ES2878451T3 - Polinucleótidos moduladores - Google Patents

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Mathieu E Nonnenmacher
Pengcheng Zhou
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Abstract

Polinucleótido modulador, que comprende (a) un tallo y bucle para formar una estructura de tallo-bucle, comprendiendo la secuencia de dicha estructura de tallo-bucle desde 5' hasta 3': (i) un motivo UG en o cerca de la base del tallo en 5' de la estructura de tallo-bucle; (ii) una rama de tallo en 5' que comprende una hebra pasajera y una región espaciadora en 5' opcional, en el que dicha región espaciadora en 5', cuando está presente, está ubicada en 5' con respecto a dicha hebra pasajera; (iii) una región de bucle; (iv) una rama de tallo en 3' que comprende una hebra guía y opcionalmente una región espaciadora en 3', en el que opcionalmente está presente una uridina en el extremo 5' de la hebra guía y en el que dicha región espaciadora en 3', cuando está presente, tiene una longitud suficiente para formar un giro de hélice; (b) una primera región flanqueante ubicada en 5' con respecto a dicha estructura de tallo-bucle; y (c) una segunda región flanqueante ubicada en 3' con respecto a dicha estructura de tallo-bucle, comprendiendo opcionalmente dicha segunda región un motivo CNNC, y en el que dicha segunda región flanqueante es una región flanqueante en 3' y comprende SEQ ID NO: 11.

Description

DESCRIPCIÓN
Polinucleótidos moduladores
Campo de la invención
La divulgación se refiere a composiciones, a métodos, a procedimientos, a kits y a dispositivos para el diseño, la preparación, fabricación y/o formulación de polinucleótidos moduladores. En algunas realizaciones, tales polinucleótidos moduladores pueden estar codificados por o dentro de virus adenoasociados (AAV) recombinantes y pueden comprender microARN artificiales, pre-microARN artificiales y/o pri-microARN artificiales.
Antecedentes de la invención
Los microARN (o miARN o miR) son moléculas de ácido ribonucleico (ARN) pequeñas, no codificantes y monocatenarias que habitualmente tienen 19-25 nucleótidos de longitud. Se han identificado más de mil microARN en genomas de mamífero. Los microARN maduros se unen principalmente a la región no traducida en 3' (3'-UTR) de ARN mensajeros (ARNm) diana a través de apareamiento parcial o total con las secuencias complementarias de los ARNm diana, lo que fomenta la degradación de los ARNm diana a nivel postranscripcional y, en algunos casos, la inhibición del inicio de la traducción. Los microARN desempeñan un papel crítico en muchos procesos biológicos clave, tales como la regulación del crecimiento y del ciclo celular, la apoptosis, la proliferación celular y la formación de tejido. Los genes de miARN se transcriben generalmente como transcritos primarios largos de miARN (es decir, pri-miARN). El pri-miARN se escinde para dar un precursor de un miARN (es decir, pre-miARN) que se procesa adicionalmente para generar el miARN maduro y funcional.
Aunque muchas estrategias de expresión de la diana emplean modalidades basadas en ácidos nucleicos, sigue existiendo la necesidad de modalidades de ácidos nucleicos mejoradas que tengan una mayor especificidad y menos efectos inespecíficos.
La presente invención proporciona tales modalidades mejoradas en forma de constructos artificiales de pri-microARN, pre-microARN y microARN maduro tal como se define por las reivindicaciones. Estos nuevos constructos pueden ser moléculas independientes sintéticas o estar codificados en un plásmido o vector de expresión para su administración a las células. Tales vectores incluyen, pero no se limitan a, vectores de virus adenoasociado tales como genoma de vectores de cualquiera de los serotipos de AAV u otros vehículos de administración viral tales como lentivirus, etc.
Sumario de la invención
La presente invención proporciona lo siguiente:
Un polinucleótido modulador, que comprende
(a) un tallo y bucle para formar una estructura de tallo-bucle, comprendiendo la secuencia de dicha estructura de tallo-bucle desde 5' hasta 3':
(i) un motivo UG en o cerca de la base del tallo en 5' de la estructura de tallo-bucle;
(ii) una rama de tallo en 5' que comprende una hebra pasajera y una región espaciadora en 5' opcional, en el que dicha región espaciadora en 5', cuando está presente, está ubicada en 5' con respecto a dicha hebra pasajera;
(iii) una región de bucle;
(iv) una rama de tallo en 3' que comprende una hebra guía y opcionalmente una región espaciadora en 3', en el que opcionalmente está presente una uridina en el extremo 5' de la hebra guía y en el que dicha región espaciadora en 3', cuando está presente, tiene una longitud suficiente para formar un giro de hélice;
(b) una primera región flanqueante ubicada en 5' con respecto a dicha estructura de tallo-bucle; y
(c) una segunda región flanqueante ubicada en 3' con respecto a dicha estructura de tallo-bucle, comprendiendo opcionalmente dicha segunda región un motivo CNNC, y en el que dicha segunda región flanqueante es una región flanqueante en 3' y comprende SEQ ID NO: 11.
Además, la invención proporciona un microARN artificial que comprende un polinucleótido modulador de este tipo, un vector que codifica para tal polinucleótido modulador o microARN artificial. El vector puede comprender un constructo de virus adenoasociado (AAV) recombinante y, por tanto, la invención también proporciona un virus AAV recombinante que comprende un constructo de AAV de este tipo.
Las “realizaciones” descritas en la descripción no son necesariamente realizaciones de la invención.
Los detalles de las diversas realizaciones de la invención se exponen en la descripción a continuación.
Breve descripción de los dibujos
Los objetos, las características y las ventajas anteriores y otros resultarán evidentes a partir de la siguiente descripción de realizaciones particulares de la invención, tal como se ilustran en los dibujos adjuntos en los que caracteres de referencia similares se refieren a las mismas partes en las diferentes vistas. Los dibujos no están necesariamente a escala, sino que se hace hincapié en ilustrar los principios de las diversas realizaciones de la invención.
La figura 1 es un esquema de un pri-microARN artificial codificado en un vector de AAV.
La figura 2 es un histograma que muestra la actividad de los constructos de pri-ARNm codificados en vectores de AAV.
La figura 3 es un histograma que muestra la actividad en células HEK293T de la hebra guía de los polinucleótidos moduladores codificados en vectores de AAV.
La figura 4 es un histograma que muestra la actividad en células HEK293T de la hebra pasajera de los polinucleótidos moduladores codificados en vectores de AAV.
La figura 5 es un histograma que muestra la actividad en células HeLa de la hebra guía de los polinucleótidos moduladores codificados en vectores de AAV.
La figura 6 es un histograma que muestra la actividad en células HeLa de la hebra pasajera de los polinucleótidos moduladores codificados en vectores de AAV.
La figura 7 es un histograma para la cuantificación de ADN de AAV intracelular expresado.
La figura 8 es un histograma que muestra la actividad en neuronas motoras humanas de los constructos codificados en vectores de AAV.
La figura 9 es un gráfico que muestra el silenciamiento dependiente de la dosis de SOD1 en células U251MG.
La figura 10 es un gráfico que muestra el silenciamiento dependiente de la dosis de SOD1 en astrocitos humanos. La figura 11 es un gráfico que muestra el transcurso temporal del silenciamiento de SOD1 en células U251MG. La figura 12 comprende la figura 12A, la figura 12B y la figura 12C, que son gráficos que muestran los efectos dependientes de la dosis de un constructo. La figura 12A muestra la expresión relativa de SOD1. La figura 12B muestra el porcentaje de hebra guía. La figura 12C muestra el porcentaje de la hebra pasajera.
La figura 13 es un diagrama que muestra la ubicación del polinucleótido modulador (MP) con respecto a las ITR, el intrón (I) y la poliA (P).
Descripción detallada
Composiciones de la invención
Según la presente invención, se proporcionan polinucleótidos moduladores tal como se definen por las reivindicaciones que funcionan como microARN artificiales. Tal como se usa en el presente documento, un “polinucleótido modulador” es cualquier polímero de ácido nucleico que funciona para modular (ya sea aumentar o disminuir) el nivel o la cantidad de un gen diana. Los polinucleótidos moduladores incluyen moléculas precursoras que se procesan dentro de la célula antes de la modulación. Los polinucleótidos moduladores o las formas procesadas de los mismos pueden codificarse en un plásmido, vector, genoma u otro vector de expresión de ácido nucleico para su administración a una célula. En algunas realizaciones, los polinucleótidos moduladores se diseñan como microARN primarios (pri-miR) o microARN precursores (pre-miR) que se procesan dentro de la célula para producir microARN artificiales altamente específicos. Los polinucleótidos moduladores, especialmente los microARN artificiales de la invención, pueden diseñarse basándose en la secuencia o el armazón de la estructura de un microARN, pri-microARN o pre-microARN canónico o conocido. Tales secuencias pueden corresponder a cualquier microARN conocido, o a su precursor, tal como los enseñados en la publicación estadounidense US2005/0261218 y la publicación estadounidense US2005/0059005.
Los microARN (o miARN o miR) son ARN no codificantes de 19-25 nucleótidos de longitud que se unen a la 3'-UTR de las moléculas de ácido nucleico y regulan por disminución la expresión génica o bien reduciendo la estabilidad de la molécula de ácido nucleico o bien inhibiendo la traducción. Los polinucleótidos moduladores de la invención pueden comprender una o más secuencias de microARN, semillas de microARN o microARN artificiales, por ejemplo, secuencias que funcionan como microARN.
Una secuencia de microARN comprende una región “semilla”, es decir, una secuencia en la región de las posiciones 2-9 del microARN maduro, cuya secuencia tiene una complementariedad de Watson-Crick perfecta con la secuencia diana del miARN. Una semilla de microARN puede comprender las posiciones 2-8 ó 2-7 ó 2-9 del microARN maduro. En algunas realizaciones, una semilla de microARN puede comprender 7 nucleótidos (por ejemplo, los nucleótidos 2­ 8 del microARN maduro), en la que el sitio complementario a la semilla en la diana de miARN correspondiente está flanqueado por una adenina (A) opuesta a la posición 1 del microARN. En algunas realizaciones, una semilla de microARN puede comprender 6 nucleótidos (por ejemplo, los nucleótidos 2-7 del microARN maduro), en la que el sitio complementario a la semilla en la diana de miARN correspondiente está flanqueado por una adenina (A) opuesta a la posición 1 del microARN. Véase, por ejemplo, Grimson A, Farh KK, Johnston WK, Garrett-Engele P, Lim LP, Bartel DP; Mol Cell. 6 de julio de 2007;27(1):91-105. En un microARN que se produce de manera natural, las bases de la semilla de microARN tienen una complementariedad completa con la secuencia diana.
Tal como se enseña en el presente documento, se han identificado y aplicado parámetros, o reglas, de diseño para diseñar polinucleótidos moduladores (por ejemplo, microARN artificiales) que tienen propiedades moduladoras de genes diana superiores con efectos inespecíficos limitados.
En una realización, el armazón molecular del polinucleótido modulador descrito en el presente documento puede diseñarse y optimizarse para crear un polinucleótido modulador que tenga las propiedades moduladoras de genes diana deseadas. Como ejemplo no limitativo, el polinucleótido modulador puede tener propiedades moduladoras de genes diana superiores con efectos inespecíficos limitados.
En una realización, los polinucleótidos moduladores, tales como miR artificiales, se componen de elementos modulares o motivos de secuencia ensamblados según un conjunto de reglas que dan como resultado un reconocimiento de dianas altamente específico y una baja razón guía/pasajera. Tales módulos o motivos de secuencia incluyen, pero no se limitan a, regiones bicatenarias, regiones flanqueantes, bucles, bucles optimizados, bucles UGUG, dominios GU, espaciadores (para controlar el espacio proximal y distal de motivos o módulos o para introducir elementos estructurales tales como giros, bucles o protuberancias), motivos CNNC y regiones de asimetría termodinámica que pueden abarcar bucles, protuberancias, apareamientos erróneos, titubeos y/o combinaciones de los mismos. Los ejemplos no limitativos de reglas que pueden aplicarse solas o en combinación cuando se construyen miR artificiales incluyen los enseñados en Seitz et al. Silence 2011, 2:4; Gu, et al., Cell 151, 900-911, 9 de noviembre de 2012; Schwartz, et al., Cell, vol. 115, 199-208, 17 de octubre de 2003; Park, et al., Nature, vol. 475, 101, 14 de julio de 2011; Ketley et al., 2013, PLoS ONE 8(6); Liu, et al., Nucleic Acids Research, 2008, vol. 36, n.° 92811-2824; Dow, et al., 2013, Nat Protoc.; 7(2): 374-393. doi:10.1038/nprot.2011.446; Auyeung, et al., Cell 152, 844-858, 14 de febrero de 2013; Gu et al., Cell, 9 de noviembre de 2012, 151(4):900-11; Fellmann et al. Molecular Cell 41, 733-746, 2011; Han et al. Cell 125, 887-907, 2006; Betancur et al. Frontiers in Genetics, vol. 3, art. 127, 1-6 de julio de 2012; Schwarz et al. Cell, vol. 115, 199-208, 2003.
Además de los módulos o motivos de secuencia, los polinucleótidos moduladores comprenden al menos una o ambas de una hebra pasajera y una guía. Las hebras pasajera y guía pueden estar posicionadas o ubicadas en la rama en 5' o la rama en 3' de una estructura de tallo-bucle del polinucleótido modulador.
En una realización, la rama de tallo en 3' de los polinucleótidos moduladores puede tener 11 nucleótidos en el sentido de 3' del extremo 3' de la hebra guía que tiene complementariedad con 11 de los 13 nucleótidos en el sentido de 5' del extremo 5' de la hebra pasajera en la rama de tallo en 5'.
En una realización, los polinucleótidos moduladores pueden tener una cisteína que esté 6 nucleótidos en el sentido de 3' del extremo 3' de la rama de tallo en 3' del polinucleótido modulador.
En una realización, los polinucleótidos moduladores comprenden un apareamiento de semilla de miARN para la hebra guía. En otra realización, los polinucleótidos moduladores comprenden un apareamiento de semilla de miARN para la hebra pasajera. En aún otra realización, los polinucleótidos moduladores no comprenden un apareamiento de semilla ni para la hebra guía ni para la pasajera.
En una realización, los polinucleótidos moduladores pueden no tener casi ninguna diana inespecífica de longitud completa significativa para la hebra guía. En otra realización, los polinucleótidos moduladores pueden no tener casi ninguna diana inespecífica de longitud completa significativa para la hebra pasajera. En aún otra realización, los polinucleótidos moduladores pueden no tener casi ninguna diana inespecífica de longitud completa significativa para la hebra guía o la hebra pasajera.
En una realización, los polinucleótidos moduladores pueden tener alta actividad in vitro. En otra realización, los polinucleótidos moduladores pueden tener baja actividad in vitro. En aún otra realización, los polinucleótidos moduladores pueden tener alta actividad de la hebra guía y baja actividad de la hebra pasajera in vitro.
En una realización, los polinucleótidos moduladores tienen alta actividad de la hebra guía y baja actividad de la hebra pasajera in vitro. La atenuación de la diana (KD) por la hebra guía puede ser de al menos el 60%, el 65%, el 70%, el 75%, el 80%, el 85%, el 90%, el 95%, el 99%, el 99,5% o el 100%. La atenuación de la diana por la hebra guía puede ser del 60-65%, el 60-70%, el 60-75%, el 60-80%, el 60-85%, el 60-90%, el 60-95%, el 60-99%, el 60-99,5%, el 60-100%, el 65-70%, el 65-75%, el 65-80%, el 65-85%, el 65-90%, el 65-95%, el 65-99%, el 65-99,5%, el 65-100%, el 70-75%, el 70-80%, el 70-85%, el 70-90%, el 70-95%, el 70-99%, el 70-99,5%, el 70-100%, el 75-80%, el 75-85%, el 75-90%, el 75-95%, el 75-99%, el 75-99,5%, el 75-100%, el 80-85%, el 80-90%, el 80-95%, el 80-99%, el 80-99,5%, el 80-100%, el 85-90%, el 85-95%, el 85-99%, el 85-99,5%, el 85-100%, el 90-95%, el 90-99%, el 90-99,5%, el 90-100%, el 95-99%, el 95-99,5%, el 95-100%, el 99-99,5%, el 99-100% o el 99,5-100%. Como ejemplo no limitativo, la atenuación de la diana (KD) por la hebra guía es superior al 70%.
En una realización, la CI50 de la hebra pasajera para la diana inespecífica más cercana es superior a 100 multiplicado por la CI50 de la hebra guía para la diana. Como ejemplo no limitativo, si la CI50 de la hebra pasajera para la diana inespecífica más cercana es superior a 100 multiplicado por la CI50 de la hebra guía para la diana, entonces se dice que el polinucleótido modulador tiene alta actividad de la hebra guía y baja actividad de la hebra pasajera in vitro.
En una realización, el procesamiento en 5' de la hebra guía tiene un inicio correcto (n) en el extremo 5' al menos el 75%, el 80%, el 85%, el 90%, el 95%, el 99% o el 100% del tiempo in vitro o in vivo. Como ejemplo no limitativo, el procesamiento en 5' de la hebra guía es preciso y tiene un inicio correcto (n) en el extremo 5' al menos el 99% del tiempo in vitro. Como ejemplo no limitativo, el procesamiento en 5' de la hebra guía es preciso y tiene un inicio correcto (n) en el extremo 5' al menos el 99% del tiempo in vivo.
En una realización, la razón de hebra guía con respecto a pasajera (G:P) es de 1:99, 5:95, 10:90, 15:85, 20:80, 25:75, 30:70, 35:65, 40:60, 45:55, 50:50, 55:45, 60:40, 65:35, 70:30, 75:25, 80:20, 85:15, 90:10, 95:5 o 99:1 in vitro o in vivo. Como ejemplo no limitativo, la razón de hebra guía con respecto a pasajera es de 80:20 in vitro. Como ejemplo no limitativo, la razón de hebra guía con respecto a pasajera es de 80:20 in vivo.
En una realización, la integridad del genoma de vector es al menos el 60%, el 65%, el 70%, el 75%, el 80%, el 85%, el 90%, el 95%, el 99% o más del 99% de la longitud completa del constructo.
Polinucleótidos moduladores
En una realización, cualquier de los constructos de iARN o agentes de iARN conocidos puede servir como constructo de partida para el diseño de la hebra pasajera y/o guía de los polinucleótidos moduladores o microARN artificiales de la invención. Estos incluyen ARNip canónicos, ARN de interferencia pequeños (ARNip), ARN bicatenarios (ARNbc), repeticiones invertidas, ARN de horquilla corta (ARNhc), ARN temporalmente regulados pequeños (ARNtp), ARN inhibidores agrupados (ARNa), incluyendo ARN inhibidor agrupado radial, ARN inhibidor agrupado asimétrico, ARN inhibidor agrupado lineal y ARN inhibidor agrupado complejo o compuesto, sustratos de Dicer, iARN dirigido por ADN (iARNdd), iARN monocatenario (iARNmc), antagonistas de microARN (miARN), imitadores de microARN, agonistas de microARN, blockmir (también denominados Xmir), miméticos de microARN, reemplazos (addback) de microARN, supermiR, los constructos oligoméricos dados a conocer en la publicación PCT WO/2005/013901, constructos de iARN tripartitos tales como los divulgados en la publicación estadounidense 20090131360, los constructos de solo-rxARN divulgados en la publicación PCT WO/2010/011346; los constructos de sd-rxARN divulgados en la publicación PCT WO/2010/033247, constructos de iARN de acción doble que reducen los niveles de ARN y también modulan la respuesta inmunitaria tal como se divulgan en las publicaciones PCT WO/2010/002851 y w O/2009/141146 y ARN antigénicos (ARNag) o ARN de activación pequeños (ARNap) que aumentan la expresión de la diana para la que están diseñados divulgados en las publicaciones PCT w O/2006/130201, WO/2007/086990, WO/2009/046397, WO/2009/149182, WO/2009/086428.
Del mismo modo, cualquier precursor de pri-microARN o pre-microARN de los microARN anteriormente enumerados también puede servir como armazón molecular de los polinucleótidos moduladores.
En una realización, el constructo de partida puede derivarse de cualquier especie relevante, tal como, pero sin limitarse a, ratón, rata, perro, mono o humano.
En una realización, el polinucleótido modulador puede estar ubicado en un vector de expresión en el sentido de 3' de un promotor tal como, pero sin limitarse a, CMV, U6, CBA o un promotor de CBA con un intrón de SV40. Además, el polinucleótido modulador también puede estar ubicado en el sentido de 5' de la secuencia de poliadenilación en un vector de expresión. Como ejemplo no limitativo, el polinucleótido modulador puede estar ubicado dentro de los 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30 o más de 30 nucleótidos en el sentido de 3' desde el promotor y/o en el sentido de 5' de la secuencia de poliadenilación en un vector de expresión. Como otro ejemplo no limitativo, el polinucleótido modulador puede estar ubicado dentro de los 1-5, 1-10, 1-15, 1-20, 1-25, 1-30, 5-10, 5-15, 5-20, 5-25, 5-30, 10-15, 10-20, 10-25, 10-30, 15-20, 15-25, 15-30, 20-25, 20-30 ó 25-30 nucleótidos en el sentido de 3' desde el promotor y/o en el sentido de 5' de la secuencia de poliadenilación en un vector de expresión. Como ejemplo no limitativo, el polinucleótido modulador puede estar ubicado dentro del primer 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 15%, 20%, 25% o más del 25% de los nucleótidos en el sentido de 3' desde el promotor y/o en el sentido de 5' de la secuencia de poliadenilación en un vector de expresión. Como otro ejemplo no limitativo, el polinucleótido modulador puede estar ubicado con el primer 1-5%, 1-10%, 1-15%, 1-20%, 1-25%, 5-10%, 5-15%, 5-20%, 5-25%, 10-15%, 10-20%, 10-25%, 15-20%, 15-25% o 20-25% en el sentido de 3' desde el promotor y/o en el sentido de 5' de la secuencia de poliadenilación en un vector de expresión.
En una realización, el polinucleótido modulador puede estar ubicado en el sentido de 5' de la secuencia de poliadenilación en un vector de expresión. Además, el polinucleótido modulador puede estar ubicado en el sentido de 3' de un promotor tal como, pero sin limitarse a, CMV, U6, CBA o un promotor de CBA con un intrón de SV40 en un vector de expresión. Como ejemplo no limitativo, el polinucleótido modulador puede estar ubicado dentro de los 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30 o más de 30 nucleótidos en el sentido de 3' desde el promotor y/o en el sentido de 5' de la secuencia de poliadenilación en un vector de expresión. Como otro ejemplo no limitativo, el polinucleótido modulador puede estar ubicado dentro de los 1-5, 1-10, 1-15, 1-20, 1-25, 1-30, 5-10, 5-15, 5-20, 5-25, 5-30, 10-15, 10-20, 10-25, 10-30, 15-20, 15-25, 15-30, 20-25, 20-30 ó 25-30 nucleótidos en el sentido de 3' desde el promotor y/o en el sentido de 5' de la secuencia de poliadenilación en un vector de expresión. Como ejemplo no limitativo, el polinucleótido modulador puede estar ubicado dentro del primer 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 15%, 20%, 25% o más del 25% de los nucleótidos en el sentido de 3' desde el promotor y/o en el sentido de 5' de la secuencia de poliadenilación en un vector de expresión. Como otro ejemplo no limitativo, el polinucleótido modulador puede estar ubicado con el primer 1-5%, 1-10%, 1-15%, 1-20%, 1-25%, 5-10%, 5-15%, 5-20%, 5-25%, 10-15%, 10-20%, 10-25%, 15-20%, 15-25% o 20-25% en el sentido de 3' desde el promotor y/o en el sentido de 5' de la secuencia de poliadenilación en un vector de expresión.
En una realización, el polinucleótido modulador puede estar ubicado en un scAAV.
En una realización, el polinucleótido modulador puede estar ubicado en un ssAAV.
En una realización, el polinucleótido modulador puede estar ubicado cerca del extremo 5' de la ITR flip en un vector de expresión. En otra realización, el polinucleótido modulador puede estar ubicado cerca del extremo 3' de la ITR flip en un vector de expresión. En aún otra realización, el polinucleótido modulador puede estar ubicado cerca del extremo 5' de la ITR flop en un vector de expresión. En aún otra realización, el polinucleótido modulador puede estar ubicado cerca del extremo 3' de la ITR flop en un vector de expresión. En una realización, el polinucleótido modulador puede estar ubicado entre el extremo 5' de la ITR flip y el extremo 3' de la ITR flop en un vector de expresión. En una realización, el polinucleótido modulador puede estar ubicado entre (por ejemplo, a la mitad entre el extremo 5' de la ITR flip y el extremo 3' de la ITR flop o el extremo 3' de la ITR flop y el extremo 5' de la ITR flip) el extremo 3' de la ITR flip y el extremo 5' de la ITR flip en un vector de expresión. Como ejemplo no limitativo, el polinucleótido modulador puede estar ubicado dentro de los 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30 o más de 30 nucleótidos en el sentido de 3' desde el extremo 5' ó 3' de una ITR (por ejemplo, ITR flip o flop) en un vector de expresión. Como ejemplo no limitativo, el polinucleótido modulador puede estar ubicado dentro de los 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30 o más de 30 nucleótidos en el sentido de 5' desde el extremo 5' ó 3' de una ITR (por ejemplo, ITR flip o flop) en un vector de expresión. Como otro ejemplo no limitativo, el polinucleótido modulador puede estar ubicado dentro de los 1-5, 1­ 10, 1-15, 1-20, 1-25, 1-30, 5-10, 5-15, 5-20, 5-25, 5-30, 10-15, 10-20, 10-25, 10-30, 15-20, 15-25, 15-30, 20-25, 20-30 ó 25-30 nucleótidos en el sentido de 3' desde el extremo 5' ó 3' de una ITR (por ejemplo, ITR flip o flop) en un vector de expresión. Como otro ejemplo no limitativo, el polinucleótido modulador puede estar ubicado dentro de los 1-5, 1­ 10, 1-15, 1-20, 1-25, 1-30, 5-10, 5-15, 5-20, 5-25, 5-30, 10-15, 10-20, 10-25, 10-30, 15-20, 15-25, 15-30, 20-25, 20-30 ó 25-30 en el sentido de 5' desde el extremo 5' ó 3' de una ITR (por ejemplo, ITR flip o flop) en un vector de expresión. Como ejemplo no limitativo, el polinucleótido modulador puede estar ubicado dentro del primer 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 15%, 20%, 25% o más del 25% de los nucleótidos en el sentido de 5' desde el extremo 5' ó 3' de una ITR (por ejemplo, ITR flip o flop) en un vector de expresión. Como otro ejemplo no limitativo, el polinucleótido modulador puede estar ubicado con el primer 1-5%, 1-10%, 1-15%, 1-20%, 1-25%, 5-10%, 5-15%, 5-20%, 5-25%, 10-15%, 10-20%, 10-25%, 15-20%, 15-25% o 20-25% en el sentido de 3' desde el extremo 5' ó 3' de una ITR (por ejemplo, ITR flip o flop) en un vector de expresión.
Armazones moleculares
En algunas realizaciones, el armazón molecular de partida del polinucleótido modulador es un pri-microARN o premicroARN conocido o de tipo natural. En otras realizaciones el armazón molecular de los polinucleótidos moduladores se diseña ab initio. (Véase Cullen, Gene Therapy (2006) 13, 503-508, trabajo con miR30; Chung, et al., Nucleic Acids Research, 2006, vol. 34, n.° 7, trabajo con miR-155).
Tal como se usa en el presente documento, un “armazón molecular” es una molécula de entramado o de partida que forma la secuencia o base estructural contra la que diseñar o elaborar una molécula posterior.
Volviendo a la figura 1, los polinucleótidos moduladores de la presente invención pueden diseñarse como pri-miR tal como se muestra. En la figura, se muestra un armazón molecular de pri-miR. El polinucleótido modulador que comprende la carga activa (por ejemplo, ARNip, miARN u otro agente de iARN descrito en el presente documento) comprende una secuencia flanqueante en 5' líder que puede ser de cualquier longitud y puede derivarse total o parcialmente de una secuencia de microARN de tipo natural o ser completamente artificial.
Del mismo modo, una secuencia flanqueante en 3' mostrada en la figura puede imitar a la secuencia flanqueante en 5' en cuanto a tamaño y origen. Cualquiera de las secuencias flanqueantes puede estar ausente. La secuencia flanqueante en 3' puede contener opcionalmente uno o más motivos CNNC, en los que “N” representa cualquier nucleótido.
La formación del tallo de la estructura de tallo-bucle mostrada es un mínimo de al menos una secuencia de carga activa. En algunas realizaciones, la secuencia de carga activa comprende al menos una secuencia de ácido nucleico que es en parte complementaria o se hibridará con la secuencia diana. En algunas realizaciones, la carga activa es un microARN de tipo natural. En algunas realizaciones, la carga activa es una molécula de ARNip o un fragmento de una molécula de ARNip. En algunas realizaciones, la carga activa es un constructo sustancialmente bicatenario que puede comprender uno o más microARN, microARN artificiales o ARNip.
En algunas realizaciones, la rama en 5' del tallo-bucle comprende una hebra pasajera. Esta hebra también se conoce como la hebra sentido porque refleja identidad con respecto a una diana. La hebra pasajera puede tener entre 15­ 30 nucleótidos de longitud. Puede tener 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21,22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 ó 30 nucleótidos de longitud.
En algunas realizaciones, la rama en 3' del tallo-bucle comprende una hebra guía. Esta hebra también se conoce como la hebra antisentido porque refleja homología con respecto a una diana. La hebra guía puede tener entre 15­ 30 nucleótidos de longitud, 21-25 nucleótidos o 22 nucleótidos de longitud. Puede tener 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21,22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 ó 30 nucleótidos de longitud. En algunos casos, la hebra guía comprende un nucleótido “G” en el extremo más en 5'.
En algunas realizaciones, cuando la hebra guía comprende un microARN, o microARN artificiales, la hebra guía puede comprender una o más secuencias semilla de microARN. La secuencia semilla puede estar ubicada en las posiciones 2-7, 2-8 ó 2-9 de la hebra guía con respecto al primer nucleótido en 5' de la hebra guía o con respecto a un sitio de escisión Dicer.
En otras realizaciones, la hebra pasajera puede encontrarse en la rama en 3' mientras que la hebra guía se encuentra en la rama en 5' del tallo de la estructura de tallo-bucle.
Las hebras pasajera y guía pueden ser completamente complementarias a lo largo de una porción sustancial de su longitud. En otras realizaciones, la hebra pasajera y la hebra guía pueden ser al menos el 70, el 80, el 90, el 95 o el 99% complementarias a lo largo de independientemente al menos el 50, el 60, el 70, el 80, el 85, el 90, el 95 o el 99% de la longitud de las hebras.
No es necesario que la identidad de la hebra pasajera ni la homología de la hebra guía sean el 100% complementarias con la diana.
Un bucle (también denominado motivo de bucle) separa las hebras pasajera y guía de la estructura de tallo-bucle. El bucle puede ser de cualquier longitud, entre 4-30 nucleótidos, entre 4-20 nucleótidos, entre 4-15 nucleótidos, entre 5­ 15 nucleótidos, entre 6-12 nucleótidos, 6 nucleótidos, 7, nucleótidos, 8 nucleótidos, 9 nucleótidos, 10 nucleótidos, 11 nucleótidos y/o 12 nucleótidos.
En algunas realizaciones, el bucle comprende al menos un motivo UGUG. En algunas realizaciones, el motivo UGUG está ubicado en el extremo 5'-terminal del bucle.
Pueden estar presentes regiones espaciadoras en el polinucleótido modulador para separar uno o más módulos entre sí. Pueden estar presentes una o más de tales regiones espaciadoras.
En una realización, puede estar presente una región espaciadora de entre 8-20, es decir, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 ó 20 nucleótidos entre la hebra pasajera y una secuencia flanqueante.
En una realización, el espaciador tiene 13 nucleótidos y está ubicado entre el extremo 5'-terminal de la hebra pasajera y una secuencia flanqueante. En una realización, un espaciador tiene una longitud suficiente como para formar aproximadamente un giro de hélice de la secuencia.
En una realización, puede estar presente una región espaciadora de entre 8-20, es decir, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 ó 20 nucleótidos entre la hebra guía y una secuencia flanqueante.
En una realización, la secuencia espadadora tiene entre 10-13, es decir, 10, 11, 12 ó 13 nucleótidos y está ubicada entre el extremo 3’-terminal de la hebra guía y una secuencia flanqueante. En una realización, un espaciador tiene una longitud suficiente como para formar aproximadamente un giro de hélice de la secuencia.
En una realización, el polinucleótido modulador comprende al menos un motivo UG en la base del tallo, mediante lo cual el nucleótido G está apareado y el nucleótido U no está apareado. En algunas realizaciones, el nucleótido U no apareado está ubicado en una secuencia flanqueante.
En una realización, el polinucleótido modulador comprende, en la dirección de 5’ a 3’, una secuencia flanqueante en 5’, una rama en 5’, un motivo de bucle, una rama en 3’ y una secuencia flanqueante en 3’. Como ejemplo no limitativo, la rama en 5’ puede comprender una hebra pasajera y la rama en 3’ comprende la hebra guía. En otro ejemplo no limitativo, la rama en 5’ comprende la hebra guía y la rama en 3’ comprende la hebra pasajera.
En una realización, puede alterarse la secuencia de la rama en 5’, de carga activa (por ejemplo, hebra pasajera y/o guía), del motivo de bucle y/o de la rama en 3’ (por ejemplo, sustituyendo 1 o más nucleótidos, añadiendo nucleótidos y/o delecionando nucleótidos). La alteración puede provocar un cambio beneficioso en la función del constructo (por ejemplo, aumentar la atenuación de la secuencia diana, reducir la degradación del constructo, reducir el efecto inespecífico, aumentar la eficiencia de la carga activa y reducir la degradación de la carga activa).
En una realización, puede alterarse la secuencia de la hebra pasajera (por ejemplo, sustituyendo 1 o más nucleótidos, añadiendo nucleótidos y/o delecionando nucleótidos). Como ejemplo no limitativo, la secuencia de la hebra pasajera puede comprender 1 ó 2 sustituciones dentro de los últimos 4 nucleótidos de la secuencia (por ejemplo, C sustituida por G). Como otro ejemplo no limitativo, la secuencia de la hebra pasajera puede comprender 1 ó 2 sustituciones dentro de los 7-15 nucleótidos desde el extremo 5’ de la secuencia (por ejemplo, U sustituida por A o C sustituida por G).
En una realización, puede alterarse la secuencia de hebra de la rama en 3’ (por ejemplo, sustituyendo 1 o más nucleótidos, añadiendo nucleótidos y/o delecionando nucleótidos). Como ejemplo no limitativo, la secuencia de la rama en 3’ puede comprender 1 ó 2 sustituciones dentro de los primeros 4 nucleótidos de la secuencia (por ejemplo, A sustituida por U).
En una realización, el armazón molecular del constructo de carga activa puede comprender una región flanqueante en 5’, un motivo de bucle y una región flanqueante en 3’. Entre la región flanqueante en 5’ y el motivo de bucle puede haber una primera región de carga activa y entre el motivo de bucle y la región flanqueante en 3’ puede haber una segunda región de carga activa. La primera y segunda regiones de carga activa pueden comprender ARNip, miARN u otros agentes, fragmentos o variantes de iARN descritos en el presente documento. La primera y segunda regiones de carga activa también pueden comprender una secuencia que es la misma, diferente o complementaria entre sí. Como ejemplo no limitativo, la secuencia de la primera región de carga activa puede ser una hebra pasajera de un constructo de ARNip y la secuencia de la segunda región de carga activa puede ser una hebra guía de un constructo de ARNip. Las secuencias pasajera y guía pueden ser sustancialmente complementarias entre sí. Como otro ejemplo no limitativo, la secuencia de la primera región de carga activa puede ser una hebra guía de un constructo de ARNip y la secuencia de la segunda región de carga activa puede ser una hebra pasajera de un constructo de ARNip. Las secuencias pasajera y guía pueden ser sustancialmente complementarias entre sí.
En una realización, el armazón molecular de los polinucleótidos moduladores descritos en el presente documento comprende una región flanqueante en 5’, una región de bucle y una región flanqueante en 3’. Los ejemplos no limitativos de las secuencias para la región flanqueante en 5’, la región de bucle y la región flanqueante en 3’ que pueden usarse en los armazones moleculares descritos en el presente documento se muestran en las tablas 1-3. Tabla 1. Regiones flanqueantes en 5’ para el armazón molecular
Figure imgf000008_0001
Tabla 2. Regiones de motivo de bucle para el armazón molecular
Figure imgf000009_0002
Tabla 3. Regiones flanqueantes en 3’ para el armazón molecular
Figure imgf000009_0001
Puede usarse cualquiera de las regiones descritas en las tablas 1-3 en los armazones moleculares descritos en el presente documento.
En una realización, el armazón molecular puede comprender una región flanqueante en 5’ enumerada en la tabla 1. Como ejemplo no limitativo, el armazón molecular puede comprender la región flanqueante en 5’ 5F1,5F2, 5F3 o 5F4. En una realización, el armazón molecular puede comprender una región de motivo de bucle enumerada en la tabla 2. Como ejemplo no limitativo, el armazón molecular puede comprenderla región de motivo de bucle L1, L2, L3, L4 o L5. En una realización, el armazón molecular puede comprender una región flanqueante en 3’ enumerada en la tabla 3. Como ejemplo no limitativo, el armazón molecular puede comprender la región flanqueante en 3’ 3F1,3F2, 3F3, 3F4, 3F5 o 3F6.
En una realización, el armazón molecular puede comprender al menos una región flanqueante en 5’ y al menos una región de motivo de bucle tal como se describen en las tablas 1 y 2. Como ejemplo no limitativo, el armazón molecular puede comprender 5F1 y L1,5F1 y L2, 5F1 y L3, 5F1 y L4, 5F1 y L5, 5F2 y L1, 5F2 y L2, 5F2 y L3, 5F2 y L4, 5F2 y L5, 5F3 y L1,5F3 y L2, 5F3 y L3, 5F3 y L4, 5F3 y L5, 5F4 y L1,5F4 y L2, 5F4 y L3, 5F4 y L4 o 5F4 y L5.
En una realización, el armazón molecular puede comprender al menos una región flanqueante en 3’ y al menos una región de motivo de bucle tal como se describen en las tablas 2 y 3. Como ejemplo no limitativo, el armazón molecular puede comprender 3F1 y L1,3F1 y L2, 3F1 y L3, 3F1 y L4, 3F1 y L5, 3F2 y L1, 3F2 y L2, 3F2 y L3, 3F2 y L4, 3F2 y L5, 3F3 y L1,3F3 y L2, 3F3 y L3, 3F3 y L4, 3F3 y L5, 3F4 y L1,3F4 y L2, 3F4 y L3, 3F4 y L4, 3F4 y L5, 3F5 y L1,3F5 y L2, 3F5 y L3, 3F5 y L4, 3F5 y L5, 3F6 y L1,3F6 y L2, 3F6 y L3, 3F6 y L4 o 3F6 y L5.
En una realización, el armazón molecular puede comprender al menos una región flanqueante en 5’ y al menos una región flanqueante en 3’ tal como se describen en las tablas 1 y 3. Como ejemplo no limitativo, el armazón molecular puede comprender 5F1 y 3F1, 5F1 y 3F2, 5F1 y 3F3, 5F1 y 3F4, 5F1 y 3F5, 5F1 y 3F6, 5F2 y 3F1,5F2 y 3F2, 5F2 y 3F3, 5F2 y 3F4, 5F2 y 3F5, 5F2 y 3F6, 5F3 y 3F1,5F3 y 3F2, 5F3 y 3F3, 5F3 y 3F4, 5F3 y 3F5, 5F3 y 3F6, 5F4 y 3F1, 5F4 y 3F2, 5F4 y 3F3, 5F4 y 3F4, 5F4 y 3F5, 5F4 y 3F6.
En una realización, el armazón molecular puede comprender al menos una región flanqueante en 5', al menos una región de motivo de bucle y al menos una región flanqueante en 3'. Como ejemplo no limitativo, el armazón molecular puede comprender 5F1, L1 y 3F1; 5F1, L1 y 3F2; 5F1, L1 y 3F3; 5F1, L1 y 3F4; 5F1, L1 y 3F5; 5F1, L1 y 3F6; 5F2, L1
,
,
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;
En una realización, el armazón molecular puede comprender uno o más conectores conocidos en la técnica. Los conectores pueden separar las regiones o un armazón molecular de otro. Como ejemplo no limitativo, el armazón molecular puede ser policistrónico.
En una realización, el polinucleótido modulador se diseña usando al menos una de las siguientes propiedades: variante de bucle, apareamiento erróneo de semilla/protuberancia/variante de titubeo, apareamiento erróneo de tallo, variante de bucle y variante de apareamiento erróneo de tallo basal, apareamiento erróneo de semilla y variante de apareamiento erróneo de tallo basal, apareamiento erróneo de tallo y variante de apareamiento erróneo de tallo basal, titubeo de semilla y variante de titubeo de tallo basal, o una variante de secuencia de tallo.
En una realización, el armazón molecular puede estar ubicado en el sentido de 3' de un promotor tal como, pero sin limitarse a, CMV, U6, CBA o un promotor de CBA con un intrón de SV40. Además, el armazón molecular también puede estar ubicado en el sentido de 5' de la secuencia de poliadenilación. Como ejemplo no limitativo, el armazón molecular puede estar ubicado dentro de los 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22,
23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30 o más de 30 nucleótidos en el sentido de 3' desde el promotor y/o en el sentido de 5' de la secuencia de poliadenilación. Como otro ejemplo no limitativo, el armazón molecular puede estar ubicado dentro de los 1-5, 1-10, 1-15, 1-20, 1-25, 1-30, 5-10, 5-15, 5-20, 5-25, 5-30, 10-15, 10-20, 10-25, 10-30, 15-20, 15-25, 15-30, 20­
25, 20-30 ó 25-30 nucleótidos en el sentido de 3' desde el promotor y/o en el sentido de 5' de la secuencia de poliadenilación. Como ejemplo no limitativo, el armazón molecular puede estar ubicado dentro del primer 1%, 2%, 3%,
4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 15%, 20%, 25% o más del 25% de los nucleótidos en el sentido de 3' desde el promotor y/o en el sentido de 5' de la secuencia de poliadenilación. Como otro ejemplo no limitativo, el armazón molecular puede estar ubicado con el primer 1-5%, 1-10%, 1-15%, 1-20%, 1-25%, 5-10%, 5-15%, 5-20%, 5-25%, 10-15%, 10-20%, 10-25%, 15-20%, 15-25% o 20-25% en el sentido de 3' desde el promotor y/o en el sentido de 5' de la secuencia de poliadenilación.
En una realización, el armazón molecular puede estar ubicado en el sentido de 5' de la secuencia de poliadenilación.
Además, el armazón molecular puede estar ubicado en el sentido de 3' de un promotor tal como, pero sin limitarse a,
CMV, U6, CBA o un promotor de CBA con un intrón de SV40. Como ejemplo no limitativo, el armazón molecular puede estar ubicado dentro de los 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21,22, 23, 24, 25, 26, 27,
28, 29, 30 o más de 30 nucleótidos en el sentido de 3' desde el promotor y/o en el sentido de 5' de la secuencia de poliadenilación. Como otro ejemplo no limitativo, el armazón molecular puede estar ubicado dentro de los 1-5, 1-10,
1-15, 1-20, 1-25, 1-30, 5-10, 5-15, 5-20, 5-25, 5-30, 10-15, 10-20, 10-25, 10-30, 15-20, 15-25, 15-30, 20-25, 20-30 ó
25-30 nucleótidos en el sentido de 3' desde el promotor y/o en el sentido de 5' de la secuencia de poliadenilación.
Como ejemplo no limitativo, el armazón molecular puede estar ubicado dentro del primer 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%,
7%, 8%, 9%, 10%, 15%, 20%, 25% o más del 25% de los nucleótidos en el sentido de 3' desde el promotor y/o en el sentido de 5' de la secuencia de poliadenilación. Como otro ejemplo no limitativo, el armazón molecular puede estar ubicado con el primer 1-5%, 1-10%, 1-15%, 1-20%, 1-25%, 5-10%, 5-15%, 5-20%, 5-25%, 10-15%, 10-20%, 10-25%,
15-20%, 15-25% o 20-25% en el sentido de 3' desde el promotor y/o en el sentido de 5' de la secuencia de poliadenilación.
En una realización, el armazón molecular puede estar ubicado en un scAAV.
En una realización, el armazón molecular puede estar ubicado en un ssAAV.
En una realización, el armazón molecular puede estar ubicado cerca del extremo 5' de la ITR flip. En otra reali el armazón molecular puede estar ubicado cerca del extremo 3' de la ITR flip. En aún otra realización, el armazón molecular puede estar ubicado cerca del extremo 5' de la ITR flop. En aún otra realización, el armazón molecular
puede estar ubicado cerca del extremo 3' de la ITR flop. En una realización, el armazón molecular puede estar ubicado entre el extremo 5' de la ITR flip y el extremo 3' de la ITR flop. En una realización, el armazón molecular puede estar ubicado entre (por ejemplo, a la mitad entre el extremo 5' de la ITR flip y extremo 3' de la ITR flop o el extremo 3' de la ITR flop y el extremo 5' de la ITR flip) el extremo 3' de la ITR flip y el extremo 5' de la ITR flip. Como ejemplo no limitativo, el armazón molecular puede estar ubicado dentro de los 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21,22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30 o más de 30 nucleótidos en el sentido de 3' desde el extremo 5' ó 3' de una ITR (por ejemplo, ITR flip o flop). Como ejemplo no limitativo, el armazón molecular puede estar ubicado dentro de los 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30 o más de 30 nucleótidos en el sentido de 5' desde el extremo 5' ó 3' de una ITR (por ejemplo, ITR flip o flop). Como otro ejemplo no limitativo, el armazón molecular puede estar ubicado dentro de los 1-5, 1-10, 1-15, 1-20, 1-25, 1-30, 5-10, 5-15, 5-20, 5-25, 5-30, 10-15, 10-20, 10-25, 10-30, 15-20, 15-25, 15-30, 20-25, 20-30 ó 25-30 nucleótidos en el sentido de 3' desde el extremo 5' ó 3' de una ITR (por ejemplo, ITR flip o flop). Como otro ejemplo no limitativo, el armazón molecular puede estar ubicado dentro de los 1-5, 1-10, 1-15, 1-20, 1-25, 1-30, 5-10, 5-15, 5-20, 5-25, 5-30, 10-15, 10­ 20, 10-25, 10-30, 15-20, 15-25, 15-30, 20-25, 20-30 o 25-30 en el sentido de 5' desde el extremo 5' ó 3' de una ITR (por ejemplo, ITR flip o flop). Como ejemplo no limitativo, el armazón molecular puede estar ubicado dentro del primer 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 15%, 20%, 25% o más del 25% de los nucleótidos en el sentido de 5' desde el extremo 5' ó 3' de una ITR (por ejemplo, ITR flip o flop). Como otro ejemplo no limitativo, el armazón molecular puede estar ubicado con el primer 1-5%, 1-10%, 1-15%, 1-20%, 1-25%, 5-10%, 5-15%, 5-20%, 5-25%, 10-15%, 10-20%, 10-25%, 15-20%, 15-25% o 20-25% en el sentido de 3' desde el extremo 5' ó 3' de una ITR (por ejemplo, ITR flip o flop).
Vector de expresión
En una realización, un vector de expresión (por ejemplo, vector de AAV) puede comprender al menos uno de los polinucleótidos moduladores que comprenden al menos uno de los armazones moleculares descritos en el presente documento.
En una realización, un vector de expresión puede comprender, de ITR a ITR enumeradas de 5' a 3', una ITR, un promotor, un intrón, un polinucleótido modulador, una secuencia de poliA y una ITR.
Tamaño del genoma
En una realización, el genoma de vector que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica para los polinucleótidos moduladores descritos en el presente documento puede ser un genoma de vector monocatenario o bicatenario. El tamaño del genoma de vector puede ser pequeño, mediano, grande o de tamaño máximo. Además, el genoma de vector puede comprender un promotor y una cola de poliA.
En una realización, el genoma de vector que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica para los polinucleótidos moduladores descritos en el presente documento puede ser un genoma de vector monocatenario pequeño. Un genoma de vector monocatenario pequeño puede tener de 2,7 a 3,5 kb de tamaño, tal como aproximadamente 2,7, 2,8, 2,9, 3,0, 3,1, 3,2, 3,3, 3,4 y 3,5 kb de tamaño. Como ejemplo no limitativo, el genoma de vector monocatenario pequeño puede tener 3,2 kb de tamaño. Además, el genoma de vector puede comprender un promotor y una cola de poliA.
En una realización, el genoma de vector que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica para los polinucleótidos moduladores descritos en el presente documento puede ser un genoma de vector bicatenario pequeño. Un genoma de vector bicatenario pequeño puede tener de 1,3 a 1,7 kb de tamaño, tal como aproximadamente 1,3, 1,4, 1,5, 1,6 y 1,7 kb de tamaño. Como ejemplo no limitativo, el genoma de vector bicatenario pequeño puede tener 1,6 kb de tamaño. Además, el genoma de vector puede comprender un promotor y una cola de poliA.
En una realización, el genoma de vector que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica para los polinucleótidos moduladores descritos en el presente documento puede ser un genoma de vector monocatenario mediano. Un genoma de vector monocatenario mediano puede tener de 3,6 a 4,3 kb de tamaño, tal como aproximadamente 3,6, 3,7, 3,8, 3,9, 4,0, 4,1, 4,2 y 4,3 kb de tamaño. Como ejemplo no limitativo, el genoma de vector monocatenario mediano puede tener 4,0 kb de tamaño. Además, el genoma de vector puede comprender un promotor y una cola de poliA.
En una realización, el genoma de vector que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica para los polinucleótidos moduladores descritos en el presente documento puede ser un genoma de vector bicatenario mediano. Un genoma de vector bicatenario mediano puede tener de 1,8 a 2,1 kb de tamaño, tal como aproximadamente 1,8, 1,9, 2,0 y 2,1 kb de tamaño. Como ejemplo no limitativo, el genoma de vector bicatenario mediano puede tener 2,0 kb de tamaño. Además, el genoma de vector puede comprender un promotor y una cola de poliA.
En una realización, el genoma de vector que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica para los polinucleótidos moduladores descritos en el presente documento puede ser un genoma de vector monocatenario grande. Un genoma de vector monocatenario grande puede tener de 4,4 a 6,0 kb de tamaño, tal como aproximadamente 4,4, 4,5, 4,6, 4,7, 4,8, 4,9, 5,0, 5,1, 5,2, 5,3, 5,4, 5,5, 5,6, 5,7, 5,8, 5,9 y 6,0 kb de tamaño. Como ejemplo no limitativo, el genoma de vector monocatenario grande puede tener 4,7 kb de tamaño. Como otro ejemplo no limitativo, el genoma de vector monocatenario grande puede tener 4,8 kb de tamaño. Como aún otro ejemplo no limitativo, el genoma de vector monocatenario grande puede tener 6,0 kb de tamaño. Además, el genoma de vector puede comprender un promotor y una cola de poliA.
En una realización, el genoma de vector que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica para los polinucleótidos moduladores descritos en el presente documento puede ser un genoma de vector bicatenario grande.
Un genoma de vector bicatenario grande puede tener de 2,2 a 3,0 kb de tamaño, tal como aproximadamente 2,2, 2,3,
2,4, 2,5, 2,6, 2,7, 2,8, 2,9 y 3,0 kb de tamaño. Como ejemplo no limitativo, el genoma de vector bicatenario grande puede tener 2,4 kb de tamaño. Además, el genoma de vector puede comprender un promotor y una cola de poliA.
Promotores
Un experto en la técnica puede reconocer que una célula diana puede requerir un promotor específico, incluyendo, pero sin limitarse a, un promotor que es específico de especie, inducible, específico de tejido o específico del ciclo celular. Parr et al., Nat. Med.3:1145-9 (1997).
En una realización, el promotor es un promotor que se considera eficiente para la carga activa en el polinucleótido modulador.
En una realización, el promotor es un promotor que se considera eficiente para la célula que va a seleccionarse como diana.
En una realización, el promotor es un promotor débil que proporciona la expresión de una carga activa durante un periodo de tiempo en tejidos seleccionados como diana, tales como, pero sin limitarse a, tejidos del sistema nervioso.
La expresión puede ser durante un periodo de 1 hora, 2, horas, 3 horas, 4 horas, 5 horas, 6 horas, 7 horas, 8 horas,
9 horas, 10 horas, 11 horas, 12 horas, 13 horas, 14 horas, 15 horas, 16 horas, 17 horas, 18 horas, 19 horas, 20 horas,
21 horas, 22 horas, 23 horas, 1 día, 2 días, 3 días, 4 días, 5 días, 6 días, 1 semana, 8 días, 9 días, 10 días, 11 días,
12 días, 13 días, 2 semanas, 15 días, 16 días, 17 días, 18 días, 19 días, 20 días, 3 semanas, 22 días, 23 días, 24 días, 25 días, 26 días, 27 días, 28 días, 29 días, 30 días, 31 días, 1 mes, 2 meses, 3 meses, 4 meses, 5 meses, 6 meses, 7 meses, 8 meses, 9 meses, 10 meses, 11 meses, 1 año, 13 meses, 14 meses, 15 meses, 16 meses, 17 meses, 18 meses, 19 meses, 20 meses, 21 meses, 22 meses, 23 meses, 2 años, 3 años, 4 años, 5 años, 6 años, 7 años, 8 años, 9 años, 10 años o más de 10 años. La expresión puede ser durante 1-5 horas, 1-12 horas, 1-2 días, 1­
5 días, 1-2 semanas, 1-3 semanas, 1-4 semanas, 1-2 meses, 1-4 meses, 1-6 meses, 2-6 meses, 3-6 meses, 3-9 meses, 4-8 meses, 6-12 meses, 1-2 años, 1-5 años, 2-5 años, 3-6 años, 3-8 años, 4-8 años o 5-10 años. Como ejemplo no limitativo, el promotor es un promotor débil para la expresión sostenida de una carga activa en tejidos nerviosos.
En una realización, el promotor puede ser un promotor que tiene menos de 1 kb. El promotor puede tener una longitud de 200, 210, 220, 230, 240, 250, 260, 270, 280, 290, 300, 310, 320, 330, 340, 350, 360, 370, 380, 390, 400, 410, 420,
430, 440, 450, 460, 470, 480, 490, 500, 510, 520, 530, 540, 550, 560, 570, 580, 590, 600, 610, 620, 630, 640, 650,
660, 670, 680, 690, 700, 710, 720, 730, 740, 750, 760, 770, 780, 790, 800 o más de 800. El promotor puede tener una longitud de entre 200-300, 200-400, 200-500, 200-600, 200-700, 200-800, 300-400, 300-500, 300-600, 300-700, 300­
800, 400-500, 400-600, 400-700, 400-800, 500-600, 500-700, 500-800, 600-700, 600-800 ó 700-800.
En una realización, el promotor puede ser una combinación de dos o más componentes tales como, pero sin limitarse a, CMV y CBA. Cada componente puede tener una longitud de 200, 210, 220, 230, 240, 250, 260, 270, 280, 290, 300, 310, 320, 330, 340, 350, 360, 370, 380, 381, 382, 383, 384, 385, 386, 387, 388, 389, 390, 400, 410, 420, 430, 450, 460, 470, 480, 490, 500, 510, 520, 530, 540, 550, 560, 570, 580, 590, 600, 610, 620, 630, 640, 650, 660, 680, 690, 700, 710, 720, 730, 740, 750, 760, 770, 780, 790, 800 o más de 800. Cada componente puede tene longitud de entre 200-300, 200-400, 200-500, 200-600, 200-700, 200-800, 300-400, 300-500, 300-600, 300-700, 300­
800, 400-500, 400-600, 400-700, 400-800, 500-600, 500-700, 500-800, 600-700, 600-800 ó 700-800. Como ejemplo no limitativo, el promotor es una combinación de una secuencia potenciadora de CMV de 382 nucleótidos y una secuencia promotora de CBA de 260 nucleótidos.
En una realización, el genoma de vector comprende al menos un elemento para potenciar la especificidad y expresión de la diana del transgén (véase, por ejemplo, Powell et al. Viral Expression Cassette Elements to Enhance Transgene Target Specificity and Expression in Gene Therapy, 2015). Los ejemplos no limitativos de elementos para potenciar la especificidad y expresión de la diana del transgén incluyen promotores, miARN endógenos, elementos reguladores postranscripcionales (PRE), secuencias señal de poliadenilación (PoliA) y potenciadores en el sentido de 5' (USE), potenciadores de CMV e intrones.
En una realización, el genoma de vector comprende al menos un elemento para potenciar la especificidad y expresión de la diana del transgén (véase, por ejemplo, Powell et al. Viral Expression Cassette Elements to Enhance Transgene Target Specificity and Expression in Gene Therapy, 2015), tales como promotores. Los promotores que promueven la expresión en la mayoría de los tejidos incluyen, pero no se limitan a, subunidad 1a del factor de elongación humano
(EF1a), citomegalovirus (CMV) temprano inmediato, p-actina de pollo (CBA) y su derivado CAG, la p-glucuronidasa (GUSB) o ubiquitina C (UBC). Pueden usarse elementos de expresión específicos de tejido para restringir la expresión a determinados tipos de células, tales como, pero sin limitarse a, promotores del sistema nervioso que pueden usarse para restringir la expresión a neuronas, astrocitos u oligodendrocitos. Los ejemplos no limitativos de elementos de expresión específicos de tejido para neuronas incluyen promotores de enolasa específica de neuronas (NSE), factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF), cadena p del factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF-P), sinapsina (Syn), proteína 2 de unión a metil-CpG (MeCP2), CaMKII, mGluR2, NFL, NFH, np2, PPE, Enk y EAAT2. Los ejemplos no limitativos de elementos de expresión específicos de tejido para astrocitos incluyen promotores de la proteína ácida fibrilar glial (GFAP) y EAAT2. Un ejemplo no limitativo de elementos de expresión específicos de tejido para oligodendrocitos es el promotor de la proteína básica de mielina (MBP).
En una realización, el genoma de vector comprende un promotor ubicuo. Los ejemplos no limitativos de promotores ubicuos incluyen CMV, CBA (incluyendo los derivados CAG, CBh, etc.), EF-1a, PGK, UBC, GUSB (hGBp) y UCOE (promotor de HNRPA2B1-CBX3). Yu et al. (Molecular Pain 2011, 7:63) evaluaron la expresión de eGFP bajo los promotores de CAG, EFIa, PGK y UBC en células DRG de rata y células DRG primarias usando vectores lentivirales y hallaron que UBC mostró una expresión más débil que los otros 3 promotores y sólo se observó el 10-12% de expresión glial para todos los promotores. Soderblom et al. (E. Neuro 2015) la expresión de eGFP en AAV8 con los promotores de CMV y UBC y en AAV2 con el promotor de CMV después de la inyección en la corteza motora. La administración intranasal de un plásmido que contenía un promotor de UBC o EFIa mostró una expresión sostenida en la vía respiratoria superior a la expresión con el promotor de CMV (véase, por ejemplo, Gill et al., Gene Therapy 2001, vol. 8, 1539-1546). Husain et al. (Gene Therapy 2009) evaluaron un constructo HpH con un promotor de hGUSB, un promotor de HSV-1LAT y un promotor de NSE, y hallaron que el constructo HpH mostraba una expresión más débil que NSE en cerebro de ratón. Passini y Wolfe (J. Virol. 2001, 12382-12392) evaluaron los efectos a largo plazo del vector HpH tras una inyección intraventricular en ratones neonatales y hallaron que había una expresión sostenida durante al menos 1 año. La baja expresión en todas las regiones del cerebro la hallaron Xu et al. (Gene Therapy 2001, 8, 1323-1332) cuando se usaron los promotores de NF-L y NF-H en comparación con CMV-lacZ, CMV-luc, EF, GFAP, hENK, nAChR, PPE, PPE wpre, NSE (0,3 kb), NSE (1,8 kb) y NSE (1,8 kb wpre). Xu et al. hallaron que la actividad de los promotores en orden descendiente era NSE (1,8 kb), EF, NSE (0,3 kb), GFAP, CMV, hENK, PPE, NFL y NFH. NFL es un promotor de 650 nucleótidos y NFH es un promotor de 920 nucleótidos, ambos ausentes en el hígado, pero NFH es abundante en neuronas propioceptivas sensoriales, cerebro y médula espinal y NFH está presente en el corazón. Scn8a es un promotor de 470 nucleótidos que se expresa en todos de DRG, médula espinal y cerebro, observándose una expresión particularmente alta en las neuronas hipocámpicas y células de Purkinje del cerebelo, la corteza, el tálamo y el hipotálamo (véanse, por ejemplo, Drews et al. 2007 y Raymond et al. 2004).
En una realización, el genoma de vector comprende un promotor de UBC. El promotor de UBC puede tener un tamaño de 300-350 nucleótidos. Como ejemplo no limitativo, el promotor de UBC tiene 332 nucleótidos.
En una realización, el genoma de vector comprende un promotor de GUSB. El promotor de GUSB puede tener un tamaño de 350-400 nucleótidos. Como ejemplo no limitativo, el promotor de GUSB tiene 378 nucleótidos. Como ejemplo no limitativo, el constructo puede ser AAV-promotor-CMV/intrón de globina-hFXN-RBG, en el que el AAV puede ser autocomplementario y el AAV puede tener el serotipo DJ.
En una realización, el genoma de vector comprende un promotor de NFL. El promotor de NFL puede tener un tamaño de 600-700 nucleótidos. Como ejemplo no limitativo, el promotor de NFL tiene 650 nucleótidos. Como ejemplo no limitativo, el constructo puede ser AAV-promotor-CMV/intrón de globina-hFXN-RBG, en el que el AAV puede ser autocomplementario y el AAV puede tener el serotipo DJ.
En una realización, el genoma de vector comprende un promotor de NFH. El promotor de NFH puede tener un tamaño de 900-950 nucleótidos. Como ejemplo no limitativo, el promotor de NFH tiene 920 nucleótidos. Como ejemplo no limitativo, el constructo puede ser AAV-promotor-CMV/intrón de globina-hFXN-RBG, en el que el AAV puede ser autocomplementario y el AAV puede tener el serotipo DJ.
En una realización, el genoma de vector comprende un promotor de scn8a. El promotor de scn8a puede tener un tamaño de 450-500 nucleótidos. Como ejemplo no limitativo, el promotor de scn8a tiene 470 nucleótidos. Como ejemplo no limitativo, el constructo puede ser AAV-promotor-CMV/intrón de globina-hFXN-RBG, en el que el AAV puede ser autocomplementario y el AAV puede tener el serotipo DJ.
En una realización, el genoma de vector comprende un promotor de FXN.
En una realización, el genoma de vector comprende un promotor de PGK.
En una realización, el genoma de vector comprende un promotor de CBA.
En una realización, el genoma de vector comprende un promotor de CMV.
En una realización, el genoma de vector comprende un promotor de hígado o músculo esquelético. Los ejemplos no limitativos de promotores de hígado incluyen hAAT y TBG. Los ejemplos no limitativos de promotores de músculo esquelético incluyen desmina, MCK y C5-12.
En una realización, el vector de expresión comprende un elemento potenciador, un promotor y/o un intrón 5'-UTR. El potenciador puede ser, pero no se limita a, un potenciador de CMV, el promotor puede ser, pero no se limita a, un promotor de CMV, CBA, UBC, GUSB, NSE, sinapsina, MeCP2 y GFAP, y el intrón 5'-UTR puede ser, pero no se limita a, de SV40 y CBA-MVM. Como ejemplo no limitativo, el potenciador, el promotor y/o el intrón usados en combinación pueden ser: (1) potenciador de c Mv , promotor de CMV, intrón 5'-UTR de SV40; (2) potenciador de CMV, promotor de CBA, intrón 5'-Ut R de SV40; (3) potenciador de CMV, promotor de CBA, intrón 5'-UTR de CBA-MVM; (4) promotor de UBC; (5) promotor de GUs B; (6) promotor de Ns E; (7) promotor de sinapsina; (8) promotor de MeCP2 y (9) promotor de GFAP.
En una realización, el vector de expresión tiene un promotor modificado por ingeniería.
Intrones
En una realización, el genoma de vector comprende al menos un elemento para potenciar la especificidad y expresión de la diana del transgén (véase, por ejemplo, Powell et al. Viral Expression Cassette Elements to Enhance Transgene Target Specificity and Expression in Gene Therapy, 2015), tal como un intrón. Los ejemplos no limitativos de intrones incluyen MVM (67-97 pb), intrón 1 truncado de F.IX (300 pb), aceptor de corte y empalme de cadena pesada de inmunoglobulina/p-globina SD (250 pb), donante de corte y empalme de adenovirus/aceptor de corte y empalme de inmunoglobina (500 pb), donante de corte y empalme de SV40 tardío/aceptor de corte y empalme (19S/16S) (180 pb) y donante de corte y empalme de adenovirus híbrido/aceptor de corte y empalme de IgG (230 pb).
En una realización, el intrón puede tener 100-500 nucleótidos de longitud. El intrón puede tener una longitud de 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 171, 172, 173, 174, 175, 176, 177, 178, 179, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 260, 270, 280, 290, 300, 310, 320, 330, 340, 350, 360, 370, 380, 390, 400, 410, 420, 430, 440, 450, 460, 470, 480, 490 ó 500. El promotor puede tener una longitud de entre 80-100, 80-120, 80-140, 80-160, 80-180, 80-200, 80-250, 80-300, 80-350, 80-400, 80-450, 80-500, 200-300, 200-400, 200-500, 300-400, 300-500 ó 400-500.
Introducción en células
Los polinucleótidos moduladores de la invención pueden introducirse en células huésped usando cualquiera de una variedad de enfoques. Puede verse afectada la infección con un vector viral que comprende el polinucleótido modulador. Los ejemplos de vectores virales adecuados incluyen vectores adenovirales, vectores adenoasociados, vectores lentivirales y vectores retrovirales defectuosos en la replicación.
Según la presente invención, los vectores virales para su uso en terapéutica y/o diagnóstico comprenden un virus que se ha destilado o reducido a los componentes mínimos necesarios para la transducción de un cargamento o una carga activa de ácido nucleico de interés.
De esta manera, se modifican por ingeniería los vectores virales como vehículos para su administración específica al tiempo que carecen de características perjudiciales de replicación y/o integración halladas en un virus de tipo natural.
Tal como se usa en el presente documento, un “vector” es cualquier molécula o resto que transporta, transduce o actúa de otro modo como portador de una molécula heteróloga tal como los polinucleótidos moduladores de la invención. Un “vector viral” es un vector que comprende una o más regiones de polinucleótido que codifican para o que comprenden moléculas de carga activa de interés, por ejemplo, un transgén, un polinucleótido que codifica para un polipéptido o multipolipéptido o un ácido nucleico modulador. Los vectores virales de la presente invención pueden producirse de manera recombinante y pueden estar basados en secuencias de virus adenoasociado (AAV) originales o de referencia. Los serotipos que pueden ser útiles en la presente invención incluyen cualquiera de lo que surgen de AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV9.47, AAV9(hul4), AAV10, AAV11, AAV12, AAVrh8, AAVrh10, AAV-DJ y AAV-DJ8.
En una realización, el serotipo que puede ser útil en la presente invención puede ser AAV-DJ8. La secuencia de aminoácidos de AAV-DJ8 puede comprender dos o más mutaciones para eliminar el dominio de unión a heparina (HBD). Como ejemplo no limitativo, la secuencia de AAV-DJ, descrita como SEQ ID NO: 1 en la patente estadounidense n.° 7.588.772, puede comprender dos mutaciones: (1) R587Q en la que la arginina (R; Arg) en el aminoácido 587 se cambia a glutamina (Q; Gln) y (2) R590T en la que la arginina (R; Arg) en el aminoácido 590 se cambia atreonina (T; Thr). Como otro ejemplo no limitativo, puede comprender tres mutaciones: (1) K406R en la que la lisina (K; Lys) en el aminoácido 406 se cambia a arginina (R; Arg), (2) R587Q en la que la arginina (R; Arg) en el aminoácido 587 se cambia a glutamina (Q; Gln) y (3) R590T en la que la arginina (R; Arg) en el aminoácido 590 se cambia a treonina (T; Thr).
Los vectores de AAV también pueden comprender vectores de AAV autocomplementarios (scAAV). Los vectores de scAAV contienen ambas hebras de ADN que se hibridan entre sí para formar un ADN bicatenario. Omitiendo la síntesis de la segunda hebra, los scAAV permiten la rápida expresión en la célula.
En una realización, el vector de AAV usado en la presente invención es un scAAV.
En una realización, los polinucleótidos moduladores pueden introducirse en células de cualquier especie relevante, tal como, pero sin limitarse a, humano, perro, ratón, rata o mono.
En una realización, los polinucleótidos moduladores pueden introducirse en células que son relevantes para la enfermedad que va a tratarse. Como ejemplo no limitativo, la enfermedad es ELA y las células diana son neuronas motoras y astrocitos.
En una realización, los polinucleótidos moduladores pueden introducirse en células que tienen un alto nivel de expresión endógena de la secuencia diana.
En otra realización, los polinucleótidos moduladores pueden introducirse en células que tienen un bajo nivel de expresión endógena de la secuencia diana.
En una realización, las células pueden ser aquellas que tienen una alta eficiencia de transducción de AAV.
En una realización, las células que pueden usarse para el análisis in vitro de los polinucleótidos moduladores incluyen, pero no se limitan a, HEK293, HeLa, astrocitos primarios humanos, línea celular de astrocitos humanos (U251MG), neuronas SH-SY5Y y progenitores de neuronas motoras derivados de iPSC humanas.
Ácidos nucleicos diana
Los polinucleótidos moduladores de la invención pueden seleccionar como diana cualquier constructo de ácido nucleico o gen que incluya genes codificantes y no codificantes. Pueden seleccionarse como diana genes (ADN o ARNm) que codifican para proteínas humanas o de primate. Además, también pueden seleccionarse como diana genes no codificantes, por ejemplo, ARN no codificantes largos (ARNncl).
La publicación internacional WO2012/018881 A2 enseña los ejemplos de tales moléculas de ARNncl y constructos de iARN diseñados para seleccionar como diana tal ARNncl, cualquier de los mismos pudiéndose seleccionar como diana por o codificarse en los polinucleótidos moduladores, respectivamente.
En una realización, los polinucleótidos moduladores de la invención pueden seleccionar como diana cualquier gen conocido en la técnica. Como ejemplo no limitativo, el gene puede ser SOD1.
En una realización, el polinucleótido modulador puede seleccionar como diana una secuencia de 15-19 nucleótidos de longitud. Como ejemplo no limitativo, la diana puede ser cualquiera de las secuencias descritas en la tabla 1. Como otro ejemplo no limitativo, la diana puede ser los nucleótidos 406-424 de NM_000454.4. Como aún otro ejemplo no limitativo, la diana puede ser los nucleótidos 645-661 de NM_000454.4.
En una realización, el polinucleótido modulador puede seleccionar como diana una secuencia de 21 nucleótidos de longitud. En un aspecto, la diana puede ser cualquier secuencia de 21 meros de NM_000454.4 o cualquier gen conocido en la técnica. Como ejemplo no limitativo, la diana puede ser los nucleótidos 521-541 de NM_000454.4. Como otro ejemplo no limitativo, la diana puede ser los nucleótidos 639-659 de NM_000454.4. Como otro ejemplo no limitativo, la diana puede ser los nucleótidos 640-660 de NM_000454.4. Como otro ejemplo no limitativo, la diana puede ser los nucleótidos 645-665 de NM_000454.4. Como otro ejemplo no limitativo, la diana puede ser los nucleótidos 664-684 de NM_000454.4.
En una realización, el polinucleótido modulador puede diseñarse para seleccionar como diana cualquier gen o ARNm en el genoma humano, por ejemplo, genes asociados con trastornos del SNC tales como, pero sin limitarse a, enfermedad Huntington, ELA y similares.
Composiciones farmacéuticas
Aunque las descripciones de las composiciones farmacéuticas, por ejemplo, los polinucleótidos moduladores (incluyendo los vectores de expresión o plásmidos codificantes, tales como virus, por ejemplo, AAV) que comprenden una carga activa que va a administrarse, proporcionadas en el presente documento se refieren principalmente a composiciones farmacéuticas que son adecuadas para su administración a humanos, el experto en la técnica entenderá que tales composiciones son generalmente adecuadas para su administración a cualquier otro animal, por ejemplo, a animales no humanos, por ejemplo, mamíferos no humanos. La modificación de las composiciones farmacéuticas adecuadas para su administración a humanos para hacer que las composiciones sean adecuadas para su administración a diversos animales se entiende bien, y el farmacólogo veterinario con conocimientos ordinarios, puede diseñar y/o realizar tal modificación simplemente con experimentación habitual, si la hay. Los sujetos para los que se contempla la administración de las composiciones farmacéuticas incluyen, pero no se limitan a, humanos y/u otros primates; mamíferos, incluyendo mamíferos comercialmente relevantes tales como ganado bovino, cerdos, caballos, ovejas, gatos, perros, ratones y/o ratas; y/o aves, incluyendo aves comercialmente relevantes tales como aves de corral, pollos, patos, ocas y/o pavos.
En algunas realizaciones, las composiciones se administran a humanos, pacientes o sujetos humanos. Para los propósitos de la presente divulgación, la expresión “principio activo” se refiere generalmente o bien al vector viral que porta la carga activa o bien a la molécula de carga activa de polinucleótido modulador administrada por un vector viral tal como se describe en el presente documento.
Las formulaciones de las composiciones farmacéuticas tal como se describen en el presente documento pueden prepararse mediante cualquier método conocido o desarrollado de aquí en adelante en la técnica de farmacología. En general, tales métodos de preparación incluyen la etapa de poner el principio activo en asociación con un excipiente y/o uno o más de otros componentes auxiliares y, después, si es necesario y/o deseable, dividir, conformar y/o envasar el producto en una unidad de dosis única o múltiple.
Las cantidades relativas del principio activo, el excipiente farmacéuticamente aceptable y/o cualquier componente adicional en una composición farmacéutica variarán dependiendo de la identidad, el tamaño y/o el estado del sujeto tratado y, además, dependiendo de la vía por la que va a administrarse la composición.
Formulación
Los polinucleótidos moduladores o vectores virales que codifican para los mismos pueden formularse usando uno o más excipientes para: (1) aumentar la estabilidad; (2) aumentar la transfección o transducción celular; (3) permitir la liberación sostenida o retardada; o (4) alterar la biodistribución (por ejemplo, dirigir el vector viral a tejidos o tipos de células específicos).
Las formulaciones pueden incluir, sin limitación, solución salina, lipidoides, liposomas, nanopartículas lipídicas, polímeros, lipoplejos, nanopartículas de núcleo-cubierta, péptidos, proteínas, células transfectadas con vectores virales (por ejemplo, para el trasplante a un sujeto), imitadores de nanopartículas y combinaciones de los mismos. Además, los vectores virales de la presente invención pueden formularse usando nanopartículas de ácido nucleico autoensambladas.
Las formulaciones de las composiciones farmacéuticas tal como se describen en el presente documento pueden prepararse mediante cualquier método conocido o desarrollado de aquí en adelante en la técnica de farmacología. En general, tales métodos de preparación incluyen la etapa de asociar el principio activo con un excipiente y/o uno o más de otros componentes auxiliares.
Una composición farmacéutica según la presente divulgación puede prepararse, envasarse y/o comercializarse a granel, como una única dosis unitaria y/o como una pluralidad de unicas dosis unitarias. Tal como se usa en el presente documento, una “dosis unitaria” se refiere a una cantidad discreta de la composición farmacéutica que comprende una cantidad predeterminada del principio activo. La cantidad del principio activo es generalmente igual a la dosificación del principio activo que se administraría a un sujeto y/o una fracción conveniente de una dosificación de este tipo, tal como, por ejemplo, la mitad o un tercio de una dosificación de este tipo.
Las cantidades relativas del principio activo, el excipiente farmacéuticamente aceptable y/o cualquier componente adicional en una composición farmacéutica según la presente divulgación pueden variar dependiendo de la identidad, el tamaño y/o el estado del sujeto que está tratándose y, además, dependiendo de la vía por la que va a administrarse la composición. Por ejemplo, la composición puede comprender entre el 0,1% y el 99% (p/p) del principio activo. A modo de ejemplo, la composición puede comprender entre el 0,1% ye l 100%, por ejemplo, entre el 0,5 yel50% , entre el 1-30%, entre el 5-80%, al menos el 80% (p/p) del principio activo.
En algunas realizaciones, las formulaciones descritas en el presente documento pueden contener al menos una molécula de carga activa. Como ejemplo no limitativo, las formulaciones pueden contener 1, 2, 3, 4 ó 5 moléculas de carga activa de polinucleótido modulador. En una realización, la formulación puede contener un constructo de carga activa de polinucleótido modulador que selecciona como diana proteínas seleccionadas de categorías tales como, pero sin limitarse a, proteínas humanas, proteínas veterinarias, proteínas bacterianas, proteínas biológicas, anticuerpos, proteínas inmunogénicas, péptidos y proteínas terapéuticos, proteínas secretadas, proteínas de la membrana plasmática, proteínas citoplásmicas y citoesqueléticas, proteínas unidas a la membrana intracelular, proteínas nucleares, proteínas asociadas con enfermedades humanas y/o proteínas asociadas con enfermedades no humanas. En una realización, la formulación contiene al menos tres constructos de carga activa que seleccionan como diana proteínas.
En algunas realizaciones, un excipiente farmacéuticamente aceptable puede ser al menos el 95%, al menos el 96%, al menos el 97%, al menos el 98%, al menos el 99% o el 100% puro. En algunas realizaciones, un excipiente está aprobado para su uso en humanos y para su uso veterinario. En algunas realizaciones, un excipiente puede estar aprobado por la Administración de Alimentos y Fármacos de los Estados Unidos. En algunas realizaciones, un excipiente puede ser de calidad farmacéutica. En algunas realizaciones, un excipiente puede cumplir las normas de la Farmacopea de Estados Unidos (USP), la Farmacopea Europea (EP), la Farmacopea Británica y/o la Farmacopea Internacional.
Los excipientes que se usan en el presente documento incluyen, pero no se limitan a, todos y cada uno de los disolventes, medios de dispersión, diluyentes u otros vehículos líquidos, adyuvantes de dispersión o suspensión, tensioactivos, agentes isotónicos, agentes espesantes o emulsionantes, conservantes y similares, según sea adecuada para la forma de dosificación particular deseada. En la técnica se conocen diversos excipientes para formular composiciones farmacéuticas y técnicas para preparar la composición (véase Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 21a edición, A. R. Gennaro, Lippincott, Williams & Wilkins, Baltimore, MD, 2006). El uso de un medio de excipiente convencional puede estar contemplado dentro del alcance de la presente divulgación, excepto en la medida en que cualquier medio de excipiente convencional pueda ser incompatible con una sustancia o sus derivados, tal como produciendo cualquier efecto biológico no deseable o interaccionando de otro modo de manera perjudicial con cualquier otro componente de la composición farmacéutica.
Los diluyentes a modo de ejemplo incluyen, pero no se limitan a, carbonato de calcio, carbonato de sodio, fosfato de calcio, fosfato de dicalcio, sulfato de calcio, hidrogenofosfato de calcio, fosfato de sodio, lactosa, sacarosa, celulosa, celulosa microcristalina, caolín, manitol, sorbitol, inositol, cloruro de sodio, almidón seco, almidón de maíz, azúcar en polvo, etc., y/o combinaciones de los mismos.
Principios inactivos
En algunas realizaciones, las formulaciones de polinucleótido modulador pueden comprender al menos un excipiente que es un principio inactivo. Tal como se usa en el presente documento, el término “principio inactivo” se refiere a uno o más agentes inactivos incluidos en las formulaciones. En algunas realizaciones, todos, ninguno o algunos de los principios inactivos que pueden usarse en las formulaciones pueden estar aprobados por la Administración de Alimentos y Fármacos (f Da ) de los Estados Unidos.
Las formulaciones de vectores virales que portan un polinucleótido modulador divulgado en el presente documento pueden incluir cationes o aniones. En una realización, las formulaciones incluyen cationes metálicos tales como, pero sin limitarse a, Zn2+, Ca2+, Cu2+, Mg2+ y combinaciones de los mismos. Como ejemplo no limitativo, las formulaciones pueden incluir polímeros y polinucleótidos moduladores complejados con un catión metálico (véanse, por ejemplo, las patentes estadounidenses n.os 6.265.389 y 6.555.525).
Administración
Los vectores virales que comprenden polinucleótidos moduladores de la presente invención pueden administrarse por cualquier vía que dé como resultado un resultado terapéuticamente eficaz. Estas incluyen, pero no se limitan a, enteral (al intestino), gastroenteral, epidural (a la duramadre), oral (por la boca), transdérmica, peridural, intracerebral (al cerebro), intracerebroventricular (a los ventrículos cerebrales), epicutánea (aplicación sobre la piel), intradérmica (a la propia piel), subcutánea (bajo la piel), administración nasal (por la nariz), intravenosa (a una vena), bolo intravenoso, gotero intravenoso, intraarterial (a una arteria), intramuscular (a un músculo), intracardiaca (al corazón), infusión intraósea (a la médula ósea), intratecal (al conducto vertebral), intraperitoneal, (infusión o inyección al peritoneo), infusión intravesical, intravítrea (por el ojo), inyección intracavernosa (a la cavidad patológica), intracavitaria (a la base del pene), administración intravaginal, intrauterina, administración extraamniótica, transdérmica (difusión a través de la piel intacta para la distribución sistémica), transmucosa (difusión a través de una membrana mucosa), transvaginal, insuflación (inhalación), sublingual, sublabial, enema, colirio (sobre la conjuntiva), en gotas para los oídos, auricular (en o por la oreja), bucal (dirigida hacia el pómulo), conjuntival, cutánea, dental (a un diente o dientes), electroósmosis, endocervical, endosinusial, endotraqueal, extracorpórea, hemodiálisis, infiltración, intersticial, intraabdominal, intraamniótica, intraarticular, intrabiliar, intrabronquial, intrabursal, intracartilaginosa (dentro de un cartílago), intracaudal (dentro de la cola de caballo), intracisternal (dentro de la cisterna magna cerebelomedular), intracorneal (dentro de la córnea), dental intracoronal, intracoronaria (dentro de las arterias coronarias), intracorporus cavernosum (dentro de los espacios dilatables del cuerpo cavernoso del pene), intradiscal (dentro de un disco), intraductal (dentro de un conducto de una glándula), intraduodenal (dentro del duodeno), intradural (dentro o por debajo de la dura), intraepidérmica (a la epidermis), intraesofágica (al esófago), intragástrica (dentro del estómago), intragingival (dentro de las encías), intraileal (dentro de la porción distal del intestino delgado), intralesional (dentro de o introducido directamente en una lesión localizada), intraluminal (dentro de una luz de un tubo), intralinfática (dentro de la linfa), intramedular (dentro de la cavidad medular de un hueso), intrameníngea (dentro de las meninges), intraocular (dentro del ojo), intraovárica (dentro del ovario), intrapericardiaca (dentro del pericardio), intrapleural (dentro de la pleura), intraprostática (dentro de la próstata), intrapulmonar (dentro de los pulmones o sus bronquios), intrasinusal (dentro de los senos nasales o periorbitales), intraespinal (dentro de la columna vertebral), intrasinovial (dentro de la cavidad sinovial de una articulación), intratendinosa (dentro de un tendón), intratesticular (dentro del testículo), intratecal (dentro del líquido cefalorraquídeo en cualquier nivel del eje cefalorraquídeo), intratorácica (dentro del tórax), intratubular (dentro de los túbulos de un órgano), intratumoral (dentro de un tumor), intratimpánica (dentro del oído medio), intravascular (dentro de un vaso o vasos), intraventricular (dentro de un ventrículo), iontoforesis (por medio de una corriente eléctrica en la que los iones de sales solubles migran hacia los tejidos del cuerpo), irrigación (bañar o lavar heridas abiertas o cavidades corporales), laríngea (directamente en la laringe), nasogástrica (por la nariz y al estómago), técnica de vendaje oclusivo (administración por vía tópica que después se cubre mediante un vendaje que ocluye el área), oftálmica (a la parte externa del ojo), orofaríngea (directamente en la boca y la faringe), parenteral, percutánea, periarticular, peridural, perineural, periodontal, rectal, respiratoria (dentro del aparato respiratorio por inhalación oral o nasal para un efecto local o sistémico), retrobulbar (detrás de la protuberancia o detrás del globo ocular), tejido blando, subaracnoidea, subconjuntival, submucosa, tópica, transplacentaria (atravesando o a través de la placenta), transtraqueal (a través de la pared de la tráquea), transtimpánica (atravesando o a través la cavidad timpánica), ureteral (al uréter), uretral (a la uretra), vaginal, bloqueo caudal, diagnóstico, bloqueo nervioso, perfusión biliar, perfusión cardiaca, fotoféresis o espinal. En realizaciones específicas, las composiciones pueden administrarse de tal manera que se les permita atravesar la barrera hematoencefálica, la barrera vascular u otra barrera epitelial. En una realización, una formulación para una vía de administración puede incluir al menos un principio inactivo.
Administración de dosis
La presente divulgación proporciona métodos que comprenden administrar vectores virales y sus complejos o carga activa de polinucleótido modulador según la invención a un sujeto que lo necesita. Las composiciones de vectores virales farmacéuticas, para la obtención de imágenes, de diagnóstico o profilácticas de los mismos pueden administrarse a un sujeto usando cualquier cantidad y cualquier vía de administración eficaz para prevenir, tratar, diagnosticar u obtener imágenes de una enfermedad, un trastorno y/o estado (por ejemplo, una enfermedad, un trastorno y/o estado relacionados con deficiencias de la memoria de trabajo). La cantidad exacta requerida variará de un sujeto a otro dependiendo de la especie, la edad y el estado general del sujeto, la gravedad de la enfermedad, la composición particular, su modo de administración, su modo de actividad y similares. Las composiciones se formulan normalmente en forma de dosificación unitaria para facilitar la administración y uniformidad de la dosificación. Sin embargo, se entenderá que la dosificación diaria total de las composiciones puede decidirla el médico responsable dentro del alcance del buen juicio médico. El nivel de dosis específico terapéuticamente eficaz, profilácticamente eficaz o apropiado para la obtención de imágenes para cualquier paciente particular dependerá de varios factores, incluyendo el trastorno que está tratándose y la gravedad del trastorno; la actividad del compuesto específico empleado; la composición específica empleada; la edad, el peso corporal, la salud general, el sexo y la dieta del paciente; el momento de la administración, la vía de administración y la tasa de excreción de la carga activa de polinucleótido modulador específica empleada; la duración del tratamiento; fármacos usados en combinación o por coincidencia con el compuesto específico empleado; y factores similares bien conocidos en las técnicas médicas.
En determinadas realizaciones, las composiciones farmacéuticas de vectores virales pueden administrarse a niveles de dosificación de polinucleótido modulador suficientes para administrar desde aproximadamente 0,0001 mg/kg hasta aproximadamente 100 mg/kg, desde aproximadamente 0,001 mg/kg hasta aproximadamente 0,05 mg/kg, desde aproximadamente 0,005 mg/kg hasta aproximadamente 0,05 mg/kg, desde aproximadamente 0,001 mg/kg hasta aproximadamente 0,005 mg/kg, desde aproximadamente 0,05 mg/kg hasta aproximadamente 0,5 mg/kg, desde aproximadamente 0,01 mg/kg hasta aproximadamente 50 mg/kg, desde aproximadamente 0,1 mg/kg hasta aproximadamente 40 mg/kg, desde aproximadamente 0,5 mg/kg hasta aproximadamente 30 mg/kg, desde aproximadamente 0,01 mg/kg hasta aproximadamente 10 mg/kg, desde aproximadamente 0,1 mg/kg hasta aproximadamente 10 mg/kg o desde aproximadamente 1 mg/kg hasta aproximadamente 25 mg/kg de peso corporal del sujeto al día, una o más veces al día, para obtener el efecto terapéutico, de diagnóstico, profiláctico o de obtención de imágenes deseado (véase, por ejemplo, el intervalo de dosis unitarias descrito en la publicación internacional n.° WO2013078199). La dosificación de polinucleótido modulador deseada puede administrarse más de una vez (por ejemplo, más de una administración en un día). En determinadas realizaciones, la dosificación de polinucleótido modulador deseada puede administrarse usando múltiples administraciones (por ejemplo, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, diez, once, doce, trece, catorce o más administraciones). Cuando se emplean múltiples administraciones, pueden usarse pautas posológicas divididas tales como las descritas en el presente documento. Tal como se usa en el presente documento, una “dosis dividida” es la división de una única dosis unitaria o dosis diaria total en dos o más dosis, por ejemplo, dos o más administraciones de la única dosis unitaria. Tal como se usa en el presente documento, una “única dosis unitaria” es una dosis de cualquier polinucleótido modulador terapéutico administrado en una dosis/de una vez/por vía única/en un punto de contacto único, es decir, un único evento de administración. Tal como se usa en el presente documento, una “dosis diaria total” es una cantidad dada o recetada en un periodo de 24 horas. Puede administrarse como una única dosis unitaria. En una realización, los vectores virales que comprenden los polinucleótidos moduladores de la presente invención se administran a un sujeto en dosis divididas. Pueden formularse en tampón sólo o en una formulación descrita en el presente documento.
En una realización, la administración de las composiciones a células comprende una tasa de administración definida por [VG/hora = ml/hora * VG/ml], en la que VG son los genomas virales, VG/ml es la concentración de la composición y ml/hora es la tasa de administración prolongada.
En una realización, la administración de composiciones a células puede comprender una concentración total por sujeto de entre aproximadamente 1x106 VG y aproximadamente 1x1016 VG. En algunas realizaciones, la administración puede comprender una concentración de composición de aproximadamente 1x106, 2x106, 3x106, 4x106, 5x106, 6x106, 7x106, 8x106, 9x106, 1x107, 2x107, 3x107, 4x107, 5x107, 6x107, 7x107, 8x107, 9x107, 1x108, 2x108, 3x108, 4x108, 5x108, 6x108, 7x108, 8x108, 9x108, 1x109, 2x109, 3x109, 4x109, 5x109, 6x109, 7x109, 8x109, 9x109, 1x1010, 2x101 4x1010, 5x1010, 6x1010, 7x1010, 8x1010, 9x1010, 1x1011, 2x1011, 2,1x1011, 2,2x1011, 2,3x1011, 2,4x1011, 2,5x1011 2,6x1011, 2,7x1011, 2,8x1011, 2,9x1011, 3x1011, 4x1011, 5x1011, 6x1011, 7x1011, 7,1x1011, 7,2x1011, 7,3x1011, 7,4x1011 7,5x1011, 7,6x1011, 7,7x1011, 7,8x1011, 7,9x1011, 8x1011, 9x1011, 1x1012, 1,1 x1012, 1,2x1012, 1,3x1012, 1,4x1012 1,5x1012, 1,6x1012, 1,7x1012, 1,8x1012, 1,9x1012, 2x1012, 3x1012, 4x1012, 4,1x1012, 4,2x1012, 4,3x1012, 4,4x1012 4,5x1012,4,6x1012, 4,7x1012, 4,8x1012, 4,9x1012, 5x1012, 6x1012, 7x1012, 8x1012, 8,1x1012, 8,2x1012, 8,3x1012, 8,4x1012 8,5x1012, 8,6x1012, 8,7x1012, 8,8 x1012, 8,9x1012, 9x1012, 1x1013, 2x1013, 3x1013, 4x1013, 5x1013, 6x1013, 6,7x1013 7x1013, 8x1013, 9x1013, 1x1014, 2x1014, 3x1014, 4x1014, 5x1014, 6x1014, 7x1014, 8x1014, 9x1014, 1x1015, 2x1015, 3x1015 4x1015, 5x1015, 6x1015, 7x1015, 8x1015, 9x1015 ó 1x1016 VG/sujeto.
En una realización, la administración de composiciones a células puede comprender una concentración total por sujeto de entre aproximadamente 1x106 VG/kg y aproximadamente 1x1016 VG/kg. En algunas realizaciones, la administración puede comprender una concentración de composición de aproximadamente 1x106, 2x106, 3x106, 4x106, 5x106, 6x106, 7x106, 8x106, 9x106, 1x107, 2x107, 3x107, 4x107, 5x107, 6x107, 7x107, 8x107, 9x107, 1x108, 2x108, 3x108, 4x108, 5x108, 6x108, 7x108, 8x108, 9x108, 1x109, 2x109, 3x109, 4x109, 5x109, 6x109, 7x109, 8x109, 9x109, 1x1010, 2x1010, 3x1010, 4x1010, 5x1010, 6x1010, 7x1010, 8x1010, 9x1010, 1x1011, 2x1011, 2,1x1011, 2,2x1011, 2,3x1011, 2,4x1011, 2,5x1011, 2,6x1011, 2,7x1011, 2,8x1011, 2,9x1011, 3x1011, 4x1011, 5x1011, 6x1011, 7x1011, 7,1x1011, 7,2x1011, 7,3x1011, 7,4x1011, 7,5x1011, 7,6x1011, 7,7x1011, 7,8x1011, 7,9x1011, 8x1011, 9x1011, 1x1012, 1,1 x1012, 1,2x1012, 1,3x1012, 1,4x1012, 1,5x1012, 1,6x1012, 1,7x1012, 1,8x1012, 1,9x1012, 2x1012, 3x1012, 4x1012, 4,1x1012, 4,2x1012, 4,3x1012, 4,4x1012, 4,5x1012,4,6x1012, 4,7x1012, 4,8x1012, 4,9x1012, 5x1012, 6x1012, 7x1012, 8x1012, 8,1x1012, 8,2x1012, 8,3x1012, 8,4x1012, 8,5x1012, 8,6x1012, 8,7x1012, 8,8 x1012, 8,9x1012, 9x1012, 1x1013, 2x1013, 3x1013, 4x1013, 5x1013, 6x1013, 6,7x1013, 7x1013, 8x1013, 9x1013, 1x1014, 2x1014, 3x1014, 4x1014, 5x1014, 6x1014, 7x1014, 8x1014, 9x1014, 1x1015, 2x1015, 3x1015, 4x1015, 5x1015, 6x1015, 7x1015, 8x1015, 9x1015 ó 1x1016 VG/kg.
En una realización, pueden administrarse de aproximadamente 105 a 106 genomas virales (unidad) por dosis.
En una realización, la administración de las composiciones a células puede comprender una concentración total de entre aproximadamente 1x106 VG/ml y aproximadamente 1x1016 VG/ml. En algunas realizaciones, la administración puede comprender una concentración de composición de aproximadamente 1x106, 2x106, 3x106, 4x106, 5x106, 6x106, 7x106, 8x106, 9x106, 1x107, 2x107, 3x107, 4x107, 5x107, 6x107, 7x107, 8x107, 9x107, 1x108, 2x108, 3x108, 4x108, 5x108, 6x108, 7x108, 8x108, 9x108, 1x109, 2x109, 3x109, 4x109, 5x109, 6x109, 7x109, 8x109, 9x109, 1x1010, 2x10 4x1010, 5x1010, 6x1010, 7x1010, 8x1010, 9x1010, 1x1011, 2x1011, 3x1011, 4x1011, 5x1011, 6x1011, 7x1011, 8x1011, 9x1011, 1x1012, 1,1x1012, 1,2x1012, 1,3x1012, 1,4x1012, 1,5x1012, 1,6x1012, 1,7x1012, 1,8x1012, 1,9x1012, 2x1012, 2,1x1012, 2,2x1012, 2,3x1012, 2,4x1012, 2,5x1012, 2,6x1012, 2,7x1012, 2,8x1012, 2,9x1012, 3x1012, 3,1x1012, 3,2x1012, 3,3x1012, 3,4x1012, 3,5x1012, 3,6x1012, 3,7x1012, 3,8x1012, 3,9x1012, 4x1012, 4,1x1012, 4,2x1012, 4,3x1012, 4,4x1012, 4,5x1012, 4,6x1012, 4,7x1012, 4,8x1012, 4,9x1012, 5x1012, 6x1012, 7x1012, 8x1012, 9x1012, 1x1013, 2x1013, 3x1013, 4x1013, 5x1013, 6x1013, 6,7x1013, 7x1013, 8x1013, 9x1013, 1x1014, 2x1014, 3x1014, 4x1014, 5x1014, 6x1014, 7x1014, 8x1014, 9x1014, 1x1015, 2x1015, 3x1015, 4x1015, 5x1015, 6x1015, 7x1015, 8x1015, 9x1015ó 1x1016 VG/ml.
Combinaciones
Los vectores virales que comprenden el polinucleótido modulador pueden usarse en combinación con uno o más de otros agentes terapéuticos, profilácticos, de diagnóstico o para la obtención de imágenes. Por “en combinación con” no se pretende insinuar que los agentes deben administrarse al mismo tiempo y/o formularse para su administración en conjunto, aunque estos métodos de administración se encuentran dentro del alcance de la presente divulgación.
Las composiciones pueden administrarse simultáneamente con, antes de o posteriormente a uno o más de otros procedimientos terapéuticos o médicos deseados. En general, cada agente se administrará a una dosis y/o en un momento determinados para ese agente. En algunas realizaciones, la presente divulgación abarca la administración de composiciones terapéuticas, profilácticas, de diagnóstico o para la obtención de imágenes en combinación con agentes que pueden mejorar su biodisponibilidad, reducir y/o modificar su metabolismo, inhibir su excreción y/o modificar su distribución dentro del cuerpo.
Administración
En una realización, el vector viral que comprende un polinucleótido modulador puede administrarse o suministrarse usando los métodos para la administración de viriones de AAV descritos en la solicitud de patente europea n.° EP1857552.
En una realización, el vector viral que comprende un polinucleótido modulador puede administrarse o suministrarse usando los métodos para administrar proteínas usando los vectores de AAV descritos en la solicitud de patente europea n.° EP2678433.
En una realización, el vector viral que comprende un polinucleótido modulador puede administrarse o suministrarse usando los métodos para administrar moléculas de ADN usando los vectores de AAV descritos en la patente estadounidense n.° US 5858351.
En una realización, el vector viral que comprende un polinucleótido modulador puede administrarse o suministrarse usando los métodos para administrar ADN al torrente sanguíneo descritos en la patente estadounidense n.° US 6211163.
En una realización, el vector viral que comprende un polinucleótido modulador puede administrarse o suministrarse usando los métodos para administrar viriones de AAV descritos en la patente estadounidense n.° US 6325998.
En una realización, el vector viral que comprende un polinucleótido modulador puede administrarse o suministrarse usando los métodos para administrar ADN a células musculares descritos en la patente estadounidense n.° US 6335011.
En una realización, el vector viral que comprende un polinucleótido modulador puede administrarse o suministrarse usando los métodos para administrar ADN a células y tejidos musculares descritos en la patente estadounidense n.° US 6610290.
En una realización, el vector viral que comprende un polinucleótido modulador puede administrarse o suministrarse usando los métodos para administrar ADN a células musculares descritos en la patente estadounidense n.° US 7704492.
En una realización, el vector viral que comprende un polinucleótido modulador puede administrarse o suministrarse usando los métodos para administrar una carga activa a músculos esqueléticos descritos en la patente estadounidense n.° US 7112321.
En una realización, el vector viral puede administrarse o suministrarse usando los métodos para administrar una carga activa al sistema nervioso central descritos en la patente estadounidense n.° US 7588757.
En una realización, el vector viral que comprende un polinucleótido modulador puede administrarse o suministrarse usando los métodos para administrar una carga activa descritos en la patente estadounidense n.° US 8283151.
En una realización, el vector viral que comprende un polinucleótido modulador puede administrarse o suministrarse usando los métodos para administrar una carga activa para el tratamiento de la enfermedad de Alzheimer descritos en la patente estadounidense n.° US 8318687.
En una realización, el vector viral que comprende un polinucleótido modulador puede administrarse o suministrarse usando los métodos para administrar una carga activa descritos en la publicación de patente internacional n.° WO2012144446.
En una realización, el vector viral que comprende un polinucleótido modulador puede administrarse o suministrarse usando los métodos para administrar una carga activa usando un vector de administración de ácido glutámico descarboxilasa (GAD) descritos en la publicación de patente internacional n.° WO2001089583.
En una realización, el vector viral que comprende un polinucleótido modulador puede administrarse o suministrarse usando los métodos para administrar una carga activa descritos en la publicación de patente internacional n.° WO2001096587.
En una realización, el vector viral que comprende un polinucleótido modulador puede administrarse o suministrarse usando los métodos para administrar una carga activa a tejido muscular descritos en la publicación de patente internacional n.° WO2002014487.
En una realización, el vector viral que comprende un polinucleótido modulador puede administrarse o suministrarse usando los métodos para administrar una carga activa a células neurales descritos en la publicación de patente internacional n.° WO2012057363.
Las composiciones farmacéuticas de vectores virales descritas en el presente documento pueden caracterizarse por uno o más de biodisponibilidad, ventana terapéutica y/o volumen de distribución.
En una realización, pueden formularse los vectores virales que comprenden un polinucleótido modulador. Como ejemplo no limitativo, la baricidad y/u osmolalidad de la formulación pueden optimizarse para garantizar una distribución óptima del fármaco en el sistema nervioso central o en una región o un componente del sistema nervioso central.
En una realización, los vectores virales que comprenden un polinucleótido modulador pueden administrarse a un sujeto mediante administración por una única vía.
En una realización, los vectores virales que comprenden un polinucleótido modulador pueden administrarse a un sujeto mediante una vía de administración en múltiples sitios. A un sujeto se le pueden administrar los vectores virales que comprenden un polinucleótido modulador en 2, 3, 4, 5 o más de 5 sitios.
En una realización, a un sujeto se le pueden administrar los vectores virales que comprenden un polinucleótido modulador descritos en el presente documento usando una infusión en bolo.
En una realización, a un sujeto se le pueden administrar los vectores virales que comprenden un polinucleótido modulador descritos en el presente documento usando administración sostenida a lo largo de un periodo de minutos, horas o días. La tasa de infusión puede cambiarse dependiendo del sujeto, la distribución, la formulación u otro parámetro de administración.
En una realización, el catéter puede estar ubicado en más de un sitio en la columna vertebral para la administración en múltiples sitios. Los vectores virales que comprenden un polinucleótido modulador pueden administrarse mediante infusión continua y/o en bolo. Cada sitio de administración puede tener una pauta posológica diferente o puede usarse la misma pauta posológica para cada sitio de administración. Como ejemplo no limitativo, los sitios de administración pueden estar en la región cervical y lumbar. Como otro ejemplo no limitativo, los sitios de administración pueden estar en la región cervical. Como otro ejemplo no limitativo, los sitios de administración pueden estar en la región lumbar.
En una realización, se puede analizar la anatomía y patología de la columna vertebral de un sujeto antes de la administración de los vectores virales que comprenden un polinucleótido modulador descritos en el presente documento. Como ejemplo no limitativo, un sujeto con escoliosis puede tener una pauta posológica y/o ubicación del catéter diferentes en comparación con un sujeto sin escoliosis.
En una realización, la orientación de la columna vertebral del sujeto durante la administración de los vectores virales que comprenden un polinucleótido modulador puede ser vertical con respecto al suelo.
En otra realización, la orientación de la columna vertebral del sujeto durante la administración de los vectores virales que comprenden un polinucleótido modulador puede ser horizontal con respecto al suelo.
En una realización, la columna vertebral del sujeto puede estar en un ángulo con respecto al suelo durante la administración al sujeto de los vectores virales que comprenden un polinucleótido modulador. El ángulo de la columna vertebral del sujeto con respecto al suelo puede ser de al menos 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150 ó 180 grados.
En una realización, el método y la duración de la administración se eligen para proporcionar una transducción amplia en la médula espinal. Como ejemplo no limitativo, se usa la administración intratecal para proporciona una transducción amplia a lo largo de la longitud rostral-caudal de la médula espinal. Como otro ejemplo no limitativo, infusiones en múltiples sitios proporcionan una transducción más uniforme a lo largo de la longitud rostral-caudal de la médula espinal. Como aún otro ejemplo no limitativo, infusiones prolongadas proporcionan una transducción más uniforme a lo largo de la longitud rostral-caudal de la médula espinal.
Biodisponibilidad
Los vectores virales que comprenden un polinucleótido modulador de la presente invención, cuando se formulan en composiciones con agentes o vehículos de administración/formulación tal como se describen en el presente documento, pueden mostrar una biodisponibilidad aumentada en comparación con composiciones que carecen de agentes de administración tal como se describen en el presente documento. Tal como se usa en el presente documento, el término “biodisponibilidad” se refiere a la disponibilidad sistémica de una cantidad dada de un agente particular administrado a un sujeto. La biodisponibilidad puede evaluarse midiendo el área bajo la curva (AUC) o la concentración máxima en suero o plasma (Cmáx) de la forma inalterada de un compuesto tras la administración del compuesto a un mamífero. El AUC es una determinación del área bajo la curva representando gráficamente la concentración en suero o plasma de un compuesto en el eje de ordenadas (eje Y) frente al tiempo en el eje de abscisas (eje X). Generalmente, el AUC para un compuesto particular puede calcularse usando métodos conocidos por los expertos habituales en la técnica y tal como se describen en G. S. Banker, Modern Pharmaceutics, Drugs and the Pharmaceutical Sciences, v. 72, Marcel Dekker, Nueva York, Inc., 1996.
Los valores de Cmáx son concentraciones máximas de los compuestos logradas en suero o plasma de un sujeto tras la administración de los compuestos al sujeto. Los valores de Cmáx de los compuestos particulares pueden medirse usando métodos conocidos por los expertos habituales en la técnica. Tal como se usa en el presente documento, las expresiones “aumentar la biodisponibilidad” o “mejorar la farmacocinética” se refieren a acciones que pueden aumentar la disponibilidad sistémica de un vector viral de la presente invención (tal como se mide mediante AUC, Cmáx o Cmín) en un sujeto. En algunas realizaciones, tales acciones pueden comprender la administración conjunta con uno o más agentes de administración tal como se describen en el presente documento. En algunas realizaciones, la biodisponibilidad de vectores virales puede aumentar en al menos aproximadamente el 2%, al menos aproximadamente el 5%, al menos aproximadamente el 10%, al menos aproximadamente el 15%, al menos aproximadamente el 20%, al menos aproximadamente el 25%, al menos aproximadamente el 30%, al menos aproximadamente el 35%, al menos aproximadamente el 40%, al menos aproximadamente el 45%, al menos aproximadamente el 50%, al menos aproximadamente el 55%, al menos aproximadamente el 60%, al menos aproximadamente el 65%, al menos aproximadamente el 70%, al menos aproximadamente el 75%, al menos aproximadamente el 80%, al menos aproximadamente el 85%, al menos aproximadamente el 90%, al menos aproximadamente el 95% o aproximadamente el 100%.
Ventana terapéutica
Los vectores virales que comprenden un polinudeótido modulador de la presente invención, cuando se formulan con uno o más agentes de administración tal como se describen en el presente documento, pueden mostrar aumentos de la ventana terapéutica de la administración de un compuesto y/o una composición en comparación con la ventana terapéutica de vectores virales administrados sin uno o más agentes de administración tal como se describen en el presente documento. Tal como se usa en el presente documento, el término “ventana terapéutica” se refiere al intervalo de concentraciones en plasma, o al intervalo de niveles de sustancia terapéuticamente activa en el sitio de acción, con una alta probabilidad de provocar un efecto terapéutico. En algunas realizaciones, las ventanas terapéuticas de los vectores virales, cuando se administran en una formulación, pueden aumentar en al menos aproximadamente el 2%, al menos aproximadamente el 5%, al menos aproximadamente el 10%, al menos aproximadamente el 15%, al menos aproximadamente el 20%, al menos aproximadamente el 25%, al menos aproximadamente el 30%, al menos aproximadamente el 35%, al menos aproximadamente el 40%, al menos aproximadamente el 45%, al menos aproximadamente el 50%, al menos aproximadamente el 55%, al menos aproximadamente el 60%, al menos aproximadamente el 65%, al menos aproximadamente el 70%, al menos aproximadamente el 75%, al menos aproximadamente el 80%, al menos aproximadamente el 85%, al menos aproximadamente el 90%, al menos aproximadamente el 95% o aproximadamente el 100%.
Volumen de distribución
Los vectores virales que comprenden un polinucleótido modulador de la presente invención, cuando se formulan con uno o más agentes de administración tal como se describen en el presente documento, pueden mostrar un volumen de distribución (Vdist) mejorado, por ejemplo, reducido o seleccionado como objetivo, con respecto a formulaciones que carecen de uno o más agentes de administración tal como se describen en el presente documento. El Vdist se refiere a la cantidad de un agente en el cuerpo con respecto a la concentración del mismo agente en la sangre o el plasma. Tal como se usa en el presente documento, el término “volumen de distribución” se refiere al volumen de fluido que se requeriría para contener la cantidad total de un agente en el cuerpo a la misma concentración que en la sangre o el plasma: Vdist es igual a la cantidad de un agente en el cuerpo/concentración del agente en la sangre o el plasma. Por ejemplo, para una dosis de 10 mg de un agente dado y una concentración en plasma de 10 mg/l, el volumen de distribución sería de 1 litro. El volumen de distribución refleja el grado al que un agente está presente en el tejido extravascular. Volúmenes de distribución grandes reflejan la tendencia de los agentes a unirse a los componentes del tejido en comparación con las proteínas plasmáticas. En entornos clínicos, el Vdist puede usarse para determinar las dosis de carga para lograr concentraciones en equilibrio. En algunas realizaciones, los volúmenes de distribución de las composiciones de vectores virales de la presente invención, cuando se administran conjuntamente con uno o más agentes de administración tal como se describen en el presente documento, pueden disminuir en al menos aproximadamente el 2%, al menos aproximadamente el 5%, al menos aproximadamente el 10%, al menos aproximadamente el 15%, al menos aproximadamente el 20%, al menos aproximadamente el 25%, al menos aproximadamente el 30%, al menos aproximadamente el 35%, al menos aproximadamente el 40%, al menos aproximadamente el 45%, al menos aproximadamente el 50%, al menos aproximadamente el 55%, al menos aproximadamente el 60%, al menos aproximadamente el 65%, al menos aproximadamente el 70%.
Kits y dispositivos
La divulgación proporciona una variedad de kits para llevar a cabo de manera conveniente y/o eficaz los métodos de la presente divulgación. Normalmente, los kits comprenderán cantidades y/o números suficientes de componentes para permitir al usuario realizar múltiples tratamientos de un(os) sujeto(s) y/o realizar múltiples experimentos.
Cualquiera de los vectores, constructos, polinucleótidos moduladores, polinucleótidos o polipéptidos de la presente invención pueden estar comprendidos en un kit. En algunas realizaciones, los kits pueden incluir además reactivos y/o instrucciones para crear y/o sintetizar compuestos y/o composiciones En algunas realizaciones, los kits también pueden incluir uno o más tampones. En algunas realizaciones, los kits pueden incluir componentes para elaborar matrices o bibliotecas de proteínas o ácidos nucleicos y, por tanto, pueden incluir, por ejemplo, soportes sólidos.
En algunas realizaciones, los componentes del kit pueden envasarse o bien en medios acuosos o bien en forma liofilizada. Los medios de recipiente de los kits incluirán generalmente al menos un vial, un tubo de ensayo, un matraz, un frasco, una jeringa u otros medios de recipiente, en los que puede estar situado un componente y, preferiblemente, tomarse alícuotas de manera adecuada. Cuando hay más de un componente de kit (el reactivo de marcaje y el marcador pueden envasarse juntos), los kits también pueden contener generalmente recipientes segundo, tercero u otro adicional en los que pueden estar situados por separado los componentes adicionales. En algunas realizaciones, los kits también pueden comprender un segundo medio de recipiente para contener tampones y/u otros diluyentes farmacéuticamente aceptables y estériles. En algunas realizaciones, pueden estar comprendidas diversas combinaciones de componentes en uno o más viales. Los kits también pueden incluir normalmente medios para contener los compuestos y/o las composiciones, por ejemplo, recipientes de proteínas, ácidos nucleicos y cualquier otro reactivo en confinamiento próximo para su venta comercial. Tales recipientes pueden incluir recipientes de plástico moldeados por inyección o soplado en los que se guardan los viales deseados.
En algunas realizaciones, los componentes del kit se proporcionan en una y/o más disoluciones líquidas. En algunas realizaciones, las disoluciones líquidas son disoluciones acuosas, siendo particularmente preferidas las disoluciones acuosas estériles. En algunas realizaciones, los componentes del kit pueden proporcionarse como polvo(s) secado(s). Cuando los reactivos y/o componentes se proporcionan como polvos secos, tales polvos pueden reconstituirse mediante la adición de volúmenes adecuados de disolvente. En algunas realizaciones, se prevé que también pueden proporcionarse disolventes en otro medio de recipiente. En algunas realizaciones, se proporcionan colorantes de marcaje como polvos secados. En algunas realizaciones, se contempla que se proporcionan en los kits 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 120, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000 microgramos o al menos o como máxima esas cantidades de colorante secado. En tales realizaciones, el colorante puede resuspenderse después en cualquier disolvente adecuado, tal como DMSO.
En algunas realizaciones, los kits pueden incluir instrucciones para emplear los componentes del kit, así como el uso de cualquier otro reactivo no incluido en el kit. Las instrucciones pueden incluir variaciones que pueden implementarse.
Dispositivos
En algunas realizaciones, los compuestos y/o las composiciones pueden combinarse con, recubrirse sobre o incrustarse en un dispositivo. Los dispositivos pueden incluir, pero no se limitan a, implantes dentales, endoprótesis, sustitutos óseos, articulaciones artificiales, válvulas, marcapasos y/u otro dispositivo terapéutico implantable.
El presente documento proporciona dispositivos que pueden incorporar vectores virales que codifican para una o más moléculas de carga activa de polinucleótido modulador. Estos dispositivos contienen, en una formulación estable, los vectores virales que pueden administrarse inmediatamente a un sujeto que lo necesita, tal como un paciente humano.
Los dispositivos para administración pueden emplearse para administrar los vectores virales que comprenden un polinucleótido modulador de la presente invención según las pautas posológicas únicas, múltiples o divididas enseñadas en el presente documento.
Se contemplan métodos y dispositivos conocidos en la técnica para la administración múltiple a células, órganos y tejidos para su uso junto con los métodos y las composiciones divulgados en el presente documento. Estos incluyen, por ejemplo, aquellos métodos y dispositivos que tienen múltiples agujas, dispositivos híbridos que emplean, por ejemplo, luces o catéteres, así como dispositivos que utilizan mecanismos impulsados por calor, corriente eléctrica o radiación.
Los polinucleótidos moduladores de la presente invención pueden usarse en el tratamiento, la profilaxis o la mejora de cualquier enfermedad o trastorno caracterizado por la expresión aberrante o no deseada de la diana.
Definiciones
En diversas partes de la presente memoria descriptiva, los sustituyentes de los compuestos de la presente divulgación se divulgan en grupos o en series. Específicamente, se pretende que la presente divulgación incluya todas y cada una de las subcombinaciones individuales de los miembros de tales grupos y series.
Aproximadamente: tal como se usa en el presente documento, el término “aproximadamente” significa /- 10% del valor recitado.
Administrado en combinación: tal como se usa en el presente documento, el término “administrado en combinación” o “administración combinada” significa que dos o más agentes se administran a un sujeto al mismo tiempo o dentro de un intervalo de tal manera que puede haber un solapamiento de un efecto de cada agente sobre el paciente. En algunas realizaciones, se administran dentro de aproximadamente 60, 30, 15, 10, 5 ó 1 minuto el uno del otro. En algunas realizaciones, las administraciones de los agentes están espaciadas lo suficientemente próximas entre sí de tal manera que se consigue un efecto combinatorio (por ejemplo, sinérgico).
Animal: tal como se usa en el presente documento, el término “animal” se refiere a cualquier miembro del reino animal. En algunas realizaciones, “animal” se refiere a humanos en cualquier fase de desarrollo. En algunas realizaciones, “animal” se refiere a animales no humanos en cualquier fase de desarrollo. En determinadas realizaciones, el animal no humano es un mamífero (por ejemplo, un roedor, un ratón, una rata, un conejo, un mono, un perro, un gato, una oveja, ganado bovino, un primate o un cerdo). En algunas realizaciones, los animales incluyen, pero no se limitan a, mamíferos, aves, reptiles, anfibios, peces y gusanos. En algunas realizaciones, el animal es un animal transgénico, un animal modificado por ingeniería genética o un clon.
Aproximadamente: tal como se usa en el presente documento, el término “de manera aproximada” o “aproximadamente”, tal como se aplica a uno o más valores de interés, se refiere a un valor que es similar a un valor de referencia indicado. En determinadas realizaciones, el término “de manera aproximada” o “aproximadamente” se refiere a un intervalo de valores que se encuentra dentro del 25%, el 20%, el 19%, el 18%, el 17%, el 16%, el 15%, el 14%, el 13%, el 12%, el 11%, el 10%, el 9%, el 8%, el 7%, el 6%, el 5%, el 4%, el 3%, el 2%, el 1% o menos en cualquier dirección (superior o inferior) del valor de referencia indicado a menos que se indique lo contrario o resulte evidente de otro modo a partir del contexto (excepto cuando tal número exceda el 100% de un valor posible).
Asociado con: tal como se usa en el presente documento, los términos “asociado con”, “conjugado”, “conectado” “unido”, y “anclado”, cuando se usan con respecto a dos o más restos, significa que los restos están físicamente asociados o conectados entre sí, ya sea directamente o mediante uno o más restos adicionales que sirve como agente de unión, para formar una estructura que es suficientemente estable de modo que los restos permanecen físicamente asociados en las condiciones en las que se usa la estructura, por ejemplo, condiciones fisiológicas. No es necesario que una “asociación” sea estrictamente a través de enlaces químicos covalentes directos. También puede sugerir enlaces iónicos o de hidrógeno o una conectividad basada en hibridación suficientemente estable de tal manera que las entidades “asociadas” permanezcan físicamente asociadas.
Bifuncional: tal como se usa en el presente documento, el término “bifuncional” se refiere a cualquier sustancia, molécula o resto que puede realizar o que mantiene al menos dos funciones. Las funciones pueden afectar al mismo resultado o a un resultado diferente. La estructura que produce la función puede ser la misma o diferente.
Biocompatible: tal como se usa en el presente documento, el término “biocompatible” significa compatible con células, tejidos, órganos o sistemas vivos y que supone poco o ningún riesgo de lesión, toxicidad o rechazo por el sistema inmunitario.
Biodegradable: tal como se usa en el presente documento, el término “biodegradable” significa capaz de descomponerse en productos inocuos mediante la acción de los seres vivos.
Biológicamente activo: tal como se usa en el presente documento, la expresión “biológicamente activo” se refiere a una característica de cualquier sustancia que tiene actividad en un organismo y/o sistema biológico. Por ejemplo, se considera biológicamente activa una sustancia que, cuando se administra a un organismo, tiene un efecto biológico sobre ese organismo. En realizaciones particulares, un polinucleótido modulador de la presente invención puede considerarse biológicamente activo si incluso una porción de los polinucleótidos es biológicamente activa o imita una actividad considerada biológicamente relevante.
Células madre pluripotentes inducidas: tal como se usa en el presente documento, “células madre pluripotentes inducidas” son células que pueden inducirse para formar cualquiera de varios tipos de células distintos.
Compuesto: tal como se usa en el presente documento, se pretende que el término “compuesto” incluya todos los estereoisómeros, isómeros geométricos, tautómeros e isótopos de las estructuras representadas.
Los compuestos descritos en el presente documento pueden ser asimétricos (por ejemplo, tener uno o más estereocentros). Se consideran todos los estereoisómeros, tales como enantiómeros y diastereómeros, a menos que se indique lo contrario. Los compuestos de la presente divulgación que contienen átomos de carbono asimétricamente sustituidos pueden aislarse en formas ópticamente activas o racémicas. En la técnica se conocen métodos sobre cómo preparar formas ópticamente activas a partir de materiales de partida ópticamente activos, tal como mediante resolución de mezclas racémicas o mediante síntesis estereoselectiva. Muchos isómeros geométricos de olefinas, dobles enlaces C=N y similares también pueden estar presentes en los compuestos descritos en el presente documento, y todos de tales isómeros estables se contemplan en la presente divulgación. Se describen los isómeros geométricos cis y trans de los compuestos de la presente divulgación y pueden aislarse como una mezcla de isómeros o como formas isoméricas independientes.
Los compuestos de la presente divulgación también incluyen formas tautoméricas. Las formas tautoméricas son el resultado del intercambio de un enlace sencillo por un doble enlace adyacente y la migración concomitante de un protón. Las formas tautoméricas incluyen tautómeros prototrópicos que son estados de protonación isoméricos que tienen la misma fórmula empírica y carga total.
Los compuestos de la presente divulgación también incluyen todos los isótopos de los átomos que se encuentran en los productos intermedios o compuestos finales. “Isótopos” se refiere a átomos que tienen el mismo número atómico pero números másicos diferentes que son el resultado de un número diferente de neutrones en los núcleos. Por ejemplo, los isótopos de hidrógeno incluyen tritio y deuterio.
Los compuestos y las sales de la presente divulgación pueden prepararse en combinación con moléculas de disolvente o agua para formar solvatos e hidratos mediante métodos de rutina.
Conservado: tal como se usa en el presente documento, el término “conservado” se refiere a nucleótidos o residuos de aminoácido de una secuencia de polinucleótido o secuencia de polipéptido, respectivamente, que son aquellos que se encuentran inalterados en la misma posición de dos o más secuencias que están comparándose. Los nucleótidos o aminoácidos que están relativamente conservados son aquellos que están conservados entre secuencias más relacionadas que los nucleótidos o aminoácidos que aparecen en cualquier otra parte en las secuencias.
En algunas realizaciones, se dice que dos o más secuencias están “completamente conservadas” si son el 100% idénticas entre sí. En algunas realizaciones, se dice que dos o más secuencias están “altamente conservadas” si son al menos el 70% idénticas, al menos el 80% idénticas, al menos el 90% idénticas o al menos el 95% idénticas entre sí. En algunas realizaciones, se dice que dos o más secuencias están “altamente conservadas” si son aproximadamente el 70% idénticas, aproximadamente el 80% idénticas, aproximadamente el 90% idénticas, aproximadamente el 95%, aproximadamente el 98% o aproximadamente el 99% idénticas entre sí. En algunas realizaciones, se dice que dos o más secuencias están “conservadas” si son al menos el 30% idénticas, al menos el 40% idénticas, al menos el 50% idénticas, al menos el 60% idénticas, al menos el 70% idénticas, al menos el 80% idénticas, al menos el 90% idénticas o al menos el 95% idénticas entre sí. En algunas realizaciones, se dice que dos o más secuencias están “conservadas” si son aproximadamente el 30% idénticas, aproximadamente el 40% idénticas, aproximadamente el 50% idénticas, aproximadamente el 60% idénticas, aproximadamente el 70% idénticas, aproximadamente el 80% idénticas, aproximadamente el 90% idénticas, aproximadamente el 95% idénticas, aproximadamente el 98% idénticas o aproximadamente el 99% idénticas entre sí. La conservación de secuencia puede aplicarse a toda la longitud de un polinucleótido o polipéptido o puede aplicarse a una porción, región o característica de la misma.
Liberación controlada: tal como se usa en el presente documento, el término “ liberación controlada” se refiere a un perfil de liberación de composición farmacéutica o compuesto que se ajusta a un patrón de liberación particular para lograr un resultado terapéutico.
Cíclico o ciclado: tal como se usa en el presente documento, el término “cíclico” se refiere a la presencia de un bucle continuo. No es necesario que las moléculas cíclicas sean circulares, sólo unidas para formar una cadena ininterrumpida de subunidades.
Citostático: tal como se usa en el presente documento, “citostático” se refiere a inhibir, reducir, suprimir el crecimiento, la división o la multiplicación de una célula (por ejemplo, una célula de mamífero (por ejemplo, una célula humana)), una bacteria, un virus, un hongo, un protozoo, un parásito, un prion o una combinación de los mismos.
Citotóxico: tal como se usa en el presente documento, “citotóxico” se refiere a destruir o provocar un efecto perjudicial, tóxico o mortal sobre una célula (por ejemplo, una célula de mamífero (por ejemplo, una célula humana)), una bacteria, un virus, un hongo, un protozoo, un parásito, un prion o una combinación de los mismos.
Administración: tal como se usa en el presente documento, “administración” se refiere a la acción o manera de suministrar un compuesto, una sustancia, una entidad, un resto, un cargamento o una carga activa.
Agente de administración: tal como se usa en el presente documento, “agente de administración” se refiere a cualquier sustancia que facilita, al menos en parte, la administración in vivo de un polinucleótido modulador a células seleccionadas como diana.
Desestabilizado: tal como se usa en el presente documento, el término “ inestable”, “desestabilizar” o “región desestabilizante” significa una región o molécula que es menos estable que una forma de inicio, de tipo natural o nativa de la misma región o molécula.
Etiqueta detectable: tal como se usa en el presente documento, “etiqueta detectable” se refiere a uno o más marcadores, señales o restos que están unidos, incorporados o asociados con otra entidad que se detecta fácilmente mediante métodos conocidos en la técnica, incluyendo radiografía, fluorescencia, quimioluminiscencia, actividad enzimática, absorbancia y similares. Las etiquetas detectables incluyen radioisótopos, fluoróforos, cromóforos, enzimas, colorantes, iones metálicos, ligandos tales como biotina, avidina, estreptavidina y haptenos, puntos cuánticos y similares. Las etiquetas detectables pueden estar ubicadas en cualquier posición en los péptidos o las proteínas divulgados en el presente documento. Pueden estar dentro de los aminoácidos, los péptidos o las proteínas o ubicadas en los extremos N-terminal o C-terminal.
Diastereómero: tal como se usa en el presente documento, el término “diastereómero” significa estereoisómeros que no son imágenes especulares entre sí y no son superponibles entre sí.
Digerir: tal como se usa en el presente documento, el término “digerir” significa descomponer en partes o componentes más pequeños. Cuando se refiere a polipéptidos o proteínas, la digestión da como resultado la producción de péptidos.
Distal: tal como se usa en el presente documento, el término “distal” significa situado lejos del centro o de un punto o una región de interés.
Pauta posológica: tal como se usa en el presente documento, una “pauta posológica” es un programa de administración o régimen de tratamiento, profilaxis o cuidados paliativos determinado por el médico.
Enantiómero: tal como se usa en el presente documento, el término “enantiómero” significa cada forma ópticamente activa individual de un compuesto que tiene una pureza óptica o una exceso enantiomérico (tal como se determina mediante métodos convencionales en la técnica) de al menos el 80% (es decir, al menos el 90% de un enantiómero y como máximo el 10% del otro enantiómero), preferiblemente de al menos el 90% y más preferiblemente de al menos el 98%.
Encapsular, tal como se usa en el presente documento, el término “encapsular” significa encerrar, rodear o recubrir.
Modificado por ingeniería: tal como se usa en el presente documento, las realizaciones están “modificadas por ingeniería” cuando se diseñan para tener una característica o propiedad, ya sea estructural o química, que varía a partir de una molécula de inicio, de tipo natural o nativa.
Cantidad eficaz: tal como se usa en el presente documento, el término “cantidad eficaz” de un agente es aquella cantidad suficiente para lograr resultados beneficiosos o deseados, por ejemplo, resultados clínicos, y, como tal, una “cantidad eficaz” depende del contexto en el que esté aplicándose. Por ejemplo, en el contexto de administrar un agente para tratar el cáncer, una cantidad eficaz de un agente es, por ejemplo, una cantidad suficiente para conseguir el tratamiento, tal como se define en el presente documento, del cáncer, en comparación con la respuesta obtenida sin la administración del agente.
Exosoma: tal como se usa en el presente documento, “exosoma” es una vesícula secretada por células de mamífero o un complejo implicado en la degradación del ARN.
Expresión: tal como se usa en el presente documento, “expresión” de una secuencia de ácido nucleico se refiere a uno o más de los siguientes eventos: (1) producción de un molde de ARN a partir de una secuencia de ADN (por ejemplo, mediante transcripción); (2) procesamiento de una transcrito de ARN (por ejemplo, mediante corte y empalme, edición, formación de caperuza en 5' y/o procesamiento en el extremo 3'); (3) traducción de un ARN en un polipéptido o una proteína; y (4) modificación postraduccional de un polipéptido o una proteína.
Característica: tal como se usa en el presente documento, una “característica” se refiere a un rasgo característico, una propiedad o un elemento distintivo.
Formulación: tal como se usa en el presente documento, una “formulación” incluye al menos un polinucleótido modulador y un agente de administración.
Fragmento: tal como se usa en el presente documento, un “fragmento” se refiere a una porción. Por ejemplo, los fragmentos de proteínas pueden comprender polipéptidos obtenidos digiriendo una proteína de longitud completa aislada de células cultivadas.
Funcional: tal como se usa en el presente documento, una molécula biológica “funcional” es una molécula biológica en una forma en la que muestra una propiedad y/o actividad por la que se caracteriza.
Homología: tal como se usa en el presente documento, el término “homología” se refiere al parentesco global entre moléculas poliméricas, por ejemplo, entre moléculas de ácido nucleico (por ejemplo, moléculas de ADN y/o moléculas de ARN) y/o entre moléculas de polipéptido. En algunas realizaciones, se considera que las moléculas poliméricas son “homólogas” entre sí si sus secuencias son al menos el 25%, el 30%, el 35%, el 40%, el 45%, el 50%, el 55%, el 60%, el 65%, el 70%, el 75%, el 80%, el 85%, el 90%, el 95% o el 99% idénticas o similares. El término “homólogas” se refiere necesariamente a una comparación entre al menos dos secuencias (secuencias de polinucleótido o polipéptido). Según la invención, se considera que dos secuencias de polinucleótido son homólogas si los polipéptidos que codifican son al menos aproximadamente el 50%, el 60%, el 70%, el 80%, el 90%, el 95% o incluso el 99% idénticas en al menos un tramo de al menos aproximadamente 20 aminoácidos. En algunas realizaciones, las secuencias de polinucleótido homólogas se caracterizan por la capacidad de codificar para un tramo de al menos 4-5 aminoácidos especificados de manera única. Para las secuencias de polinucleótido de menos de 60 nucleótidos de longitud, la homología se determina por la capacidad para codificar para un tramo de al menos 4-5 aminoácidos especificados de manera única. Según la invención, se considera que dos secuencias de proteína son homólogas si las proteínas son al menos aproximadamente el 50%, el 60%, el 70%, el 80% o el 90% idénticas en al menos un tramo de al menos aproximadamente 20 aminoácidos.
Identidad: tal como se usa en el presente documento, el término “ identidad” se refiere al parentesco global entre moléculas poliméricas, por ejemplo, entre moléculas de polinucleótido (por ejemplo, moléculas de ADN y/o moléculas de ARN) y/o entre moléculas de polipéptido. El cálculo del porcentaje de identidad de dos secuencias de polinucleótido, por ejemplo, puede realizarse alineando las dos secuencias con propósitos de comparación óptima (por ejemplo, pueden introducirse huecos en una o ambas de una primera y una segunda secuencias de ácido nucleico para la alineación óptima y pueden descartarse secuencias no idénticas con propósitos de comparación). En determinadas realizaciones, la longitud de una secuencia alineada con propósitos de comparación es al menos el 30%, al menos el 40%, al menos el 50%, al menos el 60%, al menos el 70%, al menos el 80%, al menos el 90%, al menos el 95% o el 100% de la longitud de la secuencia de referencia. Después se comparan los nucleótidos en las posiciones de nucleótido correspondientes. Cuando una posición en la primera secuencia está ocupada por el mismo nucleótido que la posición correspondiente en la segunda secuencia, entonces las moléculas son idénticas en esa posición. El porcentaje de identidad entre las dos secuencias es una función del número de posiciones idénticas compartidas por las secuencias, teniendo en cuenta el número de huecos, y la longitud de cada hueco, que es necesario introducir para una alineación óptima de las dos secuencias. La comparación de las secuencias y la determinación del porcentaje de identidad entre dos secuencias pueden lograrse usando un algoritmo matemático. Por ejemplo, el porcentaje de identidad entre dos secuencias de nucleótidos puede determinarse usando métodos tales como los descritos en Computational Molecular Biology, Lesk, A. M., ed., Oxford University Press, Nueva York, 1988; Biocomputing: Informatics and Genome Projects, Smith, D. W., ed., Academic Press, Nueva York, 1993; Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heinje, G., Academic Press, 1987; Computer Analysis of Sequence Data, parte I, Griffin, A. M. y Griffin, H. G., eds., Human Press, Nueva Jersey, 1994; y Sequence Analysis Primer, Gribskov, M. y Devereux, J., eds., M Stockton Press, Nueva York, 1991. Por ejemplo, el porcentaje de identidad entre dos secuencias de nucleótidos puede determinarse usando el algoritmo de Meyers y Miller (CABIOS, 1989, 4:11-17), que se ha incorporado en el programa ALIGN (versión 2.0) usando una tabla de residuos de peso PAM120, una penalización por longitud de hueco de 12 y una penalización por hueco de 4. El porcentaje de identidad entre dos secuencias de nucleótidos puede determinarse, alternativamente, usando el programa GAP en el paquete de software GCG usando una matriz NWSgapdna.CMP. Los métodos empleados habitualmente para determinar el porcentaje de identidad entre secuencias incluyen, pero no se limitan a, los divulgados en Carillo, H. y Lipman, D., SIAm J Applied Math., 48:1073 (1988). Las técnicas para determinar la identidad están codificadas en programas informáticos públicamente disponibles. Los software informáticos a modo de ejemplo para determinar la homología entre dos secuencias incluyen, pero no se limitan a, paquete de programa GCG, Devereux, J., et al., Nucleic Acids Research, 12(1), 387 (1984)), BLASTP, BLASTN y FASTA, Altschul, S. F. et al., J. Molec. Biol., 215, 403 (1990)).
Inhibir la expresión de un gen: tal como se usa en el presente documento, la expresión “ inhibir la expresión de un gen” significa provocar una reducción en la cantidad de un producto de expresión del gen. El producto de expresión puede ser un a Rn transcrito a partir del gen (por ejemplo, un ARNm) o un polipéptido traducido a partir de un ARNm transcrito a partir del gen. Normalmente, una reducción en el nivel de un ARNm da como resultado una reducción en el nivel de un polipéptido traducido a partir del mismo. El nivel de expresión puede determinarse usando técnicas convencionales para medir ARNm o proteína.
Isómero: tal como se usa en el presente documento, el término “ isómero” significa cualquier tautómero, estereoisómero, enantiómero o diastereómero de cualquier compuesto. Se reconoce que los compuestos pueden tener uno o más centros quirales y/o dobles enlaces y, por tanto, existir como estereoisómeros, tales como isómeros de doble enlace (es decir, isómeros E/Z geométricos) o diastereómeros (por ejemplo, enantiómeros (es decir, (+) o (-)) o isómero cis/trans). Según la invención, las estructuras químicas representadas en el presente documento y, por tanto, los compuestos abarcan todos los estereoisómeros correspondientes, es decir, tanto la forma estereoméricamente pura (por ejemplo, geométricamente pura, enantioméricamente pura o diastereoméricamente pura) como mezclas enantioméricas y estereoisoméricas, por ejemplo, racematos. Las mezclas enantioméricas y estereoisoméricas de los compuestos pueden resolverse normalmente en sus enantiómeros o estereoisómeros componentes mediante métodos bien conocidos, tales como cromatografía de gases en fase quiral, cromatografía de líquidos de alta resolución en fase quiral, cristalización del compuesto como complejo de sal quiral o cristalización del compuesto en un disolvente quiral. Los enantiómeros y estereoisómeros también pueden obtenerse a partir de productos intermedios, reactivos y catalizadores estereomérica o enantioméricamente puros mediante métodos de síntesis asimétrica bien conocidos.
In vitro: tal como se usa en el presente documento, el término “in vitro" se refiere a eventos que se producen en un entorno artificial, por ejemplo, en un tubo de ensayo o un recipiente de reacción, en un cultivo celular, en una placa de Petri, etc., en lugar de dentro de un organismo (por ejemplo, animal, planta o microbio).
In vivo: tal como se usa en el presente documento, el término “in vivo" se refiere a eventos que se producen dentro de un organismo (por ejemplo, animal, planta o microbio, o célula o tejido de los mismos).
Aislado: tal como se usa en el presente documento, el término “aislado” se refiere a una sustancia o entidad que se ha separado de al menos algunos de los componentes con los que estaba asociada (ya sea en la naturaleza o en un entorno experimental). Las sustancias aisladas pueden tener niveles variables de pureza en referencia a las sustancias a las que estaban asociadas. Las sustancias y/o entidades aisladas pueden separarse de al menos aproximadamente el 10%, aproximadamente el 20%, aproximadamente el 30%, aproximadamente el 40%, aproximadamente el 50%, aproximadamente el 60%, aproximadamente el 70%, aproximadamente el 80%, aproximadamente el 90% o más de los otros componentes con los que estaban asociados inicialmente. En algunas realizaciones, los agentes aislados son más de aproximadamente el 80%, aproximadamente el 85%, aproximadamente el 90%, aproximadamente el 91%, aproximadamente el 92%, aproximadamente el 93%, aproximadamente el 94%, aproximadamente el 95%, aproximadamente el 96%, aproximadamente el 97%, aproximadamente el 98%, aproximadamente el 99% o más de aproximadamente el 99% puros. Tal como se usa en el presente documento, una sustancia es “pura” si está sustancialmente libre de otros componentes.
Sustancialmente aislado: por “sustancialmente aislado” quiere decirse que el compuesto está sustancialmente separado del entorno en el que se formó o detectó. La separación parcial puede incluir, por ejemplo, una composición enriquecida en el compuesto de la presente divulgación. La separación sustancial pueden incluir composiciones que contienen al menos aproximadamente el 50%, al menos aproximadamente el 60%, al menos aproximadamente el 70%, al menos aproximadamente el 80%, al menos aproximadamente el 90%, al menos aproximadamente el 95%, al menos aproximadamente el 97% o al menos aproximadamente el 99% en peso del compuesto de la presente divulgación, o una sal del mismo. Los métodos para aislar compuestos y sus sales son rutinarios en la técnica.
Conector. tal como se usa en el presente documento, un conector se refiere a un grupo de átomos, por ejemplo, 10­ 1.000 átomos, y puede estar compuesto por átomos o grupos tales como, pero sin limitarse a, carbono, amino, alquilamino, oxígeno, azufre, sulfóxido, sulfonilo, carbonilo e imina. El conector puede unirse a un nucleósido o nucleótido modificado en la base nitrogenada o el resto de azúcar en un primer extremo, y a una carga activa, por ejemplo, un agente detectable o terapéutico, en un segundo extremo. El conector puede tener una longitud suficiente como para no interferir con su incorporación en una secuencia de ácido nucleico. El conector puede usarse para cualquier propósito útil, tal como para formar multímeros de polinucleótido modulador (por ejemplo, a través de la conexión de dos o más moléculas de polinucleótidos moduladores) o conjugados de polinucleótidos moduladores, así como para administrar una carga activa, tal como se describe en el presente documento. Los ejemplos de grupos químicos que pueden incorporarse en el conector incluyen, pero no se limitan a, alquilo, alquenilo, alquinilo, amido, amino, éter, tioéter, éster, alquileno, heteroalquileno, arilo o heterociclilo, cada uno de los cuales puede estar opcionalmente sustituido, tal como se describe en el presente documento. Los ejemplos de conectores incluyen, pero no se limitan a, alcanos insaturados, polietilenglicoles (por ejemplo, unidades monoméricas de etilenglicol o propilenglicol, por ejemplo, dietilenglicol, dipropilenglicol, trietilenglicol, tripropilenglicol, tetraetilenglicol o tetraetilenglicol) y polímeros de dextrano, y derivados de los mismos. Otros ejemplos incluyen, pero no se limitan a, restos escindibles dentro del conector, tales como, por ejemplo, un enlace disulfuro (-S-S-) o un enlace azoico (-N=N-), que pueden escindirse usando un agente reductor o fotólisis. Los ejemplos no limitativos de un enlace selectivamente escindible incluyen un enlace amido que puede escindirse, por ejemplo, mediante el uso de tris(2-carboxietil)fosfina (TCEP) u otros agentes reductores y/o fotólisis, así como un enlace éster que puede escindirse, por ejemplo, mediante hidrólisis ácida o básica.
Sitio de unión al microARN (miARN). tal como se usa en el presente documento, un sitio de unión al microARN (miARN) representa una ubicación o región de nucleótido de un transcrito de ácido nucleico al que se une al menos la región “semilla” de un miARN.
Modificado. tal como se usa en el presente documento, “modificado” se refiere a un estado o una estructura cambiados de una molécula de la invención. Las moléculas pueden modificarse de muchas maneras, incluyendo de manera química, estructural y funcional.
Que se produce de manera natural. tal como se usa en el presente documento, “que se produce de manera natural” significa que existe en la naturaleza sin ayuda artificial.
Anticuerpo neutralizante. tal como se usa en el presente documento, un “anticuerpo neutralizante” se refiere a un anticuerpo que se une a su antígeno y defiende a una célula de un antígeno o agente infeccioso neutralizando o suprimiendo cualquier actividad biológica que tenga.
Vertebrado no humano. tal como se usa en el presente documento, un “vertebrado no humano” incluye todos los vertebrados excepto Homo sapiens, incluyendo especies salvajes y domesticadas. Los ejemplos de vertebrados no humanos incluyen, pero no se limitan a, mamíferos tales como alpaca, banteng, bisón, camello, gato, ganado bovino, ciervo, perro, burro, gayal, cabra, cobaya, caballo, llama, mula, cerdo, conejo, reno, oveja, búfalo de agua y yak.
Efecto inespecífico. tal como se usa en el presente documento, “efecto inespecífico” se refiere a cualquier efecto no intencionado sobre una cualquiera o más dianas, genes o transcritos celulares.
Marco de lectura abierto. tal como se usa en el presente documento, “marco de lectura abierto” u “ORF” se refiere a una secuencia que no contiene un codón de terminación en un marco de lectura dado.
Conectado operativamente. tal como se usa en el presente documento, la expresión “conectado operativamente” se refiere a una conexión funcional entre dos o más moléculas, constructos, transcritos, entidades, restos o similares.
Opcionalmente sustituido: en el presente documento, se pretende que una expresión de la forma “X opcionalmente sustituido” (por ejemplo, alquilo opcionalmente sustituido) sea equivalente a “X, en el que X está opcionalmente sustituido” (por ejemplo, “alquilo, en el que el alquilo está opcionalmente sustituido”). No se pretende que signifique que la propia característica “X” (por ejemplo, alquilo) sea opcional.
Péptido. tal como se usa en el presente documento, un “péptido” tiene una longitud menor que o igual a 50 aminoácidos, por ejemplo, una longitud de aproximadamente 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45 ó 50 aminoácidos.
Paciente: tal como se usa en el presente documento, “paciente” se refiere a un sujeto que puede buscar o necesitar un tratamiento, requiere un tratamiento, está recibiendo un tratamiento, recibirá un tratamiento, o un sujeto que está bajo el cuidado de un profesional capacitado para una enfermedad o un estado particular.
Farmacéuticamente aceptable: la expresión “farmacéuticamente aceptable” se emplea en el presente documento para referirse a aquellos compuestos, materiales, composiciones y/o formas farmacéuticas que, dentro del alcance del buen juicio médico, son adecuados para su uso en contacto con los tejidos de seres humanos y animales sin excesiva toxicidad, irritación, respuesta alérgica u otro problema o complicación, acorde con una relación beneficio/riesgo razonable.
Excipientes farmacéuticamente aceptables: tal como se usa en el presente documento, la expresión “excipiente farmacéuticamente aceptable” se refiere a cualquier componente distinto de los compuestos descritos en el presente documento (por ejemplo, un vehículo capaz de suspender o disolver el compuesto activo) y que tiene las propiedades de ser sustancialmente no tóxico y no inflamatorio en un paciente. Los excipientes pueden incluir, por ejemplo: antiadherentes, antioxidantes, aglutinantes, recubrimientos, adyuvantes de compresión, disgregantes, colorantes (tintes), emolientes, emulsionantes, cargas (diluyentes), recubrimientos o formadores de película, aromatizantes, fragancias, deslizantes (potenciadores del flujo), lubricantes, conservantes, tintas de impresión, sorbentes, agentes de suspensión o dispersión, edulcorantes y aguas de hidratación. Los excipientes a modo de ejemplo incluyen, pero no se limitan a: hidroxitolueno butilado (BHT), carbonato de calcio, fosfato (dibásico) de calcio, estearato de calcio, croscarmelosa, polivinilpirrolidona reticulada, ácido cítrico, crospovidona, cisteína, etilcelulosa, gelatina, hidroxipropilcelulosa, hidroxipropilmetilcelulosa, lactosa, estearato de magnesio, maltitol, manitol, metionina, metilcelulosa, metilparabeno, celulosa microcristalina, polietilenglicol, polivinilpirrolidona, povidona, almidón pregelatinizado, propilparabeno, palmitato de retinilo, goma laca, dióxido de silicio, carboximetilcelulosa de sodio, citrato de sodio, glicolato sódico de almidón, sorbitol, almidón (maíz), ácido esteárico, sacarosa, talco, dióxido de titanio, vitamina A, vitamina E, vitamina C y xilitol.
Sales farmacéuticamente aceptables: la presente divulgación también incluye sales farmacéuticamente aceptables de los compuestos descritos en el presente documento. Tal como se usa en el presente documento, “sales farmacéuticamente aceptables” se refiere a derivados de los compuestos divulgados en los que el compuesto original se modifica mediante la conversión de un resto ácido o básico existente en su forma de sal (por ejemplo, haciendo reaccionar el grupo básico libre con un ácido orgánico adecuado). Los ejemplos de sales farmacéuticamente aceptables incluyen, pero no se limitan a, sales de ácidos minerales u orgánicos de residuos básicos tales como aminas; sales alcalinas u orgánicas de residuos ácidos tales como ácidos carboxílicos; y similares. Las sales de adición de ácido representativas incluyen sales de acetato, ácido acético, adipato, alginato, ascorbato, aspartato, bencenosulfonato, ácido bencenosulfónico, benzoato, bisulfato, borato, butirato, canforato, canforsulfonato, citrato, ciclopentanopropionato, digluconato, dodecilsulfato, etanosulfonato, fumarato, glucoheptonato, glicerofosfato, hemisulfato, heptonato, hexanoato, bromhidrato, clorhidrato, yodhidrato, 2-hidroxi-etanosulfonato, lactobionato, lactato, laurato, laurilsulfato, malato, maleato, malonato, metanosulfonato, 2-naftalenosulfonato, nicotinato, nitrato, oleato, oxalato, palmitato, pamoato, pectinato, persulfato, 3-fenilpropionato, fosfato, picrato, pivalato, propionato, estearato, succinato, sulfato, tartrato, tiocianato, toluenosulfonato, undecanoato, valerato y similares. Las sales de metales alcalinos o alcalinotérreos representativas incluyen sodio, litio, potasio, calcio, magnesio y similares, así como cationes no tóxicos de amonio, amonio cuaternario y amina, incluyendo, pero sin limitarse a, amonio, tetrametilamonio, tetraetilamonio, metilamina, dimetilamina, trimetilamina, trietilamina, etilamina y similares. Las sales farmacéuticamente aceptables de la presente divulgación incluyen las sales no tóxicas convencionales del compuesto original formado, por ejemplo, a partir de ácidos inorgánicos u orgánicos no tóxicos. Las sales farmacéuticamente aceptables de la presente divulgación pueden sintetizarse a partir del compuesto original que contiene un resto básico o ácido mediante métodos químicos convencionales. Generalmente, tales sales pueden prepararse haciendo reaccionar las formas de ácido o base libre de estos compuestos con una cantidad estequiométrica de la base o del ácido apropiados en agua o en un disolvente orgánico, o en una mezcla de los dos; generalmente, se prefieren medios no acuosos tales como éter, acetato de etilo, etanol, isopropanol o acetonitrilo. En Remington's Pharmaceutical Sciences, 17a ed., Mack Publishing Company, Easton, Pa., 1985, pág. 1418, Pharmaceutical Salts: Properties, Selection, and Use, P.H. Stahl y C.G. Wermuth (eds.), Wiley-VCH, 2008 y Berge et al., Journal of Pharmaceutical Science, 66, 1-19 (1977) se encuentran listas de sales adecuadas.
Solvato farmacéuticamente aceptable: tal como se usa en el presente documento, el término “solvato farmacéuticamente aceptable” significa un compuesto en el que se incorporan moléculas de un disolvente adecuado en la red cristalina. Un disolvente adecuado es fisiológicamente tolerable a la dosificación administrada. Por ejemplo, pueden prepararse solvatos mediante cristalización, recristalización o precipitación a partir de una disolución que incluye disolventes orgánicos, agua o una mezcla de los mismos. Los ejemplos de disolventes adecuados son etanol, agua (por ejemplo, monohidratos, dihidratos y trihidratos), N-metilpirrolidinona (NMP), dimetilsulfóxido (DMSO), N,N’-dimetilformamida (DMF), N,N’-dimetilacetamida (DMAC), 1,3-dimetil-2-imidazolidinona (DMEU), 1,3-dimetil-3,4,5,6-tetrahidro-2-(1H)-pirimidinona (DMPU), acetonitrilo (ACN), propilenglicol, acetato de etilo, alcohol bencílico, 2-pirrolidona, benzoato de bencilo y similares. Cuando el disolvente es agua, el solvato se denomina “hidrato”.
Farmacocinética: tal como se usa en el presente documento, “farmacocinética” se refiere a una cualquiera o más propiedades de una molécula o de un compuesto en lo que se refiere a la determinación del destino de las sustancias administradas a un organismo vivo. La farmacocinética se divide en varias áreas, incluyendo el grado y la tasa de absorción, distribución, metabolismo y excreción. Esto se denomina habitualmente ADME, en el que: (A) absorción es el proceso en el que una sustancia entra en el torrente sanguíneo; (D) distribución es la dispersión o diseminación de sustancias por todos los fluidos y tejidos del cuerpo; (M) metabolismo (o biotransformación) es la transformación irreversible de compuestos originales en metabolitos de segunda generación; y (E) excreción (o eliminación) se refiere a la eliminación de las sustancias del cuerpo. En casos poco frecuentes, algunos fármacos se acumulan de manera irreversible en el tejido corporal.
Fisicoquímico: tal como se usa en el presente documento, “fisicoquímico” significa o se refiere a una propiedad física y/o química.
Prevenir, tal como se usa en el presente documento, el término “prevenir” se refiere a retrasar parcial o completamente la aparición de una infección, una enfermedad, un trastorno y/o un estado; retrasar parcial o completamente la aparición de uno o más síntomas, características o manifestaciones clínicas de una infección, una enfermedad, un trastorno y/o un estado particular; retrasar parcial o completamente la aparición de uno o más síntomas, características o manifestaciones de una infección, una enfermedad, un trastorno y/o un estado particular; retrasar parcial o completamente la evolución de una infección, una enfermedad, un trastorno y/o un estado; y/o disminuir el riesgo de desarrollar patología asociada con la infección, la enfermedad, el trastorno y/o el estado.
Profármaco: la presente divulgación también incluye profármacos de los compuestos descritos en el presente documento. Tal como se usa en el presente documento, “profármacos” se refieren a cualquier sustancia, molécula o entidad que está en una forma predicada para esa sustancia, molécula o entidad para actuar como producto terapéutico tras una alteración química o física. Los profármacos pueden secuestrarse o unirse covalentemente en cierto modo y se liberan o convierten en el resto farmacológico activo antes de, tras o después de que se administren a un sujeto mamífero. Los profármacos pueden prepararse modificando los grupos funcionales presentes en los compuestos, de tal manera que las modificaciones se escinden, o bien en la manipulación rutinaria o bien in vivo, para dar los compuestos originales. Los profármacos incluyen compuestos en los que grupos hidroxilo, amino, sulfhidrilo o carboxilo están unidos a cualquier grupo que, cuando se administran a un sujeto mamífero, se escinde para formar un grupo hidroxilo, amino, sulfhidrilo o carboxilo libre, respectivamente. La preparación y el uso de profármacos se comenta en T. Higuchi y V. Stella, “Pro-drugs as Novel Delivery Systems”, vol. 14 del A.C.S. Symposium Series y en Bioreversible Carriers in Drug Design, ed. Edward B. Roche, American Pharmaceutical Association and Pergamon Press, 1987. En algunas realizaciones, los pri-miR de la invención pueden ser profármacos de los pre-miR. Del mismo modo, cualquier pri-miR o pre-miR puede ser un profármaco de los miR artificiales que se procesan a partir de los mismos.
Proliferar: tal como se usa en el presente documento, el término “proliferar” significa crecer, expandirse o aumentar, o provocar el crecimiento, la expansión o el aumento rápidamente. “Proliferativo” significa tener la capacidad de proliferar. “Antiproliferativo” significa tener propiedades contrarias o en oposición a las propiedades proliferativas.
Profiláctico: tal como se usa en el presente documento, “profiláctico” se refiere a un producto terapéutico o plan de acción usado para prevenir la propagación de una enfermedad.
Profilaxis: tal como se usa en el presente documento, “profilaxis” se refiere a una medida tomada para mantener la salud y prevenir la propagación de una enfermedad.
Sitio de escisión de proteína: tal como se usa en el presente documento, “sitio de escisión de proteína” se refiere a un sitio en el que puede conseguirse la escisión controlada de la cadena de aminoácidos por medios químicos, enzimáticos o fotoquímicos.
Señal de escisión de proteína: tal como se usa en el presente documento, “señal de escisión de proteína” se refiere a al menos un aminoácido que señala o marca un polipéptido para su escisión.
Proteína de interés: tal como se usa en el presente documento, los términos “proteínas de interés” o “proteínas deseadas” incluyen aquellas proporcionadas en el presente documentos y fragmentos, mutantes, variantes y alteraciones de las mismas.
Proximal: tal como se usa en el presente documento, el término “proximal” significa situado más cerca del centro o de un punto o una región de interés.
Purificado: tal como se usa en el presente documento, “purificar”, “purificado”, “purificación” significa hacer sustancialmente puro o libre de componentes no deseados, contaminación del material, mezcla o imperfección.
Muestra: tal como se usa en el presente documento, el término “muestra” o “muestra biológica” se refiere a un subconjunto de sus tejidos, células o partes componentes (por ejemplo, líquidos corporales, incluyendo, pero sin limitarse a, sangre, moco, líquido linfático, líquido sinovial, líquido cefalorraquídeo, saliva, líquido amniótico, sangre de cordón amniótico, orina, fluido vaginal y semen). Una muestra puede incluir además un homogeneizado, lisado o extracto preparado a partir de un organismo completo o un subconjunto de sus tejidos, células o partes componentes, o una fracción o porción de los mismos, incluyendo, pero sin limitarse a, por ejemplo, plasma, suero, líquido espinal, líquido linfático, las secciones externas de la piel, los aparatos respiratorio, intestinal y genitourinario, lágrimas, saliva, leche, células sanguíneas, tumores, órganos. Una muestra se refiere además a un medio, tal como un gel o caldo de nutrientes, que puede contener componentes celulares, tales como proteínas o molécula de ácido nucleico.
Secuencias señal: tal como se usa en el presente documento, la expresión “secuencias señal” se refiere a una secuencia que puede dirigir el transporte o la localización de una proteína.
Única dosis unitaria: tal como se usa en el presente documento, una “única dosis unitaria” es una dosis de cualquier producto terapéutico administrado en una dosis/de una vez/por vía única/en un punto de contacto único, es decir, un único evento de administración.
Similitud: tal como se usa en el presente documento, el término “similitud” se refiere al parentesco global entre moléculas poliméricas, por ejemplo, entre moléculas de polinucleótido (por ejemplo, moléculas de ADN y/o moléculas de ARN) y/o entre moléculas de polipéptido. El cálculo del porcentaje de similitud de moléculas poliméricas entre sí puede realizarse de la misma manera que el cálculo del porcentaje de identidad, excepto que el cálculo del porcentaje de similitud tiene en cuenta las sustituciones conservadoras tal como se entiende en la técnica.
Dosis dividida: tal como se usa en el presente documento, una “dosis dividida” es la división de una única dosis unitaria o dosis diaria total en dos o más dosis.
Estable: tal como se usa en el presente documento, “estable” se refiere a un compuesto que es lo suficientemente robusto como para sobrevivir al aislamiento hasta un grado de pureza útil a partir de una mezcla de reacción y, preferiblemente, que puede formularse para dar un agente terapéutico eficaz.
Estabilizado: tal como se usa en el presente documento, el término “estabilizar”, “estabilizado”, “región estabilizada” significa hacer que sea o volverse estable.
Estereoisómero: tal como se usa en el presente documento, el término “estereoisómero” se refiere a todos las formas isoméricas diferentes posibles, así como las conformacionales, que puede poseer un compuesto (por ejemplo, un compuesto de cualquier fórmula descrito en el presente documento), en particular todas las formas isoméricas estereoquímica y conformacionalmente posibles, todos los diastereómeros, enantiómeros y/o confórmeros de la estructura molecular básica. Algunos compuestos pueden existir en diferentes formas tautoméricas, incluyéndose todas ellas dentro del alcance de la presente invención tal como se define por las reivindicaciones.
Sujeto: tal como se usa en el presente documento, el término “sujeto” o “paciente” se refiere a cualquier organismo al que se le puede administrar una composición, por ejemplo, con propósitos experimentales, de diagnóstico, profilácticos y/o terapéuticos. Los sujetos típicos incluyen animales (por ejemplo, mamíferos tales como ratones, ratas, conejos, primates no humanos y humanos) y/o plantas.
Sustancialmente: tal como se usa en el presente documento, el término “sustancialmente” se refiere a la condición cualitativa de mostrar un nivel o grado total o casi total de una característica o propiedad de interés. Un experto habitual en las técnicas biológicas entenderá que los fenómenos biológicos y químicos con poca frecuencia, o casi nunca, llegan a completarse y/o avanzan hasta completar o conseguir o evitar un resultado absoluto. Por tanto, el término “sustancialmente” se usa en el presente documento para capturar la posible falta de completitud inherente en muchos fenómenos biológicos y químicos.
Sustancialmente igual: tal como se usa en el presente documento, en lo que se refiere a diferencias temporales entre dosis, el término significa más/menos 2%.
De manera sustancialmente simultánea: tal como se usa en el presente documento, y en lo que se refiere a una pluralidad de dosis, el término significa en el plazo de 2 segundos.
Que padece: un individuo “que padece” una enfermedad, un trastorno y/o un estado al que se le han diagnosticado o presenta uno o más síntomas de una enfermedad, un trastorno y/o un estado.
Propenso a: un individuo que es “propenso a” una enfermedad, un trastorno y/o un estado al que no se le han diagnosticado y/o puede no presentar síntomas de la enfermedad, el trastorno y/o el estado, pero tiene una propensión a desarrollar una enfermedad o sus síntomas. En algunas realizaciones, un individuo que es propenso a una enfermedad, un trastorno y/o un estado (por ejemplo, cáncer) puede caracterizarse por uno o más de los siguientes: (1) una mutación genética asociada con el desarrollo de la enfermedad, el trastorno y/o el estado; (2) un polimorfismo genético asociado con el desarrollo de la enfermedad, el trastorno y/o el estado; (3) expresión y/o actividad aumentada y/o disminuida de una proteína y/o un ácido nucleico asociados con la enfermedad, el trastorno y/o el estado; (4) hábitos y/o estilos de vida asociados con el desarrollo de la enfermedad, el trastorno y/o el estado; (5) antecedentes familiares de la enfermedad, el trastorno y/o el estado; y (6) exposición a y/o infección por un microbio asociado con el desarrollo de la enfermedad, el trastorno y/o el estado. En algunas realizaciones, un individuo que es propenso a una enfermedad, un trastorno y/o un estado desarrollará la enfermedad, el trastorno y/o el estado. En algunas realizaciones, un individuo que es propenso a una enfermedad, un trastorno y/o un estado no desarrollará la enfermedad, el trastorno y/o el estado.
Liberación sostenida: tal como se usa en el presente documento, el término “ liberación sostenida” se refiere a un perfil de liberación de composición farmacéutica o compuesto que se ajusta a una tasa de liberación a lo largo de un periodo de tiempo específico.
Sintético: El término “sintético” significa producido, preparado y/o fabricado de manera artificial. La síntesis de polinucleótidos o polipéptidos u otras moléculas puede ser química o enzimática.
Células seleccionadas como diana: tal como se usa en el presente documento, “células seleccionadas como diana” se refiere a una cualquiera o más células de interés. Las células pueden encontrarse in vitro, in vivo, in situ o en el tejido u órgano de un organismo. El organismo puede ser un animal, preferiblemente un mamífero, más preferiblemente un humano y lo más preferiblemente un paciente.
Agente terapéutico: el término “agente terapéutico” se refiere a cualquier agente que, cuando se administra a un sujeto, tiene un efecto terapéutico, de diagnóstico y/o profiláctico y/o provoca un efecto biológico y/o farmacológico deseado.
Cantidad terapéuticamente eficaz: tal como se usa en el presente documento, el término “cantidad terapéuticamente eficaz” significa una cantidad de un agente que va a administrarse (por ejemplo, ácido nucleico, fármaco, agente terapéutico, agente de diagnóstico, agente profiláctico, etc.) que es suficiente, cuando se administra a un sujeto que padece o es propenso a una infección, una enfermedad, un trastorno y/o un estado, para tratar, mejorar los síntomas de, diagnosticar, prevenir y/o retrasar la aparición de la infección, la enfermedad, el trastorno y/o el estado.
Resultado terapéuticamente eficaz: tal como se usa en el presente documento, el término “resultado terapéuticamente eficaz” significa un resultado que es suficiente en un sujeto que padece o es propenso a una infección, una enfermedad, un trastorno y/o un estado, para tratar, mejorar los síntomas de, diagnosticar, prevenir y/o retrasar la aparición de la infección, la enfermedad, el trastorno y/o el estado.
Dosis diaria total: tal como se usa en el presente documento, una “dosis diaria total” es una cantidad dada o recetada en un periodo de 24 horas. Puede administrarse como una única dosis unitaria.
Transfección: tal como se usa en el presente documento, el término “transfección” se refiere a métodos para introducir ácidos nucleicos exógenos en una célula. Los métodos de transfección incluyen, pero no se limitan a, métodos químicos, tratamientos físicos y lípidos catiónicos, o mezclas.
Tratar, tal como se usa en el presente documento, el término “tratar” se refiere a paliar, aliviar, mejorar, calmar, retrasar la aparición de, inhibir la evolución de, reducir la gravedad de y/o reducir la incidencia de uno o más síntomas o características de una infección, una enfermedad, un trastorno y/o un estado particular. Por ejemplo, “tratar” un cáncer puede hacer referencia a inhibir la supervivencia, el crecimiento y/o la diseminación de un tumor. El tratamiento puede administrarse a un sujeto que no muestra signos de una enfermedad, un trastorno y/o un estado y/o a un sujeto que muestra sólo signos tempranos de una enfermedad, un trastorno y/o un estado con el propósito de disminuir el riesgo de desarrollar patología asociada con la enfermedad, el trastorno y/o el estado.
No modificado: tal como se usa en el presente documento, “no modificado” se refiere a cualquier sustancia, compuesto o molécula antes de cambiarse de ninguna manera. No modificado puede hacer referencia, pero no siempre, a la forma de tipo natural o nativa de una biomolécula. Las moléculas pueden experimentar una serie de modificaciones mediante las cuales cada molécula modificada puede servir como molécula de inicio “no modificada” para una modificación posterior.
Equivalentes y alcance
No pretende limitarse el alcance de la presente invención a la descripción anterior, sino que más bien es tal como se expone en las reivindicaciones adjuntas.
En las reivindicaciones, los artículos tales como “un/o”, “una” y “el/la” pueden significar uno o más de uno a menos que se indique lo contrario o resulte evidente de otro modo a partir del contexto. Se considera que las reivindicaciones o descripciones que incluyen “o” entre uno o más miembros de un grupo quedan satisfechas si uno, más de uno o todos los miembros del grupo están presentes en, se emplean en o son relevantes de otro modo para un producto o procedimiento dado a menos que se indique lo contrario o resulte evidente de otro modo a partir del contexto. La invención incluye realizaciones en las que exactamente un miembro del grupo está presente en, se emplea en o es relevante de otro modo para un producto o procedimiento dado. La invención incluye realizaciones en las que más de uno o todos los miembros del grupo están presentes en, se emplean en o son relevantes de otro modo para un producto o procedimiento dado.
También cabe señalar que se pretende que el término “que comprende” sea abierto y permita, pero no requiera, la inclusión de elementos o etapas adicionales. Por tanto, cuando se usa el término “que comprende” en el presente documento, también está abarcado y se divulga el término “que consiste en”.
A menos que se defina lo contrario, todos los términos técnicos y científicos usados en el presente documento tienen el mismo significado que entiende habitualmente un experto habitual en la técnica a la que pertenece esta invención. Los métodos y materiales se describen en el presente documento para su uso en la presente divulgación; también pueden usarse otros métodos y materiales adecuados conocidos en la técnica.
Cuando se proporcionan intervalos, se incluyen los extremos. Además, debe entenderse que, a menos que se indique lo contrario o resulte evidente de otro modo a partir del contexto y la comprensión de un experto habitual en la técnica, los valores que se expresan como intervalos pueden asumir cualquier valor o subintervalo específico dentro de los intervalos indicados en diferentes realizaciones de la invención, hasta la décima parte de la unidad del límite inferior del intervalo, a menos que el contexto dicte claramente lo contrario.
No se pretende que los encabezados de las secciones y tablas sean limitativos.
Ejemplos
Ejemplo 1. Diseño de polinucleótidos moduladores (pri-microARN o pre-microARN artificiales)
Los pri-microARN o pre-microARN artificiales se diseñan como ARNhc o estructuras de tallo-bucle que codifican para un miR artificial (o ARNip artificial) que tiene al menos una hebra que puede hibridarse, al menos parcialmente, con un ácido nucleico diana, por ejemplo, ARN o ADN, y una o más de las siguientes características (a) un motivo UG en la base del tallo basal, (b) un motivo UGUG en el extremo 5' del bucle de miARN, (c) una uridina en el extremo 5' de la hebra guía, (d) una estructura de bucle derivada de un microARN canónico tal como miR-22, (e) un CNNC en la secuencia flanqueante en 3', (f) regiones flanqueantes de un microARN canónico tal como let-7b y/o (g) una o más protuberancias y apareamientos erróneos entre la hebra pasajera y la guía.
Una vez diseñada, la secuencia se modifica por ingeniería o se sintetiza o inserta en un plásmido o vector y se administra a una célula o a un organismo. Los plásmidos o vectores adecuados son cualquier que transduzca o transfecte la célula diana.
Pueden usarse vectores de virus adenoasociado (AAV), partículas virales o virus completos.
La administración da como resultado el procesamiento del polinucleótido modulador para generar el microARN artificial que altera los niveles de expresión del ácido nucleico diana.
La atenuación eficaz de una diana puede determinarse mediante métodos en la técnica y mostrarán pocos efectos, inespecíficos, si es que muestran alguno.
Los dúplex de hebra pasajera-guía eficaces de los polinucleótidos moduladores, por ejemplo, pri-microARN o premicroARN, demuestran una razón de hebra guía con respecto a pasajera superior al 95% cuando se mide el procesamiento.
Ejemplo 2. Optimización de las hebras pasajera-guía
Para conseguir que la atenuación de la diana o la modulación de la expresión de la diana sea específica y potente, las hebras pasajera y guía que formarán el tallo dúplex de la estructura de tallo-bucle del pri-microARN o pre-microARN de la invención pueden optimizarse por separado, por ejemplo, como ARNip (ARN de interferencia pequeños).
Los ARNip se diseñan contra un ácido nucleico diana de elección como ARNip canónicos que tienen un dúplex central de 19 pares de bases con una proyección dinucleotídica en 3' en el extremo 3' de las hebras del dúplex y en los que la hebra antisentido tiene una complementariedad perfecta con el ácido nucleico diana a lo largo de la región de 19 nucleótidos.
Alternativamente, los ARNip se diseñan de tal manera que la hebra sentido (hebra pasajera) comprende una identidad de menos de 19 nucleótidos con respecto al ácido nucleico diana.
Se realizan modificaciones en el apareamiento de bases del dúplex de hebras sentido-antisentido (pasajera-guía) para introducir protuberancias o apareamientos erróneos. Pueden incorporarse inserciones o deleciones o apareamientos erróneos en el extremo 5'-terminal o 3'-terminal de la hebra sentido, y estas inserciones o deleciones pueden reflejarse o no en la hebra guía.
Los ARNip resultantes se someten a prueba mediante métodos convencionales conocidos en la técnica para determinar la atenuación de la diana y otras propiedades fisiológicas y farmacocinéticas relevantes y para determinar el grado de efectos inespecíficos.
Después se modifican por ingeniería los ARNip que muestran una atenuación de la diana suficiente con pocos efectos inespecíficos, con o sin modificaciones adicionales, como las hebras pasajera y guía de los pri-microARN o premicroARN de la invención.
Ejemplo 3. Diseño de las hebras pasajera-guía para SOD1
En la modificación por ingeniería de las hebras pasajera y guía óptimas para los pri-microARN y/o pre-microARN de la invención, se eligió una serie de secuencias de hebra sentido (hebra pasajera) de 19 meros a partir de la secuencia de la superóxido dismutasa 1 (SOD1; referencia de GenBank NM_000454.4). La secuencia del ARNm de SOD1 (mostrada como ADN) es GTTTGGGGCCAGAGTGGGCGAGGCGCGGAGGTCTGGCCTATAAAGTAGTCGCGGAG ACGGGGTGCTGGTTTGCGTCGTAGTCTCCTGCAGCGTCTGGGGTTTCCGTTGCAGTC CTCGGAACCAGGACCTCGGCGTGGCCTAGCGAGTTATGGCGACGAAGGCCGTGTGC GT GCT GAAGGGCGACGGCCCAGTGCAGGGCAT CAT CAATTT CGAGCAGAAGGAAAG T AAT GGACCAGT GAAGGT GT GGGGAAGCATTA AAGGACT GACT GAAGGCCT GCAT G GATTCCATGTTCATGAGTTTGGAGATAATACAGCAGGCTGTACCAGTGCAGGTCCTC ACTTT AATCCT CT AT CCAG AAAACACGGT GGGCC AAAGGAT GAAGAGAGGCAT GTT GGAGACTT GGGCAAT GT GACT GCT GACAAAGAT GGTGT GGCCGAT GTGTCT ATT GA AGATT CT GTGAT CT CACTCT CAGGAGACCATT GCAT CATTGGCCGC ACACTGGTGGT CCAT GAAAAAGCAGAT GACTT GGGCAAAGGTGGAAAT GAAGAAAGTACAAAGACA GGAAACGCT GGAAGT CGTTT GGCTT GT GGT GTAATT GGGAT CGCCCA ATAAACATT C CCTT GG AT GT AGT CT GAGGCCCCTT AACT CAT CT GTT ATCCT GCT AGCTGT AGAAAT GT AT CCT GAT AAACATT AAACACT GT AAT CTT AAAAGT GTAATT GT GT GACTTTTT C AGAGTT GCTTT AAAGT ACCT GT AGT GAGAAACT GATTT AT GAT CACTT GGAAGATTT GT AT AGTTTTAT AAAACT CAGTT AAAAT GT CT GTTT C AAT GACCT GTATTTT GCCAGA CTT AAAT CACAGAT GGGT ATT AAACTT GT C AGAATTTCTTT GT CATT C AAGCCT GT G AAT AAAAACCCT GTAT GGC ACTTATT AT GAGGCT ATT AAAAGAAT CC AAATT CAAAC T A A A A A A AA A A A AA A A A A A (SEQ ID NO: 15).
Los 19 meros, junto con la posición más en 5’ de la hebra sentido se muestran en la tabla 4 junto con la hebra antisentido que es el complemento inverso de la hebra sentido.
Los 19 meros sirvieron como secuencias de inicio principales para el diseño del ARNip que va a someterse a prueba.
Tabla 4. 19 meros de SOD1
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Después se modificaron por ingeniería los pares sentido-antisentido de inicio principales de la tabla 4 anterior como ARNip dúplex. Al hacer eso, el nucleótido más en 3’ de la hebra sentido se cambió, en todos los casos, a un nucleótido de citidina (C) dejando entonces sólo 18 nucleótidos con identidad con la diana.
Después se añadió un terminal dinucleotídico al extremo 3’ de cada una de las hebras sentido y antisentido, produciendo los dúplex de la tabla 5.
Tabla 5. Dúplex de ARNip para SOD1
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Después se hibridaron los ARNip y se sometieron a prueba para determinar la atenuación de SOD1.
Ejemplo 4. Pri-microARN y pre-microARN que seleccionan como diana SOD1
Los dúplex de hebras pasajera-guía de los ARNip de SOD1 que se encontró que son eficaces a partir de los experimentos en el ejemplo 3 se modifican por ingeniería para dar vectores de expresión y se transfectan en células del sistema nervioso central o líneas de células nerviosas. Aunque la proyección utilizada en el estudio de atenuación de ARNip es una dTdT canónica para el ARNip, la proyección en los pri-MiR o pre-miR sintéticos puede comprender cualquier proyección dinucleotídica.
Las células usadas pueden ser células primarias o derivadas de células madre pluripotentes inducidas (células iPS). Después se mide la atenuación de SOD1 y se realiza una secuenciación profunda para determinar las hebras pasajera y guía exactas procesadas a partir de cada pri-microARN o pre-microARN administrado en el vector de expresión. Se calcula la razón de hebra guía con respecto a pasajera para determinar la eficiencia de atenuación, por ejemplo, del procesamiento del complejo de silenciamiento inducido por ARN (RISC).
Se somete a secuenciación el extremo N-terminal para determinar el sitio de escisión y para determinar el porcentaje de escisión homogénea de la diana. Se espera que la escisión sea superior al 90%.
Se transfectan conjuntamente células HeLa en un estudio paralelo para analizar la atenuación in vitro de SOD1. Se usa un constructo de luciferasa como control para determinar los efectos inespecíficos.
Se realiza de nuevo una secuenciación profunda.
Ejemplo 5. Pri-microARN y pre-microARN que seleccionan como diana SOD1
Se diseñaron pri-microARN y pre-microARN. Estos se proporcionan en las tablas 6A, 6B, 7A y 7B. Las secuencias se describen en la dirección de 5' a 3' y las regiones de la estructura de tallo-bucle se desglosan en la tabla en ese orden. En las tablas 7A y 7B, el componente “miR” del nombre de la secuencia no corresponde necesariamente a la numeración de la secuencia de los genes de miARN (por ejemplo, VOYmiR-101 es el nombre de la secuencia y no significa necesariamente que miR-101 forme parte de la secuencia).
Tabla 6A. Secuencias de pre-miR (5'-3')
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Tabla 6B. Secuencias de pre-miR (5'-3')
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Tabla 7A. Secuencias de pri-miR (5'-3')
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Tabla 7B. Secuencias de pri-miR (5'-3')
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Ejemplo 6. Pri-microARN y pre-microARN que seleccionan como diana SOD1; estudio in vivo
Se realizan estudios in vivo para someter a prueba la eficacia de los constructos de pri-microARN o pre-microARN del ejemplo 5.
La tabla 8 describe las variables de diseño experimental que van a explorarse.
El diseño de los ácidos nucleicos moduladores (pri-microARN o pre-microARN) incluye una región de bucle derivada de miR30, una región de tallo derivada de let7 y diversas combinaciones de hebras pasajeras que varían en cuanto a regiones de protuberancia, apareamiento erróneo y asimetría.
Tabla 8. Diseño experimental
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Ejemplo 7. Constructos de pri-miARN en vectores de AAV-miARN
Los dúplex de hebras pasajera-guía de los ARNip de SOD1 enumerados en la tabla 7 se modifican por ingeniería para dar vectores de expresión de AAV-miARN. El constructo, de ITR a ITR, recitado de 5' a 3', comprende una ITR mutante, un promotor (un promotor de CMV, U6 o CB6 (que incluye un potenciador de CMVie, un promotor de CBA y un intrón de SV40), el constructo de pri-miARN de la tabla 7, una poliA de globina de conejo y una ITR de tipo natural. Se realizan estudios in vitro e in vivo para someter a prueba la eficacia de los vectores de expresión de AAV-miARN. Ejemplo 8. Actividad de constructos de pri-miARN en células HeLa
Siete de los constructos de pri-miARN descritos en el ejemplo 7 (VOYmiR-103, VOYmiR-105, VOYmiR-108, VOYmiR-114, VOYmiR-119, VOYmiR-120 y VOYmiR-127) y un control de mCherry bicatenaria se transfectaron en células HeLa para someter a prueba la actividad de los constructos.
A. Actividad de las hebras pasajera y guía
Los siete constructos de pri-miARN y un control de mCherry bicatenaria se transfectaron en células HeLa. Después de 48 horas, se evaluó la expresión de ARNm endógeno. Los siete constructos de pri-miARN mostraron alta actividad de la hebra guía con una atenuación del 75-80% y de baja a nula actividad de la hebra pasajera. Las hebras guía de los vectores de miARN candidatos mostraron alta actividad, produciendo una atenuación del 75-80% de SOD 1, mientras que las hebras pasajeras demostraron poca a nula actividad.
B. Actividad de miARN en SOD1
Los siete constructos de pri-miARN y un control de mCherry bicatenaria (dsmCherry) se transfectaron en células HeLa a una MOI de 1e4 vg/célula, 1e3 vg/célula o 1e2 vg/célula. Después de 72 horas, se evaluó la expresión de ARNm endógeno. Los siete constructos de pri-miARN mostraron una atenuación eficiente a 1e3 vg/célula. La mayoría de los constructos de pri-miARN mostraron alta actividad (atenuación del 75-80%) tal como se muestra en la figura 2. Ejemplo 9. Actividad de constructos de pri-miARN
Treinta de los constructos de pri-miARN descritos en el ejemplo 7 (VOYmiR-102.860, VOYmiR-102.861, VOYmiR-102.866, VOYmiR-102.870, VOYmiR-102.823, VOYmiR-104.860, VOYmiR-104.861, VOYmiR-104.866, VOYmiR-104.870, VOYmiR-104.823, VOYmiR-109.860, VOYmiR-109.861, VOYmiR-109.866, VOYmiR-109.870, VOYmiR-109.823, VOYmiR-114.860, VOYmiR-114.861, VOYmiR-114.866, VOYmiR-114.870, VOYmiR-114.823, VOYmiR-116.860, VOYmiR-116.861, VOYmiR-116.866, VOYmiR-116.870, VOYmiR-116.823, VOYmiR-127.860, VOYmiR-127.861, VOYmiR-127.866, VOYmiR-127.870, VOYmiR-127.823) y un control de VOYmiR-114 y mCherry bicatenaria se transfectaron en células para someter a prueba la actividad de los constructos.
A. Actividad de las hebras pasajera y guía en HEK293
Los treinta constructos de pri-miARN y dos controles se transfectaron en células HEK293T. Después de 24 horas, se evaluó la expresión de ARNm endógeno. La mayoría de los constructos de pri-ARNm mostraron alta actividad de la hebra guía (figura 3) y poca a nula actividad de la hebra pasajera (figura 4).
B. Actividad de las hebras pasajera y guía en HeLa
Los treinta constructos de pri-miARN y dos controles se transfectaron en células HeLa. Después de 48 horas, se evaluó la expresión de ARNm endógeno. La mayoría de los constructos de pri-ARNm mostraron alta actividad de la hebra guía (figura 5) y poca a nula actividad de la hebra pasajera (figura 6).
C. Correlación entre HeLa y HEK293
La atenuación de los treinta pri-miARN fue similar entre las células HeLa y HEK293. Los treinta constructos de primiARN mostraron atenuación para la hebra guía de los constructos (véanse la figura 3 y la figura 5). La mayoría de las hebras guía de los constructos de pri-miARN mostraron una atenuación del 70-90%.
D. Selección de la cápside
Los mejores constructos de pri-miARN de HeLa y HEK293 se empaquetan en AAV y se someterán a infección en HeLa. Para determinar el mejor AAV para el empaquetamiento de los constructos, se infectaron células HeLa con mCherry empaquetada o bien en AAV2 o bien en AAV-DJ8 a una MOI de 10 vg/célula, 1e2 vg/célula, 1e3 vg/célula, 1e4 vg/célula o 1e5 vg/célula y se evaluó la expresión a las 40 horas. Se seleccionó AAV2 como cápside para empaquetar los mejores constructos de pri-miR.
E. Producción de AAV2
Los mejores constructos de pri-miARN de HeLa y HEK293 se empaquetan en AAV2 (1,6 kb) y también se empaquetó un control de mCherry bicatenaria (dsmCherry). Los constructos empaquetados se sometieron a purificación con idoixanol antes del análisis. El título de AAV se muestra en la tabla 9.
Tabla 9. Título de AAV
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El efecto de la transducción sobre la atenuación de SOD1 en células HeLa se muestra en la figura 7. Además, en células HeLa, una MOI más grande (1,0E+04 en comparación con 1,0E+05) no mostró una atenuación aumentada para cada constructo.
F. Actividad de constructos en progenitores de neuronas motoras humanas (PNMH)
Se infectaron los mejores 18 constructos de pri-miARN tal como se describen en el ejemplo 9E y un control de mCherry con células progenitoras de neuronas motoras humanas (PNMH) a una MOI de 10E5. Después de 48 horas, se evaluó la expresión de ARNm endógeno. Aproximadamente la mitad de los constructos proporcionaron un silenciamiento de SOD1 superior al 50% en PNMH y 4 de ellos proporcionaron un silenciamiento superior al 70% (figura 8).
G. Selección de constructos para estudios in vivo
Se seleccionan los doce constructos de pri-miARN empaquetados mejores que tuvieron un efecto mayor sobre la secuencia diana y un efecto menor sobre el casete. Estos constructos empaquetados en cápsides de AAV-rh10 se formulan para inyección y se administran a mamíferos para estudiar los efectos in vivo de los constructos.
H. Actividad en diversas líneas celulares
La actividad de los constructos empaquetados de pri-miARN se sometió a prueba en células HeLa, SH-SY5Y, U87MG y astrocitos humanos primarios. La actividad en células HeLa osciló desde 1 hasta 5 pM. La actividad en células SH-SY5Y osciló desde 13 hasta 17 pM. La actividad en células U87MG fue de aproximadamente 1 pM. La actividad en astrocitos humanos primarios osciló desde 49 hasta 123 pM.
Ejemplo 10. Estudio in vitro de pri-miARN
Para este estudio se usaron los 18 pri-miARN y el control de mCherry descritos en el ejemplo 9D empaquetados en AAV2. Para este estudio, se usaron para someter a prueba los constructos células HEK293T (Fisher Scientific, n.° de cat. HCL4517) en medio de cultivo (500 ml de DMEM/complemento F-12 GLUTAMAX™ (Life Technologies, n.° de cat.
10565-018), 50 ml de FBS (Life Technologies, n.° de cat. 16000-044, lote:1347556), 5 ml de disolución de aminoácidos no esenciales en MEM (100x) (n.° de cat. 11140-050) y 5 ml de HEPES (1M) (Life Technologies, n.° de cat. 15630­ 080)), células U251MG (P18) (Sigma, n.° de cat. 09063001-1VL) en medio de cultivo (500 ml de DMEM/complemento F-12 GLUTAMAX™ (Life Technologies, n.° de cat. 10565-018), 50 ml de FBS (Life Technologies, n.° de cat. 16000­ 044, lote:1347556), 5 ml de disolución de aminoácidos no esenciales en MEM (100x) (n.° de cat. 11140-050) y 5 ml de HEPES (1M) (Life Technologies, n.° de cat. 15630-080)) o astrocitos humanos normales (HA) (Lonza, n.° de cat. CC-2565) en medio de cultivo (500 ml de medio basal ABM (Lonza, n.° de cat. CC-3186) complementado con el kit SingleQuots de complementos y factores de crecimiento en AGM (Lonza, n.° de cat. CC-4123)). Se sembraron las células HEK293T (5x10E4 células/pocillo en una placa de 96 pocillos), células U251MG (2x10E4 células/pocillo en una placa de 96 pocillos) y células HA (2x10E4 células/pocillo en una placa de 96 pocillos) y la MOI usada para la infección de células fue de 1,0E+05. Después de 48 horas, se analizaron las células y los resultados se muestran en la tabla 10.
Tabla 10. Nivel relativo de ARNm de SOD1
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Se observó una atenuación superior al 80% en las células HEK293T para la mayoría de los constructos. Más de la mitad de los constructos mostraron una atenuación superior al 80% en las células U251MG y en las células HA. Ejemplo 11. Disminución de SOD1 dependiente de la dosis
Cuatro de los 18 constructos de pri-miARN mejores tal como se describe en el ejemplo 9E y un control de mCherry se transfectaron en una línea celular de astrocitos humanos (U251MG) o astrocitos humanos primarios (HA) a una MOI de 1,0E+02, 1,0E+03, 1,0E+04, 1,0E+05 ó 1,0E+06. Después de 48 horas, se evaluaron la expresión de ARNm endógeno y el silenciamiento dependiente de la dosis y se muestran en la figura 9 (U251MG) y en la figura 10 (HA). Para todos los constructos, el aumento de la dosis también se correlacionó con un aumento de la cantidad de ARNm de SOD1 que se había atenuado.
Ejemplo 12. Transcurso temporal de la atenuación de SOD1
Dos constructos de pri-miARN (VOYmiR-120 y VOYmiR-122), un control negativo y un control positivo de ARNip de SOD1 se transfectaron en una línea celular de astrocitos humanos (U251MG). El ARNm de SOD1 relativo se determinó durante 60 horas tal como se muestra en la figura 11. Se observó una atenuación del 70-75% de hSOD1 para ambos constructos de pri-miR después de la transfección con Nucleofector, observándose la mayor atenuación en la ventana de 12-24 horas.
Ejemplo 13. Porcentajes de atenuación de SOD1 y de hebras
VOYmiR-104 se transfectó en células HeLa a concentraciones de 50 pM, 100 pM y 150 pM y se comparó con células sin tratar (UT). El ARNm de SOD1 relativo, el porcentaje de la hebra guía y el porcentaje de la hebra pasajera se determinaron a las 36, 72, 108 y 144 horas tal como se muestra en las figuras 12A-12C. La concentración más alta (150 pM) mostró la mayor reducción en la expresión, pero las tres dosis mostraron una reducción significativa en la expresión de SOD1.
Ejemplo 14. Pri-miARN que seleccionan como diana SOD1
Se diseñaron pri-miARN para SOD1 de perro y los constructos se proporcionan en la tabla 11. SOD1 de perro está 100% conservada con la de humana en la región seleccionada como diana. Las secuencias se describen en el sentido de 5' a 3' y las regiones de la estructura de tallo-bucle se desglosan en la tabla en ese orden. En la tabla 11, el componente “miR” del nombre de la secuencia no corresponde necesariamente a la numeración de la secuencia de los genes de miARN (por ejemplo, dVOYmiR-102 es el nombre de la secuencia y no significa necesariamente que miR-102 forme parte de la secuencia).
Tabla 11. Secuencias de pri-miR de perro (5'-3')
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Ejemplo 15. Efecto de la posición de los polinucleótidos moduladores
A. Efecto sobre los títulos virales
Se insertó un polinucleótido modulador (VOYmiR-114 o VOYmiR-126) en un vector de expresión (tamaño de genoma de aproximadamente 2400 nucleótidos; scAAV) en seis ubicaciones diferentes tal como se muestra en la figura 13. En la figura 13, “ ITR” es la repetición terminal invertida, “ I” representa intrón, “P” es la poliA y “MP” es el polinucleótido modulador. Los títulos virales se evaluaron usando PCR con TaqMan para las 6 posiciones y para un control (constructo sin polinucleótido modulador; scAAV) y los resultados se muestran en la tabla 12.
Tabla 12. Títulos virales
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B. Efecto sobre la integridad del genoma
Se insertó un polinucleótido modulador (VOYmiR-114) en un vector de expresión (tamaño de genoma de 2400 nucleótidos; scAAV) en seis ubicaciones diferentes y un control sin polinucleótido modulador (scAAV) tal como se muestra en la figura 13. En la figura 13, “ITR” es la repetición terminal invertida, “I” representa intrón, “P” es la poliA y “MP” es el polinucleótido modulador. Los genomas virales se extrajeron a partir de preparaciones de AAV purificadas y se desarrollaron en gel de agarosa neutro. Se observaron los genomas truncados en todos los constructos y el porcentaje aproximado de los genomas truncados (porcentaje del total) se muestra en la tabla 13.
Tabla 13. Genomas truncados
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La posición 6 tuvo el mayor número de genomas truncados, teniendo las posiciones 4 y 5 la menor cantidad de genomas truncados.
C. Efecto sobre la eficiencia de atenuación
Se insertó un polinucleótido modulador (VOYmiR-114) en un vector de expresión (AAV2) (tamaño de genoma de 2400 nucleótidos; scAAV) en seis ubicaciones diferentes tal como se muestra en la figura 13. En la figura 13, “ITR” es la repetición terminal invertida, “ I” representa intrón, “P” es la poliA y “MP” es el polinucleótido modulador. La transducción de células HeLa se llevó a cabo a 1 x 104 vg/célula, 1 x 103 vg/célula y 1 x 102vg/célula. La expresión de ARNm de SOD1 (como % del control (eGFP)) se determinó 72 horas tras la infección y los resultados se muestran en la tabla 14.
Tabla 14. Expresión de SOD1
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La posición 3 tuvo la expresión de ARNm de SOD1 más alta (como % del control) y la posición 4 tuvo la expresión de ARNm de SOD1 más baja (como % del control).
Ejemplo 16. Efecto del tamaño del genoma
A. Efecto sobre los títulos virales
Se insertó un polinucleótido modulador (VOYmiR-114) en un vector de expresión (tamaño de genoma de 2 kb; scAAV) en las posiciones 1, 2, 5 y 6 tal como se muestra en la figura 13. En la figura 13, “ ITR” es la repetición terminal invertida, “ I” representa intrón, “P” es la poliA y “MP” es el polinucleótido modulador. Se comparó un control bicatenario sin polinucleótido modulador (tamaño de genoma de 1,6 kb; scAAV ctrl) y un vector de expresión bicatenario (scAAV miR114; ITR (105 nucleótidos)-promotor (~900 nucleótidos)-polinucleótido modulador (158 nucleótidos)-secuencia de poliA (127 nucleótidos) e ITR), así como un control (eGFP; scAAV) sin polinucleótido modulador. Los títulos virales se evaluaron PCR con TaqMan y los resultados se muestran en la tabla 15.
Tabla 15. Títulos virales
Figure imgf000055_0001
El título viral más bajo se observó con el constructo en la posición 5 y el más alto con el constructo en la posición 2.
B. Efecto sobre la integridad del genoma
Se insertó un polinucleótido modulador (VOYmiR-114) en un vector de expresión (tamaño de genoma de 2 kb; scAAV) en las posiciones 1, 2, 5 y 6 tal como se muestra en la figura 13. En la figura 13, “ ITR” es la repetición terminal invertida, “ I” representa intrón, “P” es la poliA y “MP” es el polinucleótido modulador. Se comparó un control bicatenario sin polinucleótido modulador (tamaño de genoma de 1,6 kb; scAAV ctrl) y un vector de expresión bicatenario (scAAV miR114; ITR (105 nucleótidos)-promotor (~900 nucleótidos)-polinucleótido modulador (158 nucleótidos)-secuencia de poliA (127 nucleótidos) e ITR), así como un control (eGFP; scAAV) sin polinucleótido modulador. Se observaron genomas truncados en todos los constructos y el porcentaje aproximado de los genomas truncados (porcentaje del total) se muestra en la tabla 16.
Tabla 16. Genomas truncados
Figure imgf000055_0002
Se determinó que todos los constructos tenían algunos genomas truncados.
Se llevó a cabo un estudio adicional para determinar el efecto de los diferentes polinucleótidos moduladores. Se insertaron VOYmiR-114 y VOYmiR-126 en vectores de expresión independientes (tamaño de genoma de 1,6 kb; scAAV) con el polinucleótido modulador cerca de la ITR en 3' (orientación directa). Para el constructo VOYmiR-114, la distancia entre el extremo 5' del genoma de vector (1526 nucleótidos) y la parte central del polinucleótido modulador (mitad del bucle flexible) es de 1115 nucleótidos. Para el constructo VOYmiR-126, la distancia entre el extremo 5' del genoma de vector (1626 nucleótidos) y la parte central del polinucleótido modulador (mitad del bucle flexible) es de 1164 nucleótidos.
Para el constructo VOYmiR-114, el título viral (VG por placa de 15 cm) fue de aproximadamente 1,1 E+11. Para el constructo VOYmiR-126, el título viral de la sonda de intrón (VG por placa de 15 cm) fue de aproximadamente 1,2E+12.
Para el control fue de aproximadamente 2,1 E+11 (VG por placa de 15 cm). VOYmir-114 tuvo aproximadamente el 20% de genomas truncados, VOYmiR-126 tuvo aproximadamente el 15% de genomas truncados y el control tuvo aproximadamente el 5% de genomas truncados.
Ejemplo 17. Efecto de constructos monocatenarios
A. Efecto sobre los títulos virales
Se insertó un polinucleótido modulador (VOYmiR-114) en un vector de expresión (tamaño de genoma de 4,7 kb; ssAAV) en las posiciones 1, 3 y 5 tal como se muestra en la figura 13 y también se sometió a prueba un control sin polinucleótido modulador (tamaño de genoma de 2 kb; ssAAV). En la figura 13, “ITR” es la repetición terminal invertida, “ I” representa intrón, “P” es la poliA y “MP” es el polinucleótido modulador. Los títulos virales se evaluaron usando PCR con TaqMan y los resultados se muestran en la tabla 17.
Tabla 17. Títulos virales
Figure imgf000056_0001
La posición 3 mostró los mayores títulos virales, seguida de la posición 1 y después la posición 5.
B. Efecto sobre la integridad del genoma
Se insertó un polinucleótido modulador (VOYmiR-114) en un vector de expresión (tamaño de genoma de 4,7 kb; ssAAV) en las posiciones 1, 3 y 5 tal como se muestra en la figura 13 y también se sometió a prueba un control sin polinucleótido modulador (tamaño de genoma de 2 kb; ssAAV). En la figura 13, “ITR” es la repetición terminal invertida, “ I” representa intrón, “P” es la poliA y “MP” es el polinucleótido modulador. Se extrajeron genomas virales a partir de preparaciones de AAV purificadas y se desarrollaron en gel de agarosa neutro. Se observaron genomas truncados en todos los constructos y el porcentaje aproximado de los genomas truncados (porcentaje del total) se muestra en la tabla 18.
Tabla 18. Genomas truncados
Figure imgf000056_0002
La posición 5 tuvo el mayor número de genomas truncados, teniendo la posición 3 la menor cantidad de genomas truncados.
C. Efecto sobre la eficiencia de atenuación
Se insertó un polinucleótido modulador (VOYmiR-114) en un vector de expresión (tamaño de genoma de 4,7 kb; ssAAV) en las posiciones 1, 3 y 5 tal como se muestra en la figura 13 y hubo un control monocatenario sin polinucleótido modulador (tamaño de genoma de 2 kb; ssAAV ctrl), un control bicatenario sin polinucleótido modulador (tamaño de genoma de 1,6 kb; scAAV ctrl) y un vector de expresión bicatenario (scAAV miR114; ITR (105 nucleótidos)-promotor (~900 nucleótidos)-polinucleótido modulador (158 nucleótidos)-secuencia de poliA (127 nucleótidos) e ITR). En la figura 13, “ITR” es la repetición terminal invertida, “ I” representa intrón, “P” es la poliA y “MP” es el polinucleótido modulador. La transducción de células HeLa se llevó a cabo a 1 x 104-vg/célula, 1 x 103vg/célula y 1 x 102-vg/célula. La expresión de ARNm de SOD1 (como % del control (eGFP)) se determinó 72 horas tras la infección y los resultados se muestran en la tabla 19.
Tabla 19. Expresión de SOD1
Constructo Expresión de ARNm de SOD1 (% del control)
Figure imgf000057_0001
La posición 3 tuvo la expresión de ARNm de SOD1 más alta (como % del control), después la posición 1 y los constructos monocatenarios con la expresión de ARNm de SOD1 más baja (como % del control) fue la posición 5. Ninguno de los constructos monocatenarios tuvo una eficiencia de atenuación que fuera tan baja como la del control bicatenario con un polinucleótido modulador.
Ejemplo 18. Atenuación de SOD1 in vivo
Para evaluar la actividad biológica in vivo de los pri-miARN, se empaquetan pri-miARN autocomplementarios (VOYmiR-114.806, VOYmiR127.806, VOYmiR102.860, VOYmiR109.860, VOYmiR114.860, VOYmiR116.860, VOYmiR127.860, VOYmiR102.861, VOYmiR104.861, VOYmiR109.861, VOYmiR114.861, VOYmiR109.866, VOYmiR116.866 o VOYmiR127.866) en AAV-DJ con un promotor de CBA.
Se administraron estos pri-miARN empaquetados o un control de vehículo sólo (solución salina tamponada con fosfato con sorbitol al 5% y F-68 al 0,001%) en ratones mediante una infusión intraestriatal de 10 minutos. Ratones Tg(SOD1)3Cje/J hembra o macho (Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME), que expresan SOD1 humana, y de aproximadamente 20-30 g de peso corporal, reciben inyecciones unilaterales de 5 ul de artículo de prueba que se dirige al cuerpo estriado (anteroposterior 0,5 mm, mediolateral 2 mm, con respecto al bregma; dorsoventral 3,8 mm, con respecto a la superficie del cráneo). Se inyectan los artículos de prueba (5 animales por artículo de prueba) a 0,5 ul/min usando microjeringas Hamilton precargadas reguladas por bomba (modelo 1701, 10 |il) con agujas de calibre 33. A las 1,2, 3, 4 ó 6 semanas tras la inyección, se sacrifican los animales, se extraen los cerebros y se diseccionan y ultracongelan los cuerpos estriados ipsilaterales que abarcan el sitio de infusión de un corte grueso coronario de 1 mm, así como el tejido del cuerpo estriado de los cortes gruesos coronarios de 1 mm adyacentes. Se someten a lisis las muestras de tejido de ratón y se cuantifican los niveles de proteína SOD1 humana y los niveles de ARNm de SOD1 y GAPDH de ratón (mGAPDH). Los niveles de proteína SOD1 se cuantifican mediante ELISA (eBioscience (Affymetrix, San Diego, CA)) y los niveles de proteína total se cuantifican mediante análisis BCA (ThermoFisher Scientific, Waltham, MA). Para cada muestra de tejido, se calcula el nivel de proteína SOD1 normalizado a la proteína total como un promedio de 2 determinaciones. Estos niveles de proteína SOD1 normalizados se normalizan adicionalmente al grupo de vehículo, después se promedian para obtener un promedio de grupo (tratamiento). Los niveles de ARNm de SOD1 y mGAPDH se cuantifican mediante qRT-PCR. Para cada muestra de tejido, se calcula la razón de SOD1/mGAPDH (nivel de ARNm de SOD1 normalizado) como un promedio de 3 determinaciones. Después se promedian estas razones para obtener un promedio de grupo (tratamiento). Estos promedios de grupo se normalizan adicionalmente al grupo de vehículo.
En primates no humanos, se administran artículos de pruebas (1 x 1013 - 3 x 1013 vg de pri-miARN empaquetado en AAV-DJ con un promotor de CBA) o vehículo mediante bolo lumbar intratecal. Macacos cangrejeros hembra (Macaca fascicularis, CR Research Model Houston, Houston, TX) que tienen un peso corporal de aproximadamente 2,5-8,5 kg reciben catéteres intratecal únicos implantados con la punta del catéter ubicada en la columna lumbar. Se administran los artículos de pruebas (4 animales por artículo de prueba) que comprenden tres inyecciones en bolo de 1 ml (1 ml/minuto), en intervalos de aproximadamente 60 minutos. A las 4-6 semanas tras la administración, se sacrifican los animales y se recogen tejidos seleccionados para su evaluación bioanalítica e histológica. Se evalúan los niveles de ARNm y de proteína SOD1 para determinar la supresión después del tratamiento con pri-miARN empaquetado en AAV-DJ con un promotor de c Ba , con respecto al grupo de vehículo.
Ejemplo 19. Atenuación de SOD1 in vivo usando VOYmiR-114.806
En ratones Tg(SOD1)3Cje/J, se administra VOYmiR-114.806 empaquetado en AAVDJ con un promotor de CBA tal como se describe en el ejemplo 18. A los ratones se les administró mediante administración intraestriatal unilateral una dosis de 3,7 x 109 vg. Después de 1 ó 2 semanas, no hubo ninguna reducción significativa en los niveles de proteína SOD1 normalizados; los niveles de proteína SOD1 normalizados fueron de 98±11% (desviación estándar) y 98±10% del grupo de control de vehículo después de 1 y 2 semanas, respectivamente. En la semana 3, VOYmiR-114.806 redujo el nivel de proteína SOD1 normalizado hasta el 84±9,0% del grupo de control de vehículo, que fue estadísticamente significativo (p<0,05, ANOVA unilateral con análisis de Dunnett a posteriori). En las semanas 4 y 6, VOYmiR-114.806 redujo el nivel de proteína SOD1 normalizado hasta el 73±7,9% (p<0,0001) y el 75±7,4% (p<0,0001), respectivamente, del grupo de control de vehículo. Estos resultados demuestran que VOYmiR-114.806 empaquetado en AAV-DJ con un promotor de CBA es eficaz in vivo en la modulación por disminución de los niveles de proteína

Claims (15)

  1. REIVINDICACIONES
    i . Polinucleótido modulador, que comprende
    (a) un tallo y bucle para formar una estructura de tallo-bucle, comprendiendo la secuencia de dicha estructura de tallo-bucle desde 5' hasta 3':
    (i) un motivo UG en o cerca de la base del tallo en 5' de la estructura de tallo-bucle;
    (ii) una rama de tallo en 5' que comprende una hebra pasajera y una región espaciadora en 5' opcional, en el que dicha región espaciadora en 5', cuando está presente, está ubicada en 5' con respecto a dicha hebra pasajera;
    (iii) una región de bucle;
    (iv) una rama de tallo en 3' que comprende una hebra guía y opcionalmente una región espaciadora en 3', en el que opcionalmente está presente una uridina en el extremo 5' de la hebra guía y en el que dicha región espaciadora en 3', cuando está presente, tiene una longitud suficiente para formar un giro de hélice;
    (b) una primera región flanqueante ubicada en 5' con respecto a dicha estructura de tallo-bucle; y
    (c) una segunda región flanqueante ubicada en 3' con respecto a dicha estructura de tallo-bucle, comprendiendo opcionalmente dicha segunda región un motivo CNNC, y en el que dicha segunda región flanqueante es una región flanqueante en 3' y comprende SEQ ID NO: 11.
  2. 2. Polinucleótido modulador según la reivindicación 1, en el que la región de bucle de dicha estructura de tallobucle es de un microARN canónico.
  3. 3. Polinucleótido modulador según la reivindicación 2, en el que el microARN canónico es miR-22, y en el que, opcionalmente, dicha primera región flanqueante es de let-7b.
  4. 4. Polinucleótido modulador según la reivindicación 1, en el que la primera región flanqueante comprende una secuencia de región flanqueante seleccionada de las SEQ ID NO: 1-4, o en el que la región de bucle comprende una secuencia de región de bucle seleccionada de las SEQ ID NO: 5-9.
  5. 5. Polinucleótido modulador según la reivindicación 1, en el que la hebra guía comprende una secuencia semilla de microARN entre las posiciones 2 y 15, en el que, opcionalmente, la hebra guía comprende una secuencia semilla de microARN en las posiciones 2-7, 2-8 ó 2-9.
  6. 6. Polinucleótido modulador según la reivindicación 1, en el que la hebra guía tiene entre 15-30 nucleótidos de longitud.
  7. 7. Polinucleótido modulador según la reivindicación 6, en el que la hebra pasajera es al menos el 70% complementaria con la hebra guía.
  8. 8. Polinucleótido modulador según la reivindicación 6, en el que la hebra guía tiene entre 21-25 nucleótidos de longitud, en el que, opcionalmente, la hebra guía tiene 22 nucleótidos de longitud, o en el que, opcionalmente, la hebra guía tiene 21 nucleótidos de longitud.
  9. 9. Polinucleótido modulador según la reivindicación 6, en el que la hebra guía es al menos el 70% complementaria con un ARN diana, seleccionándose dicho ARN diana de ARNm codificante de mamífero y ARN no codificante de mamífero.
  10. 10. Polinucleótido modulador según la reivindicación 9, en el que el ARN diana es un ARNm codificante de mamífero, en el que, opcionalmente, el ARNm codificante se expresa en una célula, un tejido u órgano nerviosos.
  11. 11. Pri-microARN artificial, que comprende el polinucleótido modulador según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9.
  12. 12. Genoma de vector, que codifica para el polinucleótido modulador según cualquiera de las reivindicaciones 1­ 10 o que codifica para el pri-microARN artificial según la reivindicación 11.
  13. 13. Virus adenoasociado (AAV) recombinante, que comprende el genoma de vector según la reivindicación 12.
  14. 14. AAV recombinante según la reivindicación 13, que comprende un serotipo de cápside seleccionado del grupo que consiste en AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV9.47, AAV9(hu14), AAV10, AAV11, AAV12, AAVrh8, AAVrh10 y AAV-DJ.
  15. 15. AAV recombinante según la reivindicación 13 ó 14, que comprende una cápside de AAV1.
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