ES2875965T3 - Aceite microbiano que contiene ácido dihomo-gamma-linolénico y biomasa microbiana que contiene ácido dihomo-gamma-linolénico - Google Patents

Aceite microbiano que contiene ácido dihomo-gamma-linolénico y biomasa microbiana que contiene ácido dihomo-gamma-linolénico Download PDF

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Abstract

Un aceite microbiano que es un aceite crudo obtenido mediante el cultivo de un microbio del género Mortierella en un medio de cultivo y recuperando lípidos de la biomasa, comprendiendo el aceite ácido dihomo-γ-linolénico como ácido graso constituyente y que tiene un contenido de triglicéridos mayor o igual al 70 % en peso y una relación en peso de ácido araquidónico con respecto a ácido dihomo-γ-linolénico (ácido araquidónico/ácido dihomo-γ-linolénico) de menos de 1/15.

Description

DESCRIPCIÓN
Aceite microbiano que contiene ácido dihomo-Y-linolénico y biomasa microbiana que contiene ácido dihomo-Y-linolénico
Campo técnico
La presente invención se refiere a un aceite microbiano que contiene ácido dihomo-Y-linolénico (también denominado en lo sucesivo DGLA), una biomasa microbiana que contiene ácido dihomo-Y-linolénico, y a métodos de preparación y usos del mismo.
Técnica antecedente
DGLA (ácido 8,11,14-eicosatrienoico) es uno de los ácidos grasos constituyentes en aceites de pescado, algas marinas y otros aceites. Se sabe que DGLA se produce como precursor del ácido araquidónico (también denominado en lo sucesivo ARA) en microbios tales como Mortierella alpina. Sin embargo, solo hay una pequeña cantidad de generación de DGLA en microbios que contienen triglicéridos, diglicéridos, monoglicéridos, fosfolípidos y esteroles como componentes lipídicos. DGLA y ARA son ácidos grasos que tienen características químicas similares. Por tanto, la separación de DGLA de ARA es difícil.
Se ha propuesto una tecnología para disminuir la cantidad generada de ARA en el microbio con el fin de producir DGLA de manera eficiente.
Por ejemplo, solicitud de patente japonesa abierta al público (JP-A) No. H5-091887 describe un método para producir DGLA o un lípido que contiene DGLA, comprendiendo el método cultivar un microbio que tiene la capacidad de producir ácido araquidónico pero que tiene una actividad de desaturación de A 5 reducida o perdida, para producir DGLA o lípidos que contienen DGLA, y recuperar el DGLA o los lípidos que contienen DGLA. El documento JP-A No. H5-091887 (US2001/021522A) también divulga que un microbio tal como Mortierella alpina que tiene una capacidad para producir ácido araquidónico y que tiene una actividad de desaturación de A 5 reducida o perdida se cultiva en presencia de un inhibidor de desaturasa de A 5, por ejemplo sesamina para producir lípidos que contienen una alta proporción de DGLA.
Además, el documento WO 2005/083101 divulga un método de producción de fosfolípidos que contiene un ácido graso poliinsaturado de cadena larga tal como ácido araquidónico y DGLA como componente constituyente. El método comprende etapas de extraer fosfolípidos de células desgrasadas obtenidas extrayendo aceites/grasas que contienen triglicéridos de células de un microbio productor de lípidos, microbio que produce un lípido que contiene un ácido graso poliinsaturado de cadena larga como componente constituyente.
A pesar de estas divulgaciones anteriores, la producción comercial de aceite microbiano rico en DGLA apenas ha tenido lugar hasta ahora, debido a las dificultades técnicas para lograr un producto de calidad satisfactoria y útil.
Sumario de la invención
Problemas que debe resolver la invención
Existe una mayor demanda de aceites que contienen DGLA de mayor pureza, y las tecnologías antes mencionadas han sido insuficientes para tal demanda.
Un objeto de la presente invención es proporcionar aceite microbiano y una biomasa microbiana que se pueda usar para obtener de manera eficiente un aceite que contenga ácido dihomo-Y-linolénico que tenga un contenido de ácido araquidónico menor que el del aceite obtenido por el método convencional. y proporcionar los métodos correspondientes de preparación y uso de los mismos.
Medios para resolver los problemas
La presente invención proporciona lo siguiente.
Un primer aspecto es un aceite microbiano de acuerdo con la reivindicación 1 que es un aceite crudo obtenido mediante el cultivo de un microbio del género Mortierella en un medio de cultivo y recuperando lípidos de la biomasa, comprendiendo el aceite ácido dihomo-Y-linolénico como ácido graso constituyente y que tiene un contenido de triglicéridos mayor o igual al 70 % en peso y una relación en peso de ácido araquidónico con respecto a dihomo ácido -Y-linolénico (ácido araquidónico/ácido dihomo-Y-linolénico) de menos de 1/15.
La relación en peso de ácido araquidónico/ácido dihomo-Y-linolénico puede ser menor o igual a 1/20.
De manera deseable, el aceite microbiano crudo tiene un contenido de triglicéridos mayor o igual al 90 % en peso. Puede contener fosfolípidos, por ejemplo de 0,1 % a 10 % en peso.
El contenido de ácido graso saturado en el aceite es deseablemente no más del 40 % en peso.
Un segundo aspecto de acuerdo con la reivindicación 6 es un aceite microbiano que es un aceite refinado obtenido refinando el aceite crudo anterior. El contenido de triglicéridos es superior o igual al 90 % en peso. La relación en peso de ácido araquidónico con respecto al ácido dihomo-Y -linolénico es menor o igual a 1/20 en el aceite refinado.
Un aspecto adicional (reivindicación 14) es un método para producir una composición de éster de alcohol inferior que comprende éster de ácido dihomo-Y -linolénico, o una composición de ácido graso libre que comprende ácido dihomo-Y -linolénico, que comprende someter cualquier aceite microbiano como se ha propuesto o descrito anteriormente en el presente documento a una reacción de intercambio de éster o una reacción de hidrólisis, respectivamente.
En tal composición de éster de alcohol inferior o composición de ácido graso libre, la relación en peso de ácido araquidónico con respecto al ácido dihomo-Y -linolénico (ácido araquidónico/ácido dihomo-Y -linolénico) puede ser menor que 1/15, o cualquier otro valor divulgado aquí para esta relación.
En el aceite microbiano, la composición de éster de alcohol inferior o la composición de ácido graso libre de cualquiera de los presentes aspectos, el contenido de ácido araquidónico es normalmente menor o igual al 7 % en peso y preferiblemente mucho menor, como se analiza a continuación.
Un aspecto adicional (reivindicación 7) es un aceite microbiano como se ha especificado anteriormente para su uso como medicamento, preferiblemente como agente antialérgico o antiinflamatorio. Este aspecto incluye la sustancia para su uso en un método para la prevención, tratamiento o mejora de una enfermedad inflamatoria o alérgica, comprendiendo el método: administrar un medicamento que incluye el aceite microbiano de cualquiera de los presentes aspectos o aspectos preferidos, y preferiblemente el ácido dihomo-Y -linolénico o éster de alcohol inferior del ácido dihomo-Y -linolénico, o la composición que lo contenga, a un sujeto que padece o corre el riesgo de padecer una enfermedad inflamatoria o una enfermedad alérgica. El medicamento se puede administrar por vía tópica u oral, preferiblemente por vía tópica. La enfermedad inflamatoria o enfermedad alérgica puede ser, pero sin limitación, cualquiera de dermatitis atópica, dermatitis alérgica de contacto (ACD), dermatitis de contacto irritante (ICD), dermatitis de fotocontacto, dermatitis de contacto sistémica, reumatismo, psoriasis y lupus.
Un aspecto adicional (reivindicación 8) es el uso de un aceite microbiano de cualquiera de los presentes aspectos en un método de producción de productos alimenticios, suplementos dietéticos, medicamentos, cosméticos o piensos para animales.
Aspectos adicionales de la invención son una biomasa microbiana (reivindicación 10) que contiene cualquier aceite microbiano como se define aquí en combinación con las células microbianas, y un medio de cultivo líquido (reivindicación 11) que contiene tal biomasa microbiana.
En tal medio de cultivo líquido, el contenido de biomasa microbiana puede ser superior o igual a 2,5 g/L, en términos de peso seco de la biomasa microbiana. De manera deseable, el medio de cultivo líquido contiene el aceite microbiano en un contenido de 0,4 g/L o más.
En el presente documento se describen métodos para producir tales aceites microbianos y para el procesamiento adicional del mismo en productos útiles.
Un método divulgado en este documento es un método para producir un aceite microbiano que contiene ácido dihomo-Y -linolénico, tal como cualquier aceite microbiano divulgado en este documento, que comprende:
agregar inhibidor de A 5 desaturasa, especialmente dos o más tipos de inhibidor de A 5 desaturasa, a un medio de cultivo líquido, y
cultivar el microbio que tiene una actividad de desaturación de A 5 reducida o perdida en el medio de cultivo líquido para producir el aceite microbiano que contiene ácido dihomo-Y -linolénico.
Uno de los al menos dos tipos de inhibidor de A 5 desaturasa puede ser un inhibidor de aril benzamida A 5 desaturasa, especialmente 2-amino-N-(3-clorofenil)benzamida.
Uno de los al menos dos tipos de inhibidor de A 5 desaturasa, o dicho inhibidor de A 5 desaturasa distinto de 2-amino-N-(3-clorofenil)benzamida, puede ser un derivado de dioxabiciclo[3.3.0]octano representado por la Fórmula (I) :
Figure imgf000003_0001
en la que, R1, R2, R3, R4, R5y R6 son cada uno independientemente un átomo de hidrógeno o un grupo alquilo que tiene de 1 a 3 átomos de carbono; o, R1 y R2y/o R4 y R5 juntos forman un grupo metileno o un grupo etileno, y n, m y L representan 0 o 1;
butóxido de piperonilo, curcumina o un compuesto representado por la Fórmula (II):
Figure imgf000004_0001
en la que, R1 representa un grupo alquilo inferior; R2 representa un grupo hidroxilo, un grupo alquilo, un grupo alcoxi, un grupo alquenilo o un grupo oxialquilo en el que, en el caso de que una pluralidad de R2 estén presentes, la pluralidad de R2 puede ser igual o diferente y n es un número entero de 0 a 5.
Cuando se utiliza un derivado de dioxabiciclo[3.3.0]octano, se puede seleccionar de sesamina, sesaminol, episesamina, episesaminol, sesamolina, 2-(3,4-metilendioxifenil)-6-(3-metoxi-4-hidroxifenil)-3,7-dioxabiciclo[3.3.0]octano, 2,6-bis-(3-metoxi-4-hidroxifenil)-3,7-dioxabiciclo[3.3.0]octano y 2-(3,4-metilendioxifenil)-6-(3-metoxi-4-hidroxifenoxi)-3,7-dioxabiciclo[3.3.0]octano.
En particular, uno de los al menos dos tipos de inhibidor de A5 desaturasa, o dicho inhibidor de A5 desaturasa distinto de 2-amino-N-(3-clorofenil)benzamida, puede ser sesamina o curcumina.
En general, el microbio utilizado aquí como fuente del aceite es un microbio que pertenece al género Mortierella. Puede o no estar modificado genéticamente. Puede ser un microbio con una función productora de ácido araquidónico que ha sido inhibida por la actividad de desaturación de A5 reducida o perdida, por ejemplo por mutación y/o selección. Un aspecto del método de la invención es un método (reivindicaciones 14, 15) para producir una composición de éster de alcohol inferior o una composición de ácido graso libre como se propuso anteriormente, a partir de cualquier aceite microbiano como se propone en el presente documento, comprendiendo el método:
(a) obtener una mezcla de ácidos grasos libres o ésteres de ácidos grasos de alcoholes inferiores mediante hidrólisis o alcoholisis, respectivamente, del aceite microbiano, y
(b) purificar la mezcla de ácidos grasos libres o ésteres de alcoholes inferiores, mediante rectificación, para obtener una composición de ácidos grasos libres o ésteres de alcoholes inferiores en la que los ácidos grasos tengan al menos 20 átomos de carbono.
Esta mezcla o composición se puede purificar adicionalmente, por ejemplo mediante cromatografía en columna tal como cromatografía en columna del tipo de distribución en fase reversa. Por ejemplo, el éster de ácido dihomo-Y-linolénico de alcohol inferior o el ácido dihomo-Y-linolénico libre se pueden purificar o producir produciendo una composición de éster de alcohol inferior o una composición de ácido graso libre como se describe y luego realizando el fraccionamiento y purificación del éster de alcohol inferior de ácido dihomo-Y-linolénico, o de ácido dihomo-Y-linolénico, mediante cromatografía en columna del tipo de distribución en fase reversa.
Un método preferido es un método para producir la composición de éster de alcohol inferior o la composición de ácido graso libre que comprende ácido dihomo-Y-linolénico, que comprende:
(a) producir el aceite microbiano que contiene ácido dihomo-Y-linolénico mediante el cultivo de un microbio en un medio de cultivo líquido para producir el ácido dihomo-Y-linolénico, siendo el microbio un microbio con una función productora de ácido araquidónico que ha sido inhibida por actividad de desaturación de A5 reducida o perdida, opcionalmente en presencia de uno, dos o más tipos de inhibidor de desaturasa de A5 en el medio de cultivo líquido, para producir dicho aceite microbiano;
(b) por hidrólisis o alcoholisis del aceite microbiano, obtener una mezcla de ácidos grasos o ésteres de alcoholes inferiores que contienen ácido dihomo-Y-linolénico, opcionalmente después de la purificación del aceite;
(c) purificar la mezcla de ácidos grasos o ésteres de alcoholes inferiores.
En la etapa (c), la mezcla puede purificarse para obtener un ácido graso o una mezcla de éster de alcohol inferior en la que los ácidos grasos tienen al menos 20 átomos de carbono, y el método puede comprender además
(d) realizar el fraccionamiento y purificación del ácido dihomo-Y-linolénico o éster de alcohol inferior del ácido dihomo-Y-linolénico de dicha mezcla purificada mediante cromatografía en fase reversa.
El ácido dihomo-Y-linolénico purificado o el éster de alcohol inferior del ácido dihomo-Y-linolénico, o la composición que lo contiene, puede usarse de cualquier manera descrita en el presente documento, por ejemplo usado como o incorporado en un medicamento, preferiblemente un agente antialérgico o un agente antiinflamatorio.
Efecto de la invención
De acuerdo con la presente invención, se puede proporcionar un aceite microbiano y biomasa microbiana susceptibles de ser utilizados para obtener de manera eficiente un aceite que contiene ácido dihomo-Y-linolénico que tiene un contenido de ácido araquidónico menor que el del aceite obtenido por un método convencional y uso del mismo.
Se divulgan un método para producir un lípido que contiene ácido dihomo-Y-linolénico que tiene un contenido de ácido araquidónico más bajo que el del aceite obtenido por un método convencional, y el ácido graso libre de ácido dihomo-Y-linolénico y un éster de alcohol inferior ácido dihomo-Y-linolénico que tienen el contenido de ácido araquidónico más bajo que los del ácido graso libre y el éster de alcohol inferior obtenido por un método convencional.
De acuerdo con otros aspectos de la presente invención, se proporcionan usos de tal lípido que contiene ácido dihomo-Y-linolénico, el ácido graso libre del ácido dihomo-Y-linolénico o el éster de alcohol inferior del ácido dihomo-Y-linolénico.
Descripción de realizaciones
El aceite microbiano de la presente invención es un aceite microbiano que comprende DGLA como un ácido graso constituyente de un aceite y una grasa y que tiene un contenido, en términos de una relación en peso de ácido araquidónico con respecto a DGLA (ARA/DGLA), de menos de 1/15.
El microbio de la presente invención es una biomasa microbiana que contiene un aceite microbiano que comprende DGLA como un ácido graso constituyente de un aceite y que tiene un contenido, en términos de una relación en peso de ARA con respecto a DGLA (ARA/DGLA), de menos de 1/15.
Aunque la relación de contenido de DGLA y ARA puede definirse como una relación de peso (ARA/DGLA), esto también se puede expresar como una relación de peso (DGLA/ARA). Dado que el aceite a menudo se origina de un microbio que tiene una función productora de ARA nativa, aunque esta función puede haber sido reducida por mutación o selección de cepas y/o inhibida en cultivo, a menudo está presente al menos un rastro de ARA.
De acuerdo con la presente invención, un aceite microbiano que contiene DGLA y tiene una relación en peso de DGLA con respecto a ARA (DGLA/ARA) mayor o igual a 15, y una biomasa microbiana que contiene DGLA y tiene una relación en peso de DGLA con respecto a a ARA (DGLA/ARA) mayores o iguales a 15. El aceite microbiano y la biomasa microbiana que tienen un DGLA/ARA (relación en peso) mayor o igual a 15 han sido desconocidos hasta ahora. Por tanto, mediante el uso del aceite microbiano de la presente invención o mediante el uso de la biomasa microbiana de la presente invención, es posible proporcionar eficazmente un aceite que contenga DGLA con mayor pureza de DGLA y menor contenido de ARA que los aceites convencionales.
El aceite microbiano de la presente invención es un lípido obtenido cultivando un microbio que produce lípidos que contienen DGLA en un medio de cultivo adecuado y recuperándose de la biomasa microbiana usando métodos tales como extracción con disolvente. En general, los lípidos incluyen triglicéridos, diglicéridos, monoglicéridos, fosfolípidos, colesterol y los lípidos están compuestos principalmente por triglicéridos. Se incluyen diversos tipos de ácidos grasos como ácidos grasos constituyentes de estos lípidos. En la biomasa microbiana y el aceite microbiano de la invención, entre estos ácidos grasos constituyentes, el contenido de DGLA es alto y el contenido de ARA es bajo.
En la presente invención, el término "aceite crudo" de aceite microbiano se refiere a una mezcla de lípidos que se obtiene simplemente por extracción de tales lípidos de la biomasa microbiana. El aceite refinado de aceite microbiano es un aceite microbiano que se obtiene refinando este aceite microbiano para eliminar los fosfolípidos y el colesterol y así aumentar la proporción de triglicéridos. El término "aceite microbiano" en la presente especificación significa tanto el aceite crudo como el aceite refinado a menos que se indique otra cosa. En general, es posible aumentar adicionalmente la concentración de un ácido graso deseado convirtiendo el ácido graso deseado en forma de ácidos grasos libres o en forma de ésteres de alcohol inferior mediante hidrólisis o esterificación con ésteres de alcohol inferior y luego refinando los ácidos grasos libres o ésteres de alcohol inferior del mismo. Se sabe que, dado que ARA y DGLA tienen el mismo número de átomos de carbono, es decir, 20 átomos de carbono, y el número de dobles enlaces es 4 y 3, las propiedades de estos compuestos son similares y es extremadamente difícil separar DGLA de ARA. mediante un proceso de purificación realizado a escala de producción real. Un aceite microbiano en el que el contenido de ARA es bajo en la etapa del aceite microbiano crudo, en otras palabras, la diferencia entre un contenido de DGLA y un contenido de ARA es grande, puede ser proporcionado por la presente invención y por lo tanto puede aumentar notablemente la capacidad para obtener un DGLA/ARA muy alto en una forma posterior refinada y/o procesada químicamente del producto.
El término "ARA/DGLA" o el término "DGLA/ARA" en la presente especificación es una relación en peso entre ARA y DGLA de acuerdo con el análisis de la composición de ácidos grasos incluidos en un aceite. La composición de los ácidos grasos puede determinarse mediante el método convencional. Específicamente, el aceite analito se esterifica usando un alcohol inferior y un catalizador para obtener ésteres de alcoholes inferiores de ácidos grasos. A continuación, los ésteres de alcoholes inferiores de ácidos grasos obtenidos se analizan mediante cromatografía de gases. Los picos correspondientes a cada uno de los ácidos grasos se identifican en el cromatograma de gases obtenido y se determina el área del pico de cada uno de los ácidos grasos, por ejemplo utilizando el algoritmo de integración Agilent ChemStation (revisión C.01.03 [37], Agilent Technologies). "Área de pico" indica la relación entre el área de pico de un componente respectivo y el área de todos los picos, es decir, la proporción de contenido del componente del pico, según lo determinado por el gráfico analítico obtenido por cromatografía de gases o cromatografía en capa fina/ detector de ionización de llama (TLC/FID) de aceite que tiene diversos ácidos grasos como componentes constituyentes. La composición de ácidos grasos se determinó mediante cromatografía de gases, por ejemplo de acuerdo con el método indicado en los Ejemplos siguientes. La composición de lípidos se determinó mediante TLC/FID. Las condiciones adecuadas detalladas se indican en los ejemplos de trabajo.
En la presente especificación, el alcance del término "proceso" incluye no sólo un proceso discreto, sino también un proceso que no se puede distinguir claramente de otro proceso siempre que se logre el efecto esperado del proceso de interés.
En la presente especificación, cualquier rango numérico expresado usando "a" se refiere a un rango que incluye los valores numéricos antes y después de "a" como los valores mínimo y máximo, respectivamente.
En el caso en el que se indique aquí la cantidad de un tipo de componente que puede incluirse en la composición, cuando hay varias sustancias correspondientes al tipo de componente en la composición, la cantidad indicada significa la cantidad total de las diversas sustancias presentes en la composición, a menos que se indique específicamente otra cosa.
En la presente especificación, el término "microbio" incluye tanto eucariotas como procariotas, como se ejemplifica específicamente por bacterias, actinomicetos, cianobacterias, arqueas, hongos, algas, líquenes y protozoos.
Por conveniencia, el término "aceite" se usa aquí para referirse a "aceite/grasa". Además, aunque los términos "aceite" y "aceite/grasa" a veces se definen de forma estricta como triglicéridos específicos, en la presente especificación se considera que estos términos incluyen aceites, por ejemplo aceites crudos, que comprenden triglicéridos como componente principal con otros componentes lipídicos tales como diglicéridos, monoglicéridos, fosfolípidos, colesterol y ácidos grasos libres. Prácticamente, el contenido de triglicéridos en el aceite microbiano es mayor o igual al 70 % en peso, y lo más preferiblemente es mayor o igual al 90 % en peso.
En la presente especificación, el término "aceite crudo" significa un aceite en el estado obtenido por extracción del microbio y que es generalmente una mezcla de los componentes lipídicos descritos anteriormente. En la presente especificación, el término "aceite refinado" se entiende como un aceite obtenido después del proceso de refinado, que comprende proceso de desgomado, proceso de desacidificación, proceso de decoloración (proceso de blanqueo), proceso de desodorización en cualquier combinación de algunos o todos, para eliminar sustancias distintas de la sustancia objetivo, tales como fosfolípidos y colesterol. El experto en la técnica está familiarizado con estos términos y puede distinguir los aceites microbianos crudos de los aceites microbianos refinados por referencia a su composición específica. Las etapas de refinado particulares eliminan subconjuntos característicos de impurezas del aceite microbiano crudo original, que en sí mismo puede ser generalmente característico de su fuente microbiana como se conoce.
En la presente especificación, el término "aceite microbiano" se entiende ampliamente como cualquier aceite obtenido de un microbio y se usa en la presente especificación sin distinguir entre aceites crudos y refinados, a menos que se indique otra cosa.
En la presente especificación, la expresión "biomasa microbiana que contiene aceite microbiano" significa biomasa que tiene el aceite microbiano acumulado dentro de las células microbianas o liberado de las células microbianas cultivando los microbios que producen el aceite microbiano de la presente invención. Tanto los microbios vivos como los muertos pueden incluirse en la biomasa microbiana. También se incluye la biomasa microbiana seca. La expresión "biomasa microbiana seca" se entiende que significa un producto seco de biomasa microbiana que no incluye sustancialmente agua así como el producto seco que incluye componentes de medio de cultivo residual y auxiliares de filtración. La expresión "que no incluye sustancialmente agua" significa que el contenido de humedad es igual o inferior a la cantidad que daría lugar a dificultades para la vida del microbio. Esta cantidad es generalmente menor o igual al 15 % en peso de contenido de humedad, y preferiblemente es menor o igual al 10 % en peso de contenido de humedad.
En la presente especificación, la expresión "medio de cultivo líquido que incluye la biomasa microbiana" es el medio de cultivo líquido en el que se cultiva la "biomasa microbiana" descrita anteriormente, y esto se refiere al estado anterior a la separación de la biomasa microbiana del líquido de cultivo.
A continuación se describirán aspectos de la presente invención.
(1) Aceite microbiano
El aceite microbiano de la presente invención incluye DGLA y tiene un DGLA/ARA (relación en peso) mayor o igual a 15. El valor de DGLA/ARA es preferiblemente lo más alto posible, además preferiblemente es mayor o igual a 20, o mayor o igual a 30, y todavía adicionalmente preferiblemente es mayor o igual a 50, todavía adicionalmente preferiblemente es mayor o igual a 100, y particularmente preferiblemente es mayor o igual a 200. Cuando el valor de DGLA/ARA es menos de 15, la proporción relativa de ARA en el aceite microbiano en relación con DGLA se vuelve alta, e incluso si el aceite microbiano se refina, el contenido de ARA resultante puede estar cerca del 10 % en peso, de modo que la pureza de DGLA puede aumentarse insusuficientemente mediante la purificación. No se coloca ninguna limitación particular en el límite superior de DGLA/ARA en el aceite microbiano y, por ejemplo, el valor de DGLA/ARA puede establecerse en un valor inferior o igual a 3000.
El contenido de DGLA en el aceite microbiano puede ser 10 % en peso o más, preferiblemente 15 % en peso o más, más preferiblemente 20 % en peso o más, más preferiblemente 25 % en peso o más, con base en el peso total de la aceite microbiano. El aceite microbiano puede tener un poco de ARA. El contenido de ARA en el aceite microbiano puede ser del 0,03 % en peso o más, del 0,01 % en peso o más, del 0,001 % en peso o más, o del 0,0005 % en peso o más. El contenido de ARA en el aceite microbiano no supera el 7 % en peso.
Además, el contenido de triglicéridos en el aceite crudo con respecto a la cantidad total de aceite microbiano es mayor o igual al 70 % en peso en el aceite microbiano descrito anteriormente, y más preferiblemente es mayor o igual al 90 % en peso. Cuando el contenido de triglicéridos en el aceite microbiano es mayor o igual al 70 % en peso, existe una tendencia a que la absorción de humedad no sea excesivamente baja, de manera que por ejemplo se puede obtener una buena fluidez. Aunque no se establece ninguna limitación particular sobre el límite superior del contenido de triglicéridos en el aceite microbiano, generalmente el contenido en peso de triglicéridos en el aceite microbiano es menor o igual al 99 % en peso. El contenido en peso de triglicéridos en el aceite microbiano puede ser del 100 % en peso, es decir, el aceite microbiano puede no contener sustancialmente componentes que no sean triglicéridos. Los ácidos grasos que constituyen los triglicéridos del aceite microbiano están ejemplificados por ácidos grasos saturados o insaturados que tienen de 14 a 26 átomos de carbono. El aceite refinado puede tener una mayor concentración de triglicéridos debido a la eliminación de impurezas, por ejemplo por métodos conocidos.
En la composición de ácidos grasos del aceite microbiano crudo, con respecto al peso total del aceite microbiano, el aceite microbiano contiene preferiblemente menos de o igual al 60 % en peso de ácidos grasos que tienen 18 átomos de carbono o menos. Este contenido es más preferiblemente menor o igual al 55 % en peso, y este contenido es más preferiblemente menor o igual al 50 % en peso. Es preferible el aceite que tiene un bajo contenido de ácidos grasos que tienen 18 o menos átomos de carbono en el aceite crudo, ya que el aceite puede usarse como triglicérido sin la necesidad de ajustar la composición de ácidos grasos eliminando los ácidos grasos que tienen 18 o menos átomos de carbono. Tal ajuste generalmente necesita un método con bajo rendimiento, tal como el acondicionamiento para el invierno (procesamiento a baja temperatura).
El aceite microbiano preferiblemente tiene un contenido de fosfolípidos menor o igual a 10 % en peso con respecto al peso total del aceite, especialmente para el aceite microbiano crudo, y más preferiblemente 5 % en peso, más preferiblemente menor o igual a 1 % en peso con respecto al peso total del aceite. Sin embargo, el fosfolípido puede estar presente hasta cierto punto, tal como del 0,1 al 10 % en peso, más preferiblemente del 0,5 al 7 % en peso, aún más preferiblemente del 1 al 5 % en peso con respecto al peso total del aceite.
El contenido de ácidos grasos saturados del aceite microbiano es preferiblemente menor o igual al 40 % en peso con respecto al peso total del aceite microbiano crudo, y más preferiblemente es menor o igual al 35 % en peso del aceite microbiano crudo. Un aceite microbiano que tiene un bajo contenido de ácidos grasos saturados es favorable para algunos usos, tales como un suplemento dietético funcional.
Debe entenderse que los valores opcionales descritos anteriormente para los diversos parámetros del aceite microbiano son generalmente alcanzables de forma independiente y pueden combinarse libremente para definir aceites microbianos preferidos.
(2) Producción de aceite microbiano
El aceite microbiano puede obtenerse mediante un método de producción que incluye producir aceite microbiano cultivando un microbio conocido para producir lípidos (denominado en lo sucesivo como el proceso de producción) y separando el aceite microbiano obtenido de la biomasa microbiana (proceso de separación).
El lípido que contiene DGLA puede obtenerse mediante un método de producción que incluye producir aceite microbiano cultivando un microbio conocido para producir lípidos (denominado en lo sucesivo como el proceso de producción) y separando el aceite microbiano obtenido de la biomasa microbiana (proceso de separación).
El método de producción del lípido o aceite microbiano que contiene DGLA puede ser un método que incluye agregar dos o más tipos de inhibidores de A 5 desaturasa a un medio de cultivo líquido y cultivar un microbio que tiene una actividad de desaturación de A 5 reducida o perdida en el medio de cultivo líquido para producir los lípidos que contienen ácido dihomo-Y-linolénico.
Alternativamente, el método de producción del lípido o aceite microbiano que contiene DGLA puede ser un método que incluye la adición de dos o más tipos de inhibidores de A 5 desaturasa a un medio de cultivo líquido; y cultivar un microbio, que tiene una actividad de desaturación de A 5 reducida o perdida obtenida por mutación de un microbio capaz de producir ácido araquidónico, en el medio de cultivo líquido para producir los lípidos que contienen ácido dihomo-Y-linolénico.
En otras palabras, el método de producción de lípidos o aceites microbianos que contienen DGLA puede ser un método para producir lípidos que tienen un contenido de ácido araquidónico reducido en relación con el ácido dihomo-Y-linolénico en los lípidos mediante el cultivo de un microbio, obtenido mediante la mutación de un microbio capaz de producir ácido araquidónico, que tiene una actividad de desaturación de 5 reducida o perdida, para producir lípidos que contienen ácido dihomo-Y-linolénico y el método que comprende añadir por ejemplo dos tipos de inhibidores de la A5 desaturasa a un líquido de cultivo del microbio.
El microbio que se sabe que produce lípidos utilizados en el proceso de producción es al menos un tipo seleccionado de los microbios del género Mortierella. El microbio debe ser un microbio perteneciente al género Mortierella que tenga la capacidad de producir DGLA.
El microbio es además preferiblemente un microbio que tiene una actividad de desaturación de A5 reducida o perdida (denominado en lo sucesivo un "microbio de actividad de desaturación de A5 baja"), tal como una actividad de desaturación de A5 reducida o perdida con respecto a un estado nativo. Más preferiblemente, es un microbio que tiene una actividad de desaturación de A5 reducida o perdida obtenido por mutación de un microbio que tiene una función de producción de ARA, que pertenece al género Mortierella y que tiene una actividad de desaturación de A5 reducida o perdida obtenida por mutación en/de un microbio que tiene una función de producción de ARA. El microbio que tiene una función de producción de ARA para la mutación es un microbio del género Mortierella que tiene una función de producción ARA.
Los microbios del género Mortierella que tienen una función de producción de ARA se ejemplifican por los microbios que pertenecen al subgénero Mortierella, tales como Mortierella elongata, Mortierella exigua, Mortierella hygrophila, y Mortierella alpina. El microbio de baja actividad de desaturación de A5 puede obtenerse introduciendo una mutación en un microbio que tiene una función de producción de ARA, induciendo una cepa mutante que ha reducido o perdido la actividad de A5 desaturasa.
Ejemplos de procedimiento de mutación incluyen tratamientos físicos tales como por irradiación (rayos X, rayos gamma, haz de neutrones), irradiación ultravioleta y tratamiento térmico.
Además, la cepa mutante objetivo puede obtenerse mediante un método de aislamiento de la cepa mutante, que comprende incubar el microbio objetivo para la mutación durante un intervalo de tiempo fijo en presencia de una fuente de mutación e inocular en medio de agar de acuerdo con el método estándar para obtener una colonia. de la cepa mutante objetivo. Ejemplos de la fuente de mutación utilizada en el método de aislamiento de la cepa mutante incluyen agentes alquilantes tales como mostaza nitrogenada, metil metanosulfonato (MMS), N-metil-N'-nitroso-N-nitrosoguanidina (NTG); análogos de bases tales como 5-bromouracilo; antibióticos tales como mitomicina C; inhibidores de la síntesis de bases tales como la 6-mercaptopurina; tintes tales como proflavina; agentes cancerígenos tales como 4-nitroquinolin-N-óxido; y compuestos de cloruro de manganeso, dicromato de potasio, ácido nitroso, hidracina, hidroxilamina, formaldehído y nitrofurano. Además, la forma del microbio objetivo de la mutación puede ser el cuerpo microbiano en crecimiento (micelios) o las esporas.
Por ejemplo, entre los microbios de baja actividad de desaturación de A5, la cepa mutante Mortierella alpina SAM 1860 (número de acceso 3589 en el Fermentation Research Institute), inducida por mutación de la manera antes mencionada, puede usarse como la cepa mutante del género Mortierella. La producción de DGLA utilizando SAM 1860 se describe en detalle en JP-A No. H05-091887. Este método de producción se resume a continuación.
Con el fin de cultivar el microbio de baja actividad de desaturación de A5, se utilizan las esporas o micelios de la cepa microbiana o medio de cultivo líquido precultivado obtenido por cultivo de antemano para inocular en un medio líquido o sólido, y se cultiva el microbio.
En el caso de un medio líquido, se puede usar cualquiera de las fuentes de carbono generalmente utilizadas, incluidas glucosa, fructosa, xilosa, sacarosa, maltosa, almidón soluble, melazas, glicerol, manitol; sin embargo, la fuente de carbono no se limita a estos.
La fuente de nitrógeno puede ser una fuente de nitrógeno natural tal como peptona, extracto de levadura, extracto de malta, extracto de carne, casaminoácido, licor de maceración de maíz, así como fuentes de nitrógeno orgánico tales como urea y fuentes de nitrógeno inorgánico tales como nitrato de sodio, nitrato de amonio, sulfato de amonio. Además, las sales inorgánicas tales como fosfatos, sulfato de magnesio, sulfato de hierro, sulfato de cobre, así como vitaminas también pueden usarse como fuente de nutrientes traza, si es necesario.
Un medio acuoso utilizado como material base para el medio líquido es básicamente agua, y se puede utilizar agua destilada o agua purificada.
No se impone ninguna limitación particular sobre estos componentes de los medios de cultivo siempre que la concentración de estos componentes no interfiera con el crecimiento del microbio de baja actividad de desaturación de A5. Generalmente, para fines prácticos, la concentración de la fuente de carbono es del 0,1 % en peso al 30 % en peso, y preferiblemente del 1 % en peso al 10 % en peso, y la concentración de la fuente de nitrógeno es del 0,01 % en peso al 5 % en peso, y preferiblemente de 0,1 % en peso a 2 % en peso. Además, la temperatura de cultivo es de 5 °C a 40 °C, y preferiblemente es de 20 °C a 30 °C. El pH del medio de cultivo es de 4 a 10, y preferiblemente de 6 a 9. El cultivo puede ser un cultivo con aireación-agitación, un cultivo con agitación o un cultivo estacionario. El cultivo generalmente se realiza durante 2 a 15 días. La tasa de aireación durante el cultivo de aireación-agitación puede ser una tasa de aireación usada habitualmente para tal aireación.
Con el fin de promover la acumulación de DGLA, se puede agregar al medio de cultivo un componente que será un sustrato para la producción de ARA y/o DGLA. Tales sustratos están ejemplificados por hidrocarburos tales como tetradecano, hexadecano, octadecano; ácidos grasos tales como ácido tetradecanoico, ácido hexadecanoico, ácido octadecanoico; sales de tales ácidos grasos, tales como sales de sodio y sales de potasio; ésteres de ácidos grasos; aceites-grasas que contienen ácidos grasos como componentes constituyentes, tales como aceite de oliva, aceite de soja, aceite de semilla de algodón y aceite de palma; Sin embargo, el sustrato no se limita a estos.
Puede usarse un medio sólido convencional como medio sólido para cultivar el microbio de baja actividad de desaturación de A5. Tales medios sólidos se ejemplifican por medio de cultivo en agar, medio de cultivo en agar extracto de malta, medio de cultivo en agar malta, medio de cultivo en agar Czapek-Dox, medio de cultivo en agar Czapek, medio de cultivo en agar patata-zanahoria (PCA), medio de cultivo en agar patata-glucosa ("Medio de cultivo de agar dextrosa de patata" como nombre comercial, agar de dextrosa de patata: PDA), medio de cultivo en agar Sabouraud, medio de cultivo en agar harina de maíz. El medio de cultivo puede seleccionarse apropiadamente de acuerdo con la especie del microbio usado para el cultivo. Cualquiera de tales medios de cultivo sólidos puede estar disponible como productos comercializados, y el medio de cultivo sólido comercial puede usarse sin ninguna modificación y de acuerdo con las instrucciones proporcionadas con el mismo. Entre tales medios de cultivo sólidos, se prefiere el medio de cultivo PDA desde el punto de vista de la producción eficaz de DGLA en el microbio de baja actividad de desaturación de A5.
Con el fin de producir un aceite microbiano que tenga una relación DGLA/ARA más alta, un medio de cultivo utilizado para el cultivo del microbio es preferiblemente un medio líquido que comprende glucosa como fuente de carbono y extracto de levadura como fuente de nitrógeno en el caso de medio líquido, o medio de cultivo PDA en el caso de un medio sólido.
(3) Cultivo del microbio
Con el fin de producir un aceite microbiano que tiene una relación DGLA/ARA más alta, el microbio, preferiblemente un microbio de baja actividad de desaturación de A5, se cultiva preferiblemente en presencia de un inhibidor de A5 desaturasa. El inhibidor de la A5 desaturasa inhibe una enzima en la vía de síntesis que conduce a ARA durante la producción de ácidos grasos en la célula microbiana. Por tanto, mediante el uso de los inhibidores de A5 desaturasa y/o selección de un microbio adecuado que favorezca la producción de DGLA sobre ARA, por ejemplo un productor de ARA mutado de acuerdo con los principios conocidos, la síntesis de ARA en las células microbianas puede inhibirse y aumentar notablemente la cantidad acumulada de DGLA en las células microbianas.
Se puede usar cualquier inhibidor de A5 desaturasa conocido sin ninguna limitación, como un tipo o como una combinación de dos o más tipos. Con el fin de obtener más eficazmente el aceite microbiano con alto contenido de DGLA/ARA, los inventores encuentran que se usa preferiblemente una combinación de dos o más inhibidores de A5 desaturasa. Sorprendentemente, los inventores han descubierto que pueden lograr un marcado aumento en la relación DGLA/ARA mediante tales combinaciones, que no se habrían previsto, para producir novedosos aceites microbianos con una relación DGLA/ARA sin precedentes.
En un caso en el que se utilice una combinación de dos tipos de inhibidores de la A5 desaturasa, se selecciona preferiblemente 2-amino-N-(3-clorofenil)benzamida como el primer tipo de inhibidor de la A5 desaturasa. Mediante la combinación de 2-amino-N-(3-clorofenil)benzamida con otro tipo de inhibidor de A5 desaturasa, se suprime la reducción de la cantidad total de producción de lípidos y se puede aumentar la relación DGLA/ARA. La 2-amino-N-(3-clorofenil)benzamida es una anilida antranílica, conocida como aril benzamida que tiene un efecto inhibidor de la A5 desaturasa que puede usarse aquí, pero no se sabía previamente que fuera eficaz para el presente tipo de proceso.
El segundo tipo de inhibidor de la A5 desaturasa puede ejemplificarse mediante un derivado de dioxabiciclo[3.3.0]octano representado por la siguiente Fórmula (I):
Figure imgf000009_0001
en la que, en la fórmula (I), R1, R2, R3, R4, R5y R6 cada uno representa independientemente un átomo de hidrógeno o un grupo alquilo que tiene de 1 a 3 átomos de carbono; alternativamente, R1 y R2 y/o R4 y R5 juntos forman un grupo metileno o un grupo etileno; y n, m y L representan 0 o 1;
butóxido de piperonilo, curcumina y un compuesto representado por la siguiente Fórmula (II) a continuación:
Figure imgf000010_0001
en la que, en la fórmula (II), R1 representa un grupo alquilo inferior, tal como un grupo alquilo que tiene de 1 a 3 átomos de carbono; R2 representa un grupo hidroxilo, un grupo alquilo, un grupo alcoxi, un grupo alquenilo o un grupo oxialquilo; en el caso de que una pluralidad de R2 están presentes, la pluralidad de R2 puede ser igual o diferente; y n es un número entero en un intervalo de 0 a 5. Tales inhibidores de la A5 desaturasa pueden usarse solos o en combinación.
El derivado de dioxabiciclo[3.3.0]octano puede ser ejemplificado por sesamina, sesaminol, episesamina, episesaminol, sesamolina, 2-(3,4-metilendioxifenil)-6-(3-metoxi-4-hidroxifenil)-3,7-dioxabiciclo[3.3.0]octano, 2,6-bis-(3-metoxi-4-hidroxifenil)-3,7-dioxabiciclo[3.3.0]octano, 2-(3,4-metilendioxifenil)-6-(3-metoxi-4-hidroxifenoxi)-3,7-dioxabiciclo[3.3.0]octano. Tales derivados de dioxabiciclo[3.3.0]octano pueden usarse solos o como una combinación de dos o más tipos. Además, tales derivados de dioxabiciclo[3.3.0]octano pueden usarse en combinación con un estereoisómero o un racemato. Particularmente preferiblemente, el derivado de dioxabiciclo[3.3.0]octano es al menos un tipo seleccionado del grupo que consiste en sesamina y curcumina. Tales derivados de dioxabiciclo[3.3.0]octano pueden ser productos de síntesis química o extractos de productos naturales.
No se impone ninguna limitación particular sobre la forma de adición del inhibidor de la A5 desaturasa que no sea la 2-amino-N-(3-clorofenil)benzamida añadida al medio de cultivo, y esta forma puede seleccionarse apropiadamente de acuerdo con el tipo y forma del inhibidor de la A5 desaturasa utilizado. Por ejemplo, el inhibidor de la A5 desaturasa puede ser al menos un tipo seleccionado de aceite de sésamo, aceite de cacahuete y extractos naturales tales como extractos de aceite de sésamo que utilizan disolventes orgánicos sustancialmente incompatibles con el aceite de sésamo, extractos de disolvente de semillas de sésamo, extracto de Acanthopoanacis Core (extracto de gokahi), extracto de árbol de Paulownia, extracto de corteza de ginkgo, extracto de Piper longum, extracto de radix de Asiasari, extracto de estragón, extracto de semilla de eneldo, extracto de perejil, extracto de cúrcuma y extracto de nuez moscada. En el caso de que el inhibidor de la A5 desaturasa sea un extracto natural, tales extractos naturales pueden añadirse al medio de cultivo utilizado para cultivar el microbio, o alternativamente, estos extractos naturales pueden añadirse al medio de cultivo líquido para cultivar el microbio. El microbio puede cultivarse adicionalmente usando un medio de cultivo que contenga estos inhibidores de la A5 desaturasa.
En un caso en el que se use una combinación de dos o más tipos de inhibidores de la A5 desaturasa, esta combinación puede ser una combinación de 2-amino-N-(3-clorofenil)benzamida (o uno de los otros inhibidores de primer tipo listados anteriormente) y al menos un tipo de inhibidor de A5 desaturasa seleccionado del grupo que consiste en derivados de dioxabiciclo[3.3.0]octano, butóxido de piperonilo, curcumina y los compuestos representados por la Fórmula (II). Desde el punto de vista de la obtención de un aceite microbiano que tiene una alta relación DGLA/ARA, se prefiere la combinación de 2-amino-N-(3-clorofenil)benzamida y el derivado de dioxabiciclo[3.3.0]octano. Una combinación de 2-amino-N-(3-clorofenil)benzamida y al menos uno seleccionado del grupo que consiste en sesamina, sesaminol, episesamina, episesaminol, sesamolina, 2-(3,4-metilendioxifenil)-6-(3-metoxi-4-hidroxifenil)-3,7-dioxabiciclo[3.3.0]octano, 2,6-bis-(3-metoxi-4-hidroxifenil)-3,7-dioxabiciclo[3.3.0]octano y 2-(3,4-metilendioxifenil)-6-(3-metoxi-4-hidroxifenoxi)-3,7-dioxabiciclo[3. 3,0]octano es más preferido.
Aunque la concentración añadida del inhibidor de la A5 desaturasa depende del tipo de inhibidor de la A5 desaturasa utilizado, en el caso de un medio líquido, la concentración añadida en el medio de cultivo líquido de inhibidor de la A5 desaturasa por día es preferiblemente de 0,01 g/L a 1 g/L, y más preferiblemente es de 0.03 g/L a 0.50 g/L. Además, en el caso de un medio sólido, la concentración respectiva del inhibidor de la A5 desaturasa es preferiblemente del 0,0001 % en peso al 0,1 % en peso, y más preferiblemente es del 0,001 % en peso al 0,05 % en peso. En el caso en el que el inhibidor de la A5 desaturasa se utilice en forma de aceite de sésamo o un extracto como el extracto de aceite de sésamo, teniendo en cuenta factores tales como la cantidad de componente eficaz incluido en el extracto, la concentración final de la cantidad total de los inhibidores de A5 desaturasa en el medio de cultivo líquido, por ejemplo, es del 0,001 % en peso al 10 % en peso, y preferiblemente es del 0,5 % en peso al 10 % en peso. En un caso en el que se utilice una combinación de dos o más tipos de inhibidores de la A5 desaturasa, no se impone ninguna limitación particular en las proporciones de las cantidades de los múltiples inhibidores de la A5 desaturasa utilizados, y tales relaciones pueden seleccionarse apropiadamente de acuerdo con los tipos de los inhibidores de A5 desaturasa utilizados. Por ejemplo, en el caso en el que se utilice 2-amino-N-(3-clorofenil)benzamida en combinación con otro inhibidor de A5 desaturasa, la relación de 2-amino-N-(3-clorofenil)benzamida u otra benzamida al otro inhibidor de la A5 desaturasa (componente eficaz en el extracto natural, en el caso de un extracto natural) puede ser, en términos de relación en peso, de 100:1 a 1:100, y preferiblemente de 10:1 a 1:10, y más preferiblemente es de 5:1 a 1:5.
La producción de lípidos por parte del microbio puede verse afectada en el caso de que se agregue el inhibidor de la A5 desaturasa al medio de cultivo, y en este caso, para disminuir el efecto sobre la producción, es preferible agregar el inhibidor de la A5 desaturasa al líquido de cultivo en alícuotas en lugar de que sea la cantidad total.
No se impone ninguna limitación particular en el momento de la adición del inhibidor de la A5 desaturasa, y tal adición se puede realizar todos los días, o se puede realizar una vez al día o una vez unos pocos días durante el cultivo del microbio. En un caso en el que el inhibidor de la A5 desaturasa se añade a intervalos de una vez al día a una vez unos pocos días, las adiciones pueden realizarse a intervalos igualmente espaciados, a intervalos espaciados irregularmente o en una combinación de tales intervalos. El tiempo de adición del inhibidor de la A5 desaturasa puede seleccionarse apropiadamente de acuerdo con el estado de crecimiento del microbio.
En un caso en el que se agregue el inhibidor de la A5 desaturasa al medio de cultivo durante el proceso de producción, con el fin de producir aceite microbiano con una relación DGLA/ARA más alta, para el medio de cultivo utilizado durante el proceso de producción, en el caso de un líquido medio, se prefiere el medio líquido en el que se utiliza glucosa como fuente de carbono y extracto de levadura como fuente de nitrógeno y, en el caso de un medio sólido, se prefiere el medio de cultivo PDA.
No se impone ninguna limitación particular al recipiente de cultivo utilizado en el proceso de producción, y se puede utilizar cualquier recipiente de cultivo que se utilice habitualmente para el cultivo de microbios. El recipiente de cultivo puede seleccionarse apropiadamente de acuerdo con la escala de cultivo.
Por ejemplo, en el caso de cultivo líquido en la escala de 1 L a 50 L, se prefiere un recipiente de cultivo de tipo agitado como recipiente de cultivo para producir un aceite microbiano que tenga una relación DGLA/ARA más alta. El recipiente de cultivo de tipo agitado tiene preferiblemente palas agitadoras de tipo turbina de disco en al menos una etapa, y un recipiente de cultivo de tipo agitado tiene además preferiblemente palas agitadoras de tipo turbina de disco en dos etapas. En el caso de un recipiente de cultivo de tipo agitado equipado con palas agitadoras de tipo turbina de disco en dos etapas, la distancia entre las palas del agitador que están más cerca de la superficie inferior puede ser pequeña para agitar eficazmente el líquido de cultivo en la superficie de fondo del recipiente de cultivo. Por ejemplo, las posiciones de colocación de las palas del agitador superior e inferior pueden seleccionarse apropiadamente. Por ejemplo, las relaciones de "distancia desde el fondo del recipiente de cultivo a la pala del agitador inferior": "distancia entre la pala del agitador inferior y la pala del agitador superior": "distancia desde la pala del agitador superior a la superficie del líquido de cultivo" son preferiblemente ajustados para convertirse en "1": "1 a 3": "1 a 5", preferiblemente "1": "1,5 a 2": "2 a 4". Un ejemplo preferido de estas relaciones es 4:7:15. El recipiente de cultivo del tipo de agitación es particularmente preferido en el caso de cultivar el microbio usando un medio de cultivo líquido que contiene el medio de cultivo que incluye el inhibidor de la A5 desaturasa.
(4) Separación de la biomasa microbiana del medio de cultivo y recuperación del aceite microbiano de la biomasa microbiana
En el proceso de separación, el aceite microbiano que contiene DGLA producido durante el proceso de producción se separa de la biomasa microbiana. El proceso de separación incluye preferiblemente la separación de la biomasa microbiana cultivada del medio de cultivo utilizado en el cultivo (proceso de separación de biomasa microbiana) y la recuperación del aceite microbiano que contiene DGLA a partir de la biomasa microbiana cultivada (proceso de recuperación), es decir, la obtención del aceite crudo.
En el proceso de separación de biomasa microbiana y el proceso de recuperación de aceite microbiano, se utilizan un método de extracción y un método de separación de acuerdo con la forma de cultivo, de modo que el aceite microbiano que contiene DGLA se recupera de la masa microbiana cultivada.
En el caso de que se utilice un medio líquido, el aceite microbiano que contiene DGLA se recupera, por ejemplo, de la siguiente manera a partir de la biomasa microbiana cultivada.
Una vez completado el cultivo, la biomasa microbiana cultivada se obtiene del medio de cultivo líquido mediante el uso de un medio normal para la separación sólido-líquido, tal como una separación y filtración centrífugas. La biomasa microbiana se lava suficientemente con agua y luego se seca preferiblemente. El secado se puede realizar mediante secado por congelación, secado al aire, secado por calentamiento.
En el caso de que se utilice un medio sólido para el cultivo, el medio sólido y la biomasa microbiana se pueden triturar utilizando un homogeneizador sin separar la masa microbiana del medio de cultivo, y el material triturado obtenido se puede suministrar directamente al proceso de recuperación.
El proceso de recuperación puede incluir el proceso de extracción de la biomasa microbiana seca obtenida en el proceso de separación de la biomasa microbiana utilizando un disolvente orgánico, preferiblemente bajo una corriente de gas nitrógeno. El disolvente orgánico utilizado incluye éter, hexano, metanol, etanol, cloroformo, diclorometano, éter de petróleo. Alternativamente, se puede obtener un buen resultado alternando la extracción usando metanol y éter de petróleo, o la extracción usando un solvente del tipo de una sola capa de cloroformo-metanol-agua. Se obtiene un aceite microbiano que contiene una alta concentración de DGLA mediante la destilación del disolvente orgánico del extracto bajo presión reducida. El hexano se usa más generalmente en el caso de recuperar triglicéridos.
Además, como alternativa al método mencionado anteriormente, la extracción se puede realizar utilizando la biomasa microbiana húmeda. Se utiliza un disolvente que sea miscible con agua, tales como metanol o etanol, o un disolvente mixto miscible con agua, que contenga el disolvente y agua y/u otro disolvente. El resto del procedimiento es similar al descrito anteriormente.
El aceite crudo del aceite microbiano recuperado puede refinarse mediante un método que se utiliza para refinar aceites vegetales o aceites de pescado. El proceso de refinado utilizado normalmente para aceites/grasas se ejemplifica mediante el proceso de desgomado, desacidificación, blanqueo (decoloración) y desodorización. Tal procesamiento puede realizarse por cualquier método. El desgomado se ejemplifica mediante el tratamiento de lavado con agua. La desacidificación se ejemplifica mediante el tratamiento de destilación. El blanqueo se ejemplifica mediante el blanqueo usando arcilla activada, carbón activado, sílica gel. La desodorización se ejemplifica mediante destilación al vapor.
(5) Producción de ésteres de alcohol inferior y ácidos grasos libres del ácido graso del aceite microbiano
El DGLA incluido como un ácido graso constituyente del aceite microbiano puede convertirse en una forma de un éster de alcohol inferior mediante el uso de un catalizador, o una forma de ácido graso libre mediante hidrolización. En comparación con los triglicéridos tal como están, el éster de alcohol inferior o el ácido graso libre pueden separarse fácilmente de otros ácidos grasos y es posible concentrar DGLA para aumentar su pureza.
Un método para producir un éster de alcohol inferior o ácido graso libre del ácido dihomo-Y-linolénico puede ser un método que comprende: (a) obtener ácidos grasos libres o ésteres de ácidos grasos de alcohol inferior mediante hidrólisis o alcoholisis del aceite microbiano; (b) rectificar una mezcla de los ácidos grasos libres o los ésteres de alcoholes inferiores de los ácidos grasos para obtener un ácido graso libre o ésteres de alcoholes inferiores de los ácidos grasos, cuyos ácidos grasos tienen al menos 20 átomos de carbono; y (c) realizar el fraccionamiento y purificación del ácido graso libre o éster de alcohol inferior del ácido dihomo-Y-linolénico mediante cromatografía en columna del tipo de distribución en fase reversa a partir del ácido graso libre o éster de alcohol inferior, cuyos ácidos grasos tienen al menos 20 átomos de carbono .
Un método para producir un éster de alcohol inferior de ácido dihomo-Y-linolénico puede ser un método que comprende: (a) obtener ésteres de alcohol inferior de ácidos grasos por alcoholisis del aceite microbiano; (b) rectificar una mezcla de los ésteres de alcoholes inferiores de los ácidos grasos para obtener un éster de alcoholes inferiores de los ácidos grasos, cuyos ácidos grasos tienen al menos 20 átomos de carbono; y (c) realizar el fraccionamiento y purificación del éster de alcohol inferior del ácido dihomo-Y-linolénico mediante cromatografía en columna del tipo de distribución en fase reversa a partir de un éster de alcohol inferior, cuyos ácidos grasos tienen al menos 20 átomos de carbono.
Un método para producir un ácido graso libre de ácido dihomo-Y-linolénico puede ser un método que comprende: (a) obtener ácidos grasos libres por hidrólisis del aceite microbiano; (b) rectificar una mezcla de ácidos grasos libres para obtener un ácido graso libre que tenga al menos 20 átomos de carbono; y (c) realizar el fraccionamiento y purificación del ácido dihomo-Y-linolénico libre mediante cromatografía en columna del tipo de distribución en fase reversa a partir del ácido graso libre que tiene al menos 20 átomos de carbono.
El alcohol inferior de la presente invención se ejemplifica mediante alcoholes que tienen 3 o menos átomos de carbono, particularmente etanol, metanol. Los ésteres de alcohol inferior de DGLA se ejemplifican por dihomo-Y-linolenato de metilo, dihomo-Y-linolenato de etilo.
Por ejemplo, los ésteres metílicos de los ácidos grasos se obtienen por tratamiento del aceite con del 5 % al 10 % de metanol anhídro-ácido clorhídrico, del 10 % al 50 % de BF3-metanol, a temperatura ambiente durante 1 a 24 horas. Los ésteres etílicos de los ácidos grasos se obtienen por tratamiento del aceite con de 1 % a 20 % de etanol de ácido sulfúrico durante 15 a 60 minutos a 25 °C a 100 °C. Los ésteres metílicos o los ésteres etílicos se pueden extraer del líquido de reacción usando un disolvente orgánico tal como hexano, éter o acetato de etilo. El extracto líquido se seca utilizando sulfato de sodio anhidro y luego el disolvente orgánico se elimina por destilación para obtener una composición que comprende ésteres de ácidos grasos como componentes principales.
Además del éster de alcohol inferior DGLA objetivo, se incluyen otros ésteres de alcohol inferior de ácidos grasos en la composición esterificada obtenida por tratamiento de esterificación. Para el aislamiento del éster de alcohol inferior DGLA de la mezcla de estos ésteres de alcohol inferior de ácidos grasos, se puede utilizar el método de destilación, el método de rectificación, la cromatografía en columna, el método de cristalización a baja temperatura, el método de clatrato de urea, la cromatografía de distribución líquido-líquido en contracorriente, únicamente o una combinación de dos o más. Se usa preferiblemente una combinación de destilación o rectificación y cromatografía en columna o cromatografía de distribución en contracorriente líquido-líquido.
Para estos métodos, se pueden aplicar procedimientos normales. Se prefiere la cromatografía en columna del tipo de distribución en fase reversa (preferiblemente ODS) como la cromatografía en columna.
Con el fin de obtener el ácido graso libre de DGLA, después de producir el éster de alcohol inferior del aceite microbiano de la manera antes mencionada, el éster de alcohol inferior de DGLA que se refina para aumentar la pureza, puede hidrolizarse para obtener DGLA libre de alta pureza. Para obtener DGLA libre a partir del éster de alcohol inferior de DGLA, después de la hidrólisis usando un catalizador alcalino, el proceso de extracción puede llevarse a cabo usando un solvente orgánico tal como éter, acetato de etilo.
Alternativamente, el ácido graso libre de DGLA también se puede obtener directamente del aceite microbiano por hidrólisis. Por ejemplo, el aceite microbiano sufre descomposición alcalina, por ejemplo, durante 2 a 3 horas a temperatura ambiente usando hidróxido de sodio al 5 % para obtener un líquido descompuesto, y luego el ácido graso libre de DGLA puede extraerse o refinarse del líquido descompuesto mediante los métodos utilizados habitualmente para la extracción o el refinado de ácidos grasos.
El ácido libre o éster de alcohol inferior de DGLA obtenido mediante el método mencionado anteriormente se produce utilizando el aceite microbiano de la presente invención como materia prima y, por tanto, el ácido libre o éster de alcohol inferior de DGLA es una composición que tiene un bajo contenido de ARA, que es difícil de eliminar en el proceso de refinado. La relación ARA/DGLA puede ser inferior a 1/20 o inferior a 1/30; o además, puede hacerse menos de 1/50, menos de 1/100, menos de 1/200, menos de 1/1.000 o menos de 1/3.000. Es decir, la concentración de ARA puede ser menor o igual al 7 % en peso, menor o igual al 5 % en peso, menor o igual al 3 % en peso, menor o igual al 2 % en peso, menor o igual al 1 % en peso, menor o igual al 0,5 % en peso, menor o igual al 0,1 % en peso, o menor o igual al 0,03 % en peso. Para uso médico, DGLA se concentra preferiblemente a más de o igual al 90 % en peso.
(6) Biomasa microbiana que contiene aceite microbiano
La expresión "biomasa microbiana que contiene aceite microbiano" se refiere a una biomasa de un microbio que produce aceite microbiano dentro de sus células mediante cultivo de la manera descrita anteriormente. La biomasa microbiana puede ser una biomasa microbiana que tiene el aceite microbiano acumulado dentro de las células microbianas, o después de la liberación del aceite de las células microbianas, siempre que la biomasa microbiana comprenda un aceite microbiano de la presente invención. Debido a que esta masa microbiana contiene un aceite microbiano de la presente invención, la biomasa microbiana contiene DGLA como un ácido graso constituyente del aceite y tiene un contenido de ARA en relación con DGLA mayor o igual a 15 según lo indicado por la relación en peso (DGLA /ARA). Además, el aceite microbiano tiene un contenido de triglicéridos mayor o igual al 70 % en peso, mayor o igual al 80 % en peso o mayor o igual al 90 % en peso.
Alternativamente, la relación DGLA/ARA del aceite microbiano incluido en la biomasa microbiana es mayor o igual a 15, más preferiblemente mayor o igual a 20, más preferiblemente mayor o igual a 30, todavía adicionalmente preferiblemente mayor o igual a 50, todavía adicionalmente preferiblemente mayor o igual a 100, y particularmente preferiblemente mayor o igual a 200.
La relación DGLA/ARA en la biomasa microbiana se toma como el valor determinado de la forma antes mencionada. Puede usarse cualquier método para la medición de DGLA y ARA en la biomasa microbiana, siempre que el método sea uno que se use normalmente para la medición de los pesos relativos de DGLA y ARA en una biomasa microbiana, o equivalente. Por ejemplo, los microbios se pueden recuperar del medio de cultivo líquido durante el crecimiento, y el tratamiento de esterificación se puede realizar con 5 % a 10 % de metanol anhidro-ácido clorhídrico, 10 % a 50 % de BF3-metanol, 1 % a 20 % de ácido sulfúrico-metanol, 1 % a 20 % de ácido sulfúrico-etanol, durante 15 minutos a 60 minutos de tratamiento a 25 °C hasta 100 °C. Luego, el análisis del contenido de ácidos grasos (%) en los ácidos grasos se puede realizar usando cromatografía de gases con o sin extracción de las formas de éster. En el caso de esterificación para la evaluación de sustancias distintas de los ácidos grasos libres, tratamiento durante 15 a 60 minutos a 25 °C hasta 100 °C utilizando un alcóxido tal como metóxido de sodio, etóxido de sodio, en una concentración de 0,1 M a 10 M puede ser usado. Para la extracción de la forma de éster después de la esterificación, puede usarse un disolvente orgánico que sea inmiscible con el componente soluble en agua, tal como hexano.
Además, el microbio es preferiblemente un microbio capaz de proporcionar un aceite que satisface al menos una condición, y preferiblemente cualquier combinación de dos o más condiciones, de entre condiciones tales como el contenido de triglicéridos, el contenido de ácidos grasos que tienen menos de 18 átomos de carbono, contenido de fosfolípidos, contenido de ácidos grasos saturados, que se describen anteriormente para el aceite microbiano.
(7) Medio de cultivo líquido que contiene biomasa microbiana que contiene el aceite microbiano
El "medio de cultivo líquido que contiene biomasa microbiana que contiene el aceite microbiano" se considera el medio de cultivo antes de la separación del medio de cultivo líquido de los microbios cultivados mediante el método de producción de aceite microbiano descrito anteriormente. Por lo tanto, el medio de cultivo líquido contiene el DGLA descrito anteriormente y aceite microbiano que tiene una relación DGLA/ARA mayor o igual a 15. Para recuperar el aceite microbiano de este medio de cultivo líquido, el medio de cultivo líquido preferiblemente tiene el contenido de microbios, en términos de peso de la biomasa microbiana seca, mayor o igual a 2,5 g/L. Adicionalmente, el contenido de microbios en el medio de cultivo líquido que contiene microbios, en términos de peso de la biomasa microbiana seca, es preferiblemente mayor o igual a 5 g/L, más preferiblemente mayor o igual a 30 g/L, y además más preferiblemente mayor o igual a 60 g/L. Es posible obtener eficazmente aceite microbiano que tiene una alta relación DGLA/ARA a partir de tal medio de cultivo líquido.
Además, considerando el aceite microbiano en la masa microbiana en el medio de cultivo líquido, el medio de cultivo líquido contiene el aceite derivado de microbios descrito anteriormente, que incluye DGLA y tiene preferiblemente un contenido de aceite que contiene DGLA mayor o igual a 0,4 g./L, más preferiblemente mayor o igual a 0,8 g/L. En el caso en el que el contenido del aceite que contiene DGLA derivado del aceite microbiano sea mayor o igual a 0,4 g/L, se tiende a obtener ventajas tales como disminución de los costes de producción, mejora de la estabilidad de la calidad,
El microbio se hace crecer mediante cultivo y el DGLA se produce en las células microbianas. Por lo tanto, mediante la recuperación del medio de cultivo líquido que contiene los microbios sin ninguna modificación durante el proceso de cultivo, se puede obtener el medio de cultivo líquido que contiene el microbio. Además, debido a la producción del aceite microbiano que contiene DGLA dentro de las células microbianas del microbio durante el proceso de cultivo, el medio de cultivo líquido que contiene aceite microbiano puede obtenerse recuperando el medio de cultivo líquido que contiene microbios sin ninguna modificación durante el proceso de cultivo o alternativamente, alterando los microbios en el medio de cultivo líquido triturando y recuperando el medio de cultivo líquido que contiene aceite microbiano liberado en el medio de cultivo. Adicionalmente, con respecto al medio de cultivo líquido en el medio de cultivo líquido que contiene el aceite microbiano y el medio de cultivo que contiene microbios, las descripciones anteriores de los mismos pueden aplicarse tal cual.
Aplicaciones
De acuerdo con la presente invención, el microbio que contiene DGLA, el aceite microbiano, los ésteres de alcoholes inferiores, los ácidos grasos libres y el líquido de cultivo que contiene microbio pueden tener cada uno una relación de ARA a DGLA menor que la conocida previamente. Por lo tanto, cada uno es extremadamente útil para uso en aplicaciones que requieren DGLA de alta pureza o para las que es preferible el contenido más bajo de ARA. Tales aplicaciones se ejemplifican con productos alimenticios, suplementos dietéticos, medicamentos, cosméticos, piensos para animales. Dado que el aceite microbiano que contiene DGLA tiene un bajo contenido de ARA, en comparación con un aceite microbiano que contiene DGLA que tiene un alto contenido de ARA, la cantidad de ARA en el aceite microbiano puede reducirse para la misma cantidad de aceite microbiano y DGLA para ser usado. Por lo tanto, las aplicaciones direccionadas a la funcionalidad de DGLA son particularmente preferidas, y tales aplicaciones se ejemplifican mediante aplicaciones antiinflamatorias y aplicaciones antialérgicas, en particular aplicaciones tópicas, como se estableció anteriormente.
Como se mencionó anteriormente, el medicamento que comprende o consiste en el aceite microbiano, la composición de éster de alcohol inferior o la composición de ácido graso libre puede administrarse usualmente por vía tópica u oral, preferiblemente por vía tópica. Una enfermedad inflamatoria o una enfermedad alérgica que se va a tratar, prevenir o mejorar puede ser, por ejemplo, sin limitación, cualquier inflamación de la piel. La inflamación de la piel puede ser al menos una seleccionada de un grupo que consiste en erupciones, urticaria, ampollas y ronchas, o puede ser causada por al menos una seleccionada de un grupo que consiste en eccema, exposición a radiación, enfermedades autoinmunes y prurito urémico.
En particular, la inflamación de la piel puede ser una inflamación de la piel asociada con o causada por eccema atópico, dermatitis de contacto, psoriasis o prurito urémico.
El medicamento puede ser para el tratamiento, prevención o mejora de la inflamación de la piel asociada con el eccema. El término eccema se aplica a un amplio rango de afecciones de la piel con una variedad de etiologías. En general, el eccema se caracteriza por la inflamación de la epidermis. Los síntomas comunes asociados con el eccema incluyen sequedad, erupciones cutáneas recurrentes, enrojecimiento, edema de la piel (hinchazón), picazón, sequedad, formación de costras, descamación, formación de ampollas, agrietamiento, supuración y sangrado. El eccema incluye eccema atópico (dermatitis atópica), dermatitis de contacto, eccema xerótico, dermatitis seborreica, dishidrosis, eccema discoide, eccema venoso, dermatitis herpetiforme, neurodermatitis y autoeczematización. El eccema es típicamente un eccema atópico o dermatitis de contacto.
El eccema atópico se agrava principalmente por el contacto con o la ingesta de alérgenos, que incluyen pelo y caspa de animales, alérgenos alimentarios, por ejemplo frutos secos o mariscos, y fármacos, por ejemplo penicilina.
La dermatitis de contacto incluye dermatitis de contacto alérgica, dermatitis de contacto irritante y dermatitis por fotocontacto. La dermatitis por fotocontacto incluye la dermatitis de contacto fototóxica y la dermatitis de contacto fotoalérgica.
La inflamación de la piel puede ser una inflamación de la piel causada por la exposición de la piel a radiación electromagnética. Esto incluye, por ejemplo, exposición a la luz solar, calor, rayos X o materiales radiactivos. Por tanto, el medicamento se puede usar, o para usar, para tratar quemaduras solares.
La radiación electromagnética incluye ondas de radio, microondas, radiación de terahercios, radiación infrarroja, luz visible, radiación ultravioleta, rayos X y rayos gamma. La radiación electromagnética es preferiblemente radiación infrarroja, luz visible, radiación ultravioleta, rayos X y rayos gamma, más preferiblemente radiación ultravioleta, rayos X y rayos gamma.
Las enfermedades autoinmunes pueden implicar una respuesta autoinmune contra la piel. Ejemplos de tales enfermedades autoinmunes son el lupus y la psoriasis.
El prurito urémico es un trastorno de la piel asociado con insuficiencia renal crónica. También afecta con frecuencia a pacientes sometidos a tratamiento de diálisis.
Opcionalmente, el aceite microbiano, la composición de éster de alcohol inferior o la composición de ácido graso libre de la presente se usa, o es para uso, se coadministra con un corticosteroide u otro agente terapéutico para cualquiera de los usos médicos anteriores.
En otros aspectos de la invención, la enfermedad inflamatoria puede ser al menos una de un grupo que consiste en dermatitis atópica, dermatitis alérgica de contacto (ACD), dermatitis de contacto irritante (ICD), dermatitis por fotocontacto, dermatitis de contacto sistémica, reumatismo, psoriasis y lupus.
Se entenderá que un medicamento para el tratamiento de una enfermedad inflamatoria/alérgica es un medicamento que debe suprimir o aliviar uno o más síntomas cuando se encuentra o se sospecha que el síntoma o síntomas se deben a una enfermedad inflamatoria/alérgica. Por otro lado, un medicamento para la prevención de enfermedades inflamatorias/alérgicas es un medicamento para suprimir la aparición de uno o más síntomas, que pueden predecirse o anticiparse debido a una enfermedad inflamatoria/alérgica, típicamente mediante preadministración. Sin embargo, los términos "medicamento para el tratamiento" y "medicamento para la prevención" deben entenderse teniendo en cuenta aspectos múltiples o generales, tales como el momento del uso y/o los síntomas que se van a tratar/prevenir en el uso, de acuerdo con práctica clínica, y no debe aplicarse de manera restrictiva.
Ejemplos
La presente invención se describe a continuación en detalle utilizando ejemplos de trabajo. Sin embargo, la presente invención no está limitada por estos ejemplos de trabajo. A menos que se indique otra cosa, "%'' en los ejemplos de trabajo siguientes significa "% en peso".
Ejemplo 1
Efecto de diversos tipos de inhibidor de la A5 desaturasa sobre los ácidos grasos producidos por la masa microbiana: 1
Cinco medios de cultivo en placa, a saber, medio de cultivo en placa A que no contiene inhibidor de A5 desaturasa añadido, medio de cultivo en placa B al que se le añadió 0,005 % en peso de sesamina, medio de cultivo en placa C al que se añadió 0,01 % en peso de sesamina, medio de cultivo en placa D al que se añadió al 0,02 % en peso de sesamina, y medio de cultivo en placa E al que se añadieron 0,01 % en peso de sesamina y 0,01 % en peso de 2-amino-N-(3-clorofenil)benzamida, se prepararon de acuerdo con las instrucciones del producto para el Medio de Cultivo de Agar Dextrosa de Patata (nombre comercial del producto; Nissui Pharmaceutical Co., Ltd.), excepto la adición o no adición del inhibidor o inhibidores de la A5 desaturasa mencionados al medio de agar dextrosa de patata para obtener la concentración indicada. El tamaño de cada medio de cultivo en placa era el mismo, es decir, 90 mm de diámetro y 5 mm de espesor.
Cada uno de los medios de cultivo en placa A a E se inoculó utilizando 100 pL de cada uno de una suspensión de esporas de SAM 1860, la cepa mutante de Mortierella alpina, y el cultivo estático se realizó a 28 °C durante 7 días.
Una vez completado el cultivo, cada medio de cultivo en placa con su masa microbiana se cortó en cuñas de muestra de aproximadamente 1 cm y las cuñas de muestra se transfirieron a matraces. Luego se agregaron 50 mL de hexano por cada placa plana, y la mezcla obtenida se homogeneizó durante 2 minutos para obtener un líquido mixto de disolvente orgánico. Se centrifugó el líquido mixto de disolvente orgánico (2000 rpm, 810 G) y se recuperó la capa sobrenadante de hexano. Luego se eliminó el disolvente por destilación para obtener aproximadamente 40 mg por medio de cultivo de placa única de Aceites Microbianos A a E.
A 0,5 mg de cada uno de los respectivos Aceites Microbianos A a E se añadieron 0,10 mL de solución de etanol de ácido sulfúrico al 10 % (v/v) y se realizó la esterificación de etilo mediante reacción durante 30 minutos a 80 °C. Con el fin de neutralizar la solución de reacción, se adicionó 0,18 mL de solución etanólica de hidróxido de sodio 1,0 M, luego se adicionaron 0,05 mL de hexano y 0,30 mL de solución saturada de cloruro de sodio y se realizó la extracción, mediante lo cual se obtuvieron los respectivos ésteres etílicos de ácidos grasos A a E. Las composiciones de ácidos grasos (%) en las composiciones A a E de éster etílico de ácidos grasos se analizaron usando cromatografía de gases. Las condiciones analíticas utilizadas para la cromatografía de gases se muestran a continuación. Los resultados de la cromatografía de gases se muestran en la Tabla 1. Adicionalmente, la composición de ácidos grasos (%) es la relación de áreas con base en el cromatograma de gases.
Condiciones de análisis de cromatografía de gases
Tipo de equipo: Sistema GC Agilent 6850 (Agilent Technologies, Inc.)
Columna: DB-WAX (Agilent Technologies, 30 m x 0,25 mm de diámetro interno, espesor de película de 0,25 pm) J&W 122-7032
Horno de columna: 180 °C-3 °C/min-230 °C (25 min)
Temperatura de inyección: 270 °C
Método de inyección: división
Relación de división: 20:1
Temperatura del detector: 270 °C
Detector: FID
Gas portador: helio (1.0 mL/min, flujo constante)
Tabla 1
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Como se muestra en la Tabla 1, para el éster etílico de ácido graso E, que utilizó el aceite microbiano E como materia prima, la relación DGLA/ARA fue sustancialmente mayor que 13, y esta relación fue más alta que cualquiera de los aceite microbiano A, aceite microbiano B, aceite microbiano C y aceite microbiano D obtenidos por cultivo de la cepa SAM 1860 conocida públicamente en presencia de un tipo de inhibidor de A5 desaturasa. Además, se obtuvieron 33,8 mg de éster de ácido graso E de aceite microbiano E.
Ejemplo 2
Efecto de diversos tipos de inhibidor de la A5 desaturasa sobre los ácidos grasos producidos por la masa microbiana: 2
En un matraz Erlenmeyer corrugado de 500 mL de volumen total, se agregaron 100 mL de un medio de cultivo (pH 6,0) que incluía 2 % de glucosa y 1 % de extracto de levadura, y luego se prepararon 4 tipos de medios de cultivo líquidos, a saber, Medio de cultivo líquido F sin inhibidor de A5 desaturasa añadido, Medio de cultivo líquido G con 10 mg de sesamina añadidos, Medio de cultivo líquido H con 10 mg de 2-amino-N-(3-clorofenil)benzamida añadidos y Medio de cultivo líquido I con ambos 10 mg de sesamina y 10 mg de 2-amino-N-(3-clorofenil)benzamida añadidos. Se utilizó un agitador apilable I-26 (fabricado por New Brunswick Scientific) como equipo de cultivo de agitación.
Después de 15 minutos de esterilización del medio de cultivo líquido F a I a 121 °C, 1 mL del medio de cultivo líquido precultivado de SAM 1860, cepa mutante de Mortierella alpina, se inoculó en los respectivos medios de cultivo líquidos y se cultivó con agitación durante 15 días a una tasa de rotación de 200 rpm y una temperatura de 28 °C. El quinto día y el décimo día, se agregaron 10 mg de sesamina esterilizada al medio de cultivo líquido G, se agregaron 10 mg de 2-amino-N-(3-clorofenil)benzamida esterilizada al medio de cultivo líquido H, y una combinación de 50 mg de sesamina esterilizada y 10 mg de 2-amino-N-(3-clorofenil)benzamida se agrgegaron al medio de cultivo líquido I. Después de cultivar, la masa microbiana se recuperó mediante separación centrífuga. Después de lavar con suficiente agua, la masa microbiana se secó por congelación. Se obtuvieron 3,2 g de masa microbiana seca (Masa microbiana seca F) del Medio de cultivo líquido F. Se obtuvieron 2,5 g de masa microbiana seca (Masa microbiana seca G) del Medio de cultivo líquido G. Se obtuvieron 0,6 g de masa microbiana seca (Masa microbiana seca H) del medio de cultivo líquido H. Se obtuvieron 0,6 g de masa microbiana seca (masa microbiana seca I) del medio de cultivo líquido I.
Se adicionaron 175 mL de hexano a cada una de las Masas Microbianas F a I para extraer los lípidos, con agitación durante 30 minutos a temperatura ambiente, y luego se filtró la mezcla obtenida para obtener el extracto líquido y las células microbianas. Esta operación se repitió 3 veces para obtener un extracto líquido de hexano. El extracto líquido de hexano se concentró usando un evaporador rotatorio bajo presión reducida. Se obtuvieron 613,2 mg de aceite microbiano, aceite microbiano F, de la masa microbiana seca F. Se obtuvieron 328,3 mg de aceite microbiano, aceite microbiano G, de la masa microbiana seca G. Se obtuvieron 77,7 mg de aceite microbiano, aceite microbiano H, de la masa microbiana seca H. Se obtuvieron 105,3 mg de aceite microbiano, aceite microbiano I, de la masa microbiana seca I.
A 0,5 mg de cada aceite microbiano respectivo entre los aceites microbianos F a I, se añadieron 0,10 mL de solución etanólica de ácido sulfúrico al 10 % (v/v) y la reacción se llevó a cabo durante 30 minutos a 80 °C para la esterificación etílica. Se añadieron al líquido 0,18 mL de solución de etanol de hidróxido de sodio 1,0 M después de la reacción de neutralización. Luego se agregaron 0,05 mL de hexano y 0,30 mL de solución saturada de cloruro de sodio para extracción. Se obtuvieron 533,2 mg de éster etílico de ácido graso, éster etílico de ácido graso F, de aceite microbiano F. Se obtuvieron 285,4 mg de éster etílico de ácido graso, éster etílico de ácido graso G, de aceite microbiano G. Se obtuvieron 67,6 mg de éster etílico de ácido graso, éster etílico de ácido graso H, del aceite microbiano H. Se obtuvieron 91,6 mg de éster etílico de ácido graso, éster etílico del ácido graso I, del aceite microbiano I. Las proporciones de ácido graso de los ésteres etílicos de ácido graso F a I fueron analizados por cromatografía de gases de la misma manera que en el Ejemplo 1. Los resultados de la cromatografía de gases se muestran en la Tabla 2. Adicionalmente, las composiciones de ácidos grasos (%) se basan en las relaciones de área de los cromatogramas de gases de la manera antes mencionada.
Las condiciones analíticas de la cromatografía de gases fueron similares a las del Ejemplo 1.
Como se muestra en la Tabla 2, la relación de DGLA/ARA para el éster etílico de ácidos grasos I usando aceite microbiano I como materia prima fue mucho mayor que 13, y este valor fue más alto que el de cualquiera de los aceites microbianos F, G y H, que se produjeron cultivando la cepa SAM 1860 conocida o cultivando la cepa SAM 1860 en presencia de un tipo de inhibidor de la A5 desaturasa.
Tabla 2
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Ejemplo 3
Efecto de diversos tipos de inhibidor de la A5 desaturasa sobre los ácidos grasos producidos por la masa microbiana: 3
Se proporcionó un fermentador de jarra de un litro (1 L) equipado con palas agitadoras de tipo turbina de disco en dos etapas. Las posiciones de las palas del agitador en el fermentador de jarra se ajustaron de tal manera que las relaciones entre las posiciones de las palas del agitador y la superficie líquida del medio de cultivo líquido (500 mL) contenido fueran las siguientes: relaciones de "distancia desde el fondo del recipiente de cultivo a la pala del agitador de la etapa inferior” :"distancia del agitador de la etapa inferior al agitador de la etapa superior":"distancia del agitador de la etapa superior a la superficie del líquido de cultivo" = 4: 7: 15.
Se colocaron 500 mL de un medio de cultivo (pH 6,0) que contenía glucosa al 2 % y extracto de levadura al 1 % en cada uno de los cuatro fermentadores de jarra de 1 L y se prepararon 4 tipos de medios de cultivo líquidos: Medio de cultivo líquido J sin inhibidor de desaturasa A5 añadido, Medio de cultivo líquido K con 50 mg de sesamina añadida, Medio de cultivo líquido L con 50 mg de 2-amino-N-(3-clorofenil)benzamida añadida y Medio de cultivo líquido M con 50 mg de sesamina añadida y 50 mg de 2-amino- N-(3-clorofenil)benzamida.
Después de esterilizar cada uno de los medios de cultivo líquidos J a M durante 20 minutos a 120 °C, se inocularon 20 mL de medio de cultivo líquido precultivado de una cepa de Mortierella alpina que carecía de A5 desaturasa en el medio de cultivo líquido respectivo y se cultivaron con aireación y la agitación se realizó durante 12 días por debajo de 0,6 v.v.m. de aireación y 28 °C de temperatura. En el tercer día, cuarto día, quinto día, sexto día, séptimo día, décimo día y undécimo día, se añadieron 50 mg de sesamina esterilizada al medio de cultivo líquido K, se añadieron 50 mg de 2-amino-N-(3-clorofenil)benzamida al medio de cultivo líquido L, y se añadió una combinación de 50 mg de sesamina esterilizada y 50 mg de 2-amino-N-(3-clorofenil)benzamida al medio de cultivo líquido M. Después del cultivo, la masa microbiana se recuperó por separación centrífuga. Después de lavar con suficiente agua, la masa microbiana se secó por congelación. Se obtuvieron 2,9 g de masa microbiana seca (Masa microbiana seca J) del Medio de cultivo líquido J. Se obtuvieron 2,9 g de masa microbiana seca (Masa microbiana seca K) del Medio de cultivo líquido K. Se obtuvieron 1,5 g de masa microbiana seca (Masa microbiana seca L) del medio de cultivo líquido L. Se obtuvieron 2,9 g de masa microbiana seca (masa microbiana seca M) del medio de cultivo líquido M.
Se adicionaron 175 mL de hexano a cada una de las Masas Microbianas Secas J a M para extraer los lípidos, con agitación durante 30 minutos a temperatura ambiente, y luego se filtró la mezcla obtenida para obtener el extracto líquido y las células microbianas. Esta operación se repitió 3 veces para obtener un extracto líquido de hexano. El extracto líquido de hexano se concentró usando un evaporador rotatorio bajo presión reducida. Se obtuvieron 552,0 mg de aceite microbiano, aceite microbiano J, de la masa microbiana seca J. Se obtuvieron 379,5 mg de aceite microbiano, aceite microbiano K, de la masa microbiana seca K. Se obtuvieron 195,5 mg de aceite microbiano, aceite microbiano L, de la masa microbiana seca L. Se obtuvieron 552,0 mg de aceite microbiano, aceite microbiano M, de la masa microbiana seca M. Los contenidos y tipos de lípidos en los aceites microbianos J a M obtenidos se analizaron mediante método de cromatografía en capa fina/detector de ionización de llama (TLC/FID) (IATROSCAN (un nombre comercial; lo mismo a continuación), Mitsubishi Chemical Medience Corp.).
Además, se añadieron 0,10 mL de solución de etanol de ácido sulfúrico al 10 % a 0,5 mg de cada aceite microbiano respectivo entre los aceites microbianos J a M, y se llevó a cabo la reacción durante 30 minutos a 80 °C para la esterificación etílica. Se añadieron al líquido 0,18 mL de solución de etanol de hidróxido de sodio 1,0 M después de la reacción de neutralización. Luego se agregaron 0,05 mL de hexano y 0,30 mL de solución saturada de cloruro de sodio para extracción. Se obtuvieron 480,0 mg de éster etílico de ácido graso, éster etílico de ácido graso J, de aceite microbiano J. Se obtuvieron 330,0 mg de éster etílico de ácido graso, éster etílico de ácido graso K, de aceite microbiano K. Se obtuvieron 170,0 mg de éster etílico de ácido graso, éster etílico de ácido graso L, de aceite microbiano L. Se obtuvieron 480,0 mg de éster etílico de ácido graso, éster etílico de ácido graso M, de aceite microbiano M. Los contenidos y tipos de ácidos grasos en los ésteres etílicos de ácidos grasos J a M obtenidos se analizaron mediante cromatografía de gases.
Los resultados del uso del IATROSCAN y la cromatografía de gases se muestran en la Tabla 3.
Las condiciones analíticas de IATROSCAN y las condiciones analíticas de cromatografía de gases se listan a continuación.
Condiciones analíticas de IATROSCAN
Disolvente revelador:
0-3 min. CHCl3 : MeOH = 95:5 (v/v)
3-23 min. hexano: éter dietílico: ácido fórmico = 90: 10: 0,2 (v/v)
Concentración de la muestra: 10 mg/mL
Cantidad añadida: 5 pL
Condiciones de análisis de cromatografía de gases
Tipo de equipo: sistema GC Agilent 7890 (Agilent Technologies)
Columna: DB-WAX (Agilent Technologies, 30 m x 0,25 mm ID, 0,25 pm de espesor de película) J & W122-7032
Horno de columna: 180 °C - 3 °C/min - 230 °C (25 min)
Temperatura de inyección: 270 °C
Método de inyección: división
Relación de división: 20:1
Temperatura del detector: 270 °C
Detector: FID
Gas portador: helio (1.0 mL/min, flujo constante)
Como se aclara en la Tabla 3, cuando la cepa deficiente en A5 desaturasa perteneciente a Mortierella alpina utilizada en el presente ejemplo de trabajo se cultivó por sí mismo (Aceite microbiano J), cuando el cultivo se realizó en presencia de un tipo de inhibidor de A5 desaturasa (Aceite microbiano K y Aceite microbiano L), y cuando el cultivo se realizó en presencia de dos tipos de inhibidores de A5 desaturasa (Aceite microbiano M), la relación DGLA/ARA para cada aceite fue mayor o igual a 15.
Entre estos aceites microbianos, mientras que el aceite microbiano L, al que se le había agregado un solo tipo de inhibidor de la A5 desaturasa, tenía un contenido de grasa total reducido en el medio de cultivo líquido; también se obtuvo un resultado inesperado en el que se suprimió la reducción del contenido de grasa total en el medio de cultivo líquido para Aceite microbiano M, para lo cual se usaron dos tipos de inhibidores de A5 desaturasa.
Tabla 3
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Ejemplo 4
(1) Refinación del éster etílico de ácidos grasos mediante rectificación
Cada una de las composiciones de éster etílico de ácido graso J, K y M obtenidas en el Ejemplo 3 se sometió a un proceso de rectificación bajo presión reducida, para obtener las fracciones respectivas (fracciones de éster etílico de ácido graso J, K y M) cada una de las cuales contenía ésteres etílicos de ácido graso J, K o M como componente principal, derivados de ácidos grasos que tenían 20 o más carbonos.
Los resultados se muestran en la Tabla 4. Como se aclara en la Tabla 4, mediante la rectificación del éster etílico que tiene la relación DGLA/ARA controlada a 2836 mediante la adición de sesamina y 2-amino-N-(3-clorofenil)benzamida en el ejemplo de trabajo, se obtuvo una fracción de éster de ácido graso que tenía 20 átomos de carbono o más y un contenido de ARA extremadamente bajo.
Tabla 4
Composición de ácidos grasos (% Éster etílico de ácidos Éster etílico de ácidos Éster etílico de ácidos en peso) grasos J grasos K grasos M
DGLA 61,8 59,53 65,06
ARA 1,78 0,50 0,03
DGLA/
Figure imgf000019_0001
35
Figure imgf000019_0002
120
Figure imgf000019_0003
2024
(2) Refinado de ésteres etílicos de ácidos grasos mediante cromatografía en columna
Los ésteres etílicos de ácidos grasos J, K y M después de la rectificación, que tenían las composiciones mostradas en la Tabla 4, se sometieron a una alta purificación adicional usando ODS (Octa Decil Silil)-HPLC. Las condiciones de separación se listan a continuación.
Condiciones de separación
Columna: ODS AQ S-5012 nm (YMC Corp., Ltd.), 20 $ x 300 mm
Líquido de separación: metanol
Tasa de flujo: 25 mL/min
Temperatura de la columna: 40 °C
Carga de muestra: 1,42 g
Detectores: espectrofotómetro UV/Vis y refractómetro diferencial
La Tabla 5 muestra las composiciones de ácidos grasos después de la purificación con ODS-HPLC de cada fracción de éster etílico de ácidos grasos cuando el rendimiento de HPLC fue del 65 %. Además, las composiciones de ácidos grasos (%) se basan en las relaciones de área de los cromatogramas de gases de la manera antes mencionada.
Tabla 5
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Como se aclara en la Tabla 5, para cada una de las fracciones de éster etílico de ácido graso (J, K y M), el refinado ODS-HPLC pudo aumentar el contenido de DGLA. En particular, fue posible alcanzar una pureza del 95 % en peso o más, particularmente para la Fracción de éster etílico de ácidos grasos M.
Por otro lado, no hubo grandes cambios en las relaciones de DGLA/ARA para las fracciones de éster etílico de ácidos grasos obtenidas por purificación adicional más alta de DGLA en comparación con las relaciones de DGLA/ARA de los aceites crudos antes del refinado. Se entiende que la separación de DGLA del ARA en un proceso de refinación es difícil. Por tanto, con el fin de obtener una alta concentración de éster etílico de DGLA con un bajo contenido de ARA, se entiende que es eficaz aumentar la relación DGLA/ARA de antemano, en una etapa temprana.
En particular, se entiende que el cultivo de una cepa microbiana mientras se añaden dos tipos de inhibidores de A5 desaturasa en combinación (por ejemplo, sesamina y 2-amino-N-(3-clorofenil)benzamida) durante el crecimiento del microbio es eficaz para esto.
Por tanto, se entiende que la presente invención proporciona un microbio y un aceite microbiano que incluye un aceite que tiene una alta relación DGLA/ARA, y también proporciona ésteres de alcoholes inferiores y ácidos grasos libres obtenidos a partir de tales microbios y aceites.
Aplicabilidad industrial
El aceite microbiano que contiene DGLA de la presente invención tiene un bajo contenido de ácido araquidónico. Por tanto, mientras se administra una determinada cantidad de DGLA, el efecto del ácido araquidónico puede reducirse. Puede proporcionarse una composición que sea adecuada para aplicaciones para las que el ácido araquidónico no es deseable, por ejemplo como agentes antialérgicos y como agentes antiinflamatorios.

Claims (17)

REIVINDICACIONES
1. Un aceite microbiano que es un aceite crudo obtenido mediante el cultivo de un microbio del género Mortierella en un medio de cultivo y recuperando lípidos de la biomasa, comprendiendo el aceite ácido dihomo-Y-linolénico como ácido graso constituyente y que tiene un contenido de triglicéridos mayor o igual al 70 % en peso y una relación en peso de ácido araquidónico con respecto a ácido dihomo-Y-linolénico (ácido araquidónico/ácido dihomo-Y-linolénico) de menos de 1/15.
2. El aceite microbiano de acuerdo con la reivindicación 1, en el que dicha relación en peso es menor o igual a 1/20.
3. El aceite microbiano de acuerdo con la reivindicación 1 o 2 que tiene un contenido de triglicéridos superior o igual al 90 % en peso.
4. El aceite microbiano de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, que contiene fosfolípidos de 0,1 % a 10 % en peso.
5. El aceite microbiano de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que el aceite microbiano tiene un contenido de ácidos grasos saturados menor o igual al 40 % en peso.
6. Un aceite microbiano que es un aceite refinado obtenido refinando un aceite crudo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, y en el que el contenido de triglicéridos es mayor o igual al 90 % en peso y dicha relación en peso de ácido araquidónico con respecto al ácido dihomo-Y-linolénico es menor o igual a 1/20.
7. Aceite microbiano de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, para uso como medicamento, preferiblemente como agente antialérgico o antiinflamatorio.
8. Uso de aceite microbiano de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 en un método de producción de productos alimenticios, complementos dietéticos, medicamentos, cosméticos o piensos para animales.
9. Uso de acuerdo con la reivindicación 8, en el que el éster del ácido dihomo-Y-linolénico, o una composición de ácido graso libre que comprende ácido dihomo-Y-linolénico, se obtiene sometiendo el aceite microbiano a una reacción de intercambio de éster o reacción de hidrólisis.
10. Una biomasa microbiana de un microbio del género Mortierella, que contiene un aceite microbiano producido por el microbio y que comprende ácido dihomo- Y -linolénico como un ácido graso constituyente del aceite, teniendo el aceite microbiano un contenido de triglicéridos mayor o igual al 70 % en peso y una relación en peso de ácido araquidónico con respecto al ácido dihomo-Y-linolénico (ácido araquidónico/ácido dihomo-Y-linolénico) de menos de 1/15.
11. Un medio de cultivo líquido que contiene una biomasa microbiana de acuerdo con la reivindicación 10.
12. Un medio de cultivo líquido de acuerdo con la reivindicación 11, en el que un contenido de biomasa microbiana es mayor o igual a 2,5 g/L, en términos de peso seco de la biomasa microbiana.
13. Un medio de cultivo líquido de acuerdo con la reivindicación 11 o 12, en el que el medio de cultivo líquido contiene dicho aceite microbiano con un contenido de 0,4 g/L o superior.
14. Un método para producir una composición de éster de alcohol inferior que comprende éster de ácido dihomo-Y-linolénico, o una composición de ácido graso libre que comprende ácido dihomo-Y-linolénico, que comprende someter un aceite microbiano de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 a una reacción de intercambio de éster o reacción de hidrólisis.
15. Un método de acuerdo con la reivindicación 14 para producir una composición de éster de alcohol inferior o una composición de ácido graso libre a partir de un aceite microbiano de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, comprendiendo el método:
(a) obtener una mezcla de ácidos grasos libres o ésteres de ácidos grasos de alcoholes inferiores mediante hidrólisis o alcoholisis del aceite microbiano, y
(b) rectificar la mezcla de ácidos grasos libres o ésteres de alcoholes inferiores para obtener una composición de ácidos grasos libres o ésteres de alcoholes inferiores en la que los ácidos grasos tienen al menos 20 átomos de carbono.
16. Un método para producir un éster de ácido dihomo-Y-linolénico de alcohol inferior o ácido dihomo-Y-linolénico libre, que comprende producir una composición de éster de alcohol inferior o una composición de ácido graso libre de acuerdo con la reivindicación 15, y luego
(c) realizar el fraccionamiento y purificación del éster de alcohol inferior del ácido dihomo-Y-linolénico o del ácido dihomo-Y-linolénico, mediante cromatografía en columna del tipo de distribución en fase reversa, a partir de la composición de ácido graso libre o éster de alcohol inferior en la que los ácidos grados tienen al menos 20 átomos de carbono.
17. Un método de la reivindicación 16 que comprende además incorporar el ácido dihomo-Y-linolénico purificado o el éster de alcohol inferior del ácido dihomo-Y-linolénico en un medicamento.
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