CN102105583A - 从粪便试样中回收核酸的方法、核酸分析方法以及粪便试样处理装置 - Google Patents

Abstract

本发明涉及提供一种不需要繁杂的操作且高纯度地回收粪便中的核酸的方法、使用通过该方法回收的核酸进行分析的方法、以及该方法中使用的粪便试样处理装置，该方法具有以下工序：(A)将采集的粪便添加到以水溶性有机溶剂为有效成分的核酸扩增反应抑制物质除去用溶液中而调制粪便试样，并将上述粪便试样保存规定的时间，从而使核酸扩增反应抑制物质溶出的工序；和(B)在工序(A)之后，从粪便试样中除去核酸扩增反应抑制物质除去用溶液并回收粪便来源的固体成分的工序；和(C)从在工序(B)中回收的粪便来源的固体成分中回收核酸的工序。

Description

从粪便试样中回收核酸的方法、核酸分析方法以及粪便试样处理装置

技术领域

本发明涉及一种用于从粪便试样中高纯度地回收核酸的从粪便试样中回收核酸的方法、使用了由该核酸回收方法回收的核酸的核酸分析方法、以及粪便试样处理装置。

本申请基于2008年7月23日在日本申请的日本特愿2008-189684号要求优先权，并将其内容援引于此。

背景技术

与欧美同样，在日本，结肠癌的患者数也在逐年急剧增加，结肠癌已占居癌症死亡率的前几位。其原因认为是日本人的饮食生活转变成欧美型的以肉食为中心。具体而言，每年约6万人左右罹患结肠癌，在按照脏器分类的死亡数方面，结肠癌排在第三位，仅次于胃癌、肺癌，预测今后也会进一步增加。另一方面，结肠癌与其他的癌症不同，通过在发病初期进行治疗，近100％能够治愈。因此，将结肠癌作为早期癌诊察的对象是非常有意义的，用于早期发现结肠癌的检查方法的研究和开发正在盛行。

作为用于早期发现结肠癌的检查方法，进行的有例如灌肠检查、结肠镜检查等。灌肠检查是如下检查：向大肠中注入钡使其附着于大肠的粘膜面，照射X射线拍摄其表面的凹凸，观察大肠的表面。另一方面，结肠镜检查是通过内窥镜直接观察大肠内部的检查。特别是结肠镜检查的灵敏度和特异性高，还具有也能够切除息肉和早期癌的优点。然而，这些检查方法存在成本高、给受试者带来的负担大、伴随并发症的风险的问题。例如，灌肠检查中存在X射线暴露和肠梗阻的危险性。另外，结肠镜检查由于将内窥镜直接***大肠内因而具有侵入性。进而，需要内窥镜操作熟练，能够检查的设施有限。因此，这些检查方法不适于定期体检等以无症状的普通人为对象的结肠癌检查。

近年来，作为结肠癌的一次筛查方法，正广泛实施一种非侵入性且低成本的粪便潜血检查。粪便潜血检查是调查粪便中所含的红细胞来源的血红蛋白的有无的检查，是间接预测结肠癌的存在的方法。作为粪便潜血检查被广泛利用的原因，可列举出：可在常温下进行粪便的采集和保存，也不需要冷藏和冷冻等特殊的保存条件；以及，可以在普通家庭简单地进行；操作非常简便。但是，在粪便潜血检查中，存在灵敏度低至25％左右、漏检结肠癌的概率高的问题。进而，阳性命中率也低，粪便潜血检查为阳性的受试者中实际为结肠癌患者的比例为10％以下，包括很多假阳性。因此，强烈期望开发可靠性更高的新型检查方法。

作为也适于定期体检等的、非侵入性、简便、且可靠性高的新型检查方法，调查粪便中有无癌细胞或有无癌细胞来源的基因的检查受到瞩目。这些检查方法由于直接调查有无癌细胞或癌细胞来源的基因，因此可以期待成为与调查有无伴随结肠癌的患病产生的消化道出血的、作为间接的结肠癌检查方法的粪便潜血检查法相比可靠性更高的检查法。

为了以高精度检测粪便中的癌细胞等，有效地回收粪便中的癌细胞来源的核酸很重要。特别是，由于粪便中的癌细胞来源的核酸为微量，且粪便中含有大量消化残留物和细菌，因此核酸非常容易被分解。因此，为了有效地从粪便试样回收核酸、特别是人等哺乳动物细胞来源的核酸，重要的是调制粪便试样以防止粪便中核酸的分解并且能够稳定地保存至检查操作时为止。作为这种粪便试样的调制方法，例如有从采集的粪便中分离从大肠等消化道脱落的癌细胞的方法。通过从粪便中分离癌细胞，可以抑制细菌等来源的蛋白酶、DNase、RNase等分解酶造成的影响。作为从粪便中分离癌细胞的方法，例如公开了以下方法：(1)为从粪便中分离细胞的方法，其包含(a)将粪便冷却至低于其凝胶凝固点的温度的工序；和(b)将粪便保持在低于其凝胶凝固点的温度以使得粪便实质上为保持完好的状态，同时从粪便中采集细胞的工序(例如，参照专利文献1。)。另外，公开了以下方法：(2)在通常周围温度下将粪便分散到含有蛋白酶抑制物质、粘液溶解剂和杀菌剂的运输培养基中，然后分离从大肠脱落的细胞(例如，参照专利文献2。)。

另外，粪便中含有对PCR(Polymerase Chain Reaction)等核酸扩增反应有抑制作用的物质(例如胆汁酸和其盐等)(例如，参照非专利文献1。)。例如，据报道，成人的平均粪便***量约为200～400g/日，健康人其粪便中的胆汁酸***量为200～650mg/日，另外，在伴有回肠障碍的患者的情况下，其胆汁酸的***量甚至为健康人的10倍。即，换算为每1g粪便时，健康人的每1g粪便中含有约0.5mg～3.25mg的胆汁酸，患者的每1g粪便中含有健康人的10倍的胆汁酸。

另一方面，还报道，胆汁酸盐所导致的PCR的抑制效果在50μg/mL左右的浓度下产生。因此，从粪便中提取核酸并用PCR等对其进行扩增时，为了使扩增效率提高，期望防止胆汁酸盐等核酸扩增反应中的抑制物质的残留(carry over)。

现有技术文献

专利文献

专利文献1：日本特表平11-511982号公报

专利文献2：日本特表2004-519202号公报

非专利文献

非专利文献1：Wilson IG，APPLIED AND ENVIRONMENTAL MICROBIOLOGY，1997年，第63卷，第3741～51页。

发明内容

发明要解决的问题

在上述(1)的方法中，一边冷却粪便试样一边分离细胞。如果不在冷却的情况下进行该分离操作，则由于粪便试样的变质等而无法得到准确的检测结果。因此，为了有效地防止粪便试样的变质，在采集粪便后迅速进行冷却很重要。然而，如诊察等那样在家里进行粪便采集时，采集后立即将粪便试样冷却非常困难，不现实。此外，从粪便试样中分离细胞的操作很繁杂，存在导致检查所需的费用增大的问题。

在上述(2)的方法中，通过添加杀菌剂等，从而不需要冷却操作就能在室温下进行粪便试样的调制和保存，但是由于需要从粪便中分离从大肠脱落的细胞的操作，因此操作性还是差，结果，存在花费成本的问题。

进而，在专利文献1和2以及非专利文献1中，均完全没有记载从粪便中回收核酸时防止胆汁酸、胆汁酸盐等核酸扩增反应中的抑制物质的残留。

本发明的目的在于提供一种减少胆汁酸等核酸扩增反应中的抑制物质的残留、不需要繁杂的操作且高纯度地回收粪便中的核酸的方法；使用由该方法回收的核酸进行分析的方法；以及该回收和分析方法中使用的粪便试样处理装置。

用于解决问题的方案

本发明人等为了解决上述课题，发现，通过在核酸提取工序之前，将采集的粪便浸泡在以水溶性有机溶剂为有效成分的核酸扩增反应中的抑制物质除去用的溶液中并保存规定的时间，能够溶出并除去粪便中所含的核酸扩增反应中的抑制物质，从粪便中高纯度地回收核酸。

即，本发明包括，

(1)一种从粪便试样中回收核酸的方法，其为从粪便中高纯度地回收核酸的方法，具有以下工序：

(A)将采集的粪便添加到以水溶性有机溶剂为有效成分的核酸扩增反应中的抑制物质的除去用溶液中而调制粪便试样，并将上述粪便试样保存规定的时间，从而使核酸扩增反应抑制物质溶出的工序；

(B)在工序(A)之后，从粪便试样中除去核酸扩增反应中的抑制物质的除去用溶液并回收粪便来源的固体成分的工序；和

(C)从在工序(B)中回收的粪便来源的固体成分中回收核酸的工序。

(2)上述(1)所述的从粪便试样中回收核酸的方法中，也可以不将采集的粪便制成悬浮液，而是立即添加到核酸扩增反应抑制物质除去用溶液中，调制粪便试样。

(3)上述(1)或(2)所述的从粪便试样中回收核酸的方法中，使用的上述水溶性有机溶剂优选为水溶性醇和/或酮类。

(4)上述(1)～(3)所述的从粪便试样中回收核酸的方法中，使用的上述水溶性有机溶剂的浓度优选为30％以上。

(5)上述(3)或(4)所述的从粪便试样中回收核酸的方法中，使用的上述水溶性有机溶剂优选含有选自由乙醇、丙醇、和甲醇组成的组中的1种以上作为水溶性醇。

(6)上述(1)所述的从粪便试样中回收核酸的方法中，使用的上述水溶性有机溶剂优选为乙醇。

(7)上述(3)或(4)所述的从粪便试样中回收核酸的方法中，使用的上述水溶性有机溶剂优选含有丙酮和/或甲乙酮作为酮类。

(8)上述(1)～(7)中任一项所述的从粪便试样中回收核酸的方法中，使用的上述粪便和上述核酸扩增反应抑制物质除去用溶液的混合比率优选为：设粪便体积为1时，相对于该1，核酸扩增反应抑制物质除去用溶液体积为1以上。

(9)上述(1)～(8)中任一项所述的从粪便试样中回收核酸的方法中，上述工序(B)中的从粪便试样中除去核酸扩增反应抑制物质除去用溶液优选通过离心分离法来进行。

(10)上述(1)～(9)中任一项所述的从粪便试样中回收核酸的方法中，上述工序(A)中，保存粪便试样的时间优选为1小时以上。

(11)上述(1)～(9)中任一项所述的从粪便试样中回收核酸的方法中，上述工序(A)中，保存粪便试样的时间优选为12小时以上。

(12)上述(1)～(9)中任一项所述的从粪便试样中回收核酸的方法中，上述工序(A)中，保存粪便试样的时间优选为24小时以上。

(13)上述(1)～(9)中任一项所述的从粪便试样中回收核酸的方法中，上述工序(A)中，保存粪便试样的时间优选为72小时以上。

(14)上述(1)～(13)中任一项所述的从粪便试样中回收核酸的方法中，上述工序(A)中，保存粪便试样的温度优选为4℃以上。

(15)上述(1)～(13)中任一项所述的从粪便试样中回收核酸的方法中，上述工序(A)中，保存粪便试样的温度优选为20℃以上。

(16)上述(1)～(15)中任一项所述的从粪便试样中回收核酸的方法中，使用的上述核酸扩增反应抑制物质除去用溶液优选含有表面活性剂。

(17)上述(1)～(16)中任一项所述的从粪便试样中回收核酸的方法中，使用的上述核酸扩增反应抑制物质除去用溶液优选含有着色剂。

(18)上述(1)～(17)中任一项所述的从粪便试样中回收核酸的方法的上述工序(C)优选为如下工序：从在工序(B)中回收的粪便来源的固体成分中同时回收常居肠细菌来源的核酸和常居肠细菌以外的生物来源的核酸。

(19)上述(18)所述的从粪便试样中回收核酸的方法中，使用的上述常居肠细菌以外的生物优选为哺乳动物细胞。

(20)上述(1)～(19)中任一项所述的从粪便试样中回收核酸的方法的上述工序(C)优选具有：

(a)使工序(B)中回收的粪便来源的固体成分中的蛋白质变性，并使核酸从上述粪便来源的固体成分中的常居肠细菌和常居肠细菌以外的生物中溶出的工序；和

(b)回收上述工序(a)中溶出的核酸的工序。

(21)上述(20)所述的从粪便试样中回收核酸的方法中，优选在上述工序(a)之后、上述工序(b)之前具有(c)除去通过上述工序(a)而变性的蛋白质的工序。

(22)上述(20)或(21)所述的从粪便试样中回收核酸的方法中，上述工序(a)中的蛋白质的变性优选使用选自由离液序列高的盐、有机溶剂和表面活性剂组成的组中的1种以上来进行。

(23)上述(22)所述的从粪便试样中回收核酸的方法中，使用的上述有机溶剂优选为酚类。

(24)上述(21)～(23)中任一项所述的从粪便试样中回收核酸的方法中，上述工序(c)中的变性的蛋白质的除去优选使用氯仿来进行。

(25)上述(20)～(24)中任一项所述的从粪便试样中回收核酸的方法中，上述工序(b)中的核酸的回收优选具有以下工序：

(b1)使上述工序(a)中溶出的核酸吸附于无机支撑体的工序；和

(b2)使上述工序(b1)中吸附的核酸从无机支撑体溶出的工序。

(26)另外，本发明为通过上述(1)～(25)中任一项所述的从粪便试样中回收核酸的方法而回收的核酸。

(27)另外，本发明为使用回收的核酸对哺乳动物细胞来源的核酸进行分析的核酸分析方法，该回收的核酸为利用上述(1)～(26)中任一项所述的核酸回收方法从粪便试样中回收的核酸。

(28)上述(27)所述的核酸分析方法中，使用的上述哺乳动物细胞优选为消化道细胞。

(29)上述(27)所述的核酸分析方法中，使用的上述哺乳动物细胞优选为从大肠脱落的细胞。

(30)上述(27)～(29)中任一项所述的核酸分析方法中，被分析的上述哺乳动物细胞来源的核酸优选为指示致瘤性转化的标记物。

(31)上述(27)～(29)中任一项所述的核酸分析方法中，被分析的上述哺乳动物细胞来源的核酸优选为指示炎症性消化器官疾病的标记物。

(32)上述(27)～(31)中任一项所述的核酸分析方法中的分析优选为选自由mRNA的表达分析、K-ras基因的突变分析、以及DNA的甲基化分析组成的组中的1种以上。

(33)另外，本发明为包括溶液除去机构的粪便试样处理装置，该溶液除去机构用于从粪便试样中除去下述核酸扩增反应抑制物质除去用溶液，该粪便试样是将采集的粪便浸泡于以水溶性有机溶剂为有效成分的核酸扩增反应抑制物质除去用溶液中保存规定的时间后的粪便试样。

(34)上述(33)所述的粪便试样处理装置中的上述溶液除去机构优选具有离心分离机构、溶液抽吸排出机构和废液回收部。

(35)上述(34)所述的粪便试样处理装置中，优选上述溶液抽吸排出机构为溶液抽吸排出喷嘴，该粪便试样处理装置还具有洗涤上述溶液抽吸排出喷嘴的机构。

(36)本发明为一种核酸扩增反应抑制物质除去用溶液，其是用于调制核酸回收用粪便试样的溶液，以水溶性有机溶剂为有效成分，用以降低回收的核酸中的核酸扩增反应抑制物质。

(37)上述(36)所述的核酸扩增反应抑制物质除去用溶液中，上述水溶性有机溶剂优选为水溶性醇和/或酮类。

(38)上述(37)所述的核酸扩增反应抑制物质除去用溶液中，上述水溶性有机溶剂的浓度优选为30％以上。

(39)本发明为一种粪便采集用试剂盒，其具有上述(36)～(38)中任一项所述的核酸扩增反应抑制物质除去用溶液、和含有该核酸扩增反应抑制物质除去用溶液的粪便采集容器。

发明的效果

根据本发明的从粪便试样中回收核酸的方法，能够有效地溶出除去粪便中所含的核酸扩增反应抑制物质，并从粪便试样中回收高纯度的核酸。另外，根据本发明，由于不需要从粪便试样中分离哺乳动物细胞等作为检测对象的生物或其细胞等之类繁杂的操作，因此即使在处理多个待测物时，也能够有效地降低劳力和成本。特别是，通过使用本发明的粪便试样处理装置，能够更简便地从粪便试样中回收核酸。

像这样，通过利用本发明的从粪便试样中回收核酸的方法、以及使用由该回收方法回收的核酸的核酸分析方法，从而能够高灵敏度且高精度地分析粪便中的核酸。因此，期望通过利用本发明，对以结肠癌为首的各种症状和疾病的早期发现和诊断、治疗过程的观察以及其他异常情况的病理学研究等有益。

附图说明

图1为表示本发明的粪便试样处理装置的一个实施方式的图。

图2为表示本发明的粪便采集用试剂盒中能够使用的粪便采集容器A的一个实施方式的图。

图3为表示本发明的粪便采集用试剂盒中能够使用的粪便采集容器B的一个实施方式与其使用方法的一个例子的图。

图4为表示实施例1中每100μL所提取的RNA溶液中的胆汁酸量的图。

图5为表示实施例2中以脱氧胆酸钠浓度为横轴、以GAPDH扩增量为纵轴的测定结果的图。

附图标记说明

1…容器本体

1a…***部

2…盖

3…粪便采集棒

3a…杯

S…核酸扩增反应抑制物质除去用溶液

11…容器本体

12…盖

13…粪便采集棒

13a…孔

13b…可动盖

15…袋

E…粪便

101…粪便试样处理装置

102…离心分离机构

103…溶液抽吸排出喷嘴

104…废液回收部

105…溶液抽吸排出喷嘴洗涤机构

具体实施方式

本发明中，核酸扩增反应抑制物质是指对核酸扩增反应有抑制作用的物质，具体而言，可列举出胆汁酸、胆汁酸盐等。以下，将核酸扩增反应抑制物质简称为抑制物质A。另外，本发明中，核酸扩增反应意味着像PCR等那样的利用DNA聚合酶且伴随核酸伸长的扩增反应。

本发明的从粪便试样中回收核酸的方法(以下，有时称作“本发明的核酸回收方法”。)，将采集的粪便与以水溶性有机溶剂为有效成分的抑制物质A的除去用溶液混合后，保存规定的时间。通过将粪便在与抑制物质A的除去用溶液混合的状态下保存规定的时间，能够有效地溶出除去粪便中所含的胆汁酸和胆汁酸盐等抑制物质A。由此，能够显著减少抑制物质A在从粪便试样中回收的核酸中的残留，能够回收高纯度的核酸。

推测水溶性有机溶剂所带来的上述抑制物质A量的降低效果、即能够使抑制物质A在回收的核酸中的残留减少的效果，是由抑制物质A与核酸在水溶性有机溶剂中的溶解性的差异引起的。即，胆汁酸等抑制物质A易溶于醇等水溶性有机溶剂中，但难溶于非极性有机溶剂中。另一方面，核酸在醇中由于盐的效果而不溶化，难溶于醇等水溶性有机溶剂中。因此推测，如果使粪便与醇等水溶性有机溶剂混合，则能够使抑制物质A溶出到水溶性有机溶剂中，将其与不溶于水溶性有机溶剂成分的核酸分离，因而能够降低回收的核酸中的抑制物质A量。

关于本发明的核酸回收方法，具体而言，首先，作为工序(A)，将采集的粪便添加到以水溶性有机溶剂为有效成分的核酸扩增反应抑制物质除去用溶液(以下，简称为除去用溶液S)中，调制粪便试样。然后，将调制的上述粪便试样保存规定的时间，从而使抑制物质A溶出。

本发明的核酸回收方法中使用的除去用溶液S以水溶性有机溶剂为有效成分。粪便等生物试样通常含有大量的水分，但除去用溶液S以在水中的溶解度高的溶剂、或能与水以任意比例混合的水溶性有机溶剂作为有效成分。因此，能够与粪便试样迅速混合，获得更高的抑制物质A量的降低效果。

本发明中，水溶性有机溶剂是指醇类或酮类，是具有直链结构且在室温附近例如15～40℃下为液态的溶剂。另外，本发明中的水溶性有机溶剂中不含有机酸。通过以具有直链结构的水溶性有机溶剂作为有效成分，与以具有苯环等环状结构的有机溶剂作为有效成分相比，能够迅速地进行与粪便的混合。具有环状结构的有机溶剂通常容易与水分离，因此不易与粪便混合，难以获得好的抑制物质A量的降低效果。即使是在水中一定程度溶解的具有环状结构的有机溶剂，为了使粪便均匀地分散，也需要剧烈混合或者加温。另外还考虑到，为了易于将粪便与具有环状结构的有机溶剂混合，预先制作有机溶剂与水的混合溶液，然后将粪便与该混合溶液混合。然而，为了制作该混合溶液，需要将具有环状结构的有机溶剂与水剧烈混合、或者加温，故不优选。

除去用溶液S中所含的水溶性有机溶剂优选为在水中的溶解度为12重量％以上的水溶性有机溶剂，更优选为在水中的溶解度为20重量％以上的水溶性有机溶剂，进一步优选为在水中的溶解度为90重量％以上的水溶性有机溶剂，特别优选为能与水以任意比例混合的水溶性有机溶剂。作为能与水以任意比例混合的水溶性有机溶剂，例如有甲醇、乙醇、正丙醇、2-丙醇、丙酮等。

除去用溶液S中所含的水溶性有机溶剂只要是满足上述定义、核酸的溶解性低但抑制物质A能够溶解的溶剂，则没有特别限定。作为该水溶性有机溶剂，例如有醇类和酮类，作为醇类有作为水溶性醇的甲醇、乙醇、丙醇、丁醇、巯基乙醇等，作为酮类有丙酮、甲乙酮(在水中的溶解度为90重量％)等。丙醇可以为正丙醇，也可以为2-丙醇。另外，丁醇可以为1-丁醇(在水中的溶解度为20重量％)，也可以为2-丁醇(在水中的溶解度为12.5重量％)。

作为除去用溶液S中所含的水溶性有机溶剂，优选醇类或酮类，更优选选自由水溶性醇、丙酮、和甲乙酮组成的组中的1种以上。这些溶剂中，胆汁酸盐等抑制物质A的溶解性高，能够获得更优异的抑制物质A量的降低效果。进而，从容易获得性、处理容易性、安全性等观点来看，更优选水溶性醇，进一步优选乙醇、丙醇、甲醇。特别是乙醇，由于安全性最高，在家庭内也容易处理，因此在定期体检等筛选检查中特别有用。

除去用溶液S中的水溶性有机溶剂浓度只要为能够发挥抑制物质A量的降低效果的浓度，则没有特别限定，可以考虑水溶性有机溶剂的种类等而适当决定。例如，使用水溶性醇、酮类作为有效成分时，除去用溶液S的水溶性有机溶剂浓度优选为30％以上。通过使水溶性有机溶剂浓度为充分的高浓度，从而混合粪便与除去用溶液S时，水溶性有机溶剂成分迅速地渗透到粪便中，能够迅速发挥抑制物质A的除去效果。

另外，本发明和本申请说明书中，只要没有特别记载，“％”意味着“体积％”。

特别是使用水溶性醇作为有效成分时，除去用溶液S的水溶性有机溶剂浓度优选为30％以上，更优选为50％以上，进一步优选为50～80％，特别优选为50％以上且不足70％。如果水溶性有机溶剂浓度高，则即使对于水分含量多的粪便，用少量的除去用溶液S也足够，且能够发挥充分的抑制物质A量的降低效果。

另外，使用丙酮、甲乙酮作为有效成分时，本发明的除去用溶液S的水溶性有机溶剂浓度优选为30％以上，更优选为60％以上，进一步优选为80％以上。

此外，本发明中使用的水溶性有机溶剂可以只含有1种水溶性有机溶剂，也可以是2种以上的水溶性有机溶剂的混合溶液。例如，可以是2种以上的醇的混合溶液，也可以是醇和其他种类的水溶性有机溶剂的混合溶液。进而，从能够更加改善抑制物质A量的降低效率和核酸回收效率方面来看，也优选为醇和丙酮的混合溶液。

采集的粪便中所添加的除去用溶液S的体积没有特别限定，但粪便与除去用溶液S的混合比率优选为，设粪便体积为1时，相对于该1，除去用溶液S的体积为1以上。这是由于，向装有除去用溶液S的粪便采集容器中加入粪便时，如果使用与粪便等量以上的除去用溶液S，则可使粪便完全浸泡于除去用溶液S中，能够有效地获得本发明的效果。例如，粪便与除去用溶液S等量时，能够使装有除去用溶液S的粪便采集容器轻量化和小型化。另一方面，通过添加相对于粪便为5倍以上体积的除去用溶液S，能够迅速并且有效地进行粪便向除去用溶液S中的分散。进而，通过使用该体积的除去用溶液S，还可以抑制粪便中含有的水分所导致的水溶性有机溶剂浓度的降低。为了使装有除去用溶液S的粪便采集容器的轻量化和粪便分散性的提高这两方面效果取得较好的平衡，更优选粪便与除去用溶液S的混合比率为1∶1～1∶20，进一步优选为1∶3～1∶10，更优选为1∶5左右。

另外，供于本发明的核酸回收方法的粪便只要为动物的粪便，则没有特别限定，但优选为哺乳动物来源的粪便，更优选为人来源的粪便。例如，优选为了定期体检或诊断等而采集的人的粪便，但也可以是家畜或野生动物等的粪便。另外，作为试样的粪便可以是采集后保存了一定时间的粪便，但优选刚采集后的粪便。进而，采集的粪便优选为刚***后的粪便，但也可以是***后经过一段时间的粪便。

供于本发明的核酸回收方法的粪便的量没有特别限定，但优选为10mg～1g的范围。粪便量过多时，采集操作费工夫，粪便采集容器也变大，因此处理性等可能会降低。相反粪便量过于少量时，粪便中所含的从大肠脱落的细胞等哺乳动物细胞数变得过少，因此无法回收所需的核酸量，目标核酸分析的精度可能会降低。另外，由于粪便是不均质的，即各种各样的成分不均匀地存在，因此为了避免哺乳动物细胞的存在于局部的影响，优选在采集粪便时从粪便的多个不同部位采集。

除去用溶液S可以通过适当稀释水溶性有机溶剂并将其调整至所期望的浓度从而得到。用于稀释的溶剂没有特别限定，优选为水或PBS等缓冲液。另外，只要不损害水溶性有机溶剂成分所带来的抑制物质A量的降低效果，除去用溶液S中除水溶性有机溶剂以外还可以含有任意的成分。例如，可以含有离液序列高的盐，也可以含有表面活性剂。通过含有离液序列高的盐或表面活性剂，从而能更有效地抑制粪便中的细胞活性和各种分解酶的酶活性。

作为除去用溶液S中所含的离液序列高的盐，例如有盐酸胍、异硫氰酸胍、碘化钠、高氯酸钠和三氯醋酸钠等。作为除去用溶液S中所含的表面活性剂，优选为非离子性表面活性剂。作为该非离子性表面活性剂，例如有Tween80、CHAPS(3-[3-胆酰胺丙基二甲氨基]-1-丙磺酸内盐)、Triton X-100、Tween20等。离液序列高的盐和表面活性剂的种类和浓度，只要是能够获得抑制物质A量的降低效果的浓度，则没有特别限定，可以考虑粪便量、之后的工序和分析方法等而适当决定。

此外，除去用溶液S中可添加适当着色剂。通过对除去用溶液S着色，可以获得防止误吞、减轻粪便颜色等效果。作为该着色剂，优选用作食品添加剂的着色料，优选蓝色或绿色等。可列举出如坚牢绿FCF(绿色3号)、亮蓝FCF(蓝色1号)、靛蓝胭脂红(蓝色2号)等。另外，可以混合添加多种着色剂，也可以单独添加。

在除去用溶液S中添加粪便后，通过使粪便与除去用溶液S混合，能够获得更好的抑制物质A量的降低效果。优选粪便与除去用溶液S的混合能够充分进行、并且粪便采集者能够简便进行的方法。这是由于，通过将粪便充分地分散于除去用溶液S中，能够使水溶性有机溶剂成分充分地渗透到粪便中，并且能够使粪便中的抑制物质A充分地溶出到除去用溶液S中。另外，混合粪便与除去用溶液S的方法只要是通过物理方法进行混合的方法，则没有特别限定。例如，可以通过向预先装有除去用溶液S的可密闭的容器中投入采集的粪便，密闭后，将该容器上下颠倒而进行混合，也可以通过将该容器置于旋涡混合器等震荡器上进行混合。另外，还可以将粪便与除去用溶液S在混合用颗粒的存在下进行混合。为了迅速并且充分地进行混合，该混合方法优选使用震荡器的方法和使用混合用颗粒的方法。特别是，通过使用预先含有混合用颗粒的粪便采集容器，从而在家庭等没有特殊装置的环境中也能够简便并且充分地进行混合。

作为混合用颗粒，只要是不损害水溶性有机溶剂成分所带来的抑制物质A量的降低效果的组合物，并且具有通过与粪便碰撞从而能够迅速并且充分地将粪便分散至除去用溶液S中的硬度和比重的颗粒，则没有特别限定。进而，混合用颗粒可以是由1种材质形成的颗粒，也可以是由2种以上的材质形成的颗粒。作为这样的混合用颗粒，例如有由玻璃、陶瓷、塑料、胶乳、金属等形成的颗粒。此外，混合用颗粒可以是磁性颗粒，也可以是非磁性颗粒。

将粪便添加到除去用溶液S中，处于使粪便浸泡于除去用溶液S中的状态，从而能够发挥抑制物质A量的降低效果。

因此，不一定需要在添加到粪便除去用溶液S中之后迅速使粪便与除去用溶液S混合。还可以处于使粪便浸泡于除去用溶液S中的状态，从而在保存时运输的情况下利用该运输中的振动而混合。

像这样，为了使抑制物质A从粪便中溶出，将使粪便浸泡于除去用溶液S中而得到的粪便试样保存规定的时间。保存粪便试样的时间只要是能够发挥抑制物质A量的降低效果的时间，则没有特别限定，可以考虑水溶性有机溶剂的种类和浓度、粪便与除去用溶液S的混合比、保存温度等而适当决定。本发明的核酸回收方法中，该粪便试样的保存时间优选保存1小时以上，更优选保存12小时以上，进一步优选保存24小时以上，特别优选保存72小时以上。另外，还可以保存168小时以上。例如，通过将该粪便试样至少保存1小时以上，从而使溶出的抑制物质A的量达到如下程度：在通常的PCR反应条件下能够充分抑制粪便中抑制物质A的残留所导致的影响。

关于水溶性有机溶剂所带来的抑制物质A量的降低效果，保存粪便试样的温度为低温时，不如温度高时更能获得好的效果。具体而言，本发明中，工序(A)中的粪便试样的保存温度优选为4℃以上，更优选为20℃以上。但是，优选在保存温度50℃以下进行保存。其原因是，通过在50℃以上的高温条件下长时间保存，该粪便试样中的水溶性有机溶剂的浓度可能会由于挥发等而低于发挥抑制物质A量的降低效果所需的充分的浓度。

本发明的核酸回收方法中，粪便试样的保存温度只要为4℃以上即可发挥抑制物质A量的降低效果。即，工序(A)中的保存可以使用恒温装置等在温度被控制的环境下进行，但也可以不需要温度被控制的特殊的环境，而在室温下进行。另外，还可以在通常进行粪便的采集或粪便试样的运输等的温度下进行。因此，例如，即使在温度非控制下运输工序(A)中调制的粪便试样时，也可将该运输期间作为保存期间。更具体而言，在像定期体检等情况下，粪便采集者调制粪便试样的场所和进行核酸提取操作的场所是分开的，将调制的粪便试样运输到进行核酸提取操作的场所时，只要运输时的温度为4～50℃，则无论有无温度控制，都可将该运输时间作为工序(A)中的保存时间。

为了减少从粪便回收的核酸中的抑制物质A的量，还可以在提取核酸后进行抑制物质A的溶出除去操作。然而，进行临床上的待测物的检查时，这种检查工序的增加直接关系到人事费用的增加。

相对于此，使用本发明的核酸回收方法时，可以在检查场所进行的检查工序之前进行如下工序：粪便采集者在采集粪便后直接将粪便浸泡于除去用溶液S中，溶出除去抑制物质。因此，本发明的核酸回收方法可期待削减临床检查等中的成本。

另外，如上所述，粪便中的核酸非常容易分解。因此，通常调制粪便试样后，迅速地供于核酸回收、分析工序中。另外，粪便试样调制时和核酸回收、分析时的时间间隔较长的情况下，为了抑制核酸分解的进行，而在冷冻、冷藏等低温环境下保存粪便试样。然而，本发明的核酸回收方法中，调制粪便试样后，即使在室温等温度比较高的环境下长时间保存时也能够非常有效地从该粪便试样中回收核酸。这是由于，通过使粪便与水溶性有机溶剂混合，从而防止粪便中所含的核酸的分解等并稳定地保持核酸，推测水溶性有机溶剂所带来的这种高效地回收核酸、即防止核酸的分解等、稳定地保持并有效地回收核酸这一效果，是由于以下的原因而得到的：

(1)由于水溶性有机溶剂成分具有的脱水作用，哺乳动物细胞或病毒等具有作为检测对象的核酸的常居肠细菌以外的生物的细胞被活化；

(2)由于常居肠细菌的细胞活性显著降低，并且经时的变化被抑制；

(3)由于水溶性有机溶剂成分具有的蛋白质变性作用，粪便中的蛋白酶、DNase、RNase等各种分解酶的活性显著降低。

即，本发明的核酸回收方法中，为了调制粪便试样，使用以水溶性有机溶剂为有效成分的除去用溶液S。因此，即使在为了溶出抑制物质A而将调制的粪便试样保存充分的时间的情况下，也能在粪便试样的保存期间抑制粪便试样中核酸的分解并稳定地保持该核酸。因此，能够在之后的工序(C)中非常有效地回收核酸。

粪便中所含的抑制物质A在除去用溶液S中优先被溶出，但在除去用溶液S中的溶解性较低的核酸残留于粪便来源的固体成分中。因此，在工序(A)之后，作为工序(B)，从粪便试样中除去除去用溶液S并回收粪便来源的固体成分。然后，作为工序(C)，从回收的粪便来源的固体成分中回收核酸，从而能够回收抑制物质A的含量较低的高纯度的核酸。

工序(B)中的将除去用溶液S从粪便试样中除去的方法，可以从分离液体成分和固体成分时通常所使用的分离方法中适当选择而进行。该分离方法只要是不损害粪便试样中的核酸，能够将粪便试样的液体成分即除去用溶液S连同溶出的抑制物质A一起从固体成分即粪便来源的固体成分中分离的方法，则没有特别限定。例如，可以通过离心分离法除去上清、回收作为沉淀的粪便来源的固体成分，也可以利用过滤法对粪便试样进行过滤器过滤、回收残留在过滤面上的粪便来源的固体成分。本发明中特别优选离心分离法。

工序(C)中的核酸回收方法没有特别限定，只要是从试样中回收核酸时通常采用的方法，则可以通过任意方法进行。从粪便来源的固体成分中回收的核酸既可以是DNA，可以是RNA，也可以是DNA和RNA这两者。

粪便来源的固体成分中主要含有哺乳动物细胞等常居肠细菌以外的生物(以下，称为哺乳动物细胞)来源的核酸、和常居肠细菌来源的核酸。从粪便来源的固体成分中回收核酸时，可以分别回收哺乳动物细胞来源的核酸和常居肠细菌细胞来源的核酸，但特别优选同时回收。通过同时回收哺乳动物细胞来源的核酸和常居肠细菌来源的核酸，从而粪便中大量存在的常居肠细菌来源的核酸作为载体发挥功能。其结果，与预先从粪便中分离哺乳动物细胞等后回收核酸相比，对于量较少的哺乳动物细胞来源的核酸能够更有效地回收核酸。

例如，作为工序(a)，使粪便来源的固体成分中的蛋白质变性，使核酸从上述粪便来源的固体成分中的哺乳动物细胞等和常居肠细菌中溶出，然后作为工序(b)，回收溶出的核酸，从而能够从粪便来源的固体成分中同时回收哺乳动物细胞来源的核酸和常居肠细菌来源的核酸。

工序(a)中的粪便来源的固体成分中的蛋白质的变性可以通过公知的方法进行。例如，通过向粪便来源的固体成分中添加离液序列高的盐、有机溶剂、表面活性剂等通常用作蛋白质变性剂的化合物，能够使粪便来源的固体成分中的蛋白质变性。工序(a)中，作为添加到粪便来源的固体成分中的离液序列高的盐或表面活性剂，可以使用与作为添加到除去用溶液S中的离液序列高的盐和表面活性剂而列举的物质同样的物质。作为有机溶剂，优选为酚类。酚类可以为中性，也可以为酸性。使用酸性的酚类时，能够选择性地将RNA优先于DNA提取至水层中。另外，工序(a)中，向粪便来源的固体成分中添加离液序列高的盐、有机溶剂、表面活性剂等时，可以添加1种化合物，也可以添加2种以上的化合物。

也可以在工序(a)和工序(b)之间设置工序(c)，除去通过工序(a)而变性的蛋白质。通过在回收核酸之前预先除去变性的蛋白质，能够提高回收的核酸的质量。工序(c)中的蛋白质的除去可以通过公知的方法进行。例如，通过离心分离使变性蛋白质沉淀并仅回收上清，能够除去变性蛋白质。另外，也可以添加氯仿，通过旋涡混合器等充分搅拌混合后进行离心分离，使变性蛋白质沉淀并仅回收上清。由此，与仅进行离心分离相比，能够更完全地除去变性蛋白质。

工序(b)中溶出的核酸的回收可以通过乙醇沉淀法或氯化铯超速离心法等公知的方法进行。作为回收方法的例子，可列举出以下的工序(b1)和工序(b2)。作为工序(b1)，使工序(a)中溶出的核酸吸附于无机支撑体上。然后，作为工序(b2)，使工序(b1)中吸附的核酸从无机支撑体上溶出。由此，能够回收核酸。工序(b1)中使用的无机支撑体可以使用能吸附核酸的公知的无机支撑体。另外，该无机支撑体的形状也没有特别限定，可以为颗粒状，也可以为膜状。作为该无机支撑体，例如有硅胶、硅基氧化物、玻璃、硅藻土等含二氧化硅的颗粒(珠子)，或尼龙、聚碳酸酯、聚丙烯酸酯、硝基纤维素等的多孔质膜等。

工序(b2)中使用的溶剂可考虑回收的核酸的种类与之后的核酸分析方法等而适当使用通常用于使核酸从这些公知的无机支撑体溶出的溶剂。例如，作为该溶出用溶剂，特别优选纯化水。另外，优选在工序(b1)之后、工序(b2)之前，使用适当的洗涤缓冲液对吸附有核酸的无机支撑体进行洗涤。

使用含有用于从哺乳动物细胞等中溶出核酸的充分浓度的离液序列高的盐或表面活性剂的除去用溶液S来调制粪便来源的固体成分时，工序(C)中从粪便来源的固体成分回收核酸时，也可以省略工序(a)。

可以向工序(B)中回收的粪便来源的固体成分中直接添加离液序列高的盐等蛋白质变性剂，但优选暂时悬浮到适当的溶出用药剂中后再添加蛋白质变性剂。回收DNA时，作为该溶出用药剂，例如可以使用磷酸缓冲液或tris缓冲液等。优选通过高压蒸汽灭菌等使DNase失活的药剂，进而更优选含有蛋白酶K等蛋白质水解酶的药剂。另一方面，回收RNA时，作为该溶出用药剂，例如可以使用柠檬酸缓冲液等。然而，由于RNA是非常容易分解的物质，因此优选使用含有硫氰酸胍或盐酸胍等RNase抑制剂的缓冲液。另外，也可以在工序(C)之前，预先用PBS(磷酸缓冲生理盐水、pH7.4)等适当的缓冲液对工序(B)中回收的粪便来源的固体成分进行洗涤。

根据之后的分析方法的不同，也可以不从粪便来源的固体成分中提取并纯化核酸，而仅在粪便来源的固体成分中添加并混合适当的溶出用药剂，从粪便来源的固体成分中溶出核酸，从而能够回收核酸。例如，粪便试样中存在大量病原菌等时，对这些病原菌来源的核酸进行分析时，从粪便试样中仅回收固形成分后，添加并混合含有蛋白酶K等蛋白水解酶的PBS等溶出用药剂。将由此得到的均匀的粪便试样溶液直接用于核酸分析，从而能够检测病原菌来源的基因等。此外，从粪便来源的固体成分中回收核酸也可以使用核酸提取试剂盒、病毒检测试剂盒等市售的试剂盒来进行。

本发明的核酸回收方法中，可以使将采集的粪便浸泡于以水溶性有机溶剂为有效成分的除去用溶液S中保存规定时间的工序分配到保存或运输时间中。因此，通过使用本发明的核酸回收方法从采集的粪便中回收核酸，从而像诊察等筛选检查那样，从粪便采集后到核酸分析时为止有一段间隔时，或者粪便采集场所与核酸分析场所分开时，也能够稳定地保持核酸。另外，与此同时，能够边使抑制物质A溶出边保存或运输粪便试样。此外，不需要非得设定用于冷藏或冷冻的特殊的机器或保存温度条件，而能够简便地使粪便试样中的抑制物质A溶出。

关于本发明的核酸回收方法中的工序(B)，例如，可通过使用含有溶液除去机构的处理装置从而简便并且迅速地进行，该溶液除去机构用于从粪便试样中除去作为液体成分的除去用溶液S。这种溶液除去机构只要是通常能够分离固体成分和液体成分的固液分离机构，则没有特别限定，优选为离心分离机构。另外，只要是具备用于抽吸除去由离心分离机构分离的上清的溶液抽吸排出机构和废液回收部的装置，则能够对多个粪便试样自动进行工序(B)。作为溶液抽吸排出机构，优选为从前端的喷嘴抽吸上清的溶液抽吸排出喷嘴。作为这种溶液抽吸排出喷嘴，可列举出如电动移液管等。

具有作为溶液抽吸排出机构的溶液抽吸排出喷嘴的装置，其进一步具备洗涤溶液抽吸排出喷嘴的机构时，从多个粪便试样中抽吸除去上清时，能够针对每个粪便试样洗涤溶液抽吸排出喷嘴，因而能够避免外部的杂菌等混入(污染)粪便试样中。另外，溶液抽吸排出喷嘴的前端部为能够装卸的尖部等时，例如，通过具有广泛使用的尖部安装和卸载装置，针对每个粪便试样能够自动地替换尖部等，从而即使在不具备溶液抽吸排出喷嘴洗涤机构的情况下，也能够避免对粪便试样的污染。

图1为表示本发明的核酸回收方法中用于自动进行工序(B)的粪便试样处理装置的一个实施方式的图。本实施方式的粪便试样处理装置101具有离心分离机构102、用于抽吸除去由离心分离机构102分离的上清的溶液抽吸排出喷嘴103、废液回收部104和溶液抽吸排出喷嘴洗涤机构105。首先，将采集的粪便浸泡于粪便采集容器内的除去用溶液S中并保存规定的时间。将粪便试样以粪便采集容器的盖打开的状态设置于该粪便试样处理装置101的离心分离机构102中。此时，可一次性设置多个粪便试样进行离心分离。然后，使溶液抽吸排出喷嘴103的前端与离心分离后的粪便试样的上清接触，从粪便采集容器中抽吸并除去上清。将由溶液抽吸排出喷嘴103抽吸的上清废弃于废液回收部104中，然后通过溶液抽吸排出喷嘴洗涤机构105洗涤溶液抽吸排出喷嘴中接触了上清的部位。洗涤后以同样的方式从另外的粪便试样中抽吸除去上清。像这样，通过使用具备图1所示机构的粪便试样处理装置，从同时经离心分离处理处理过的多个粪便试样中依次抽吸除去上清，能够自动进行工序(B)。

利用本发明的核酸回收方法能够有效地回收显著降低了胆汁酸等抑制物质A的残留的、高纯度的核酸。因此，可期待通过对使用本发明的核酸回收方法回收的核酸进行分析而得到可靠性高的分析结果。因此，利用本发明的核酸回收方法回收的核酸可供于各种各样的核酸分析。特别是，不仅非常适用于粪便中大量存在的常居肠细菌来源的核酸的分析，还非常适用于粪便中仅少量含有的常居肠细菌以外的生物来源的核酸的分析。

另外，本发明的核酸回收方法的工序(C)中，同时回收哺乳动物细胞等常居肠细菌以外的生物来源的核酸和常居肠细菌来源的核酸时，能够非常有效且高纯度地回收远比常居肠细菌来源的核酸微量的哺乳动物细胞来源的核酸。因此，通过使用这样回收的核酸进行核酸分析，能够高灵敏度且高精度地检测结肠癌等特定的疾病标记物。

作为这种常居肠细菌以外的生物来源的核酸，例如，有癌细胞来源的核酸等哺乳动物细胞来源的核酸、肝炎病毒等感染症的初期或后期的该感染症的致病菌来源的核酸等。此外，也可以是寄生虫来源的核酸。特别是，由于是从粪便中回收的核酸，因此利用本发明的核酸回收方法回收的核酸优选供于大肠、小肠、胃等消化道细胞来源的核酸的分析，但更优选供于从大肠脱落的细胞来源的核酸的分析。

另外，本发明中，常居肠细菌是粪便中比较大量存在的细菌细胞，意味着通常栖息在人等动物的肠内的常居菌。作为该常居肠细菌，例如有拟杆菌属(Bacteroides)、真杆菌属(Eubacterium)、双歧杆菌属(Bifidobacterium)、梭状芽胞杆菌属(Clostridium)等专性厌氧菌，埃希氏菌属(Escherichia)、肠杆菌属(Enterobacter)、克雷伯氏菌属(Klebsiella)、柠檬酸杆菌属(Citrobacter)、肠球菌属(Enterococcus)等兼性厌氧菌等。

另外，由本发明的核酸回收方法回收的核酸也适用于对早期发现和精确性的要求较强烈的、用于调查有无癌的发病或罹患感染症的核酸分析。另外，还优选供于用于调查有无结肠炎、肠炎、胃炎、胰腺炎等炎症性疾病的发病的核酸分析。此外，还可以供于息肉等***性病变的检查或胃溃疡等大肠、小肠、胃、肝脏、胆囊、胆管的疾病的检查。

例如，通过使用由本发明的核酸回收方法回收的核酸来检测并分析癌细胞来源的核酸、即发生突变等的核酸，能够检查有无结肠癌或胰腺癌等癌症的发病。另外，通过调查是否能检测到作为感染症等原因的病原菌来源的核酸、例如病毒来源的核酸或寄生虫来源的核酸等，能够调查有无感染症的罹患或有无寄生虫的存在。特别是，通过使用由本发明的核酸回收方法回收的核酸来检测甲型、戊型肝炎病毒等被排到粪便中的病原菌来源的核酸，能够非侵入性并且简便地进行感染症检查。此外，通过调查是否能检测到常居肠细菌以外的病原细菌、例如肠道出血性大肠杆菌O-157等引起食物中毒的菌或病原菌来源的核酸，能够调查有无细菌感染症的罹患。

特别优选通过核酸分析来检测指示致瘤性转化的标记物和指示炎症性消化器官疾病的标记物。作为该指示致瘤性转化的标记物，例如有癌胚抗原(CEA)、唾液酸Tn抗原(STN)等公知的癌标记物，或APC基因、p53基因、K-ras基因等中有无突变等。另外，p16、hMLHI、MGMT、p14、APC、E-钙黏蛋白、ESR1、SFRP2等基因的甲基化的检测作为大肠疾病的诊断标记物也是有用的(例如，参照Lind et al.、“A CpG island hypermethylation profile of primary colorectal carcinomas andcolon cancer cell lines”、Molecular Cancer、2004年、第3卷第28章)。此外，已经报道了粪便试样中的幽门螺旋杆菌来源的DNA被用作胃癌标记物(例如参照Nilsson et al.、Journal of ClinicalMicrobiology、2004年、第42卷第8号、第3781～8页)。另一方面，作为指示炎症性消化器官疾病的标记物，例如有Cox-2基因来源的核酸等。

本发明的从粪便试样中回收的核酸可以采用公知的核酸分析方法进行分析。作为该核酸分析方法，例如有使用PCR等来检测特定的碱基序列区域的方法和对核酸进行定量的方法等。例如，通过检测编码癌基因等的碱基序列区域、和含有小随体的碱基序列区域等有无基因突变，能够调查有无癌症的发病。使用从粪便试样中回收的DNA时，能够检测例如DNA上的甲基化、碱基的***、缺失、置换、重复、或倒置等突变。此外，回收RNA时，通过逆转录反应(RT：Reverse transcription)合成cDNA后，可将该cDNA与DNA同样地用于扩增分析中。使用回收的RNA时，能够检测例如RNA上的碱基的***、缺失、置换、重复、倒置、或剪接变体(isoforms)等突变。另外，还可以检测RNA表达量。特别优选进行mRNA的表达分析、K-ras基因的突变分析、以及DNA的甲基化分析等。另外，这些分析可以通过该领域中公知的方法进行。另外，也可以使用K-ras基因突变分析试剂盒、甲基化检测试剂盒等市售的分析试剂盒。

本发明通过将粪便采集到预先含有除去用溶液S的粪便采集容器中，能够更简便且迅速地调制采集的粪便。另外，通过使用本发明的具有除去用溶液S与含有除去用溶液S的粪便采集容器的粪便采集用试剂盒，能够更简便地进行本发明的核酸回收方法。另外，该粪便采集用试剂盒中还可以适当具有粪便采集棒等除除去用溶液S与含有其的粪便采集容器以外的组成物。

本发明中使用的粪便采集容器的形态和大小等没有特别限定，可以使用能够收纳溶剂的公知的粪便采集容器。为了处理简便，优选粪便采集容器的盖和粪便采集棒一体化的粪便采集容器。另外，为了能够控制粪便采集量，更优选粪便采集棒能够采集一定量的粪便的粪便采集容器。作为这种公知的粪便采集容器，例如有日本特公平6-72837号公报中公开的粪便采集容器等。

图2和图3是分别表示本发明的粪便采集用试剂盒中能够使用的粪便采集容器A和B的一个实施方式的图。另外，本发明的粪便采集用试剂盒中能够使用的粪便采集容器不限定于这些粪便采集容器。

首先对图2的粪便采集容器进行说明。本实施方式的粪便采集容器A具有与粪便采集棒3一体化的盖2和容器本体1，容器本体1的内部含有除去用溶液S。粪便采集棒3的前端有能够采集一定量粪便的杯3a，在该杯3a的底部布有网作为筛子。另一方面，容器本体1的底部有与杯3a的形状大致相同的、并与杯3a的形状重合的***部1a。通过将杯3a嵌合到***部1a中，使得杯3a中采集的粪便能够从杯3a的底部布的网中挤出，因此能够将粪便迅速地分散于除去用溶液S中。

图3所述的粪便采集容器具有与前端尖锐的粪便采集棒13一体化的盖12和容器本体11，是容器本体11内部具有含有除去用溶液S的密封袋15的粪便采集容器B。在粪便采集棒13的前端侧空出能够采集一定量粪便E的孔13a。另外，作为孔13a的盖的可动盖13b通过在粪便采集棒13上滑动而连接在粪便采集棒13的两侧部。以下对本粪便采集容器B的使用方法的一个实施方式进行说明。

首先，如图3的a所示，首先，将粪便采集棒13上的可动盖13b推离孔13a而靠近盖12侧，使孔13a处于完全开口的状态，将粪便采集棒13压入粪便E中。于是如图3的b所示，粪便E被填充至孔13a中。在该状态下，通过将可动盖13b滑动至粪便采集棒13的前端侧而盖住孔13a，从而将多余的粪便E分离，因此能够准确地采集孔13a的容积量的粪便E(图3的c)。然后，使可动盖13b回到原来的位置使孔13a处于完全开口的状态(图3的d)，然后将盖12收纳至容器本体11中(图3的e)。在粪便采集棒13被收纳至容器本体11中时，粪便采集棒13的尖锐的前端扎破含有除去用溶液S的袋15，从而容器本体11被除去用溶液S充满至含有粪便E的孔13a以上的水位，粪便E与除去用溶液S直接接触(图3的f)。此时，容器本体11被盖12密封，因此除去用溶液S不会漏出。然后，通过搬运等而移动容器本体11，从而将容器11内部的除去用溶液S与粪便E混合。这样的粪便采集容器B由于将粪便采集棒13***容器中之后溶液才开始填满容器中，因此即使使用像甲醇那样对人体有害的除去用溶液S时，也能够避免因溶液漏出而导致的事故，在家庭中也能够安全处理。

实施例

接着，示出实施例对本发明进一步详细地说明，但本发明不限定于以下的实施例。另外，没有特别记载时，“％”意味着“体积％”。此外，MKN45细胞和SW1116细胞使用由常规方法培养的细胞。

[实施例1]

测定存在于通过本发明的核酸回收方法从粪便中回收的RNA溶液中的胆汁酸量。

分别各取1g采自于1名健康人的粪便至7支15mL的聚丙烯管中。分取之后，在不添加乙醇的情况下迅速对其中1支迅速进行RNA提取操作。具体而言，添加并混合酚类混合物“Trizol”(Invitorogen公司制)，然后添加并混合氯仿，进行离心分离处理。通过该离心分离处理而分离上清(水层)。向该分离的上清中添加醋酸钠和乙醇并搅拌。然后，对该溶液进行离心分离处理，除去上清即乙醇，得到沉淀。将该沉淀在室温下风干并溶解于DEPC处理过的水中，得到100μL的RNA溶液(1A)。

分取之后，迅速对剩下的6支粪便添加10mL的99.5％乙醇溶液(除去用溶液S)，然后在20℃下静置12分钟(1B)、1小时(1C)、12小时(1D)、24小时(1E)、72小时(1F)、168小时(1G)而保存这些粪便试样。经过各保存时间后，立刻进行离心，除去上清即乙醇(除去用溶液S)，得到粪便来源的固体成分。然后，对得到的粪便来源的固体成分与(1A)同样地进行RNA提取操作，得到各100μL的RNA溶液。

向得到的各RNA溶液中添加十七烷酸(C17:0)和23去甲脱氧胆酸(23N-DCA)作为内标，用醚提取。接着，通过对胆汁酸的羧基丁基化而制得丁酯。另外，通过对胆汁酸的羟基乙酰化而制得醋酸酯，制得丁基·乙酰基衍生物。使用OV-1701(GLsci ence公司制)利用GCMS-QP5050***(岛津制作所制)对生成的丁基·乙酰基衍生物进行气相色谱分析，测定RNA溶液中残留的胆汁酸量。

图4为表示测定结果所得到的每100μL所提取的RNA溶液中的胆汁酸量的图。由这些结果可知，通过将粪便试样在除去用溶液S中浸泡(保存)1小时以上，能够充分除去作为抑制物质A的胆汁酸。进而，在1小时至24小时之间，能够急剧地除去胆汁酸。另外，粪便试样在除去用溶液S中的浸泡时间超过72小时的试样几乎看不到除去效率的变化。

[实施例2]

确认由胆汁酸导致的RT-PCR的反应抑制。具体而言，以从培养细胞MKN45细胞所回收的RNA作为模板，向扩增GAPDH(甘油醛-3-磷酸脱氢酶)mRNA的一步实时(One-Step real time)RT-P CR的反应液中添加胆汁酸的主要成分即脱氧胆酸钠的稀释系列，确认由脱氧胆酸钠导致的抑制条件。

边按照一步法Prime Script RT-PCR试剂盒(TaKaRa)的说明书边混合各试剂，向反应液中添加脱氧胆酸钠，使脱氧胆酸钠的最终浓度为0、1、2、4、10、15、20μg/25μL，进行42℃5分钟、95℃10秒钟的逆转录反应。然后，将由95℃5秒钟、60℃30秒钟构成的反应条件重复40个循环来进行PCR。此时，使用TaqMan基因表达分析(Gene Expression Assays)、库存(Inventoried)的GAPDH检测用TaqMan引物和探针。

通过ABI Prism 7700序列检测***(S equence Detection System)(Applied Biosystems公司制)分析调制的试剂，确认TaqMan PCR的扩增效率。由已知浓度的质粒DNA所示的CT值算出拷贝数，由由此得到的初期核酸量的推测值的降低程度进行抑制的评价。

图5为表示以脱氧胆酸钠浓度为横轴、GAPDH扩增量为纵轴的测定结果的图。由这些结果可确认到，当反应体系内含有的脱氧胆酸钠的浓度增加至4μg/25μL以上时，可确认到抑制物质A所导致的核酸扩增反应的抑制。

在此，以5μL在实施例1的条件下所得到的RNA为模板，使反应体系为25μL而进行RT-PCR。此时，使用保存时间为1小时的RNA(1C)时，反应液中的胆汁酸浓度约为3.75μg/25μL，使用保存时间为12小时的RNA(1D)时，反应液中的胆汁酸浓度约为1.6μg/25μL。即，弄清楚了，只要保存时间为1小时以上，即能有效地抑制回收核酸时从粪便带入的胆汁酸所导致的对核酸扩增反应的影响。此外，还考虑到，从粪便中回收的核酸的情况下其他杂质物也有影响，因此认为比保存12小时时的浓度(约1.6μg/25μL)还小的胆汁酸量也会产生抑制。因此可知，更优选保存12小时以上。

[实施例3]

分别各取1g采自于1名健康人的粪便至3支15mL的聚丙烯管中。分取之后，迅速对其中1支添加10mL的70％乙醇溶液(除去用溶液S)，然后在室温(20℃)下静置1分钟，作为粪便试样(3A)。分取后对另外1支添加10mL的70％乙醇溶液(除去用溶液S)使粪便充分分散，然后在室温下静置并保存18小时，作为粪便试样(3B)。分取后对剩下的1支添加10mL的70％乙醇溶液(除去用溶液S)使粪便充分分散，然后在室温下静置并保存36小时，将其作为粪便试样(3C)。经过各保存时间后，立即对各样品进行离心，除去上清即乙醇(除去用溶液S)，得到粪便来源的固体成分。

另外，随时从除去了乙醇的各粪便试样中回收RNA。具体而言，向各粪便来源的固体成分中添加并混合酚类混合物“Trizol”(Invitorogen公司制)，然后添加并混合氯仿，进行离心分离处理。通过该离心分离处理得到上清(水层)。向该上清中添加醋酸钠和乙醇，搅拌后进行离心分离处理。通过该离心分离处理得到沉淀，然后风干该沉淀物。将这些沉淀物溶解于DEP C处理过的水中，得到RNA溶液。

使用各RNA溶液中的一部分(5μL)，采用作为逆转录反应用试剂盒的ReverTra Ace qP CR RT Kit来合成cDNA。以该cDNA为模板，向其中添加12.5μL的2×TaqMan PCR master mix(Perkin-Elmer Applied Biosystems公司制)，并分别添加人GAPDH用正向引物(序列号1：5′-GAAGGTGAAGGTCGGAGTC-3′)和人GAPDH用反向引物(序列号2：5′-GAAGATGGTGATGGGATTTC-3′)使反应液中最终浓度为900nmol，最终体积为25μL，调制PCR溶液。利用ABI Prism 7700(Perkin-Elmer Applied Biosystems公司制)对该PCR溶液进行使用了SYBR green的PCR分析。PCR的热循环于95℃10分钟的变性循环之后，在将95℃30秒钟、55℃30秒钟、72℃30秒钟重复45个循环的条件下进行。定量基于以利用浓度已知的标准质粒的稀释系列作为模板而得到的荧光强度的结果来进行。

将样品(3A)来源的RNA用于模板时，与样品(3B)相比，可见到约80％以上的扩增效率的降低。另外，样品(3B)和样品(3C)的差约为10％左右，没有看到样品(1A)和样品(1B)那种程度的差。

即，由这些结果可知，使用向粪便中添加除去用溶液S、浸泡并保存一定时间的本发明的核酸回收方法而得到的核酸，核酸的扩增效率很好。这是由于通过本发明的核酸回收方法，可以降低回收的核酸中的粪便来源的抑制物质A的量。另外，本实施例中，虽然没有确认由除去用溶液S溶出除去的物质是什么，但由于回收的核酸的扩增效率良好，因此推测粪便中所含的胆汁酸以外的抑制物质A也被溶出除去。

[实施例4]

分别各取1g采自于1名健康人的粪便至3支15mL的聚丙烯管中。分取之后，迅速对其中1支添加10mL的70％乙醇溶液，然后在4℃下静置1分钟，作为粪便试样(4A)。分取后对另外1支添加10mL的70％乙醇溶液(除去用溶液S)使粪便充分分散，然后在4℃下静置并保存12小时，作为粪便试样(4B)。分取后对剩下的1支添加10mL的70％乙醇溶液(除去用溶液S)使粪便充分分散，然后在4℃下静置并保存72小时，将其作为粪便试样(4C)。经过各个时间后，随时通过离心分离除去乙醇，接着用7mL的PBS洗涤，然后通过离心除去上清即PBS。

与实施例3同样地提取RNA进行逆转录反应。接着，通过利用细菌的16S rRNA基因用正向引物(序列号3：5′-AGGAGGTGATCCAACCGCA-3′)和细菌的16S rRNA基因用反向引物(序列号4：5′-AACTGGAGGAAGGTGGGGAT-3′)的实时PCR检测大肠杆菌的基因。将样品(4A)来源的RNA用于模板时，与样品(4B)相比，可见到约70％以上的扩增效率的降低。另外，样品(4B)和样品(4C)的差约为30％左右。

即，由这些结果可知，即使保存时的温度为4℃时，使用本发明的核酸回收方法所得到的核酸，核酸的扩增效率也很好，即，推测以胆汁酸盐为代表的抑制物质A从回收的核酸中被除去。

[实施例5]

代替实施例1中使用的乙醇，制作添加了55％甲醇、5％异丙醇的醇溶液。将该醇溶液用作除去用溶液S，准备醇溶液浸泡粪便样品，与实施例1同样地制作改变了浸泡(保存)时间的样品。即，分取之后，迅速对其中1支添加10mL的醇溶液使粪便充分分散，然后在室温(20℃)下静置1分钟，作为粪便试样(5A)。分取后对另外1支添加10mL的醇溶液使粪便充分分散，然后在室温下静置并保存12小时，作为粪便试样(5B)。分取后对剩下的1支添加10mL的醇溶液使粪便充分分散，然后在室温下静置并保存36小时，将其作为粪便试样(5C)。随时通过离心分离从这些样品中除去醇溶液，得到粪便来源的固体成分。接着，用7mL的99.5％乙醇洗涤粪便来源的固体成分，通过离心除去上清即99.5％乙醇，对粪便来源的固体成分进行风干。接着，用“Trizol”和氯仿提取RNA。对得到的水层添加乙醇，用旋涡混合器很好地搅拌，然后向RNeasy midi kit(Qiagen公司制)的RNA回收用柱(硅胶柱)中添加该水层与乙醇的混合液并离心，依照所附的操作规程，对该RNA回收用柱进行洗涤操作和RNA溶出操作，从而回收RNA。

使用所回收的各RNA溶液中的一部分，与实施例3同样地进行使用了SYBR green的PCR分析。其结果，将样品(5A)来源的RNA用于模板时，与样品(5B)相比，可见到约40％的扩增效率的降低。另外，样品(5B)和样品(5C)的差约为20％左右，为样品(5A)和样品(5B)的差的约一半。

即，由这些结果可知，即使使用乙醇以外的醇作为除去用溶液S时，也能够提取除去胆汁酸盐等抑制物质A并回收高纯度的核酸。另外，暂时用有机溶剂提取RNA后，进一步用硅胶柱进行纯化，从而除去糖类和核酸分解物等物质。由此，粪便中的核酸的扩增效率上升。

[实施例6]

向4g健康人的粪便中混合5.0×10⁵个K-ras基因密码子12突变为GCT的人结肠癌来源的培养细胞SW1116细胞，将该混合而成的物质作为结肠癌患者疑似粪便。分别各取0.5g该粪便至6支15mL的聚丙烯管中。分取之后，迅速对其中2支添加10mL的改性乙醇(55％乙醇和5％异丙醇的醇溶液)使粪便充分分散，然后在室温(20℃)下静置1分钟，作为粪便试样(6A)。分取后迅速对另外的2支添加10mL的改性乙醇(除去用溶液S)使粪便充分分散，然后在室温下静置并保存12小时，作为粪便试样(6B)。分取后迅速对剩下的2支添加10mL的改性乙醇(除去用溶液S)使粪便充分分散，然后在室温下静置并保存36小时，将其作为粪便试样(6C)。

(6A)、(6B)、(6C)的各样品经过各保存时间后，随时通过离心分离除去改性乙醇，得到粪便来源的固体成分。接着，用7mL的99.5％乙醇洗涤粪便来源的固体成分，通过离心除去上清即99.5％乙醇，将该固体成分风干。

另外，随时从除去了乙醇的各粪便来源的固体成分中回收DNA溶液。即，使用粪便来源DNA提取试剂盒“QIAamp DNA Stool Mini Kit”(Qiagen公司制)从各粪便来源的固体成分中回收DNA。用吸光度法对回收的DNA的浓度进行定量，结果，能够从各粪便来源的固体成分中回收几乎同等量的DNA。

使用回收的DNA，用等位基因特异性PCR(allele specific-PCR)法检测K-ras密码子12的GCT突变序列。即，以使正义链侧的引物的3′末端与GCT突变序列相匹配的方式进行设计，从而扩增GCT突变型等位基因。另外，反义链侧的引物来源于内含子部分的碱基序列。平均每一个反应使用各50pmol的与K-ras密码子12GCT突变型密码子相对应的正向引物(序列号5：5′-ACTTGTGGTAGTTGGAGCTGC-3′)和反向引物(序列号6：5′-CTCATGAAAATGGTCAGAGAAACC-3′)、1.25U的TaKaRa Ex Taq(TaKaRa公司制)、1×Ex Taq Buffer、200μM dNTP Mixture、和10ng的模板核酸来进行PCR。温度条件为94℃1分钟、55℃1分钟、72℃1分钟，进行35个循环。

PCR反应后，通过以3％NuSieve(FMC公司制)制作的琼脂糖凝胶电泳确认扩增产物，结果确认到179bp的扩增产物。其结果，将样品(6A)来源的DNA用于模板时，2个样品其中的一个看不到扩增。此外，另外一个的条带也比样品(6B)来源的DNA淡很多，可见到扩增效率的降低。另外，2个样品(6B)来源的DNA和2个样品(6C)来源的DNA都很好地扩增，基本见不到条带浓度的差异。

由以上的结果可推测，保存时间方面，时间越长核酸的扩增效率越好，即，抑制核酸扩增的胆汁酸盐等的除去效率越好。

可知，通过使用由本发明的核酸回收方法所回收的DNA，从而即使是基因突变等要求较高精确性的核酸分析，也能够高精度地进行核酸分析。另外，本实施例中使用混合了异丙醇和乙醇的改性乙醇作为除去用溶液S，但能够得到与使用相同醇浓度的50％的乙醇溶液时同等的结果。

[实施例7]

使用如图2所示的粪便采集容器A调制粪便试样并回收核酸。该粪便采集容器A具有与粪便采集棒3一体化的盖2和容器本体1，为内部含有5mL的作为除去用溶液S的59％乙醇溶液的粪便采集容器A。另外，粪便采集棒3的前端具备具有4个直径为3mm的孔的0.5mL容量的杯3a。

首先，使用粪便采集棒3采集约0.5g粪便至杯3a中，并将其***该粪便采集容器A中盖上盖2。于是，容器本体1的底部的***部1a从杯3a的孔中挤出粪便，丝状的粪便分散于溶液中。将这样调制的粪便试样作为粪便试样(7A)。

另一方面，与粪便试样(7A)同样地采集约0.5g粪便至含有5mL的59％乙醇溶液的15mL聚丙烯管中，使粪便与除去用溶液S的体积比为1∶10，将其作为对照试样(7B)。

将粪便试样(7A)和对照试样(7B)在30℃下保存2天，然后与实施例2同样地回收RNA。此时，从粪便试样(7A)除去的乙醇，与从对照试样(7B)除去的乙醇相比，显示更深的茶褐色。另外，与实施例3同样地回收RNA、合成cDNA后，进行人GAPDH基因的定量PCR。将样品(7B)来源的RNA用于模板时，与样品(7A)来源的RNA相比可见到约40％的扩增效率的降低。

其结果可推测，由于使用如图2所示的粪便采集容器A，从而可迅速地将粪便分散于除去用溶液S中，能够更高纯度地回收核酸。另外，通过使用这种粪便采集容器A，从而粪便采集者在采集粪便后能够简便且迅速地进行粪便试样的调制和保存，因此能够减少检查工序操作者的人事费的一部分。

[实施例8]

使用如图3所示的粪便采集容器B调制粪便试样并回收核酸。该粪便采集容器的粪便采集棒13前端尖锐，具有2.5mL容量的孔13a。另外，粪便采集容器B具有与粪便采集棒13一体化的盖12和容器本体11，在容器本体11内部具有含有作为除去用溶液S的59％甲醇溶液的密封袋15。

首先，使用袋15内含有5mL的59％甲醇溶液的粪便采集容器B，按照图3的顺序采集约0.1g的粪便，使袋15内的5mL的59％甲醇溶液与粪便混合而调制粪便试样(8A)。将该粪便试样(8A)在18℃下静置并保存36小时，然后与实施例5同样地回收RNA，进行使用了SYBR green的PCR分析，结果确认到扩增效率良好。

由该结果也清楚了，通过使用如图3所示的粪便采集容器B进行本发明的核酸回收方法，能够高纯度地回收核酸，因此可谋求粪便采集用试剂盒的轻量化、小型化和确保安全性。

[实施例9]

使用如图1所示的粪便试样处理装置自动进行本发明的核酸回收方法中的工序(B)，从粪便试样中回收核酸。

首先，与实施例7同样地，调制2管在图2所示的粪便采集容器A内混合了粪便与59％乙醇溶液(除去用溶液S)的粪便试样。将该2管粪便试样在室温下保存12小时后，打开粪便采集容器的盖部分，固定于粪便试样处理装置中的离心分离机构内。固定的粪便试样通过离心分离工序分离成上清部分即乙醇溶液(除去用溶液S)和粪便来源的固体成分。用溶液抽吸排出喷嘴抽吸1管粪便试样的上清部分并废弃至废液回收部中。废弃后，用洗涤层洗涤喷嘴，对剩余的粪便试样同样地进行上清的除去。

除去上清后，可与实施例5同样地从得到的粪便固体成分中回收RNA。

[实施例10]

分别各取1g采自于1名健康人的粪便至8支15mL的聚丙烯管中。分取之后，迅速添加6mL的70％乙醇溶液(除去用溶液S)充分地分散粪便并调制粪便试样，然后在-4℃(10A)、0℃(10B)、4℃(10C)、8℃(10D)、12℃(10E)、16℃(10F)、20℃(10G)、24℃(10H)各条件下将调制的粪便试样静置并保存24小时。

各样品经过各保存时间后，离心并除去上清即乙醇溶液，得到粪便来源的固体成分。

接着，与实施例1同样地从得到的粪便来源的固体成分中回收RNA。使用所回收的各RNA溶液中的一部分，与实施例3同样地进行使用了SYBR green的PCR分析。

将与SYBR green反应后的各粪便试样(样品)的分析结果示于表1。分别将样品(10A)和(10B)来源的RNA用于模板时，没有确认到扩增。另一方面，分别将样品(10C)～样品(10F)来源的RNA用于模板时，确认到扩增。另外，样品(10G)和样品(10H)来源的RNA的情况下，可见到样品(10C)～样品(10F)来源的RNA的数倍左右的扩增。

即，保存温度为4℃以上时，抑制物质A的除去效率很好，20℃以上时能够更好地除去抑制物质并且核酸扩增效率上升。

[表1]

粪便试样

10A

10B

10C

10D

10E

10F

10G

10H

保存温度

-4℃

0℃

4℃

8℃

12℃

16℃

20℃

24℃

核酸扩增量

-

-

+

+

+

+

++

++

[实施例11]

分别各取1g采自于1名健康人的粪便至9支15mL的聚丙烯管中。分取之后，迅速添加6mL的70％乙醇溶液(除去用溶液S)使粪便充分分散而调制粪便试样，然后在保存时间为1分钟(11A)、10分钟(11B)、1小时(11C)、12小时(11D)、24小时(11E)、36小时(11F)、48小时(11G)、72小时(11H)、168小时(11I)的各条件下静置并保存。另外，保存温度为一定温度20℃。

各样品经过各保存时间后，与实施例10同样地回收RNA，然后用定量PCR进行分析。将分析结果示于表2。

分别将样品(11A)和(11B)来源的RNA用于模板时，没有确认到扩增，但将样品(11C)来源的RNA用于模板时，确认到扩增。另外，在样品(11D)来源的RNA的情况下，可见到样品(11C)来源的RNA的数倍左右的扩增。在样品(11E)、(11F)、(11G)来源的RNA的情况下，可见到样品(11C)来源的RNA的3倍左右的扩增，样品(11H)和(11I)来源的RNA可见到样品(11D)来源的RNA的1.5倍左右的扩增。

即，保存时间为1小时以上时，抑制物质A的除去效率很好，24小时以上时能够更好地除去抑制物质，72小时以上时能够进一步除去，168小时时也没有见到核酸扩增效率的下降。

[表2]

粪便试样

11A

11B

11C

11D

11E

11F

11G

11H

11I

保存时间

1分钟

10分钟

1小时

12小时

24小时

36小时

48小时

72小时

168小时

核酸扩增量

-

-

+

++

+++

+++

+++

++++

++++

[参考例1]

分别各取1g采自于1名健康人的粪便至3支15mL的聚丙烯管中。分取之后，迅速使用液态氮对其中的1支进行冷冻处理，作为粪便试样(1)。分取后，对另外1支添加10mL的70％乙醇溶液使粪便充分分散，然后在室温下静置1小时，作为粪便试样(2)。分取后，将剩下的1支在不添加溶液等的条件下转移到提取工序中，将其作为粪便试样(3)。

然后，从各粪便试样中回收RNA。具体而言，向各粪便试样中添加3mL的酚类混合物“Trizol”(Invitorogen公司制)，用均化器充分混合30秒以上。然后添加3mL氯仿，使用旋涡混合器充分混合，然后以12,000×g、在4℃下进行20分钟离心分离处理。将通过该离心分离处理而得到的上清(水层)通入RNeasy midi kit(Qiagen公司制)的RNA回收用柱中，依照所附的操作规程，对该RNA回收用柱进行洗涤操作和RNA溶出操作，从而回收RNA。使用NanoDrop(NanoDrop公司制)对回收的RNA进行定量。

从使用作为本发明的除去用溶液S的乙醇溶液调制的粪便试样(2)中回收的RNA量稍微少于从采集之后迅速进行了冷冻处理的粪便试样(1)中回收的RNA量，但与采集之后迅速进行了核酸提取的粪便试样(3)相比，能够回收非常多的RNA。由这些结果可知，通过使用本发明的除去用溶液S进行调制，即使为在室温下的调制，也可获得能够非常有效地回收核酸的粪便试样。在诊察等这样的情况下，患者在自己家进行粪便采集时，期望在室温附近进行粪便试样的调制，而本发明的除去用溶液S能够充分满足这样的要求。

[参考例2]

各自分取1g采自于1名健康人的粪便至2支15mL的聚丙烯管中。分取后，对其中1支添加10mL的70％乙醇溶液使粪便充分分散，然后在室温下静置1小时，作为粪便试样(4)。然后除去粪便试样(4)中的乙醇，接着进行提取操作。分取粪便试样后，将剩下的1支悬浮于10mL的磷酸缓冲液(pH7.0)中，通过轻微离心而回收上清，除去比细胞还大的残渣。回收的上清以3000rpm离心15分钟，回收作为沉淀的细胞。向沉淀中添加9mL的70％乙醇，混和后以3000rpm离心10分钟，将沉淀物作为粪便试样(5)，接着进行提取操作。具体而言，向各粪便试样中添加3mL的酚类混合物“Trizol”(Invitorogen公司制)，用均化器充分混合30秒以上。然后，添加3mL氯仿，使用旋涡混合器充分混合，然后以12,000×g、在4℃下进行20分钟离心分离处理。将由该离心分离处理而得到的上清(水层)通入RNeasy midi kit(Qiagen公司制)的RNA回收用柱，依照所附的操作规程，对该RNA回收用柱进行洗涤操作和RNA溶出操作，从而回收RNA。使用NanoDrop(NanoDrop公司制)对回收的RNA进行定量。

使用各RNA溶液的一部分(5μL)，使用作为逆转录反应用试剂盒的ReverTra Ace qPCR RT Kit来合成cDNA。以该cDNA为模板，向其中添加12.5μL的2×TaqMan PCR master mix(Perkin-Elmer Applied Biosystems公司制)，并分别添加人GAPDH用正向引物(序列号1：5′-GAAGGTGAAGGTCGGAGTC-3′)和人GAPDH用反向引物(序列号2：5′-GAAGATGGTGATGGGATTTC-3′)使反应液中最终浓度为900nmol，最终体积为25μL，调制PCR溶液。利用ABI Prism 7700(Perkin-Elmer Applied Biosystems公司制)使用SYBR green对该PCR溶液进行PCR分析。PCR的热循环于95℃10分钟的变性循环之后，在将95℃30秒钟、55℃30秒钟、72℃30秒钟重复45个循环的条件下进行。定量基于以利用浓度已知的标准质粒的稀释系列作为模板而得到的荧光强度的结果来进行。

将样品(5)来源的RNA用于模板时，与样品(4)相比，可见到约50％以上的扩增效率的降低。

即，由这些结果可知，使用不将采集的粪便制成悬浮液而是立即浸泡于除去用溶液S中并保存一定时间的本发明的核酸回收方法而得到的核酸，与使用暂时将粪便制成悬浮液的核酸回收方法而得到的核酸相比，抑制物质A从回收的核酸中被除去，并且，回收损失较少，核酸的扩增效率很好。

另外，上述实施例和参考例中的核酸扩增反应利用使用DNA聚合酶的PCR法，但也可以包括组合了使用RNA聚合酶的逆转录反应的核酸扩增法即RT-PCR法、NASBA法、和TRC法等。

产业上的可利用性

利用本发明的核酸回收方法能够有效地除去粪便中所含的核酸扩增反应抑制物质，从粪便试样中有效地回收高纯度的核酸，因此特别能够利用于使用粪便试样的定期体检等临床检查等领域中。

Claims (39)

1.一种从粪便试样中回收核酸的方法，其特征在于，其为从粪便中高纯度地回收核酸的方法，具有以下工序：

(A)将采集的粪便添加到以水溶性有机溶剂为有效成分的核酸扩增反应抑制物质除去用溶液中而调制粪便试样，并将上述粪便试样保存规定的时间，从而使核酸扩增反应抑制物质溶出的工序；

(B)在工序(A)之后，从粪便试样中除去核酸扩增反应抑制物质除去用溶液并回收粪便来源的固体成分的工序；和

(C)从在工序(B)中回收的粪便来源的固体成分中回收核酸的工序。

2.根据权利要求1所述的从粪便试样中回收核酸的方法，其中，不将采集的粪便制成悬浮液，而是将采集的粪便立即添加到核酸扩增反应抑制物质除去用溶液中，调制粪便试样。

3.根据权利要求1或权利要求2所述的从粪便试样中回收核酸的方法，其中，上述水溶性有机溶剂为水溶性醇和/或酮类。

4.根据权利要求1～3中任一项所述的从粪便试样中回收核酸的方法，其中，上述水溶性有机溶剂的浓度为30％以上。

5.根据权利要求3或4所述的从粪便试样中回收核酸的方法，其中，上述水溶性有机溶剂含有选自由乙醇、丙醇、和甲醇组成的组中的1种以上作为水溶性醇。

6.根据权利要求1所述的从粪便试样中回收核酸的方法，其中，上述水溶性有机溶剂为乙醇。

7.根据权利要求3或4所述的从粪便试样中回收核酸的方法，其中，上述水溶性有机溶剂含有丙酮和/或甲乙酮作为酮类。

8.根据权利要求1～7中任一项所述的从粪便试样中回收核酸的方法，其中，关于上述粪便与上述核酸扩增反应抑制物质除去用溶液的混合比率，相对于粪便体积1，核酸扩增反应抑制物质除去用溶液体积为1以上。

9.根据权利要求1～8中任一项所述的从粪便试样中回收核酸的方法，其中，上述工序(B)中的从粪便试样中除去核酸扩增反应抑制物质除去用溶液是通过离心分离法来进行的。

10.根据权利要求1～9中任一项所述的从粪便试样中回收核酸的方法，其中，上述工序(A)中，保存粪便试样的时间为1小时以上。

11.根据权利要求1～9中任一项所述的从粪便试样中回收核酸的方法，其中，上述工序(A)中，保存粪便试样的时间为12小时以上。

12.根据权利要求1～9中任一项所述的从粪便试样中回收核酸的方法，其中，上述工序(A)中，保存粪便试样的时间为24小时以上。

13.根据权利要求1～9中任一项所述的从粪便试样中回收核酸的方法，其中，上述工序(A)中，保存粪便试样的时间为72小时以上。

14.根据权利要求1～13中任一项所述的从粪便试样中回收核酸的方法，其中，上述工序(A)中，保存粪便试样的温度为4℃以上。

15.根据权利要求1～13中任一项所述的从粪便试样中回收核酸的方法，其中，上述工序(A)中，保存粪便试样的温度为20℃以上。

16.根据权利要求1～15中任一项所述的从粪便试样中回收核酸的方法，其中，上述核酸扩增反应抑制物质除去用溶液含有表面活性剂。

17.根据权利要求1～16中任一项所述的从粪便试样中回收核酸的方法，其中，上述核酸扩增反应抑制物质除去用溶液含有着色剂。

18.根据权利要求1～17中任一项所述的从粪便试样中回收核酸的方法，其中，上述工序(C)为如下工序：从在工序(B)中回收的粪便来源的固体成分中同时回收常居肠细菌来源的核酸和常居肠细菌以外的生物来源的核酸。

19.根据权利要求18所述的从粪便试样中回收核酸的方法，其中，上述常居肠细菌以外的生物为哺乳动物细胞。

20.根据权利要求1～19中任一项所述的从粪便试样中回收核酸的方法，其中，上述工序(C)具有以下工序：

(a)使工序(B)中回收的粪便来源的固体成分中的蛋白质变性，并使核酸从上述粪便来源的固体成分中的常居肠细菌和常居肠细菌以外的生物中溶出的工序；和

(b)回收上述工序(a)中溶出的核酸的工序。

21.根据权利要求20所述的从粪便试样中回收核酸的方法，其中，在上述工序(a)之后、上述工序(b)之前具有(c)除去通过上述工序(a)而变性的蛋白质的工序。

22.根据权利要求20或21所述的从粪便试样中回收核酸的方法，其中，上述工序(a)中蛋白质的变性是使用选自由离液序列高的盐、有机溶剂和表面活性剂组成的组中的1种以上来进行的。

23.根据权利要求22所述的从粪便试样中回收核酸的方法，其中，上述有机溶剂为酚类。

24.根据权利要求21～23中任一项所述的从粪便试样中回收核酸的方法，其中，上述工序(c)中的变性的蛋白质的除去是使用氯仿来进行的。

25.根据权利要求20～24中任一项所述的从粪便试样中回收核酸的方法，其特征在于，上述工序(b)中的核酸的回收具有以下工序：

(b1)使上述工序(a)中溶出的核酸吸附于无机支撑体的工序；和

(b2)使上述工序(b1)中吸附的核酸从无机支撑体溶出的工序。

26.一种核酸，其为通过权利要求1～25中任一项所述的从粪便试样中回收核酸的方法而回收的核酸。

27.一种核酸分析方法，其使用回收的核酸对哺乳动物细胞来源的核酸进行分析，该回收的核酸为利用权利要求1～26中任一项所述的核酸回收方法从粪便试样中回收的核酸。

28.根据权利要求27所述的核酸分析方法，其中，上述哺乳动物细胞为消化道细胞。

29.根据权利要求27所述的核酸分析方法，其中，上述哺乳动物细胞为从大肠脱落的细胞。

30.根据权利要求27～29中任一项所述的核酸分析方法，其中，上述哺乳动物细胞来源的核酸为指示致瘤性转化的标记物。

31.根据权利要求27～29中任一项所述的核酸分析方法，其中，上述哺乳动物细胞来源的核酸为指示炎症性消化器官疾病的标记物。

32.根据权利要求27～31中任一项所述的核酸分析方法，其中，上述分析为选自由mRNA的表达分析、K-ras基因的突变分析、以及DNA的甲基化分析组成的组中的1种以上。

33.一种粪便试样处理装置，其包括溶液除去机构，该溶液除去机构用于从粪便试样中除去下述核酸扩增反应抑制物质除去用溶液，该粪便试样是将采集的粪便浸泡于以水溶性有机溶剂为有效成分的核酸扩增反应抑制物质除去用溶液中保存规定的时间后的粪便试样。

34.根据权利要求33所述的粪便试样处理装置，其中，上述溶液除去机构具有离心分离机构、溶液抽吸排出机构和废液回收部。

35.根据权利要求34所述的粪便试样处理装置，其中，上述溶液抽吸排出机构为溶液抽吸排出喷嘴，该粪便试样处理装置还具有洗涤上述溶液抽吸排出喷嘴的机构。

36.一种核酸扩增反应抑制物质除去用溶液，其为用于调制核酸回收用粪便试样的溶液，以水溶性有机溶剂为有效成分，用以降低回收的核酸中的核酸扩增反应抑制物质。

37.根据权利要求36所述的核酸扩增反应抑制物质除去用溶液，其中，上述水溶性有机溶剂为水溶性醇和/或酮类。

38.根据权利要求37所述的核酸扩增反应抑制物质除去用溶液，其中，上述水溶性有机溶剂的浓度为30％以上。

39.一种粪便采集用试剂盒，其具有权利要求36～38中任一项所述的核酸扩增反应抑制物质除去用溶液、和含有该核酸扩增反应抑制物质除去用溶液的粪便采集容器。

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