JP4763681B2 - RNAi作用媒介物の同時デリバリーのためのマルチプロモーター発現カセット - Google Patents
RNAi作用媒介物の同時デリバリーのためのマルチプロモーター発現カセット Download PDFInfo
- Publication number
- JP4763681B2 JP4763681B2 JP2007502094A JP2007502094A JP4763681B2 JP 4763681 B2 JP4763681 B2 JP 4763681B2 JP 2007502094 A JP2007502094 A JP 2007502094A JP 2007502094 A JP2007502094 A JP 2007502094A JP 4763681 B2 JP4763681 B2 JP 4763681B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- rnai
- promoter
- expression
- sequence
- viral
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Fee Related
Links
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
- A61P1/16—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for liver or gallbladder disorders, e.g. hepatoprotective agents, cholagogues, litholytics
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/12—Antivirals
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/12—Antivirals
- A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
- C12N15/111—General methods applicable to biologically active non-coding nucleic acids
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
- C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
- C12N15/1131—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing against viruses
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
- C12N2310/10—Type of nucleic acid
- C12N2310/11—Antisense
- C12N2310/111—Antisense spanning the whole gene, or a large part of it
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
- C12N2310/10—Type of nucleic acid
- C12N2310/14—Type of nucleic acid interfering N.A.
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
- C12N2310/50—Physical structure
- C12N2310/53—Physical structure partially self-complementary or closed
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2330/00—Production
- C12N2330/30—Production chemically synthesised
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Virology (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Public Health (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Oncology (AREA)
- Communicable Diseases (AREA)
- Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Description
本出願は、2004年3月17日に提出された米国仮特許出願第60/553,920号、および2004年3月5日に提出された米国仮特許出願第60/550,504号の利益を主張するものであり、これらの両者を本明細書の一部として引用に取り込む。
しかしながら、未改変RNAiを効果的治療薬としてヒトに使用するためにin vivoデリバリーすることは多くの技術的障害に直面する。第一に、細胞性および血清ヌクレアーゼのために、in vivo注入されたRNAの半減期はわずかに約70秒である(たとえばKurreck, Eur. J. Bioch. 270: 1628-44 (2003)参照)。化学的改変によって注入したRNAの安定性を増加させる多くの試みがなされてきたが、化学的改変が細胞傷害性効果を増加させるということが時々起こる。一つの具体的な例では、各2つめのリン酸をホスホロチオエートに置換したRNAi二本鎖の複数投与に対して細胞は耐えられなかった(Harborthら、Antisense Nucleic Acid Drug Rev. 13(2): 83-105 (2003))。他の障害には組織特異的デリバリーおよび治療応答を顕在化させるに十分であって毒性を示さない量でRNAi作用媒介物をデリバリーさせ得ることが含まれる。
現在、標的配列をデリバリーするために最も一般的に使用されているウイルスはレトロウイルス、単純ヘルペスウイルス(HSV)またはアデノウイルス(Ad)に由来する系に基づくものである。これらのベクターはいずれも比較的大きな挿入物に適合することができ治療的に適切な力価で産生することができる。しかしながら、すべての系において、癌の発生と関連する問題があり(Cavazzana-Calvoら、Science, 288: 669-72(2000))、望ましくない宿主の免疫応答および患者にとって毒性を生じさせるという問題がある。RNAiをデリバリーするために有用な他の例はアデノ随伴ウイルス(AAV)である。
従って、従来技術においては安定で効果的なRNAi治療薬の開発が求められている。本発明は従来技術のこの要求を満足するものである。
本発明の組成物および方法を説明する前に、このような方法、装置および処方は当然ならが変化するから、本発明は、説明される特定の方法論、生成物、装置および因子に限定されないことが理解されるべきである。また、ここで使用される用語は、特定の実施態様説明するためのものにすぎず、特許請求の範囲のみにより限定される本発明の範囲を限定することを意図するものでないことも理解されるべきである。
ここで使用する単数形は、明確にそうでないことを述べない限り、複数への参照を含むものである。従って、例えば「因子」の用語は、一つの因子または複数の因子の混合物を意味する。また、「製造方法」の用語は、当業者に知られた均等な工程および方法等への言及を含むものである。
異なるように定義しない限り、ここで使用する全ての技術用語および科学用語は、本発明が属する技術における当業者が通常理解するのと同じ意味を有する。ここで述べる全ての刊行物は、前記刊行物に記載され、またここに記載する発明に関して使用され得る装置、処方および方法を説明する目的で、制限なく本明細書の一部として援用される。
本発明は、単一の発現構築物を使用して、少なくとも三つの異なるRNAi作用媒介物を同時に細胞にデリバリーするための、革新的で強靭な遺伝的組成物および方法に向けられている。この組成物および方法は、標的核酸の安定で持続的な阻害を提供する。
「プロモーター」または「プロモーター配列」は、細胞内においてRNAポリメラーゼに結合でき、またメッセンジャーRNA、リボゾームRNA、核小体RNA、またはRNAポリメラーゼI、IIもしくはIIIの何れかによって転写される何れかの種類のRNAのような、ポリヌクレオチドまたはポリペプチドコード配列の転写を開始できるDNA調節領域である。
「RNA干渉」または「RNAi」の用語は、一般には、二本鎖RNA分子または短いヘアピンRNAが、それに対して実質的または全体的な相同性を有する核酸配列の発現を変化させる過程を意味する。「RNAi種」または「RNAi作用媒介物」の用語は、RNAiを誘起する個別のRNA配列を言う。また、「RNAi発現カセット」の用語は、三つ以上のRNAi種を含む本発明の実施態様に従うカセットを意味する。
図3Eに示した別の実施態様において、全てのRNAiセンスおよびアンチセンス配列は同じ鎖から転写される。当業者は、図3A〜図3Eに示したマルチプロモーターRNAi発現カセットの何れの実施態様も、その組合せまたは変形として、ある応用のために使用され得ることを理解する。
ウイルス性マルチプロモーターRNAi発現構築物には、問題の遺伝子の発現を増大させるために、1以上のエンハンサーが存在してもよい。本発明の実施態様において使用するために適したエンハンサーは、Apo E HCRエンハンサー、最近記述されたCMVエンハンサー(Xia et al, Nucleic Acids Res 31-17 (2003)参照)、および当業者に既知の他のエンハンサーが含まれる。
典型的には、RNAiによる標的配列の阻害は、標的配列とRNAi分子のセンス鎖との間の高度な配列相同性を必要とする。幾つかの実施態様において、このような相同性は約70%よりも高く、約75%よりも高いであろう。好ましくは、相同性は約80%よりも高く、また85%、更には90%よりも高い。更に好ましくは、標的配列とRNAiのセンス鎖との間の配列相同性は、約90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%または99%よりも高い。マルチプロモーターRNAi発現構築物がウイルス感染をターゲッティングするために使用される実施態様においては、ウイルスの種々の亜種ゲノム間の配列相同性は、保存された領域においてでさえも、15〜30の連続するヌクレオチドに亘って90%以上、更には80%のレベルにも達しない可能性がある。このような場合に、幾つかの亜種についての標的配列とRNAiのセンス鎖との間の配列相同性は、80%以下である可能性がある。
標的配列の保存された領域に基づいてRNAi配列を選択することに加えて、RNAi配列の選択は他の因子に基づいてもよい。望ましい標的配列の特徴(例えばGC含量パーセント、翻訳開始コドンからの位置、または提案されたRNAiの相同体についてのコンピュータ配列データベースの検索に基づく配列類似性、熱力学的ペアリング基準)に基づいて、RNAiにおいて有効であろう配列を同定するための選択基準を考案する多くの試みにもかかわらず、無数の可能なRNAi配列候補の中から、何れが実際にRNAサイレンシング応答を誘導できる望ましい標的に対応するかを高い信頼性で予測することは、現在のところ不可能である。その代わり、典型的には個々の具体的なRNAiポリヌクレオチド配列を作製し、テストして所望の標的の発現との干渉が生じ得るかどうかを決定する。
例えば、本発明の一実施態様では、パルボウイルス科由来のウイルスが利用される。パルボウイルス科は、長さが約5000ヌクレオチドの、エンベロープで包まれていない小さい一本鎖DNAウイルスの科である。この科のメンバーには、アデノ関連ウイルス(AAV)、定義により、生産的感染サイクルを開始および維持するためにもう一つのウイルス(典型的にはアデノウイルスまたはヘルペスウイルス)との同時感染を必要とする依存性パルボウイルスが含まれる。このようなヘルパーウイルスの不存在下において、AAVは、非***細胞および***細胞の両方において受容体媒介性の結合および内部移行によって標的細胞を感染またはトランスダクションする能力がある。
しかし、AAVをマルチプロモーターRNAi発現構築物のための担体として使用するときには、技術的障害に対処しなければならない。例えば、ヒト集団の種々の割合は、あるAAV血清型に対する中和抗体を保持している可能性がある。しかし、幾つかのAAV血清型が存在し、その幾つかについては、中和抗体を保持する個体のパーセンテージが大幅に低下するので、他の血清型を使用することができ、または偽型化を利用することができる。既に特徴付けされている少なくとも八つの異なる血清型が存在し、単離されている多数の他の血清型は未だ十分には記述されていない。もう一つの制限は、AAVに対する可能な免疫応答の結果として、AAVに基づく療法は1回しか投与することができないかもしれない;しかし、別の非ヒト由来の血清型を使用して、反復投与が可能になり得る。投与経路、血清型、およびデリバリーされるゲノムの組成は、全て組織特異性に影響する。
パッケージング細胞株で産生された後に、前記マルチプロモーターRNAi発現カセットを含むウイルス粒子は精製および定量(力価測定)される。精製の基本的な方法には、密度勾配遠心分離法、または、好ましくはカラムクロマトグラフィー法が含まれる。
加えて、本マルチプロモーターカセットを含むベクターは、適切な医薬的に許容可能な適切なキャリアまたは希釈剤と組み合わせることによって、医薬組成物に処方することができる。医薬投与量形態において、前記マルチプロモーターカセットを含んでなるベクターは、単独で、または他の医薬的有効成分と共に組合せて投与することができる。当業者は、前記マルチプロモーターカセットを含むベクターのための投与量レベルが、デリバリー担体、標的細胞へのトランスダクションの相対的容易さ、標的細胞におけるRNAi種の発現レベルの関数として変化するであろうことを容易に理解するであろう。
本発明のマルチプロモーターRNAi発現構築物で治療できる疾患の一つはC型肝炎ウイルス(HCV)感染である。疾病管理予防センターから集めた統計に基づくと米国民のおよそ2%−400万人近い人々が現在HCVに感染している。最初、HCVに感染した個人の大部分は何の症状も示さない;しかしながら、80%を越える人々が慢性および進行性肝疾患に移行し、ついには肝硬変または肝細胞がんになる。HCVは米国において肝移植の先行指標であり毎年8,000から10000人の米国民の死をもたらす。世界的規模では、世界保健機構は1億7000万人を超える感染患者がいると見積もっており、ある国々の一般住民の10〜30%という高い感染率になっている。
HCVはフラビウイルス科に属する、エンベロープを有するプラス一本鎖のRNAウイルスである。HCVの感染サイクルは典型的にはレセプター媒介結合によるウイルス粒子の細胞への侵入およびインターナリゼーションから始まる。細胞質におけるアンコーティング後、ゲノムを含むRNAプラス鎖は宿主細胞の翻訳装置と直接に相互作用し得る。5'キャップメチル化を欠くので、このRNAは5'非翻訳領域(UTR)において長い二次構造を形成し、これが内部リボソームエントリー部位(IRES)として機能し、翻訳過程の最初の工程としての40Sサブユニットの直接結合が可能になる。
感染性粒子によるshRNAデリバリーのテストの前に、適切な発現プラスミドを構築して評価する。マルチプロモーターRNAi発現構築物を設計する際に考慮することのできる少なくとも2つの特徴がある:1)前記構築物は子孫ウイルス粒子に効率的にパッケージングされねばならない;2)前記プラスミドは高レベルのshRNA発現を生じさせなければならない。さらに、種々のマルチプロモーターRNAi発現構築物をテストするため、トランスフェクション及びトランスダクション効率を評価する手段がなければならない。
repおよびcap配列を除去したAAV-2ベクターはウイルス性RNAi発現構築物の骨格(以下rAAVベクターと呼ぶ)を与える。このベクターはAAV研究で広く使用されており効率的なパッケージングの必要条件はよく知られている。U6およびH1プロモーターがshRNA配列の発現に使用されるが、各プロモーターに独立に駆動される個々のshRNA阻害レベルに大きな相違があることが報告されている。しかしながら、そのような変動が見られた場合にはこのベクター構築物はプロモーターを容易に交換できるものである。
本明細書に記載のrAAVベクター態様において、各プロモーター/RNAi/ターミネーター構成要素は長さがおよそ400ヌクレオチドであり、発現カセットあたり多くのプロモーター/RNAi/ターミネーター構成要素を含めるための十分な余地が残されている。あるいは、rAAV発現構築物のトランスフェクション効率および感染性粒子によってデリバリーされるrAAV発現構築物による標的細胞のトランスダクションの定量を可能にするため、1以上の選択可能マーカーカセットをrAAVマルチプロモーターRNAi発現構築物に操作して導入することができる。
ルシフェラーゼに対するshRNAは従前に評価されているが、in vivoで構築物をテストするに先だってrAAV-デリバリーされるshRNAの効率をin vitroで評価する。テストおよびレポーター構築物を標準的技術を用いて許容細胞へトランスフェクションする。ルシフェラーゼ特異的shRNAを無関係のshRNA配列に置換したrAAV発現構築物をネガティブコントロールとしてこの実験で使用する。蛍光顕微鏡を用いて選択マーカーのレベルを評価することによってトランスフェクション効率の相対百分率を直接見積る。shRNAの阻害活性を評価するため、ルシフェラーゼ活性を標準的な市販のキットを用いて測定する。あるいは、並行実験プレートから収集して精製したRNAに対して定量的リアルタイムPCR解析(Q-PCR)を行う。無関係のshRNA種で処理した細胞の溶解物中に見られる活性に比較して90パーセントよりも大きく低下した活性は、そのshRNAが高度に機能的であることの指標である。
裸のDNAプラスミドの同時トランスフェクションを用いてin vitro培養細胞系およびin vivoマウスモデルの両方において発現構築物が機能することが明らかになったならば、感染性粒子にパッケージングされたrAAV発現構築物でテストを開始する。感染性粒子は、1)ルシフェラーゼに対するshRNA(AAV ITRに挟まれている)を発現するrAAV構築物;2)AAV repおよびcap遺伝子をコードする構築物;および3)高力価のウイルスを生産するために必要なヘルパーアデノウイルス遺伝子を含む発現構築物、を含む3つの別個の発現構築物の同時トランスフェクションを必要とする商業的に入手可能なAVV無ヘルパー系によって作製される。標準的な精製手順により、実験で使用するためのウイルス粒子が用意される。
ルシフェラーゼレポーター活性が肝臓において確立された後、rAAV粒子を門脈または尾静脈注入によって正常なC57Bl/6マウスに注入する。無関係のshRNA発現構築物を保持するrAAV粒子はネガティブコントロールとして使用される。最初、マウスにかなり高用量(2x1012ベクターゲノム(vg))を注入し、用量応答曲線を作製するため続く実験では低下させる。7日から10日後、マウスを犠牲にし、肝臓を集め血清サンプルを集める。肝臓ルシフェラーゼ活性及びRNAの相対レベルを、上述したルシフェラーゼアッセイ及びQPCR法を用いて、単離した肝臓から測定する。更に、肝臓組織の連続切片中でマーカータンパク質を測定することによってトランスダクションの効率を評価する。
三重発現構築物によってデリバリーされるAAV粒子がin vitroでルシフェラーゼ-HCV融合レポーターを阻害することを確認しなければならない。許容組織培養細胞を図9に記載したレポーター構築物の一つでトランスフェクションする。さらに、各同時トランスフェクション混合物にhAATをコードするプラスミドを補充する。48時間のインキュベーション後、HCVに対する三重プロモーターshRNA発現プラスミドを保持する感染性粒子を細胞に投与する。3種の無関係のshRNA種を発現する三重プロモーター構築物AAV粒子はネガティブコントロールとして機能する。ルシフェラーゼ活性の測定を用いてAAV-デリバリーshRNAが高度に機能的であることを確認する。
AAVベースのベクターは所望の配列を肝細胞へデリバリーできることが示されているがそれらの組織内で起こるトランスダクションの相対レベルは伝統的にかなり低いものであった。第IX血液因子のデリバリーおよび発現のためにAAV-2を使用する血友病の臨床研究についてはこれは重大な問題ではない。血友病の治療のためには分泌タンパク質レベルを治療レベルにまで補充することだけが重要である。そのような補充は所望のタンパク質を有意なレベルに発現するこのできる小数のトランスダクション細胞から起こりえるであろう。しかしながら、RNAi作用の機序は細胞内機構でありその効果は直接には細胞から細胞へと伝搬せず、shRNAを発現するAAVを治療薬として使用するためにはトランスダクション効率を上げなければならない。
McCartyらは、キャプシド内に同じ発現カセットのプラス鎖とマイナス鎖の両方を有する自己相補性AAVベクター(scAAV)を作製することができた(Gene Ther. 8: 1248-1254 (2001))。これは5' ITRを変異させ、3' ITRを無傷で残すことによって達成された。末端解離部位他の非必須AAV配列を変異または欠失させ、それによって野生型AAVとこの構築物との可能な組換えを排除することによって、複製が3' ITRから開始するDNA鋳型が作製させる。複製装置が5' ITRに達したならば、解離は起こらず複製は3' ITRへ継続する。生じた産物はプラス鎖と相補的なマイナス鎖の両方を有し、なお効率的にパッケージングされる。scAAVベクターを使用して、肝臓細胞のトランスダクションは全肝臓細胞の30%に増大した(Fuら、Mlec Therapy. 8(6): 911-7 (2003))。大槽内デリバリーした場合、50%を越える小脳のプルキニエ細胞がscAAV粒子によってトランスダクションされた。Thomasらは、マウス肝臓に等価な用量で注入した場合、自己相補ベクターは対応する一本鎖AAV対応物よりもマウス肝臓において50倍高いルシフェラーゼ導入遺伝子発現を生じさせることを示した(Thomasら、J. Virol.(近刊))。若干落ちるものの、これらのベクター間の発現の相対的相違は注入およそ1年後に20倍に維持された。
AAVデリバリー系の他の改変もトランスダクション効率を劇的に増大させるために利用されてきた。それらには他の血清型からのCapタンパク質を有するrAAV-2ベクターゲノムをパッケージングすることによって偽型ウイルス粒子を作製することが含まれる。全ての血清型の中でもっともよく解析されているので、AAV-1からAAV-6までのCapタンパク質がAAV-2ベクターを偽型化するためにもっとも一般的に使用されている。偽型化ストラテジーを使用することによって得られる利益があっても、肝細胞のトランスダクション効率の閾値は全集団のわずかに15%までしか増加しないであろう。しかしながら、多数の他の血清型のAAVが単離および同定されているが、それは評価できる程度に特徴解析されていない。例えば、最初にアカゲザルの心臓組織から単離されたAAV-8はそれらの一つである。新規なキャップタンパク質のトランスダクションに対する影響を決定するため、一本鎖AAV-2ゲノムをAAV-8capに偽型化した偽型ウイルスが作製された。このベクターは感染性粒子の用量を増加させて注入した後のマウス肝臓のトランスダクションの相対効率を評価するためにLacZゲノムを保持している。表1に結果のまとめ(Thomasら、J Virol. 78(6):3110-22 (2004))を示す。
無関係のshRNA配列を発現するrAAVベクターを保持する対応するウイルス粒子を作製し、陰性対照として使用する。ルシフェラーゼ活性の相対レベルの大きな低下はトランスダクション効率の増加と相関する。
HCVに対する治療剤として有用なshRNAの選抜は簡単な命題ではない。エスケープ変異体の出現という問題に加えて、高い変異率はウイルスを保持する感染個体の集団内で広範囲の配列相違を生じさせ、ヌクレオチド配列内で31-34%程度の遺伝子が相違が生じる。サブタイプ(任意のある遺伝子型内の種)は完全長ゲノム配列比較に基づくと20〜23%異なり得る。従って、高い保存性を有するウイルスゲノム領域を同定し、最も広い治療用途を保証するために選択する。どのように配列をアラインメントするか、および、治療的に関連する領域を選択するかの例として、HCV遺伝子型1bのウイルスに対応する30の完全長配列を公共データベースから入手し、Jotun Hein MethodおよびMdgAlign解析ソフトウエァ(DNASTAR)を用いてアラインメントする。5' UTR中の領域(ヌクレオチド75-112番)のように高い保存性を有する領域を同定した。
図12は、HCVの5つの異なる100bp領域を標的とする種々のRNAi作用媒介物による相対光単位として測定したルシフェラーゼ発現の阻害の結果を示す。図13はルシフェラーゼ発現阻害の結果を示すが、図12のデータをパーセント値として表してある。これらの結果を見ると、選択した全てのRNAi作用媒介物について少なくとも50%阻害が達成されており、半分以上のプラスミドは80%より大きくルシフェラーゼ発現を阻害することが注目される
図14はHCVの5'領域中の異なる100bp部分を標的とする4つの異なるRNAi作用媒介物(5'-1、5'-2、5'-3および5'-4)をテストして行った実験結果の再現性を示す。再現性はテストした各作用因子について極めて優れていたことが注目される。
図16は、HCVの5'領域中の異なる100bp部分を標的とする2つの異なるRNAi作用媒介物(5'-1および5'-3)、HCVの3'領域中の異なる100bp部分を標的とする5つの異なるRNAi作用媒介物(3'-1、3'-2、3'-3、3'-4および3'-5)、およびHCVのオープンリーディングフレーム内の100bpの部分を標的とする一つのRNAi(C-3)について、トランスフェクション後44時間および72時間におけるルシフェラーゼ発現のパーセント阻害の変化を示す。阻害は、感染後72時間で44時間のレベルの約10%以内に維持される。
図18は、ルシフェラーゼ-HCV融合プラスミド中のHCVゲノム内の異なる領域を標的とする種々のRNAi作用媒介物で処理したルシフェラーゼ阻害結果を示す。ルシフェラーゼ活性はRNAi作用媒介物のHuh7細胞へのトランスフェクション後48時間で測定した。このデータからRNAi作用媒介物はHCVゲノムの全ての領域を効率的に標的とすることができ、ルシフェラーゼレポーターシグナルを強く阻害することが分かる。
HCV複製の個々の過程の多くは理解されているが、最近までこのウイルス生活環を展開できる組織培養系がなく、このウイルスの研究を困難にしていた。しかしながら、in vitroレプリコン系が開発された(例えば、Riceらの米国特許第5,585,258号;第6,427,180号および第6,127,116号参照)。レプリコンはHCVゲノムRNAの自律複製部分を含み、選抜および複製確認のためのマーカー遺伝子を含み得る。HCV-RNA構築物を連続増殖を支持し得る細胞株にトランスフェクションする。感染サイクル工程に続いて、RNAは細胞内装置によって翻訳され、ゲノムの複製に必要な適切なウイルスタンパク質および存在する場合には選抜マーカーの両方を生成する。完全長およびサブゲノムレプリコンが作製されており、機能することが示されているが、非構造タンパク質だけが絶対的である。このRNAの自律的に複製する性質は構造遺伝子の発現とは独立に維持される。完全長HCVゲノムを発現するレプリコン中に存在する場合であっても、コアタンパク質およびエンベロープタンパク質はゲノムを感染性粒子へ効率的にパッケージングすることができず、従って、このウイルスのパッケージング、放出、再侵入過程を研究するためのモデル系が存在しない。そうであっても、レプリコンはHCVが利用する生物学と装置の一部を再形成することができる。
siRNAがゲノムRNAの複製を阻害する能力はルシフェラーゼ-HCV融合レプリコンによって形質転換された細胞株におけるレニラルシフェラーゼ発現を測定することによってテストする。対応する配列が無いので5つのsiRNAはサブゲノム複製系でテストすることができず、非特異的対照としてこのテストに含めた。これらのルシフェラーゼ-HCVレプリコンの模式図は図8Bと8Cに示した。細胞を96ウェルプレートに播種した:24時間のインキュベーション後、HCVレプリコン活性を阻害することが知られている(Blightら、Science. 290:1972-72 (2000))インターフェロンα2B(IFN)を特定のウェルに100ユニット/mlの濃度で添加した。さらに48時間のインキュベーション後、培地を捨て、細胞抽出物をin situで作製し、ルシフェラーゼ活性を測定した。ルシフェラーゼ活性は正確にルシフェラーゼmRNAに対応していた(データ示さず)。RNAi作用媒介物のテストにおいて、ルシフェラーゼ-HCVレプリコンを含む29Σ細胞(図8Bに示した)をHCVゲノム中の種々の領域を標的とするRNAi作用媒介物でトランスフェクションした。細胞を48時間後に集め、抽出物を作製し、ルシフェラーゼ活性の相対レベルを評価した。図19はルシフェラーゼ-HCVレプリコンの種々の領域に対するsiRNAによるルシフェラーゼ阻害の結果を示す。コード領域C-1からC-5に対するRNAi作用媒介物はルシフェラーゼ-HCVレプリコン中に標的を有さず、さらなる非特異的対照として機能する。再度、HCVゲノムの全ての領域中の標的はsiRNA作用因子の効果的な阻害部位として作用することができる。
3種のRNAi作用媒介物の効果が確認され、各々対応するshRNAに対するこれらのコード配列を長い、相補的な自己アニーリングオリゴヌクレオチドから作製し、三重プロモーターAAVベクターの個々の部位にクローニングする。次にこの構築物を本明細書に記載の方法に従って、肝臓組織の高いトランスダクション効率を生じさせる系を用いてウイルス粒子へパッケージングする。この三重プロモーターカセットの各プロモーター/RNA/ターミネーター構成要素の全長は短い(〜400ヌクレオチド);3つのプロモーター/RNA/ターミネーター構成要素を一緒に連結して、長さ1200〜1300ヌクレオチドの配列が生じ、これは自己相補性AAVのサイズ制限の上限よりはるかに小さい。
これらの粒子の阻害活性を前記レプリコンを保持する細胞株でテストする。3種の無関係のshRNA種を発現する三重プロモーター構築物の作製はネガティブコントロールとして役に立つ。shRNA配列の効力は上述した解析技術によって調べることができる。
三重プロモーター発現構築物の構築には、個々のshRNAを豊富と言えるレベルで発現を駆動する3つの独立のプロモーター配列およびターミネータ配列が含まれる。プロモーター素片の繰り返しは組込み発現カセットの組換え事象を生じやすい状態にするかもしれない;従って、3つの個別のプロモーターおよびターミネーターを同定し、有効であると確認する。核内小RNAおよびトランスファーRNAの合成はRNAポリメラーゼIII(pol III)特異的プロモーターの制御下にpol IIIによって指令される。これらの制御配列素片によって指令される転写物は相対的に非常に豊富なので、U6およびH1遺伝子由来のプロモーターを含めて、pol IIIプロモーターをshRNAの発現を駆動するために使用する(例えば、DomitrovichとKunkel, Nucl.Acids Res. 31(9):2344-52 (2003);Bodenら、Nucl. Acids Res. 31(17):5033-38 (2003a);および、Kawasakiら、Nucleic Acids Res. 31(2): 700-7 (2003)参照)。
最初に、pol III特異的配列の相対的なプロモーターの強さの評価を単一の個々のプロモーターを含むベクターで行った(図7に示した)。各プロモーター構築物はルシフェラーゼ活性を機能阻害することが示されているshRNA(Elbashirら、Nature. 411:494-498 (2001a))の発現を駆動する。shRNAの発現のためにU6プロモーターの成功裡の使用を示す豊富なデータがあるので、他のプロモーターの相対的強さを評価するための標準としてこのプロモーターを使用する。テストしたプロモーターの大部分は極めて短く、ほとんどは長さ200-300ヌクレオチドである。長い、重複するオリゴヌクレオチドをこのプロモーターおよびターミネーターをde novoでアッセンブルするために使用し、これらをshRNAを挟むマルチクローニング部位へクローン化した。このプロモーターはそのプロモーターが得られた遺伝子の下流に通常存在する終結シグナルと対になっている。
適切なプロモーターおよびターミネーター対が同定されたなら、最終的な三重プロモーターRNAi発現カセットを設計する。3つの全てのプロモーターを直列配置にする、あるいは時計回りおよび反時計回りに配置すること(すなわち、カセットDNAのトトップおよびボトム鎖から転写される)、あるいはそれらの任意の変化型を含めて最終ベクターのいくつかの設計をテストする。これらの3つの配置は図3A、3Bおよび3Cに示してある。
以下のRNA Pol IIIクラス3プロモーター:U6-1、U6-8、H1 ロング、ヒトY4、ヒトY5を選択し、合成して単一またはマルチプロモーター構築物へクローン化した。次にルシフェラーゼ特異的shRNAを単一プロモーター構築物の下流または三重プロモーター構築物の一つのプロモーターの下流にクローン化した(表4)。
全てのプロモーターは、図3C型の構築物がHuh7細胞において(17A)、図3B型の構築物が293細胞において(17B)、いずれも同様に活性であることが示された。阻害特性は単一プロモーター状況でもマルチプロモーター状況でも同様であったことが分かる。これらのデータはshRNAの阻害は三重プロモーター環境において、並びにHuh7細胞および293細胞においても同等であることを示す。
以下のプロモーターを有する図3Cに示した型の三重プロモーターカセットを作製した:位置AにU6-9、位置BにU6-1、位置CにU6-8。これらのプロモーターは、HCVゲノムの種々の部分を標的とするshRNA配列の転写物を駆動するか、または「空」配置においてはプロモーターのリードスルーを防止するためその後にT列が続く。対照として用いた単一プロモーター/shRNA構築物はU6-1プロモーターを用いて構築した。単一または三重プロモーター構築物を種々のHCV標的領域を含むルシフェラーゼ-HCVレポータープラスミドと共に同時トランスフェクションした。図21は、HCVゲノム中の異なる領域を標的とする単一またはマルチプロモーター構築物およびHCVゲノム内の標的領域からの配列を含む3種のルシフェラーゼ-HCV融合プラスミドの一つで同時トランスフェクションした後のルシフェラーゼ阻害の結果を示す。Huh7細胞へ同時トランスフェクションした72時間後にルシフェラーゼ活性を測定した。図21の一番上のグラフでHCVのC-12領域に特異的なshRNAがHCVのC-12コード領域を含むルシフェラーゼレポータープラスミドに対して適切な阻害活性を示すことが分かる。HCVの他の領域に特異的なshRNAが単独でまたは本発明のマルチプロモーターカセットの一部として発現された場合には、非特異的な阻害は観察されなかった。ルシフェラーゼ-HCVレポータープラスミドがHCVのコード領域C-9からの配列を含む場合である、真ん中のグラフでも同様な結果が見られる。この場合、単一プロモーターまたは三重プロモーターカセットから発現されたC-9領域に特異的なshRNAは、テストしたshRNA作用因子中最も強い阻害活性を有していた。下のグラフは、HCVの5'6領域を含むレポータープラスミドおよび単一または三重プロモーター構築物による同時トランスフェクションから得られたルシフェラーゼ阻害を示す。単一またはマルチプロモーター構築物のいずれにおいても、最も強い阻害は5'6標的に対して特異的なshRNAを含む構築物から得られることが分かる。本発明の三重プロモーター構築物は特異的な遺伝子標的を効率的に抑制するために機能する。
本発明のマルチプロモーター構築物のin vivo評価をマウス肝臓を図3Cに示した型のマルチプロモーター/shRNAプラスミドDNAおよび適切なホタルルシフェラーゼ-HCV融合レポータープラスミドとをハイドロダイナミック尾静脈注入法を用いて同時トランスフェクションすることによって評価した。ここで用いたマルチプロモーター/shRNAプラスミドはHCVのコーディング9、コーディング12および5'8領域を標的とするshRNA種の発現を制御する。ネガティブコントロールマウスにはレポーター構築物および無関係のshRNAを注入した。さらに、レニラルシフェラーゼタンパク質を発現するプラスミドをマウスに注入した。このタンパク質はマウス肝臓のトランスフェクション効率を正規化するために使用した。注入の48時間後、動物を犠牲にし、肝臓を集めた。肝臓溶解物をホタルルシフェラーゼ活性及びレニラルシフェラーゼ活性についてプロメガルシフェラーゼキットを用いてアッセイした。ヘアピン構築物からのshRNA発現によって誘導された、ネガティブコントロールに対する阻害のレベルを評価した。表6に示した結果は、本発明の三重プロモーター構築物がin vivoでレポーターシグナルを効率的に阻害することを示している。
AAV-デリバリーされるHCVに対するshRNA発現構築物の効力をテストするための理想的な小動物モデルが存在しない。しかしながら、AAV発現RNAi構築物の代替えモデル系におけるテストを肝臓におけるウイルス複製の阻害の程度を評価するために利用することができる。そのようなモデルではデリバリーするshRNAの配列組成は当然に異なるが、AAV三重プロモーター発現ベクターおよびパッケージング構成要素を含むこの系の残りは変わらずに維持される。B型肝炎ウイルス(HBV)のためのモデル系を利用する。HBVを標的とするための三重プロモーターAAV発現構築物に含めるべきshRNA配列の選択はこれまでに公表されているshRNA配列の効力に基づいて選ぶ(McCaffreyら、Nature Biotech. 21(6): 639-644 (2003);Yingら、Biochem. Biophys. Res. Commun. 309 (2): 482-484 (2003);Kleinら、Gastroent. 125(1): 9-18 (2003);および、Shlomaiら、Hepatology 37(4): 764-70 (2003))。次に、3種のHBV-特異的shRNAを駆動する三重プロモーターを有する適切なAAV発現構築物をここに記載の方法に従ってウイルス粒子にパッケージングする。
HBV複製の確立に続いて、HBV shRNAをコードする三重プロモーター構築物をパッケージングしたAAVウイルス粒子を未静脈注射または肝門脈注射を用いてマウスに導入する。HBVと無関係の3種のshRNAをコードするAAV発現構築物を保持するAAVウイルス粒子はネガティブコントロールとして使用する。実験の終わりに、血清サンプルをHBsAgおよびHBcAgタンパク質の量のダウンレギュレーションについて調べる。あるいは、またはそれに加えて、肝臓組織をHBV RNAの相対レベルについてQ-PCRによって評価する。全体的肝臓毒性はアラニンアミノトランスフェラーゼ、アスパルテートアミノトランスフェラーゼおよび腫瘍壊死因子αについてELISAにより血清を調べることによって評価する。
本明細書中に引用した全ての参考文献は本発明の理解を助けるためであり、何らの制限無くその全体が取り込まれるものとする。
Claims (11)
- 少なくとも3つのプロモーター/RNAi/ターミネーター構成要素を含むマルチプロモーター発現カセットを含む遺伝子構築物であって、前記各プロモーター/RNAi/ターミネーター構成要素がプロモ−ター、ターミネーターおよび前記プロモーターおよびターミネーターに機能的に連結されたRNAi種をコードする配列含み、前記RNAi種の少なくとも一つが配列番号22によってコードされている、前記遺伝子構築物。
- RNAi種の少なくとも一つが配列番号6または配列番号19によってコードされている、請求項1記載の遺伝子構築物。
- RNAi種が配列番号6、配列番号19および配列番号22によってコードされている、請求項1記載の遺伝子構築物。
- プロモーター/RNAi/ターミネーター構成要素中のターミネーターのうちの2つの配列が互いに異なっている、請求項1〜3のいずれか1項記載の遺伝子構築物。
- プロモーター/RNAi/ターミネーター構成要素中のプロモーターのうちの2つの配列が互いに異なっている、請求項1〜4のいずれか1項記載の遺伝子構築物。
- 3つ以上のRNAi種が変種間で単一ヌクレオチド配列多型(SNPs)を有する核酸配列を標的とし、前記RNAi種の各々が前記変種の一以上のサブセットを標的とし得る、請求項1〜5のいずれか1項記載の遺伝子構築物。
- RNAi種の配列が、核酸配列の一以上の変種を標的とする、請求項1〜5のいずれか1項記載の遺伝子構築物。
- RNAi種が標的核酸配列に基づき、さらにRNAi治療に抵抗するように生じた点変異を有する配列に基づく、請求項1記載の遺伝子構築物。
- 細胞中で発現している1以上のC型肝炎ウイルス核酸標的を阻害するための組成物であって、請求項1〜8のいずれか1項記載の遺伝子構築物を活性成分として含み、各RNAi種が前記核酸標的の配列または前記核酸標的の変種の配列と実質的に同一である、前記組成物。
- 細胞中で発現している1以上のC型肝炎ウイルス核酸標的の発現を改変するための医薬の製造のための請求項1〜8のいずれか1項記載の遺伝子構築物の使用であって、
請求項1〜8のいずれか1項記載の遺伝子構築物をウイルス粒子にパッケージングすること、
を含む、前記使用。 - 細胞中で発現している1以上のC型肝炎ウイルス核酸標的の発現を改変するための医薬の製造のための請求項1〜8のいずれか1項記載の遺伝子構築物の使用であって、
請求項1〜8のいずれか1項記載の遺伝子構築物を非ウイルス粒子にパッケージングすること、
を含む、前記使用。
Applications Claiming Priority (5)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US55050404P | 2004-03-05 | 2004-03-05 | |
US60/550,504 | 2004-03-05 | ||
US55392004P | 2004-03-17 | 2004-03-17 | |
US60/553,920 | 2004-03-17 | ||
PCT/US2005/007447 WO2005087926A2 (en) | 2004-03-05 | 2005-03-04 | Multiple promoter expression cassettes for simultaneous delivery of rnai agents |
Publications (3)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JP2007527244A JP2007527244A (ja) | 2007-09-27 |
JP2007527244A5 JP2007527244A5 (ja) | 2011-06-02 |
JP4763681B2 true JP4763681B2 (ja) | 2011-08-31 |
Family
ID=34963938
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2007502094A Expired - Fee Related JP4763681B2 (ja) | 2004-03-05 | 2005-03-04 | RNAi作用媒介物の同時デリバリーのためのマルチプロモーター発現カセット |
Country Status (13)
Country | Link |
---|---|
US (3) | US7727970B2 (ja) |
EP (2) | EP1725660B1 (ja) |
JP (1) | JP4763681B2 (ja) |
KR (2) | KR101337579B1 (ja) |
CN (1) | CN103060324B (ja) |
AT (1) | ATE508190T1 (ja) |
AU (1) | AU2005222084B2 (ja) |
CA (1) | CA2558771C (ja) |
DE (1) | DE602005027820D1 (ja) |
DK (1) | DK1725660T3 (ja) |
IL (1) | IL177862A (ja) |
NZ (1) | NZ550284A (ja) |
WO (1) | WO2005087926A2 (ja) |
Families Citing this family (76)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2005087926A2 (en) * | 2004-03-05 | 2005-09-22 | Benitec, Inc. | Multiple promoter expression cassettes for simultaneous delivery of rnai agents |
EP1797185B1 (en) | 2004-09-24 | 2011-04-13 | Alnylam Pharmaceuticals, Inc. | Targeting opposite strand replication intermediates of single-stranded viruses by rnai |
EP2189469B1 (en) * | 2004-11-18 | 2015-09-16 | The Board Of Trustees Of The University Of Illinois | Multicistronic siRNA constructs to inhibit tumors |
CN101180394B (zh) * | 2005-02-03 | 2013-01-09 | 贝尼泰克有限公司 | RNAi表达构建体 |
CA2606002A1 (en) * | 2005-04-28 | 2006-11-02 | Benitec Limited | Multiple-rnai expression cassettes for simultaneous delivery of rnai agents related to heterozygotic expression patterns |
US7452696B2 (en) * | 2006-10-27 | 2008-11-18 | National Taiwan University | Recombinant plasmid and method for expressing hepatitis B viral antigens and virions in vivo |
WO2008069940A2 (en) * | 2006-12-06 | 2008-06-12 | Albert Einstein College Of Medicine Of Yeshiva University | Multi-microrna methods and compositions |
WO2008134720A2 (en) * | 2007-04-30 | 2008-11-06 | Medtronic, Inc. | Inert dna sequences for efficient viral packaging and methods of use |
WO2009002918A2 (en) | 2007-06-22 | 2008-12-31 | Nucleonics, Inc. | Hepatitis c dsrna effector molecules, expression constructs, compositions, and methods of use |
US9217155B2 (en) | 2008-05-28 | 2015-12-22 | University Of Massachusetts | Isolation of novel AAV'S and uses thereof |
US20120034157A1 (en) * | 2010-08-03 | 2012-02-09 | Searete Llc, A Limited Liability Corporation Of The State Of Delaware | Artificial cells |
US20100041133A1 (en) * | 2008-08-13 | 2010-02-18 | Searete Llc, A Limited Liability Corporation Of The State Of Delaware | Biological targeting compositions and methods of using the same |
US20100040546A1 (en) * | 2008-08-13 | 2010-02-18 | Searete Llc, A Limited Liability Corporation Of The State Of Delaware | Biological targeting compositions and methods of using the same |
US20100042072A1 (en) * | 2008-08-13 | 2010-02-18 | Searete Llc, A Limited Liability Corporation Of The State Of Delaware | Biological targeting compositions and methods of using the same |
WO2010138263A2 (en) | 2009-05-28 | 2010-12-02 | University Of Massachusetts | Novel aav 's and uses thereof |
WO2011133874A1 (en) * | 2010-04-23 | 2011-10-27 | University Of Massachusetts | Multicistronic expression constructs |
EP2826860B1 (en) | 2010-04-23 | 2018-08-22 | University of Massachusetts | CNS targeting AAV vectors and methods of use thereof |
EP2561075B1 (en) | 2010-04-23 | 2018-06-27 | University of Massachusetts | Aav-based treatment of cholesterol-related disorders |
CA2853613C (en) | 2010-10-28 | 2020-03-24 | Benitec Biopharma Limited | Hbv treatment |
KR101554678B1 (ko) * | 2012-10-19 | 2015-09-21 | 영남대학교 산학협력단 | 식물 바이러스를 이용한 식물체 형질전환을 위한 유전자 전달 시스템 및 이의 용도 |
MX2015008697A (es) | 2013-01-08 | 2016-08-04 | Benitec Biopharma Ltd | Tratamiento contra la degeneración macular relacionada con la edad. |
AU2015231294B2 (en) | 2014-03-18 | 2020-10-29 | University Of Massachusetts | rAAV-based compositions and methods for treating amyotrophic lateral sclerosis |
GB201405834D0 (en) * | 2014-04-01 | 2014-05-14 | Univ London Queen Mary | Oncolytic virus |
WO2015187825A2 (en) | 2014-06-03 | 2015-12-10 | University Of Massachusetts | Compositions and methods for modulating dysferlin expression |
US10711270B2 (en) | 2014-10-03 | 2020-07-14 | University Of Massachusetts | High efficiency library-identified AAV vectors |
US10370432B2 (en) | 2014-10-03 | 2019-08-06 | University Of Massachusetts | Heterologous targeting peptide grafted AAVS |
CN107073051B (zh) | 2014-10-21 | 2021-08-24 | 马萨诸塞大学 | 重组aav变体及其用途 |
CN107109407A (zh) | 2014-11-14 | 2017-08-29 | 沃雅戈治疗公司 | 治疗肌萎缩性侧索硬化(als)的组合物和方法 |
SG11201703419UA (en) | 2014-11-14 | 2017-05-30 | Voyager Therapeutics Inc | Modulatory polynucleotides |
EP3221445B1 (en) | 2014-11-20 | 2021-07-14 | The Regents of The University of California | Compositions and methods related to hematologic recovery |
EP3256170B1 (en) | 2015-02-13 | 2020-09-23 | University of Massachusetts | Compositions and methods for transient delivery of nucleases |
EP3285780A4 (en) | 2015-04-24 | 2018-12-19 | University of Massachusetts | Modified aav constructions and uses thereof |
WO2017070525A1 (en) | 2015-10-22 | 2017-04-27 | University Of Massachusetts | Methods and compositions for treating metabolic imbalance in neurodegenerative disease |
EP3364996B1 (en) | 2015-10-22 | 2021-08-25 | University of Massachusetts | Prostate-targeting adeno-associated virus serotype vectors |
KR20180104075A (ko) | 2016-02-02 | 2018-09-19 | 올릭스 주식회사 | IL4Rα, TRPA1, 또는 F2RL1을 표적화하는 RNA 복합체를 사용한 아토피 피부염 및 천식의 치료 |
WO2017136536A1 (en) | 2016-02-02 | 2017-08-10 | University Of Massachusetts | Method to enhance the efficiency of systemic aav gene delivery to the central nervous system |
WO2017139643A1 (en) | 2016-02-12 | 2017-08-17 | University Of Massachusetts | Anti-angiogenic mirna therapeutics for inhibiting corneal neovascularization |
EP3440210A4 (en) | 2016-04-05 | 2019-11-27 | University of Massachusetts | COMPOSITIONS AND METHODS FOR SELECTIVE INHIBITION OF EXPRESSION OF GRAINHEAD PROTEIN |
US11413356B2 (en) | 2016-04-15 | 2022-08-16 | University Of Massachusetts | Methods and compositions for treating metabolic imbalance |
CN110214187B (zh) | 2016-05-18 | 2024-01-30 | 沃雅戈治疗公司 | 调节性多核苷酸 |
WO2017218852A1 (en) | 2016-06-15 | 2017-12-21 | University Of Massachusetts | Recombinant adeno-associated viruses for delivering gene editing molecules to embryonic cells |
WO2018017814A1 (en) | 2016-07-20 | 2018-01-25 | President And Fellows Of Harvard College | Peptidoglycan glycosyltransferase inhibitors of sed proteins for treating bacterial infections |
WO2018053142A2 (en) | 2016-09-14 | 2018-03-22 | President And Fellows Of Harvard College | Methods and compositions for modulating erythropoiesis |
US10457940B2 (en) | 2016-09-22 | 2019-10-29 | University Of Massachusetts | AAV treatment of Huntington's disease |
WO2018071831A1 (en) | 2016-10-13 | 2018-04-19 | University Of Massachusetts | Aav capsid designs |
WO2018112033A1 (en) | 2016-12-13 | 2018-06-21 | President And Fellows Of Harvard College | Methods and compositions for targeting tumor-infiltrating tregs |
WO2018112365A2 (en) | 2016-12-16 | 2018-06-21 | Evelo Biosciences, Inc. | Methods of treating colorectal cancer and melanoma using parabacteroides goldsteinii |
WO2018112360A1 (en) | 2016-12-16 | 2018-06-21 | Evelo Biosciences, Inc. | Combination therapies for treating cancer |
WO2018112363A1 (en) | 2016-12-16 | 2018-06-21 | Evelo Biosciences, Inc. | Methods of treating cancer using parabacteroides |
WO2018112364A1 (en) | 2016-12-16 | 2018-06-21 | Evelo Biosciences, Inc. | Combination therapies for treating melanoma |
EP3570856A2 (en) | 2017-01-18 | 2019-11-27 | Evelo Biosciences, Inc. | Methods of treating cancer |
EP3570857A1 (en) | 2017-01-18 | 2019-11-27 | Evelo Biosciences, Inc. | Methods of treating cancer |
EP3618839A4 (en) | 2017-05-05 | 2021-06-09 | Voyager Therapeutics, Inc. | COMPOSITIONS AND TREATMENT METHODS FOR AMYOTROPHIC LATERAL SCLEROSIS (ALS) |
EP3622073A4 (en) | 2017-05-09 | 2021-01-06 | University of Massachusetts | METHOD FOR TREATMENT OF AMYOTROPHIC LATERAL SCLEROSIS (ALS) |
TW201920648A (zh) | 2017-08-29 | 2019-06-01 | 美商艾弗洛生物科技股份有限公司 | 使用布勞特氏(blautia)菌株治療癌症 |
JP7397488B2 (ja) | 2017-09-22 | 2023-12-13 | ユニバーシティ オブ マサチューセッツ | Sod1二重発現ベクターおよびその使用 |
WO2019079242A1 (en) | 2017-10-16 | 2019-04-25 | Voyager Therapeutics, Inc. | TREATMENT OF AMYOTROPHIC LATERAL SCLEROSIS (ALS) |
AU2018352236A1 (en) | 2017-10-16 | 2020-04-23 | The Curators Of The University Of Missouri | Treatment of amyotrophic lateral sclerosis (ALS) |
WO2019169138A1 (en) | 2018-02-28 | 2019-09-06 | Evelo Biosciences, Inc. | Compositions and methods for treating cancer using paraclostridium benzoelyticum |
WO2019169143A1 (en) | 2018-02-28 | 2019-09-06 | Evelo Biosciences, Inc. | Compositions and methods for treating cancer using turicibacter sanguinis |
WO2019169168A1 (en) | 2018-02-28 | 2019-09-06 | Evelo Biosciences, Inc. | Compositions and methods for treating cancer using agathobaculum |
WO2019169160A1 (en) | 2018-02-28 | 2019-09-06 | Evelo Biosciences, Inc. | Compositions and methods for treating cancer using ruminococcus gnavus |
US20210113628A1 (en) | 2018-03-12 | 2021-04-22 | Sqz Biotechnologies Company | Intracellular delivery of biomolecules to modify immune response |
US20210047645A1 (en) * | 2018-05-08 | 2021-02-18 | Mayo Foundation For Medical Education And Research | Methods for treating ovarian cancer |
WO2020172229A1 (en) * | 2019-02-19 | 2020-08-27 | Board Of Regents, The University Of Texas System | Genetic targeting of cellular or neuronal sub-populations |
EP3938049A1 (en) | 2019-03-12 | 2022-01-19 | President and Fellows of Harvard College | Methods and compositions for treating cancer |
WO2020252257A1 (en) | 2019-06-12 | 2020-12-17 | President And Fellows Of Harvard College | Methods and compositions for modulation of an interspecies gut bacterial pathway for levodopa metabolism |
WO2021022110A1 (en) | 2019-08-01 | 2021-02-04 | Evelo Biosciences, Inc. | Inducing immune effects using bacteria of the genus bifidobacterium |
EP4088742A2 (en) | 2020-01-06 | 2022-11-16 | Seasun Therapeutics | Composition for preventing or treating macular degeneration, containing cell permeable nucleic acid complex as active ingredient |
JP2023515671A (ja) | 2020-03-04 | 2023-04-13 | リジェネロン・ファーマシューティカルズ・インコーポレイテッド | 免疫療法に対する腫瘍細胞の感作のための方法及び組成物 |
EP4157264A1 (en) | 2020-05-27 | 2023-04-05 | The Regents of the University of California | Compositions and methods for transdifferentiating cells |
WO2022056454A2 (en) | 2020-09-14 | 2022-03-17 | President And Fellows Of Harvard College | Methods and compositions for treating hpv-positive cancers |
WO2022060986A2 (en) | 2020-09-16 | 2022-03-24 | President And Fellows Of Harvard College | Methods of treating an individual that has failed an anti-pd-1/anti-pd-l1 therapy |
WO2023150181A1 (en) | 2022-02-01 | 2023-08-10 | President And Fellows Of Harvard College | Methods and compositions for treating cancer |
KR102632204B1 (ko) * | 2022-03-24 | 2024-02-02 | (주)셀레브레인 | 신규 재조합 벡터 및 이의 용도 |
WO2023182870A1 (ko) * | 2022-03-24 | 2023-09-28 | (주)셀레브레인 | 신규 재조합 벡터 및 이의 용도 |
Citations (7)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2003046186A1 (en) * | 2001-11-28 | 2003-06-05 | Toudai Tlo, Ltd. | siRNA EXPRESSION SYSTEM AND METHOD FOR PRODUCING FUNCTIONAL GENE KNOCK-DOWN CELLS USING THE SYSTEM |
WO2003070750A2 (en) * | 2002-02-20 | 2003-08-28 | Sirna Therapeutics, Inc | Rna interference mediated inhibition of hepatitis c virus |
WO2003076620A1 (en) * | 2002-03-14 | 2003-09-18 | Commonwealth Scientific And Industrial Research Organisation | Methods and means for monitoring and modulating gene silencing |
WO2003078629A1 (de) * | 2002-03-20 | 2003-09-25 | Basf Plant Science Gmbh | Konstrukte und verfahren zur regulation der genexpression |
WO2003079757A2 (en) * | 2002-03-20 | 2003-10-02 | Massachusetts Institute Of Technology | Hiv therapeutic |
WO2004000384A1 (en) * | 2002-06-19 | 2003-12-31 | Scimed Life Systems, Inc. | Implantable or insertable medical devices for controlled delivery of a therapeutic agent |
WO2004078974A1 (ja) * | 2003-01-24 | 2004-09-16 | Tokyo Metropolitan Organization For Medical Research | C型肝炎ウイルスの働きを阻害するオリゴリボヌクレオチドまたはペプチド核酸 |
Family Cites Families (19)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US6194140B1 (en) | 1990-04-04 | 2001-02-27 | Chiron Corporation | HCV NS3 protein fragments having helicase activity and improved solubility |
DE69133402T2 (de) | 1990-04-04 | 2004-11-11 | Chiron Corp. (N.D.Ges.D. Staates Delaware), Emeryville | Protease von hepatitis-c-virus |
US6127116A (en) | 1995-08-29 | 2000-10-03 | Washington University | Functional DNA clone for hepatitis C virus (HCV) and uses thereof |
US6218181B1 (en) | 1998-03-18 | 2001-04-17 | The Salk Institute For Biological Studies | Retroviral packaging cell line |
CZ295108B6 (cs) | 1998-03-20 | 2005-05-18 | Benitec Australia Ltd | Syntetický gen obsahující dispergovanou nebo cizorodou deoxyribonukleovou molekulu a genový konstrukt obsahující tento syntetický gen |
US6509323B1 (en) | 1998-07-01 | 2003-01-21 | California Institute Of Technology | Linear cyclodextrin copolymers |
EP1272630A2 (en) | 2000-03-16 | 2003-01-08 | Genetica, Inc. | Methods and compositions for rna interference |
WO2001083736A2 (en) | 2000-04-21 | 2001-11-08 | Boehringer Ingelheim (Canada) Ltd. | Internal de novo initiation sites of the hcv ns5b polymerase and use thereof |
JP2004532022A (ja) * | 2001-03-26 | 2004-10-21 | サーナ・セラピューティクス・インコーポレイテッド | B型肝炎ウイルスおよびc型肝炎ウイルスの複製のオリゴヌクレオチド媒介性阻害 |
US6693701B2 (en) * | 2001-05-29 | 2004-02-17 | Ibsen Photonics A/S | Method and apparatus for diffractive transfer of a mask grating |
AUPR644301A0 (en) * | 2001-07-17 | 2001-08-09 | Unisearch Limited | Method and composition for treatment of cancer |
WO2003016572A1 (en) * | 2001-08-17 | 2003-02-27 | Eli Lilly And Company | Oligonucleotide therapeutics for treating hepatitis c virus infections |
US7919309B2 (en) | 2001-09-13 | 2011-04-05 | California Institute Of Technology | Method for expression of small antiviral RNA molecules within a cell |
US20040053876A1 (en) | 2002-03-26 | 2004-03-18 | The Regents Of The University Of Michigan | siRNAs and uses therof |
AU2003261231A1 (en) * | 2002-07-26 | 2004-02-16 | Chiron Corporation | Modified small interfering rna molecules and methods of use |
AU2003268323A1 (en) | 2002-08-29 | 2004-03-19 | The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University | Circular nucleic acid vectors, and methods for making and using the same |
CN1276976C (zh) | 2003-10-30 | 2006-09-27 | 封江南 | 单一载体编码多个发夹结构小干扰性rna表达***及其构建方法 |
CN101068926B (zh) * | 2004-03-05 | 2013-01-02 | 贝尼泰克生物制药有限公司 | 用于RNAi试剂同时递送的多启动子表达盒及用途 |
WO2005087926A2 (en) | 2004-03-05 | 2005-09-22 | Benitec, Inc. | Multiple promoter expression cassettes for simultaneous delivery of rnai agents |
-
2005
- 2005-03-04 WO PCT/US2005/007447 patent/WO2005087926A2/en active Application Filing
- 2005-03-04 US US11/072,592 patent/US7727970B2/en not_active Expired - Fee Related
- 2005-03-04 CN CN201210556628.0A patent/CN103060324B/zh not_active Expired - Fee Related
- 2005-03-04 EP EP05727680A patent/EP1725660B1/en not_active Not-in-force
- 2005-03-04 EP EP11161216.4A patent/EP2363483A3/en not_active Withdrawn
- 2005-03-04 AT AT05727680T patent/ATE508190T1/de not_active IP Right Cessation
- 2005-03-04 AU AU2005222084A patent/AU2005222084B2/en not_active Ceased
- 2005-03-04 CA CA2558771A patent/CA2558771C/en not_active Expired - Fee Related
- 2005-03-04 JP JP2007502094A patent/JP4763681B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 2005-03-04 KR KR1020127000533A patent/KR101337579B1/ko not_active IP Right Cessation
- 2005-03-04 DE DE602005027820T patent/DE602005027820D1/de active Active
- 2005-03-04 KR KR1020067020986A patent/KR101246862B1/ko not_active IP Right Cessation
- 2005-03-04 NZ NZ550284A patent/NZ550284A/en unknown
- 2005-03-04 DK DK05727680.0T patent/DK1725660T3/da active
-
2006
- 2006-09-03 IL IL177862A patent/IL177862A/en not_active IP Right Cessation
-
2010
- 2010-03-12 US US12/723,466 patent/US8283461B2/en not_active Expired - Fee Related
-
2012
- 2012-09-26 US US13/627,644 patent/US8691967B2/en not_active Expired - Fee Related
Patent Citations (7)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2003046186A1 (en) * | 2001-11-28 | 2003-06-05 | Toudai Tlo, Ltd. | siRNA EXPRESSION SYSTEM AND METHOD FOR PRODUCING FUNCTIONAL GENE KNOCK-DOWN CELLS USING THE SYSTEM |
WO2003070750A2 (en) * | 2002-02-20 | 2003-08-28 | Sirna Therapeutics, Inc | Rna interference mediated inhibition of hepatitis c virus |
WO2003076620A1 (en) * | 2002-03-14 | 2003-09-18 | Commonwealth Scientific And Industrial Research Organisation | Methods and means for monitoring and modulating gene silencing |
WO2003078629A1 (de) * | 2002-03-20 | 2003-09-25 | Basf Plant Science Gmbh | Konstrukte und verfahren zur regulation der genexpression |
WO2003079757A2 (en) * | 2002-03-20 | 2003-10-02 | Massachusetts Institute Of Technology | Hiv therapeutic |
WO2004000384A1 (en) * | 2002-06-19 | 2003-12-31 | Scimed Life Systems, Inc. | Implantable or insertable medical devices for controlled delivery of a therapeutic agent |
WO2004078974A1 (ja) * | 2003-01-24 | 2004-09-16 | Tokyo Metropolitan Organization For Medical Research | C型肝炎ウイルスの働きを阻害するオリゴリボヌクレオチドまたはペプチド核酸 |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
AU2005222084A1 (en) | 2005-09-22 |
JP2007527244A (ja) | 2007-09-27 |
CN103060324B (zh) | 2015-04-01 |
KR101246862B1 (ko) | 2013-03-27 |
EP1725660A2 (en) | 2006-11-29 |
EP2363483A2 (en) | 2011-09-07 |
KR101337579B1 (ko) | 2013-12-06 |
WO2005087926A2 (en) | 2005-09-22 |
IL177862A (en) | 2014-05-28 |
IL177862A0 (en) | 2006-12-31 |
ATE508190T1 (de) | 2011-05-15 |
CA2558771C (en) | 2013-01-08 |
AU2005222084B2 (en) | 2010-04-22 |
CA2558771A1 (en) | 2005-09-22 |
CN103060324A (zh) | 2013-04-24 |
WO2005087926A3 (en) | 2006-03-16 |
EP1725660B1 (en) | 2011-05-04 |
US20110003378A1 (en) | 2011-01-06 |
US20130171726A1 (en) | 2013-07-04 |
KR20070063470A (ko) | 2007-06-19 |
US8691967B2 (en) | 2014-04-08 |
US7727970B2 (en) | 2010-06-01 |
EP2363483A3 (en) | 2014-07-16 |
US8283461B2 (en) | 2012-10-09 |
KR20120008094A (ko) | 2012-01-25 |
DE602005027820D1 (de) | 2011-06-16 |
NZ550284A (en) | 2009-04-30 |
DK1725660T3 (da) | 2011-08-29 |
US20050197313A1 (en) | 2005-09-08 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
JP4763681B2 (ja) | RNAi作用媒介物の同時デリバリーのためのマルチプロモーター発現カセット | |
US8076471B2 (en) | RNAi expression constructs | |
Schubert et al. | Maintaining inhibition: siRNA double expression vectors against coxsackieviral RNAs | |
US20110117608A1 (en) | Double-stranded nucleic acid | |
JP2008510489A (ja) | 多重rnaポリメラーゼiiiプロモーター発現構築物 | |
JP2008526229A (ja) | 幹細胞の維持のためのRNAi剤 | |
Rothe et al. | Rapid construction of adeno-associated virus vectors expressing multiple short hairpin RNAs with high antiviral activity against echovirus 30 | |
JP4228071B2 (ja) | C型肝炎ウイルスのタンパク質合成及び/又はc型肝炎ウイルスの複製を抑制することができる二本鎖オリゴヌクレオチド | |
WO2006090906A1 (ja) | RNAi耐性ウイルス株を克服する新手法 | |
ES2366126T3 (es) | CASSETTE DE EXPRESIÓN DE PROMOTOR MÚLTIPLE PARA EL SUMINISTRO SIMULTÁNEO DE AGENTES ARNi. | |
AU2004243347B2 (en) | Double-stranded nucleic acid |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20080226 |
|
A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20080226 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20100223 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20110117 |
|
A524 | Written submission of copy of amendment under article 19 pct |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A524 Effective date: 20110414 |
|
A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20110516 |
|
A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 |
|
A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20110609 |
|
FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20140617 Year of fee payment: 3 |
|
R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
LAPS | Cancellation because of no payment of annual fees |