CN101972476B - 利用MicroRNA-155的核酸疫苗佐剂及其构建方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及医药生物学技术领域。MicroRNA-155是一种调节T细胞和B细胞成熟及天然免疫反应的小分子RNA。本发明提供一种基于microRNA-155设计的用于增强核酸疫苗细胞免疫效果的质粒,经过在pcDNA-3.1质粒中***microRNA-155前体分子的表达序列获得质粒pcDNA3.1-pre-miR-155,可高效表达microRNA-155前体分子,并不影响共转染的核酸疫苗的表达能力。在体内试验中,该质粒与核酸疫苗同时注射具有有效地诱导细胞免疫反应的能力,表现为抗原特异性脾脏IFN-γ阳性细胞增多和脾脏CD8阳性细胞杀靶能力增强。本发明的质粒可以添加到现有核酸疫苗制剂内混合注射,从而显著促进核酸疫苗诱导的细胞免疫反应,作为一种新型的细胞免疫佐剂。
Description
技术领域
本发明涉及医药生物学技术领域,尤其涉及核酸疫苗的免疫活性增强技术领域。
背景技术
MicroRNAs是一种丰富的内源性的非编码的RNAs,在转录的过程中在3′UTR区通过缺陷碱基互补配对来调节靶向性mRNAs的表达,由此调节mRNA***及转录抑制。(Kato,M.and Slack,F.J.(2008)microRNAs:small molecules with big roles-C.elegans to human cancer.Biol.Cell,100,71-81.)MicroRNAs主要调节很多生物进程,包括在天然免疫应答中许多细胞的分化和活化。(Garzon,R.and Croce,C.M.(2008)MicroRNAs in normal and malignant hematopoiesis.Curr.Opin.Hematol.,15,352-358.)其中一种典型的MicroRNA:MicroRNA-155是一种调节T细胞和B细胞成熟及天然免疫反应的小分子RNA。(Rodriguez,A.,Vigorito,E.,Clare,S.,Warren,M.V.,Couttet,P.,Soond,D.R.,van,D.S.,Grocock,R.J.,Das,P.P.,Miska,E.A.et al.2007)Requirement ofbic/microRNA-155for normal immune function.Science,316,608-611.)它是一种免疫负向调控分子,其主要作用是限制炎症介质的释放、激发粒细胞和单核细胞的增值来增强天然免疫,同时使B细胞产生高亲和性的IgG1抗体,削弱Th1细胞和Th2细胞分化,T细胞正面调节使抗原减低等方面来增强获得性免疫反应。(Mark A.Lindsay(2008)microRNAs andthe immune response,cell,346-348)在生理情况下,该分子对体内免疫反应,尤其是细胞免疫反应的自然衰减过程意义重大。有研究表明MicroRNA-155在基因敲除小鼠中可使Th2细胞产生大量的各类细胞因子,如IL-4,IL-5,IL-10等。(Rodriguez,A.et al.(2007)Requirement ofbic/microRNA-155 for normal immune function.Science 316,608-611)这些细胞因子是与B细胞免疫有关的细胞因子。同时有研究表明MicroRNA-155能够下调T淋巴细胞免疫应答,主要表现为γ干扰素(IFN-γ)及白介素2(IL-2)的减少。(Thai,T.H.et al.(2007)Regulation of the germinal center response by microRNA-155.Science 316,604-608)。这些发现提示,microRNA-155对抗原特异性免疫反应的建立有重要调节作用,因此可能在疫苗领域具有很大研究和应用价值。
核酸疫苗是一种重要的新型疫苗。(Donnelly,J.J.,J.B.Ulmer,J.W.Shiver,and M.A.Liu.DNA vaccines.Annu.Rev.Immunol.,1997,15:617-648)由于其诱导细胞免疫反应的特殊能力,它在某些病毒感染,胞内菌感染,肿瘤等疾病的治疗上有着特殊的意义。核酸疫苗免疫后,产生免疫反应的主要包括天然免疫应答和获得性免疫应答。但是核酸疫苗也存在着明显的不足,即核酸疫苗刺激机体产生免疫应答的能力往往比常规疫苗接种引起的免疫反应弱,这就给核酸疫苗的研究提出了新的挑战。因此,核酸疫苗佐剂已成为当今倍受关注的研究热点。目前作为核酸疫苗的佐剂主要有细胞因子、共刺激分子、CpG DNA和脂质体(Donnelly,JJ,Wahren,B,and Liu,MA.DNA vaccines:progress andchallenges.J Immunol.,2005,175:633-639.)。
但是,现有的核酸疫苗佐剂中,并没有利用MicroRNA-155质粒载体作为疫苗佐剂的研究报道和相关专利。
发明内容
本发明的目的在于提供一种具有细胞免疫增强活性的利用MicroRNA-155质粒载体的核酸疫苗佐剂及其构建方法。
本发明鉴于MicroRNA-155在B细胞和T细胞免疫应答有重要调节意义,增强MicroRNA-155在核酸疫苗免疫局部细胞内的表达,可能对疫苗诱导的特异性免疫增强有很大意义。
本发明提供了一种具有细胞免疫增强活性的核酸疫苗佐剂,其特征在于该核酸疫苗佐剂是含有可以有效表达MicroRNA-155前体分子的DNA序列的质粒,其中的DNA序列如SEQ ID NO:4所示。
上述的质粒是pcDNA.3.1(+),本发明也可以用pVAX1或pEZX等其他真核表达质粒替代。质粒也可以以腺病毒、慢病毒等替代。
本发明还提供了上述核酸疫苗佐剂的构建方法,包括以下步骤:A)设计PCR引物如SEQ ID NO:2或3所示,采用人外周血单核细胞抽提的基因组DNA进行PCR,得到编码MicroRNA-155前体分子的DNA序 列如SEQ ID NO:4所示;
B)将上述编码MicroRNA-155前体分子的DNA序列克隆入质粒。
本发明的具体内容如下:
1、首先根据互联网数据库信息查找了人类的microRNA-155前体分子序列(GENBANK NR 030784.1,如SEQ ID NO:1所示),针对其侧翼基因组编码序列设计PCR引物(上下游分别添加BamH I和EcoR I酶切位点),采用人外周血单核细胞抽提的基因组DNA进行PCR,克隆用PCR引物如下:
上游引物:3’GGATCCGGTGGCACAAACCAGGAA 5’(如SEQ ID NO:2所示)
下游引物:5’GAATTCTCTAAGTTTATCCAGCAGGGTG 3’(如SEQ ID NO:3所示)
从而获取了包含microRNA-155前体分子的DNA片段(如SEQ IDNO:4所示,247bp)。
2、在购自美国Invitrogene公司的商品化质粒pcDNA.3.1(+)的多克隆区域连入上述克隆的包含pre-miR-155编码序列的DNA片段(如图1所示),采用BamH I和EcoR I酶切位点。该***序列侧翼的多克隆酶切位点仍然保留,可以用于***抗原序列并不影响其有效表达。所述即为pre-miR-155表达载体:pcDNA.3.1-pre-miR-155。
本发明的一种含有hsa-miR-155前体编码序列的质粒pcDNA.3.1-pre-miR-155,该质粒可以在体内外高效表达人类MicroRNA-155前体分子(pre-miR-155),并经过剪切作用形成MicroRNA-155成熟体,体外试验中可以促使细胞MicroRNA-155成熟体浓度提高1000倍以上。经过与乙肝表面抗原核酸疫苗共注射免疫小鼠,我们发现该质粒对核酸疫苗免疫效力提高尤其是细胞免疫反应的增强有重要作用,因此,所述质粒与核酸疫苗共注射可以作为一种新的核酸疫苗免疫效力增强方法。
本发明的质粒经过验证,具有以下属性:(1)该质粒可以高效增加细胞内的MicroRNA-155分子表达水平。(2)该质粒可以与各种核酸疫苗共免疫而不影响后者表达抗原。(3)将该质粒与乙肝表面抗原核酸疫苗共注射小鼠,可以诱导很强的抗原特异性细胞免疫反应,较传统核酸疫苗有显著提高。但是对抗体滴度影响不显著。(4)在多次大剂量免疫 该载体的实验中,实验动物未出现任何异常超敏反应或自身免疫现象。
附图说明
图1:pcDNA3.1-pre-miR-155质粒模式图
将pre-microRNA-155干扰表达元件通过BamH I和EcoR I位点***pcDNA3.1(+)载体的多克隆区域,获得表达has-MicroRNA-155的载体。图中绿色区域为pre-microRNA-155表达序列***位点,绿色区域以外的多克隆位点仍然保留,可用于抗原编码序列***。该质粒含有氨苄霉素抗性基因。
图2:pcDNA3.1-pre-miR-155质粒的体外表达验证
其中图2A是pcDNA3.1-pre-miR-155质粒(pMiR-155)单独转染HEK293细胞后MicroRNA-155的表达效率验证,pcDNA3.1空质粒(pcDNA)转染细胞和未处理细胞作为对照;图2B是pcDNA3.1-pre-miR-155质粒(pMiR-155)与核酸疫苗pVAX 1-HBsAg(pHBs)共同转染HEK293细胞后,通过ELISA检测上清中HBsAg表达量来验证pHBs表达效率,pcDNA3.1空质粒与pHBs(pcDNA+pHBs)共同转染细胞和pHBs单独转染细胞作为对照;图2C是pcDNA3.1-pre-miR-155质粒(pMiR-155)与核酸疫苗pVAX1-HBsAg(pHBs)共同转染HEK293细胞后对MicroRNA-155的表达效率进行验证,pcDNA3.1空质粒与pHBs(pcDNA+pHBs)共同转染细胞和pHBs单独转染细胞作为对照;所有实验均重复3次,图中显示的是平均值+标准差。
图3:pcDNA3.1-pre-miR-155质粒对pVAX1-HBsAg核酸疫苗的佐剂效果验证
对C57/BL小鼠接种pcDNA3.1-pre-miR-155质粒与核酸疫苗pVAX1-HBsAg(pHBs+pMiR-155)的混合制剂,并以Mock质粒pcDNA3.1与核酸疫苗pVAX1-HBsAg联合免疫(pHBs+Mock);单独注射PBS两组作为对照。免疫3次,检测其免疫指标。其中图3A是各组小鼠免疫过程中随免疫时间血清乙肝特异性抗体水平的变化曲线。图中表示为血清1∶20稀释后进行HBsAg特异性ELISA检测的OD450数值,重复3次取平均值。图3B是末次免疫后1周,处死小鼠后取脾脏淋巴细胞并以乙肝表面抗原刺激,采用ELISPOT方法检测各组小鼠脾脏T细胞的 IL-4和IFN-γ分泌情况。图中显示了每组内3只小鼠检测的平均值+标准差;图3C是小鼠脾脏淋巴细胞经过抗原诱导和CD4细胞、CD8细胞分别剔除后,检测其杀伤乙肝抗原阳性靶细胞的能力。图中显示了在不同效应细胞:靶细胞比例下,脾脏淋巴细胞的杀伤效率曲线。图中数值为每组内3只小鼠检测的平均值+标准差。
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本发明作详细描述,但本发明的实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的保护范围。
实施例1:pcDNA3.1-pre-miR-155质粒的构建
我们首先根据互联网数据库信息(http://www.mirbase.org)查找了编码人类microRNA-155前体分子(GENBANK:NR_030784,如SEQ IDNO:1所示)的基因组序列,针对其侧翼序列设计PCR引物(上下游分别添加BamH I和EcoR I酶切位点),采用人外周血单核细胞抽提的基因组DNA进行PCR,microRNA-155前体分子序列和克隆用PCR引物如下表。从而获取了包含microRNA-155前体分子编码序列的DNA片段。
我们在购自美国Invitrogene公司的商品化质粒pcDNA.3.1(+)的 多克隆区域连入上述克隆的包含pre-miR-155编码序列的DNA片段(如图1和以下序列所示),采用BamH I和EcoR I酶切位点。该***序列侧翼的多克隆酶切位点仍然保留,可以用于***抗原序列并不影响其有效表达。所述即为pre-miR-155表达载体:pcDNA.3.1-pre-miR-155。
实施例2:pcDNA3.1-pre-miR-155质粒的体外表达验证
利用293T细胞(购自美国ATCC公司)作为体外模型,利用Lipofectamine2000转染试剂(美国Invitrogene公司,参照其说明书进行操作)将pcDNA3.1-pre-miR-155质粒(pMiR-155)转染细胞。设立pcDNA3.1(pcDNA)空质粒转染组和未处理组(Untreated)作为对照。24小时后采用Trizol试剂(美国Invitrogene公司,参照其说明书进行操作)抽提细胞总RNA,采用广州复能基因有限公司的microRNA实时定量检测试剂盒,参照其公司说明书以realtime PCR方法检测细胞内has-microRNA-155成熟体的表达水平,发现pcDNA3.1-pre-miR-155质粒转染后has-microRNA-155成熟体的表达水平上升超过1000倍(如图2A所示)。
实施例3:pcDNA3.1-pre-miR-155质粒与pVAX1-HBsAg核酸疫苗共转染情况下体外表达能力检测。
利用293T细胞作为体外模型,利用Lipofectamine2000转染试剂z转染以下三组质粒,1.pVAX1-HBsAg和pcDNA3.1空质粒组 (pHBs+pcDNA)转染;2.pcDNA3.1-pre-miR-155质粒与pVAX1-HBsAg转染(pHBs+pMiR-155);3.pVAX1-HBsAg单独转染(pHBs)。24小时后采用双抗体夹心ELISA方法检测细胞培养基上清中HBsAg抗原的表达水平,发现pcDNA3.1-pre-miR-155质粒与pVAX1-HBsAg共同转染后,pVAX1-HBsAg仍然可以高效表达HBsAg抗原,与pVAX1-HBsAg表达水平相当(如图2B所示)。
对上述3组处理的细胞同时采用美国Invitrogene公司Trizol试剂抽提细胞总RNA,采用广州复能基因有限公司的microRNA实时定量检测试剂盒以realtime PCR方法检测细胞内has-miR-155成熟体的表达水平(实验方法参照公司试剂盒说明书),发现pcDNA3.1-pre-miR-155质粒转染后has-miR-155成熟体的表达水平上升超过1000倍(如图2C所示)。
经过上述设计和试验验证,我们证明在体外实验中,pcDNA3.1-pre-miR-155质粒可以有效表达MicroRNA-155分子,并且不影响共转染的核酸疫苗进行疫苗抗原表达。
实施例4:将pcDNA3.1-pre-miR-155质粒与pVAX1-HBsAg核酸疫苗共免疫后的体内免疫效力检测。
该实施例主要参考文献(Wang,Y.,Li,D.,He,Y.and et al.Proteomicanalysis of augmented immune responses in mouse by prime-and-boostimmunization strategy with DNA vaccine coding HBsAg and rHBsAgprotein.Vaccine,2007,25:8146-8153.)(Yang,F.,Yan,S.,He,Y.,and et al.Expression of HBV Proteins in Transgenic Mice Disturbs Liver LipidMetabolism and Induces Oxidative Stress.J.Hepatol.,2008,48:12-19.)的方法进行,简述如下:
将pcDNA3.1-pre-miR-155以0.1mg/只与pVAX1-HBsAg以0.1mg/只剂量免疫6-8周龄C57BL/6J小鼠,共免疫3次,间隔2周,第6周末以HBsAg重组蛋白(10μg/只)混合不完全弗氏佐剂加强免疫一次。
设立以下三组对照:1.PBS空白对照组(PBS);2.pcDNA3.1-pre-miR-155质粒与pVAX1-HBsAg共同免疫组(pHBs+pMiR-155);3.Mock质粒pcDNA3.1与pVAX1-HBsAg单独免疫(pHBs+Mock)。
体液免疫方面,经过不同免疫时间点尾静脉采血,采用ELISA检 测血清乙肝表面抗原特异性抗体滴度;细胞免疫方面,在末次免疫后1周处死小鼠(每组3只),无菌分离脾脏淋巴细胞,并以乙肝表面抗原蛋白(10μg/ml)处理5天,采用ELISPOT方法检测脾脏T细胞的IL-4和IFN-γ分泌情况,采用体外CTL杀靶实验检测抗原特异性CD8+T细胞数量。
结果发现,pcDNA3.1-pre-miR-155以0.1mg/只与pVAX1-HBsAg以0.1mg/只共同免疫后,抗体滴度峰值相对于pVAX1-HBsAg免疫组没有明显变化,但是抗体峰值出现时间提前(如图3A)。而在细胞免疫检测中,pcDNA3.1-pre-miR-155以0.1mg/只与pVAX1-HBsAg以0.1mg/只共同免疫后可以有效的诱导抗原特异性CTL反应,IFN-γ分泌阳性细胞显著增多(如图3B),靶细胞杀伤效率显著提高(如图3C),提示抗原特异性细胞免疫获得明显增强。
Claims (4)
1.一种具有细胞免疫增强活性的核酸疫苗佐剂,其特征在于该核酸疫苗佐剂是含有表达MicroRNA-155前体分子的DNA序列的质粒,其中的DNA序列如SEQ ID NO:4所示。
2.根据权利要求1所述的具有细胞免疫增强活性的核酸疫苗佐剂,其特征在于其中的质粒是pcDNA.3.1(+)。
3.一种如权利要求1或2所述的具有细胞免疫增强活性的核酸疫苗佐剂的构建方法,其特征在于该方法包括以下步骤:
A)设计PCR引物如SEQ ID NO:2和3所示,采用人外周血单核细胞抽提的基因组DNA进行PCR,得到编码MicroRNA-155前体分子的DNA序列如SEQ ID NO:4所示;
B)将上述编码MicroRNA-155前体分子的DNA序列克隆入质粒。
4.根据权利要求3所述的具有细胞免疫增强活性的核酸疫苗佐剂的构建方法,其特征在于其中的质粒是pcDNA.3.1(+)。
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