JPH0599923A - ヒトヘモグロビンの検出方法及びそれに用いる便溶解用緩衝液 - Google Patents
ヒトヘモグロビンの検出方法及びそれに用いる便溶解用緩衝液Info
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- JPH0599923A JPH0599923A JP29216391A JP29216391A JPH0599923A JP H0599923 A JPH0599923 A JP H0599923A JP 29216391 A JP29216391 A JP 29216391A JP 29216391 A JP29216391 A JP 29216391A JP H0599923 A JPH0599923 A JP H0599923A
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Abstract
(57)【要約】
【目的】 糞便を含有する被検液中に存在するヒトヘモ
グロビンが、放置下で変性することを防止し、しかも高
感度で正確にヒトヘモグロビンを検出する方法、および
これに用いる便溶解用緩衝液を提供する。 【構成】 キレート試薬を便溶解するための緩衝液中に
添加し、抗ヒトヘモグロビン抗体を用いたヒトヘモグロ
ビンの検出を行なう。
グロビンが、放置下で変性することを防止し、しかも高
感度で正確にヒトヘモグロビンを検出する方法、および
これに用いる便溶解用緩衝液を提供する。 【構成】 キレート試薬を便溶解するための緩衝液中に
添加し、抗ヒトヘモグロビン抗体を用いたヒトヘモグロ
ビンの検出を行なう。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は抗ヒトヘモグロビン抗体
を用いた免疫学的なヒトヘモグロビン検出方法に関し、
特に糞便を含む被検液中に存在するヒトヘモグロビンを
高感度にて検出することができる方法、及びそれに用い
る便溶解用緩衝液に関する。
を用いた免疫学的なヒトヘモグロビン検出方法に関し、
特に糞便を含む被検液中に存在するヒトヘモグロビンを
高感度にて検出することができる方法、及びそれに用い
る便溶解用緩衝液に関する。
【０００２】
【従来の技術】近年、大腸癌などの下部消化器の疾患を
検査する方法として、消化器管からの出血に起因する糞
便中の潜血成分、特にヒトヘモグロビンの検出が主に行
われている。中でも、食品摂取や薬剤投与の制限を必要
としない、抗ヒトヘモグロビン抗体を用いた免疫学的な
検出方法が提案されている。
検査する方法として、消化器管からの出血に起因する糞
便中の潜血成分、特にヒトヘモグロビンの検出が主に行
われている。中でも、食品摂取や薬剤投与の制限を必要
としない、抗ヒトヘモグロビン抗体を用いた免疫学的な
検出方法が提案されている。
【０００３】このような検出方法には例えば、寒天板内
での抗ヒトヘモグロビン抗体と、被検液中のヒトヘモグ
ロビンとの沈降線を利用してヘモグロビンを検出する一
次元免疫拡散法や、動物血球に抗ヒトヘモグロビン抗体
を感作したものと、被検液とを混合して生じる沈降現象
像を利用して検出する逆受身血球凝集法、高分子ラテッ
クス粒子に抗ヒトヘモグロビン抗体を感作したものと、
被検液を混合して生じる凝集像を利用して検出するラテ
ックス凝集法、酵素や放射性同位元素で標識した抗ヒト
ヘモグロビン抗体を利用する酵素免疫法や放射免疫法な
どがある。
での抗ヒトヘモグロビン抗体と、被検液中のヒトヘモグ
ロビンとの沈降線を利用してヘモグロビンを検出する一
次元免疫拡散法や、動物血球に抗ヒトヘモグロビン抗体
を感作したものと、被検液とを混合して生じる沈降現象
像を利用して検出する逆受身血球凝集法、高分子ラテッ
クス粒子に抗ヒトヘモグロビン抗体を感作したものと、
被検液を混合して生じる凝集像を利用して検出するラテ
ックス凝集法、酵素や放射性同位元素で標識した抗ヒト
ヘモグロビン抗体を利用する酵素免疫法や放射免疫法な
どがある。
【０００４】上記検出法においては被検物質であるヒト
ヘモグロビンは通常、溶解液状で検査に供され、例えば
便潜血検査では糞便を生理食塩水や緩衝液中に溶解する
事により、糞便中のヒトヘモグロビンを溶解液状態にし
て被検液として用いられている。
ヘモグロビンは通常、溶解液状で検査に供され、例えば
便潜血検査では糞便を生理食塩水や緩衝液中に溶解する
事により、糞便中のヒトヘモグロビンを溶解液状態にし
て被検液として用いられている。
【０００５】ヒトヘモグロビンの構造は、例えば、ヘモ
グロビンＡではアミノ酸141 個からなるα鎖とアミノ酸
146 個からなるβ鎖と呼ばれるポリペプチドが、それぞ
れ２個から形成してなる四量体であり、これらが立体構
造で配置されている。このような構造のヒトヘモグロビ
ンは糞便溶解液中で徐々に変性するために、従来から用
いられている免疫学的方法では検出感度が著しく低下す
るものである。特に、被検液中の糞便濃度が高い場合に
は上記ヒトヘモグロビンの変性が著しく、診断上、意義
のある低濃度領域での検出が困難となる。
グロビンＡではアミノ酸141 個からなるα鎖とアミノ酸
146 個からなるβ鎖と呼ばれるポリペプチドが、それぞ
れ２個から形成してなる四量体であり、これらが立体構
造で配置されている。このような構造のヒトヘモグロビ
ンは糞便溶解液中で徐々に変性するために、従来から用
いられている免疫学的方法では検出感度が著しく低下す
るものである。特に、被検液中の糞便濃度が高い場合に
は上記ヒトヘモグロビンの変性が著しく、診断上、意義
のある低濃度領域での検出が困難となる。
【０００６】一方、便潜血検査では検査員の手間や不快
感を少なくするために、被検者自身が自宅などで糞便中
に含まれるヒトヘモグロビンを溶解液状態にする場合が
あり、このような場合は溶解液状態で数日間放置される
ことが多い。また、検査員がヒトヘモグロビンを溶解液
状態にした場合でも、作業の都合上、検査までに数時間
放置される場合もあり、このような放置状態では前述の
ようにヒトヘモグロビンの変性が起こってしまい好まし
くない。
感を少なくするために、被検者自身が自宅などで糞便中
に含まれるヒトヘモグロビンを溶解液状態にする場合が
あり、このような場合は溶解液状態で数日間放置される
ことが多い。また、検査員がヒトヘモグロビンを溶解液
状態にした場合でも、作業の都合上、検査までに数時間
放置される場合もあり、このような放置状態では前述の
ようにヒトヘモグロビンの変性が起こってしまい好まし
くない。
【０００７】また、酵素免疫法のような検出方法を採用
した場合、高温度下で数分間上記溶解液をインキュベー
トすることがあり、やはりヒトヘモグロビンの変性によ
って正確な検出が困難となる。このようなヒトヘモグロ
ビンの変性を防止する目的で、例えばウシ血清アルブミ
ンや糖類などを添加することが行われているが、充分に
効果を発揮できるものとはいえないのが実情である。
した場合、高温度下で数分間上記溶解液をインキュベー
トすることがあり、やはりヒトヘモグロビンの変性によ
って正確な検出が困難となる。このようなヒトヘモグロ
ビンの変性を防止する目的で、例えばウシ血清アルブミ
ンや糖類などを添加することが行われているが、充分に
効果を発揮できるものとはいえないのが実情である。
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】本発明は上記従来の技
術の欠点を解決するためになされたものであって、その
目的とするところは糞便を含有する被検液中に存在する
ヒトヘモグロビンの放置下での変性を防止しながら、か
つ、高感度で正確にヒトヘモグロビンを検出できる方
法、およびこれに用いる便溶解用緩衝液を提供すること
にある。
術の欠点を解決するためになされたものであって、その
目的とするところは糞便を含有する被検液中に存在する
ヒトヘモグロビンの放置下での変性を防止しながら、か
つ、高感度で正確にヒトヘモグロビンを検出できる方
法、およびこれに用いる便溶解用緩衝液を提供すること
にある。
【０００９】
【課題を解決するための手段】即ち、本発明は、抗ヒト
ヘモグロビン抗体を用いたヒトヘモグロビンの検出にお
いて、キレート試薬を被検液中に添加することを特徴と
する検出方法およびこれに用いる便溶解用緩衝液に関す
る。
ヘモグロビン抗体を用いたヒトヘモグロビンの検出にお
いて、キレート試薬を被検液中に添加することを特徴と
する検出方法およびこれに用いる便溶解用緩衝液に関す
る。
【００１０】本発明の方法において被検体としてのヒト
ヘモグロビンもしくはヒトヘモグロビンを含有する糞便
を溶解するための液としては、例えばりん酸緩衝液、グ
リシン緩衝液、トリス−塩酸緩衝液、ほう酸緩衝液など
がベース液として用いられる。緩衝液のｐＨは６〜９、
好ましくは６．５〜８．５の範囲とする。緩衝液中には
生理食塩濃度近傍の食塩を添加することが好ましい。ま
た、細菌などによるヒトヘモグロビンの変性を抑制する
ために、０．０５〜０．５重量％濃度のアジ化ナトリウ
ムなどの抗菌剤を添加することが好ましい。
ヘモグロビンもしくはヒトヘモグロビンを含有する糞便
を溶解するための液としては、例えばりん酸緩衝液、グ
リシン緩衝液、トリス−塩酸緩衝液、ほう酸緩衝液など
がベース液として用いられる。緩衝液のｐＨは６〜９、
好ましくは６．５〜８．５の範囲とする。緩衝液中には
生理食塩濃度近傍の食塩を添加することが好ましい。ま
た、細菌などによるヒトヘモグロビンの変性を抑制する
ために、０．０５〜０．５重量％濃度のアジ化ナトリウ
ムなどの抗菌剤を添加することが好ましい。
【００１１】本発明の方法においては上記緩衝液中にキ
レート試薬を添加し、ヒトヘモグロビンの変性を抑制す
る。本発明にて用いるキレート試薬としては、Ethylene
diamine tetraacetic acid（以下、ＥＤＴＡという）
や、Trans-1,2-Cyclohexanediamine-N,N,N',N'-tetraac
etic acid,monohydeate 、N,N-Di(hydroxyethyl)glycin
e 、Ethylenediamine-N,N'-diacetic acid、Ethylenedi
amine-N,N'-dipropionicacid,dihydrochloride、Ethyle
nediamine-N,N,N',N'-TETRAKis(methylenephosphonic a
cid)、Glycoletherdiamine-N,N,N',N'-tetraacetic aci
d 、Hexamethylenediamine-N,N,N',N'-tetraacetic aci
d 、Hydroxyethyliminodiacetic acid、Iminodiacetic
acid、1,2-Diaminopropane-N,N,N',N'-tetraacetic aci
d、Nitrilotriacetic acid （以下、ＮＴＡという）、N
itrilotripropionic acid、Nitrilotris(methylenephos
phonic acid)trisodium salt など、およびその金属塩
を用いることができる。キレート試薬の添加量は被検液
中の糞便の濃度によって適宜設定するが、糞便濃度４ｍ
ｇ／ｍｌの場合、０．０１ｍｍｏｌ／ｌ以上、好ましく
は０．１〜５０ｍｍｏｌ／ｌの濃度となるように添加す
る。添加量が少なすぎるとヒトヘモグロビンの変性を抑
制する作用が充分でなくなり好ましくなく、また多すぎ
ると増量効果が認められず不経済であると共に、溶解し
がたくなる。
レート試薬を添加し、ヒトヘモグロビンの変性を抑制す
る。本発明にて用いるキレート試薬としては、Ethylene
diamine tetraacetic acid（以下、ＥＤＴＡという）
や、Trans-1,2-Cyclohexanediamine-N,N,N',N'-tetraac
etic acid,monohydeate 、N,N-Di(hydroxyethyl)glycin
e 、Ethylenediamine-N,N'-diacetic acid、Ethylenedi
amine-N,N'-dipropionicacid,dihydrochloride、Ethyle
nediamine-N,N,N',N'-TETRAKis(methylenephosphonic a
cid)、Glycoletherdiamine-N,N,N',N'-tetraacetic aci
d 、Hexamethylenediamine-N,N,N',N'-tetraacetic aci
d 、Hydroxyethyliminodiacetic acid、Iminodiacetic
acid、1,2-Diaminopropane-N,N,N',N'-tetraacetic aci
d、Nitrilotriacetic acid （以下、ＮＴＡという）、N
itrilotripropionic acid、Nitrilotris(methylenephos
phonic acid)trisodium salt など、およびその金属塩
を用いることができる。キレート試薬の添加量は被検液
中の糞便の濃度によって適宜設定するが、糞便濃度４ｍ
ｇ／ｍｌの場合、０．０１ｍｍｏｌ／ｌ以上、好ましく
は０．１〜５０ｍｍｏｌ／ｌの濃度となるように添加す
る。添加量が少なすぎるとヒトヘモグロビンの変性を抑
制する作用が充分でなくなり好ましくなく、また多すぎ
ると増量効果が認められず不経済であると共に、溶解し
がたくなる。
【００１２】本発明の方法では上記のようにしてキレー
ト試薬を添加した緩衝液中に、被検物質であるヒトヘモ
グロビンもしくはヒトヘモグロビンを含有する糞便を溶
解して被検液とする。具体的には、便潜血検査の場合、
被検者の糞便の一定量をキレート試薬を含有する一定量
の緩衝液中に溶解することにより調製することができ
る。
ト試薬を添加した緩衝液中に、被検物質であるヒトヘモ
グロビンもしくはヒトヘモグロビンを含有する糞便を溶
解して被検液とする。具体的には、便潜血検査の場合、
被検者の糞便の一定量をキレート試薬を含有する一定量
の緩衝液中に溶解することにより調製することができ
る。
【００１３】本発明の検出方法を実施するには、従来か
ら知られている抗ヒトヘモグロビン抗体を用いた免疫学
的検出方法が採用できる。
ら知られている抗ヒトヘモグロビン抗体を用いた免疫学
的検出方法が採用できる。
【００１４】以下にラテックス凝集法を利用した検出方
法について例示する。精製したヘモグロビンＡを抗原と
してウサギ、ヤギなどの動物に免疫したのち、採血、精
製をして抗ヒトヘモグロビン抗体を得る。この抗体を中
性ｐＨでポリスチレンラテックス（粒径０．３μｍ) と
混合して数時間吸着反応させたのち、ウシ血清アルブミ
ンおよび食塩を含む緩衝液などで遠心分離精製を行い、
抗ヒトヘモグロビン抗体感作ラテックス試薬を得る。
法について例示する。精製したヘモグロビンＡを抗原と
してウサギ、ヤギなどの動物に免疫したのち、採血、精
製をして抗ヒトヘモグロビン抗体を得る。この抗体を中
性ｐＨでポリスチレンラテックス（粒径０．３μｍ) と
混合して数時間吸着反応させたのち、ウシ血清アルブミ
ンおよび食塩を含む緩衝液などで遠心分離精製を行い、
抗ヒトヘモグロビン抗体感作ラテックス試薬を得る。
【００１５】次に、このラテックス試薬と被検液とをガ
ラス板上で撹拌混合し、数分後のラテックスの凝集像に
よって、ヒトヘモグロビンを定性的に検出することがで
きる。
ラス板上で撹拌混合し、数分後のラテックスの凝集像に
よって、ヒトヘモグロビンを定性的に検出することがで
きる。
【００１６】また、酵素免疫法の場合は、抗ヒトヘモグ
ロビン抗体を感作したマイクロプレートのウエルに被検
液を入れ、洗浄した後、ペルオキシダーゼやアルカリフ
ォスファターゼで標識した抗体を添加し、発色度合いを
測定する。
ロビン抗体を感作したマイクロプレートのウエルに被検
液を入れ、洗浄した後、ペルオキシダーゼやアルカリフ
ォスファターゼで標識した抗体を添加し、発色度合いを
測定する。
【００１７】
【実施例】以下に本発明の実施例を示し、さらに具体的
に説明する。
に説明する。
【００１８】実施例 ０．２ｍｏｌ／ｌグリシン、０．１％ウシ血清アルブミ
ン、０．１％アジ化ナトリウム、０．９％塩化ナトリウ
ムからなる水溶液を作製したのち、この溶液に表１中に
記載のキレート試薬を濃度を変えて溶解し、１Ｎ水酸化
ナトリウム水溶液にてｐＨ８．０に調整した。
ン、０．１％アジ化ナトリウム、０．９％塩化ナトリウ
ムからなる水溶液を作製したのち、この溶液に表１中に
記載のキレート試薬を濃度を変えて溶解し、１Ｎ水酸化
ナトリウム水溶液にてｐＨ８．０に調整した。
【００１９】次に、５％カルボキシル化ポリスチレンラ
テックス１０ｍｌに１ｍｇ／ｍｌの１- エチル- ３-(３
- ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド１０ｍｌを
加え、２０分間撹拌しながら反応させた後、０．０１ｍ
ｏｌ／ｌほう酸緩衝液（ｐＨ８．０）で２回遠心分離精
製した。
テックス１０ｍｌに１ｍｇ／ｍｌの１- エチル- ３-(３
- ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド１０ｍｌを
加え、２０分間撹拌しながら反応させた後、０．０１ｍ
ｏｌ／ｌほう酸緩衝液（ｐＨ８．０）で２回遠心分離精
製した。
【００２０】このラテックス（濃度５％）１０ｍｌに、
精製ヒトヘモグロビンをウサギに免疫して作製した抗ヒ
トヘモグロビン抗体（ウサギＩｇＧ、濃度５ｍｇ／ｍ
ｌ）７ｍｌを添加し、５時間ゆっくりと撹拌しながら反
応させ、さらに０．１％ウシ血清アルブミンを含む０．
０１ｍｏｌほう酸緩衝液（ｐＨ８．０）で３回遠心分離
精製し、ラテックス濃度１％の抗ヒトヘモグロビン抗体
感作ラテックス試薬を得た。
精製ヒトヘモグロビンをウサギに免疫して作製した抗ヒ
トヘモグロビン抗体（ウサギＩｇＧ、濃度５ｍｇ／ｍ
ｌ）７ｍｌを添加し、５時間ゆっくりと撹拌しながら反
応させ、さらに０．１％ウシ血清アルブミンを含む０．
０１ｍｏｌほう酸緩衝液（ｐＨ８．０）で３回遠心分離
精製し、ラテックス濃度１％の抗ヒトヘモグロビン抗体
感作ラテックス試薬を得た。
【００２１】次に、前記にて調製したキレート試薬溶解
溶液中にヒトヘモグロビンを濃度を変えて溶解し、さら
に健常人糞便を４ｍｇ／ｍｌ濃度で溶解し、この溶液８
０μｌと前記ラテックス試薬２０μｌとをウエル内で混
合、撹拌して、１０分後の凝集像を肉眼にて観察した。
その結果を表１に示す。表１から明らかなように、高感
度でヒトヘモグロビンを検出できることが判明した。
溶液中にヒトヘモグロビンを濃度を変えて溶解し、さら
に健常人糞便を４ｍｇ／ｍｌ濃度で溶解し、この溶液８
０μｌと前記ラテックス試薬２０μｌとをウエル内で混
合、撹拌して、１０分後の凝集像を肉眼にて観察した。
その結果を表１に示す。表１から明らかなように、高感
度でヒトヘモグロビンを検出できることが判明した。
【００２２】次に、前記ヒトヘモグロビン溶解液を２５
℃で６日間放置した後、再び前記ラテックス試薬と混合
して凝集像を観察した。その結果を表２に示す。
℃で６日間放置した後、再び前記ラテックス試薬と混合
して凝集像を観察した。その結果を表２に示す。
【００２３】比較例 キレート試薬を添加しなかった以外は実施例と同様にし
てラテックス凝集反応を行い凝集像を観察した。その結
果を表１および表２に併記した。
てラテックス凝集反応を行い凝集像を観察した。その結
果を表１および表２に併記した。
【００２４】＜凝集判定基準＞ ＋＋：非常に強い凝集がみられた。 ＋：強い凝集が
みられた。 ±：弱い凝集がみられた。 −：凝集がみられ
ない。
みられた。 ±：弱い凝集がみられた。 −：凝集がみられ
ない。
【００２５】
【表１】
【００２６】
【表２】
【００２７】
【発明の効果】以上のように本発明の方法によれば、キ
レート試薬を被検液中に添加しているので、被検液中の
ヒトヘモグロビンが変性することを制御でき、その結
果、被検液を長時間放置する場合でも高感度にヒトヘモ
グロビンを検出することができるものである。
レート試薬を被検液中に添加しているので、被検液中の
ヒトヘモグロビンが変性することを制御でき、その結
果、被検液を長時間放置する場合でも高感度にヒトヘモ
グロビンを検出することができるものである。
Claims (2)
- 【請求項１】 抗ヒトヘモグロビン抗体を用いたヒトヘ
モグロビンの検出において、キレート試薬を被検液中に
添加することを特徴とするヒトヘモグロビンの検出方
法。 - 【請求項２】 ヒトヘモグロビンの検出に用いる、キレ
ート試薬を含有することを特徴とする、被検体を溶解す
るための便溶解用緩衝液。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP29216391A JPH0599923A (ja) | 1991-10-11 | 1991-10-11 | ヒトヘモグロビンの検出方法及びそれに用いる便溶解用緩衝液 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP29216391A JPH0599923A (ja) | 1991-10-11 | 1991-10-11 | ヒトヘモグロビンの検出方法及びそれに用いる便溶解用緩衝液 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0599923A true JPH0599923A (ja) | 1993-04-23 |
Family
ID=17778366
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP29216391A Pending JPH0599923A (ja) | 1991-10-11 | 1991-10-11 | ヒトヘモグロビンの検出方法及びそれに用いる便溶解用緩衝液 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH0599923A (ja) |
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2009051032A1 (ja) | 2007-10-16 | 2009-04-23 | Eiken Chemical Co., Ltd. | ヘムタンパク質の安定化方法及び保存溶液 |
| US10435735B2 (en) | 2014-03-07 | 2019-10-08 | Dna Genotek Inc. | Composition and method for stabilizing nucleic acids in biological samples |
| US11002646B2 (en) | 2011-06-19 | 2021-05-11 | DNA Genotek, Inc. | Devices, solutions and methods for sample collection |
| US11572581B2 (en) | 2002-06-07 | 2023-02-07 | DNA Genotek, Inc. | Compositions and methods for obtaining nucleic acids from sputum |
-
1991
- 1991-10-11 JP JP29216391A patent/JPH0599923A/ja active Pending
Cited By (17)
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| CN101828112A (zh) * | 2007-10-16 | 2010-09-08 | 荣研化学株式会社 | 血红素蛋白的稳定化方法和保存溶液 |
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