaerobic bacteria isolated from human feces. Curr Microbiol 19: 39-43.

23. US 2008/0124714 (A.P. Shuber y D.H. Whitney).

Habiendo descrito así la invención, será obvio que la misma puede variarse de muchas formas. El alcance de las reivindicaciones no debe limitarse a las modalidades preferidas establecidas para la descripción, sino que debe recibir la interpretación más amplia de acuerdo con la descripción en su conjunto.

Claims (28)

1. REIVINDICACIONES

   i . Un método para estabilizar el ácido nucleico contenido en una muestra biológica a la temperatura ambiental que comprende las etapas de:

   a) poner en contacto una muestra biológica, tal como una muestra fecal, una muestra de suelo, una muestra de aguas residuales domésticas, una muestra de aguas residuales o una muestra de agua, con una composición acuosa que comprende un agente quelante, en donde el agente quelante está presente a una concentración de al menos aproximadamente 150 mM, y en donde la composición tiene un pH de al menos 9,5, para formar una mezcla;

   b) homogeneizar la mezcla de (a) para formar una mezcla homogénea; y

   c) almacenar la mezcla homogénea a la temperatura ambiental.
2. 2. El método de la reivindicación 1, en donde el agente quelante se selecciona de ácido 1,2-ciclohexanodiaminotetraacético (CDTA), ácido dietilentriaminopentaacético (DTPA), ácido tetraazaciclododecanotetraacético (DOTA), ácido tetraazaciclotetradecanotetraacético (TETA), desferioximina o análogos quelantes de estos.
3. 3. El método de la reivindicación 1 o 2, en donde el ácido nucleico es ácido desoxirribonucleico (ADN).
4. 4. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1-3, en donde la muestra biológica es una muestra fecal obtenida de un vertebrado, preferentemente un mamífero, tal como un ser humano.
5. 5. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1-4, en donde:

   a) el agente quelante es CDTA;

   b) la concentración del agente quelante es de aproximadamente 150 mM a aproximadamente 500 mM, o de aproximadamente 250 mM a aproximadamente 350 mM o aproximadamente 300 mM; c) la composición tiene un pH de 9,5 a 11,5 o de 10,5 a 11,5 u 11;

   d) la composición comprende además al menos un agente tamponante, tal como beta-alanina, capaz de tamponar en el intervalo de pH de 9,5 a 11,5;

   e) la composición comprende además un solvente orgánico soluble en agua, tal como un alcanol C1-C6;

   preferentemente, en donde el solvente orgánico soluble en agua es etanol; en donde el etanol está opcionalmente presente en la composición a una concentración de menos de aproximadamente 30 % en volumen o menos de aproximadamente 24 % en volumen;

   f) la composición comprende además un detergente, tal como dodecilsulfato de sodio; y/o

   g) la composición comprende además un agente antiespumante, tal como Antiespumante A.
6. 6. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1-5, en donde la mezcla se homogeneiza mediante el uso de un medio de homogeneización, tal como al menos una bola mezcladora; en donde cuando el medio de homogeneización es al menos una bola mezcladora, el método comprende formar la mezcla de la muestra biológica y la composición en un recipiente de muestras que contiene al menos una bola mezcladora, sellar el recipiente de muestras y homogeneizar la mezcla mediante agitación de la mezcla en presencia de la al menos una bola mezcladora, en donde la agitación se hace opcionalmente manualmente; opcionalmente, en donde

   a) la al menos una bola mezcladora es una bola mezcladora de acero inoxidable o una bola mezcladora de carburo de tungsteno;

   b) la al menos una bola mezcladora es una bola mezcladora de acero inoxidable que tiene un diámetro de aproximadamente 5,6-11,1 mm y una densidad de al menos aproximadamente 7,6 g/cm3; o c) la al menos una bola mezcladora es una bola mezcladora de acero inoxidable que tiene un diámetro de aproximadamente 7,1-8,7 mm y una densidad de al menos aproximadamente 7,6 g/cm3 y el recipiente de muestras es un tubo de fondo redondo que tiene un diámetro interno de aproximadamente 12,9 mm.
7. 7. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1-6, en donde

   a) la muestra biológica es una muestra fecal obtenida de un ser humano y el ácido nucleico es ADN humano; opcionalmente, en donde el método hace que el ADN humano sea estable durante:

   al menos 7 días, al menos 14 días, al menos 30 días o al menos 60 días a la temperatura del local; al menos 7 días, o al menos 14 días a una temperatura de aproximadamente 37 °C a aproximadamente 50 °C; y/o

   al menos 30 días a -20 °C; o

   b) el ácido nucleico es ADN microbiano y el método estabiliza un perfil del microbioma de la muestra biológica; opcionalmente, en donde el método hace que el perfil del microbioma de la muestra biológica sea estable durante

   al menos 7 días, al menos 14 días, al menos 30 días o al menos 60 días a la temperatura del local;

   al menos 7 días, o al menos 14 días a una temperatura de aproximadamente 37 °C a aproximadamente 50 °C; y/o

   al menos 30 días a -20 °C.
8. 8. Una composición acuosa para estabilizar el ácido nucleico contenido en una muestra biológica, tal como una muestra fecal, una muestra de suelo, una muestra de aguas residuales domésticas, una muestra de aguas residuales o una muestra de agua, a la temperatura ambiental, que comprende un agente quelante en donde el agente quelante está presente a una concentración de al menos aproximadamente 150 mM, y en donde la composición tiene un pH de al menos 9,5.
9. 9. La composición de la reivindicación 8, en donde el agente quelante se selecciona de CDTA, DTPA, DOTA, TETA, desferioximina o análogos quelantes de estos.
10. 10. La composición de la reivindicación 8 o 9, en donde el ácido nucleico es ácido desoxirribonucleico (ADN).
11. 11. La composición de cualquiera de las reivindicaciones 8-10, en donde la muestra biológica es una muestra fecal obtenida de un vertebrado, preferentemente un mamífero, tal como un ser humano.
12. 12. La composición de cualquiera de las reivindicaciones 8-11, en donde:

    a) el agente quelante es CDTA;

    b) la concentración del agente quelante es de aproximadamente 150 mM a aproximadamente 500 mM, o de aproximadamente 250 mM a aproximadamente 350 mM o aproximadamente 300 mM; c) la composición tiene un pH de 9,5 a 11,5 o de 10,5 a 11,5 u 11;

    d) la composición comprende además al menos un agente tamponante, tal como beta-alanina, capaz de tamponar en el intervalo de pH de 9,5 a 11,5;

    e) la composición comprende además un solvente orgánico soluble en agua, tal como un alcanol C1-C6;

    preferentemente, en donde el solvente orgánico soluble en agua es etanol; en donde el etanol está opcionalmente presente en la composición a una concentración de menos de aproximadamente 30 % en volumen o menos de aproximadamente 24 % en volumen;

    f) la composición comprende además un detergente, tal como dodecilsulfato de sodio; y/o

    g) la composición comprende además un agente antiespumante, tal como Antiespumante A.
13. 13. La composición de cualquiera de las reivindicaciones 8-12, en donde la muestra biológica es una muestra fecal obtenida de un ser humano y el ácido nucleico es ADN humano; o el ácido nucleico es ADN microbiano y la composición es para estabilizar un perfil del microbioma de la muestra biológica.
14. 14. Un kit para estabilizar el ácido nucleico contenido en una muestra biológica, tal como una muestra fecal, una muestra de suelo, una muestra de aguas residuales domésticas, una muestra de aguas residuales o una muestra de agua, a la temperatura ambiental, el kit comprende:

    a) un recipiente de muestras que tiene un cierre resellable;

    b) una composición acuosa que comprende un agente quelante en donde el agente quelante está presente a una concentración de al menos aproximadamente 150 mM, en donde la composición tiene un pH de al menos 9,5, en donde dicha composición está contenida opcionalmente dentro del recipiente de muestras;

    c) un medio de homogeneización, contenido opcionalmente dentro del recipiente de muestras;

    d) un medio para transferir la muestra biológica, o una porción de esta, al recipiente de muestras; y e) las instrucciones para su uso.
15. 15. El kit de la reivindicación 14, en donde el agente quelante se selecciona de CDTA, DTPA, DOTA, TETA, desferioximina o análogos quelantes de estos.
16. 16. El kit de la reivindicación 14 o 15, en donde el ácido nucleico es ácido desoxirribonucleico (ADN).
17. 17. El kit de cualquiera de las reivindicaciones 14-16, en donde la muestra biológica es una muestra fecal obtenida de un vertebrado, preferentemente un mamífero, tal como un ser humano.
18. 18. El kit de cualquiera de las reivindicaciones 14-17, en donde:

    a) el agente quelante es CDTA;

    b) la concentración del agente quelante es de aproximadamente 150 mM a aproximadamente 500 mM, o de aproximadamente 250 mM a aproximadamente 350 mM o aproximadamente 300 mM; c) la composición tiene un pH de 9,5 a 11,5 o de 10,5 a 11,5 u 11;

    d) la composición comprende además al menos un agente tamponante, tal como beta-alanina, capaz de tamponar en el intervalo de pH de 9,5 a 11,5;

    e) la composición comprende además un solvente orgánico soluble en agua, tal como un alcanol C1-C6;

    preferentemente, en donde el solvente orgánico soluble en agua es etanol; en donde el etanol está opcionalmente presente en la composición a una concentración de menos de aproximadamente 30 % en volumen, o menos de aproximadamente 24 % en volumen;

    f) la composición comprende además un detergente, tal como dodecilsulfato de sodio; y/o

    g) la composición comprende además un agente antiespumante, tal como Antiespumante A.
19. 19. El kit de cualquiera de las reivindicaciones 14-18, en donde la muestra biológica es una muestra fecal obtenida de un ser humano y el ácido nucleico es ADN humano; o el ácido nucleico es ADN microbiano y el kit es para estabilizar un perfil del microbioma de la muestra biológica.
20. 20. El kit de cualquiera de las reivindicaciones 14-19, en donde el medio de homogeneización es al menos una bola mezcladora; opcionalmente,

    a) en donde la al menos una bola mezcladora es una bola mezcladora de acero inoxidable o una bola mezcladora de carburo de tungsteno;

    b) en donde la al menos una bola mezcladora es una bola mezcladora de acero inoxidable que tiene un diámetro de aproximadamente 5,6-11,1 mm y una densidad de al menos aproximadamente 7,6 g/cm3; o

    c) en donde la al menos una bola mezcladora es una bola mezcladora de acero inoxidable que tiene un diámetro de aproximadamente 7,1-8,7 mm y una densidad de al menos aproximadamente 7,6 g/cm3 y el recipiente de muestras es un tubo de fondo redondo que tiene un diámetro interno de aproximadamente 12,9 mm.
21. 21. El método de la reivindicación 1, en donde el ácido nucleico es ADN, la muestra biológica es una muestra fecal obtenida de un mamífero, la composición tiene un pH de 10,5 a 11,5 y la composición comprende, consiste esencialmente en o consiste en:

    CDTA en una cantidad de aproximadamente 250 mM a aproximadamente 350 mM o aproximadamente 300 mM;

    P-alanina en una cantidad de aproximadamente 30 mM a aproximadamente 70 mM o aproximadamente 50 mM;

    etanol en una cantidad de aproximadamente 21,5 % a aproximadamente 23,5 % en volumen o aproximadamente 23,5 % en volumen;

    dodecilsulfato de sodio en una cantidad de aproximadamente 0 a aproximadamente 1 % (p/v), o aproximadamente 0,5 % (p/v); y

    Antiespumante A en una cantidad de aproximadamente 0 a aproximadamente 0,2 % (v/v) o aproximadamente 0,1 % (v/v); opcionalmente, en donde el método comprende formar la mezcla de la muestra fecal y la composición en un tubo de fondo redondo que tiene un diámetro interno de aproximadamente 12,9 mm y que contiene al menos una bola mezcladora de acero inoxidable que tiene un diámetro de aproximadamente 5,6-11,1 mm y una densidad de al menos aproximadamente 7,6 g/cm3, sellar el tubo de fondo redondo y homogeneizar la mezcla mediante agitación de la mezcla manualmente en presencia de la al menos una bola mezcladora de acero inoxidable.
22. 22. El método de la reivindicación 21, en donde el ácido nucleico es ADN microbiano y el método estabiliza un perfil del microbioma de la muestra fecal, en donde el perfil del microbioma de la muestra fecal se vuelve estable durante:

    al menos 7 días, al menos 14 días, al menos 30 días o al menos 60 días a la temperatura del local; al menos 7 días, o al menos 14 días a una temperatura de aproximadamente 37 °C a aproximadamente 50 °C; y/o

    al menos 30 días a -20 °C.
23. 23. La composición de la reivindicación 8, en donde el ácido nucleico es ADN, la muestra biológica es una muestra fecal obtenida de un mamífero, la composición tiene un pH de 10,5 a 11,5 y la composición comprende, consiste esencialmente en o consiste en:

    CDTA en una cantidad de aproximadamente 250 mM a aproximadamente 350 mM o aproximadamente 300 mM;

    (3-alanina en una cantidad de aproximadamente 30 mM a aproximadamente 70 mM o aproximadamente 50 mM;

    etanol en una cantidad de aproximadamente 21,5 % a aproximadamente 23,5 % en volumen o aproximadamente 23,5 % en volumen;

    dodecilsulfato de sodio en una cantidad de aproximadamente 0 a aproximadamente 1 % (p/v), o aproximadamente 0,5 % (p/v); y

    Antiespumante A en una cantidad de aproximadamente 0 a aproximadamente 0,2 % (v/v) o aproximadamente 0,1 % (v/v).
24. 24. La composición de la reivindicación 23, en donde la composición es para estabilizar un perfil del microbioma de la muestra fecal.
25. 25. El kit de la reivindicación 14, en donde el ácido nucleico es ADN, la muestra biológica es una muestra fecal obtenida de un mamífero, la composición tiene un pH de 10,5 a 11,5 y la composición comprende, consiste esencialmente en o consiste en:

    CDTA en una cantidad de aproximadamente 250 mM a aproximadamente 350 mM o aproximadamente 300 mM;

    (3-alanina en una cantidad de aproximadamente 30 mM a aproximadamente 70 mM o aproximadamente 50 mM;

    etanol en una cantidad de aproximadamente 21,5 % a aproximadamente 23,5 % en volumen o aproximadamente 23,5 % en volumen;

    dodecilsulfato de sodio en una cantidad de aproximadamente 0 a aproximadamente 1 % (p/v), o aproximadamente 0,5 % (p/v); y

    Antiespumante A en una cantidad de aproximadamente 0 a aproximadamente 0,2 % (v/v) o aproximadamente 0,1 % (v/v).
26. 26. El kit de la reivindicación 25, en donde el ácido nucleico es ADN microbiano y el kit es para estabilizar un perfil del microbioma de la muestra biológica; opcionalmente, en donde el medio de homogeneización es al menos una bola mezcladora de acero inoxidable que tiene un diámetro de aproximadamente 5,6 a 11,1 mm y una densidad de al menos aproximadamente 7,6 g/cm3, y el recipiente de muestras es un tubo de fondo redondo que tiene un diámetro interno de aproximadamente 12,9 mm.
27. 27. El método de la reivindicación 1, la composición de la reivindicación 8 o el kit de la reivindicación 14, en donde el ácido nucleico es ácido ribonucleico (ARN).
28. 28. El uso de una composición acuosa de cualquiera de las reivindicaciones 8-13 y 23-24, para estabilizar el ácido nucleico contenido en una muestra biológica a la temperatura ambiental.