CN103189507A

CN103189507A - 用于向神经***细胞导入基因的腺相关病毒粒子

Info

Publication number: CN103189507A
Application number: CN2011800520443A
Authority: CN
Inventors: 村松慎一
Original assignee: Jichi Medical University
Current assignee: Jichi Medical University
Priority date: 2010-10-27
Filing date: 2011-10-26
Publication date: 2013-07-03
Also published as: US11674156B2; US10738326B2; EP2634253A1; JP5704361B2; US20200325493A1; JP5907579B2; CN107828820A; EP2634253A4; EP2634253B1; JP2015051009A; CN107828820B; WO2012057363A1; US20130224836A1; JPWO2012057363A1

Abstract

本发明提供一种采用高效率且更简易的方法将目的治疗用基因送入神经***细胞的方法。更详细而言，本发明提供一种使用腺相关病毒（AAV）的重组载体、制作该载体的方法、以及使用该载体的方法。更具体而言，提供一种重组腺相关病毒粒子、含有该粒子的医药组合物、制作该粒子的方法、以及试剂盒等，其中，该重组腺相关病毒粒子能够通过血脑屏障且用于高效率地将目的治疗用基因导入神经***细胞。

Description

用于向神经***细胞导入基因的腺相关病毒粒子

技术领域

本发明涉及用于导入基因的重组腺相关病毒（rAAV）粒子。更具体而言，本发明涉及用于高效率地向神经***细胞导入目的基因的能够通过血脑屏障的重组腺相关病毒（rAAV）粒子、以及含有该病毒粒子的组合物等。

背景技术

中枢神经障碍给公共卫生方面带来了大的问题。据推测，即使仅仅由神经细胞的变性脱落导致的认知功能障碍的阿尔茨海默病（Alzheimer），在日本国内也有60万人以上的患者。现在，很多中枢神经障碍是采用治疗药进行全身给药来治疗。但是，当全身给药时，很多情况下药物无法通过血脑屏障，往往是低效率的，很多有潜力的有用的治疗用蛋白质等不能予以全身给药。

利用腺相关病毒（AAV）作为基因治疗用的病毒来源的载体的方法是公知的（例如，WO2003/018821、WO2003/053476、WO2007/001010等）。但是，当试图将基因导入脑等神经***细胞时，有必要研究上述血脑屏障等的防御机能、神经***细胞的导入效率、表达效率、更安全的给药方法等的问题。

Nakai H等（Unrestricted hepatocyte transduction with adeno-associated virusserotype8vectors in mice.J.Virol.2005Jan；79（1）：214-24.）中记载了，将基因导入肝细胞作为目的，使用了通过EF1α启动子对LacZ基因的标记进行表达的8型AAV载体AAV8-EF1α（-nlslacZ）的例子。

Foust KD等（Intravascular AAV9preferentially targets neonatal neurons andadult astrocytes.Nat.Biotechnol.2009Jan；27（1）：59-65.）中记载了关于具有9型AAV（AAV9）的外壳蛋白，通过鸡β-肌动蛋白杂合启动子（chickenβ-actin hybrid promoter）（CB）来表达荧光蛋白GFP的自补（self-complementary（sc））型载体。另外，Duque S等（IntravenousAdministration of Self-complementary AAV9Enables Transgene Delivery toAdult Motor Neurons.Mol.Ther.2009Jul；17（7）：1187-96.）（结果的概要参照表1）中公开了具有9型AAV（AAV9）的衣壳蛋白、并且在巨细胞病毒（CMV）立即早期启动子（cytomegalovirus immediate early promoter）的控制下表达荧光蛋白GFP的自补型载体（scAAV9-GFP）。

虽然通过这些重组AAV9载体的血管内给药将基因导入了脑（新生儿的神经元、成人的星形胶质细胞等），但由于需要含有使病毒基因组成为sc型的逆向序列的缘故，该基因组中可整合的基因成为非sc型时一半的长度。具体而言，在sc型载体中可整合的基因，被限制为含启动子和poly（A）区域的2kb短的基因。基于该限制，重组病毒载体的治疗用途也受到限制。

如上所述，虽然以往制作了各种重组腺相关病毒载体，但是目前尚未发现能够采用简易的给药方法通过生物体的血脑屏障、特别是将基因有效地导入脑神经***细胞并且能够利用有望更广泛的治疗用途的非sc型AAV基因组的重组AAV载体。

现有技术文献

非专利文献

非专利文献1：Nakai H等（J.Virol.2005Jan；79（1）：214-24.）

非专利文献2：Foust KD等（Nat.Biotechnol.2009Jan；27（1）：59-65.）

非专利文献3：Duque S等（Mol.Ther.2009Jul；17（7）：1187-96.）

发明内容

发明要解决的课题

如上所述的状况中，希望开发一种病毒载体（病毒粒子）且该病毒载体能够通过采用高效率且更简易的给药方法将目的治疗用基因送入到生物体的脑、脊髄等内存在的神经细胞、特别是脑神经细胞中，由于能够更广泛地选择目的基因的长度，从而能够包装非sc型病毒基因组。

解决课题的方法

本发明人等反复进行了精心研究的结果，对通常的单链AAV进行野生型衣壳蛋白质的改变，进而通过组合含有对神经***细胞有特异性的少突胶质细胞特异性启动子、或者突触蛋白I启动子的重组AAV基因组，成功制作了通过对被检体外周给药能够非常高效率地将基因导入神经***细胞的重组腺相关病毒（rAAV）的病毒粒子。

即，本发明提供一种能够高效率地将治疗用基因导入生物体的脑、脊髄等的神经***细胞内并且能够通过血脑屏障的重组腺相关病毒（rAAV）的病毒粒子、以及含有该粒子的医药组合物等。

[1]一种重组腺相关病毒粒子，其包括：

（a）壳粒，该壳粒含有能够形成病毒粒子的蛋白质，该蛋白质含有在相对于序列号2、4或6的氨基酸序列具有90%以上的同一性的氨基酸序列中至少一个表面露出的酪氨酸残基被置换为其它氨基酸残基的氨基酸序列；以及

（b）多核苷酸，该多核苷酸被包装于该壳粒内，并且该多核苷酸含有神经***细胞特异性启动子序列和以能够操作的方式连结于该启动子序列的核苷酸序列。

[1a]如[1]所述的病毒粒子，其中，所述神经***细胞特异性启动子序列来自神经细胞、神经胶质细胞或者少突胶质细胞。

[2]如[1]所述的病毒粒子，其中，所述蛋白质含有至少序列号2中的445位的酪氨酸残基、序列号4中的444位的酪氨酸残基、或者序列号6中的446位的酪氨酸残基被置换了的氨基酸序列。

[3]如技术方案1或2所述的病毒粒子，其中，所述酪氨酸残基被置换为苯丙氨酸残基。

[4]如[1]～[3]中任一项所述的病毒粒子，其中，所述蛋白质含有序列号8、10或12的氨基酸序列、或者在序列号8、10或12的氨基酸序列的444～446位以外的位置中具有一个至数个氨基酸的缺失、置换、***和/或添加的氨基酸序列，并且能够形成病毒粒子。

[5]如[1]～[4]中任一项所述的病毒粒子，其中，在所述多核苷酸的5'末端和3'末端，分别含有来自AAV1、AAV2、AAV3或者AAV4的5'末端和3'末端的倒转末端重复ITR序列。

[6]如[1]～[5]中任一项所述的病毒粒子，其中，在所述多核苷酸的5'末端和3'末端，分别含有序列号13和序列号14的核苷酸序列。

[7]如[1]～[5]中任一项所述的病毒粒子，其中，所述多核苷酸具有总长约2～6kb的长度，并且是正义链或者反义链的单链DNA。

[8]如[1]～[6]中任一项所述的病毒粒子，其中，所述启动子序列选自于由下列启动子序列所构成的组中：突触蛋白I启动子序列；髓鞘碱性蛋白启动子序列；神经元特异性烯醇化酶启动子序列；钙/钙调蛋白依赖性蛋白激酶II（CMKII）启动子；微管蛋白αI启动子；血小板来源生长因子β链启动子；胶质纤维酸性蛋白（GFAP）启动子序列；L7启动子序列（小脑浦肯野细胞特异性启动子）；以及谷氨酸受体δ2启动子（小脑浦肯野细胞特异性启动子）。

[9]如[7]所述的病毒粒子，其中，所述启动子序列含有序列号23或者序列号24所述的多核苷酸。

[10]如[7]所述的病毒粒子，其中，以能够操作的方式连结于所述启动子序列的核苷酸序列，编码选自于由抗体、神经营养因子（NGF）、生长因子（HGF）、酸性成纤维细胞生长因子（aFGF）、碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）、胶质细胞源性神经营养因子（GDNF）、芳香族氨基酸脱羧酶（AADC）以及β淀粉样蛋白分解酶（Neprilysin：脑啡肽酶）所构成的组中的蛋白质。

[10a]如[7]所述的病毒粒子，其中，以能够操作的方式连结于所述启动子序列的核苷酸序列，表达了相对于芳香族氨基酸脱羧酶（AADC）或者α-突触核蛋白（α-Synuclein）的dsRNA、siRNA、shRNA、或者miRNA。

[11]如[9]所述的病毒粒子，其中，所述抗体是对凝集性β淀粉样蛋白的抗体。

[11a]如[9]所述的病毒粒子，其中，所述抗体是对凝集性β淀粉样蛋白的单链抗体。

[11b]如技术方案10所述的病毒粒子，其中，所述核苷酸序列是β淀粉样蛋白分解酶（Neprilysin：脑啡肽酶）。

[12]如[1]～[11]中任一项所述的病毒粒子，其中，其能够通过被检体的血脑屏障。

[12a]如[1]～[12]中任一项所述的病毒粒子，其中，其用于通过对被检体进行外周给药而将基因导入神经细胞中。

[12b]如[1]～[12]中任一项所述的病毒粒子，其中，被检体是母体中的胎儿，并且用于通过对母体进行外周给药而将基因导入胎儿的神经细胞中。

[13]如[1]～[12]中任一项所述的病毒粒子，其中，所述病毒粒子是腺相关病毒载体。

[14]一种医药组合物，其中，其含有[1]～[13]中任一项所述的病毒粒子。

[15]如[14]所述的医药组合物，其中，其使被检体脑中的凝集性β淀粉样蛋白减少。

[15a]如[13]所述的医药组合物，其中，其使被检体脑神经细胞内的α-突触核蛋白（α-Synuclein）的量减少。

[16]如[14]或者[15]所述的医药组合物，其中，其是阿尔茨海默病的治疗药。

[16a]如[14]或者[15a]所述的医药组合物，其中，其对帕金森氏病的治疗有作用。

[17]一种方法，其包括将[1]～[12]中任一项所述的病毒粒子对被检体进行外周给药的工序。

[17a]如[17]所述的方法，其中，被检体是母体中的胎儿，并且将病毒粒子对母体进行外周给药。

[18]如[17]所述的方法，其中，其还包括使被检体的脑中的凝集性β淀粉样蛋白减少的工序。

[18a]如[17a]所述的方法，其中，其还包括使被检体脑神经细胞内的α-突触核蛋白（α-Synuclein）量减少的工序。

[19]如[18]所述的方法，其中，其是用于治疗阿尔茨海默病。

[19a]如[18a]所述的方法，其中，其对帕金森氏病的治疗有作用。

发明效果

本发明的重组病毒载体，因为能够通过血脑屏障，所以能够通过外周给药将基因导入脑神经***细胞。并且，通过本发明的载体对非sc型基因组加以利用，能够更广泛地选择特别是与长度相关的目的治疗用基因。因此，例如，通过使用本发明的rAAV载体并且该载体包装了含有对抗体、神经营养因子等有用蛋白质（可以是一种以上）进行编码的目的基因的病毒基因组，并且采用外周给药等更安全的给药方法，能够将基因导入被检体的脑等的神经***细胞。例如，在本发明的重组载体中，整合对治疗帕金森氏病有作用的α-突触核蛋白（α-Synuclein）进行编码的基因、对成为阿尔茨海默病的原因的β淀粉样蛋白凝集体的抗体进行编码的基因等，能够提供用于治疗各疾病的更安全的治疗药。另外，采用本发明的病毒载体制备方法和/或使用本发明的试剂盒，能够制作一种rAAV载体，该载体用于通过外周给药将目的基因高效率地送入并导入脑、中枢神经的神经***细胞中。

附图说明

图1是通过图表来示出使用了本发明rAAV病毒粒子的每一个大脑中的GFP阳性细胞个数的图。

图2A是表示将含有yfAAV9-CAG-GFP的rAAV载体进行外周给药后的小鼠脑组织的冠状断面照片及其部分放大照片的图。GFP阳性细胞多数是胶质细胞（箭头）（绿色：GFP（绿色荧光蛋白）；红色：NeuN（神经元核））。

图2B是表示将含有yfAAV9-SynI-GFP的rAAV载体进行外周给药后的小鼠脑组织的冠状断面照片及其部分放大照片的图。

图2C是表示将含有yfAAV9-MBP-GFP的rAAV载体外进行外周给药后的小鼠脑组织的冠状断面照片及其部分放大照片的图。

图3是表示使用本发明rAAV病毒粒子后的大脑皮质每0.04mm³的GFP阳性细胞个数的图。

图4是表示使用本发明rAAV病毒粒子后的脊髄中的GFP和ChAT表示阳性的神经细胞的照片及其部分放大照片的图。

图5是表示使用了本发明rAAV病毒粒子的、通过对母亲小鼠进行心腔内给药而将基因导入胎儿脑神经细胞中的结果的图像照片（左图）及其部分放大图（右图）。

图6是表示将实施例3所述的yfAAV9-SynI-GFP-miAADC进行心腔内给药后的小鼠脑神经细胞的黑质致密部中的各种抗体免疫染色结果的图像照片的图。使用的一次抗体是anti-GFP（左图）、anti-AADC（中间图）、anti-TH（右图）。

具体实施方式

1.本发明的重组腺相关病毒（rAAV）的病毒粒子

本发明的一个实施方式中提供了下述的rAAV病毒粒子，其包括：

1.1腺相关病毒（AAV）

天然的腺相关病毒（AAV）是非病原性病毒。通过利用该特征来制作各种重组病毒载体，然后送入用于基因治疗所需的基因（例如，参照WO2003/018821、WO2003/053476、WO2007/001010、药学杂志126（11）1021-1028等）。野生型AAV基因组，是具有总长为约5kb的核苷酸长度的单链DNA分子，并且是正义链或者反义链。AAV基因组，通常在基因组的5'侧和3'侧的两末端具有约145个核苷酸长度的倒转末端重复（ITR）序列。已知该ITR具有作为AAV基因组的复制起点的功能以及作为该基因组的病毒粒子内的包装信号的功能等多种功能（例如，参照上述文献的药学杂志126（11）1021-1028等）。ITR所***的野生型AAV基因组的内部区域（下称“内部区域”）含有AAV复制（rep）基因和衣壳（cap）基因。这些rep基因和cap基因，分别编码参与病毒复制的蛋白质Rep以及形成作为正20面体结构的外壳的壳粒的衣壳蛋白质（例如，VP1、VP2和VP3中的至少一个）。更详细而言，例如参照：Human Gene Therapy，13，pp.345-354，2002；NeuronalDevelopment45，pp.92-103，2001；实验医学20，pp.1296-1300，2002；药学杂志126（11）1021-1028；Hum Gene Ther，16，541-550，2005等。

天然的腺相关病毒，已知有各种类型，已发现分别有感染对象细胞的倾向（例如，在“Gao，G等Curr.Gene Ther.5:285–297，2005；Xin，K-Q等J.Virol.80：11899-910，2006；Hellstroem，M等Gene Ther.16:521-32，2009”等中有记载）。本发明的rAAV载体，优选能够采用来自天然的腺相关病毒1型（AAV1）、2型（AAV2）、3型（AAV3）、4型（AAV4）、5型（AAV5）、6型（AAV6）、7型（AAV7）、8型（AAV8）、9型（AAV9）等来进行制作，但并不限定于这些。这些腺相关病毒基因组的核苷酸序列是公知的，能够分别参照GenBank登记编号AF063497.1（AAV1）、AF043303（AAV2）、NC_001729（AAV3）、NC_001829.1（AAV4）、NC_006152.1（AAV5）、AF028704.1（AAV6）、NC_006260.1（AAV7）、NC_006261.1（AAV8）、AY530579（AAV9）的核苷酸序列。其中，2型、3型、5型和9型是人源的。本发明中，特别优选为利用对来自AAV1、AAV2或者AAV9的衣壳蛋白质进行编码的核苷酸序列。已有报道AAV1和AAV9是人源AAV中对神经细胞的感染效率比较高的（Taymans等Hum Gene Ther18:195-206，2007等）。另外，AAV2已经被临床应用于对帕金森氏病的基因治疗等（Kaplitt等，Lancet369：2097-2105，2007；Marks等，Lancet Neurol7:400-408，2008；Christine等，Neurology73：1662-1669，2009；Muramatsu等，Mol Ther18：1731-1735，2010等）。

1.2本发明的rAAV病毒粒子中的衣壳蛋白质

本发明rAAV病毒粒子含有的衣壳蛋白质，在VP1氨基酸序列（序列号2、4或者6）中表面露出的酪氨酸残基（例如，在病毒粒子表面所露出氨基酸侧链的酪氨酸残基）中的至少一个被置换为其它的氨基酸。作为如上所述蛋白质，可以举出如下所述的蛋白质：该蛋白质包含与序列号2、4或者6的氨基酸序列具有约90%以上、91%以上、92%以上、93%以上、94%以上、95%以上、96%以上、97%以上、98%以上、99%以上、99.1%以上、99.2%以上、99.3%以上、99.4%以上、99.5%以上、99.6%以上、99.7%以上、99.8%以上、99.9%以上的同一性的氨基酸序列，并且在表面所露出的酪氨酸残基中的至少一个被置换为其它氨基酸，且该蛋白质能够形成病毒粒子。上述数值通常优选为较大的数值。本发明的rAAV病毒粒子中所含的衣壳蛋白质，能够单独或与其它衣壳蛋白质成员（例如，VP2和/或VP3等）一起形成壳粒，并且能够形成在该壳粒内包装有AAV基因组（或者AAV载体基因组）的本发明的rAAV病毒粒子。上述本发明的rAAV，能够通过生物的血脑屏障（包括不成熟的胎儿和新生儿的血脑屏障、以及已独立的成体的血脑屏障）。并且，本发明的rAAV病毒粒子，能够通过外周给药而以成体的脑、脊髄等所含的神经细胞作为靶标。本说明书中，所谓外周给药，是指静脉内给药、动脉内给药、腹腔内给药、心腔内给药、肌肉内给药、脐带血管内给药（例如，当以胎儿为对象时）等本领域技术人员通常所理解的作为外周给药的给药途径。作为能够相互置换的氨基酸残基，可以举出其残基所属的相似氨基酸残基的组（后述）内所含的其它残基。根据相互能够置换的氨基酸残基而得到改变的衣壳蛋白质，能够按照通常的基因操作技术等、本领域技术人员所公知的方法进行制作。关于上述基因操作规程，例如，能够参照：Molecular Cloning3rd Edition,J.Sambrook等，Cold Spring Harbor Lab.Press.2001、CurrentProtocols in Molecular Biology，John Wiley&Sons1987-1997等。

本发明的rAAV病毒粒子中所含的衣壳蛋白质，优选为序列号2中露出表面的252位、273位、445位、701位、705位或731位的酪氨酸残基中的一个以上被其它的氨基酸、优选被苯丙氨酸残基所置换的蛋白质。优选为序列号2的氨基酸序列中445位的酪氨酸残基被置换为苯丙氨酸残基。本发明的rAAV病毒粒子中所含的衣壳蛋白质，优选为序列号4中露出表面的252位、272位、444位、500位、700位、704位或730位的酪氨酸残基中的一个以上被其它氨基酸、优选被苯丙氨酸残基所置换的蛋白质。优选为序列号4的氨基酸序列中444位的酪氨酸残基被置换为苯丙氨酸残基。本发明的rAAV病毒粒子含有的衣壳蛋白质，优选为序列号8中露出表面的252位、274位、446位、701位、705位、706位或731位中的至少一个酪氨酸残基中一个以上被其它氨基酸、优选被苯丙氨酸残基所置换的蛋白质。优选为序列号6的氨基酸序列中446位的酪氨酸残基被置换为苯丙氨酸残基。本发明的rAAV病毒粒子的壳粒，既可以单独含有上述蛋白质，也可以共同含有上述蛋白质及其它成员（VP2和/或VP3）。本发明中，上述被置换的氨基酸残基的位置，包括：分别与病毒型的VP2和VP3对应的位置的氨基酸残基的置换，优选为对应的酪氨酸残基置换成为苯丙氨酸残基的置换。这些被改变的衣壳蛋白质，能够按照通常的基因操作技术等本领域技术人员所公知的方法进行制作。关于上述基因操作规程，例如，参照《分子克隆（モレキュラー·クローニング）（Molecular Cloning3rd Edition：分子克隆第三版）》等。含有这些衣壳蛋白质的本发明的病毒粒子，如上所述，能够通过成体和胎儿的血脑屏障。优选含有相同功能的衣壳蛋白质的病毒粒子能够通过外周给药感染成体的脑、脊髄等所含的神经***细胞。所谓在本发明中所使用的神经***，是指通过神经组织构成的器官***。本发明中，作为基因导入靶标的神经***细胞，至少包括脑、脊髄等中枢神经***中所含的神经细胞，并且也可以包括神经胶质细胞、小胶质细胞、星状胶质细胞、少突胶质细胞、室管膜细胞、脑血管内皮细胞等。在导入了基因的神经***细胞中的神经细胞的比例，优选为70%以上、80%以上、85%以上、90%以上、91%以上、92%以上、93%以上、94%以上、95%以上、96%以上、97%以上、98%以上、99%以上、99.1%以上、99.2%以上、99.3%以上、99.4%以上、99.5%以上、99.6%以上、99.7%以上、99.8%以上、99.9%以上、或者100%。

本发明的rAAV病毒粒子，进一步含有一种如下所述的蛋白质，该蛋白质含有在序列号为8、10或12的氨基酸序列、或者序列号为8、10或12的氨基酸序列中在444～446位以外的位置上有一个以上的氨基酸的缺失、置换、***和/或添加而成的氨基酸序列，并且依然能够形成病毒粒子。更详细而言，本发明的rAAV病毒粒子中所含的衣壳蛋白质，能够单独或者与其它衣壳蛋白质成员（例如，VP2和/或VP3等）一起包含于本发明的rAAV病毒粒子的壳粒中，该壳粒内包装有AAV基因组（或者重组AAV载体基因组）。也可以同时产生上述氨基酸的缺失、置换、***和添加中的两种以上。作为上述蛋白质，可以举出，例如，该蛋白质含有序列号8、10或者12的氨基酸序列、或序列号8、10或者12的氨基酸序列中在444～446位以外的位置上、例如有1～50个、1～40个、1～39个、1～38个、1～37个、1～36个、1～35个、1～34个、1～33个、1～32个、1～31个、1～30个、1～29个、1～28个、1～27个、1～26个、1～25个、1～24个、1～23个、1～22个、1～21个、1～20个、1～19个、1～18个、1～17个、1～16个、1～15个、1～14个、1～13个、1～12个、1～11个、1～10个、1～9个（1～数个）、1～8个、1～7个、1～6个、1～5个、1～4个、1～3个、1～2个、或者1个氨基酸残基发生缺失、置换、***和/或添加而形成的氨基酸序列，且该蛋白质能够形成病毒粒子的蛋白质。上述氨基酸残基的缺失、置换、***和/或添加的数目，通常优选为较小的数目。所形成的本发明rAAV病毒粒子，如上所述，能够通过成体和胎儿的血脑屏障，并且优选通过外周给药能够将基因导入脑、脊髄等的神经细胞中。另外，本发明的rAAV病毒粒子，通过针对母体进行外周给药而能够将基因导入母体中胎儿的脑、脊髄等所含的神经***细胞中。这些被改变的衣壳蛋白质，能够按照通常的基因操作技术等本领域技术人员所公知的方法进行制作。

下面示出本发明的蛋白质（多肽）中能够相互置换的氨基酸残基的例子。在同一组中所含的氨基酸残基能够相互置换。A组：亮氨酸、异亮氨酸、正亮氨酸、缬氨酸、正缬氨酸、丙胺酸、2-氨基丁酸、蛋氨酸、邻甲基丝氨酸、叔丁基甘氨酸、叔丁基丙胺酸、环己基丙胺酸；B组：天冬氨酸、谷氨酸、异天冬氨酸、异谷氨酸、2-氨基己二酸、2-氨基辛二酸；C组天冬酰胺、谷氨酰胺；D组：赖氨酸、精氨酸、鸟氨酸、2,4-二氨基丁酸、2,3-二氨基丙酸；E组：脯氨酸、3-羟基脯氨酸、4-羟基脯氨酸；F组：丝氨酸、苏氨酸、高丝氨酸；G组：苯丙氨酸、酪氨酸。

本发明的rAAV病毒粒子中所含的上述衣壳蛋白质VP1、VP2和/或VP3，是通过一种以上的多核苷酸来进行编码所获得。优选本发明中的衣壳蛋白质全部通过一种多核苷酸来进行编码。更优选为衣壳蛋白质是通过序列号为7、9或11的多核苷酸来进行编码。

对本发明rAAV病毒粒子中所含的上述衣壳蛋白质进行编码的多核苷酸，能够针对可形成本发明的重组病毒粒子的衣壳蛋白质以及功能相同的蛋白质进行编码。上述多核苷酸，包括例如在序列号为7、9或11的多核苷酸序列、或者在序列号为7、9或11的多核苷酸序列中具有1个以上（例如，1～50个、1～40个、1～30个、1～25个、1～20个、1～15个、1～10个、1～9个（1～数个）、1～8个、1～7个、1～6个、1～5个、1～4个、1～3个、1～2个、1个等）的核苷酸的缺失、置换、***和/或添加的多核苷酸，并且其对可以形成含有下述氨基酸序列的病毒粒子的蛋白质进行编码的多核苷酸，该氨基酸序列是通过在序列号为8、10或12的氨基酸序列、或者序列号8、10或12的氨基酸序列中在444～446位以外的位置上有1个以上的氨基酸发生缺失、置换、***和/或添加而成的氨基酸序列。在这些缺失、置换、***和添加的情况中，也可以同时产生两种情况以上。含有根据上述多核苷酸进行编码的衣壳蛋白质的本发明的rAAV病毒粒子，如上所述，能够通过成体和胎儿的血脑屏障。优选本发明的rAAV病毒粒子能够经过外周给药将基因导入成体的脑、脊髄等所含的神经***细胞中。另外，本发明的rAAV病毒粒子，能够通过针对母体进行外周给药而将基因导入母体中胎儿的脑、脊髄等所含的神经***细胞中。上述核苷酸的缺失、置换、***和/或添加的数目，通常优选为较小的数目。上述多核苷酸，能够包括例如是在严格杂交条件下能够与序列号为7、9或11的序列或者其互补序列进行杂交的多核苷酸，并且是针对可形成本发明重组病毒粒子的蛋白质（例如，含有序列号为8、10或12的氨基酸序列、或者序列号为8、10或12的氨基酸序列中在444～446位以外的位置上有1个以上的氨基酸发生缺失、置换、***和/或添加而成的氨基酸序列的蛋白质）进行编码的多核苷酸。

杂交能够按照公知的方法或以公知方法为标准的方法、例如《分子克隆》（Molecular Cloning3rd Edition（分子克隆第三版），J.Sambrook等Cold SpringHarbor Lab.Press.2001）中所记载的方法等来进行。另外，若使用市售的文库，则能够按照制造业者提供的使用说明书中等所记载的方法来进行。其中，“严格条件”，可以是低严格条件、中严格条件和高严格条件中的任意条件。“低严格条件”，例如是5×SSC、5×邓哈特溶液（Denhardt’s solution）、0.5%SDS、50%甲酰胺、32℃的条件。另外，“中严格条件”，例如是5×SSC、5×邓哈特溶液、0.5%SDS、50%甲酰胺、42℃的条件。“高严格条件”，例如是5×SSC、5×邓哈特溶液、0.5%SDS、50%甲酰胺、50℃的条件。在这些条件中越是提高温度，则越能够有望有效地获得具有高同源性的DNA。其中，作为影响杂交严格度的因素，被认为有温度、探针浓度、探针长度、离子强度、时间、盐浓度等多个因素；若是本领域技术人员，则可通过对这些因素进行适当选择来实现相同的严格度。

作为可杂交的多核苷酸，可以举出如下所述多核苷酸：该多核苷酸在通过FASTA、BLAST等同源性检索软件并使用默认的参数计算时具有与序列号为7、9或11的核苷酸序列的例如70%以上、80%以上、90%以上、91%以上、92%以上、93%以上、94%以上、95%以上、96%以上、97%以上、98%以上、99%以上、99.1%以上、99.2%以上、99.3%以上、99.4%以上、99.5%以上、99.6%以上、99.7%以上、99.8%以上、99.9%以上的同一性。上述同源性的数值通常优选为较大的数值。

此外，氨基酸序列和多核苷酸序列的同一性，能够采用由卡尔林（Karlin）和阿尔丘尔（Altschul）提出的算法BLAST（Proc.Natl.Acad.Sci.USA872264-2268，1990；Proc.Natl.Acad.Sci USA90：5873，1993）来进行确定。已经开发出基于BLAST算法的被称为BLASTN和BLASTX的程序（AltschulSF等：J Mol Biol215：403，1990）。当使用BLASTN分析碱基序列时，设定参数例如为score＝100、wordlength＝12。另外，当使用BLASTX分析氨基酸序列时，设定参数例如为score＝50、wordlength＝3。当使用BLAST和Gapped BLAST程序时，使用各程序的默认参数。

本发明中使用的Rep蛋白质，只要具有与识别ITR序列而依据该序列进行基因组复制的功能、向病毒粒子内补充野生型AAV基因组（或者rAAV基因组）后将其进行包装的功能、形成本发明rAAV病毒粒子的功能等公知的功能相同水平的功能，即可具有与上述同样数量的氨基酸序列同一性，并能够包含与上述相同数量的氨基酸残基的缺失、置换、***和/或添加。关于在功能上同等水平的范围，可以举出与上述比活性相关的说明中所记载的范围。本发明中，优选使用公知的AAV3来源的Rep蛋白质。更优选使用具有序列号16所记载的氨基酸序列的蛋白质。

对本发明中使用的Rep蛋白质进行编码的多核苷酸，只要是编码具有与识别ITR序列而依据该序列进行基因组复制的功能、向病毒粒子内补充野生型AAV基因组（或者rAAV基因组）并将其进行包装的功能、形成本发明rAAV病毒粒子的功能等公知的功能相同水平的Rep蛋白质，即可具有与上述同样数量的同一性，并可以包含与上述相同数量的核苷酸的缺失、置换、***和/或添加。关于在功能上同等水平的范围，可以举出与上述比活性相关的说明中所记载的范围。本发明中，优选使用AAV3来源的rep基因。更优选使用具有序列号15所记载的核苷酸序列的多核苷酸。

本发明的实施方式1中，由上述野生型AAV基因组的内部区域进行编码的衣壳蛋白质VP1等（VP1、VP2和/或VP3）和Rep蛋白质，是通过将编码它们的多核苷酸整合于本发明的AAV辅助质粒中来提供。本发明中所用的衣壳蛋白质（VP1、VP2和/或VP3）以及Rep蛋白质，可以根据需要而整合于一种、两种、三种或更多种的质粒中。根据不同情况，这些衣壳蛋白质和Rep蛋白质中的一种以上可以被包含于AAV基因组中。本发明中，优选衣壳蛋白质（VP1、VP2和/或VP3）和Rep蛋白质全部由一种多核苷酸进行编码并且作为AAV辅助质粒进行提供。例如，参见本说明书中的实施例。

1.3本发明的rAAV基因组

本发明的rAAV病毒粒子中所包装的重组腺相关病毒基因组（下面，本发明的rAAV基因组），能通过如下方法进行制作，即：采用包含编码目的蛋白质的多核苷酸（治疗用基因）和用于转录该多核苷酸的启动子序列等的基因盒（gene cassett），对位于野生型基因组的5'侧和3'侧的ITR之间的内部区域（即，rep基因和cap基因中的一者或者两者）的多核苷酸进行置换而制作。优选位于5'侧和3'侧的ITR分别位于AAV基因组的5'末端和3'末端。本发明的rAAV基因组，优选位于5'末端和3'末端的ITR含有AAV1、AAV2、AAV3或者AAV9的基因组中所含的5'侧ITR和3'侧ITR。特别优选本发明的rAAV病毒粒子中所包装的病毒基因组，5'侧的ITR是序列号为13的多核苷酸、3'侧ITR是序列号为14的多核苷酸。通常，ITR部分容易取得互补序列替换而成的序列（flip and flop structure：来回换位结构），因此，本发明的rAAV基因组中所含的ITR的5'和3'的方向也可以逆转。与本发明rAAV基因组中的内部区域之间所置换的多核苷酸（即，治疗用基因）的长度，在实用上优选与原来的多核苷酸的长度同等的水平。即，本发明的rAAV基因组的全长与野生型的全长5kb是同等的水平，例如是约2～6kb，优选为约4～6kb。本发明的rAAV基因组中所整合的治疗用基因的长度，若减去含有启动子、多聚腺苷酸等的转录调节区域的长度（例如，当假定为约1～1.5kb时），则优选长度约0.01～3.7kb，更优选长度约0.01～2.5kb，进一步优选约0.01～2kb，但不限定于这些。并且，使用公知的介于内部核糖体进入位点（IRES：internalribozyme entry site）序列之间等的公知方法，只要rAAV基因组全长是在上述范围内，即可同时整合约0.01～1.5kb的两种以上的多个治疗用基因。

通常，重组腺相关病毒粒子内所包装的病毒基因组存在的问题是：因该基因组为单链，从而引起表达基因组中所含的目的基因时需要时间（数日）。为了解决该问题，将被导入的治疗用基因设计成为自互补性（被称作自补（self-complementary（sc））型载体）并实现对病毒载体感染后的表达进行促进的目的。此时，为了形成双链也存在包含反向序列的必要性，因而，应当设计上述治疗用基因的长度是与非sc型基因组载体相比大概有一半长度。更具体而言，当重组病毒基因组为sc型时，能够整合的目的基因的长度，包括启动子、多聚腺苷酸等需要的区域在内，被设计为约2kb。关于具体实施的详细情况，例如前述Foust KD等（Nat Biotechnol.2009Jan；27（1）：59-65；非专利文献3）等中所记载的内容。本发明中，当目的基因的长度短时，也能够利用sc型基因组载体。即，本发明中使用的rAAV基因组，即可以是非sc型也可以是sc型。当是sc型时，含有目的基因的表达盒的整体或其局部能够形成双链DNA。

对本发明的rAAV基因组而言，为了表达目的多肽，将对该多肽进行编码的多核苷酸序列以能够操作的方式与各种公知的启动子序列组合在一起。但是，例如，当对采用作为通常所用的强力的启动子的CMV启动子而成的rAAV载体加以利用时，在成体中是将大部分目的基因导入胶质样细胞中而不导入神经细胞中（例如，参照本说明书中的实施例1）。因此，本发明的rAAV病毒粒子中所使用的启动子序列是对神经***细胞有特异性的序列。在本发明中所使用的所谓神经***，是指如前面所述的由神经组织构成的器官***。在本发明中所使用的神经***细胞特异性启动子序列，例如，来自神经细胞、神经胶质细胞、少突胶质细胞、脑血管内皮细胞、小胶质细胞、脑室上皮细胞等，但并不限定于这些。作为上述启动子序列，具体而言，可以举出突触蛋白I启动子序列、髓鞘碱性蛋白质启动子序列、神经元特异性烯醇化酶启动子序列、胶质纤维酸性蛋白启动子序列、L7启动子序列（小脑浦肯野细胞特异性启动子）、谷氨酸受体δ2启动子（小脑浦肯野细胞特异性启动子），但并不限定于这些。另外，本发明的rAAV病毒粒子中，也能够使用钙/钙调蛋白依赖性蛋白激酶II（CMKII）启动子、微管蛋白αI启动子、血小板由来生长因子β链启动子等启动子序列。上述这些启动子序列，既可以是单独的启动子序列，也可以是任意多个启动子序列的组合。特别优选为突触蛋白I启动子序列和髓鞘碱性蛋白质启动子序列。本发明的rAAV基因组，可以进一步含有辅助mRNA转录、蛋白质翻译等的增强子序列、Kozak序列、适当的聚腺嘌呤基化信号序列等公知序列。

在本发明的rAAV基因组中整合有目的治疗用基因。该治疗用基因，可以编码用于治疗各种疾病的蛋白质。进行编码的蛋白质，既可以是一种也可以是一种以上，但包含目的基因在内所得到包装的rAAV基因组的长度应该在约5kb以下（除ITR区域以外约在4.7kb以下）。例如，当被包装的rAAV基因组是非sc型时，整合于rAAV基因组中的目的基因长度实质上被限制在约3.5kb以下。若是sc型基因组，则进一步被限制为上述一半的长度。因此，在一个实施方式中，目的治疗用基因，优选使用对通过短多肽所构成的蛋白质进行编码的多核苷酸。作为这种蛋白质，例如，可以举出抗体（包括抗原结合部位、Fab、Fab2、单链抗体（scFv）等）、神经生长因子（NGF）、生长因子（HGF）、酸性成纤维细胞生长因子（aFGF）、脑源性神经营养因子（BDNF）、神经营养因子NT-3和NT-4/5、睫状神经营养因子（CNTF）、胶质细胞系由来神经营养因子（GDNF）、神经秩蛋白（Neurturin）、集聚蛋白的调节蛋白（heregluin（ヘレグルイン））/神经调节蛋白/ARIA/neu分化因子（NDF）家族中的任一者、脑信号蛋白/脑衰蛋白、神经突起生长导向因子（ネツリン）-1和神经突起生长导向因子（ネツリン）-2、碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）、胶质细胞源性神经营养因子（GDNF）、芳香族氨基酸脱羧酶（AADC）、β淀粉样蛋白分解酶（Neprilysin：脑啡肽酶）等，但并不限定于这些。另外，也能够整合与呈现神经障碍的代谢酶病（例如，包括高歇氏病的粘多糖贮积病、包括高胱氨酸尿症的氨基酸代谢异常症、包括异染性脑白质营养不良的脂质代谢异常症等）相关的基因，例如，对葡糖脑苷脂酶、胱硫醚β-合成酶、芳香基硫酸酯酶A（アリスサルファターゼA）等进行编码的基因。

本发明的实施方式1中，由本发明的rAAV基因组所编码的抗体的类别，并没有特别限定，包括具有IgG、IgM、IgA、IgD或IgE等任意的同型的抗体。其中，关于对抗体进行编码的多核苷酸的长度，应该注意在实用上存在限制。本说明书中，术语“抗体”的意思还包括任意的抗体片断或者衍生物，例如，包括Fab、Fab'2、CDR、人源化抗体、嵌合抗体、多功能抗体、单链抗体（ScFv）等。本发明中，优选利用编码单链抗体（ScFv）的多核苷酸作为目的治疗用基因。

由本发明的rAAV基因组所编码的蛋白质，只要具有目的功能即可包括通过基因操作而含有氨基酸残基的***、缺失、置换和/或添加的蛋白质突变体。该蛋白质突变体中，也可以同时发生上述的缺失、置换、***和添加中的两种以上。优选这些蛋白质突变体具有与原来的蛋白质相同的功能（例如，抗原结合能力）。优选作为上述蛋白质突变体可以举出如下所述的蛋白质，该蛋白质是通过在例如抗β淀粉样蛋白（Aβ）的单链抗体（scFv）的氨基酸序列中有例如1～50个、1～40个、1～39个、1～38个、1～37个、1～36个、1～35个、1～34个、1～33个、1～32个、1～31个、1～30个、1～29个、1～28个、1～27个、1～26个、1～25个、1～24个、1～23个、1～22个、1～21个、1～20个、1～19个、1～18个、1～17个、1～16个、1～15个、1～14个、1～13个、1～12个、1～11个、1～10个、1～9个（1～数个）、1～8个、1～7个、1～6个、1～5个、1～4个、1～3个、1～2个、或者1个氨基酸残基发生缺失、置换、***和/或添加而成的氨基酸序列构成的、并且具有与原来的蛋白质相同的抗原结合能力的蛋白质。本发明中，所谓具有相同的功能，是指具有比活性例如约0.01～100倍、优选约0.5～20倍、更优选约0.5～2倍的范围内所含的抗原结合能力的意思，但并不限定于这些。

本发明的rAAV基因组中所整合的目的治疗用基因，是用于使反义分子、核酶、干扰RNA（iRNA）、微RNA（miRNA）等的作为靶标的内源性基因的功能发生变化（例如，破坏、降低）的多核苷酸，或者还可以是用于使内源性蛋白质的表达水平发生变化（例如，降低）的多核苷酸。作为靶标的基因，可以举出各种疾病发生的病因基因，例如，可以举出与帕金森氏病相关的α-突触核蛋白的编码基因，成为癌的病因的公知的各种致癌基因，但并不限定于这些。例如，为了使用反义序列而有效抑制目的基因的表达，优选反义核酸的长度在10个碱基以上、15个碱基以上、20个碱基以上、100个碱基以上，更优选在500个碱基以上。通常所使用的反义核酸的长度短于5kb，优选短于2.5kb。

通过使用核酶，能够特异性地切断目的蛋白质的mRNA从而抑制该蛋白质的表达。关于上述核酶的设计，能够参照各种公知的文献（例如，参照FEBSLett.228:228，1988；FEBS Lett.239:285，1988；Nucl.Acids.Res.17:7059，1989；Nature323:349，1986；Nucl.Acids.Res.19:6751，1991；Protein Eng3:733，1990；Nucl.Acids Res.19:3875，1991；Nucl.Acids Res.19:5125，1991；Biochem Biophys Res Commun186:1271，1992等）。

另外，所谓“RNAi”是指：当将具有与目的基因序列相同或相似的序列的双链RNA导入细胞内时所导入的外来基因和靶向内源性基因的表达均受到抑制的现象。作为这里所用的RNA，例如产生21～25个碱基长的干扰RNA的双链RNA，例如，可以举出dsRNA（double strand RNA：双链RNA）、siRNA（small interfering RNA：小干扰RNA）、shRNA（short hairpin RNA：短发夹RNA）或者miRNA（microRNA：小分子RNA）。如上所述的RNA，能够通过脂质体等送入***向所希望的部位进行局部送入，还能够通过使用使得上述双链RNA生成的载体来对其进行局部表达。上述双链RNA（dsRNA、siRNA、shRNA或miRNA）的制备方法、使用方法等，是来自很多文献的公知方法（参照日本的特表2002-516062号公报；美国的公开专利第2002/086356A号；Nature Genetics，24（2），180-183，2000Feb.；Genesis，26（4），240-244，2000April；Nature，407:6802，319-20，2002Sep.21；Genes&Dev.，Vol.16，（8），948-958，2002Apr.15；Proc.Natl.Acad.Sci.USA.，99（8），5515-5520，2002Apr.16；Science，296（5567），550-553，2002Apr.19；Proc Natl.Acad.Sci.USA，99:9，6047-6052，2002Apr.30；NatureBiotechnology，Vol.20（5），497-500，2002May；Nature Biotechnology，Vol.20（5），500-505，2002May；Nucleic Acids Res.，30:10，e46，2002May15等）。

在本说明书中使用“病毒粒子（virus virion）”、“病毒载体（virusvector）”、“病毒颗粒（virus particle）”各术语时，只要没有特别说明，均能够相互替换使用。

在本说明书中使用术语“多核苷酸”时，该术语能够与“核酸”、“基因”或者“核酸分子”进行替换使用，意在表示核苷酸的聚合物。在本说明书中使用术语“核苷酸序列”时，该术语能够与“核酸序列”或“碱基序列”替换使用，并且以脱氧核糖核苷酸（简写为A、G、C和T）的序列的方式示出。例如，所谓“含有序列号1的核苷酸序列的多核苷酸或者其片段”，意思是指含有以序列号1的各脱氧核苷酸A、G、C和/或T所示出的序列的多核苷酸或者其片断部分。

本发明的各个“病毒基因组”和“多核苷酸”分别能够以DNA的方式（例如，cDNA或基因组DNA）存在，根据情况也可以是RNA（例如，mRNA）的方式。本说明书中所使用的各个病毒基因组和多核苷酸，可以是双链或是单链的DNA。当是单链DNA或者RNA时，既可以是编码链（已知也作为正义链），也可以是非编码链（已知也作为反义链）。在不特别予以说明的情况下，在本说明书中，当针对rAAV基因组进行编码的启动子、目的基因、多聚腺苷酸信号等的基因上的配置进行说明时，若rAAV基因组是正义链则是针对其链自身进行描述，若是反义链则针对其互补链进行描述。

本说明书中，“蛋白质”与“多肽”能够相互替换使用，意思是指氨基酸的聚合物。本说明书中所使用的多肽，按照肽标记的惯例，左端为N末端（氨基末端）、右端为C末端（羧基末端）。作为本发明的多肽的部分肽（本说明书中有时略记为“本发明的部分肽”），是前述本发明的多肽的部分肽，优选是与前述本发明的多肽具有相同的性质的部分肽。

本说明书中的术语“质粒”，是指各种公知的基因要素，例如质粒、噬菌体、转座子、粘粒、染色体等。质粒能够在特定的宿主中复制，并且能够在细胞间输送基因序列。本说明书中，质粒，含有各种公知的核苷酸（DNA、RNA、PNA及其混合物），既可以是单链也可以是双链，优选为双链。例如，本说明书中，在没有特别写明的情况下，术语“rAAV载体质粒”的意思包括通过rAAV载体基因组及其互补链所形成的双链。在本发明中所使用的质粒，既可以是直链状也可以是环状。

本发明的rAAV基因组中所整合的目的治疗用基因，被以高于以往的效率送入神经***细胞中、并整合于该细胞的基因组中。当使用本发明的rAAV载体时，与使用以往的rAAV载体时相比，能够将基因导入约10倍以上、约20倍以上、约30倍以上、约40倍以上或者约50倍以上数量的神经细胞中。对导入了基因的神经细胞的数量能够通过如下方法进行测定，例如，制作对整合了任意标记基因的rAAV载体基因组进行包装的rAAV病毒粒子，接着，将该rAAV病毒粒子给药于待测动物，并测量对整合于rAAV载体基因组中的标记基因（或者标记蛋白质）进行表达的神经***细胞的数量。作为所使用的标记基因，能够选择公知的标记基因。作为上述标记基因，例如，可以举出LacZ基因、绿色荧光蛋白质（GFP）基因、发光蛋白质基因（荧火虫荧光素酶等）等。

本发明中，对rAAV载体基因组进行包装的rAAV病毒粒子，能够通过生物体的血脑屏障，因此通过对被检体进行外周给药，能够向被检体的脑、脊髄等神经***细胞中导入目的治疗用基因。当本发明的rAAV基因组是非sc型时，能够选择更广范围的长度的启动子和目的基因，也能够利用多个目的基因。

本说明书中所使用的术语“包装”是指包括单链病毒基因组的制备、外壳蛋白质（衣壳）的组装、以及通过衣壳来包覆病毒基因组（衣壳化（encapsidation））等的现象。将适当的质粒载体（通常是多个质粒）在适当的条件下导入可包装的细胞株中时，被组装成重组病毒颗粒（即病毒粒子、病毒载体）并被分泌于培养物中。

2.本发明的rAAV病毒粒子的制备

本发明的其它实施方式中提供了制备本发明的rAAV病毒粒子的方法。该方法能够包括如下工序：将（a）编码本发明衣壳蛋白质的第一多核苷酸（通常被称为“AAV辅助质粒”）、以及（b）在本发明rAAV病毒粒子内所包装的第二多核苷酸（含有目的治疗用基因）对培养细胞进行转染的工序。本发明中的制备方法，能够进一步包括（c）将对被称为腺病毒（AdV）辅助质粒的腺病毒来源的因子进行编码的质粒转染于培养细胞的工序，或者还包括使腺病毒对培养细胞进行感染的工序。并且，还能够包括培养上述被转染的培养细胞的工序以及从培养上清液中收集重组腺相关病毒载体的工序。上述方法已经是公知方法，也被利用于本说明书的实施例中。

优选本发明rAAV病毒粒子的制备方法中包括对培养细胞转染下列多核苷酸：（a）第一多核苷酸，其对含有选自于由序列号8、10和12所构成的组中的氨基酸序列的蛋白质进行编码；以及（b）第二多核苷酸，其在序列号13的核苷酸序列与序列号14的核苷酸序列之间具有：包含神经***细胞特异性启动子序列的多核苷酸以及以能够操作的方式连结于该启动子序列的多核苷酸序列。上述第一多核苷酸和第二多核苷酸，包括例如实施例的表1中所记入的多核苷酸的组合。

第一多核苷酸中的对本发明的衣壳蛋白质进行编码的核苷酸，优选以能够操作的方式与培养细胞中作为能够操作的公知的启动子序列相结合。作为上述启动子序列，例如，能够适当使用巨细胞病毒（CMV）启动子、EF-1α启动子、SV40启动子等。并且，可以适当含有公知的增强子序列、Kozak序列、聚A附加信号序列等。

第二多核苷酸在能够与神经***细胞特异性启动子进行操作的位置上含有治疗用基因。并且，可以适当含有公知的增强子序列、Kozak序列、聚A附加信号序列等。该第一多核苷酸，在神经***细胞特异性启动子序列的下游，也可以含有通过各种公知的限制酶能够切断的克隆位点。更优选含有多个限制酶识别部位的多克隆位点。本领域技术人员，能够按照公知的基因操作规程而在神经***细胞特异性启动子的下游整合目的治疗用基因。关于上述基因操作规程，例如参照《分子克隆》（Molecular Cloning3rd Edition（分子克隆第三版）,J.Sambrook等，Cold Spring Harbor Lab.Press.2001）等。

AAV是辅助依赖性病毒，因此，为了制备本发明的rAAV病毒粒子，在对病毒粒子生产用细胞（培养细胞）进行感染时，需要与辅助病毒（例如，腺病毒、疱疹病毒或者牛痘）进行共感染。当没有与辅助病毒共感染时，虽然AAV将病毒基因组***宿主细胞染色体中，但不生成被***的病毒基因组来源的感染性AAV病毒粒子。具有该被***的病毒基因组的宿主，在被辅助病毒感染时，能够生成被整合的基因组来源的感染性AAV病毒粒子。AAV自身能够感染来自不同种的细胞，但需要辅助病毒是与宿主细胞相同的种。例如，人AAV能够在被狗的腺病毒共感染的狗的细胞中进行复制。

本发明rAAV病毒粒子的制备中，能够使用辅助病毒质粒（例如，腺病毒、疱疹病毒或者牛痘）并与上述第一和第二多核苷酸同时导入培养细胞中。优选本发明的制备方法中还含有导入腺病毒（AdV）辅助质粒的工序。AdV的辅助质粒，对复制AAV基因组等所需的E1a、E1b、E2a、E4orf4等的蛋白质进行编码。或者，也可以利用输送需要的辅助功能的重组病毒或非病毒载体（例如，质粒、附加体等）。这样的重组病毒，在本技术领域中是既知的而且能够按照公开的技术进行制造。多种腺病毒株能够从ATCC（AmericanType Culture Collection：美国典型培养物保藏中心）中获取，另外在市场上也有销售。或者，很多腺病毒株的序列，例如，能够从公用的数据库（例如，PubMed、Genbank等）中获取。

本发明中，优选AdV辅助体来自与培养细胞相同种的病毒。例如，当使用人培养细胞293T时，能够使用人AdV来源的辅助病毒载体。作为上述AdV辅助载体，能够使用市场上销售的产品（例如，Agilent Technologies社制造的AAV Helper-Free***（产品目录编号为240071））。

在本发明rAAV病毒粒子的制备中将上述一种以上质粒转染于培养细胞中的方法，例如，能够采用磷酸钙法、脂质转染法、电穿孔法等公知的各种方法。上述方法例如有“Molecular Cloning3rd Ed.（分子克隆第三版）、CurrentProtocols in Molecular Biology，John Wiley&Sons1987-1997”等中所记载的方法。

3.本发明的含有rAAV病毒粒子的医药组合物

本发明进一步的实施方式中，提供了含有本发明的rAAV病毒粒子（rAAV载体）的医药组合物。并且，提供了一种通过利用含有本发明rAAV病毒粒子的医药组合物（下称“本发明的医药组合物”）能够将基因高效率地导入被检体的神经***细胞中并通过该导入的基因能够治疗目的疾病的方法。本发明的rAAV能够通过生物体的血脑屏障，因此，通过对被检体进行外周给药，能够将本发明rAAV基因送入脑、脊髄等神经***细胞中。即，当使用本发明的rAAV时，无需采用脑实质内给药等的需要更慎重的操作的给药方式，因此能够期待有更高的安全性。

在一个实施方式中，本发明的rAAV病毒粒子，优选含有神经***细胞特异性的启动子序列以及与其启动子序列以能够操作的方式相连结的治疗用基因。本发明的rAAV病毒粒子，能够包含对神经疾病（例如帕金森氏病、阿尔茨海默病、三核苷酸重复疾病(Triplet Repeat)、朊病毒病、肌萎缩侧索硬化症、脊髄小脑变性症、离子通道病(channelopathy)、癫痫等）、先天性代谢障碍（威尔逊氏病、过氧化物酶体病等）、脱髄性疾病（多发性硬化症等）、中枢神经感染症（例如HIV脑炎、细菌性髄膜炎等）、血管障碍（脑梗死、脑出血、脊髄梗死）、外伤（脑挫伤、脊髄损伤等）、视网膜疾病（老年性黄斑变性、糖尿病视网膜病等）等的治疗有用的基因，能够将这些基因例如通过血脑屏障而整合于脑、脊髄、视网膜的神经细胞中。本发明的医药组合物中具有包含上述治疗用基因的rAAV病毒粒子。作为上述治疗用基因，能够选择对例如上述的抗体、神经营养因子（NGF）、生长因子（HGF）、酸性成纤维细胞生长因子（aFGF）等进行编码的多核苷酸。例如，作为与帕金森氏病相关的治疗靶向基因，可以举出对α-突触核蛋白（α-Synuclein）的表达进行抑制的反义多核苷酸、RNAi等。例如，通过选择对能够识别凝集性β淀粉样蛋白的单链抗体进行编码的多核苷酸，能够制作用于治疗阿尔茨海默病的rAAV病毒粒子。通过采用上述rAAV病毒粒子对被检体进行外周给药，能够期待治疗帕金森氏病、阿尔茨海默病等神经疾病。本发明的医药组合物，例如，是通过降低患者的脑神经细胞中的α-突触核蛋白（α-Synuclein）的表达水平从而对治疗帕金森氏病有作用，或者是通过对凝集性β淀粉样蛋白的抗体进行表达来降低患者脑中的凝集性β淀粉样蛋白从而对治疗阿尔茨海默病有作用。

当使用本发明的医药组合物时，例如能够通过口服、非口服（静脉内）、肌肉、口腔粘膜、直肠、***、皮肤、鼻腔途径或者通过吸入途径等进行给药，优选非口服方式给药。更优选为静脉内给药。本发明医药组合物的有效成分，既可以单独配制也可以组合配制，也能够通过对其配合有制药学上容许的载体或者制剂用添加物而以制剂的方式进行提供。此时，本发明的有效成分，例如能够在制剂中含有0.1～99.9重量%。

作为制药学上的容许的载体或添加剂，例如，能够使用赋形剂、崩解剂、崩解助剂、结合剂、润滑剂、涂敷剂、色素、稀释剂、溶解剂、溶解助剂、等渗剂、pH调节剂、稳定剂等。

作为适于口服的制剂的例子，例如，可以举出散剂、片剂、胶囊剂、细粒剂、颗粒剂、液剂或者糖浆剂等。在口服的情况下，能够与下列物质一起使用：微晶质纤维素、柠檬酸钠、碳酸钙、磷酸二钾、甘氨酸等的各种赋形剂；淀粉，优选玉米、马铃薯或木薯的淀粉，以及藻酸或某种硅酸复盐等的各种崩解剂；以及，聚乙烯吡咯烷酮、蔗糖、明胶、***胶等的颗粒形成结合剂。另外，在多数情况下，硬脂酸镁、月桂基硫酸钠、滑石等润滑剂对片剂的形成也是非常有效的。也能够将同种固体组合物填充到明胶胶囊后进行使用。作为与此关联的优选物质，可以举出乳糖或者除乳糖之外还可以举出高分子量的聚乙二醇。当要将水性悬浮液和/或酏剂作为口服用时，能够将活性成分与各种甜味料或香味料、色素或染料并用、此外在需要的情况下还与乳化剂和/或悬浮剂并用、与水、乙醇、丙二醇、甘油等、以及将它们组合而成的稀释剂一起使用。

作为适于非口服的制剂，例如，可以例举出注射剂、栓剂等。在非口服给药的情况下，能够使用将本发明的有效成分溶解于芝麻油或花生油中的任一者中、或者溶解于丙二醇水溶液中而形成的溶液。根据需要，对水溶液适当进行缓冲（优选pH8以上），并需要首先使液体稀释剂进行等渗化。作为上述液体稀释剂，例如，能够使用生理盐水。所制备的水溶液适于静脉内注射；另一方面，油性溶液适于关节内注射、肌肉注射和皮下注射。本领域技术人员能够按照公知的标准制药技术容易地实现在无菌状态下制造上述这些全部溶液。并且，也能够将本发明的有效成分对皮肤等局部给药。此时优选按照标准的医药常规而以乳霜、胶冻剂、糊剂、软膏的形式进行局部给药。

对本发明医药组合物的给药量没有特别限定，能够根据疾病种类、患者年龄和症状、给药途径、治疗目的、有无并用药剂等各种条件而选择适当的给药量。本发明的医药组合物的给药量，例如，成人（例如，体重60kg）每天1～5000mg，优选为10～1000mg，但并不限定于这些。这些一天的给药量也可以分成2次～4次给药。另外，当利用vg（vector genome：基因组数量）作为给药单位时，例如，能够选择每1kg体重的给药量为10⁹～10¹⁴vg、优选为10¹⁰～10¹³vg、更优选为10¹⁰～10¹²vg的范围，但并不限定于这些。

4.使用本发明rAAV病毒粒子向生物体导入基因的方法

本发明进一步的实施方式中，提供一种通过使用本发明rAAV病毒粒子而在生物体的神经***细胞中导入基因的方法（下称“本发明的方法”）。具体而言，本发明的方法中，包括将本发明rAAV病毒粒子对被检体进行外周给药的工序。本发明的方法，还包括将包含本发明rAAV病毒粒子的治疗用基因送入脑、脊髄等神经***细胞中的工序。本发明rAAV病毒粒子，能够如上所述地通过生物体（包括成体和胎儿）的血脑屏障。因此，无需采用脑内给药等的需要更慎重的操作的给药方式，因此能够期待有更高的安全性。

实施方式1中，本发明的rAAV病毒粒子，优选具有包含神经***细胞特异性启动子序列以及以能够操作的方式连结于该启动子序列的治疗用基因的重组病毒基因组（这种病毒基因组处于被包装状态）。作为上述治疗用基因，能够选择对例如上述的抗体、神经营养因子（NGF）、生长因子（HGF）、酸性成纤维细胞生长因子（aFGF）等进行编码的多核苷酸。本发明的实施方式1中，例如，将含有对能够识别凝集性β淀粉样蛋白的单链抗体进行编码的多核苷酸的rAAV病毒粒子，对被检体进行外周给药，由此能够减少被检体脑中的凝集性β淀粉样蛋白，并且期待能够治疗阿尔茨海默病。另外，通过使用本发明的rAAV病毒粒子，期待能够治疗（缓和、改善、修复等）神经细胞中的基因上的缺陷（包括先天的缺陷和后天的缺陷）。

5.本发明的试剂盒

本发明的其它实施方式中提供了用于制作本发明的rAAV的试剂盒。上述试剂盒，例如，能够含有上述的（a）第一多核苷酸和（b）第二多核苷酸。例如，第一多核苷酸包括编码序列号8、10和12的蛋白质的多核苷酸。例如，第二多核苷酸，既可以含有也可以不含有目的治疗用基因，但优选能够包含用于整合这种目的治疗用基因的各种限制性酶切位点。

用于制作本发明rAAV病毒粒子的试剂盒，还能够进一步含有本说明书中所记载的任何结构（例如，AdV辅助体（AdV helper）等）。本发明的试剂盒还能够进一步包括记载有使用本发明的试剂盒来制作rAAV病毒粒子用的规约的指示书。

本说明书中未特别说明的术语的含义，是指本领域技术人员通常理解的术语的意思的范围。

实施例

下面，通过实施例进一步具体说明本发明，但本发明的范围并不局限于下述实施例。

材料和方法

（1）AAV的外被（衣壳）蛋白VP1的改变

对1型AAV（AAV1）、2型AAV（AAV2）、9型AAV（AAV9）这三种AAV分别以含有编码各外壳蛋白VP1的碱基序列的质粒pAAV1-RC、pAAV2-RC、pAAV9-RC作为模板来使用。这些质粒来自文献（Handa等，J GenVirol，81:2077-2084，2000）中所记载的AAV3Rep/VP，并含有AAV3的Rep序列的（Muramatsu等Virology221，208-217（1996））。这些AAV的VP1的碱基序列，已经分别在基因库（GeneBank）中作为登录号（AccessionNo.）AF063497、AF043303、AY530579进行了报道（分别如序列号1、3和5所示）。通过合成如下所示的引物、使用Quick Change II XL（商品名称）定点突变试剂盒（Stratagene公司），分别用苯丙氨酸（F）残基置换位于AAV1的VP1氨基酸序列（序列号2）的第445位点、AAV2的VP1氨基酸序列（序列号4）的第444位点、AAV9的VP1氨基酸序列（序列号6）第446位点上的酪氨酸（Y）残基。制作了包含分别对被置换的氨基酸序列AAV1-yfVP1（序列号8）、AAV2-yfVP1（序列号10）和AAV9-yfVP1-3（序列号12）进行编码的多核苷酸的质粒pAAV1-yfRC、pAAV2-yfRC、pAAV9-yfRC。另外，pAAV1-yfRC、pAAV2-yfRC、pAAV9-yfRC均包含对AAV2的Rep进行编码的核苷酸序列（序列号15）。

yfAAV1-F：

5'-CGACCAATACCTGTATTTCCTGAACAGAACTC-3'（序列号17）

yfAAV1-R：

3'-GCTGGTTATGGACATAAAGGACTTGTCTTGAG-5'（序列号18）

yfAAV2-F：

5'-CGACCAGTACCTGTATTTCTTGAGCAGAACAAAC-3'（序列号19）

yfAAV2-R：

3'-GCTGGTCATGGACATAAAGAACTCGTCTTGTTTG-5’（序列号20）

yfAAV9-F：

5'-CGACCAATACTTGTACTTTCTCTCAAAGAC-3'（序列号21）

yfAAV9-R：

3'-GCTGGTTATGAACATGAAAGAGAGTTTCTG-5'（序列号22）

（2）rAAV载体的制作

（a）载体基因组质粒的制作

作为神经细胞特异性启动子使用了突触蛋白I（Synapsin I（SynI）启动子（GeneBank登录号M55300.1，序列号23），或者作为少突胶质细胞（少突神经胶质）特异性启动子使用了髓鞘碱性蛋白（MBP）启动子（GeneBank登录号M63599，序列号24）。另外，作为对照使用了巨细胞病毒增强子和鸡β-肌动蛋白启动子（cytomegalovirus enhancer/chickenβ-actin promoter）（CAG）的启动子（Niwa H等，Gene108：193-200，1991）。通过在含有3型AAV（AAV3）的DNA序列的质粒pAAV3的5'侧和3'侧的、被称为倒转末端重复（inverted terminal repeats（ITR））的发夹DNA序列之间***这些启动子和绿色荧光蛋白质（GFP）的碱基序列（TAKARA产品编码Z2468N），制作了三种质粒pAAV-SynI-GFP、pAAV-MBP-GFP、pAAV-CAG-GFP。这些质粒的基本结构在“Li等，Mol Ther13：160-166.2006”中有记载。

（b）对HEK293细胞的转染

＜第一天＞

将1.5×10⁶的HEK293细胞接种于225cm²烧瓶中，并使用10%的FCS-DMEM/F12培养基在5%CO₂、37℃下进行了培养。

＜第三天＞

采用磷酸钙法进行转染。将下面10种组合的质粒（AAV载体质粒＋AAV的辅助质粒）以及含有腺病毒（AdV）的碱基序列的辅助质粒pHelper（AgilentTechnologies公司制造的AAV Helper-Free System（登记号：240071）），分别按每次25μg（总计75μg）逐步混合于0.3M的CaCl₂中。

表1

然后，加入2×HBS（80mM NaCl，50mM赫佩斯缓冲液（Hepes buffer），1.5mM Na₂HPO₄（pH7.10）），制作DNA-磷酸钙。将烧瓶中的培养液与添加有DNA-磷酸钙的培养基进行替换，培养几小时之后更换培养基。

＜第六天＞

回收采用上述组合所获得的10种重组病毒粒子（上述表中“rAAV病毒粒子”）。加入0.5M的EDTA后，将细胞从培养皿中剥离、悬浮于TBS（100mM的三氨基甲烷盐酸盐（Tris HCl），pH8.0，150mM的NaCl）中。通过使用干冰乙醇和37℃的水浴来反复冷冻/融解3次，将细胞破碎。以10000×g进行离心10分钟后，回收上清液并去除了粗大的细胞碎片。

（c）病毒载体的提纯

按照如下步骤，按照氯化铯（CsCl）的密度梯度进行超速离心、提纯rAAV载体。将1.5M和1.25M的CsCl在超速离心管内分层、制作了密度梯度。将含有rAAV载体的细胞破碎溶液分层后进行超速离心（30000rpm，2.5小时）。测量折射率，回收含有RI为1.365～1.380的rAAV载体的组分。再次在CsCl溶液上对该组分进行分层，进行超速离心（36000rpm，2.5小时），获得含有rAAV的组分。

（d）病毒载体效价的测定（实时PCR）

制作了提纯的rAAV的10^-2～10^-6的稀释系列。通过使用以GFP序列作为标准的引物组（序列号25和26），采用Applied Biosystems7900HT Fast（商品名称）实时PCR***（Applied Biosystems公司）进行了定量。

实施例1

1.对成体小鼠脑神经细胞导入基因

（1）对小鼠心腔内进行rAAV载体的给药

使用了出生后4个月龄的成体小鼠C57BL6、雄性、30只（各载体分别对应3只）。按每30g体重200μl将戊巴比妥钠给药于腹腔内并进行麻醉、固定于小动物固定装置上。使用胰岛素注射用的1ml注射器，经皮肤穿刺左心室，注入了用PBS稀释而成的上述各载体2×10¹²vg（给药量：100μl）。通过置于加热垫上的笼子来进行观察直至从麻醉中醒来。然后，将小鼠笼子送回感染动物用架子上。

（2）免疫组织化学

在深度麻醉下使用PBS、然后使用4%冰冷PFA（多聚甲醛）对小鼠进行回流。将脑和脊髄取出、接着在4%的PFA中进行4小时的后固定。制作从前囟（Bregma）出发前方0.7mm～后方2.5mm的范围（3.2mm）的脑的冠状剖面切片（40μm）。另外，制作颈髓的水平切割片（40μm）。在含有2%小鼠IgG封闭液（Mouse IgG Blocking solution）（M.O.M Kit（免疫检测试剂盒）；Vector Laboratories，Burlingame，CA、US）的0.3%的曲通（Triton）X-100/PBS中封闭了1小时。接着，与NeuN（1:100，小鼠抗神经元核单克隆抗体（mouse anti-Neuronal nuclei monoclonal antibody）；Chemicon，Temecula，CA，USA）和GFP（1:1000，兔抗GFP的多克隆抗体（rabbit anti-GFPpolyclonal antibody）；Abcam，Cambridge，MA，USA）一起在4℃下培养过夜。然后，与Alexa Fluor（注册商标）594抗小鼠（anti-mouse）IgG、AlexaFluor（注册商标）488抗兔（anti-rabbit）IgG（1:500，Invitrogen，Carlsbad，CA，USA）一起在室温下培养2小时达到了可视化。在激光共聚焦显微镜（TCSNT；Leica，Heidelberg，Germany）下观察，采用200μm间隔的切片，计量大脑皮质的0.04mm³（1mm×1mm×40μm）的范围、以及脊髄的每一切片的GFP和NeuN阳性细胞。另外，通过如下所述的GFP/ChAT二重免疫荧光染色来鉴定脊髄的GFP阳性细胞。同样地，将颈髓的切片进行封闭后，与ChAT（稀释至1:100，小鼠抗ChAT多克隆抗体（mouse anti-ChAT polyclonalantibody）；Chemicon，Temecula，CA，USA）和GFP（稀释至1:1000，Abcam）一起在4℃下进行培养过夜。然后，与Alexa Fluor（注册商标）594抗小鼠（anti-mouse）IgG，Alexa Fluor（注册商标）488抗兔（anti-rabbit）IgG（1:500，Invitrogen公司）一起在室温下培养2小时并达到可视化，同样地观察了GFP/NeuN二重染色。

为了GFP/Olig2二重免疫荧光染色，将切片置于含有3%的山羊血清的0.3%的曲通（Triton）X-100/PBS中进行封闭后，与Olig2（稀释至1:50，兔抗Olig2多克隆抗体（rabbit anti-Olig2polyclonal antibody）；IBL，Takasaki，Gunma，Japan）一起在4℃下培养过夜。然后，与Alexa Fluor（注册商标）594抗兔（anti-rabbit）IgG、接着与Alexa Fluor（注册商标）488共轭的抗GFP的兔多克隆抗体（conjugated anti-GFP rabbit polyclonal antibody）（稀释至1:400，Invitrogen公司）一起在室温下以每次2小时逐次进行培养。与其它荧光免疫染色同样地进行观察，测量了发荧光的细胞数。

2.结果

（1）在上述表1中记载的组合中产生以下6种rAAV载体的组合中，未见大脑皮质和脊髄的神经细胞中有GFP的表达。

AAV1-CAG-GFP（试样编号：1）；

yfAAV1-CAG-GFP（试样编号：2）；

AAV1-SynI-GFP（试样编号：3）；

AAV2-SynI-GFP（试样编号：5）；

yfAAV2-SynI-GFP（试样编号：6）；

AAV9-CAG-GFP（试样编号：7）。

（2）在yfAAV1-SynI-GFP的组合（试样编号：4）中，未见大脑和脊髄的神经细胞中有GFP的表达。另一方面，在AAV1-SynI-GFP的组合（试样编号：3）中未见有阳性细胞（图1）。因此，通过用苯丙氨酸（F）置换AAV1的衣壳蛋白质VP1的第445位的酪氨酸（Y），显示出将基因高效率地导入脑内的神经细胞中是可能的。

（3）在yfAAV9-CAG-GFP（试样编号：8）中，虽然可见到少数神经细胞中有GFP的表达，但是大部分GFP阳性细胞不是神经细胞而是胶质细胞。另一方面，在yfAAV9-SynI-GFP（试样编号：9）中，进一步确认有约4倍数量的GFP阳性的神经细胞（图2A、2B和图3）。另外，在yfAAV9-MBP-GFP中，确认有数量多的GFP阳性的少突胶质细胞（图2C）。因此，通过使用神经细胞特异性启动子或者少突胶质细胞特异性启动子序列，显示出通过进行外周给药的rAAV载体而高效率地将基因导入脑内神经细胞和少突胶质细胞中是可能的。

当对rAAV病毒粒子不进行外周给药而直接注入脑内时，即使利用CAG启动子时导入神经细胞内的效率也充分高，具体显示出基因表达水平比SynI启动子相比高2～4倍以上（Hioki等，Gene Ther14:872-882，2007等）。但是，当将本申请的rAAV病毒粒子进行外周血管内给药时，利用了CAG启动子的rAAV病毒粒子，在胶质样细胞中而不是在神经细胞中能够见到基因表达的大部分。当对采用通常的CMV启动子的rAAV载体加以使用时，也同样地，在成体中大部分的rAAV病毒粒子是导入胶质样细胞中而不是导入神经细胞中。

另一方面，对神经细胞中的基因表达而言，作为神经细胞特异性启动子的SynI，优于CAG启动子。因此，上述的结果是，作为与本发明的rAAV病毒粒子组合的启动子，与诸如CAG启动子这种非特异性的、通常性强力的启动子相比，还不如SynI等的神经细胞特异性启动子更有利。采用它们的组合，显示出对采用外周给药将基因导入神经细胞而发挥的协同效果。

对脊髄而言，在每片颈髓的切片上可见有24±3.5个GFP和NeuN是阳性的神经细胞。并且，各切片的GFP阳性细胞中有4～5个是ChAT阳性的运动神经细胞（图4）。因此，通过使用神经细胞特异性启动子（SynI）或者少突胶质细胞特异性启动子（MBP），示出了采用外周给药能够稳定地将基因导入成体小鼠的脑和脊髄的神经细胞和少突胶质细胞中。

3.总结

基于上述的结果，显示出了：通过用苯丙氨酸（F）残基来置换野生型AAV1/2/9的衣壳蛋白质VP1的各个445/444/446位的酪氨酸（Y）残基，以及通过将作为神经细胞特异性启动子的SynI启动子序列或者MBP启动子序列与目的治疗用基因进行组合后进行使用，本发明的rAAV载体通过对成体小鼠进行外周给药而能够通过血脑屏障，能够最终高效率地将基因导入脑和脊髄的神经***细胞中。

实施例2

通过对母亲小鼠进行外周给药而将基因导入其胎儿的脑中

已有报道是通过在母亲小鼠的羊膜血管内给药rAAV载体而将基因导入胎儿中（RAHIM等，FASEB Journal，pp1-14，Vol.25，October2011）。因此，针对将本发明rAAV载体对母亲小鼠进行外周给药时对胎儿的基因导入进行了试验。

材料和方法

rAAV载体：yfAAV9-SynI-AcGFP1（试样编号：9）

效价：1.3×10¹³基因组数量（vector genome）/ml

给药量：50μl

给药方法

将上述rAAV载体，对妊娠第13天的母小鼠（3只）进行心腔内给药，然后对所出生的仔小鼠（计9只）在生后的第1天、第3周、第4周和第11周采用4%的多聚甲醛（PFA）进行回流固定，并制作了各脑的海马区附近的冠状断面切片（厚度：40μm）。在制作的各切片试样中，与上述同样地，检测神经细胞内所表达的GFP。

结果

当测量来自5只的共计20片的切片试样中所表达的GFP时，确认有平均4.6个/切片的GFP阳性细胞（图5）。因此，显示出：本发明的rAAV载体，即使在对母体进行外周给药时，也能够将基因导入胎儿的脑神经细胞中。

实施例3

使用重组AAV载体：yfAAV9-SynI-GFP-miAADC的脑神经细胞中的芳香族氨基酸脱羧酶（AADC）的表达控制

对本发明的rAAV载体而言，通过在病毒基因组中整合miRNA等，试验了是否作为治疗用载体能够有用于控制内源性基因的表达。作为具体的步骤是，通过以yfAAV9-SynI-GFP（试样编号:9）作为基质，并且含有yfAAV9作为外壳蛋白，并使用神经细胞特异性的突触蛋白（Synapsin）I启动子，由此制作对小鼠芳香族氨基酸脱羧酶（AADC）的miRNA和荧光绿色蛋白（GFP）进行表达的rAAV载体，将其对小鼠进行给药，从而试验了能否降低脑神经细胞内的AADC。

作为使用的miRNA，合成了以相当于小鼠AADC（Genebank登录号为NM_016672）的碱基编号831～851的5'-TGCCTTTATGTCCTGAATT-3'（序列号27）作为目标的下述序列。

5'-GAATTCAGGACAGATAAAGGCAGTTTTGGCCACTGACTGACTGCCTTTATGTCCTGAATT-3'（序列号28）

在上述表1中编号为9的试样所示的rAAV载体基因组质粒pAAV-SynI-GFP中的GFP基因的下游整合该序列，由此制作pAAV-SynI-GFP-miAADC（参照序列号29）。与编号为9的试样同样地，通过同时使用AAV辅助质粒pAAV9-yfRC和AdV辅助质粒pHelper，来制备rAAV病毒粒子yfAAV9-SynI-GFP-miAADC。

材料和步骤

rAAV载体：yfAAV9-SynI-GFP-miAADC

效价：1.7×10¹⁴基因组数量（vector genome）/ml

成体小鼠：C57BL/6J，10周龄，雄性，4只

心腔内给药：50μl/只

脑组织分析的步骤

在rAAV载体给药2周后，使用4%的多聚甲醛（PFA）进行回流固定，然后取出脑后进行固定4小时，经过10%→20%→30%的蔗糖处理，在载玻片上制作厚度为40μm的冠状断面切片。为了免疫染色，采用3%的正常山羊血清（normal goat serum）对切片试样进行封闭后，将作为一级抗体的兔抗AADC（抗-AADC，稀释至1:5000，由名古屋大学的永津俊治博士提供）和小鼠抗酪氨酸羟化酶（抗-TH）（稀释至1:800，Dia Sorin公司制造）与切片试样在4℃下发生反应过夜。作为二级抗体使用了Alexa Fluor（注册商标）594抗兔IgG和Alexa Fluor（注册商标）405抗小鼠IgG（以上均稀释至1:1000，均由Life technologies制造），将这些抗体分别与各切片试样在室温下发生反应2小时。然后，使用Alexa Fluor（注册商标）488共轭抗（conjugate anti）-GFP（稀释至1:400；Life technologies公司制造），并将该抗体与各切片试样在室温下反应1小时。采用共焦点激光扫描型显微镜（FV10i；Olympus，东京），将切片试样中的各荧光物质进行图像化（图6）。

结果

图6的左图（抗-GFP）中，可见在黑质致密部有5个GFP阳性细胞，因此确认本发明的rAAV载体与上述实施例同样地能够将基因导入神经细胞中。当对使抗-AADC对这些神经细胞发生反应的结果进行观察时，则是背景程度，并没有明显呈色（图6的中间图，抗-AADC）。因此，通过使用本发明的rAAV载体，能够显著地降低AADC在脑神经细胞中的表达。作为对照，确认仍保持着对作为细胞内蛋白质的酪氨酸羟化酶（Tyrosine hydroxylase：TH）的表达（图6的右图，抗-TH）。根据以上所述，示出了本发明的rAAV载体能够将基因导入脑神经细胞中、并且作为通过在病毒基因组中整合miRNA等来抑制内源性基因的表达等的治疗用载体是有用的。

工业实用性

本发明的重组腺相关病毒（rAAV）的病毒粒子能够通过血脑屏障，因此能够通过外周给药等简易的给药方法将基因导入神经***细胞中。因此，例如，通过在本发明的重组载体中整合对抗体、神经营养因子等有用蛋白质进行编码的多核苷酸，能够提供一种能将基因导入神经***细胞中的医药组合物。例如，整合有对导致阿尔茨海默病的原因的β淀粉样蛋白凝集体的抗体进行编码的基因的本发明的重组载体，能够提供更安全的治疗阿尔茨海默病的方法。另外，通过使用本发明的病毒颗粒制备方法和/或本发明的试剂盒，能够制作用于将目的基因导入神经***细胞中的病毒颗粒。

序列表自由内容

序列号1野生型AAV1来源的衣壳蛋白质AAV1-VP1的核苷酸序列（GenBank：NC_002077.1）

序列号2野生型AAV1来源的衣壳蛋白质AAV1-VP1的氨基酸序列（GenBank：NC_2077.1）

序列号3野生型AAV2来源的衣壳蛋白质AAV2-VP1的核苷酸序列（GenBank：NC_001401.2）

序列号4野生型AAV2来源的衣壳蛋白质AAV2-VP1的氨基酸序列（GenBank：NC_001401.2）

序列号5野生型AAV9来源的衣壳蛋白质AAV9-VP1的核苷酸序列（GenBank：AY530579.1）

序列号6野生型AAV9来源的衣壳蛋白质AAV9-VP1的氨基酸序列（GenBank：AY530579.1）

序列号7AAV1来源的衣壳蛋白质突变体AAV1-yfVP1的核苷酸序列

序列号8AAV1来源的衣壳蛋白质突变体AAV1-yfVP1的氨基酸序列

序列号9AAV2来源的衣壳蛋白质突变体AAV2-yfVP1的核苷酸序列

序列号10AAV2来源的衣壳蛋白质突变体AAV2-yfVP1的氨基酸序列

序列号11AAV9来源的衣壳蛋白质突变体AAV9-yfVP1的核苷酸序列

序列号12AAV9来源的衣壳蛋白质突变体AAV9-yfVP1的氨基酸序列

序列号13AAV3来源的5'侧ITR核苷酸序列（来源于GenBank：NC_001729）

序列号14AAV3来源的3'侧ITR核苷酸序列

序列号15AAV2来源的rep基因核苷酸序列

序列号16AAV2来源的Rep蛋白质氨基酸序列

序列号17突变导入引物1（yfAAV1-F）核苷酸序列

序列号18突变导入引物2（yfAAV1-R）核苷酸序列

序列号19突变导入引物3（yfAAV2-F）核苷酸序列

序列号20突变导入引物4（yfAAV2-R）核苷酸序列

序列号21突变导入引物5（yfAAV9-F）核苷酸序列

序列号22突变导入引物6（yfAAV9-R）核苷酸序列

序列号23突触蛋白I启动子序列（GenBank：M55300.1）

序列号24髓鞘碱性蛋白质启动子序列（GenBank：M63599（人）来源）

序列号25GFP检测用引物1核苷酸序列

序列号26GFP检测用引物2核苷酸序列

序列号27针对小鼠芳香族氨基酸脱羧酶（AADC：Genebank登录号为NM_016672）的831～851碱基而设计的核苷酸序列

序列号28产生针对小鼠芳香族氨基酸脱羧酶（AADC）的miRNA所用的核苷酸序列

序列号29表达针对GFP和小鼠芳香族氨基酸脱羧酶（AADC）的miRNA（序列号28）所用的核苷酸序列

Claims

1.一种重组腺相关病毒粒子，其包括：

2.如权利要求1所述的病毒粒子，其中，所述蛋白质含有至少序列号2中的445位的酪氨酸残基、序列号4中的444位的酪氨酸残基、或者序列号6中的446位的酪氨酸残基被置换了的氨基酸序列。

3.如权利要求1或2所述的病毒粒子，其中，所述酪氨酸残基被置换为苯丙氨酸残基。

4.如权利要求1～3中任一项所述的病毒粒子，其中，所述蛋白质含有序列号8、10或12的氨基酸序列、或者在序列号8、10或12的氨基酸序列的444～446位以外的位置中具有一个至数个氨基酸的缺失、置换、***和/或添加的氨基酸序列，并且能够形成病毒粒子。

5.如权利要求1～4中任一项所述的病毒粒子，其中，在所述多核苷酸的5'末端和3'末端，分别含有来自AAV1、AAV2、AAV3或者AAV4的5'末端和3'末端的倒转末端重复ITR序列。

6.如权利要求1～5中任一项所述的病毒粒子，其中，在所述多核苷酸的5'末端和3'末端，分别含有序列号13和序列号14的核苷酸序列。

7.如权利要求1～5中任一项所述的病毒粒子，其中，所述多核苷酸具有总长约2～6kb的长度，并且是正义链或者反义链的单链DNA。

8.如权利要求1～6中任一项所述的病毒粒子，其中，所述启动子序列选自于由下列启动子序列所构成的组中：突触蛋白I启动子序列；髓鞘碱性蛋白启动子序列；神经元特异性烯醇化酶启动子序列；钙/钙调蛋白依赖性蛋白激酶II启动子、即CMKII启动子；微管蛋白αI启动子；血小板来源生长因子β链启动子；胶质纤维酸性蛋白GFAP启动子序列；L7启动子序列、即小脑浦肯野细胞特异性启动子；以及谷氨酸受体δ2启动子、即小脑浦肯野细胞特异性启动子。

9.如权利要求7所述的病毒粒子，其中，所述启动子序列含有序列号23或者序列号24所述的多核苷酸。

10.如权利要求7所述的病毒粒子，其中，以能够操作的方式连结于所述启动子序列的核苷酸序列，编码选自于由抗体、神经营养因子NGF、生长因子HGF、酸性成纤维细胞生长因子aFGF、碱性成纤维细胞生长因子bFGF、胶质细胞源性神经营养因子GDNF、芳香族氨基酸脱羧酶AADC以及β淀粉样蛋白分解酶的脑啡肽酶所构成的组中的蛋白质。

11.如权利要求7所述的病毒粒子，其中，以能够操作的方式连结于所述启动子序列的核苷酸序列，表达了相对于芳香族氨基酸脱羧酶AADC或者α-突触核蛋白的dsRNA、siRNA、shRNA、或者miRNA。

12.如权利要求9所述的病毒粒子，其中，所述抗体是对凝集性β淀粉样蛋白的抗体。

13.如权利要求1～12中任一项所述的病毒粒子，其中，该病毒粒子能够通过被检体的血脑屏障。

14.如权利要求1～13中任一项所述的病毒粒子，其中，所述病毒粒子是腺相关病毒载体。

15.一种医药组合物，其中，其含有权利要求1～14中任一项所述的病毒粒子。