ES2873350T3 - Composiciones de ARN interferente asimétrico y usos de las mismas - Google Patents

Composiciones de ARN interferente asimétrico y usos de las mismas

Info

Publication number
ES2873350T3
ES2873350T3 ES16187862T ES16187862T ES2873350T3 ES 2873350 T3 ES2873350 T3 ES 2873350T3 ES 16187862 T ES16187862 T ES 16187862T ES 16187862 T ES16187862 T ES 16187862T ES 2873350 T3 ES2873350 T3 ES 2873350T3
Authority
ES
Spain
Prior art keywords
strand
rna
sirna
rna duplex
gene
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
ES16187862T
Other languages
English (en)
Inventor
Chiang Li
Xiangao Sun
Harry Rogoff
Youzhi Li
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
1Globe Health Institute LLC
Original Assignee
1Globe Health Institute LLC
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 1Globe Health Institute LLC filed Critical 1Globe Health Institute LLC
Application granted granted Critical
Publication of ES2873350T3 publication Critical patent/ES2873350T3/es
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/04—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for ulcers, gastritis or reflux esophagitis, e.g. antacids, inhibitors of acid secretion, mucosal protectants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P13/00—Drugs for disorders of the urinary system
    • A61P13/12—Drugs for disorders of the urinary system of the kidneys
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P27/00—Drugs for disorders of the senses
    • A61P27/02—Ophthalmic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/04—Antibacterial agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/06—Immunosuppressants, e.g. drugs for graft rejection
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/08—Antiallergic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P5/00—Drugs for disorders of the endocrine system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/111—General methods applicable to biologically active non-coding nucleic acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/14—Type of nucleic acid interfering N.A.
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/14—Type of nucleic acid interfering N.A.
    • C12N2310/141—MicroRNAs, miRNAs
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/31—Chemical structure of the backbone
    • C12N2310/315—Phosphorothioates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/32—Chemical structure of the sugar
    • C12N2310/321—2'-O-R Modification
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/50—Physical structure
    • C12N2310/53—Physical structure partially self-complementary or closed
    • C12N2310/531—Stem-loop; Hairpin
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2320/00—Applications; Uses
    • C12N2320/30—Special therapeutic applications
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2320/00—Applications; Uses
    • C12N2320/50—Methods for regulating/modulating their activity
    • C12N2320/53—Methods for regulating/modulating their activity reducing unwanted side-effects
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2330/00—Production
    • C12N2330/50—Biochemical production, i.e. in a transformed host cell
    • C12N2330/51—Specially adapted vectors

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Pulmonology (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Transplantation (AREA)
  • Dermatology (AREA)
  • Cardiology (AREA)
  • Heart & Thoracic Surgery (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)

Abstract

Una molécula dúplex de ARN interferente asimétrica que comprende una primera cadena con una longitud de 19, 20, 21, 22 o 23 nucleótidos; y una segunda cadena con una longitud de 14, 15, 16 o 17 nucleótidos, en donde la primera cadena es más larga que la segunda cadena y el último nucleótido de la primera cadena consiste en un ribonucleótido A, U, G o C, en donde la segunda cadena es al menos un 70 % complementaria a la primera cadena, forma una región bicatenaria con la primera cadena y el primer y último nucleótido de la segunda cadena forma un par de bases con nucleótidos en la primera cadena, en donde la primera cadena tiene un saliente 3' y un extremo romo 5', en donde la primera cadena es complementaria a una secuencia de ARNm diana de un gen, en donde el dúplex de ARN interferente asimétrico comprende un nucleótido modificado o análogo de nucleótido.

Description

DESCRIPCIÓN
Composiciones de ARN interferente asimétrico y usos de las mismas
Antecedentes de la invención
El silenciamiento génico a través de ARNi (ARN interferente) mediante el uso de ARN interferente pequeño o corto (ARNsi) ha surgido como una herramienta poderosa para la biología molecular y tiene el potencial de ser utilizado con fines terapéuticos (de Fougerolles et al., 2007; Kim and Rossi, 2007).
El ARNi se puede emplear teóricamente para bloquear o silenciar cualquier gen de enfermedad con especificidad y potencia. Las posibles aplicaciones de a Rní con fines terapéuticos son amplias e incluyen enfermedades genéticas, epigenéticas e infecciosas, siempre que se identifique un gen causante de la enfermedad.
Sin embargo, aparte de la cuestión prominente de administración, el desarrollo de fármacos con base en ARNi se enfrenta a desafíos de eficacia limitada de ARNsi, efectos no específicos de ARNsi tales como respuestas de tipo interferón y silenciamiento génico fuera de la diana mediado por cadenas en sentido, y el alto o prohibitivo coste asociado con la síntesis de ARNsi. La eficacia de silenciamiento de genes por ARNsi se limita a aproximadamente el 50 % o menos para la mayoría de genes en células de mamíferos. La fabricación de estas moléculas es de alto coste (mucho más costoso que la fabricación de desoxinucleótidos antisentido), ineficaz y requiere modificación química. Finalmente, la observación de que la administración extracelular de ARNsi sintéticos puede desencadenar respuestas tipo interferón ha agregado una barrera significativa para la investigación con base en ARNi y desarrollo terapéutico con base en ARNi.
El ARNi puede activarse selectivamente mediante ARN interferente corto sintético (ARNsi) o elementos genéticos que codifican ARN de horquilla corta (ARNsh) que posteriormente se escinden en ARNsi por la enzima de tipo ribonucleasa III, Dicer. El mecanismo bioquímico del silenciamiento génico, que aún no se comprende por completo, parece implicar un complejo silenciador inducido por ARN de múltiples proteínas (RISC). RISC se enlaza, desenrolla e incorpora la cadena de ARNsi antisentido, que luego reconoce y tiene como diana a ARNm perfectamente complementarios para la escisión, reduciendo así la expresión génica. El potente silenciamiento de genes (1-10 días) se atribuye a las propiedades catalíticas del complejo RISC. El poder de ARNi proviene de la exquisita especificidad que se puede lograr. Sin embargo, se sabe que se producen efectos de ARNi fuera de la diana. Otro efecto secundario importante es la activación de la respuesta tipo interferón por el ARNsi, que está mediado por la proteína quinasa dependiente de ARNds (PKR) y receptores tipo Toll (TLR). La capacidad de inducir una respuesta tipo interferón por el ARNsi está determinada principalmente por su longitud. (ibídem.)
Para el silenciamiento génico en células de mamíferos, la técnica actual enseña que la estructura del ARNsi es un ARN bicatenario simétrico con una longitud de 19-21 nucleótidos y saliente 3' en ambos extremos para ser eficaz en células de mamífero y evitar respuestas celulares "antivirales" innatas. (ibídem.) Ahora está bien establecido en el campo que esta estructura "óptima" todavía puede desencadenar respuestas de interferón y plantear desafíos importantes para el desarrollo de la investigación con base en ARNi y terapias con base en ARNi (Sledz et al., 2003).
El documento WO 2005/079533 A2 describe ARNsi que tienen extremos canónicos o no canónicos para el silenciamiento génico.
El documento WO 2005/089287 A2 describe composiciones que comprenden moléculas de ARNds capaces de reducir la expresión de genes diana en células eucariotas.
Existe la necesidad de desarrollar metodologías nuevas para el ARNi eficaz en células de mamíferos a través de un diseño nuevo de ARNsi que tenga mejor eficacia y potencia, inicio de acción rápido, mejor durabilidad y una longitud más corta del dúplex de ARN para evitar casos inespecíficos de respuesta tipo interferón y para reducir el coste de síntesis para investigación y desarrollo farmacéutico de terapéuticos de ARNi.
Sumario de la invención
La presente invención trata sobre un descubrimiento sorprendente de una nueva clase de Dúplex de ARN pequeño que puede inducir un potente silenciamiento génico en células de mamíferos, que se denomina aquí ARN interferente asimétrico (ARNai). El sello distintivo de esta nueva clase de inductores de ARNi es la asimetría de longitud de las dos cadenas de ARN. Un diseño estructural tan nuevo no solo es funcionalmente potente para afectar el silenciamiento génico, sino que ofrece varias ventajas sobre los ARNsi de última generación. Entre las ventajas, el ARNai puede tener una estructura dúplex de ARN de longitud mucho más corta que el ARNsi actual, lo que debería reducir el coste de síntesis y anular/reducir la activación dependiente de la longitud de respuestas inespecíficas tipo interferón. Además, la asimetría de la estructura del ARNai anula/reduce los efectos fuera de la diana mediados por la cadena en sentido. Además, el ARNai es más eficaz, potente, de inicio rápido y duradero que el ARNsi para inducir el silenciamiento génico. El ARNai se puede utilizar en todas las áreas en las que se está aplicando o contemplando utilizar el actual ARNsi o ARNsh, incluida investigación en biología, investigación de R&D en la industria biotecnológica y farmacéutica y terapias con base en ARNi.
La presente invención proporciona una molécula de dúplex de ARN interferente asimétrica que comprende: una primera cadena con una longitud de 19, 20, 21, 22 o 23 nucleótidos; y una segunda cadena con una longitud de 14, 15, 16 o 17 nucleótidos, en donde la primera cadena es más larga que la segunda cadena y el último nucleótido de la primera cadena consiste en un ribonucleótido A, U, G o C, en donde la segunda cadena es al menos un 70 % complementaria a la primera cadena, forma una región de doble cadena con la primera cadena y el primer y último nucleótido de la segunda cadena forma un par de bases con nucleótidos en la primera cadena, en donde la primera cadena tiene un saliente 3' y un extremo romo 5', en donde la primera cadena es complementaria a una secuencia de ARNm diana de un gen, y en donde el dúplex de ARN interferente asimétrico comprende un nucleótido modificado o análogo de nucleótido.
En algunas realizaciones, el saliente 3' tiene una longitud de 2, 3 o 4 nucleótidos. En algunas realizaciones, el saliente 3' es complementario a la secuencia de ARNm diana. En algunas realizaciones, la primera cadena tiene una longitud de 21 nucleótidos. En algunas realizaciones, la segunda cadena tiene una longitud de 14 a 15 nucleótidos y preferiblemente tiene una longitud desde 15 nucleótidos. En algunas realizaciones, la región bicatenaria comprende al menos un nucleótido no emparejado o con error de emparejamiento. En algunas realizaciones, el al menos un nucleótido modificado o su análogo es un ribonucleótido con azúcar, esqueleto principal y/o base modificados, preferiblemente en donde el ribonucleótido con esqueleto principal modificado tiene una modificación en un enlace fosfodiéster con otro ribonucleótido y más preferiblemente en donde el enlace fosfodiéster se modifica para incluir al menos uno de un heteroátomo de nitrógeno o azufre. En algunas realizaciones, el al menos un nucleótido modificado o su análogo comprende una base no natural o una base modificada. En algunas realizaciones, el al menos un nucleótido modificado o su análogo comprende inosina o una base tritilada. En algunas realizaciones, el al menos un nucleótido modificado o su análogo es un ribonucleótido con azúcar modificado, en donde el grupo 2'-OH se reemplaza por un grupo seleccionado de H, OR, R, halo, SH, SR, NH2, NHR, NR2, o CN, en donde cada R es independientemente alquilo, alquenilo o alquinilo C1-C6, y halo es F, Cl, Br o I. En algunas realizaciones, el al menos un nucleótido modificado o su análogo es un ribonucleótido con esqueleto principal modificado que contiene un grupo fosfotioato.
La presente invención proporciona además una composición farmacéutica que comprende como un agente activo al menos una molécula dúplex de ARN interferente asimétrica de la invención y un portador farmacéutico.
La presente invención proporciona además una composición que comprende una molécula dúplex de ARN interferente asimétrica de la invención y un lípido o una molécula de colesterol. En algunas realizaciones, la molécula de lípido o colesterol se conjuga con la molécula dúplex de ARN interferente asimétrica.
La presente invención proporciona además la molécula dúplex de ARN interferente asimétrica de la invención para uso en terapia. La presente invención proporciona además la molécula dúplex de ARN interferente asimétrica de la invención para uso en un método de silenciamiento génico selectivo, en una célula eucariota en donde el gen diana es: un gen asociado con enfermedades humanas o animales; un gen de un microorganismo patógeno; un gen viral; un gen asociado a un tumor; o un gen asociado con una enfermedad seleccionada del grupo seleccionado del grupo que consiste en enfermedad autoinmune, enfermedades inflamatorias, enfermedades degenerativas, enfermedades infecciosas, enfermedades proliferativas, enfermedades metabólicas, trastornos inmunomediados, enfermedades alérgicas, enfermedades dermatológicas, enfermedades malignas, trastornos gastrointestinales, trastornos respiratorios, trastornos cardiovasculares, trastornos renales, trastornos reumatoides, trastornos neurológicos, trastornos endocrinos y envejecimiento.
Como se describe aquí, es una molécula dúplex de ARN que comprende una primera cadena con una longitud de 18­ 23 nucleótidos y una segunda cadena con una longitud de 12-17 nucleótidos, en donde la segunda cadena es sustancialmente complementaria a la primera cadena, y forma una región bicatenaria con la primera cadena, en donde la primera cadena tiene un saliente 3' de 1-9 nucleótidos, y un saliente 5' de 0-8 nucleótidos, en donde dicha molécula dúplex de ARN es capaz de efectuar un silenciamiento génico selectivo en una célula eucariota. En un ejemplo, la primera cadena comprende una secuencia que es sustancialmente complementaria a una secuencia de ARNm diana. En un ejemplo adicional, la primera cadena comprende una secuencia que es al menos un 70 por ciento complementaria a una secuencia de ARNm diana.
En una realización, la célula eucariota es una célula de mamífero o una célula aviar.
En un ejemplo, al menos un nucleótido de la secuencia del saliente 5' se selecciona del grupo que consiste en A, U y dT.
En una realización, el contenido de GC de la región bicatenaria es del 20 %-70 %.
En una realización, la primera cadena tiene una longitud de 19-22 nucleótidos.
En una realización, la primera cadena tiene una longitud de 21 nucleótidos. En una realización adicional, la segunda cadena tiene una longitud de 14-16 nucleótidos.
En una realización, la primera cadena tiene una longitud de 21 nucleótidos y la segunda cadena tiene una longitud de 15 nucleótidos. En una realización adicional, la primera cadena tiene un saliente 3' de 2-4 nucleótidos. En aún otra realización adicional, la primera cadena tiene un saliente 3' de 3 nucleótidos.
En la presente invención, la molécula dúplex de ARN contiene al menos un nucleótido modificado o su análogo. En una realización adicional, el al menos un nucleótido modificado o su análogo es un ribonucleótido con azúcar, esqueleto principal y/o base modificados. En aún otra realización adicional, el ribonucleótido con esqueleto principal modificado tiene una modificación en un enlace fosfodiéster con otro ribonucleótido. En una realización, el enlace fosfodiéster se modifica para incluir al menos uno de un heteroátomo de nitrógeno o azufre. En otra realización, el análogo de nucleótido es un ribonucleótido con esqueleto principal modificado que contiene un grupo fosfotioato.
En una realización, el al menos un nucleótido modificado o su análogo es una base inusual o una base modificada. En otra realización, el al menos un nucleótido modificado o su análogo comprende inosina o una base tritilada.
En una realización adicional, el análogo de nucleótido es un ribonucleótido con azúcar modificado, en donde el grupo 2'-OH se reemplaza por un grupo seleccionado de H, OR, R, halo, SH, SR, NH2, NHR, NR2, o CN, en donde cada R es independientemente alquilo, alquenilo o alquinilo C1-C6, y halo es F, Cl, Br o I.
En una realización, la primera cadena comprende al menos un desoxinucleótido. En un ejemplo adicional, el al menos un desoxinucleótido está en una o más regiones seleccionadas del grupo que consiste en una región de saliente 3', saliente 5' y de bicatenaria. En una realización adicional, el al menos un desoxinucleótido se encuentra en una o más regiones seleccionadas del grupo que consiste en una región saliente 3' y bicatenaria. En otra realización, la segunda cadena comprende al menos un desoxinucleótido.
El dúplex de ARNai de la presente invención puede usarse en un método de modulación de la expresión génica en una célula u organismo que comprende las etapas de poner en contacto dicha célula u organismo con la molécula dúplex de ARN de la reivindicación 1 bajo condiciones en donde puede producirse el silenciamiento génico selectivo y mediar un silenciamiento génico selectivo efectuado por la molécula dúplex de ARN hacia un gen o ácido nucleico diana que tiene una porción de secuencia que corresponde sustancialmente al ARN bicatenario. En una realización adicional, dicha etapa de contacto comprende la etapa de introducir dicha molécula dúplex de ARN en una célula diana en cultivo o en un organismo en el que puede producirse el silenciamiento génico selectivo. En aún otra realización adicional, la etapa de introducción se selecciona del grupo que consiste en transfección, lipofección, electroporación, infección, inyección, administración oral, inhalación, administración tópica y regional. En otra realización, la etapa de introducción comprende el uso de un excipiente, portador o diluyente farmacéuticamente aceptables seleccionados del grupo que consiste en un portador farmacéutico, un portador de carga positiva, un liposoma, un portador proteico, un polímero, una nanopartícula, una nanoemulsión, un lípido y un lipoide.
En una realización, el método de modulación se usa para determinar la función o utilidad de un gen en una célula u organismo.
En una realización, el método de modulación se usa para tratar o prevenir una enfermedad o una condición indeseable.
En una realización, el gen diana está asociado con una enfermedad, una afección patológica o una afección indeseable en un mamífero. En una realización adicional, el gen diana es un gen de un microorganismo patógeno. En aún otra realización adicional, el gen diana es un gen viral. En otra realización, el gen diana es un gen asociado a tumor. En otra realización más, el gen diana es un gen asociado con una enfermedad seleccionada del grupo que consiste en enfermedades autoinmunes, enfermedades inflamatorias, enfermedades degenerativas, enfermedades infecciosas, enfermedades proliferativas, enfermedades metabólicas, trastornos inmunomediados, enfermedades alérgicas, enfermedades dermatológicas, enfermedades malignas, trastornos gastrointestinales, trastornos respiratorios, trastornos cardiovasculares, trastornos renales, trastornos reumatoides, trastornos neurológicos, trastornos endocrinos y envejecimiento.
La presente divulgación proporciona un reactivo de investigación. El reactivo comprende la molécula dúplex de ARN.
La presente divulgación proporciona además un kit. El kit comprende una primera cadena de ARN con una longitud de 18-23 nucleótidos y una segunda cadena de ARN con una longitud de 12-17 nucleótidos, en donde la segunda cadena es sustancialmente complementaria a la primera cadena y capaz de formar una molécula dúplex de ARN con la primera cadena, en donde la molécula dúplex de ARN tiene un saliente 3' de 1-9 nucleótidos y un saliente 5' de 0-8 nucleótidos, en donde dicha molécula dúplex de ARN es capaz de efectuar un silenciamiento génico específico de secuencia en un célula eucariota.
La presente divulgación también proporciona un método para preparar la molécula dúplex de ARN. El método comprende las etapas de sintetizar la primera cadena y la segunda cadena, y combinar las cadenas sintetizadas bajo condiciones, en donde se forma la molécula dúplex de ARN, que es capaz de efectuar un silenciamiento génico específico de secuencia. En un ejemplo, el método comprende además una etapa de introducir al menos un nucleótido modificado o su análogo en la molécula dúplex de ARN durante la etapa de síntesis, después de la síntesis y antes de la etapa de combinación, o después de la etapa de combinación. En otro ejemplo, las cadenas de ARN se sintetizan químicamente o se sintetizan biológicamente.
La presente divulgación proporciona un vector de expresión. El vector comprende un ácido nucleico o ácidos nucleicos que codifican la molécula dúplex de ARN unida operativamente a al menos una secuencia de control de expresión. En un ejemplo, el vector comprende un primer ácido nucleico que codifica la primera cadena unida operativamente a una primera secuencia de control de expresión y un segundo ácido nucleico que codifica la segunda cadena unida operativamente a una segunda secuencia de control de expresión. En otro ejemplo, el vector es un vector de expresión viral, eucariota o bacteriano.
La presente divulgación también proporciona una célula. En un ejemplo, la célula comprende el vector. En otro ejemplo, la célula comprende la molécula dúplex de ARN. En un ejemplo adicional, la célula es una célula de mamífero, aviar o bacteriana.
La presente divulgación proporciona una molécula dúplex de ARN. La molécula dúplex de ARN comprende una primera cadena y una segunda cadena, en donde la primera cadena es más larga que la segunda cadena, en donde la segunda cadena es sustancialmente complementaria a la primera cadena y forma una región de doble cadena con la primera cadena, en donde dicha molécula dúplex de ARN es capaz de efectuar un silenciamiento génico selectivo en una célula eucariota. En un ejemplo, los dos extremos de la molécula dúplex de ARN se seleccionan independientemente del grupo que consiste en un saliente 3' de 1-10 nucleótidos, un saliente 5' de 0-10 nucleótidos y un extremo romo. En otro ejemplo, la primera cadena es sustancialmente complementaria a una secuencia de ARNm diana. En un ejemplo alternativo, la segunda cadena es sustancialmente complementaria a una secuencia de ARNm diana. En un ejemplo, la célula eucariota es una célula de mamífero o una célula aviar. En otro ejemplo, la molécula dúplex de ARN es una molécula dúplex de ARN aislada.
En un ejemplo, la primera cadena tiene un saliente 3' de 1-8 nucleótidos y un saliente 5' de 1-8 nucleótidos.
En otro ejemplo, la primera cadena tiene un saliente 3' de 1-10 nucleótidos y un extremo romo.
En otro ejemplo más, la primera cadena tiene un saliente 5' de 1-10 nucleótidos y un extremo romo.
En un ejemplo alternativo, el dúplex de ARN tiene dos salientes 5' de 1-8 nucleótidos, o dos salientes 3' de 1-10 nucleótidos.
En un ejemplo, la primera cadena tiene una longitud de 12-100 nucleótidos, de 12-30 nucleótidos, de 18-23 nucleótidos, de 19-25 nucleótidos. En una realización adicional, la primera cadena tiene una longitud de 21 nucleótidos. En otro ejemplo, la segunda cadena tiene una longitud de 5-30 nucleótidos, 12-22 nucleótidos, 12-17 nucleótidos. En otro ejemplo, la segunda cadena tiene una longitud de 15 nucleótidos.
En un ejemplo, la primera cadena tiene una longitud de 12-30 nucleótidos, y la segunda cadena tiene una longitud de 10-29 nucleótidos, con la condición de que cuando la región de doble cadena es de 27 bp, ambos extremos de la molécula de ARN son independientemente saliente 3' o saliente 5'. En otro ejemplo, la primera cadena tiene una longitud de 18-23 nucleótidos y la segunda cadena tiene una longitud de 12-17 nucleótidos.
En otro ejemplo, la primera cadena tiene una longitud de 19-25 nucleótidos y la segunda cadena tiene una longitud de 12-17 nucleótidos.
En un ejemplo alternativo, la primera cadena tiene una longitud de 19-25 nucleótidos y la segunda cadena tiene una longitud de 18-24 nucleótidos,
con la condición de que cuando la primera cadena es
5'-UUCGAAGUAUUCCGCGUACGU
5'-UCGAAGUAUUCCGCGUACGUG o
5'-CGAAGUAUUCCGCGUACGUGA
la segunda cadena tiene una longitud de como máximo 17 nucleótidos, o contiene al menos un error de emparejamiento con la primera cadena, o contiene al menos una modificación.
En un ejemplo, la primera cadena tiene una longitud de 21 nucleótidos y la segunda cadena tiene una longitud de 12­ 17 nucleótidos. En una realización, la primera cadena tiene una longitud de 21 nucleótidos y la segunda cadena tiene una longitud de 14-16 nucleótidos.
En un ejemplo, la primera cadena es de 1-10 nucleótidos más larga que la segunda cadena.
En una realización, el saliente 3' tiene una longitud de 2-6 nucleótidos.
En otro ejemplo, el saliente 5' tiene una longitud de 0-5 nucleótidos.
En una realización, el silenciamiento génico comprende una o dos, o todas, del ARN interferente, modulación de traducción y modulaciones epigenéticas del ADN.
En un ejemplo, la molécula dúplex de ARN comprende además una muesca en al menos una de dichas primera y segunda cadenas.
En otro ejemplo, la región bicatenaria comprende una brecha de uno o más nucleótidos.
En un ejemplo, al menos un nucleótido del saliente 5' no es complementario a la secuencia de ARNm diana.
En otro ejemplo, al menos un nucleótido del saliente 5' se selecciona del grupo que consiste en A, U y dT.
En una realización, la molécula dúplex de ARN se conjuga con una entidad seleccionada del grupo que consiste en péptido, anticuerpo, polímero, lípido, oligonucleótido, colesterol y aptámero.
En una realización, la molécula de ARN comprende además al menos un nucleótido no emparejado o con error de emparejamiento.
En otra realización, el contenido de GC de la región bicatenaria es 20-70 %.
En un ejemplo, el saliente 3' y/o el saliente 5' se estabiliza contra la degradación.
En una realización, el saliente 3' se estabiliza contra la degradación.
En la invención, la molécula dúplex de ARN contiene al menos un nucleótido modificado o su análogo. En una realización adicional, el al menos un nucleótido modificado o su análogo es un ribonucleótido con azúcar, esqueleto principal y/o base modificados. En una realización adicional, el ribonucleótido con esqueleto principal modificado tiene una modificación en la unión fosfodiéster con otro ribonucleótido. En otra realización, la unión fosfodiéster se modifica para incluir al menos uno de un heteroátomo de nitrógeno o azufre. En aún otra realización adicional, el análogo de nucleótido es un ribonucleótido con esqueleto principal modificado que contiene un grupo fosfotioato.
En una realización, el al menos un nucleótido modificado o su análogo comprende una base no natural o una base modificada. En otra realización, el al menos un nucleótido modificado o su análogo comprende inosina o una base tritilada.
En una realización adicional, el análogo de nucleótido es un ribonucleótido con azúcar modificado, en donde el grupo 2'-OH se reemplaza por un grupo seleccionado de H, OR, R, halo, SH, SR, NH2, NHR, NR2, o CN, en donde cada R es independientemente alquilo, alquenilo o alquinilo C1-C6, y halo es F, Cl, Br o I.
En una realización, la primera cadena comprende al menos un desoxinucleótido. En un ejemplo, el al menos un desoxinucleótido está en una o más regiones seleccionadas del grupo que consiste en una región de saliente 3', saliente 5' y bicatenaria proximal al extremo 5' de la primera cadena. En una realización adicional, el al menos un desoxinucleótido se encuentra en una o más regiones seleccionadas del grupo que consiste en una región saliente 3' y bicatenaria próxima al extremo 5' de la primera cadena. En otra realización, la segunda cadena comprende al menos un desoxinucleótido.
El ARNai dúplex de la presente invención también puede usarse en un método para modular la expresión génica en una célula o un organismo. El método comprende las etapas de: poner en contacto dicha célula u organismo con la molécula dúplex de ARN de la reivindicación 1 bajo condiciones en donde puede producirse silenciamiento génico selectivo, y mediar un silenciamiento génico selectivo efectuado por el ARN bicatenario hacia un ácido nucleico diana que tiene una porción de secuencia correspondiente sustancialmente al ARN bicatenario. En una realización adicional, dicho contacto comprende la etapa de introducir dicha molécula dúplex de ARN en una célula diana en cultivo o en un organismo en el que puede producirse el silenciamiento selectivo del gen. En aún otra realización adicional, la etapa de introducción se selecciona del grupo que consiste en transfección, lipofección, electroporación, infección, inyección, administración oral, inhalación, administración tópica y regional. En otra realización, la etapa de introducción comprende el uso de un excipiente, portador o diluyente farmacéuticamente aceptables seleccionados del grupo que consiste en un portador farmacéutico, un portador de carga positiva, un liposoma, un portador proteico, un polímero, una nanopartícula, una nanoemulsión, un lípido y un lipoide. En una realización, el método de modulación se usa para modular la expresión de un gen en una célula o un organismo.
En otra realización, el método de modulación se usa para tratar o prevenir una enfermedad o una afección indeseable.
En una realización, el gen diana es un gen asociado con enfermedades humanas o animales. En una realización adicional, el gen es un gen de un microorganismo patógeno. Incluso aún otra realización adicional, el gen diana es un gen viral. En otra realización, el gen es un gen asociado a un tumor.
En otra realización más, el gen diana es un gen asociado con una enfermedad seleccionada del grupo que consiste en enfermedades autoinmunes, enfermedades inflamatorias, enfermedades degenerativas, enfermedades infecciosas, enfermedades proliferativas, enfermedades metabólicas, trastornos inmunomediados, enfermedades alérgicas, enfermedades dermatológicas, enfermedades malignas, trastornos gastrointestinales, trastornos respiratorios, trastornos cardiovasculares, trastornos renales, trastornos reumatoides, trastornos neurológicos, trastornos endocrinos y envejecimiento.
El método de modulación también se puede usar para estudiar la diana del fármaco in vitro o in vivo.
La presente invención proporciona un reactivo que comprende la molécula dúplex de ARN.
La presente divulgación proporciona además un kit. El kit comprende una primera cadena de ARN y una segunda cadena de ARN, donde la primera cadena es más larga que la segunda cadena, en donde la segunda cadena es sustancialmente complementaria a la primera cadena y capaz de formar una molécula dúplex de ARN con la primera cadena, en donde dicha molécula dúplex de ARN es capaz de efectuar un silenciamiento génico específico de secuencia en una célula eucariota.
La presente divulgación también proporciona un método para preparar la molécula dúplex de ARN de la reivindicación 1 que comprende las etapas de sintetizar la primera cadena y la segunda cadena, y combinar las cadenas sintetizadas bajo condiciones, en donde se forma la molécula dúplex de ARN, que es capaz de efectuar un silenciamiento génico específico de secuencia. En un ejemplo, las cadenas de ARN se sintetizan químicamente o se sintetizan biológicamente. En otro ejemplo, la primera cadena y la segunda cadena se sintetizan por separado o simultáneamente.
En un ejemplo, el método comprende además una etapa de introducir al menos un nucleótido modificado o su análogo en la molécula dúplex de ARN durante la etapa de síntesis, después de la síntesis y antes de la etapa de combinación, o después de la etapa de combinación.
La presente invención proporciona además una composición farmacéutica. La composición farmacéutica comprende como un agente activo al menos una molécula dúplex de ARNai de la invención, un portador farmacéutico y, opcionalmente, uno o más portadores seleccionados del grupo que consiste en un portador de carga positiva, un liposoma, un portador proteico, un polímero, una nanopartícula, un colesterol, un lípido y un lipoide.
La presente invención también proporciona un dúplex de ARNai de la invención o una composición de la invención para uso en un método de tratamiento. El método comprende administrar una cantidad eficaz de la composición farmacéutica a un sujeto que lo necesite. En una realización, la composición farmacéutica se administra mediante una ruta seleccionada del grupo que consiste en administración iv, sc, inhalación, tópica, po y regional.
En una realización, la primera cadena comprende una secuencia que es complementaria a la secuencia diana de ARNm de un gen seleccionado del grupo que consiste en un gen de desarrollo, un oncogén, un gen supresor de tumores y un gen enzimático, y un gen para una molécula de adhesión, un inhibidor de ciclina quinasa, un miembro de la familia Wnt, un miembro de la familia Pax, un miembro de la familia de hélice alada, un miembro de la familia Hox, una citocina/linfocinas o su receptor, un factor de crecimiento/diferenciación o su receptor, un neurotransmisor o su receptor, una quinasa, un transductor de señal, un gen viral, un gen de una enfermedad infecciosa, ABLI, BCL1, BCL2, BCL6, CBFA2, CBL, CSFIR, ERBA, ERBB, EBRB2,ETS1, ETS1, ETV6, FGR, FOS, FYN, HCR, HRAS, JUN, KRAS, LCK, LYN, MDM2, MLL, MYB, MYC, MYCL1, MYCN, NRAS, PIM1, PML, RET, SRC, TALI, TCL3 y YES, APC, BRCA1, BRCA2, MADH4, MCC, NF1, NF2, RB1, TP53, WT1, una ACP desaturasa o hidroxilasa, una ADP-glucosa piroforilasa, una ATPasa, una alcohol deshidrogenasa, una amilasa, una amiloglucosidasa, una catalasa, una celulasa, una ciclooxigenasa, una descarboxilasa, una dextrinasa, una ADN o ARN polimerasa, una galactosidasa, una glucanasa, una glucosa oxidasa, una GTPasa, una helicasa, una hemicelulasa, una integrasa, una invertasa, una isomerasa, una quinasa, una lactasa, una lipasa, una lipoxigenasa, una lisozima, una pectinesterasa, una peroxidasa, una fosfatasa, una fosfolipasa, una fosforilasa, una poligalacturonasa, una proteinasa o peptidasas, una pullanasa, una recombinasa, una transcriptasa inversa, una topoisomerasa, una xilanasa, k-RAS, p-catenina, Rsk1, PCNA, p70S6K, Survivina, mTOR, PTEN, Parpl o p21.
Las moléculas dúplex de ARN se pueden seleccionar del grupo que consiste en
Figure imgf000007_0001
Figure imgf000008_0001
Figure imgf000009_0001
En donde A, U, G y C son nucleótidos, mientras que a, t, g y c son desoxinucleótidos.
La presente divulgación proporciona un método para modificar una primera molécula dúplex de ARN con una cadena antisentido y una cadena en sentido que forman una región bicatenaria. El método comprende acortar la longitud de la cadena en sentido de modo que la cadena antisentido tenga un saliente 3' de 1-8 nucleótidos y un saliente 5' de 0­ 8 nucleótidos, y formar una segunda molécula dúplex de ARN; en donde se mejora al menos una propiedad de la primera molécula dúplex de ARN. En un ejemplo, la propiedad se selecciona del grupo que consiste en tamaño, eficacia, potencia, la velocidad de aparición, durabilidad, coste de síntesis, efectos fuera de la diana, respuesta de interferón y administración. En otro ejemplo, el método comprende además combinar la cadena antisentido y la reducida cadena en sentido bajo condiciones en donde se forma la segunda molécula dúplex de ARN. En un ejemplo adicional, la primera molécula dúplex de ARN es un ARNsi, o ARNsi dicer-sustrato, o un precursor de ARNsi.
La presente divulgación proporciona un vector de expresión. El vector comprende un ácido nucleico o ácidos nucleicos que codifican la molécula dúplex de ARN de la reivindicación 1 unida operativamente a al menos una secuencia de control de expresión. En un ejemplo, el vector de expresión comprende un primer ácido nucleico que codifica la primera cadena unida operativamente a una primera secuencia de control de expresión y un segundo ácido nucleico que codifica la segunda cadena unida operativamente a una segunda secuencia de control de expresión. En otro ejemplo, el vector de expresión es un vector de expresión viral, vector de expresión eucariota o vector de expresión bacteriano.
La presente divulgación también proporciona una célula. En un ejemplo, la célula comprende el vector de expresión. En otro ejemplo, la célula comprende la molécula dúplex de ARN. En otro ejemplo más, la célula es una célula de mamífero, célula aviar o célula bacteriana.
Otras características y ventajas de la presente invención son evidentes a partir de las descripciones adicionales proporcionadas aquí que incluyen los diferentes ejemplos. Los ejemplos proporcionados ilustran diferentes componentes y metodología útiles en la práctica de la presente invención. Los ejemplos no limitan la invención reivindicada. Con base en la presente divulgación, la persona experimentada en la técnica puede identificar y emplear otros componentes y metodología útiles para poner en práctica la presente invención.
Breve descripción de los dibujos
La Figura 1A muestra la estructura de una molécula dúplex de ARN que tiene un saliente 3' y un saliente 5' en la primera cadena.
La Figura 1B muestra la estructura de una molécula dúplex de ARN que tiene un saliente 3' y un saliente 5' en la primera cadena, y una muesca en el dúplex.
La Figura 1C muestra la estructura de una molécula dúplex de ARN que tiene un saliente 3' y un saliente 5' en la primera cadena y una brecha en la segunda cadena.
La Figura 2A muestra la estructura de una molécula dúplex de ARN que tiene un extremo romo y un saliente 5' en la primera cadena.
La Figura 2B muestra la estructura de una molécula dúplex de ARN que tiene un extremo romo y un saliente 3' en la primera cadena.
La Figura 2C muestra la estructura de una molécula dúplex de ARN que tiene salientes 3' en ambos extremos del dúplex y que la primera cadena es más larga que la segunda cadena.
La Figura 2D muestra la estructura de una molécula dúplex de ARN que tiene salientes 5' en ambos extremos del dúplex y que la primera cadena es más larga que la segunda cadena.
La Figura 3 muestra la inducción del silenciamiento génico de p-catenina por ARNai (ARN interferente asimétrico).
La Figura 3A muestra la confirmación de los oligos. Después de hibridar, los oligos se confirmaron mediante gel de poliacrilamida al 20 %. Carril 1, 21 nt/21 nt; carril 2, 12nt (a)/21nt; carril 3, 12nt (b)/21nt; carril 4, 13nt/13nt; carril 5, 13nt/21 nt; carril 6, 14nt/14nt; carril 7, 14nt (a)/21nt; carril 8, 14nt(b)/21nt; carril 9, 15nt/15nt; carril 10, 15nt/21 nt.
La Figura 3B muestra los efectos de los oligos en el silenciamiento génico. Las células HeLa se sembraron en placa a 200,000 células/pozo en una placa de cultivo de 6 pozos. 24 horas más tarde, se transfectaron con ARNsi codificado (línea 1), ARNsi de 21 bp direccionado a E2F1 (línea 2, como control de especificidad) o ARNsi de 21 bp direccionado a beta-catenina (línea 3, como control positivo), o la misma concentración de ARNai de diferente mezcla de longitud: 12nt(a)/21nt (carril 4); 12nt(b)/21nt (carril 5); 13nt/21 nt (carril 6); 14nt(a)/21nt (carril 7); 14nt(b)/21nt (carril 8); 15nt/21nt (carril 9). Las células se cosecharon 48 horas después de la transfección. La expresión de p-catenina se determinó mediante inmunoprecipitación Western. E2F1 y actina se utilizan como controles.
Las Figuras 4 y 5 muestran la relación estructura-actividad de los oligos de ARNai, con o sin sustituciones de bases, en la mediación del silenciamiento génico. Se transfectaron células Hela con el ARNai indicado. Se cosecharon las células y se generaron lisados a las 48 horas posttransfección. Se realizaron inmunoprecipitaciones Western para detectar niveles de p-catenina y actina. si significa oligonucleótido de ARNsi de p-catenina. El marcado numérico sobre cada carril corresponde a los oligos de ARNai en la Tabla 3.
La Figura 6 muestra el análisis del mecanismo de silenciamiento génico desencadenado por ARNai.
La Figura 6a muestra el análisis de inmunoprecipitación Northern de los niveles de ARNm de p-catenina en células transfectadas con ARNai o ARNsi durante el número de días indicado.
La Figura 6b muestra el esquema de 5'-RACE-PCR para p-catenina que muestra la escisión del ARNm y el producto de PCR esperado.
La Figura 6c muestra que los productos de escisión de p-catenina mediados por ARNai fueron amplificados por 5'-RACE-PCR de células transfectadas con ARNai durante 4 u 8 horas.
La Figura 6d muestra el esquema del sitio de escisión del ARNm de p-catenina confirmado mediante la secuenciación del fragmento 5'-RACE-Pc R.
La Figura 6e muestra la eficiencia de carga diferencial de RISC de ARNai y ARNsi. Se transfectaron dúplex de ARNai o ARNsi en células Hela 48 horas después de la transfección con pCMV-Ago2. Se inmunoprecipitó Ago2 en los puntos de tiempo indicados después de la transfección de ARNai o ARNsi, y se realizó un análisis de inmunoprecipitación Northern para determinar los niveles de ARN pequeños asociados a Ago2/RISC. Los niveles de Ago2 (que se muestran a continuación) se determinaron mediante inmunoprecipitación Western después de IP.
La Figura 6f muestra los efectos de bloquear Ago2 o Dicer en la actividad de silenciamiento génico de ARNai y ARNsi. Las células se transfectaron con ARNsi codificado (siCon), o ARNsi con direccionamiento a Ago2 (siAgo2) o Dicer (siDicer) 24 horas antes de la transfección con ARNai codificado (Con) o ARNai con direccionamiento a Stat3 (ai). Se cosecharon las células y se realizó un análisis de inmunoprecipitación Western a las 48 horas después de la transfección con aiStat3.
La Figura 7 muestra las ventajas de incorporación de ARNai en RISC en comparación con ARNsi.
La Figura 7A muestra que ARNai entra en RISC con mejor eficacia que ARNsi. Las células transfectadas con el plásmido de expresión de Ago2 se transfectaron con ARNai o ARNsi durante los tiempos indicados. Después de la lisis celular, se inmunoprecipitó Ago2, se extrajo ARN del inmunoprecipitado y se separó en un gel de acrilamida al 15 %. Después de la transferencia, la membrana se hibridó con una sonda para detectar la cadena antisentido 21 mer del ARNai o ARNsi. El carril de control de IgG muestra falta de señal en comparación con el inmunoprecipitado de Ago2.
La Figura 7B muestra que la cadena en sentido de ARNai no permanece en RISC. La membrana de (A) se despojó y se volvió a sondar para detectar la cadena en sentido del oligo transfectado. Los dibujos animados en (A) y (B) ilustran la posición de la cadena en sentido (cadena superior), la cadena antisentido (cadena inferior) o el dúplex en la membrana.
La Figura 8 muestra que el mecanismo de carga de RISC por ARNai.
La Figura 8A muestra el análisis de inmunoprecipitación de la interacción entre diferentes cadenas de ARNai o ARNsi y Ago2. El lisado de Hela S-10 que contenía Ago2 sobreexpresado se incubó con el dúplex de ARNai o ARNsi indicado que contenía cadenas en sentido o antisentido marcadas en el extremo 32P. El (*) marca la ubicación de la marca. Después de la inmunoprecipitación de Ago2, el ARN se aisló y se separó en un gel de acrilamida al 15 % y se expuso a una película. Los ARN asociados a Ago2 se muestran en la fracción de sedimento, mientras que los ARN no enlazados a Ago2 permanecen en el sobrenadante (Sup).
La Figura 8B muestra el papel de la escisión de la cadena en sentido en la actividad de ARNai. Las células se transfectaron con ARNai o ARNai con cadena en sentido 2'-O-metilo en la posición 8 (sitio de escisión de Ago2 predicho) o en la posición 9 como un control. Se recolectó ARN 4 horas posttransfección y se realizó qRT-PCR para determinar los niveles relativos de ARNm de p-catenina restante.
La Figura 9 muestra el análisis de competencia de ARNai y ARNsi.
La Figura 9A ilustra el dúplex de ARNsi y ARNai que contiene cadenas antisentido marcadas en el extremo 32P. El (*) marca la ubicación de la marca.
La Figura 9B muestra que el ARNai frío no compite con el ARNsi marcado por Ago2. El lisado de Hela S-10 que contenía Ago2 sobreexpresado se incubó con el ARNsi marcado en el extremo 32P y el dúplex de ARNai o ARNsi frío antes de la inmunoprecipitación de Ago2. A continuación, se aisló el ARN y se analizó en gel de acrilamida al 15 %.
La Figura 9C muestra que el ARNsi frío no compite con el ARNai marcado por Ago2. El mismo lisado de S-10 usado en B se incubó con el ARNai marcado en el extremo 32P y el dúplex frío de ARNai o ARNsi antes de la inmunoprecipitación de Ago2. A continuación, se aisló el ARN y se analizó en gel de acrilamida al 15 %.
La Figura 10 ilustra el modelo de ARNai y ARNsi que muestra las diferencias observadas en la carga de RISC y la generación de RISC maduro.
La Figura 11 muestra dúplex de ARN asimétrico de 14-15 bp con salientes antisentido (ARNai) que inducen silenciamiento génico potente, eficaz, rápido y duradero.
La Figura 11A muestra el diagrama que muestra la secuencia y diseño de ARNsi y ARNai que se direccionan a pcatenina.
La Figura 11B muestra la inducción del silenciamiento génico por ARNai de diversas longitudes. Los niveles de proteína p-catenina se analizaron mediante inmunoprecipitación Western en células transfectadas con el ARNai indicado durante 48 horas.
La Figura 11C muestra que el ARNai es más potente y eficaz que el ARNsi para inducir el agotamiento de la proteína 13-catenina. Las células Hela se sometieron a transfección con ARNai o ARNsi direccionado a p-catenina a las concentraciones indicadas. 48 horas posttransfección, se prepararon los lisados celulares y se realizó el análisis de inmunoprecipitación Western.
La Figura 11D muestra que el ARNai es más eficaz, rápido y duradero que el ARNsi para reducir los niveles de ARN de p-catenina. Las células se sometieron a transfección con ARNai de 15 bp 10 nM o ARNsi de 21-mer durante el número indicado de días antes del análisis de inmunoprecipitación Northern.
La Figura 12 muestra que ARNai media un silenciamiento rápido y potente.
La Figura 12A muestra la secuencia y estructura de ARNai y ARNsi usados para tener como diana a p-catenina.
La Figura 12B muestra la RT-PCR de los niveles de ARNm de p-catenina de las células transfectadas con ARNai de control o ARNai direccionado a p-catenina. El ARN se recolectó en los tiempos indicados posttransfección.
La Figura 12C muestra la RT-PCR cuantitativa en tiempo real de los niveles de ARNm de p-catenina en células sometidas a transfección con control, ARNai o ARNsi durante el número indicado de horas.
La Figura 12D muestra el análisis de inmunoprecipitación Western de los niveles de proteína p-catenina en células transfectadas con control, ARNai o ARNsi durante los tiempos indicados.
La Figura 13 muestra la comparación de ARNai con ARNsi en la eficacia y durabilidad del silenciamiento génico contra múltiples dianas. Las células Hela se sometieron a transfección con ARNsi (c), ARNai (ai) o ARNsi (si) codificados direccionados a (a) 8-catenina a 10 nM, (b) Stat3, (c) EF2 o (d) NQO1 a 20 nM. El ARN y la proteína se purificaron en los puntos de tiempo indicados y se analizaron los niveles de ARNm mediante reacción cuantitativa en cadena de la polimerasa en tiempo real (qRT-PCR) y los niveles de proteína mediante inmunoprecipitación Western. Los datos de qRT-PCR se normalizan a células sometidas a transfección con siCon.
La Figura 14 muestra que el silenciamiento génico mediado por ARNai es efectivo contra diversos genes en múltiples líneas celulares.
La Figura 14a muestra que el dúplex de ARNai es más eficaz que el ARNsi para direccionar a la p-catenina en diferentes líneas celulares de mamíferos.
La Figura 14b muestra el análisis de inmunoprecipitación Western de Nbs1, Survivina, Parp1, p21 de células sometidas a transfección con 20 nM del ARNai o ARNsi indicado durante 48 horas.
La Figura 14c muestra el análisis de inmunoprecipitación Western de Rsk1, PCNA, p70S6K, mTOR y PTEN de células sometidas a transfección con 20 nM del ARNai o ARNsi indicado durante 48 horas.
La Figura 14d muestra el silenciamiento génico específico de alelo de k-Ras mediante ARNai. Se probó el ARNai direccionado a k-Ras de tipo salvaje para el silenciamiento de k-Ras en líneas celulares de k-Ras de tipo salvaje (DLD1) y k-Ras mutante (SW480) mediante análisis de inmunotransferencia Western.
La Figura 15 muestra la falta de silenciamiento génico fuera de la diana por la cadena en sentido, inmunoestimulación y estabilidad en suero de los ARNai.
La Figura 15a muestra el análisis de RT-PCR de la expresión de genes inducibles por interferón en PBMC tratadas de forma simulada o incubadas con p-catenina de dúplex ARNsi o ARNai durante 16 horas.
La Figura 15b muestra el análisis por RT-PCR de la expresión de genes inducibles por interferón en células Hela sometidas a transfección simulada o sometidas a transfección con EF2 o ARNai o ARNsi de Survivina durante 24 horas.
La Figura 15c muestra el análisis de micromatrices de cambios en la expresión de genes conocidos relacionados con la respuesta al interferón. El ARN total aislado de las células Hela sometidas a transfección con ARNai y ARNsi se analizó mediante micromatriz.
La Figura 15d muestra que no se detecta silenciamiento génico fuera de la diana mediado por cadena en sentido para el ARNai. Las células se cotransfectaron con ARNai o ARNsi y un plásmido que expresa Stat3 (ARN en sentido) o un plásmido que expresa Stat3 antisentido (ARN antisentido). Se cosecharon las células y se recolectó el ARN 24 horas posttransfección y se determinaron niveles relativos de ARN en sentido o antisentido de Stat3 mediante PCR cuantitativa en tiempo real o RT-PCR (insertos).
La Figura 15e muestra la estabilidad de los dúplex de ARNai y ARNsi en suero humano. Los dúplex de ARNai y ARNsi se incubaron en suero humano al 10 % a 37 ° C durante el tiempo indicado antes de la electroforesis en gel. Se indica el dúplex restante (% de control).
La Figura 15f ilustra el modelo propuesto para el silenciamiento génico específico mediado por el dúplex de ARNai.
La Figura 16 muestra la potente actividad antitumoral del ARNai contra la p-catenina en el modelo de ratón xenoinjerto de colon humano SW480. A los ratones inmunodeprimidos con cáncer de colon humano subcutáneo establecido SW480 se les administró por vía intravenosa (iv) 0.6 nmol de ARNsi de p-catenina formando complejos con PEI, ARNai de p-catenina formando complejos con PEI o un ARNsi no relacionado formando complejos con PEI como control negativo diariamente. El tamaño del tumor se evaluó periódicamente durante el tratamiento. Cada punto representa la media ± SEM de seis tumores.
La Figura 17 muestra la potente actividad antitumoral del ARNai contra la p-catenina en un modelo de ratón xenoinjerto de colon humano HT29. A los ratones inmunodeprimidos con cáncer de colon humano HT29 subcutáneo establecido se les administró por vía intravenosa (iv) 0.6 nmol de ARNsi de p-catenina formando complejos con PEI, ARNai de pcatenina formando complejos con PEI o un ARNsi no relacionado formando complejos con PEI como control negativo cada dos días. El tamaño del tumor se evaluó periódicamente durante el tratamiento. Cada punto representa la media ± SEM de cinco tumores.
Descripción detallada
La presente invención se relaciona con una molécula dúplex de ARN asimétrica que es capaz de efectuar un silenciamiento génico selectivo en una célula eucariota. La molécula dúplex de ARN asimétrica de la invención se define en las reivindicaciones. Aquí, la molécula dúplex de ARN comprende una primera cadena y una segunda cadena. La primera cadena es más larga que la segunda cadena. La segunda cadena es sustancialmente complementaria a la primera cadena y forma una región de doble cadena con la primera cadena.
En una realización, la molécula dúplex de ARN comprende además 1-10 nucleótidos no emparejados o con error de emparejamiento. En una realización alternativa, los nucleótidos no emparejados o con error de emparejamiento están en o cerca del extremo rebajado 5'. En una realización alternativa, los nucleótidos no emparejados o con error de emparejamiento están en la región bicatenaria. En otra realización, la secuencia de nucleótidos no emparejada o con error de emparejamiento tiene una longitud de 1-5 nucleótidos. En aún otra realización adicional, los nucleótidos no emparejados o con error de emparejamiento forman una estructura de bucle.
En una realización, la primera cadena o la segunda cadena contiene al menos una muesca, o está formada por dos fragmentos de nucleótidos.
En una realización, el silenciamiento génico se logra mediante una o dos, o toda la interferencia del ARN, modulación de la traducción y modulaciones epigenéticas del ADN.
Como se usa en la especificación y reivindicaciones, la forma singular "un”, uno, una", y "el/la" incluyen referencias en plural a menos que el contexto indique claramente lo contrario. Por ejemplo, el término "una célula" incluye una pluralidad de células que incluyen mezclas de las mismas.
Como se usa aquí, un "ARN bicatenario", un "ARN dúplex" o un "dúplex de ARN" se refiere a un ARN de dos cadenas y con al menos una región bicatenaria, e incluye moléculas de ARN que tienen al menos una brecha, muesca, protuberancia y/o burbuja dentro de una región bicatenaria o entre dos regiones bicatenarias vecinas. Si una cadena tiene una brecha o una región monocatenaria de nucleótidos no emparejados entre dos regiones bicatenarias, se considera que esa cadena tiene múltiples fragmentos. Un ARN bicatenario como se usa aquí puede tener salientes terminales en cualquier extremo o en ambos extremos. En algunas realizaciones, las dos cadenas del dúplex de ARN se pueden unir a través de cierto enlazador químico.
Como se usa aquí, una "cadena antisentido" se refiere a una cadena de ARN que tiene una complementariedad sustancial de secuencia contra un ARN mensajero diana. Una cadena antisentido puede ser parte de una molécula de ARNsi, parte de un dúplex ARNmi/ARNmi* o un ARNmi maduro monocatenario.
El término "aislado" o "purificado" como se usa aquí se refiere a un material que está sustancial o esencialmente libre de componentes que normalmente lo acompañan en su estado nativo. La pureza y homogeneidad se determinan típicamente usando técnicas de química analítica tales como electroforesis en gel de poliacrilamida o cromatografía líquida de alta resolución.
Como se usa aquí, "modular" y sus equivalentes gramaticales se refieren a aumentar o disminuir (por ejemplo, silenciar), en otras palabras, sobrerregular o subregular. Como se usa aquí, "silenciamiento génico" se refiere a la reducción de la expresión génica, y puede referirse a una reducción de la expresión génica de aproximadamente el 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 % o 95 % del gen direccionado.
Como se usa aquí, el término "sujeto" se refiere a cualquier animal (por ejemplo, un mamífero), incluido, pero no limitado a, humanos, primates no humanos, roedores y similares, que va a ser el receptor de un tratamiento particular. Normalmente, los términos "sujeto" y "paciente" se usan indistintamente aquí en referencia a un sujeto humano.
Los términos como "tratar" o "tratamiento" o "para tratar" o "aliviar" o "para aliviar" como se usan aquí se refieren a ambas (1) medidas terapéuticas que curan, ralentizan, disminuyen los síntomas y/o detienen la progresión de una afección o trastorno patológico diagnosticado y (2) medidas profilácticas o preventivas que previenen o ralentizan el desarrollo de una afección o trastorno patológico direccionado. Por tanto, los que necesitan tratamiento incluyen aquellos que ya padecen el trastorno; aquellos propensos a tener el trastorno; y aquellos en quienes se debe prevenir el trastorno. Un sujeto es "tratado" con éxito de acuerdo con los métodos descritos aquí si el paciente muestra uno o más de los siguientes: una reducción en el número de o ausencia completa de células cancerosas; una reducción del tamaño del tumor; inhibición de o una ausencia de infiltración de células cancerosas en órganos periféricos, incluida la propagación del cáncer a tejidos blandos y hueso; inhibición de o una ausencia de metástasis tumoral; inhibición o ausencia de crecimiento tumoral; alivio de uno o más síntomas asociados con el cáncer específico; reducción de morbilidad y mortalidad; y mejora de la calidad de vida.
Como se usa aquí, los términos "inhibir", "que inhibe" y sus equivalentes gramaticales, cuando se usan en el contexto de una bioactividad, se refieren a una subregulación de la bioactividad, que puede reducir o eliminar la función direccionada, como la producción de una proteína o fosforilación de una molécula. En realizaciones particulares, la inhibición puede referirse a una reducción de aproximadamente el 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 % o 95 % de la actividad direccionada. Cuando se utilizan en el contexto de un trastorno o enfermedad, los términos se refieren al éxito en la prevención de la aparición de síntomas, alivio de síntomas o eliminación de la enfermedad, afección o trastorno.
Como se usa aquí, el término "sustancialmente complementario" se refiere a la complementariedad en una región bicatenaria de pares de bases entre dos ácidos nucleicos y no cualquier región monocatenaria tal como un saliente terminal o una región de brecha entre dos regiones bicatenarias. La complementariedad no necesita ser perfecta; puede haber cualquier número de errores de apareamiento de pares de bases, por ejemplo, entre los dos ácidos nucleicos. Sin embargo, si el número de errores de apareamiento es tan grande que no puede producirse hibridación incluso bajo las condiciones de hibridación menos rigurosas, la secuencia no es una secuencia sustancialmente complementaria. Cuando aquí se hace referencia a dos secuencias como "sustancialmente complementarias", significa que las secuencias son suficientemente complementarias entre sí para hibridarse bajo las condiciones de reacción seleccionadas. La relación de complementariedad de ácidos nucleicos y rigurosidad de hibridación suficiente para lograr especificidad es bien conocida en la técnica. Dos cadenas sustancialmente complementarias pueden ser, por ejemplo, perfectamente complementarias o pueden contener de 1 a muchos errores de apareamientos siempre que las condiciones de hibridación sean suficientes para permitir, por ejemplo, discriminación entre una secuencia de apareamiento y una secuencia de no apareamiento. Por consiguiente, secuencias sustancialmente complementarias pueden referirse a secuencias con una complementariedad de pares de bases de 100, 95, 90, 80, 75, 70, 60, 50 por ciento o menos, o cualquier número intermedio, en una región bicatenaria.
Como se usa aquí, los antagomirs son inhibidores de ARNmi y pueden usarse para silenciar ARNmi endógenos. Como se usa aquí, miméticos o imitadores son agonistas de ARNmi y pueden usarse para reemplazar ARNmi endógenos como equivalentes funcionales y de ese modo sobrerregular rutas afectadas por tales ARNmi endógenos.
1. Interferencia de ARN
La interferencia de ARN (abreviado como ARNi) es un proceso celular para la destrucción direccionada de ARN monocatenario (ARNss) inducida por ARN bicatenario (ARNds). El ARNss es una transcripción de genes, como un ARN mensajero (ARNm). ARNi es una forma de silenciamiento génico postranscripcional en la que el ARNds puede interferir específicamente con la expresión de genes con secuencias que son complementarias al ARNds. La cadena de ARN antisentido del ARNds tiene como diana una transcripción de un gen complementario, como un ARN mensajero (ARNm) para la escisión por una ribonucleasa.
En el proceso de ARNi, ARNds largo es procesado a formas cortas por una proteína de ribonucleasa Dicer llamada ARN interferente pequeño (ARNsi). El ARNsi se separa en cadena guía (o antisentido) y cadena pasajera (o en sentido). La cadena guía está integrada en el complejo de silenciamiento inducido por ARN (RISC), que es un complejo de múltiples proteínas que contiene ribonucleasas. Luego, el complejo se direcciona específicamente a las transcripciones génicas complementarias para destrucción.
Se ha demostrado que el ARNi es un proceso celular común en muchos eucariotas. RISC, así como Dicer, se conserva a través del dominio eucariota. Se cree que el ARNi juega un papel en la respuesta inmune al virus y otro material genético extraño.
Los ARN interferentes pequeños (ARNsi) son una clase de moléculas de ARN bicatenario corto (ARNds) que desempeñan diversas funciones en biología. Más notablemente, está involucrado en la vía de ARN interferente (ARNi) donde el ARNsi interfiere con la expresión de un gen específico. Además, los ARNsi también juegan un papel en los procesos tales como un mecanismo antiviral o dar forma a la estructura de cromatina de un genoma. En un ejemplo, el ARNsi tiene una región de ARN bicatenario (ARNds) corta (19-21 nt) con salientes 3' de 2-3 nucleótidos con terminales 5'-fosfato y 3'-hidroxilo.
Los microARN (ARNmi) son una clase de moléculas de ARN endógenas, monocatenarias o bicatenarias, de aproximadamente 22 nucleótidos de longitud que regulan hasta un 30 % de los genes de mamíferos (Czech, 2006; Eulalio et al., 2008; Mack, 2007). ARNMi reprime la producción de proteínas bloqueando la traducción o provocando degradación de transcripción. Un ARNmi puede tener como diana a 250-500 ARNm diferentes. ARNmi es el producto de la digestión Dicer de pre-ARNmi, que es el producto de ARNmi primario (pri-ARNmi).
Como se usa aquí, los antagomirs son inhibidores de ARNmi y pueden usarse en el silenciamiento de ARNmi endógenos. Como se usa aquí, los miméticos son agonistas de ARNmi y se pueden usar para reemplazar los ARNmi y subregular los ARNm.
Dicer es un miembro de la familia de ribonucleasas RNasa III. Dicer escinde ARN bicatenario largo (ARNds), premicroARN (ARNmi) y ARN en horquilla corta (ARNsh) en fragmentos cortos de ARN bicatenario llamados ARN interferente pequeño (ARNsi) de unos 20-25 nucleótidos de longitud, generalmente con saliente de dos bases en el extremo de 3'. Dicer cataliza la primera etapa en la vía de interferencia del ARN e inicia la formación del complejo de silenciamiento inducido por a Rn (RISC), cuyo componente catalítico argonauta es una endonucleasa capaz de degradar el ARN mensajero (ARNm) cuya secuencia es complementaria a la de la cadena guía de ARNsi.
Como se usa aquí, una secuencia de ARNsi eficaz es un ARNsi que es eficaz para activar la ARNi para degradar las transcripciones de un gen diana. No todos los ARNsi complementarios al gen diana son eficaces para activar el ARNi para degradar las transcripciones del gen. De hecho, el cribado que requiere mucho tiempo suele ser necesario para identificar una secuencia de ARNsi eficaz. En una realización, la secuencia de ARNsi eficaz es capaz de reducir la expresión del gen diana en más del 90 %, más del 80 %, más del 70 %, más del 60 %, más del 50 %, más del 40 % o mas de 30 %.
La presente invención proporciona un armazón estructural nuevo llamado ARN interferente asimétrico (ARNai) que puede usarse para efectuar resultados similares a ARNsi, y también para modular las actividades de la ruta de ARNmi (descritas en detalle en las solicitudes de PCT y de Estados Unidos de copropiedad presentadas en el mismo día que la presente solicitud bajo el título "Composición de Dúplex de ARN asimétrico como mimético de microARN o inhibidor").
El nuevo diseño estructural de ARNai no solo es funcionalmente potente para efectuar la regulación génica, sino que también ofrece varias ventajas sobre los reguladores de ARNi de última generación (principalmente antisentido, ARNsi). Entre las ventajas, el ARNai puede tener una estructura dúplex de ARN de longitud mucho más corta que los constructos de ARNsi actuales, lo que debería reducir el coste de síntesis y anular o reducir la activación dependiente de la longitud de respuestas inmunes de tipo interferón inespecíficas de las células huésped. La longitud más corta de la cadena pasajera en el ARNai también debería eliminar o reducir la incorporación involuntaria de la cadena pasajera en RISC y, a su vez, reducir los efectos fuera de la diana observados en el silenciamiento génico mediado por ARNmi. ARNai se puede utilizar en todas las áreas en las que se están aplicando o contemplando aplicar las tecnologías actuales con base en ARNmi, incluida la investigación en biología, la R&D en las industrias biotecnológica y farmacéutica, y diagnósticos y terapias con base en ARNmi.
2. El armazón estructural de ARNai
Elbashir et al, probaron varias moléculas dúplex de ARN asimétricas así como moléculas de ARNsi simétricas (Elbashir et al., 2001c). Las moléculas dúplex de ARN asimétrico se enumeran en la tabla 1 junto con las moléculas de ARNsi correspondientes.
Tabla 1
Figure imgf000016_0001
Sin embargo, en comparación con las correspondientes moléculas de ARNsi simétricas, las moléculas dúplex de ARN asimétricas son incapaces de efectuar un silenciamiento selectivo de genes (i bid).
La presente invención es pertinente para moléculas dúplex de ARN asimétricas que son capaces de efectuar un silenciamiento génico específico de secuencia. La molécula de ARN de la presente invención comprende una primera cadena y una segunda cadena, en donde la segunda cadena es sustancialmente complementaria a la primera cadena y forma una región bicatenaria con la primera cadena, en donde la primera cadena es más larga que la segunda cadena, como se define en la reivindicación 1; excluyendo las moléculas dúplex de ARN asimétricas divulgadas en Elbashir (Elbashir et al., 2001c), específicamente las moléculas dúplex de a Rn asimétricas enumeradas en la Tabla 1. La molécula de ARN comprende una región bicatenaria y dos extremos seleccionados independientemente del grupo que consiste en un saliente de 5', saliente de 3' y extremo romo. La cadena de ARN puede tener nucleótidos no emparejados o emparejados de manera imperfecta.
En una realización, la región bicatenaria de la molécula de ARN no contiene ningún error de emparejamiento o protuberancia. En otra realización, la región bicatenaria de la molécula de ARN contiene errores de emparejamiento y/o protuberancias.
En una realización, cuando la primera cadena es
5'-UUCGAAGUAUUCCGCGUACGU
5'-UCGAAGUAUUCCGCGUACGUG o
5'-CGAAGUAUUCCGCGUACGUGA,
la segunda cadena tiene una longitud de como máximo 17 nucleótidos, o contiene al menos un error de emparejamiento con la primera cadena, o contiene al menos una modificación.
En una realización alternativa, la primera cadena no es
5'-UUCGAAGUAUUCCGCGUACGU
5'-UCGAAGUAUUCCGCGUACGUG o
5'-CGAAGUAUUCCGCGUACGUGA.
En la invención, la primera cadena comprende una secuencia que es complementaria a una secuencia de ARNm diana. La presente invención es pertinente para moléculas de ARN asimétricas de doble cadena que son capaces de efectuar el silenciamiento génico. La molécula de ARN descrita aquí comprende una primera cadena y una segunda cadena, en donde la segunda cadena es sustancialmente complementaria, o parcialmente complementaria a la primera cadena, y la primera cadena y la segunda cadena forman al menos una región bicatenaria, en donde la primera cadena es más larga que la segunda cadena (asimetría de longitud). La molécula de ARN de la presente divulgación tiene al menos una región bicatenaria y dos extremos seleccionados independientemente del grupo que consiste en un saliente 5', un saliente 3' y un extremo romo (por ejemplo, véanse las Figuras 1A, 2A-2D).
En el campo de la fabricación de pequeños reguladores de ARN donde cambios, adiciones y eliminaciones de un solo nucleótido pueden afectar críticamente la funcionalidad de la molécula (Elbashir et al., 2001c), el armazón de ARNai proporciona una plataforma estructural distinta de la estructura ARNsi clásica de ARN de doble cadena de 21 nt que es simétrica en cada cadena y sus respectivos salientes 3'. Además, el ARNai de la presente invención proporciona una nueva metodología muy necesaria para diseñar una nueva clase de reguladores de moléculas pequeñas que, como se muestra en los datos incluidos en los siguientes ejemplos, pueden superar obstáculos que se encuentran actualmente en investigaciones con base en ARNi y desarrollo de fármacos. Por ejemplo, los datos de los ARNai que imitan estructuralmente a los ARNsi muestran que los ARNai son más eficaces, potentes, de inicio rápido, duraderos y específicos que los ARNsi para inducir el silenciamiento génico.
Cualquier región monocatenaria de la molécula de ARN de la invención, incluidos cualquiera de los salientes terminales y las brechas entre dos regiones bicatenarias, puede estabilizarse frente a la degradación, ya sea mediante modificación química o estructura secundaria. Las cadenas de ARN pueden tener nucleótidos no emparejados o emparejados de manera imperfecta. Cada cadena puede tener una o más muescas (un corte en el esqueleto principal del ácido nucleico, por ejemplo, ver la Figura 1B), brechas (una cadena fragmentada con uno o más nucleótidos faltantes, por ejemplo, ver la Figura 1C) y nucleótidos modificados o análogos de nucleótidos. No solo se pueden modificar químicamente cualquiera o todos los nucleótidos de la molécula de ARN, cada cadena puede conjugarse con uno o más unidades estructurales para aliar su funcionalidad, por ejemplo, con unidades estructurales tales como uno o más péptidos, anticuerpos, fragmentos de anticuerpos, aptámeros, polímeros y así sucesivamente.
En un ejemplo, la primera cadena tiene 21 nucleótidos de longitud. En un ejemplo, la segunda cadena tiene una longitud de 15 nucleótidos.
En una realización, la región bicatenaria de la molécula de ARN no contiene ningún error de emparejamiento o protuberancia, y las dos cadenas son perfectamente complementarias entre sí en la región bicatenaria. En otra realización, la región bicatenaria de la molécula de ARN contiene errores de emparejamiento y/o protuberancia.
En un ejemplo, el saliente terminal es de 1-8 nucleótidos. En otro ejemplo, el saliente terminal es de 3 nt.
2.1 La molécula dúplex de ARN con un saliente 5' y un saliente 3' en la primera cadena
Refiriéndose a la Figura 1A la molécula de ARN de doble cadena tiene un saliente 5' y un saliente 3' en la primera cadena. La molécula de ARN comprende una primera cadena y una segunda cadena; la primera cadena y la segunda cadena forman al menos una región bicatenaria con secuencias sustancialmente complementarias, en donde la primera cadena es más larga que la segunda cadena. En la primera cadena, que flanquea la región de doble cadena, hay un saliente sin apareamiento en los terminales 5' y 3'.
2.2. La molécula dúplex de ARN con un extremo romo y un saliente 5' o un saliente 3' en la primera cadena.
Como se describe aquí, la molécula dúplex de ARN comprende una región bicatenaria, un extremo romo y un saliente 5' o un saliente 3' (véanse, por ejemplo, las Figuras 2A y 2B). La molécula de ARN comprende una primera cadena y una segunda cadena, en donde la primera cadena y la segunda cadena forman una región bicatenaria, en donde la primera cadena es más larga que la segunda cadena.
En la invención, la molécula dúplex de ARN comprende una región bicatenaria, un extremo romo y una saliente 3' (ver, por ejemplo, la figura 2B).
En un ejemplo, la saliente 3' tiene una longitud de 1-8 nt.
También se describe aquí un ejemplo en donde la molécula dúplex de ARN comprende una región bicatenaria, un extremo romo y una saliente 55 (ver, por ejemplo, la figura 2A).
2.3. La molécula dúplex de ARN con dos salientes 5' o dos salientes 3'
También se describe aquí un ejemplo en donde la molécula dúplex de ARN comprende una región bicatenaria y dos salientes 3' o dos salientes 5' (véanse, por ejemplo, las figuras 2C y 2D). La molécula de ARN comprende una primera cadena y una segunda cadena, en donde la primera cadena y la segunda cadena forman una región bicatenaria, en donde la primera cadena es más larga que la segunda cadena.
En un ejemplo alternativo, la molécula dúplex de ARN comprende una región bicatenaria y dos salientes 3' (véase, por ejemplo, la figura 2C). La región bicatenaria comparte características similares a las descritas con respecto a otras realizaciones.
En un ejemplo, la molécula dúplex de ARN comprende una región bicatenaria y dos salientes 5' (véase, por ejemplo, la Figura 2D).
3. El diseño de ARNai
Los ARNsi y ARNmi se utilizan ampliamente como herramientas de investigación y se desarrollan como candidatos a fármacos. (ver, por ejemplo, Dykxhoorn, Novina & Sharp. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 4: 457-467 (2003); Kim & Rossi, Nature Rev. Genet. 8: 173-184 (2007); de Fougerolles, et al., Nature Rev. Drug Discov. 6: 443-453 (2007); Czech, NEJM 354:1194-1195 (2006); y Mack, Nature Biotech. 25:631-638 (2007)). Las moléculas dúplex de ARN de la presente invención, es decir, ARNai, pueden derivarse de ARNsi y ARNmi conocidos en el campo.
La presente divulgación proporciona un método para convertir un ARNsi o un ARNmi en un ARNai. La conversión resulta en una nueva molécula dúplex de ARN que tiene al menos una propiedad mejorada en comparación con la molécula original. La propiedad puede ser tamaño, eficacia, potencia, la velocidad de aparición, durabilidad, coste de síntesis, efectos fuera de la diana, respuesta al interferón o administración.
En un ejemplo, la molécula original es una molécula dúplex de ARN, como un ARNsi. La molécula dúplex de ARN comprende una cadena antisentido (por ejemplo, una cadena guía) y una cadena en sentido (por ejemplo, una cadena pasajera) que forman al menos una región bicatenaria. El método comprende cambiar la longitud de una o ambas cadenas de modo que la cadena antisentido sea más larga que la cadena en sentido. En un ejemplo, se acorta la cadena en sentido pasajera. En otro ejemplo, la cadena antisentido se alarga. En un ejemplo aún más, la cadena en sentido se acorta y la cadena antisentido se alarga. Las cadenas de ARN antisentido y en sentido, intactas o con tamaño modificado, se pueden sintetizar y luego combinar bajo condiciones en donde se forma una molécula de ARNai.
En un ejemplo adicional, el método comprende cambiar la longitud de la cadena antisentido y/o en sentido de modo que la molécula dúplex de ARN se forme con al menos uno de un saliente 3' de 1-6 nucleótidos y un saliente 5' de 1­ 6 nucleótidos.
Alternativamente, las moléculas dúplex de ARN de la presente invención pueden diseñarse de novo. Se puede diseñar una molécula dúplex de ARN de la presente invención aprovechando los métodos de diseño para ARNsi y ARNmi, como el método de caminata génica.
Se puede diseñar una molécula de ARN de la presente invención con metodologías bioinformáticas, y luego probar in vitro e in vivo para determinar su eficacia moduladora contra el gen diana y la existencia de cualquier efecto fuera de la diana. Con base en estos estudios, las secuencias de las moléculas de ARN pueden seleccionarse y modificarse para mejorar la eficacia moduladora contra el gen diana y minimizar los efectos fuera de la diana (véase, por ejemplo, Patzel, Drug Discovery Today 12:139-148 (2007)).
3.1. Región no emparejada o con error de emparejamiento en la molécula dúplex de ARN
Las dos cadenas sencillas del dúplex de ARNai pueden tener al menos una región no emparejada o emparejada de manera imperfecta que contiene, por ejemplo, uno o más errores de emparejamiento. En una realización, la región no emparejada o emparejada de manera imperfecta es al menos una región terminal de la molécula de ARN, que incluye una región terminal con un extremo romo y una región terminal con un receso 5' o un saliente 3'. Como se usa aquí, la región final es una región de la molécula de ARN que incluye un extremo y el área vecina.
En una realización, la región no emparejada o emparejada de manera imperfecta está en una región bicatenaria de la molécula de ARNai. En una realización adicional, el dúplex de ARN asimétrico tiene una estructura de abultamiento o bucle no emparejada.
3.2. Motivos de secuencia en la molécula dúplex de ARN
En el diseño de una molécula de ARNai de la invención, el contenido global de GC puede variar. En una realización, el contenido de GC de la región bicatenaria es del 20-70 %. En una realización adicional, el contenido de GC de la región bicatenaria es inferior al 50 %, o preferiblemente del 30-50 %, para facilitar la separación de las cadenas, ya que el emparejamiento G-C es más fuerte que el emparejamiento A-U.
La secuencia de nucleótidos en un saliente terminal, en algunas realizaciones, por ejemplo, el terminal 5', puede diseñarse independientemente de cualquier secuencia molde (por ejemplo, una secuencia de ARNm diana), es decir, no tiene que ser sustancialmente complementaria a un ARNm diana (en el caso de un mimético de ARNsi o de ARNmi) o un ARNmi diana (en el caso de un inhibidor de ARNmi). En una realización, el saliente, en el 3', de la cadena más larga o antisentido, es un motivo "AA", "UU" o "dTdT", que han mostrado una eficacia incrementada en comparación con algunos otros motivos. En otra realización, el saliente 3' de la cadena más larga o antisentido tiene un motivo "UU".
3.3. Sustitución de nucleótidos
Uno o más de los nucleótidos en la molécula de ARN de la invención se pueden sustituir con desoxinucleótidos o nucleótidos modificados o análogos de nucleótidos. La sustitución puede tener lugar en cualquier parte de la molécula de ARN, por ejemplo, una o ambas regiones salientes y/o una región bicatenaria. En algunos casos, la sustitución potencia una propiedad física de la molécula de ARN, como la afinidad de cadena, solubilidad y resistencia a degradación de RNasa o la estabilidad potenciada de otro modo.
En una realización, el nucleótido modificado o análogo es un ribonucleótido con azúcar, esqueleto principal y/o base modificados. El ribonucleótido con esqueleto principal modificado puede tener una modificación en un enlace fosfodiéster con otro ribonucleótido. En una realización, el enlace fosfodiéster en la molécula de ARN se modifica para incluir al menos un heteroátomo de nitrógeno y/o azufre. En una realización, el nucleótido modificado o análogo es una base inusual o una base modificada. En una realización, el nucleótido modificado o análogo es inosina o una base tritilada.
En una realización adicional, el análogo de nucleótido es un ribonucleótido con azúcar modificado en el que el grupo 2'-OH está reemplazado por un grupo seleccionado del grupo que consiste en H, OR, R, halo, SH, SR, NH2, NHR, NR2 y CN, en donde cada R se selecciona independientemente del grupo que consiste en alquilo, alquenilo y alquinilo C1-C6, y halo se selecciona del grupo que consiste en F, Cl, Br e I.
En una realización, el análogo de nucleótido es un ribonucleótido con esqueleto principal modificado que contiene un grupo fosfotioato.
4. Las utilidades
La presente divulgación también proporciona un método para modular la expresión génica en una célula u organismo (método de silenciamiento). El método comprende las etapas de poner en contacto dicha célula u organismo con la molécula dúplex de ARN bajo condiciones en donde puede producirse el silenciamiento génico selectivo, y mediar un silenciamiento génico selectivo efectuado por dicha molécula dúplex de ARN hacia un ácido nucleico diana que tiene una porción de secuencia sustancialmente correspondiente al a Rn bicatenario.
En una realización, la etapa de contacto comprende la etapa de introducir dicha molécula dúplex de ARN en una célula diana en cultivo o en un organismo en el que puede ocurrir el silenciamiento génico selectivo. En una realización adicional, la etapa de introducción comprende transfección, lipofección, infección, electroporación u otras tecnologías de administración.
En una realización, el método de silenciamiento se usa para determinar la función o utilidad de un gen en una célula u organismo.
El método de silenciamiento puede usarse para modular la expresión de un gen en una célula o un organismo. En una realización, el gen está asociado con una enfermedad, por ejemplo, una enfermedad humana o animal, una afección patológica o una afección indeseable. En una realización adicional, el gen es un gen de un microorganismo patógeno. Incluso en una realización adicional, el gen es un gen viral. En otra realización, el gen es un gen asociado a un tumor.
En una realización alternativa, el gen es un gen asociado con enfermedades autoinmunes, enfermedades inflamatorias, enfermedades degenerativas, enfermedades infecciosas, enfermedades proliferativas, enfermedades metabólicas, trastornos inmunomediados, enfermedades alérgicas, enfermedades dermatológicas, enfermedades malignas, trastornos gastrointestinales, trastornos respiratorios, trastornos cardiovasculares, trastornos renales, trastornos reumatoides, trastornos neurológicos, trastornos endocrinos y envejecimiento.
4.1. Herramientas de investigación
Las moléculas de ARN de la presente invención se pueden usar para crear "bloqueado" de genes en modelos animales en contraposición a modelos de anulado manipulados genéticamente para descubrir funciones de genes. Los métodos también pueden usarse para silenciar genes in vitro. Por ejemplo, el ARNai se puede transfectar a células. El ARNai se puede utilizar para 1 como herramienta de investigación en la identificación y validación de diana/vías de fármacos, y otras investigaciones biomédicas en investigación y desarrollo de fármacos.
4.2 Usos terapéuticos
Las moléculas de ARN de la presente invención se pueden utilizar para el tratamiento o la prevención de diversas enfermedades o afecciones indeseables, incluidas las enfermedades resumidas (Czech, 2006; de Fougerolles et al., 2007; Dykxhoorn et al., 2003; Kim and Rossi, 2007; Mack, 2007).
En una realización, la presente invención se puede utilizar como terapia contra el cáncer o para prevenir el cáncer. Las moléculas de ARN de la presente invención se pueden utilizar para silenciar o bloquear genes implicados en la proliferación celular u otros fenotipos cancerosos. Ejemplos de estos genes son k-Ras, p-catenina, Nbs1, EF2, Stat3, PTEN, p70S6K, mTOR, Rsk1, PCNA, Parpl, Survivina, NQO1 y p21. Específicamente, k-Ras y p-catenina son genes terapéuticos del cáncer de colon. Estos oncogenes son activos y relevantes en la mayoría de los casos clínicos.
Estas moléculas de ARN también se pueden usar para silenciar o bloquear dianas de genes no cancerosos. Las moléculas de ARN de la invención también se pueden usar para tratar o prevenir enfermedades oculares (por ejemplo, degeneración macular relacionada con la edad (AMD) y retinopatía diabética (DR)); enfermedades infecciosas (por ejemplo, VIH/SIDA, virus de la hepatitis B (HBV), virus de la hepatitis C (HCV), virus del papiloma humano (HPV), virus del herpes simple (HSV), RCV, citomegalovirus (CMV), fiebre del dengue, virus del Nilo occidental); enfermedades respiratorias (por ejemplo, virus respiratorio sincitial (RSV), asma, fibrosis quística); enfermedades neurológicas (por ejemplo, enfermedad de Huntingdon (HD), esclerosis lateral amiotrófica (ALS), lesión de la médula espinal, enfermedad de Parkinson, enfermedad de Alzheimer, dolor); enfermedades cardiovasculares; trastornos metabólicos (por ejemplo, diabetes); trastornos genéticos; y afecciones inflamatorias (por ejemplo, enfermedad inflamatoria intestinal (IBD), artritis, enfermedad reumatoide, trastornos autoinmunes), enfermedades dermatológicas.
Se pueden silenciar diversos genes usando la molécula dúplex de ARN asimétrica de la presente invención. En una realización, la primera cadena comprende una secuencia que es sustancialmente complementaria a la secuencia de ARNm diana de un gen seleccionado del grupo que consiste en un gen del desarrollo, un oncogén, un gen supresor de tumores y un gen enzimático, y un gen para una molécula de adhesión, un inhibidor de ciclina quinasa, un miembro de la familia Wnt, un miembro de la familia Pax, un miembro de la familia Winged helix, un miembro de la familia Hox, una citoquina/linfoquina o su receptor, un factor de crecimiento/diferenciación o su receptor, un neurotransmisor o su receptor, ABLI, BCL1, BCL2, BCL6, CBFA2, CBL, CSFIR, ERBA, ERBB, EBRB2,ETS1, ETS1, ETV6, FGR, FOS, FYN, HCR, HRAS, JUN, KRAS, LCK, LYN, MDM2, MLL, MYB, MYC,MYCL1, MYCN, NRAS, PIM1, PML, RET, SRC, TAL1, TCL3 y YES) (por ejemplo, APC, BRCA1, BRCA2, MADH4, MCC,NF1, NF2,RB1, TP53, WT1, una ACP desaturasa o hidroxilasa, una ADP-glucosa piroforilasa, una ATPasa, una alcohol deshidrogenasa, una amilasa, una amiloglucosidasa, una catalasa, una celulasa, una ciclooxigenasa, una descarboxilasa, una dextrinasa, una ADN o ARN polimerasa, una galactosidasa, una glucanasa, una glucosa oxidasa, una GTPasa, una helicasa, una hemicelulasa, una integrasa, una invertasa, una isomerasa, una quinasa, una lactasa, una lipasa, una lipoxigenasa, una lisozima, una pectinesterasa, una peroxidasa, una fosfatasa, una fosfolipasa, una fosforilasa, una poligalacturonasa, una proteinasa o peptidasas, una pullanasa, una recombinasa, una transcriptasa inversa, una topoisomerasa, una xilanasa, k-RAS, p-catenina, Rsk1, PCNA, p70S6K, Survivina, mTOR, PTEN, Parpl o p21.
La presente invención proporciona un método para tratar una enfermedad o afección indeseable. El método comprende usar la molécula dúplex de ARN asimétrica para efectuar el silenciamiento génico de un gen asociado con la enfermedad o afección indeseable.
4.3. Conversión de moléculas de ARN (ARNai) en fármacos
4.3.1. Modificaciones de las moléculas de ARN.
Las moléculas de ARN desnudas son relativamente inestables y pueden degradarse in vivo con relativa rapidez. Se pueden introducir modificaciones químicas en las moléculas de ARN de la presente invención para mejorar su vida media y reducir aún más el riesgo de efectos no específicos del direccionamiento génico, sin reducir sus actividades biológicas.
Se han investigado las modificaciones de moléculas de ARN para mejorar la estabilidad de diversas moléculas de ARN, incluyendo ARN antisentido, ribozima, aptámero y ARNi (Chiu and Rana, 2003; Czauderna et al., 2003; de Fougerolles et al., 2007; Kim and Rossi, 2007; Mack, 2007; Zhang et al., 2006; y Schmidt, Nature Biotech. 25:273-275 (2007)).
Puede usarse cualquier modificación estabilizante conocida por una persona experimentada en la técnica para mejorar la estabilidad de las moléculas de ARN de la presente invención. Dentro de las moléculas de ARN de la presente invención, se pueden introducir modificaciones químicas en el esqueleto principal de fosfato (por ejemplo, enlaces de fosforotioato), la ribosa (por ejemplo, ácidos nucleicos bloqueados, 2'-desoxi-2'-fluorouridina, 2'-O-metil) y/o la base (por ejemplo, 2-fluoropirimidinas). A continuación, se resumen varios ejemplos de tales modificaciones químicas.
Se pueden adoptar modificaciones químicas en la posición 2' de la ribosa, tales como 2-O-metilpurinas y 2'-fluoropirimidinas, que aumentan la resistencia a la actividad endonucleasa en suero, para estabilizar las moléculas de ARN de la presente invención. La posición para la introducción de la modificación debe seleccionarse cuidadosamente para evitar reducir significativamente la potencia silenciadora de la molécula de ARN. Por ejemplo, las modificaciones en el extremo 5' de la cadena guía pueden reducir la actividad de silenciamiento. Por otro lado, las modificaciones de 2'-O-metilo se pueden escalonar entre las dos cadenas de ARN en la región bicatenaria para mejorar la estabilidad mientras se reserva la potencia de silenciamiento génico. Las modificaciones 2'-O-metilo también pueden eliminar o reducir la inducción de interferón.
Otra modificación estabilizante es el enlace fosforotioato (P=S). La introducción del enlace fosforotioato (P=S) en las moléculas de ARN, por ejemplo, en el saliente 3', puede proporcionar protección contra la exonucleasa.
La introducción de desoxirribonucleótidos en las moléculas de ARN también puede reducir el coste de fabricación y aumentar la estabilidad.
En una realización, el saliente 3' se estabiliza frente a degradación.
En una realización, la molécula de ARN contiene al menos un nucleótido modificado o su análogo. En una realización adicional, el ribonucleótido modificado se modifica en su azúcar, esqueleto principal, base o cualquier combinación de los tres.
En una realización, el análogo de nucleótido es un ribonucleótido con azúcar modificado. En una realización adicional, el grupo 2'-OH del análogo de nucleótido se reemplaza por un grupo seleccionado de H, OR, R, halo, SH, SR, NH2, NHR, NR2 o CN, en donde cada R es independientemente alquilo, alquenilo o alquinilo C1-C6, y halo es F, Cl, Br o I.
En una realización alternativa, el análogo de nucleótido es un ribonucleótido con esqueleto principal modificado que contiene un grupo fosfotioato.
En una realización, la molécula dúplex de ARN contiene al menos un desoxinucleótido. En una realización adicional, la primera cadena comprende de 1-6 desoxinucleótidos. En aún otra realización adicional, la primera cadena comprende 1-3 desoxinucleótidos. En otra realización, el saliente 3' comprende 1-3 desoxinucleótidos. En una realización alternativa, la segunda cadena comprende de 1-5 desoxinucleótidos.
En una realización, la molécula dúplex de ARN comprende un saliente 3' que contiene al menos un desoxinucleótido. En otra realización, el ARN el saliente 3' consiste en desoxinucleótidos.
En una realización, la molécula dúplex de ARN se conjuga con una entidad. En una realización adicional, la entidad se selecciona del grupo que consiste en péptido, anticuerpo, polímero, lípido, oligonucleótido y aptámero.
En otra realización, la primera cadena y la segunda cadena están unidas por un enlazador químico.
4.4. Administración in vivo de las moléculas de ARN
Un obstáculo importante para el uso terapéutico de ARNi es la administración de ARNsi a la célula diana (Zamore and Aronin, 2003). Se han desarrollado diversas metodologías para la administración de moléculas de ARN, especialmente moléculas de ARNsi (de Fougerolles et al., 2007; Dykxhoorn et al., 2003; Kim and Rossi, 2007). Puede usarse cualquier metodología de administración conocido por una persona experimentada en la técnica para la administración de las moléculas de ARN de la presente invención.
Los problemas principales en la administración incluyen inestabilidad en suero, distribución no específica, barreras tisulares y respuesta de interferón no específica (Lu & Woodle, Methods in Mol Biology 437:93-107 (2008)). En comparación con sus homólogos de ARNsi y ARNmi, las moléculas de ARNai poseen varias ventajas que deberían hacer que haya una gama más amplia de métodos disponibles para fines de administración. En primer lugar, los ARNai se pueden diseñar para que sean más pequeños que sus homólogos ARNsi y ARNmi, por lo tanto, se reduce o elimina cualquier respuesta al interferón. En segundo lugar, los ARNai son más potentes, de inicio más rápido, más eficaces y duran más, por lo tanto, se requiere menos cantidad/dosificación de ARNai para lograr un objetivo terapéutico. En tercer lugar, los ARNai son bicatenarios y más estables que los oligos antisentido monocatenarios y ARNmi, y pueden modificarse químicamente para potenciar la estabilidad. Por lo tanto, las moléculas de ARN de la invención se pueden administrar a un sujeto a través de una variedad de rutas de administración sistémicas o locales. En algunas realizaciones, las moléculas de la invención se administran a través de rutas de administración sistémica que incluyen intravenosa (I.V.) e intraperitoneal (ip). En otras realizaciones, las moléculas de la invención se administran a través de rutas de administración locales, por ejemplo, intranasal, intravítreo, intratraqueal, intracerebral, intramuscular, intraarticular e intratumoral.
Ejemplos de tecnologías de administración incluyen inyección directa de moléculas de ARN desnudas, conjugación de moléculas de ARN con un ligando natural como colesterol o un aptámero, administración formulada en liposomas y enlazado no covalente a proteínas de fusión anticuerpo-protamina. Otras opciones de portadores incluyen portadores con carga positiva (por ejemplo, lípidos y polímeros catiónicos) y diversos portadores de proteínas. En una realización, la administración de las moléculas de la invención usa un sistema de administración direccionado a ligando con base en el complejo de liposomas catiónicos o en sistemas de complejos poliméricos (Woodle, et al. J Control Release 74:309-311; Song, et al. Nat Biotechnol. 23(6):709-717 (2005); Morrissey y col. Nat Biotechnol. 23(8):1002-1007 (2005)).
En una realización, las moléculas de la invención se formulan con un portador de colágeno, por ejemplo, atelocolágeno, para administración in vivo. Se ha informado que el atelocolágeno protege el ARNsi de ser digerido por la RNasa y permite una liberación sostenida (Minakuchi, et al. Nucleic Acids Res. 32: e109 (2004); Takei et al. Cancer Res.
64:3365-3370 (2004)). En otra realización, las moléculas de la invención se formulan con nanopartículas o forman una nanoemulsión, por ejemplo, nanopartículas direccionadas al ligando peptídico de RGD. Se ha demostrado que se pueden combinar diferentes oligos de ARNsi en la misma nanopartícula direccionada al ligando RGD para tener como diana a varios genes al mismo tiempo (Woodle et al. Materials Today 8 (supl. 1): 34-41 (2005)).
También se pueden usar vectores virales para la administración de las moléculas de ARN de la presente invención. Alternativamente, se usan vectores lentivirales para administrar los transgenes de la molécula de ARN que se integran en el genoma para una expresión estable. Alternativamente, se usan virus adenovirales y adenoasociados (AAV) para administrar los transgenes de la molécula de ARN que no se integran en el genoma y tienen expresión episomal.
Además, se pueden usar bacterias para la administración de moléculas de ARN de la presente invención (Xiang et al., 2006).
5. Las composiciones y formulaciones farmacéuticas
La presente invención proporciona además una composición farmacéutica. El producto farmacéutico comprende como agente activo al menos una molécula dúplex de ARN asimétrico de la invención y uno o más portadores seleccionados del grupo que consiste en un portador farmacéutico, un portador de carga positiva, un liposoma, un portador proteico, un polímero, una nanopartícula, una nanoemulsión, un lípido y un lipoide. En una realización, la composición es para aplicaciones de diagnóstico o para aplicaciones terapéuticas.
Las composiciones y formulaciones farmacéuticas de la presente invención pueden ser iguales o similares a las composiciones y formulaciones farmacéuticas desarrolladas para ARNsi, ARNmi y ARN antisentido (de Fougerolles et al., 2007; Kim and Rossi, 2007), excepto para el ingrediente de ARN. El ARNsi, ARNmi y ARN antisentido en las composiciones y formulaciones farmacéuticas se pueden reemplazar por las moléculas dúplex de ARN de la presente información. Las composiciones y formulaciones farmacéuticas también se pueden modificar adicionalmente para acomodar las moléculas dúplex de ARN de la presente invención.
Una "sal farmacéuticamente aceptable" o "sal" de la molécula dúplex de ARN divulgada es un producto de la molécula dúplex de ARN divulgada que contiene un enlace iónico, y se produce típicamente haciendo reaccionar la molécula dúplex de ARN divulgada con un ácido o una base, adecuada para administrar a un sujeto. La sal farmacéuticamente aceptable puede incluir, pero sin limitación, sales de adición de ácido que incluyen hidrocloruros, hidrobromuros, fosfatos, sulfatos, hidrogenosulfatos, alquilsulfonatos, arilsulfonatos, acetatos, benzoatos, citratos, maleatos, fumaratos, succinatos, lactatos y tartratos; cationes de metales alcalinos como Na, K, Li, sales de metales alcalinotérreos como Mg o Ca, o sales de amina orgánica.
Una "composición farmacéutica" es una formulación que contiene las moléculas dúplex de ARN divulgadas en una forma adecuada para la administración a un sujeto. En una realización, la composición farmacéutica está a granel o en forma de dosificación unitaria. La forma de dosificación unitaria es cualquiera de una variedad de formas, que incluyen, por ejemplo, una cápsula, una bolsa intravenosa, un comprimido, una sola bomba en un inhalador de aerosol o un vial. La cantidad de ingrediente activo (por ejemplo, una formulación de la molécula dúplex de ARN divulgada o sus sales) en una dosis unitaria de composición es una cantidad eficaz y varía de acuerdo con el tratamiento particular involucrado. Una persona experimentada en la técnica apreciará que a veces es necesario realizar variaciones rutinarias de la dosificación dependiendo de la edad y el estado del paciente. La dosificación también dependerá de la vía de administración. Se contempla una variedad de vías, que incluyen oral, pulmonar, rectal, parenteral, transdérmica, subcutánea, intravenosa, intramuscular, intraperitoneal, intranasal y similares. Las formas de dosificación para la administración tópica o transdérmica de una molécula dúplex de ARN de esta invención incluyen polvos, aspersores, ungüentos, pastas, cremas, lociones, geles, soluciones, parches e inhalantes. En una realización, la molécula dúplex de ARN activa se mezcla bajo condiciones estériles con un portador farmacéuticamente aceptable y con cualquier conservante, regulador o propulsor que se requiera.
La presente divulgación proporciona un método de tratamiento que comprende administrar una cantidad eficaz de la composición farmacéutica a un sujeto que lo necesite. En una realización, la composición farmacéutica se administra mediante una vía seleccionada del grupo que consiste en iv, sc, tópica, po e ip. En otra realización, la cantidad eficaz es de 1 ng a 1 g por día, de 100 ng a 1 g por día o de 1 |jg a 1 mg por día.
La presente invención también proporciona formulaciones farmacéuticas que comprenden una molécula dúplex de ARN de la presente invención en combinación con al menos un excipiente o portador farmacéuticamente aceptable. Como se usa aquí, "excipiente farmacéuticamente aceptable" o "portador farmacéuticamente aceptable" pretende incluir cualesquiera y todos los disolventes, medios de dispersión, recubrimientos, agentes antibacterianos y antifúngicos, agentes isotónicos y retardadores de absorción y similares, compatibles con la administración farmacéutica. Los portadores adecuados se describen en "Remington: The Science and Practice of Pharmacy, Twentieth Edition," Lippincott Williams & Wilkins, Philadelphia, PA. Ejemplos de dichos portadores o diluyentes incluyen, pero no se limitan a, agua, solución salina, soluciones de Ringer, solución de dextrosa y albúmina de suero humano al 5 %. También se pueden usar liposomas y vehículos no acuosos tales como aceites fijos. El uso de tales medios y agentes para sustancias farmacéuticamente activas es bien conocido en la técnica. Excepto en la medida en que cualquier medio o agente convencional sea incompatible con la molécula dúplex de ARN activa, se contempla su uso en las composiciones. También se pueden incorporar a las composiciones moléculas dúplex de ARN activas suplementarias.
Los métodos para la formulación se divulgan en la Solicitud Internacional PCT PCT/US02/24262 (WO03/011224), la Publicación de la Solicitud de Patente de los Estados Unidos No. 2003/0091639 y la Publicación de la Solicitud de Patente de los Estados Unidos No. 2004/0071775.
Se administra una molécula dúplex de ARN de la presente invención en una forma de dosificación adecuada preparada combinando una cantidad terapéuticamente eficaz (por ejemplo, un nivel eficaz suficiente para lograr el efecto terapéutico deseado mediante la inhibición del crecimiento tumoral, destrucción de las células tumorales, tratamiento o prevención de trastornos proliferativos celulares, etc.) de una molécula dúplex de ARN de la presente invención (como un ingrediente activo) con portadores o diluyentes farmacéuticos estándar de acuerdo con procedimientos convencionales (es decir, produciendo una composición farmacéutica de la invención). Estos procedimientos pueden implicar mezclar, granular y comprimir o disolver los ingredientes según sea apropiado para lograr la preparación deseada. En otra realización, se administra una cantidad terapéuticamente eficaz de una molécula dúplex de ARN de la presente invención en una forma de dosificación adecuada sin portadores o diluyentes farmacéuticos estándar.
Los portadores farmacéuticamente aceptables incluyen portadores sólidos tales como lactosa, terra alba, sacarosa, talco, gelatina, agar, pectina, goma arábiga, estearato de magnesio, ácido esteárico y similares. Los portadores líquidos de ejemplo incluyen jarabe, aceite de cacahuete, aceite de oliva, agua y similares. De manera similar, el portador o diluyente puede incluir material retardador conocido en la técnica, tal como monoestearato de glicerilo o diestearato de glicerilo, solo o con una cera, etilcelulosa, hidroxipropilmetilcelulosa, metacrilato de metilo o similares. También pueden incluirse en una composición farmacéutica de acuerdo con esta invención otros agentes de relleno, excipientes, aromatizantes y otros aditivos como los conocidos en la técnica.
Las composiciones farmacéuticas que contienen moléculas dúplex de ARN activas de la presente invención se pueden fabricar de una manera generalmente conocida, por ejemplo, mediante mezcla, disolución, granulación, preparación de grageas, levigación, emulsificación, encapsulación, atrapamiento o procesos de liofilización. Las composiciones farmacéuticas pueden formularse de manera convencional usando uno o más portadores fisiológicamente aceptables que comprenden excipientes y/o auxiliares que facilitan el procesamiento de las moléculas dúplex de ARN activas en preparaciones que pueden usarse farmacéuticamente. Por supuesto, la formulación apropiada depende de la vía de administración elegida.
Una molécula dúplex de ARN o una composición farmacéutica de la invención se puede administrar a un sujeto en muchos de los métodos bien conocidos que se usan actualmente para tratamiento quimioterapéutico. Por ejemplo, para el tratamiento contra cánceres, una molécula dúplex de ARN de la invención puede inyectarse directamente en tumores, inyectarse en el torrente sanguíneo o en cavidades corporales o tomarse oralmente o aplicarse a través de la piel con parches. Para el tratamiento de afecciones psoriásicas, la administración sistémica (por ejemplo, administración oral) o administración tópica a las áreas afectadas de la piel, son las vías de administración preferidas. La dosis elegida debe ser suficiente para constituir un tratamiento eficaz, pero no tan alta como para causar efectos secundarios inaceptables. El estado de la enfermedad (por ejemplo, cáncer, psoriasis y similares) y la salud del paciente deben monitorizarse cuidadosamente durante y por un período razonable después del tratamiento.
Ejemplos
A continuación, se proporcionan ejemplos para ilustrar adicionalmente las diferentes características de la presente invención. Los ejemplos también ilustran una metodología útil para poner en práctica la invención. Estos ejemplos no limitan la invención reivindicada.
La interferencia de ARN (ARNi) es un mecanismo catalítico de silenciamiento génico específico en organismos eucariotas con profundas implicaciones para biología y medicina (Fire et al., 1998),12. El a Rní está mediado por el complejo de silenciamiento inducido por ARN (RISC) (Hammond et al., 2000; Martinez y Tuschl, 2004; Rana, 2007) al incorporarse con pequeños ARN interferentes (ARNsi) de 19-21 pares de bases (bp) con salientes 3', el dúplex de ARN más pequeño que se sabe que ingresa a RISC y media el ARNi (Elbashir et al., 2001a; Elbashir et al., 2001b; Elbashir et al., 2001c; Fire et al., 1998; Zamore et al., 2000). Como el sustrato natural del complejo enzimático RISC, el ARNsi puede sintetizarse químicamente o generarse mediante el procesamiento catalizado por Dicer de sus diversos precursores (Donze y Picard, 2002; Hammond et al., 2000; Kim et al., 2005; Paddison et al., 2002). Si bien se utiliza ampliamente para el silenciamiento génico, el ARNsi tiene una eficacia limitada en el silenciamiento génico con baja eficacia de silenciamiento para numerosos genes en células de mamíferos (de Fougerolles et al., 2007; Iorns et al., 2007). Aquí investigamos los requisitos de armazón estructural para un mediador de ARNi eficiente en células de mamíferos. Para nuestra sorpresa, encontramos que los dúplex de ARN asimétricos de 14-15 bp con salientes antisentido dobles median el silenciamiento génico de manera potente y eficaz en células de mamíferos. El ARN interferente asimétrico (ARNai), caracterizado estructuralmente por dúplex de ARN de 14-15 bp con salientes antisentido 3' y 5', se incorporó en RISC con mayor eficacia que ARNsi. El ARNai provocó la escisión específica de secuencia del ARNm y el silenciamiento génico direccionado en células de mamíferos. Cuando se direccionó a la secuencia idéntica de ARNm de p-catenina, el ARNai fue más eficaz (cerca del 100 %), potente (picoM), de inicio rápido (menos de 24 horas) y duradero (hasta 1 semana) que el ARNsi en el gen mediador silenciamiento in vitro. Estos resultados sugieren a ARNai como el armazón de Dúplex de ARN más pequeño incorporado en RISC y mediadores de ARNi de tipo no ARNsi que silencian genes con mejor eficiencia que ARNsi en células de mamíferos. Por lo tanto, ARNai puede tener un potencial significativo para amplia aplicación de ARNi.
Métodos y materiales
Cultivo celular y reactivos
Se obtuvieron células Hela, SW480, DLD1, HT29 y H1299 de ATCC y se cultivaron en medio de Eagle modificado de Dulbecco (DMEM) que contenía suero bovino fetal al 10 % (FBS), 100 unidades/ml de penicilina, 100 |jg/ml de estreptomicina y L-glutamina 2 mM (Invitrogen). Se obtuvieron células mononucleares de sangre periférica (PBMC) frescas de AllCells LLC y se mantuvieron en medio RPMI-1640 que contenía FBS al 10 % y pen/estrep (Invitrogen). Los ARN pequeños descritos en este estudio fueron sintetizados por Dharmacon, Qiagen o tecnologías de ADN integrado (Tabla 2) y recocidos siguiendo las instrucciones del fabricante (Figura 3a). Se utilizaron ARNsi direccionados a Ago2 humano y Dicer (Ambion) a 100 nM. Las transfecciones de los ARN se realizaron utilizando DharmaFECT1 (Dharmacon) a las concentraciones indicadas. El vector de expresión humano Argonaute2 (Ago2) (OriGene) se transfectó usando Lipofectamine 2000 (Invitrogen). La estabilidad en suero se determinó mediante la incubación de dúplex de ARNai o ARNsi con suero humano al 10 % (Sigma) durante la cantidad de tiempo indicado seguido de electroforesis en gel de acrilamida con TBE no desnaturalizante y tinción con bromuro de etidio.
Análisis de inmunoprecipitación Northern.
Para determinar los niveles de p-catenina, se extrajo el ARN total con TRIZOL (Invitrogen) a partir de células Hela transfectadas con ARNsi o ARNai en diversos puntos de tiempo. Se cargaron 20 |jg de ARN celular total en cada carril de un gel de agarosa desnaturalizante. Después de la electroforesis, el ARN se transfirió a una membrana de nailon Hybond-XL (Amersham Biosciences), se entrecruzó con UV y se horneó a 80 ° C durante 30 minutos. Las sondas que detectan el ARNm de p-catenina y actina se prepararon usando el kit de marcado con cebador aleatorio Prime-It II (Stratagene) a partir del fragmento de ADNc de p-catenina (1-568 nt) y el fragmento de ADNc de actina (1-500 nt). Para analizar la carga de RISC de ARN pequeño, se transfectaron ARNsi o ARNai en células Hela 48 horas después de la transfección con pCMV-Ago2. Las células se lisaron en los puntos de tiempo indicados y se inmunoprecipitaron con anticuerpo Ago2. Se lavaron los inmunoprecipitados, se aisló el ARN del complejo mediante extracción con TRIZOL y se cargaron en un gel TBE-Urea PAGe al 15 % (Bio-Rad). Después de la electroforesis, el ARN se transfirió a una membrana de nailon Hybond-XL. Se utilizó el kit de sonda de ARNmi mirVana (Ambion) para generar sondas de ARN marcadas con 5' 32P. Sonda antisentido (5'-GUAGCUGAUAUUGAUGGACUU-3'). Sonda en sentido (5'-UCCAUCAAUAUCAGC-3')
Carga in vitro Ago2-RISC.
Las cadenas en sentido y antisentido de ARNai o ARNsi se marcaron en el extremo 32P usando quinasa T4 (Promega). Los ARN marcados en los extremos se purificaron con fenol/cloroformo/alcohol isoamílico, se precipitaron con EtOH y se resuspendieron en agua. A continuación, los ARN marcados se hibridaron con cadenas antisentido de ARNsi o ARNai como se describe. Para los lisados in vitro, las células Hela se transfectaron durante 24 horas con el vector de expresión Ago2 humano y los lisados S10 se generaron esencialmente como se describe (Dignam et al., 1983). A continuación, se añadió ARNai o ARNsi dúplex marcado con cadena 5' en sentido o cadena antisentido al lisado de Ago2-S10. Después de una incubación de 5 minutos a 37 ° C, se inmunoprecipitó Ago2 como se describe, y fracciones asociadas a Ago2 (sedimento) y no asociadas a Ago2 (sobrenadante) se separaron en un gel de acrilamida con TBE al 20 % y el gel se expuso a una película para detectar asociación de cadena en sentido-Ago2. Para los experimentos de competencia de ARNai y ARNsi, se utilizaron hasta 100 veces ARNai y ARNsi fríos para competir con ARNai o ARNsi marcado con 32P para cargar en RISC. Brevemente, se generaron lisados de S10 a partir de células Hela transfectadas con el vector de expresión Ago2 como se describe. A continuación, se añadió ARNai o ARNsi marcado a los lisados de S10, seguido inmediatamente por la adición de ARNai o ARNsi sin marcar. La reacción se incubó durante 5 minutos a 37 ° C y se procesó como se describe anteriormente.
qRT-PCR.
Las células transfectadas con el ARNai o ARNsi indicado se cosecharon en los puntos de tiempo indicados después de la transfección. El ARN se aisló con TRIZOL y la qRT-PCR se realizó utilizando reactivos de RT-PCR de una etapa de TaqMan y conjuntos de sondas de cebadores para el ARNm indicado (Applied Biosystems). Los datos se presentan en relación con las células transfectadas de control y cada muestra se normaliza a los niveles de ARNm de actina. Para el experimento de la Figura 14d, se crearon constructos de Stat3 clonando ADNc de Stat3 (Origene) en ADNpc3.1 o ADNpc3.1 en los sitios HindIII-Xho1. Los vectores de expresión directa o inversa de Stat3 se cotransfectaron luego en células Hela con aiStat3 o siStat3 durante 24 horas. A continuación, se cosecharon las células, se aisló el ARN mediante TRIZOL y se realizó qRT-PCR utilizando reactivos de RT-PCR de una etapa TaqMan y conjuntos de sondas de cebador para Stat3 o actina (Applied Biosystems). La RT-PCR se realizó en las mismas muestras de ARN utilizando el kit Superscript One-Step RT-PCR (Invitrogen) y cebadores Stat3 directo (5'-GGATCTAGAATCAGCTACAGCAGC-3') y Stat3 inverso (5'-TCCTCTAGAGGGCAATCTCCATTG-3') y cebadores actina directa (5'-CCATGGATGATGATATCGCC-3') y actina inverso (5'-TAGAAGCATTTGCGGTGGAC-3').
RT-PCR.
El ARN total se preparó usando TRIZOL y el ADNc se sintetizó usando cebadores aleatorios con Thermoscript RT-PCR System (Invitrogen). La PCR se ejecutó durante 20 ciclos usando polimerasa Pfx. Cebadores: ACTINA-1, 5' CCATGGATGATGATATCGCC-3'; ACTINA-2, 5'-T AGAAGCATTT GCGGT GGAC-3'; p-catenina-1, 5'-GACAATGGCTACTCAAGCTG-3'; p-catenina-2, 5'-CAGGTCAGTATCAAACCAGG-3'.
Inmunoprecipitación Western.
Las células se lavaron dos veces con solución salina regulada con fosfato enfriada con hielo y se lisaron en regulador de lisis (HEPES 50 mM, pH 7.5, Nonidet P-40 al 0.5 %, NaCl 150 mM, EDTA 1 mM, EGTA 1 mM, ortovanadato de sodio 1 mM, ditiotreitol 1 mM, NaF 1 mM, fluoruro de fenilmetilsulfonilo 2 mM y 10 jg/m l cada uno de pepstatina, leupeptina y aprotinina). Se separaron 20 jg de proteína soluble mediante SDS-PAGE y se transfirieron a membranas de PVDF. Anticuerpos primarios contra p-catenina, Nbs1, Survivina, p21, Rsk1, k-Ras, Stat3, PCNA, NQO1, Actina (Santa Cruz), EF2, p70S6K, mTOR, Pt En (Cell Signaling Technology), Ago2 (Wako), Dicer (Novus) y Parp1 (EMD Biosciences) se utilizaron en este estudio. Los complejos antígeno-anticuerpo se visualizaron mediante quimioluminiscencia potenciada (GE Biosciences).
Análisis 5'-RACE
El ARN total (5 |jg) de células Hela tratadas con ARNai no silenciador o ARNai se ligó al adaptador de ARN GeneRacer™ (Invitrogen, 5'-CGACUGGAGCACGAGGACACUGACAUGGACUGAAGGAGUAGAAA-3') sin ningún procesamiento previo. El ARN ligado se transcribió de forma inversa en ADNc usando un cebador aleatorio. Para detectar el producto de escisión, se realizó PCR utilizando cebadores complementarios al adaptador de ARN (Cebador anidado 5' GeneRacer™: 5'-GGACACTGACATGGACTGAAGGAGTA-3') y cebador específico de p-catenina (GSP: 5'-CGCATGATAGCGTGTCTGGAAGCTT-3'). Los fragmentos de amplificación se resolvieron en gel de agarosa al 1.4 % y se dimensionaron usando una escalera de ADN Plus de 1 kb (Invitrogen). El sitio de escisión específico se confirmó además mediante secuenciación de ADN.
Detección de respuesta al interferón.
Para el experimento de la Figura 15a, las PBMC se incubaron directamente con ARNsi o ARNai de p-catenina 100 nM. El ARN total se purificó a las 16 horas usando TRIZOL, y los niveles de expresión génica sensible al interferón se determinaron mediante RT-PCR como describe el fabricante (System Biosciences). Para el experimento de la Figura 15b, las células Hela se transfectaron de manera simulada o se transfectaron con 100 nM del ARNai o ARNsi indicado durante 24 horas. El ARN total se purificó usando TRIZOL y los niveles de expresión génica sensible al interferón se determinaron mediante RT-PCR. Para el análisis de micromatrices, las células Hela se transfectaron con ARNai o ARNsi 100 nM. El ARN total se purificó a las 24 horas usando TRIZOL, y el ARN se usó para la hibridación con el genoma humano U133 Plus 2.0 GeneChip (Affymetrix) de acuerdo con el protocolo del fabricante (ExpressionAnalysis, Inc.). Se utilizó como control ARN de células tratadas con DharmaFECT 1. Para calcular los valores de expresión de la transcripción, se usó Microarray Suite 5.0 con normalización de cuantiles, y en este estudio se usaron transcripciones con suficientes señales de hibridación para ser llamadas presentes (P).
Secuencias de ARNai y ARNsi
La secuencia y estructura de los dúplex de ARNai y ARNsi se enumeraron en la Tabla 2. La ubicación de la mutación puntual se enmarca en el ARNai de k-Ras.
Tabla 2
Figure imgf000025_0001
Figure imgf000026_0001
En evaluaciones de vida
También se llevaron a cabo exámenes diarios del estado de salud de cada animal. Los pesos corporales se controlaron cada tres días. Se suministró comida y agua diariamente de acuerdo con los procedimientos de cría de animales de la instalación. Se consideró tóxico el tratamiento que producía >20 % de letalidad o >20 % de pérdida de peso corporal neto. Los resultados se expresan como volumen tumoral medio (mm3) ± SE. Los valores de P <0.05 se consideran estadísticamente relevantes.
La cría de animales
Se aclimataron ratones inmunodeprimidos atímicos machos o hembras de 4-5 semanas (Charles River Laboratories, Wilmington, MA) a la instalación de alojamiento de animales durante al menos 1 semana antes del inicio del estudio. Todos los procedimientos experimentales utilizados fueron consistentes con las pautas descritas por la Sociedad de Psicología Americana y la Guía para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio y también fueron aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de Boston Biomedical Inc. Los animales se alojaron en grupos de cuatro en jaulas con lecho de virutas de madera en una habitación con temperatura controlada (68 ° F-72 ° F), luz (ciclo de luz-oscuridad de 12 horas) y humedad (45-55 %). A los animales se les permitió acceso libre al agua y la comida durante el experimento.
Ejemplo 1. El ARN de interferencia asimétrico (ARNai) provoca un silenciamiento específico de genes en células de mamíferos
El armazón estructural de ARNsi se considera la configuración esencial para incorporarse en RISC y ARNi mediador (Elbashir et al., 2001a; Elbashir et al., 2001b; Elbashir et al., 2001c; Rana, 2007; Zamore et al., 2000). Sin embargo, se sabe muy poco sobre los requisitos del armazón de dúplex de ARN para la incorporación de RISC y silenciamiento génico. Para investigar los requisitos del armazón estructural para un mediador de ARNi eficiente y sustrato RISC, primero determinamos si los dúplex de ARN más cortos que los ARNsi podrían mediar el silenciamiento génico. La longitud del ARN bicatenario (ds) es un determinante importante de su propensión a activar respuestas de interferón no específicas mediadas por la proteína quinasa R (PKR), aumento del coste de síntesis y desafíos de administración (Elbashir et al., 2001b; Sledz et al., 2003). Diseñamos una serie de ARNds cortos que van desde 12 a 21 bp con salientes 3' de 2 nucleótidos o extremos romos direccionados a diferentes genes de mamíferos. No se detectó silenciamiento génico después de que la longitud se redujo por debajo de 19 bp (datos no mostrados), lo cual es consistente con reportes previos en el lisado de células de Drosophila Melanogaster (Elbashir et al., 2001b) y la noción de que 19-21 bp es el dúplex de ARNsi más corto que media el ARNi (Elbashir et al., 2001a; Elbashir et al., 2001b; Elbashir et al., 2001c; Rana, 2007; Zamore et al., 2000).
A continuación, se probó si los dúplex de ARN del armazón no ARNsi con una configuración asimétrica de salientes pueden mediar en el silenciamiento génico. El dúplex de ARNsi contiene una cadena en sentido simétrica y una cadena antisentido. Si bien la estructura de ARNsi dúplex que contiene un saliente 3' se requiere para la incorporación en el complejo RISC, después de la escisión de la cadena en sentido mediada por Argonaute (Ago), la cadena antisentido dirige la escisión del ARNm diana (Hammond et al., 2001; Matranga et al., 2005; Tabara et al., 1999). Buscamos hacer dúplex de ARN asimétricos de diversas longitudes con salientes en los extremos 3' y 5' de la cadena antisentido.
Los oligonucleótidos con secuencias mostradas en la Tabla 3 se confirmaron mediante gel de poliacrilamida al 20 % después de la hibridarción. Como se muestra en la figura 3A, cada carril se cargó de la siguiente manera: carril 1, 21 nt/21 nt; carril 2, 12nt(a)/21nt; carril 3, 12nt(b)/21nt; carril 4, 13nt/13nt; carril 5, 13nt/21nt; carril 6, 14nt/14nt; carril 7, 14nt(a)/21 nt; carril 8, 14nt(b)/21nt; carril 9, 15nt/15nt; carril 10, 15nt/21nt.
Tabla 3
Figure imgf000027_0001
Las células HeLa se sembraron en placa a 200,000 células/pozo en una placa de cultivo de 6 pozos. Como se muestra en la figura 3B, 24 horas más tarde se transfectaron con ARNsi codificado (carril 1), E2F1 direccionado a ARNsi de 21 bp (carril 2, como control de especificidad) o beta-catenina direccionada a ARNsi de 21 bp (carril 3, como control positivo), o una mezcla de la misma concentración de ARNai de diferente longitud: 12nt(a)/21nt (carril 4); 12nt(b)/21nt (carril 5); 13nt/21 nt (carril 6); 14nt(a)/21nt (carril 7); 14nt(b)/21nt (carril 8); 15nt/21 nt (carril 9). Las células se cosecharon 48 horas después de la transfección. La expresión de p-cotenina se determinó mediante inmunoprecipitación Western. E2F1 y actina se utilizaron como controles. Los resultados demuestran que el ARN de interferencia asimétrico (ARNai) provoca un silenciamiento génico específico en células de mamíferos.
Para determinar las características estructurales de ARNai importantes en la función de ARNai, generamos múltiples oligonucleótidos de ARNai con base en la modificación de la estructura del saliente antisentido dual del núcleo 15/21 (Tabla 4). Los ARNai, resumidos en la Tabla 4, contenían modificaciones que incluían, pero no se limitaban a, longitud de las cadenas en sentido y antisentido, el grado de salientes en sentido y antisentido, y oligonucleótidos híbridos ARN-ADN.
La modificación de la estructura del ARNai 15/21 parental se realizó alterando la cadena en sentido, cadena antisentido o ambas (Tabla 4). Se transfectaron dúplex de ARNai modificados en células Hela a 50 nM durante 48 horas. Se utilizaron inmunoprecipitaciones Western para p-catenina y actina para examinar el grado de silenciamiento génico en comparación con el ARNai 15/21 parental y con la estructura del ARNsi tradicional. También se probaron modificaciones de ARNai que contenían salientes de cadena dual en sentido. Estos oligonucleótidos contienen una cadena en sentido de 21 bases emparejada con cadenas antisentido de diferente longitud. Además, también examinamos la actividad de oligonucleótidos de ARNai que se han modificado con bases de ADN. Se realizaron sustituciones de ADN tanto en la cadena antisentido como en sentido (Tabla 3). Los oligonucleótidos híbridos ARN-ADN probados contenían 1 o más sustituciones de ADN en la cadena en sentido o antisentido, o contenían ARN antisentido de 21 bases emparejado con la longitud indicada de la cadena en sentido de ADN. Los resultados del silenciamiento génico de estos diversos ARNai se muestran en las Figuras 4 y 5.
Tomados en conjunto, estos datos proporcionan pistas estructurales para la función del ARNai.
Con respecto a la cadena en sentido, estos datos indican que la longitud de 15 bases funciona bien, mientras que las longitudes entre 14 y 19 bases siguen siendo funcionales. La cadena en sentido puede coincidir con cualquier parte de la cadena antisentido, siempre que se cumplan las reglas de saliente antisentido. Se tolera el reemplazo de una única base de ARN con ADN ya sea en el extremo 5' o en el 3' de la cadena en sentido y puede incluso proporcionar actividad aumentada.
Con respecto a la longitud de la cadena antisentido, la longitud de 21 bases funciona bien, 19-22 bases retienen la actividad y la actividad disminuye cuando la longitud cae por debajo de 19 bases o aumenta por encima de 22 bases. El extremo 3' de la cadena antisentido requiere un saliente de 1-5 bases, prefiriéndose un saliente de 2-3 bases, el extremo romo muestra una disminución en la actividad. Se prefiere el emparejamiento de bases con la secuencia de ARN diana, y se tolera el reemplazo de la base del ADN hasta 3 bases sin el reemplazo simultáneo de la base del ADN 5'. El extremo 5' de la cadena antisentido prefiere un saliente de base 0-4 y no requiere un saliente para permanecer activo. El extremo 5' de la cadena antisentido puede tolerar 2 bases que no coincidan con la secuencia de ARN diana y puede tolerar el reemplazo de la base del ADN hasta 3 bases sin el reemplazo concurrente de la base 3' del ADN.
Con respecto a las bases con error de emparejamiento o modificadas químicamente, encontramos que ambos errores de emparejamiento y una o más bases modificadas químicamente en la cadena en sentido o antisentido son tolerados por la estructura de ARNai.
Tabla 4: secuencias de ARNai utilizadas para las figuras 4-5
Figure imgf000028_0001
Figure imgf000029_0001
Figure imgf000030_0001
Figure imgf000031_0001
En la tabla 4, A, U, G, C representan nucleótidos, mientras que a, t, g, c representan desoxinucleótidos.
Ejemplo 2. Mecanismo de silenciamiento génico desencadenado por ARNai
Para investigar el mecanismo de bloqueado de genes inducido por ARNai, primero determinamos si el silenciamiento génico por ARNai ocurre a nivel de traducción o ARNm. El análisis de inmunoprecipitación Northern de p-catenina en células transfectadas con 10 nM del ARNai de 15 bp mostró que el ARNai redujo los niveles de ARNm en más del 95 % en 24 horas y la disminución duró más de 4 días (Figura 6a) lo que sugiere que el ARNai media el silenciamiento génico a nivel de ARNm. La reducción del ARNm de p-catenina inducida por ARNai fue sustancialmente más rápida, eficaz y duradera que por ARNsi (figura 6a). Además, determinamos si el ARNai de 15 bp catalizaba la escisión específica del sitio del ARNm de p-catenina. El ARN total aislado de células transfectadas con el ARNai de 15 pb se examinó mediante amplificación rápida de extremos de ADNc (5'-RACE) y PCR para detectar la presencia de fragmentos de escisión de ARNm de p-catenina (figura 6b). Detectamos fragmentos de escisión de p-catenina a las 4 y 8 horas después de la transfección de ARNai (figura 6c). El análisis de secuencia mostró que la escisión estaba teniendo lugar dentro de la secuencia diana de ARNai entre las bases 10 y 11 en relación con el extremo 5' de la cadena antisentido de ARNai (figura 6d). No se observaron tales fragmentos de escisión después de la transfección con un ARNai codificado (figura 6c). Estos resultados demuestran que el ARNai indujo un silenciamiento génico potente y eficaz a través de la escisión específica de secuencia del ARNm diana.
A continuación, se detgerminó si el nuevo armazón asimétrico de ARNai se puede incorporar en el RISC. El ARNi es catalizado por un complejo enzimático RISC con una proteína Argonaute (Ago) como unidad catalítica del complejo (Liu et al., 2004; Matranga et al., 2005). Para determinar si ARNai se incorpora en el complejo Ago/RIsC, inmunoprecipitamos Ago1 humano etiquetado con myc a partir de células que expresan Ago1 etiquetado con myc (Siolas et al., 2005) después de que las células se transfectaron con ARNai. Se detectaron pequeños ARN asociados con el complejo RISC mediante inmunoprecipitación Northern de inmunoprecipitados de Ago. El análisis de inmunoprecipitación Northern reveló que el ARNai entró en el complejo RISC con alta eficacia (figura 6e). Estos datos sugieren que el armazón asimétrico de aiRNA se puede incorporar de manera eficiente en RISC.
Dado que ARNai inducía un silenciamiento génico más eficaz que ARNsi, probamos si ARNai puede dar lugar al complejo RISC de forma más eficaz que ARNsi. Como se muestra en la figura 6e, los complejos ARNai-Ago2/RISC se formaron más rápido y más eficientemente que los complejos ARNsi-Ago2/RISC, con más ARNai contenido en el complejo RISC que el correspondiente ARNsi (figura 6c y figura 7A). Es de destacar que el ARNsi mostró un patrón típico (21) que es consistente con la formación de estructuras secundarias por ARNsi (figura 6e y figura 7). Por el contrario, ARNai mostró una sola banda, lo que sugiere que la longitud más corta de ARNai puede reducir o eliminar la formación de la estructura secundaria como ocurrió con ARNsi.
Además, la configuración asimétrica de ARNai puede facilitar la formación de RISC activo con cadena antisentido y reducir el RISC ineficaz formado con la cadena en sentido (Referencia 16). Nuestros datos demostraron que esto es cierto, como se muestra en la figura 7B, no se puede detectar ninguna cadena en sentido en el complejo RISC. La figura 8A también demuestra que mientras que la cadena antisentido del ARNai se asocia fuertemente con Ago 2, la cadena en sentido no lo hace. Por el contrario, tanto la cadena antisentido como la cadena en sentido del ARNsi se asocian con Ago 2. Estos datos sugieren que el ARNai tiene una mayor eficacia en la formación de RISC que el ARNsi en células, lo que puede ser la base de la superior eficacia de silenciamiento génico del ARNai.
Además, se ha demostrado que se requiere escindir la cadena en sentido del ARNsi para que sea funcional. Por lo tanto, probamos si el mismo requisito es cierto para el ARNai. Para hacer eso, el nucleótido en la posición 8 o 9 de la cadena en sentido de ARNai se modificó con 2'-O-metilo para hacerlo no escindible. Nuestros resultados muestran que los ARNai con la cadena en sentido que no se puede escindir siguen siendo funcionales (figura 8B), lo que demuestra que el ARNai es bastante diferente al ARNsi en términos de su mecanismo.
Además, se pregunta si hay algún bolsillo de carga diferente para ARNai y ARNsi. Usamos ARNai o ARNsi frío para competir con el ARNsi o ARNai marcado radiactivamente por el complejo RISC (figura 9). Sorprendentemente, los resultados muestran que el ARNai frío no compite con el ARNsi por el complejo RISC (figura 9B) y el ARNsi frío tampoco compite con el ARNai por el complejo RISC (figura 9C). Estos datos indican que ARNai y ARNsi pueden cargarse en diferentes bolsillos del complejo RISC.
En conjunto, los datos anteriores sugieren que ARNai representa el primer armazón no ARNsi que se incorpora en RISC, proporcionando un armazón estructural nuevo que interactúa con RISC. La diferencia de la carga RISC de ARNai y ARNsi se ilustra en nuestro modelo que se muestra en la figura 10. Brevemente, debido a la propiedad asimétrica, solo la cadena antisentido se selecciona para permanecer en el complejo RISC y da como resultado una eficiencia del 100 % en la selección de cadenas. Por el contrario, el ARNsi es estructuralmente simétrico. Tanto la cadena antisentido como la cadena en sentido del ARNsi tienen la posibilidad de ser seleccionadas para permanecer en el complejo RISC y, por lo tanto, el ARNsi tiene una selección de cadena ineficaz y al mismo tiempo puede causar un silenciamiento génico inespecífico debido al complejo RISC de la cadena en sentido.
Ejemplo 3. ARNai media un silenciamiento génico más rápido, potente, eficaz y duradero que ARNsi
Para comparar ARNai con ARNsi en las propiedades de silenciamiento génico, primero determinamos la estructura óptima de ARNai para el silenciamiento génico.
El dúplex de ARNsi contiene una cadena en sentido simétrica y una cadena antisentido. Si bien la estructura dúplex de ARNsi que contiene un saliente 3' es necesaria para la incorporación en el complejo RISC, después de la escisión de la cadena en sentido mediada por Argonaute (Ago), la cadena antisentido dirige la escisión del ARNm diana (Hammond et al., 2001; Matranga et al., 2005; Tabara et al., 1999). Buscamos hacer dúplex de ARN asimétricos de diversas longitudes con salientes en los extremos 3' y 5' de la cadena antisentido. Diseñamos un conjunto de tales dúplex de ARN asimétricos de 12 a 15 bp con salientes antisentido 3' y 5' para tener como diana a la p-catenina (figura 11A), un gen endógeno implicado en cáncer y células madre (Clevers, 2006). Se ha diseñado un ARNsi optimizado de la configuración estándar para tener como diana a la p-catenina para activar el ARNi (Xiang et al., 2006). Todos los ARNai contra p-catenina se diseñaron dentro de la misma secuencia direccionada por el ARNsi (figura 11A). Los resultados mostraron que el silenciamiento génico óptimo logrado fue con el ARNai de 15 bp (figura 11B). Por lo tanto, usamos ARNai de 15 bp para compararlo con el dúplex de ARNsi de 21-mer en los experimentos posteriores.
Para nuestra sorpresa, encontramos que el ARNai inducía una reducción potente y altamente eficaz de la proteína pcatenina mientras evitaba la actina de los genes de control no direccionados (figura 11C).
A continuación, examinamos el inicio del silenciamiento génico por ARNai y ARNsi que tienen como diana a la pcatenina. La secuencia del ARNai y ARNsi usados se muestra en la figura 11A. Como se muestra en la figura 12, ARNai tiene un inicio más rápido (figura 12C y D) y también una mejor eficacia (figura 12B y D).
También se compararon los efectos de silenciamiento génico de ARNai y ARNsi en diversas dianas y múltiples líneas celulares humanas. Los ARNai se diseñaron para tener como diana genes de diferentes categorías funcionales, incluidos Stat3 (figura 13b), NQO1 (figura 12d), factor de elongación 2 (EF2) (figura 13c), Nbs1 (figura 14b), Survivina (figura 14b), Parp1 (figura 14b), p21 (figura 14b), Rsk1 (figura 14c), PCNA (figura 14c), p70S6K (figura 14c), mTOR (figura 14c) y PTEN (figura 14c), además de p-catenina (figura 13a) en las mismas secuencias que han sido direccionadas con ARNsi con baja eficiencia (Rogoff et al., 2004). Como se muestra en las Figuras 13 y 14, el ARNai es más eficaz que el ARNsi para silenciar Stat3, p-catenina, Rsk1, p70S6K, Nbsl, mTOR y EF2, y es tan eficaz como ARNsi para silenciar NQO1, PCNA, Survivina, PTEN, Parp1 y p21. Dado que las secuencias diana se eligieron con base en la optimización para ARNsi, es posible que la eficacia y potencia del ARNai se pueda incrementar aún más direccionando sitios que están optimizados para ARNai. Además, nuestros datos también muestran que ARNai es más eficaz que ARNsi contra p-catenina en múltiples líneas celulares, incluyendo Hela (figura 13a), H1299 (figura 14a, panel izquierdo) y Dld1 (figura 14a, panel derecho).
Tomados en conjunto, estos datos demuestran que el ARNai es más eficaz, potente, de inicio rápido y duradero que el ARNsi en la mediación del silenciamiento génico en células de mamíferos.
Ejemplo 4. Especificidad del silenciamiento génico mediado por ARNai
A continuación, se investigó la especificidad del silenciamiento génico mediado por ARNai. Primero analizamos los ARNai que se tienen como diana al alelo k-Ras de tipo salvaje. Las células DLD1 contienen k-Ras de tipo salvaje, mientras que las células SW480 contienen k-Ras mutante que tiene una sustitución de un solo par de bases (figura 14d). La transfección de células DLD1 con ARNai direccionadas a k-Ras de tipo salvaje mostró un silenciamiento eficaz, pero no se observó silenciamiento de k-Ras mutante en las células SW480. Estos datos demuestran que el ARNai media en el silenciamiento génico específico de alelos.
La activación de una respuesta de tipo interferón es un mecanismo no específico principal de silenciamiento génico. Una razón principal por la que se utilizan ARNsi para el silenciamiento génico es que el ARNds de menos de 30 bp tiene una capacidad reducida para activar la respuesta tipo interferón en células de mamíferos (Bernstein et al., 2001; Martinez and Tuschl, 2004; Sledz et al., 2003). Probamos si el ARNai mostraba algún signo de activación de la respuesta tipo interferón en células de mamíferos. El ARN recolectado de células PBMC transfectadas con ARNai contra p-catenina y células Hela transfectadas con ARNai contra EF2 o Survivina se analizó mediante RT-PCR en busca de genes inducibles por interferón. Encontramos que la transfección de ARNai no mostró aumento por RT-PCR de ninguno de los genes inducibles por interferón probados, mientras que los niveles de ARNm diana se redujeron en relación con las células transfectadas de control (figura 15a y b). También se realizó un análisis de micromatrices para comparar los cambios en la expresión de genes relacionados con la respuesta de interferón conocidos inducidos por ARNai y ARNmi. Como se muestra en la figura 15c, se observaron muchos menos cambios para ARNai en comparación con ARNsi.
Además, como se mencionó anteriormente, el complejo RISC de cadena en sentido puede causar silenciamiento génico no específico. Para comparar ARNai y ARNsi en el silenciamiento génico no específico mediado por el complejo cadena en sentido-RISC, las células se cotransfectaron con ARNai o ARNsi y un plásmido que expresa Stat3 (ARN en sentido) o un plásmido que expresa Stat3 antisentido (ARN antisentido). Se cosecharon las células y se recolectó ARN 24 horas posttransfección y se determinaron los niveles relativos de ARN en sentido o antisentido de Stat3 mediante PCR cuantitativa en tiempo real o RT-PCR (insertos). Los resultados muestran que el ARNai no tiene ningún efecto sobre los ARNm de Stat3 antisentido, mientras que el ARNsi sí (figura 15d). Este resultado demuestra que el ARNai suprime por completo el silenciamiento génico no específico no deseado mediado por el complejo cadena en sentido-RISC.
En resumen, se ha demostrado que el ARNai es una nueva clase de inductores de silenciamiento génico, el tipo no ARNsi y el armazón estructural más pequeño para sustratos de RISC y mediadores de ARNi (figura 15f). Nuestros datos sugieren que el ARNai funciona a través de RISC, la maquinaria celular del ARNi. Después de la incorporación en RISC, ARNai media la escisión específica de secuencia del ARNm entre las bases 10 y 11 con respecto al extremo 5' de la cadena antisentido de ARNai. La configuración asimétrica de ARNai puede interactuar de manera más eficiente con RISC que ARNsi. De acuerdo con la alta eficiencia de enlace de RISC, ARNai es más potente, eficaz, de inicio rápido y duradero que ARNsi en la mediación del silenciamiento génico específico contra genes probados en nuestro estudio. Si bien estudios anteriores han propuesto un papel de Dicer para facilitar la formación eficiente de RISC, nuestros datos sugieren que el ARNai puede dar lugar a complejos RISC activos con alta eficiencia independientemente del procesamiento mediado por Dicer.
La característica clave de este nuevo armazón dúplex de ARN son los salientes antisentido en los extremos 3' y 5'. El ARNai de 12-15 bp es el dúplex de ARN más corto conocido por inducir ARNi. Mientras que los ARNds largos desencadenaron un potente silenciamiento génico en C. elegans y Drosophila Melanogaster, el silenciamiento génico específico en células de mamíferos no fue posible hasta que se utilizaron dúplex de ARNsi. El armazón de ARNsi, tal como lo define la digestión de Dicer, se caracteriza por una simetría en longitudes de cadena de 19-21 bp y salientes 3' (Bernstein et al., 2001), que se ha considerado la estructura esencial para incorporar en RISC para mediar ARNi. Por lo tanto, los esfuerzos de optimización para los inductores de ARNi se han centrado en los precursores de ARNsi, que son invariablemente más grandes que ARNsi (Soutschek et al., 2004; Zhang and Farwell, 2007). Nuestros datos sugieren que ARNsi no es el armazón esencial para incorporar en RISC para mediar ARNi. Los ARNai de diferentes longitudes mostraron un espectro de eficacia de silenciamiento génico y eficiencia de incorporación de RISC, ofreciendo una oportunidad única para comprender el mecanismo de incorporación y activación de RISC. Se necesita investigación para comprender mejor la relación entre estructura y actividad de los ARNai en la incorporación de RISC y la inducción de ARNi, lo que debería ayudar a establecer una base racional para optimizar los ARNai con respecto a la selección de secuencias diana, longitud, estructura, composición química y modificaciones para diversas aplicaciones de ARNi.
Ejemplo 5. El ARNai es más eficaz que el ARNsi in vivo
Para investigar si ARNai es eficaz in vivo y compararlo con ARNsi, probamos los efectos de ARNai y ARNsi en modelos de xenoinjerto de cáncer de colon humano.
El cáncer de colon humano es la segunda causa principal de muerte por cáncer en los Estados Unidos. La vía de señalización de la p-catenina Wnt está estrictamente regulada y tiene funciones importantes en el desarrollo, homeostasis tisular y regeneración. La desregulación de la señalización de Wnt/p-catenina se encuentra con frecuencia en diversos cánceres humanos. El ochenta por ciento de los cánceres colorrectales por sí solos revelan la activación de esta vía por inactivación del gen supresor de tumores poliposis coli adenomatosa o por mutación del protooncogén p-catenina.
Se ha encontrado que la activación de la señalización de Wnt/p-catenina es importante tanto para el inicio como para la progresión de cánceres de diferentes tejidos. Por lo tanto, la inhibición direccionada de la señalización de Wnt/pcatenina es una nueva metodología racional y prometedora para la terapia de cánceres de diversos orígenes.
In vitro, mediante el direccionamiento de ribozimas, hemos demostrado la reducción de la expresión de p-catenina en células SW480 de cáncer de colon humano y la inducción asociada de muerte celular, lo que indica que la expresión de p-catenina limita la rata del crecimiento tumoral in vitro.
Se inocularon células de cáncer de colon humano SW480 por vía subcutánea en ratones inmunodeprimidos atímicos hembra (8 x 106 células/ratón) y se dejó que formaran tumores palpables. En este estudio, la dosificación comenzó cuando los tumores alcanzaron aproximadamente 120 mm3. Los animales se trataron por vía intravenosa (iv) con 0.6 nmol de ARNsi de p-catenina formando complejo con PEI, ARNai de p-catenina formando complejo con PEI o un ARNsi no relacionado formando complejo con PEI como control negativo diariamente. Los animales recibieron un total de 10 dosis de ARNsi, ARNai o control. Los tumores se midieron durante todo el tratamiento. Como se muestra en la Figura 16, el tratamiento intravenoso con ARNsi y ARNai como una monoterapia a 0.6 nmol mg/kg inhibió significativamente el crecimiento tumoral. Se calculó que el valor % T/C de ARNsi era 48.8 % con un valor p de 0.0286. Sin embargo, el tratamiento con ARNai específicos de p-catenina dio como resultado una reducción mucho más potente del crecimiento tumoral. Se calculó que el valor de % T/C era del 9.9 % con un valor de p de 0.0024. No hubo un cambio significativo en el peso corporal debido a la administración iv del ARNsi, ARNai o control. Estos datos sugieren que la aplicación sistémica in vivo de ARNai a través de la formación de complejos de PEI tras tener como diana a la p-catenina ofrece una avenida para el desarrollo de agentes altamente eficientes, específicos y seguros para aplicaciones terapéuticas para pacientes con cáncer de colon.
Además, también se probaron los efectos de ARNai y ARNsi en el modelo de xenoinjerto de cáncer de colon humano HT29. Se inocularon células de cáncer de colon humano HT29 por vía subcutánea en ratones inmunodeprimidos atímicos hembra (6x106 células/ratón) y se dejó que formaran tumores palpables. En este estudio, la dosificación comenzó cuando los tumores alcanzaron aproximadamente 200 mm3 Los animales se trataron por vía intravenosa (iv) con 0.6 nmol de ARNsi de p-catenina formando complejos con PEI, ARNai de p-catenina formando complejos con PEI o un ARNsi no relacionado formando complejos con PEI como control negativo cada dos días. Los animales recibieron un total de 8 dosis de ARNsi, ARNai o control. Los tumores se midieron durante todo el tratamiento. Como se muestra en la figura 17, el tratamiento intravenoso con ARNsi y ARNai como una monoterapia a 0.6 nmol mg/kg inhibió significativamente el crecimiento tumoral. Se calculó que el valor de % T/C de ARNsi era del 78 % con un valor de p de 0.21. De nuevo, el tratamiento con los ARNai específicos de p-catenina dio como resultado una reducción aún más potente del crecimiento tumoral. Se calculó que el valor de % T/C era del 41 % con un valor de p de 0.016. No hubo un cambio significativo en el peso corporal debido a la administración iv del ARNsi, ARNai o control. Estos datos corroboran que la aplicación sistémica in vivo de ARNai a través de la formación de complejos de PEI tras el direccionamiento de la p-catenina ofrece una avenida para el desarrollo de agentes altamente eficientes, específicos y seguros para aplicaciones terapéuticas para pacientes con cáncer de colon.
Juntos, el ARNai puede mejorar significativamente las aplicaciones amplias de ARNi. Las terapias con base en ARNsi se han enfrentado a desafíos, incluida la eficacia limitada, dificultad de administración, respuestas tipo interferón y coste de fabricación (de Fougerolles et al., 2007; Iorns et al., 2007; Rana, 2007). La eficacia mejorada, potencia, durabilidad y tamaño más pequeño de los ARNai pueden ayudar o superar estos desafíos, ya que ARNai es más pequeño y puede necesitar menos material para su administración. Por lo tanto, ARNai representa dúplex de ARN nuevos y más pequeños que ingresan a RISC y media en el silenciamiento génico de mejor eficacia, potencia, inicio de acción y durabilidad que el ARNsi en células de mamíferos, lo que tiene un potencial significativo para aplicaciones amplias de ARNi en estudios de función génica y terapias con base en ARNi.
Otras realizaciones están dentro de las siguientes reivindicaciones. Aunque se han mostrado y descrito varias realizaciones, se pueden realizar diversas modificaciones.
Referencias
Bernstein, E., Caudy, A.A., Hammond, S.M., and Hannon, G.J. (2001). Role for a bidentate ribonuclease in the initiation step of RNA interference. Nature 409, 363-366.
Chiu, Y.L., and Rana, T.M. (2003). siRNA function in RNAi: a chemical modification analysis. RNA (New York, NY 9, 1034-1048.
Clevers, H. (2006). Wnt/beta-catenin signaling in development and disease. Cell 127, 469-480.
Czauderna, F., Fechtner, M., Dames, S., Aygun, H., Klippel, A., Pronk, G.J., Giese, K., and Kaufmann, J. (2003). Structural variations and stabilising modifications of synthetic siRNAs in mammalian cells. Nucleic acids research 31, 2705-2716.
Czech, M.P. (2006). MicroRNAs as therapeutic targets. The New England journal of medicine 354, 1194-1195. de Fougerolles, A., Vornlocher, H.P., Maraganore, J., and Lieberman, J. (2007). Interfering with disease: a progress report on siRNA-based therapeutics. Nat Rev Drug Discov 6, 443-453.
Dignam, J.D., Lebovitz, R.M., and Roeder, R.G. (1983). Accurate transcription initiation by RNA polymerase II in a soluble extract from isolated mammalian nuclei. Nucleic acids research 11, 1475-1489.
Donze, O., and Picard, D. (2002). RNA interference in mammalian cells using siRNAs synthesized with T7 RNA polymerase. Nucleic Acids Res 30, e46.
Dykxhoorn, D.M., Novina, C.D., and Sharp, P.A. (2003). Killing the messenger: short RNAs that silence gene expression. Nat Rev Mol Cell Biol 4, 457-467.
Elbashir, S.M., Harborth, J., Lendeckel, W., Yalcin, A., Weber, K., and Tuschl, T. (2001a). Duplexes of 21-nucleotide RNAs mediate RNA interference in cultured mammalian cells. Nature 411, 494-498.
Elbashir, S.M., Lendeckel, W., and Tuschl, T. (2001b). RNA interference is mediated by 21- and 22-nucleotide RNAs. Genes Dev 15, 188-200.
Elbashir, S.M., Martinez, J., Patkaniowska, A., Lendeckel, W., and Tuschl, T. (2001c). Functional anatomy of siRNAs for mediating efficient RNAi in Drosophila melanogaster embryo lysate. Embo J 20, 6877-6888.
Eulalio, A., Huntzinger, E., and Izaurralde, E. (2008). Getting to the root of miRNA-mediated gene silencing. Cell 132, 9-14.
Fire, A., Xu, S., Montgomery, M.K., Kostas, S.A., Driver, S.E., and Mello, C.C. (1998). Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans. Nature 391, 806-811.
Hammond, S.M., Bernstein, E., Beach, D., and Hannon, G.J. (2000). An RNA-directed nuclease mediates posttranscriptional gene silencing in Drosophila cells. Nature 404, 293-296.
Hammond, S.M., Boettcher, S., Caudy, A.A., Kobayashi, R., and Hannon, G.J. (2001). Argonaute2, a link between genetic and biochemical analyses of RNAi. Science 293, 1146-1150.
Iorns, E., Lord, C.J., Turner, N., and Ashworth, A. (2007). Utilizing RNA interference to enhance cancer drug discovery. Nature reviews 6, 556-568.
Kim, D.H., Behlke, M.A., Rose, S.D., Chang, M.S., Choi, S., and Rossi, J.J. (2005). Synthetic dsRNA Dicer substrates enhance RNAi potency and efficacy. Nat Biotechnol 23, 222-226.
Kim, D.H., and Rossi, J.J. (2007). Strategies for silencing human disease using RNA interference. Nature reviews 8, 173-184.
Liu, J., Carmell, M.A., Rivas, F.V., Marsden, C.G., Thomson, J.M., Song, J.J., Hammond, S.M., Joshua-Tor, L., and Hannon, G.J. (2004). Argonaute2 is the catalytic engine of mammalian RNAi. Science 305, 1437-1441.
Mack, G.S. (2007). MicroRNA gets down to business. Nature biotechnology 25, 631-638.
Martinez, J., and Tuschl, T. (2004). RISC is a 5' phosphomonoester-producing RNA endonuclease. Genes Dev 18, 975-980.
Matranga, C., Tomari, Y., Shin, C., Bartel, D.P., and Zamore, P.D. (2005). Passenger-strand cleavage facilitates assembly of siRNA into Ago2-containing RNAi enzyme complexes. Cell 123, 607-620.
Paddison, P.J., Caudy, A.A., Bernstein, E., Hannon, G.J., and Conklin, D.S. (2002). Short hairpin RNAs (shRNAs) induce sequence-specific silencing in mammalian cells. Genes Dev 16, 948-958.
Patzel, V. (2007). In silico selection of active siRNA. Drug discovery today 12, 139-148.
Rana, T.M. (2007). Illuminating the silence: understanding the structure and function of small RNAs. Nat Rev Mol Cell Biol 8, 23-36.
Rogoff, H.A., Pickering, M.T., Frame, F.M., Debatis, M.E., Sanchez, Y., Jones, S., and Kowalik, T.F. (2004). Apoptosis associated with deregulated E2F activity is dependent on E2F1 and Atm/Nbsl/Chk2. Mol Cell Biol 24, 2968-2977. Siolas, D., Lerner, C., Burchard, J., Ge, W., Linsley, P.S., Paddison, P.J., Hannon, G.J., and Cleary, M.A. (2005). Synthetic shRNAs as potent RNAi triggers. Nat Biotechnol 23, 227-231.
Sledz, C.A., Holko, M., de Veer, M.J., Silverman, R.H., and Williams, B.R. (2003). Activation of the interferon system by short-interfering RNAs. Nat Cell Biol 5, 834-839.
Soutschek, J., Akinc, A., Bramlage, B., Charisse, K., Constien, R., Donoghue, M., Elbashir, S., Geick, A., Hadwiger, P., Harborth, J., et al. (2004). Therapeutic silencing of an endogenous gene by systemic administration of modified siRNAs. Nature 432, 173-178.
Tabara, H., Sarkissian, M., Kelly, W.G., Fleenor, J., Grishok, A., Timmons, L., Fire, A., and Mello, C.C. (1999). The rde-1 gene, RNA interference, and transposon silencing in C. elegans. Cell 99, 123-132.
Xiang, S., Fruehauf, J., and Li, C.J. (2006). Short hairpin RNA-expressing bacteria elicit RNA interference in mammals. Nature biotechnology 24, 697-702.
Zamore, P.D., and Aronin, N. (2003). siRNAs knock down hepatitis. Nature medicine 9, 266-267.
Zamore, P.D., Tuschl, T., Sharp, P.A., and Bartel, D.P. (2000). RNAi: double-stranded RNA directs the ATP-dependent cleavage of mRNA at 21 to 23 nucleotide intervals. Cell 101,25-33.
Zhang, B., and Farwell, M.A. (2007). microRNAs: a new emerging class of players for disease diagnostics and gene therapy. J Cell Mol Med.
Zhang, H.Y., Du, Q., Wahlestedt, C., and Liang, Z. (2006). RNA Interference with chemically modified siRNA. Current topics in medicinal chemistry 6, 893-900.

Claims (12)

REIVINDICACIONES
1. Una molécula dúplex de ARN interferente asimétrica que comprende
una primera cadena con una longitud de 19, 20, 21,22 o 23 nucleótidos; y
una segunda cadena con una longitud de 14, 15, 16 o 17 nucleótidos,
en donde la primera cadena es más larga que la segunda cadena y el último nucleótido de la primera cadena consiste en un ribonucleótido A, U, G o C,
en donde la segunda cadena es al menos un 70 % complementaria a la primera cadena, forma una región bicatenaria con la primera cadena y el primer y último nucleótido de la segunda cadena forma un par de bases con nucleótidos en la primera cadena,
en donde la primera cadena tiene un saliente 3' y un extremo romo 5',
en donde la primera cadena es complementaria a una secuencia de ARNm diana de un gen,
en donde el dúplex de ARN interferente asimétrico comprende un nucleótido modificado o análogo de nucleótido.
2. La molécula dúplex de ARN interferente asimétrica de la reivindicación 1, en donde el saliente 3' tiene una longitud de 2, 3 o 4 nucleótidos.
3. La molécula dúplex de ARN interferente asimétrica de la reivindicación 1 o 2, en donde el saliente 3' es complementario a la secuencia de ARNm diana.
4. La molécula dúplex de ARN interferente asimétrica de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en donde la primera cadena tiene una longitud de 21 nucleótidos.
5. La molécula dúplex de ARN interferente asimétrica de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4,
en donde la segunda cadena tiene una longitud de 14 a 15 nucleótidos, y preferiblemente tiene una longitud de 15 nucleótidos.
6. La molécula dúplex de ARN interferente asimétrica de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en donde la región bicatenaria comprende al menos un nucleótido no emparejado o con error de emparejamiento.
7. La molécula dúplex de ARN interferente asimétrica de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en donde a) el al menos un nucleótido modificado o su análogo es un ribonucleótido con azúcar, esqueleto principal y/o base modificados, preferiblemente en donde el ribonucleótido con esqueleto principal modificado tiene una modificación en un enlace fosfodiéster con otro ribonucleótido, y más preferiblemente en donde el enlace fosfodiéster se modifica para incluir al menos uno de un heteroátomo de nitrógeno o azufre,
b) el al menos un nucleótido modificado o su análogo comprende una base no natural o una base modificada, c) el al menos un nucleótido modificado o su análogo comprende inosina, o una base tritilada,
d) el al menos un nucleótido modificado o su análogo es un ribonucleótido con azúcar modificado, en donde el grupo 2'-OH está reemplazado por un grupo seleccionado de H, OR, R, halo, SH, SR, NH2, NHR, NR2, o CN, en donde cada R es independientemente alquilo, alquenilo o alquinilo C1-C6, y halo es F, Cl, Br o I, o
e) el al menos un nucleótido modificado o su análogo es un ribonucleótido con esqueleto principal modificado que contiene un grupo fosfotioato.
8. Una composición farmacéutica que comprende como un agente activo al menos una molécula dúplex de ARN interferente asimétrica de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7 y un portador farmacéutico.
9. Una composición que comprende una molécula dúplex de ARN interferente asimétrica de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7 y un lípido o una molécula de colesterol.
10. La composición de la reivindicación 9, en donde la molécula de lípido o colesterol está conjugada con la molécula dúplex de ARN interferente asimétrica.
11. La molécula dúplex de ARN interferente asimétrica de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7 o una composición de una cualquiera de las reivindicaciones 9 a 10 para uso en terapia.
12. La molécula dúplex de ARN interferente asimétrica de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, para uso en un método de silenciamiento génico selectivo, en una célula eucariota en donde el gen diana es:
a) un gen asociado con enfermedades humanas o animales
b) un gen de un microorganismo patógeno.
c) un gen viral.
d) un gen asociado a un tumor, o
e) un gen asociado con una enfermedad seleccionada del grupo seleccionado del grupo que consiste en enfermedad autoinmune, enfermedades inflamatorias, enfermedades degenerativas, enfermedades infecciosas, enfermedades proliferativas, enfermedades metabólicas, trastornos inmunomediados, enfermedades alérgicas, enfermedades dermatológicas, enfermedades malignas, trastornos gastrointestinales, trastornos respiratorios, trastornos cardiovasculares, trastornos renales, trastornos reumatoides, trastornos neurológicos, trastornos endocrinos y envejecimiento.
ES16187862T 2007-08-27 2008-08-27 Composiciones de ARN interferente asimétrico y usos de las mismas Active ES2873350T3 (es)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US96825707P 2007-08-27 2007-08-27
US2975308P 2008-02-19 2008-02-19
US3895408P 2008-03-24 2008-03-24

Publications (1)

Publication Number Publication Date
ES2873350T3 true ES2873350T3 (es) 2021-11-03

Family

ID=40387778

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
ES08828867.5T Active ES2617877T3 (es) 2007-08-27 2008-08-27 Composiciones de ARN interferente asimétrico y uso de las mismas
ES16187862T Active ES2873350T3 (es) 2007-08-27 2008-08-27 Composiciones de ARN interferente asimétrico y usos de las mismas

Family Applications Before (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
ES08828867.5T Active ES2617877T3 (es) 2007-08-27 2008-08-27 Composiciones de ARN interferente asimétrico y uso de las mismas

Country Status (9)

Country Link
US (6) US20100286378A1 (es)
EP (4) EP2201022A4 (es)
JP (7) JP2010537639A (es)
CN (3) CN101835789B (es)
CA (2) CA2735167A1 (es)
DK (1) DK2193140T3 (es)
ES (2) ES2617877T3 (es)
HK (2) HK1148534A1 (es)
WO (2) WO2009029688A2 (es)

Families Citing this family (130)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2008073578A2 (en) 2006-12-08 2008-06-19 Iowa State University Research Foundation, Inc. Plant genes involved in nitrate uptake and metabolism
EP2201022A4 (en) * 2007-08-27 2012-01-04 Boston Biomedical Inc COMPOSITION OF ASYMMETRIC RNA DUPLEX AS MICRO-RNA MIMETICUM OR INHIBOTOR
US8097712B2 (en) 2007-11-07 2012-01-17 Beelogics Inc. Compositions for conferring tolerance to viral disease in social insects, and the use thereof
KR100949791B1 (ko) * 2007-12-18 2010-03-30 이동기 오프-타겟 효과를 최소화하고 ＲＮＡｉ 기구를 포화시키지않는 신규한 ｓｉＲＮＡ 구조 및 그 용도
EP2342340A1 (en) 2008-09-22 2011-07-13 Rxi Pharmaceuticals Corporation Rna interference in skin indications
WO2010039536A2 (en) 2008-09-23 2010-04-08 President And Fellows Of Harvard College Sirt4 and uses thereof
US8283460B2 (en) * 2008-10-15 2012-10-09 Somagenics, Inc. Short hairpin RNAs for inhibition of gene expression
WO2010078536A1 (en) 2009-01-05 2010-07-08 Rxi Pharmaceuticals Corporation Inhibition of pcsk9 through rnai
WO2010090762A1 (en) 2009-02-04 2010-08-12 Rxi Pharmaceuticals Corporation Rna duplexes with single stranded phosphorothioate nucleotide regions for additional functionality
EP2756845B1 (en) * 2009-04-03 2017-03-15 Dicerna Pharmaceuticals, Inc. Methods and compositions for the specific inhibition of KRAS by asymmetric double-stranded RNA
CN103555722B (zh) * 2009-04-03 2016-08-31 戴瑟纳制药公司 利用不对称双链rna特异性抑制kras的方法和组合物
WO2010141933A1 (en) * 2009-06-05 2010-12-09 Dicerna Pharmaceuticals, Inc. Specific inhibition of gene expression by nucleic acid containing a dicer substrate
EP2454371B1 (en) 2009-07-13 2021-01-20 Somagenics, Inc. Chemical modification of small hairpin rnas for inhibition of gene expression
US8796238B2 (en) 2009-09-17 2014-08-05 Sigma-Aldrich Co. Llc Short RNA mimetics
WO2011041582A2 (en) 2009-09-30 2011-04-07 President And Fellows Of Harvard College Methods for modulation of autophagy through the modulation of autophagy-inhibiting gene products
US20150025122A1 (en) 2009-10-12 2015-01-22 Larry J. Smith Methods and Compositions for Modulating Gene Expression Using Oligonucleotide Based Drugs Administered in vivo or in vitro
US8962584B2 (en) 2009-10-14 2015-02-24 Yissum Research Development Company Of The Hebrew University Of Jerusalem, Ltd. Compositions for controlling Varroa mites in bees
US9260470B2 (en) * 2009-11-04 2016-02-16 Sungkyunkwan University Foundation For Corporate Collaboration SiRNA structure for minimizing off-target effects caused by antisense strands, and use thereof
WO2011072390A1 (en) * 2009-12-16 2011-06-23 The University Of Western Ontario Compositions and methods related to mirna in diabetic conditions
AU2011224570B2 (en) 2010-03-08 2014-08-14 Monsanto Technology Llc Polynucleotide molecules for gene regulation in plants
WO2011119852A1 (en) 2010-03-24 2011-09-29 Rxi Pharmaceuticals Corporation Reduced size self-delivering rnai compounds
EP2550001B1 (en) 2010-03-24 2019-05-22 Phio Pharmaceuticals Corp. Rna interference in ocular indications
KR20180044433A (ko) 2010-03-24 2018-05-02 알엑스아이 파마슈티칼스 코포레이션 진피 및 섬유증성 적응증에서의 ｒｎａ 간섭
LT2561078T (lt) 2010-04-23 2019-01-10 Cold Spring Harbor Laboratory Naujos struktūriškai sukonstruotos shrnr
GB201006841D0 (en) * 2010-04-26 2010-06-09 Thomsen Lars Method, device and system for targetted cell lysis
ES2930555T3 (es) 2010-10-22 2022-12-16 Olix Pharmaceuticals Inc Moléculas de ácido nucleico que inducen la interferencia de ARN y usos de las mismas
CN101979558B (zh) * 2010-10-28 2015-09-02 百奥迈科生物技术有限公司 一种靶向乙型肝炎病毒基因的siRNA分子及其应用
WO2012140234A1 (en) 2011-04-13 2012-10-18 Vib Vzw Modulation of mirna in diseases with aberrant angiogenesis
WO2012149646A1 (en) * 2011-05-05 2012-11-08 Sunnybrook Research Institute Mirna inhibitors and their uses
CN112426538A (zh) 2011-08-04 2021-03-02 耶达研究及发展有限公司 微rna和包含微rna的组合物
US10806146B2 (en) 2011-09-13 2020-10-20 Monsanto Technology Llc Methods and compositions for weed control
US10829828B2 (en) 2011-09-13 2020-11-10 Monsanto Technology Llc Methods and compositions for weed control
AU2012308694B2 (en) 2011-09-13 2018-06-14 Monsanto Technology Llc Methods and compositions for weed control
US10760086B2 (en) 2011-09-13 2020-09-01 Monsanto Technology Llc Methods and compositions for weed control
MX2014004516A (es) * 2011-10-11 2015-01-16 Brigham & Womens Hospital Micro-arns en trastornos neurodegenerativos.
EP2774989B1 (en) 2011-11-02 2018-09-05 Osaka City University Double-stranded nucleic acid molecule for gene expression control
US20130273655A1 (en) * 2012-03-12 2013-10-17 Shannon Eaker ENGRAFTMENT POTENTIAL OF EMBRYONIC STEM CELLS AND PLURIPOTENT STEM CELLS USING MICRO RNAs
KR101567576B1 (ko) 2012-05-22 2015-11-10 올릭스 주식회사 세포 내 관통능을 가지고 ｒｎａ 간섭을 유도하는 핵산 분자 및 그 용도
CA2873828A1 (en) 2012-05-24 2013-11-28 A.B. Seeds Ltd. Naked dsrna for silencing target molecules in plant seeds
CN104379744A (zh) 2012-05-26 2015-02-25 株式会社博纳克 具有递送功能的基因表达调控用单链核酸分子
EP2703498B1 (en) * 2012-08-29 2015-01-14 Chanel Parfums Beauté Inhibitors of micro-RNAs for use for preventing and/or attenuating skin ageing
US9096853B2 (en) * 2012-09-24 2015-08-04 U.S. Department Of Veterans Affairs Modified siRNA molecules incorporating 5-fluoro-2′-deoxyuridine residues to enhance cytotoxicity
WO2014063155A1 (en) 2012-10-21 2014-04-24 University Of Rochester Thy1 (cd90) as a novel therapy to control adipose tissue accumulation
WO2014089121A2 (en) * 2012-12-03 2014-06-12 Thomas Ichim Retrograde delivery of cells and nucleic acids for treatment of cardiovascular diseases
AU2014215421A1 (en) * 2013-02-05 2015-08-13 1Globe Health Institute Llc Biodegradable and clinically-compatible nanoparticles as drug delivery carriers
MX2015012334A (es) 2013-03-13 2016-02-05 Monsanto Technology Llc Metodos y composiciones para el control de malezas.
BR112015023051A2 (pt) 2013-03-13 2017-11-14 Monsanto Technology Llc método para controle de ervas daninhas, composição herbicida, cassete de expressão microbiano e método de produção de polinucleotídeo
US10568328B2 (en) 2013-03-15 2020-02-25 Monsanto Technology Llc Methods and compositions for weed control
AU2014250940A1 (en) 2013-04-09 2015-10-22 Boston Biomedical, Inc. 2-acetylnaphtho[2,3-b]furan -4,9-dione for use on treating cancer
BR112016000555B1 (pt) 2013-07-19 2022-12-27 Monsanto Technology Llc Método para controlar uma infestação da espécie de leptinotarsa em uma planta, composição inseticida e construção de dna recombinante
US9540642B2 (en) 2013-11-04 2017-01-10 The United States Of America, As Represented By The Secretary Of Agriculture Compositions and methods for controlling arthropod parasite and pest infestations
RU2744194C2 (ru) 2013-12-02 2021-03-03 Фио Фармасьютикалс Корп Иммунотерапия рака
UA119253C2 (uk) 2013-12-10 2019-05-27 Біолоджикс, Інк. Спосіб боротьби із вірусом у кліща varroa та у бджіл
EP3088524A4 (en) 2013-12-26 2017-08-09 Tokyo Medical University Artificial mimic mirna for controlling gene expression, and use of same
CA2935022A1 (en) 2013-12-27 2015-07-02 Bonac Corporation Artificial match-type mirna for controlling gene expression and use therefor
EP3116303B1 (en) 2014-01-15 2020-07-22 Monsanto Technology LLC Methods and compositions for weed control using epsps polynucleotides
CN111733231A (zh) 2014-02-05 2020-10-02 耶达研究及发展有限公司 用于治疗和诊断的微rna和包含所述微rna的组合物
TW201620525A (zh) * 2014-03-14 2016-06-16 波士頓生醫公司 使ｋ－ｒａｓ靜默之非對稱干擾ｒｎａ組成物及其使用方法
CN110506752B (zh) 2014-04-01 2022-02-18 孟山都技术公司 用于控制虫害的组合物和方法
US11279934B2 (en) 2014-04-28 2022-03-22 Phio Pharmaceuticals Corp. Methods for treating cancer using nucleic acids targeting MDM2 or MYCN
US10729785B2 (en) * 2014-05-19 2020-08-04 BioNTech SE Particles comprising protamine and RNA in combination with endosome destabilizing agents
KR101681669B1 (ko) * 2014-05-27 2016-12-02 주식회사 제노포커스 유전자 침묵에 의한 목적 단백질의 과발현 방법
WO2015200223A1 (en) 2014-06-23 2015-12-30 Monsanto Technology Llc Compositions and methods for regulating gene expression via rna interference
WO2015200539A1 (en) 2014-06-25 2015-12-30 Monsanto Technology Llc Methods and compositions for delivering nucleic acids to plant cells and regulating gene expression
RU2021123470A (ru) 2014-07-29 2021-09-06 Монсанто Текнолоджи Ллс Композиции и способы борьбы с насекомыми-вредителями
KR20230037676A (ko) 2014-09-05 2023-03-16 피오 파마슈티칼스 코프. Tyr 또는 mmp1을 표적화하는 핵산을 사용한 노화 및 피부 장애의 치료 방법
CN107207556B (zh) 2014-11-14 2020-12-08 沃雅戈治疗公司 调节性多核苷酸
CN107109407A (zh) 2014-11-14 2017-08-29 沃雅戈治疗公司 治疗肌萎缩性侧索硬化(als)的组合物和方法
JP6637652B2 (ja) * 2014-11-21 2020-01-29 株式会社バイオシンクタンク 抗腫瘍剤の選択方法およびその抗腫瘍剤が含有するｓｉＲＮＡ
US11045488B2 (en) 2014-12-26 2021-06-29 Nitto Denko Corporation RNA interference agents for GST-π gene modulation
US10264976B2 (en) * 2014-12-26 2019-04-23 The University Of Akron Biocompatible flavonoid compounds for organelle and cell imaging
CN107109415B (zh) * 2014-12-27 2021-07-09 株式会社博纳克 控制基因表达的天然型miRNA及其用途
MX2017009521A (es) 2015-01-22 2018-11-09 Monsanto Technology Llc Composiciones y métodos para controlar leptinotarsa.
CN104673796A (zh) * 2015-02-09 2015-06-03 暨南大学 靶向hsv-1病毒ul18基因的小干扰rna及应用
AU2016233311A1 (en) * 2015-03-16 2017-10-05 MiRagen Therapeutics, Inc. MiRNA mimetics and their use in treating sensory conditions
CN108064289A (zh) 2015-03-27 2018-05-22 株式会社博纳克 具有递送功能和基因表达调控能力的单链核酸分子
US10883103B2 (en) 2015-06-02 2021-01-05 Monsanto Technology Llc Compositions and methods for delivery of a polynucleotide into a plant
CN108024517A (zh) 2015-06-03 2018-05-11 孟山都技术公司 用于将核酸引入到植物中的方法和组合物
MX2017015618A (es) 2015-06-03 2018-08-15 Boston Biomedical Inc Composiciones que comprenden un inhibidor de la autorrenovación y diferenciación de células madre cancerosas y un agente inmunoterapéutico para su uso en el tratamiento del cáncer.
BR112017026201A2 (pt) 2015-06-05 2018-08-14 MiRagen Therapeutics, Inc. inibidores de mir-155 para o tratamento de linfoma cutâneo de células t (ctcl)
US10808247B2 (en) 2015-07-06 2020-10-20 Phio Pharmaceuticals Corp. Methods for treating neurological disorders using a synergistic small molecule and nucleic acids therapeutic approach
CN108135923B (zh) 2015-07-06 2021-03-02 菲奥医药公司 靶向超氧化物歧化酶1（sod1）的核酸分子
GB201516685D0 (en) * 2015-09-21 2015-11-04 Varghese Oommen P And Oommen Oommen P Nucleic acid molecules with enhanced activity
WO2017070151A1 (en) 2015-10-19 2017-04-27 Rxi Pharmaceuticals Corporation Reduced size self-delivering nucleic acid compounds targeting long non-coding rna
JP7027311B2 (ja) 2015-11-16 2022-03-01 オリックス ファーマシューティカルズ，インコーポレーテッド ＭｙＤ８８又はＴＬＲ３を標的とするＲＮＡ複合体を使用した加齢黄斑変性の治療
WO2017100127A1 (en) 2015-12-06 2017-06-15 Boston Biomedical, Inc. ASYMMETRIC INTERFERING RNAs, AND COMPOSITIONS, USE, OR PREPARATION THEREOF
CA3005937C (en) 2015-12-13 2021-11-09 Nitto Denko Corporation Sirna structures for high activity and reduced off target
EP3408391A4 (en) 2016-01-31 2019-08-28 University of Massachusetts BRANCHED OLIGONUCLEOTIDES
KR20180104692A (ko) 2016-02-02 2018-09-21 올릭스 주식회사 Angpt2 및 pdgfb를 표적화하는 rna 복합체를 사용하는 혈관신생 관련 질환의 치료
CN108779463B (zh) 2016-02-02 2022-05-24 奥利克斯医药有限公司 使用靶向IL4Rα、TRPA1或F2RL1的RNA复合物治疗特应性皮炎和哮喘
WO2017139758A1 (en) * 2016-02-12 2017-08-17 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health & Human Services Rna/dna hybrid nanoparticles modified with single stranded rna toeholds and uses thereof
MA45328A (fr) 2016-04-01 2019-02-06 Avidity Biosciences Llc Compositions acide nucléique-polypeptide et utilisations de celles-ci
CA3020487C (en) 2016-04-11 2022-05-31 Olix Pharmaceuticals, Inc. Treatment of idiopathic pulmonary fibrosis using rna complexes that target connective tissue growth factor
BR112018073384A2 (pt) 2016-05-18 2019-03-06 Voyager Therapeutics, Inc. polinucleotídeos moduladores
EP3458589A4 (en) 2016-05-18 2020-01-01 Voyager Therapeutics, Inc. COMPOSITIONS AND METHODS FOR TREATING HUNTINGTON'S DISEASE
CA3029596A1 (en) 2016-06-28 2018-01-04 Boston Biomedical, Inc. Methods for treating cancer
KR101916652B1 (ko) 2016-06-29 2018-11-08 올릭스 주식회사 작은 간섭 rna의 rna 간섭효과 증진용 화합물 및 이의 용도
CN107630015B (zh) * 2016-07-19 2021-03-09 上海市东方医院 一种稳定的dna-rna双链结构
US11753638B2 (en) 2016-08-12 2023-09-12 University Of Massachusetts Conjugated oligonucleotides
CA3041761A1 (en) * 2016-10-31 2018-05-03 Gifu University Double-stranded nucleic acid molecule and use thereof
WO2018098352A2 (en) 2016-11-22 2018-05-31 Jun Oishi Targeting kras induced immune checkpoint expression
WO2018102427A1 (en) 2016-11-29 2018-06-07 Boston Biomedical, Inc. Naphthofuran derivatives, preparation, and methods of use thereof
CA3052038C (en) * 2017-01-31 2023-08-01 Curigin Co., Ltd. Nucleic acid simultaneously inhibiting expression of mtor gene and stat3 gene
US11591600B2 (en) 2017-02-10 2023-02-28 OliX Pharmaceuticals. Inc. Long double-stranded RNA for RNA interference
WO2018160887A1 (en) * 2017-03-01 2018-09-07 Boston Biomedical, Inc. Pdl1-specific and beta-catenin-specific asymmetric interfering rna compositions, uses or preparation thereof
CA3061652A1 (en) 2017-05-05 2018-11-08 Voyager Therapeutics, Inc. Compositions and methods of treating amyotrophic lateral sclerosis (als)
SG11201909868YA (en) 2017-05-05 2019-11-28 Voyager Therapeutics Inc Compositions and methods of treating huntington's disease
CA3062656A1 (en) 2017-05-17 2018-11-22 Boston Biomedical, Inc. Methods for treating cancer
JP7406793B2 (ja) * 2017-06-23 2023-12-28 ユニバーシティー オブ マサチューセッツ ２テイル自己デリバリー型ｓｉＲＮＡおよび関連方法
EP3647423A4 (en) * 2017-06-30 2021-03-24 National University Corporation Tokyo Medical and Dental University DOUBLE STRANDED HETERO-ANTI-MIRNA
US11298371B2 (en) 2017-10-11 2022-04-12 Nitto Denko Corporation Regulation of nucleic acid molecule expression
US20200237799A1 (en) 2017-10-16 2020-07-30 Voyager Therapeutics, Inc. Treatment of amyotrophic lateral sclerosis (als)
CN111479924B (zh) 2017-10-16 2024-06-14 沃雅戈治疗公司 肌萎缩性侧索硬化症(als)的治疗
WO2019103581A1 (ko) * 2017-11-27 2019-05-31 (주)프로스테믹스 이중 가닥의 올리고뉴클레오티드 및 그 제조 방법
JP7506601B2 (ja) 2017-12-06 2024-06-26 アビディティー バイオサイエンシーズ，インク． 筋萎縮症と筋緊張性ジストロフィーを処置するための組成物および方法
WO2020027641A1 (ko) * 2018-08-03 2020-02-06 주식회사 레모넥스 아토피성 질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물
SG11202101288TA (en) 2018-08-10 2021-03-30 Univ Massachusetts Modified oligonucleotides targeting snps
WO2020149702A1 (ko) * 2019-01-18 2020-07-23 올릭스 주식회사 Nrl(neural retina leucine zipper)의 발현을 억제하는 비대칭 sirna
AU2020268798A1 (en) * 2019-05-03 2021-11-04 Dicerna Pharmaceuticals, Inc. Double-stranded nucleic acid inhibitor molecules with shortened sense strands
TW202144572A (zh) 2020-03-19 2021-12-01 美商亞維代堤生物科學公司 治療臉肩胛肱骨肌肉失養症之組合物及方法
EP4294449A1 (en) 2021-02-18 2023-12-27 Oneglobe Holdings Limited Compositions for conjugating oligonucleotides and carbohydrates
WO2022240824A1 (en) 2021-05-13 2022-11-17 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Compositions and methods for treating sickle cell diseases
JP2024520556A (ja) 2021-05-29 2024-05-24 １グローブ ヘルス インスティテュート エルエルシー 新規遺伝子サイレンシング技術としての短鎖二重鎖ｄｎａおよびその使用
AU2022285661A1 (en) 2021-05-29 2023-12-21 1Globe Health Institute Llc Asymmetric short duplex dna as a novel gene silencing technology and use thereof
TW202315943A (zh) 2021-06-23 2023-04-16 麻薩諸塞大學 用於治療子癇前症及其它血管新生病症的最佳化抗flt1寡核苷酸化合物
EP4373932A1 (en) * 2021-07-22 2024-05-29 Microbio (Shanghai) Co., Ltd. Modified small interfering rna molecules with reduced off-target effects
WO2023043953A1 (en) 2021-09-16 2023-03-23 Avidity Biosciences, Inc. Compositions and methods of treating facioscapulohumeral muscular dystrophy
WO2023081500A2 (en) * 2021-11-08 2023-05-11 Dicerna Pharmaceuticals, Inc. RNAi OLIGONUCLEOTIDE CONJUGATES
WO2023207615A1 (zh) * 2022-04-26 2023-11-02 南京明德新药研发有限公司 一类含由天然核苷酸组成突出端的双链RNAi化合物
WO2024040531A1 (en) 2022-08-25 2024-02-29 1Globe Health Institute, Nanjing Novel compositions for conjugating oligonucleotides and carbohydrates

Family Cites Families (15)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20040259247A1 (en) 2000-12-01 2004-12-23 Thomas Tuschl Rna interference mediating small rna molecules
US20060211642A1 (en) * 2001-05-18 2006-09-21 Sirna Therapeutics, Inc. RNA inteference mediated inhibition of hepatitis C virus (HVC) gene expression using short interfering nucleic acid (siNA)
US20070042983A1 (en) * 2001-05-18 2007-02-22 Sirna Therapeutics, Inc. RNA interference mediated inhibition of gene expression using short interfering nucleic acid (siNA)
US7074824B2 (en) 2001-07-31 2006-07-11 Arqule, Inc. Pharmaceutical compositions containing beta-lapachone, or derivatives or analogs thereof, and methods of using same
US6962944B2 (en) 2001-07-31 2005-11-08 Arqule, Inc. Pharmaceutical compositions containing beta-lapachone, or derivatives or analogs thereof, and methods of using same
EP2305812A3 (en) 2002-11-14 2012-06-06 Dharmacon, Inc. Fuctional and hyperfunctional sirna
US20040248299A1 (en) * 2002-12-27 2004-12-09 Sumedha Jayasena RNA interference
WO2005056761A2 (en) 2003-12-05 2005-06-23 Massachusetts Institute Of Technology REAGENTS AND METHODS FOR IDENTIFICATION OF RNAi PATHWAY GENES AND CHEMICAL MODULATORS OF RNAi
WO2005079533A2 (en) * 2004-02-17 2005-09-01 University Of Massachusetts Methods and compositions for mediating gene silencing
US20050203047A1 (en) 2004-03-10 2005-09-15 Ulrich Thomann Delivery vectors for short interfering RNA, micro-RNA and antisense RNA
AU2005222965B8 (en) * 2004-03-15 2010-07-01 City Of Hope Methods and compositions for the specific inhibition of gene expression by double-stranded RNA
US20060142228A1 (en) 2004-12-23 2006-06-29 Ambion, Inc. Methods and compositions concerning siRNA's as mediators of RNA interference
EP2201022A4 (en) * 2007-08-27 2012-01-04 Boston Biomedical Inc COMPOSITION OF ASYMMETRIC RNA DUPLEX AS MICRO-RNA MIMETICUM OR INHIBOTOR
KR100949791B1 (ko) * 2007-12-18 2010-03-30 이동기 오프-타겟 효과를 최소화하고 ＲＮＡｉ 기구를 포화시키지않는 신규한 ｓｉＲＮＡ 구조 및 그 용도
TW201620525A (zh) 2014-03-14 2016-06-16 波士頓生醫公司 使ｋ－ｒａｓ靜默之非對稱干擾ｒｎａ組成物及其使用方法

Also Published As

Publication number Publication date
US11015195B2 (en) 2021-05-25
HK1148534A1 (en) 2011-09-09
EP2193140B1 (en) 2016-11-02
JP2017127333A (ja) 2017-07-27
JP2016168050A (ja) 2016-09-23
JP6236498B2 (ja) 2017-11-22
WO2009029688A2 (en) 2009-03-05
CN105018492B (zh) 2018-08-24
CN101835789B (zh) 2015-06-24
US9328345B2 (en) 2016-05-03
JP2014097072A (ja) 2014-05-29
JP2016171815A (ja) 2016-09-29
EP2193140A2 (en) 2010-06-09
US20210301292A1 (en) 2021-09-30
DK2193140T3 (en) 2017-01-23
JP2015130885A (ja) 2015-07-23
CA2735166C (en) 2020-12-01
CN101842381A (zh) 2010-09-22
WO2009029690A1 (en) 2009-03-05
CA2735167A1 (en) 2009-03-05
EP3121281A1 (en) 2017-01-25
JP2010537639A (ja) 2010-12-09
CA2735166A1 (en) 2009-03-05
WO2009029688A3 (en) 2009-07-02
US10266821B2 (en) 2019-04-23
US10927376B2 (en) 2021-02-23
US20200071696A1 (en) 2020-03-05
EP3121281B1 (en) 2021-03-31
EP2201022A1 (en) 2010-06-30
EP3889261A1 (en) 2021-10-06
HK1217349A1 (zh) 2017-01-06
ES2617877T3 (es) 2017-06-20
JP2010537640A (ja) 2010-12-09
US20100286378A1 (en) 2010-11-11
CN105018492A (zh) 2015-11-04
US20090208564A1 (en) 2009-08-20
EP2193140A4 (en) 2011-07-13
US20200063128A1 (en) 2020-02-27
EP2201022A4 (en) 2012-01-04
CN101835789A (zh) 2010-09-15
JP5986596B2 (ja) 2016-09-06
JP6453275B2 (ja) 2019-01-16
US20160304868A1 (en) 2016-10-20

Similar Documents

Publication Publication Date Title
ES2873350T3 (es) Composiciones de ARN interferente asimétrico y usos de las mismas
JP7307137B2 (ja) ＧＳＴ－π遺伝子を調節するためのＲＮＡ干渉剤
JP2014097072A5 (es)
TWI752927B (zh) 具高活性及減低脫靶之siRNA構造
JP6751185B2 (ja) ＧＳＴ−π遺伝子を調節するためのＲＮＡ干渉剤