JP2000069987A - アラキドン酸含有脂質並びにジホモ−γ−リノレン酸含有脂質の製造方法 - Google Patents
アラキドン酸含有脂質並びにジホモ−γ−リノレン酸含有脂質の製造方法Info
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Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
- C12P7/64—Fats; Fatty oils; Ester-type waxes; Higher fatty acids, i.e. having at least seven carbon atoms in an unbroken chain bound to a carboxyl group; Oxidised oils or fats
- C12P7/6436—Fatty acid esters
- C12P7/6445—Glycerides
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-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 全脂肪酸に対するアラキドン酸又はジホモ−
γ−リノレン酸の比率が上昇した、アラキドン酸又はジ
ホモ−γ−リノレン酸含有脂質の新規な製造方法。 【解決手段】 モルティエレラ (Mortierella ) 属など
に属しアラキドン酸生産能を有する微生物に変異処理を
施して得られる、ω３不飽和化活性の低下または欠失し
た変異株を、培地中で培養開始から、又は最適生育温度
で培養した後に、最適生育温度より低い温度で培養し、
その培養物からアラキドン酸を含有する脂質を採取する
ことを特徴とするアラキドン酸含有脂質の製造方法。
γ−リノレン酸の比率が上昇した、アラキドン酸又はジ
ホモ−γ−リノレン酸含有脂質の新規な製造方法。 【解決手段】 モルティエレラ (Mortierella ) 属など
に属しアラキドン酸生産能を有する微生物に変異処理を
施して得られる、ω３不飽和化活性の低下または欠失し
た変異株を、培地中で培養開始から、又は最適生育温度
で培養した後に、最適生育温度より低い温度で培養し、
その培養物からアラキドン酸を含有する脂質を採取する
ことを特徴とするアラキドン酸含有脂質の製造方法。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明はω３不飽和化活性の
低下または欠失した変異株を用いて醗酵法により、アラ
キドン酸含有脂質を製造する方法、またはジホモ−γ−
リノレン酸含有脂質を製造する方法に関する。
低下または欠失した変異株を用いて醗酵法により、アラ
キドン酸含有脂質を製造する方法、またはジホモ−γ−
リノレン酸含有脂質を製造する方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】アラキドン酸はドコサヘキサエン酸と同
じく母乳中に含まれており、乳児の発育に役立つとの報
告（「Advances in Polyunsaturated Fatty Acid Resea
rch 」, Elsevier Science Publishers, 1993, pp.261-
264 ）や、胎児の身長や脳の発育における重要性に関す
る報告（Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90, 1073-1077
(1993), Lancet, 344, 1319-1322 (1994) ）がなされ、
母乳と調製粉乳の脂肪酸組成の大きな違いであるアラキ
ドン酸及びドコサヘキサエン酸を調製粉乳に添加しよう
とする動きがある。
じく母乳中に含まれており、乳児の発育に役立つとの報
告（「Advances in Polyunsaturated Fatty Acid Resea
rch 」, Elsevier Science Publishers, 1993, pp.261-
264 ）や、胎児の身長や脳の発育における重要性に関す
る報告（Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90, 1073-1077
(1993), Lancet, 344, 1319-1322 (1994) ）がなされ、
母乳と調製粉乳の脂肪酸組成の大きな違いであるアラキ
ドン酸及びドコサヘキサエン酸を調製粉乳に添加しよう
とする動きがある。
【０００３】また早産児の場合のアラキドン酸およびド
コサヘキサエン酸の摂取量をそれぞれ６０mg/kg/日およ
び４０mg/kg/日に、成熟児の場合のアラキドン酸および
ドコサヘキサエン酸の摂取量をそれぞれ４０mg/kg/日お
よび２０mg/kg/日にするようにとの勧告書もＦＡＯ／Ｗ
ＨＯより出されている。そこでこれらの脂肪酸を大量に
得る方法として、従来から微生物による生産方法が知ら
れており、例えばモルティエレラ（Mortierella ）属に
属する微生物を使用して、安価な常用の培地を用いて、
従来法より短い培養時間で、高収率で、しかも単純な工
程でアラキドン酸を製造することができる方法が提供さ
れている（特公平７−３４７５２）。
コサヘキサエン酸の摂取量をそれぞれ６０mg/kg/日およ
び４０mg/kg/日に、成熟児の場合のアラキドン酸および
ドコサヘキサエン酸の摂取量をそれぞれ４０mg/kg/日お
よび２０mg/kg/日にするようにとの勧告書もＦＡＯ／Ｗ
ＨＯより出されている。そこでこれらの脂肪酸を大量に
得る方法として、従来から微生物による生産方法が知ら
れており、例えばモルティエレラ（Mortierella ）属に
属する微生物を使用して、安価な常用の培地を用いて、
従来法より短い培養時間で、高収率で、しかも単純な工
程でアラキドン酸を製造することができる方法が提供さ
れている（特公平７−３４７５２）。
【０００４】しかしながら、このような従来の製造方法
では、アラキドン酸の全脂肪酸に占める割合に関して
は、未だ満足いくものではない。すなわちアラキドン酸
を含有する脂質を食品などに添加する場合、出来る限り
アラキドン酸の含有率が高い方が、不必要な物質の添加
を最小限に抑えられ、また該脂質の食品への添加量を最
小限に抑えられるため、品質的にもコスト的にも好まし
く、また該脂質からアラキドン酸エチルエステルを分離
精製する場合にも、出来る限りアラキドン酸の含有率が
高い方が簡便かつ低コストで高純度品を得ることができ
るため好ましい。
では、アラキドン酸の全脂肪酸に占める割合に関して
は、未だ満足いくものではない。すなわちアラキドン酸
を含有する脂質を食品などに添加する場合、出来る限り
アラキドン酸の含有率が高い方が、不必要な物質の添加
を最小限に抑えられ、また該脂質の食品への添加量を最
小限に抑えられるため、品質的にもコスト的にも好まし
く、また該脂質からアラキドン酸エチルエステルを分離
精製する場合にも、出来る限りアラキドン酸の含有率が
高い方が簡便かつ低コストで高純度品を得ることができ
るため好ましい。
【０００５】脂質中のアラキドン酸の全脂肪酸に占める
割合を高める方法として、いくつかの方法が知られてい
る。例えば、モルティエレラ・アルピナ（Mortierella
alpina) を２８℃の通常の通気攪拌培養で培養し、グル
コースが完全に枯渇した状態で、さらに６日間培養を続
けることで６７．４％までアラキドン酸の割合を高める
ことに成功している（Appl. Microbial. Biotechnol, 3
1, 11-6 (1989)) 。しかし、この方法は、飢餓状態の菌
が生命を維持するために菌体内のトリグリセリドの飽和
度の低い脂肪酸をβ酸化しエネルギーに変換することを
利用している。
割合を高める方法として、いくつかの方法が知られてい
る。例えば、モルティエレラ・アルピナ（Mortierella
alpina) を２８℃の通常の通気攪拌培養で培養し、グル
コースが完全に枯渇した状態で、さらに６日間培養を続
けることで６７．４％までアラキドン酸の割合を高める
ことに成功している（Appl. Microbial. Biotechnol, 3
1, 11-6 (1989)) 。しかし、この方法は、飢餓状態の菌
が生命を維持するために菌体内のトリグリセリドの飽和
度の低い脂肪酸をβ酸化しエネルギーに変換することを
利用している。
【０００６】従ってアラキドン酸の総量には変化が無
く、低不飽和度の脂肪酸が減少することによって、相対
的にアラキドン酸の割合が高まっているに過ぎない。即
ち、アラキドン酸を高含有率で含むトリグリセリドの生
成量が上昇しているわけでなく、逆にβ酸化によりトリ
グリセリドの割合も低下していると考えられる。
く、低不飽和度の脂肪酸が減少することによって、相対
的にアラキドン酸の割合が高まっているに過ぎない。即
ち、アラキドン酸を高含有率で含むトリグリセリドの生
成量が上昇しているわけでなく、逆にβ酸化によりトリ
グリセリドの割合も低下していると考えられる。
【０００７】また一般に、アラキドン酸生産能を有する
微生物は、最適生育温度よりも低い温度では、不飽和脂
肪酸の不飽和度を高めることで細胞膜の流動性及び機能
を維持し低温環境に適応しようとするため、Δ６不飽和
化酵素やΔ５不飽和化酵素等の活性が高まり、アラキド
ン酸のような不飽和度の高い脂肪酸がより多く生成され
ることが知られている。従ってアラキドン酸の含有率を
高めるためには低温で培養することが望ましい。
微生物は、最適生育温度よりも低い温度では、不飽和脂
肪酸の不飽和度を高めることで細胞膜の流動性及び機能
を維持し低温環境に適応しようとするため、Δ６不飽和
化酵素やΔ５不飽和化酵素等の活性が高まり、アラキド
ン酸のような不飽和度の高い脂肪酸がより多く生成され
ることが知られている。従ってアラキドン酸の含有率を
高めるためには低温で培養することが望ましい。
【０００８】この性質を利用した方法として、モルティ
エレラ・アルピナ（Mortierella alpina) を２０℃の通
気攪拌培養で１６日間培養し、７１．２％までアラキド
ン酸の割合を高めることに成功している（「Industrial
Applications of Single Cell Oils 」, American Oil
Chemists' Society Champaign, 1992, pp.52-60) 。し
かし、この方法では培養に時間がかかりすぎて工業生産
には好ましくないばかりでなく、低温培養では、せっか
く生産されたアラキドン酸の一部が、低温で働くω３不
飽和化酵素（Biochem. Biophys. Res. Commun., 150, 3
35-341 (1988)）によってエイコサペンタエン酸に変換
されてしまい、全脂肪酸に占めるアラキドン酸の割合が
減少し、エイコサペンタエン酸の割合が増加してしまう
ことが知られている。
エレラ・アルピナ（Mortierella alpina) を２０℃の通
気攪拌培養で１６日間培養し、７１．２％までアラキド
ン酸の割合を高めることに成功している（「Industrial
Applications of Single Cell Oils 」, American Oil
Chemists' Society Champaign, 1992, pp.52-60) 。し
かし、この方法では培養に時間がかかりすぎて工業生産
には好ましくないばかりでなく、低温培養では、せっか
く生産されたアラキドン酸の一部が、低温で働くω３不
飽和化酵素（Biochem. Biophys. Res. Commun., 150, 3
35-341 (1988)）によってエイコサペンタエン酸に変換
されてしまい、全脂肪酸に占めるアラキドン酸の割合が
減少し、エイコサペンタエン酸の割合が増加してしまう
ことが知られている。
【０００９】例えば、モルティエレラ（Mortierella )
属糸状菌を１２℃で７週間培養した場合、ω３不飽和化
酵素が活性化され、全脂肪酸に対するＥＰＡの割合は２
−２０％に達し（J. Am.Oil Chem. Soc., 65, 1455-145
9 (1988)、それに伴ってアラキドン酸の割合は低下す
る。これに対し、本発明のω３不飽和化酵素が低下ある
いは欠損した株を用いることにより、アラキドン酸の脂
質中の全脂肪酸に対する割合を５０％以上、さらに変異
を繰り返した場合には７０％以上にも高めることがで
き、かつＥＰＡの割合を０．５％以下に押さえることが
できる。
属糸状菌を１２℃で７週間培養した場合、ω３不飽和化
酵素が活性化され、全脂肪酸に対するＥＰＡの割合は２
−２０％に達し（J. Am.Oil Chem. Soc., 65, 1455-145
9 (1988)、それに伴ってアラキドン酸の割合は低下す
る。これに対し、本発明のω３不飽和化酵素が低下ある
いは欠損した株を用いることにより、アラキドン酸の脂
質中の全脂肪酸に対する割合を５０％以上、さらに変異
を繰り返した場合には７０％以上にも高めることがで
き、かつＥＰＡの割合を０．５％以下に押さえることが
できる。
【００１０】本来、母乳中にはエイコサペンタエン酸は
ほとんど含まれておらず、最近の研究では未熟児の発育
には不都合であることが明かとなった（「Advances in
Polyunsaturated Fatty Acid Research 」, Elsevier S
cience Publishers, 1993, pp.261-264 ）。したがっ
て、エイコサペンタエン酸を全く含まない、あるいは含
んでもごくわずかな、アラキドン酸の含有率の高い脂質
を安価な常用の培地を用いて単純な工程で大量に製造す
る方法を開発することが強く望まれている。
ほとんど含まれておらず、最近の研究では未熟児の発育
には不都合であることが明かとなった（「Advances in
Polyunsaturated Fatty Acid Research 」, Elsevier S
cience Publishers, 1993, pp.261-264 ）。したがっ
て、エイコサペンタエン酸を全く含まない、あるいは含
んでもごくわずかな、アラキドン酸の含有率の高い脂質
を安価な常用の培地を用いて単純な工程で大量に製造す
る方法を開発することが強く望まれている。
【００１１】一方、ジホモ−γ−リノレン酸は、培養温
度に関係なくΔ５不飽和化酵素によってアラキドン酸に
変換されるが、ジホモ−γ−リノレン酸を醗酵法により
安価に大量生産する方法として、Δ５不飽和化酵素の活
性を阻害するような物質、例えばセサミン、エピセサミ
ン、セサミノール、エピセサミノール等やクルクミン等
を培地に添加して培養することや、アラキドン酸生産能
を有する微生物に突然変異を誘発させΔ５不飽和化活性
が低下又は欠損した変異株を用いて培養することが知ら
れている（特開平１−２４３９９２、特開平３−７２８
９２、特開平３−４９６８８、特開平５−９１８８７号
公報）。
度に関係なくΔ５不飽和化酵素によってアラキドン酸に
変換されるが、ジホモ−γ−リノレン酸を醗酵法により
安価に大量生産する方法として、Δ５不飽和化酵素の活
性を阻害するような物質、例えばセサミン、エピセサミ
ン、セサミノール、エピセサミノール等やクルクミン等
を培地に添加して培養することや、アラキドン酸生産能
を有する微生物に突然変異を誘発させΔ５不飽和化活性
が低下又は欠損した変異株を用いて培養することが知ら
れている（特開平１−２４３９９２、特開平３−７２８
９２、特開平３−４９６８８、特開平５−９１８８７号
公報）。
【００１２】しかしながら、この場合もジホモ−γ−リ
ノレン酸の含有率を高めようと最適生育温度よりも低い
温度、例えば１２℃で培養すると上述のω３不飽和化酵
素が作用し、ジホモ−γ−リノレン酸の一部が８，１
１，１４，１７−エイコサテトラエン酸に変換されてし
まうため、ジホモ−γ−リノレン酸の割合が減少し、
８，１１，１４，１７−エイコサテトラエン酸の割合が
増加してしまうことが懸念される。したがって、ジホモ
−γ−リノレン酸の含有率の高い脂質を安価な常用の培
地を用いて単純な工程で大量に製造する方法を開発する
ことが強く望まれている。
ノレン酸の含有率を高めようと最適生育温度よりも低い
温度、例えば１２℃で培養すると上述のω３不飽和化酵
素が作用し、ジホモ−γ−リノレン酸の一部が８，１
１，１４，１７−エイコサテトラエン酸に変換されてし
まうため、ジホモ−γ−リノレン酸の割合が減少し、
８，１１，１４，１７−エイコサテトラエン酸の割合が
増加してしまうことが懸念される。したがって、ジホモ
−γ−リノレン酸の含有率の高い脂質を安価な常用の培
地を用いて単純な工程で大量に製造する方法を開発する
ことが強く望まれている。
【００１３】
【発明が解決しようとする課題】従って本発明は、アラ
キドン酸の含有率が高く、エイコサペンタエン酸を全く
含まないあるいは含んでもごくわずかな、アラキドン酸
含有脂質を安価な常用の培地を用いて単純な工程で大量
に製造する方法、並びにエイコサペンタエン酸や８，１
１，１４，１７−エイコサテトラエン酸を全く含まな
い、あるいは含んでもごくわずかな、ジホモ−γ−リノ
レン酸の含有率の高い脂質を安価な常用の培地を用いて
単純な工程で大量に製造する方法を提供しようとするも
のである。
キドン酸の含有率が高く、エイコサペンタエン酸を全く
含まないあるいは含んでもごくわずかな、アラキドン酸
含有脂質を安価な常用の培地を用いて単純な工程で大量
に製造する方法、並びにエイコサペンタエン酸や８，１
１，１４，１７−エイコサテトラエン酸を全く含まな
い、あるいは含んでもごくわずかな、ジホモ−γ−リノ
レン酸の含有率の高い脂質を安価な常用の培地を用いて
単純な工程で大量に製造する方法を提供しようとするも
のである。
【００１４】
【課題を解決するための手段】本発明者等は、上記の目
的を達成するため、種々研究の結果、アラキドン酸生産
能を有する微生物に変異処理を施して得られる、ω３不
飽和化活性の低下または欠失した微生物を見出し本発明
を完成した。
的を達成するため、種々研究の結果、アラキドン酸生産
能を有する微生物に変異処理を施して得られる、ω３不
飽和化活性の低下または欠失した微生物を見出し本発明
を完成した。
【００１５】すなわち本発明は、モルティエレラ（Mort
ierella ）属、コニディオボラス（Conidiobolus）属、
フィチウム（Pythium ）属、フィトフトラ（Phytophtho
ra）属、ペニシリューム（Penicillium ）属、クラドス
ポリューム（Cladosporium）属、ムコール（Mucor ）
属、フザリューム（Fusarium）属、アスペルギルス（As
pergillus ）属、ロードトルラ（Rhodotorula ）属、エ
ントモフトラ（Entomophthora ）属、エキノスポランジ
ウム（Echinosporangium）属またはサプロレグニア（Sa
prolegnia ）属に属しアラキドン酸生産能を有する微生
物に変異処理を施して得られる、ω３不飽和化活性の低
下または欠失した微生物を、培地中で培養開始から、又
は最適生育温度で培養した後に、最適生育温度より低い
温度で培養し、その培養物からアラキドン酸を含有する
脂質を採取することを特徴とするアラキドン酸を含有す
る脂質の製造方法を提供するものである。
ierella ）属、コニディオボラス（Conidiobolus）属、
フィチウム（Pythium ）属、フィトフトラ（Phytophtho
ra）属、ペニシリューム（Penicillium ）属、クラドス
ポリューム（Cladosporium）属、ムコール（Mucor ）
属、フザリューム（Fusarium）属、アスペルギルス（As
pergillus ）属、ロードトルラ（Rhodotorula ）属、エ
ントモフトラ（Entomophthora ）属、エキノスポランジ
ウム（Echinosporangium）属またはサプロレグニア（Sa
prolegnia ）属に属しアラキドン酸生産能を有する微生
物に変異処理を施して得られる、ω３不飽和化活性の低
下または欠失した微生物を、培地中で培養開始から、又
は最適生育温度で培養した後に、最適生育温度より低い
温度で培養し、その培養物からアラキドン酸を含有する
脂質を採取することを特徴とするアラキドン酸を含有す
る脂質の製造方法を提供するものである。
【００１６】さらに本発明は、モルティエレラ（Mortie
rella ）亜属に属する微生物に変異処理を施して得られ
る、ω３不飽和化活性の低下または欠失した微生物を、
培地中で培養開始時より又は２０〜４０℃で培養した後
に、２０℃より低い温度で培養し、その培養物からアラ
キドン酸を含有する脂質を採取することを特徴とするア
ラキドン酸を含有する脂質の製造方法を提供するもので
ある。
rella ）亜属に属する微生物に変異処理を施して得られ
る、ω３不飽和化活性の低下または欠失した微生物を、
培地中で培養開始時より又は２０〜４０℃で培養した後
に、２０℃より低い温度で培養し、その培養物からアラ
キドン酸を含有する脂質を採取することを特徴とするア
ラキドン酸を含有する脂質の製造方法を提供するもので
ある。
【００１７】また本発明は、モルティエレラ（Mortiere
lla ）属、コニディオボラス（Conidiobolus）属、フィ
チウム（Pythium ）属、フィトフトラ（Phytophthora）
属、ペニシリューム（Penicillium ）属、クラドスポリ
ューム（Cladosporium）属、ムコール（Mucor ）属、フ
ザリューム（Fusarium）属、アスペルギルス（Aspergil
lus ）属、ロードトルラ（Rhodotorula ）属、エントモ
フトラ（Entomophthora ）属、エキノスポランジウム
（Echinosporangium）属またはサプロレグニア（Saprol
egnia ）属に属しアラキドン酸生産能を有する微生物に
変異処理を施して得られるΔ５不飽和化活性の低下また
は欠失した微生物に、変異処理を施して得られるω３不
飽和化活性の低下または欠失した微生物を、培地中で培
養開始時より又は最適生育温度で培養した後に、最適生
育温度より低い温度で培養し、その培養物からジホモ−
γ−リノレン酸を含有する脂質を採取することを特徴と
するジホモ−γ−リノレン酸を含有する脂質の製造方法
を提供するものである。
lla ）属、コニディオボラス（Conidiobolus）属、フィ
チウム（Pythium ）属、フィトフトラ（Phytophthora）
属、ペニシリューム（Penicillium ）属、クラドスポリ
ューム（Cladosporium）属、ムコール（Mucor ）属、フ
ザリューム（Fusarium）属、アスペルギルス（Aspergil
lus ）属、ロードトルラ（Rhodotorula ）属、エントモ
フトラ（Entomophthora ）属、エキノスポランジウム
（Echinosporangium）属またはサプロレグニア（Saprol
egnia ）属に属しアラキドン酸生産能を有する微生物に
変異処理を施して得られるΔ５不飽和化活性の低下また
は欠失した微生物に、変異処理を施して得られるω３不
飽和化活性の低下または欠失した微生物を、培地中で培
養開始時より又は最適生育温度で培養した後に、最適生
育温度より低い温度で培養し、その培養物からジホモ−
γ−リノレン酸を含有する脂質を採取することを特徴と
するジホモ−γ−リノレン酸を含有する脂質の製造方法
を提供するものである。
【００１８】さらに本発明は、モルティエレラ（Mortie
rella ）亜属に属する微生物に変異処理を施して得られ
るΔ５不飽和化活性の低下または欠失した微生物に、変
異処理を施して得られるω３不飽和化活性の低下または
欠失した微生物を、培地中で培養開始時より又は２０〜
４０℃で培養した後に、２０℃より低い温度で培養し、
その培養物からジホモ−γ−リノレン酸を含有する脂質
を採取することを特徴とするジホモ−γ−リノレン酸を
含有する脂質の製造方法を提供するものである。
rella ）亜属に属する微生物に変異処理を施して得られ
るΔ５不飽和化活性の低下または欠失した微生物に、変
異処理を施して得られるω３不飽和化活性の低下または
欠失した微生物を、培地中で培養開始時より又は２０〜
４０℃で培養した後に、２０℃より低い温度で培養し、
その培養物からジホモ−γ−リノレン酸を含有する脂質
を採取することを特徴とするジホモ−γ−リノレン酸を
含有する脂質の製造方法を提供するものである。
【００１９】
【発明の実施の形態】本発明において、変異処理を施す
微生物として、Δ６不飽和化酵素及びΔ５不飽和化酵素
を有し、脂肪酸生合成経路中でアラキドン酸まで生産す
ることができるモルティエレラ（Mortierella ）属、コ
ニディオボラス（Conidiobolus）属、フィチウム（Pyth
ium ）属、フィトフトラ（Phytophthora）属、ペニシリ
ューム（Penicillium ）属、クロドスポリューム（Clad
osporium）属、ムコール（Mucor ）属、フザリューム
（Fusarium）属、アスペルギルス（Aspergillus ）属、
ロードトルラ（Rhodotorula ）属、エントモフトラ（En
tomophthora ）属、エキノスポランジウム（Echinospor
angium）属およびサプロレグニア（Saprolegnia ）属に
属する微生物を、より好ましくはモルティエレラ（Mort
ierella ）属、コニディオボラス（Conidiobolus）属、
フィチウム（Pythium ）属、エントモフトラ（Entomoph
thora ）属、エキノスポランジウム（Echinosporangiu
m）属及びサプロレグニア（Saprolegnia ）属に属する
微生物を挙げることができる。
微生物として、Δ６不飽和化酵素及びΔ５不飽和化酵素
を有し、脂肪酸生合成経路中でアラキドン酸まで生産す
ることができるモルティエレラ（Mortierella ）属、コ
ニディオボラス（Conidiobolus）属、フィチウム（Pyth
ium ）属、フィトフトラ（Phytophthora）属、ペニシリ
ューム（Penicillium ）属、クロドスポリューム（Clad
osporium）属、ムコール（Mucor ）属、フザリューム
（Fusarium）属、アスペルギルス（Aspergillus ）属、
ロードトルラ（Rhodotorula ）属、エントモフトラ（En
tomophthora ）属、エキノスポランジウム（Echinospor
angium）属およびサプロレグニア（Saprolegnia ）属に
属する微生物を、より好ましくはモルティエレラ（Mort
ierella ）属、コニディオボラス（Conidiobolus）属、
フィチウム（Pythium ）属、エントモフトラ（Entomoph
thora ）属、エキノスポランジウム（Echinosporangiu
m）属及びサプロレグニア（Saprolegnia ）属に属する
微生物を挙げることができる。
【００２０】より具体的にはフィチウム（Pythium ）属
に属する微生物として例えばフィチウム・インシジオス
ム（Pythium insidiosm ）ＡＴＣＣ２８２５１を、また
エキノスポランジウム（Echinosporangium）属に属する
微生物として例えばエキノスポランジウム・トランスバ
ーサリス（Echinosporangium transversalis）ＡＴＣＣ
１６９６０（ＮＲＲＬ３１１６）およびＡＴＣＣ１８０
３６（ＮＲＲＬ５５２５）を、サプロレグニア（Saprol
egnia ）属に属する微生物として例えばサプロレグニア
・フェラクス（Saprolegnia ferax ）ＣＢＳ５３４．６
７、サプロレグニア・ラッポニカ（Saprolegnia lappon
ica ）ＣＢＳ２８４．３８、サプロレグニア・リトラリ
ス（Saprolegnia litoralis ）ＣＢＳ５３５．６７、サ
プロレグニア・モニリゲラ（Saprolegnia moniligera）
ＣＢＳ５５８．６７およびサプロレグニア・ツルフォサ
（Saprolegnia turfosa ）ＣＢＳ３１３．８２等の菌株
を挙げることができる。
に属する微生物として例えばフィチウム・インシジオス
ム（Pythium insidiosm ）ＡＴＣＣ２８２５１を、また
エキノスポランジウム（Echinosporangium）属に属する
微生物として例えばエキノスポランジウム・トランスバ
ーサリス（Echinosporangium transversalis）ＡＴＣＣ
１６９６０（ＮＲＲＬ３１１６）およびＡＴＣＣ１８０
３６（ＮＲＲＬ５５２５）を、サプロレグニア（Saprol
egnia ）属に属する微生物として例えばサプロレグニア
・フェラクス（Saprolegnia ferax ）ＣＢＳ５３４．６
７、サプロレグニア・ラッポニカ（Saprolegnia lappon
ica ）ＣＢＳ２８４．３８、サプロレグニア・リトラリ
ス（Saprolegnia litoralis ）ＣＢＳ５３５．６７、サ
プロレグニア・モニリゲラ（Saprolegnia moniligera）
ＣＢＳ５５８．６７およびサプロレグニア・ツルフォサ
（Saprolegnia turfosa ）ＣＢＳ３１３．８２等の菌株
を挙げることができる。
【００２１】特に本発明ではアラキドン酸の生産能力が
高いモルティエレラ（Mortierella）属モルティエレラ
（Mortierella ）亜属に属する微生物が好ましい。本発
明のモルティエレラ（Mortierella ）属モルティエレラ
（Mortierella ）亜属に属する微生物としては、例えば
モルティエレラ・エロンガタ（Mortierella elongat
a）、モルティエレラ・エキシグア（Mortierella exigu
a）、モルティエレラ・フィグロフィラ（Mortierella h
ygrophila）、モルティエレラ・アルピナ（Mortierella
alpina）、モルティエレラ・パルビスポラ（Mortierel
la parvispora）、モルティエレラ・ベルジャコバ（Mor
tierella beljakovae）、モルティエレラ・グロバルピ
ナ（Mortierella globalpina）、モルティエレラ・エピ
ガマ（Mortierella epigama ）、モルティエレラ・クフ
ルマニ（Mortierella kuhlmanii ）、モルティエレラ・
アクロトナ（Mortierella acrotona）、モルティエレラ
・ザイチャ（Mortierella zychae）、モルティエレラ・
リシケシャ（Mortierella rishikesha）、モルティエレ
ラ・ミヌチシマ（Mortierella minutissima ）、モルテ
ィエレラ・バイニエリ（Mortierella bainieri）、モル
ティエレラ・シュマッカリ（Mortierella schmuckeri）
等を挙げることができ、
高いモルティエレラ（Mortierella）属モルティエレラ
（Mortierella ）亜属に属する微生物が好ましい。本発
明のモルティエレラ（Mortierella ）属モルティエレラ
（Mortierella ）亜属に属する微生物としては、例えば
モルティエレラ・エロンガタ（Mortierella elongat
a）、モルティエレラ・エキシグア（Mortierella exigu
a）、モルティエレラ・フィグロフィラ（Mortierella h
ygrophila）、モルティエレラ・アルピナ（Mortierella
alpina）、モルティエレラ・パルビスポラ（Mortierel
la parvispora）、モルティエレラ・ベルジャコバ（Mor
tierella beljakovae）、モルティエレラ・グロバルピ
ナ（Mortierella globalpina）、モルティエレラ・エピ
ガマ（Mortierella epigama ）、モルティエレラ・クフ
ルマニ（Mortierella kuhlmanii ）、モルティエレラ・
アクロトナ（Mortierella acrotona）、モルティエレラ
・ザイチャ（Mortierella zychae）、モルティエレラ・
リシケシャ（Mortierella rishikesha）、モルティエレ
ラ・ミヌチシマ（Mortierella minutissima ）、モルテ
ィエレラ・バイニエリ（Mortierella bainieri）、モル
ティエレラ・シュマッカリ（Mortierella schmuckeri）
等を挙げることができ、
【００２２】具体的にはモルティエレラ・エロンガタ
（Mortierella elongata）ＩＦＯ８５７０、モルティエ
レラ・エキシグア（Mortierella exigua）ＩＦＯ８５７
１、モルティエレラ・フィグロフィラ（Mortierella hy
grophila）ＩＦＯ５９４１、モルティエレラ・アルピナ
（Mortierella alpina）ＩＦＯ８５６８、ＡＴＣＣ１６
２６６、ＡＴＣＣ３２２２１、ＡＴＣＣ４２４３０、Ｃ
ＢＳ２１９．３５、ＣＢＳ２２４．３７、ＣＢＳ２５
０．５３、ＣＢＳ３４３．６６、ＣＢＳ５２７．７２、
ＣＢＳ５２９．７２、ＣＢＳ６０８．７０、ＣＢＳ７５
４．６８等の菌株を挙げることができる。
（Mortierella elongata）ＩＦＯ８５７０、モルティエ
レラ・エキシグア（Mortierella exigua）ＩＦＯ８５７
１、モルティエレラ・フィグロフィラ（Mortierella hy
grophila）ＩＦＯ５９４１、モルティエレラ・アルピナ
（Mortierella alpina）ＩＦＯ８５６８、ＡＴＣＣ１６
２６６、ＡＴＣＣ３２２２１、ＡＴＣＣ４２４３０、Ｃ
ＢＳ２１９．３５、ＣＢＳ２２４．３７、ＣＢＳ２５
０．５３、ＣＢＳ３４３．６６、ＣＢＳ５２７．７２、
ＣＢＳ５２９．７２、ＣＢＳ６０８．７０、ＣＢＳ７５
４．６８等の菌株を挙げることができる。
【００２３】これらの菌株はいずれも、大阪市の財団法
人醗酵研究所（ＩＦＯ）、及び米国アメリカン・タイプ
・カルチャー・コレクション（American Type Culture
Collection，ＡＴＣＣ）及び、Centrralbureau voor Sc
himmelcultures（ＣＢＳ）からなんら制限なく入手する
ことができる。また我々研究グループが土壌から分離し
た菌株モルティエレラ・エロンガタＳＡＭ０２１９（微
工研菌寄第８７０３号）（微工研条寄第１２３９号）を
使用することもできる。
人醗酵研究所（ＩＦＯ）、及び米国アメリカン・タイプ
・カルチャー・コレクション（American Type Culture
Collection，ＡＴＣＣ）及び、Centrralbureau voor Sc
himmelcultures（ＣＢＳ）からなんら制限なく入手する
ことができる。また我々研究グループが土壌から分離し
た菌株モルティエレラ・エロンガタＳＡＭ０２１９（微
工研菌寄第８７０３号）（微工研条寄第１２３９号）を
使用することもできる。
【００２４】また本発明において変異処理を施す微生物
としては、上記の微生物の野生株に限らず上記の微生物
（野生株）、好ましくはモルティエレラ（Mortierella
）属モルティエレラ（Mortierella ）亜属に属する微
生物（野生株）の変異株又は組換え株、即ち、同じ基質
を用いて培養したときに、元の野生株が産生する量と比
べて、脂質中のアラキドン酸又はジホモ−γ−リノレン
酸の含量が多くなるように、または総脂質量が多くなる
ように、あるいはその両方を意図して設計されたものが
含まれる。
としては、上記の微生物の野生株に限らず上記の微生物
（野生株）、好ましくはモルティエレラ（Mortierella
）属モルティエレラ（Mortierella ）亜属に属する微
生物（野生株）の変異株又は組換え株、即ち、同じ基質
を用いて培養したときに、元の野生株が産生する量と比
べて、脂質中のアラキドン酸又はジホモ−γ−リノレン
酸の含量が多くなるように、または総脂質量が多くなる
ように、あるいはその両方を意図して設計されたものが
含まれる。
【００２５】さらに費用効果の優れた基質を効率よく用
いて、対応する野生株と同量の不飽和脂肪酸を産生する
ように設計された微生物も含まれる。例えばΔ１２不飽
和化活性が欠失しかつΔ６不飽和化活性が上昇した変異
株としてモルティエレラ・アルピナＳＡＭ２０８６（微
工研条寄第６０３２号、ＦＥＲＭ ＢＰ−６０３２）
や、人為的にジホモ−γ−リノレン酸の生産性を増加さ
せるために誘発したΔ５不飽和化活性が欠失した変異株
としてモルティエレラ・アルピナＳＡＭ１８６０（微工
研条寄第３５８９号、ＦＥＲＭ ＢＰ−３５８９）を挙
げることができる。これらの菌株はいずれも、財団法人
醗酵研究所からなんら制限なく入手することができる。
いて、対応する野生株と同量の不飽和脂肪酸を産生する
ように設計された微生物も含まれる。例えばΔ１２不飽
和化活性が欠失しかつΔ６不飽和化活性が上昇した変異
株としてモルティエレラ・アルピナＳＡＭ２０８６（微
工研条寄第６０３２号、ＦＥＲＭ ＢＰ−６０３２）
や、人為的にジホモ−γ−リノレン酸の生産性を増加さ
せるために誘発したΔ５不飽和化活性が欠失した変異株
としてモルティエレラ・アルピナＳＡＭ１８６０（微工
研条寄第３５８９号、ＦＥＲＭ ＢＰ−３５８９）を挙
げることができる。これらの菌株はいずれも、財団法人
醗酵研究所からなんら制限なく入手することができる。
【００２６】また本発明において、本発明のω３不飽和
化活性が低下した変異株に変異処理を施し、ω３不飽和
化活性がさらに低下したあるいは欠失した変異株を得る
こともできる。本発明においてω３不飽和化活性とは、
脂肪酸のメチル基から数えて第３番目と第４番目の炭素
の間に二重結合を入れる作用を言うものであり、ω３不
飽和化活性の低下または欠失した微生物は、容易にその
ω３不飽和化活性の低下または欠失を判定することがで
きる。
化活性が低下した変異株に変異処理を施し、ω３不飽和
化活性がさらに低下したあるいは欠失した変異株を得る
こともできる。本発明においてω３不飽和化活性とは、
脂肪酸のメチル基から数えて第３番目と第４番目の炭素
の間に二重結合を入れる作用を言うものであり、ω３不
飽和化活性の低下または欠失した微生物は、容易にその
ω３不飽和化活性の低下または欠失を判定することがで
きる。
【００２７】具体的には、アラキドン酸含有脂質の製造
においては、親株を変異処理して得られた変異株を最適
生育温度よりも低い温度、たとえば２０℃よりも低い温
度で培養した際の菌体内のエイコサペンタエン酸の全脂
肪酸に占める割合で判定することができる。つまり低温
培養下での親株と変異株のエイコサペンタエン酸の割合
を比較した場合に親株のエイコサペンタエン酸の割合を
１として、変異株のエイコサペンタエン酸の割合が１以
下の時、活性が低下していると言え、０の時、活性が欠
失していると言える。
においては、親株を変異処理して得られた変異株を最適
生育温度よりも低い温度、たとえば２０℃よりも低い温
度で培養した際の菌体内のエイコサペンタエン酸の全脂
肪酸に占める割合で判定することができる。つまり低温
培養下での親株と変異株のエイコサペンタエン酸の割合
を比較した場合に親株のエイコサペンタエン酸の割合を
１として、変異株のエイコサペンタエン酸の割合が１以
下の時、活性が低下していると言え、０の時、活性が欠
失していると言える。
【００２８】またジホモ−γ−リノレン酸含有脂質の製
造においては、親株（例えばΔ５不飽和化活性の低下ま
たは欠失した変異株）を変異処理して得られた変異株を
最適生育温度よりも低い温度、たとえば２０℃よりも低
い温度で培養した際の菌体内の８，１１，１４，１７−
エイコサテトラエン酸の全脂肪酸に占める割合で判定す
ることができる。つまり低温培養下での親株と変異株の
比較において親株の８，１１，１４，１７−エイコサテ
トラエン酸の割合を１として、変異株が１以下の時、活
性が低下し、０の時、活性欠失していると言える。
造においては、親株（例えばΔ５不飽和化活性の低下ま
たは欠失した変異株）を変異処理して得られた変異株を
最適生育温度よりも低い温度、たとえば２０℃よりも低
い温度で培養した際の菌体内の８，１１，１４，１７−
エイコサテトラエン酸の全脂肪酸に占める割合で判定す
ることができる。つまり低温培養下での親株と変異株の
比較において親株の８，１１，１４，１７−エイコサテ
トラエン酸の割合を１として、変異株が１以下の時、活
性が低下し、０の時、活性欠失していると言える。
【００２９】本発明のジホモ−γ−リノレン酸の製造方
法において使用する微生物としては、アラキドン酸生産
能を有する微生物を変異処理して得られる、ω３不飽和
化活性が低下または欠失した変異株を使用することがで
きるが、さらにΔ５不飽和化活性が低下または欠失した
変異株を用いるのが好ましい。ω３不飽和化活性が低下
又は欠失し、且つΔ５不飽和化活性が低下または欠失し
た変異株を得るには、本発明において得られるω３不飽
和化活性が低下又は欠失した変異株をさらに変異処理し
て、Δ５不飽和化活性が低下又は欠失した変異株を選択
することができる。あるいは、すでにΔ５不飽和化活性
が低下又は欠失している株を変異処理して、さらにω３
不飽和化活性が低下又は欠失させることによっても得ら
れる。
法において使用する微生物としては、アラキドン酸生産
能を有する微生物を変異処理して得られる、ω３不飽和
化活性が低下または欠失した変異株を使用することがで
きるが、さらにΔ５不飽和化活性が低下または欠失した
変異株を用いるのが好ましい。ω３不飽和化活性が低下
又は欠失し、且つΔ５不飽和化活性が低下または欠失し
た変異株を得るには、本発明において得られるω３不飽
和化活性が低下又は欠失した変異株をさらに変異処理し
て、Δ５不飽和化活性が低下又は欠失した変異株を選択
することができる。あるいは、すでにΔ５不飽和化活性
が低下又は欠失している株を変異処理して、さらにω３
不飽和化活性が低下又は欠失させることによっても得ら
れる。
【００３０】本発明において変異処理は、放射線（Ｘ
線、ガンマー線、中性子線、重イオン）照射や紫外線照
射、高熱処理等を行って突然変異を誘発させたり、また
微生物を適当なバッファー中などに懸濁し、変異源を加
えて一定時間インキュベート後、適当に希釈して寒天培
地に植菌し、変異株のコロニーを得るといった一般的な
突然変異操作により行うことができる。
線、ガンマー線、中性子線、重イオン）照射や紫外線照
射、高熱処理等を行って突然変異を誘発させたり、また
微生物を適当なバッファー中などに懸濁し、変異源を加
えて一定時間インキュベート後、適当に希釈して寒天培
地に植菌し、変異株のコロニーを得るといった一般的な
突然変異操作により行うことができる。
【００３１】変異源としては、ナイトロジェンマスター
ド、メチルメタンサルホネート（MMS ）、Ｎ−メチル−
N −ニトロ−N −ニトロソグアニジン（ＮＴＧ）等のア
ルキル化剤や、５−ブロモウラシル等の塩基類似体や、
マイトマイシンC 等の抗生物質や、６−メルカプトプリ
ン等の塩基合成阻害剤や、プロフラビン等の色素類（そ
の他の誘導体）や、４−ニトロキノリン−N −オキシド
等のある種の発がん剤や塩化マンガン、ホルムアルデヒ
ド等のその他の化合物を挙げることができる。また使用
する微生物は、生育菌体（菌糸など）でも良いし、胞子
でも良い。
ド、メチルメタンサルホネート（MMS ）、Ｎ−メチル−
N −ニトロ−N −ニトロソグアニジン（ＮＴＧ）等のア
ルキル化剤や、５−ブロモウラシル等の塩基類似体や、
マイトマイシンC 等の抗生物質や、６−メルカプトプリ
ン等の塩基合成阻害剤や、プロフラビン等の色素類（そ
の他の誘導体）や、４−ニトロキノリン−N −オキシド
等のある種の発がん剤や塩化マンガン、ホルムアルデヒ
ド等のその他の化合物を挙げることができる。また使用
する微生物は、生育菌体（菌糸など）でも良いし、胞子
でも良い。
【００３２】例えば本発明の変異株として、アラキドン
酸生産能を有するモルティエレラ・アルピナＩＦＯ８５
６８から本発明者らが誘導したω３不飽和化活性が限り
なく低下したモルティエレラ・アルピナＳＡＭ２１５３
（ＦＥＲＭ Ｐ−１５７６７）を使用することができる
が、この菌株に限定しているわけではなく、低温培養下
での親株のエイコサペンタエン酸の割合を１として、１
以下の活性を示す変異株をすべて使用することができ
る。
酸生産能を有するモルティエレラ・アルピナＩＦＯ８５
６８から本発明者らが誘導したω３不飽和化活性が限り
なく低下したモルティエレラ・アルピナＳＡＭ２１５３
（ＦＥＲＭ Ｐ−１５７６７）を使用することができる
が、この菌株に限定しているわけではなく、低温培養下
での親株のエイコサペンタエン酸の割合を１として、１
以下の活性を示す変異株をすべて使用することができ
る。
【００３３】本発明に使用される菌株を培養する為に
は、その菌株の胞子、菌糸、又は予め培養して得られた
前培養液を、液体培地又は固体培地に接種し培養する。
液体培地の場合に、炭素源としてはグルコース、フラク
トース、キシロース、サッカロース、マルトース、可溶
性デンプン、糖蜜、グリセロール、マンニトール等の一
般的に使用されているものが、いずれも使用できるが、
これらに限られるものではない。窒素源としてはペプト
ン、酵母エキス、麦芽エキス、肉エキス、カザミノ酸、
コーンスティープリカー、大豆タンパク、脱脂ダイズ、
綿実カス等の天然窒素源の他に、尿素等の有機窒素源、
ならびに硝酸ナトリウム、硝酸アンモニウム、硫酸アン
モニウム等の無機窒素源を用いることができる。
は、その菌株の胞子、菌糸、又は予め培養して得られた
前培養液を、液体培地又は固体培地に接種し培養する。
液体培地の場合に、炭素源としてはグルコース、フラク
トース、キシロース、サッカロース、マルトース、可溶
性デンプン、糖蜜、グリセロール、マンニトール等の一
般的に使用されているものが、いずれも使用できるが、
これらに限られるものではない。窒素源としてはペプト
ン、酵母エキス、麦芽エキス、肉エキス、カザミノ酸、
コーンスティープリカー、大豆タンパク、脱脂ダイズ、
綿実カス等の天然窒素源の他に、尿素等の有機窒素源、
ならびに硝酸ナトリウム、硝酸アンモニウム、硫酸アン
モニウム等の無機窒素源を用いることができる。
【００３４】この他必要に応じリン酸塩、硫酸マグネシ
ウム、硫酸鉄、硫酸銅等の無機塩及びビタミン等も微量
栄養源として使用できる。これらの培地成分は微生物の
生育を害しない濃度であれば特に制限はない。実用上一
般に、炭素源は０．１〜４０重量％、好ましくは１〜２
５重量％、窒素源は０．０１〜１０重量％、好ましくは
０．１〜１０重量％の濃度とするのが望ましく、より好
ましくは初発の炭素源添加量を１〜５重量％、初発の窒
素源添加量を０．１〜６重量％として、培養途中で炭素
源及び窒素源を、さらに、より好ましくは、炭素源のみ
を流加して培養する。
ウム、硫酸鉄、硫酸銅等の無機塩及びビタミン等も微量
栄養源として使用できる。これらの培地成分は微生物の
生育を害しない濃度であれば特に制限はない。実用上一
般に、炭素源は０．１〜４０重量％、好ましくは１〜２
５重量％、窒素源は０．０１〜１０重量％、好ましくは
０．１〜１０重量％の濃度とするのが望ましく、より好
ましくは初発の炭素源添加量を１〜５重量％、初発の窒
素源添加量を０．１〜６重量％として、培養途中で炭素
源及び窒素源を、さらに、より好ましくは、炭素源のみ
を流加して培養する。
【００３５】本発明の変異株は、培地中で培養開始から
菌の最適生育温度より低い温度で培養するか、あるいは
最適生育温度で培養した後に、最適生育温度より低い温
度で培養する。ここで最適生育温度とは使用する微生物
によって異なるが、２０〜４０℃、好ましくは２０〜３
０℃であり、最適生育温度より低い温度とは２５℃より
低い温度、好ましくは２０℃より低い温度、さらに好ま
しくは２０℃より低く５℃以上の温度である。このよう
な温度管理により、菌体内への油脂の蓄積を上昇せしめ
ることができる。
菌の最適生育温度より低い温度で培養するか、あるいは
最適生育温度で培養した後に、最適生育温度より低い温
度で培養する。ここで最適生育温度とは使用する微生物
によって異なるが、２０〜４０℃、好ましくは２０〜３
０℃であり、最適生育温度より低い温度とは２５℃より
低い温度、好ましくは２０℃より低い温度、さらに好ま
しくは２０℃より低く５℃以上の温度である。このよう
な温度管理により、菌体内への油脂の蓄積を上昇せしめ
ることができる。
【００３６】培養期間は、培養開始時から最適生育温度
より低い温度で培養する場合には、２〜２０日間、好ま
しくは２〜１４日間行う。また最適生育温度で培養した
後に、最適生育温度より低い温度で培養する場合には、
最適生育温度で１〜６日間、好ましくは１〜４日間行
い、最適生育温度より低い温度で２〜１４日間、好まし
くは２〜１０日間行う。培地のｐＨは４〜１０、好まし
くは６〜９として、通気攪拌培養、振盪培養又は静置培
養を行う。
より低い温度で培養する場合には、２〜２０日間、好ま
しくは２〜１４日間行う。また最適生育温度で培養した
後に、最適生育温度より低い温度で培養する場合には、
最適生育温度で１〜６日間、好ましくは１〜４日間行
い、最適生育温度より低い温度で２〜１４日間、好まし
くは２〜１０日間行う。培地のｐＨは４〜１０、好まし
くは６〜９として、通気攪拌培養、振盪培養又は静置培
養を行う。
【００３７】固体培養で培養する場合は、固形物重量に
対して５０〜１００重量％の水を加えたふすま、もみが
ら、米ぬか等を用い、前記の温度において、３〜１４日
間培養を行う。この場合に必要に応じて培地中に窒素
源、無機塩類、微量栄養源を加えることができる。また
本発明においては、培地中にアラキドン酸又はジホモ−
γ−リノレン酸の生合成基質を添加して培養することに
より、アラキドン酸又はジホモ−γ−リノレン酸の蓄積
を促進することもできる。生合成基質としてはテトラデ
カン、ヘキサデカン、オクタデカン等の炭化水素、テト
ラデカン酸、ヘキサデカン酸、オクタデカン酸等の脂肪
酸又はその塩（例えばナトリウム塩、カリウム塩等）又
はエステル、あるいは脂肪酸が構成成分として含まれる
油脂（例えば、オリーブ油、ヤシ油、パーム油）等を挙
げることができる。
対して５０〜１００重量％の水を加えたふすま、もみが
ら、米ぬか等を用い、前記の温度において、３〜１４日
間培養を行う。この場合に必要に応じて培地中に窒素
源、無機塩類、微量栄養源を加えることができる。また
本発明においては、培地中にアラキドン酸又はジホモ−
γ−リノレン酸の生合成基質を添加して培養することに
より、アラキドン酸又はジホモ−γ−リノレン酸の蓄積
を促進することもできる。生合成基質としてはテトラデ
カン、ヘキサデカン、オクタデカン等の炭化水素、テト
ラデカン酸、ヘキサデカン酸、オクタデカン酸等の脂肪
酸又はその塩（例えばナトリウム塩、カリウム塩等）又
はエステル、あるいは脂肪酸が構成成分として含まれる
油脂（例えば、オリーブ油、ヤシ油、パーム油）等を挙
げることができる。
【００３８】特に脂肪酸の中でもアラキドン酸又はジホ
モ−γ−リノレン酸の前駆体であるオメガ６系不飽和脂
肪酸を添加して培養することにより、アラキドン酸又は
ジホモ−γ−リノレン酸の蓄積をより効果的に行うこと
ができる。該オメガ６系不飽和脂肪酸としては例えばリ
ノール酸、γーリノレン酸、ジホモ−γ−リノレン酸を
挙げることができ、該脂肪酸を構成成分として含有する
油脂としては例えばサフラワー油、大豆油、トウモロコ
シ油、綿実油、Ｂｉｏ−γ（γ−リノレン酸含有トリグ
リセリド）等を挙げることができる。
モ−γ−リノレン酸の前駆体であるオメガ６系不飽和脂
肪酸を添加して培養することにより、アラキドン酸又は
ジホモ−γ−リノレン酸の蓄積をより効果的に行うこと
ができる。該オメガ６系不飽和脂肪酸としては例えばリ
ノール酸、γーリノレン酸、ジホモ−γ−リノレン酸を
挙げることができ、該脂肪酸を構成成分として含有する
油脂としては例えばサフラワー油、大豆油、トウモロコ
シ油、綿実油、Ｂｉｏ−γ（γ−リノレン酸含有トリグ
リセリド）等を挙げることができる。
【００３９】基質の総添加量は培地に対して０．００１
〜１０重量％、好ましくは０．５〜１０重量％である。
これらの基質は生産微生物を接種する前又はその直後に
加えてもよく、又は培養を開始した後に加えてもよく、
あるいは両時点で加えてもよい。培養開始後の添加は１
回でもよく、又は複数回に分けて間欠的に添加してもよ
い。あるいは連続的に添加することもできる。またこれ
らの基質を唯一の炭素源として培養してもよい。このよ
うにして培養して、菌体内にアラキドン酸又はジホモ−
γ−リノレン酸を大量に含有する脂質が生成蓄積され
る。液体培地を使用した場合には、培養菌体から、例え
ば、次のようにしてアラキドン酸又はジホモ−γ−リノ
レン酸の採取を行う。
〜１０重量％、好ましくは０．５〜１０重量％である。
これらの基質は生産微生物を接種する前又はその直後に
加えてもよく、又は培養を開始した後に加えてもよく、
あるいは両時点で加えてもよい。培養開始後の添加は１
回でもよく、又は複数回に分けて間欠的に添加してもよ
い。あるいは連続的に添加することもできる。またこれ
らの基質を唯一の炭素源として培養してもよい。このよ
うにして培養して、菌体内にアラキドン酸又はジホモ−
γ−リノレン酸を大量に含有する脂質が生成蓄積され
る。液体培地を使用した場合には、培養菌体から、例え
ば、次のようにしてアラキドン酸又はジホモ−γ−リノ
レン酸の採取を行う。
【００４０】培養終了後、培養液より遠心分離及び濾過
等の常用の固液分離手段により培養菌体を得る。菌体は
十分水洗し、好ましくは乾燥する。乾燥は凍結乾燥、風
乾等によって行うことができる。乾燥菌体は、好ましく
は窒素気流下で有機溶媒によって抽出処理する。有機溶
媒としてはエーテル、ヘキサン、メタノール、エタノー
ル、クロロホルム、ジクロロメタン、石油エーテル等を
用いることができ、又メタノールと石油エーテルの交互
抽出やクロロホルム- メタノール- 水の一層系の溶媒を
用いた抽出によっても良好な結果を得ることができる。
抽出物から減圧下で有機溶媒を留去することにより、ア
ラキドン酸又はジホモ−γ−リノレン酸を含有する脂質
が得られる。
等の常用の固液分離手段により培養菌体を得る。菌体は
十分水洗し、好ましくは乾燥する。乾燥は凍結乾燥、風
乾等によって行うことができる。乾燥菌体は、好ましく
は窒素気流下で有機溶媒によって抽出処理する。有機溶
媒としてはエーテル、ヘキサン、メタノール、エタノー
ル、クロロホルム、ジクロロメタン、石油エーテル等を
用いることができ、又メタノールと石油エーテルの交互
抽出やクロロホルム- メタノール- 水の一層系の溶媒を
用いた抽出によっても良好な結果を得ることができる。
抽出物から減圧下で有機溶媒を留去することにより、ア
ラキドン酸又はジホモ−γ−リノレン酸を含有する脂質
が得られる。
【００４１】また、上記の方法に代えて湿菌体を用いて
抽出を行うことができる。メタノール、エタノール等の
水に対して相溶性の溶媒、又はこれらと水及び／又は他
の溶媒とから成る水に対して相溶性の混合溶媒を使用す
る。その他の手順は上記と同様である。上記のようにし
て得られた脂質中には、各種脂肪酸が脂質化合物、例え
ば脂肪の構成成分として含まれている。これらを直接分
離することもできるが、低級アルコールとのエステル、
例えばγ- リノレン酸メチル、ジホモ- γ- リノレン酸
メチル、アラキドン酸メチル等として分離するのが好ま
しい。
抽出を行うことができる。メタノール、エタノール等の
水に対して相溶性の溶媒、又はこれらと水及び／又は他
の溶媒とから成る水に対して相溶性の混合溶媒を使用す
る。その他の手順は上記と同様である。上記のようにし
て得られた脂質中には、各種脂肪酸が脂質化合物、例え
ば脂肪の構成成分として含まれている。これらを直接分
離することもできるが、低級アルコールとのエステル、
例えばγ- リノレン酸メチル、ジホモ- γ- リノレン酸
メチル、アラキドン酸メチル等として分離するのが好ま
しい。
【００４２】このようなエステルにすることにより、他
の脂質成分から容易に分離することができ、また培養中
に生成する他の脂肪酸、例えばパルミチン酸、オレイン
酸等（これらも、アラキドン酸又はジホモ−γ−リノレ
ン酸のエステル化に際してエステル化される）から容易
に分離することができる。例えば、アラキドン酸又はジ
ホモ−γ−リノレン酸のメチルエステルを得るには、前
記の抽出脂質を無水メタノール- 塩酸５〜１０％、ＢＦ
３−メタノール１０〜５０％等により、室温にて１〜２
４時間処理するのが好ましい。
の脂質成分から容易に分離することができ、また培養中
に生成する他の脂肪酸、例えばパルミチン酸、オレイン
酸等（これらも、アラキドン酸又はジホモ−γ−リノレ
ン酸のエステル化に際してエステル化される）から容易
に分離することができる。例えば、アラキドン酸又はジ
ホモ−γ−リノレン酸のメチルエステルを得るには、前
記の抽出脂質を無水メタノール- 塩酸５〜１０％、ＢＦ
３−メタノール１０〜５０％等により、室温にて１〜２
４時間処理するのが好ましい。
【００４３】前記の処理液からアラキドン酸又はジホモ
−γ−リノレン酸のメチルエステルを回収するにはヘキ
サン、エーテル、酢酸エチル等の有機溶媒で抽出するの
が好ましい。次に、この抽出液を無水硫酸ナトリウム等
により乾燥し、有機溶媒を好ましくは減圧下で留去する
ことにより主として脂肪酸エステルからなる混合物が得
られる。この混合物には、目的とするアラキドン酸又は
ジホモ−γ−リノレン酸のメチルエステルの他に、パル
ミチン酸メチルエステル、ステアリン酸メチルエステ
ル、オレイン酸メチルエステル等の脂肪酸メチルエステ
ルが含まれている。これらの脂肪酸メチルエステル混合
物からアラキドン酸又はジホモ−γ−リノレン酸のメチ
ルエステルを単離するには、カラムクロマトグラフィ
ー、低温結晶化法、尿素包接法、液々交流分配クロマト
グラフィー等を単独で、又は組み合わせて使用すること
ができる。
−γ−リノレン酸のメチルエステルを回収するにはヘキ
サン、エーテル、酢酸エチル等の有機溶媒で抽出するの
が好ましい。次に、この抽出液を無水硫酸ナトリウム等
により乾燥し、有機溶媒を好ましくは減圧下で留去する
ことにより主として脂肪酸エステルからなる混合物が得
られる。この混合物には、目的とするアラキドン酸又は
ジホモ−γ−リノレン酸のメチルエステルの他に、パル
ミチン酸メチルエステル、ステアリン酸メチルエステ
ル、オレイン酸メチルエステル等の脂肪酸メチルエステ
ルが含まれている。これらの脂肪酸メチルエステル混合
物からアラキドン酸又はジホモ−γ−リノレン酸のメチ
ルエステルを単離するには、カラムクロマトグラフィ
ー、低温結晶化法、尿素包接法、液々交流分配クロマト
グラフィー等を単独で、又は組み合わせて使用すること
ができる。
【００４４】こうして単離されたアラキドン酸又はジホ
モ−γ−リノレン酸のメチルエステルからアラキドン酸
又はジホモ−γ−リノレン酸を得るには、アルカリで加
水分解した後、エーテル、酢酸エチル等の有機溶媒で抽
出すればよい。又、アラキドン酸又はジホモ−γ−リノ
レン酸をそのメチルエステルを経ないで得るには、前記
の抽出脂質をアルカリ分解（例えば５％水酸化ナトリウ
ムにより室温にて２〜３時間）した後、この分解液か
ら、脂肪酸の抽出・精製に常用されている方法により抽
出・精製することができる。次に、実施例により、本発
明をさらに具体的に説明する。
モ−γ−リノレン酸のメチルエステルからアラキドン酸
又はジホモ−γ−リノレン酸を得るには、アルカリで加
水分解した後、エーテル、酢酸エチル等の有機溶媒で抽
出すればよい。又、アラキドン酸又はジホモ−γ−リノ
レン酸をそのメチルエステルを経ないで得るには、前記
の抽出脂質をアルカリ分解（例えば５％水酸化ナトリウ
ムにより室温にて２〜３時間）した後、この分解液か
ら、脂肪酸の抽出・精製に常用されている方法により抽
出・精製することができる。次に、実施例により、本発
明をさらに具体的に説明する。
【００４５】
【実施例】実施例１．モルティエレラ・アルピナ（Mort
ierella alpina）ＩＦＯ８５６８を、Ｃｚａｐｅｋ寒天
培地（０．２％ＮａＮＯ3 、０．１％Ｋ2 ＨＰＯ4 、
０．０５％ＭｇＳＯ4 ・７Ｈ2 Ｏ、０．０５％ＫＣｌ、
０．００１％ＦｅＳＯ4 ・７Ｈ2 Ｏ、３％シュークロー
ス、２％寒天、ｐＨ６．０）３００ｍｌを含む大型スラ
ント瓶に植菌し、２週間、２８℃で培養した。培養後、
大型スラント瓶にＴｗｅｅｎ８０を２滴加えた滅菌水５
０ｍｌを加えてよく振り、４重のガーゼで濾過した。こ
の操作を２回繰り返し、濾液を８０００x g で１０分間
遠心した。このようにして得られた胞子を５０ｍＭ Ｔ
ｒｉｓ／ｍａｌｅａｔｅ緩衝溶液（ｐＨ７．５）で１ x
１０6 /ml になるように懸濁し、胞子溶液を調製した。
ierella alpina）ＩＦＯ８５６８を、Ｃｚａｐｅｋ寒天
培地（０．２％ＮａＮＯ3 、０．１％Ｋ2 ＨＰＯ4 、
０．０５％ＭｇＳＯ4 ・７Ｈ2 Ｏ、０．０５％ＫＣｌ、
０．００１％ＦｅＳＯ4 ・７Ｈ2 Ｏ、３％シュークロー
ス、２％寒天、ｐＨ６．０）３００ｍｌを含む大型スラ
ント瓶に植菌し、２週間、２８℃で培養した。培養後、
大型スラント瓶にＴｗｅｅｎ８０を２滴加えた滅菌水５
０ｍｌを加えてよく振り、４重のガーゼで濾過した。こ
の操作を２回繰り返し、濾液を８０００x g で１０分間
遠心した。このようにして得られた胞子を５０ｍＭ Ｔ
ｒｉｓ／ｍａｌｅａｔｅ緩衝溶液（ｐＨ７．５）で１ x
１０6 /ml になるように懸濁し、胞子溶液を調製した。
【００４６】得られた胞子溶液１．０ｍｌに、１００ｍ
Ｍ Ｔｒｉｓ／ｍａｌｅａｔｅ緩衝溶液（ｐＨ７．５）
０．５ｍｌを加え、ＮＴＧ溶液（N-メチル-N'-ニトロ-N
- ニトロソグアニジン５ｍｇ／脱イオン水1 ｍｌ）５０
０μl を加えて、２８℃で１５分間インキュベートして
変異処理を施した。１０％Ｎａ2 Ｓ2 Ｏ3 を３ｍｌ加え
て、反応液を５５００x g で１０分間遠心し、沈殿物
（変異処理が施された胞子）を滅菌水３ｍｌで洗浄し、
５５００x g で１０分間遠心後、沈殿物に滅菌水２ｍｌ
を加えてＮＴＧ処理された胞子懸濁液とした。
Ｍ Ｔｒｉｓ／ｍａｌｅａｔｅ緩衝溶液（ｐＨ７．５）
０．５ｍｌを加え、ＮＴＧ溶液（N-メチル-N'-ニトロ-N
- ニトロソグアニジン５ｍｇ／脱イオン水1 ｍｌ）５０
０μl を加えて、２８℃で１５分間インキュベートして
変異処理を施した。１０％Ｎａ2 Ｓ2 Ｏ3 を３ｍｌ加え
て、反応液を５５００x g で１０分間遠心し、沈殿物
（変異処理が施された胞子）を滅菌水３ｍｌで洗浄し、
５５００x g で１０分間遠心後、沈殿物に滅菌水２ｍｌ
を加えてＮＴＧ処理された胞子懸濁液とした。
【００４７】ＮＴＧ処理された胞子懸濁液は、１０-3〜
１０-4程度に希釈し、ＧＹ寒天プレート（１％グルコー
ス、０．５％酵母エキス、０．００５％トリトン（Ｔｒ
ｉｔｏｎ）X −１００、１．５％寒天、ｐＨ６．０）に
塗布した。２８℃で培養し、コロニーが出現したものか
らランダムに新しいプレートにピックアップし、２８℃
で生育が見られるまで培養した。生育が見られた時点で
そのまま低温で保存した。
１０-4程度に希釈し、ＧＹ寒天プレート（１％グルコー
ス、０．５％酵母エキス、０．００５％トリトン（Ｔｒ
ｉｔｏｎ）X −１００、１．５％寒天、ｐＨ６．０）に
塗布した。２８℃で培養し、コロニーが出現したものか
らランダムに新しいプレートにピックアップし、２８℃
で生育が見られるまで培養した。生育が見られた時点で
そのまま低温で保存した。
【００４８】ピックアップした保存コロニーを、ＧＹ寒
天プレートで２８℃で２日間、１２℃で２日間培養し、
寒天ごとくりぬいて１００℃で乾燥させた。得られた乾
燥菌体をねじ口試験管（１６．５ mm φ）に入れ、塩化
メチレン１ｍｌ、無水メタノール−塩酸（１０％）２ｍ
ｌを加え、５０℃で３時間処理することによってメチル
エステル化し、ｎ−ヘキサン４ｍｌ、水１ｍｌを加え
て、２回抽出し、抽出液の溶媒を遠心エバポレーター
（４０℃、１時間）で留去した後、得られた脂肪酸メチ
ルエステルをキャピラリーガスクロマトグラフィーで分
析した。そして、スクリーニングの結果、低温培養下で
エイコサペンタエン酸を生産しないモルティエレラ・ア
ルピナＳＡＭ２１５３（ＦＥＲＭ Ｐ−１５７６７）が
得られた。
天プレートで２８℃で２日間、１２℃で２日間培養し、
寒天ごとくりぬいて１００℃で乾燥させた。得られた乾
燥菌体をねじ口試験管（１６．５ mm φ）に入れ、塩化
メチレン１ｍｌ、無水メタノール−塩酸（１０％）２ｍ
ｌを加え、５０℃で３時間処理することによってメチル
エステル化し、ｎ−ヘキサン４ｍｌ、水１ｍｌを加え
て、２回抽出し、抽出液の溶媒を遠心エバポレーター
（４０℃、１時間）で留去した後、得られた脂肪酸メチ
ルエステルをキャピラリーガスクロマトグラフィーで分
析した。そして、スクリーニングの結果、低温培養下で
エイコサペンタエン酸を生産しないモルティエレラ・ア
ルピナＳＡＭ２１５３（ＦＥＲＭ Ｐ−１５７６７）が
得られた。
【００４９】実施例２．ＧＹ寒天プレート（１％グルコ
ース、０．５％酵母エキス、０．００５％トリトン（Tr
iton）X-１００、１．５％寒天、ｐＨ６．０）にモルテ
ィエレラ・アルピナ（Mortierella alpina）ＩＦＯ８５
６８および実施例１で得たモルティエレラ・アルピナＳ
ＡＭ２１５３（ＦＥＲＭ Ｐ−１５７６７）を植菌し静
置培養した。培養温度は下記の６条件で行った。
ース、０．５％酵母エキス、０．００５％トリトン（Tr
iton）X-１００、１．５％寒天、ｐＨ６．０）にモルテ
ィエレラ・アルピナ（Mortierella alpina）ＩＦＯ８５
６８および実施例１で得たモルティエレラ・アルピナＳ
ＡＭ２１５３（ＦＥＲＭ Ｐ−１５７６７）を植菌し静
置培養した。培養温度は下記の６条件で行った。
【００５０】１．２８℃（２日間）、１２℃（２日間） ２．２８℃（４日間） ３．１２℃（６日間） ４．２８℃（４日間）、１２℃（３日間） ５．２８℃（７日間） ６．１２℃（７日間） 培養終了後、実施例１と同様にメチルエステル化を行
い、得られた脂肪酸メチルエステルをキャピラリーガス
クロマトグラフィーで分析した。表１にその結果を示
す。
い、得られた脂肪酸メチルエステルをキャピラリーガス
クロマトグラフィーで分析した。表１にその結果を示
す。
【００５１】
【表１】
【００５２】親株であるＩＦＯ８５６８は１２℃で培養
した場合、エイコサペンタエン酸を産生し、その割合も
１２℃での培養時間に比例して増加しているが、変異株
であるモルティエレラ・アルピナＳＡＭ２１５３（ＦＥ
ＲＭ Ｐ−１５７６７）は１２℃で長時間培養してもエ
イコサペンタエン酸を全く産生せず、ω３不飽和化酵素
（アラキドン酸からエイコサペンタエン酸に変換する酵
素）活性が欠失あるいは限りなく低下した変異株である
ことが明らかとなった。またアラキドン酸からエイコサ
ペンタエン酸への変換能がないことから、低温下では本
来エイコサペンタエン酸に変換されるべき分がアラキド
ン酸として蓄積されるため、低温培養で効率的にアラキ
ドン酸の含有率を高めることが明らかとなった。
した場合、エイコサペンタエン酸を産生し、その割合も
１２℃での培養時間に比例して増加しているが、変異株
であるモルティエレラ・アルピナＳＡＭ２１５３（ＦＥ
ＲＭ Ｐ−１５７６７）は１２℃で長時間培養してもエ
イコサペンタエン酸を全く産生せず、ω３不飽和化酵素
（アラキドン酸からエイコサペンタエン酸に変換する酵
素）活性が欠失あるいは限りなく低下した変異株である
ことが明らかとなった。またアラキドン酸からエイコサ
ペンタエン酸への変換能がないことから、低温下では本
来エイコサペンタエン酸に変換されるべき分がアラキド
ン酸として蓄積されるため、低温培養で効率的にアラキ
ドン酸の含有率を高めることが明らかとなった。
【００５３】実施例３．グルコース４％および酵母エキ
ス１％を含む培地（ｐＨ６．０）２ｍｌを１０ｍｌのエ
ルレンマイヤーフラスコに入れ、１２０℃で２０分間殺
菌した。モルティエレラ・アルピナ（Mortierella alpi
na）ＩＦＯ８５６８および実施例１で得たモルティエレ
ラ・アルピナＳＡＭ２１５３（ＦＥＲＭ Ｐ−１５７６
７）を培地に一白金耳接種し、レシプロシェーカー（１
５０ｒｐｍ）により、１２℃で７日間、あるいは１２℃
で１０日間培養した。表２にその結果を示す。１２℃で
培養を行ってもエイコサペンタエン酸を全く産生せず、
アラキドン産の含有率並びに生産量を高めることが、液
体培養でも確かめられた。
ス１％を含む培地（ｐＨ６．０）２ｍｌを１０ｍｌのエ
ルレンマイヤーフラスコに入れ、１２０℃で２０分間殺
菌した。モルティエレラ・アルピナ（Mortierella alpi
na）ＩＦＯ８５６８および実施例１で得たモルティエレ
ラ・アルピナＳＡＭ２１５３（ＦＥＲＭ Ｐ−１５７６
７）を培地に一白金耳接種し、レシプロシェーカー（１
５０ｒｐｍ）により、１２℃で７日間、あるいは１２℃
で１０日間培養した。表２にその結果を示す。１２℃で
培養を行ってもエイコサペンタエン酸を全く産生せず、
アラキドン産の含有率並びに生産量を高めることが、液
体培養でも確かめられた。
【００５４】
【表２】
【００５５】実施例４．グルコース４％および酵母エキ
ス１％を含む培地（ｐＨ６．０）２ｍｌに表３に示した
アラキドン酸の生合成基質又はそれを含有する油脂をそ
れぞれ０．５％添加し、１０ｍｌのエルレンマイヤーフ
ラスコに入れ、１２０℃で２０分間殺菌した。実施例１
で得たモルティエレラ・アルピナ（Mortierella alpin
a）ＳＡＭ２１５３（ＦＥＲＭ Ｐ−１５７６７）を培
地に一白金耳接種し、レシプロシェーカー（１５０ｒｐ
ｍ）により、１２℃で１０日間培養した。表３にその結
果を示す。
ス１％を含む培地（ｐＨ６．０）２ｍｌに表３に示した
アラキドン酸の生合成基質又はそれを含有する油脂をそ
れぞれ０．５％添加し、１０ｍｌのエルレンマイヤーフ
ラスコに入れ、１２０℃で２０分間殺菌した。実施例１
で得たモルティエレラ・アルピナ（Mortierella alpin
a）ＳＡＭ２１５３（ＦＥＲＭ Ｐ−１５７６７）を培
地に一白金耳接種し、レシプロシェーカー（１５０ｒｐ
ｍ）により、１２℃で１０日間培養した。表３にその結
果を示す。
【００５６】
【表３】
【００５７】実施例５．グルコース２％、大豆タンパク
１．５％、ＫＨ2 ＰＯ4 ０．３％、ＭｇＣｌ2・６Ｈ2
Ｏ ０．０５％、Ｎａ2 ＳＯ4 ０．１％および大豆油
０．１％を含む培地（ｐＨ６．０）５Ｌを１０Ｌジャー
ファーメンターに入れ、１２０℃で３０分間殺菌した。
実施例１で得たモルティエレラ・アルピナ（Mortierell
a alpina）ＳＡＭ２１５３（ＦＥＲＭ Ｐ−１５７６
７）を接種し、通気量１ｖｖｍ、１０日間の通気攪拌培
養を行った。培養温度は、培養開始時は２０℃で培養３
日目より１２℃に下げて行った。なお培養１日目のみ１
％のグルコースを添加した。
１．５％、ＫＨ2 ＰＯ4 ０．３％、ＭｇＣｌ2・６Ｈ2
Ｏ ０．０５％、Ｎａ2 ＳＯ4 ０．１％および大豆油
０．１％を含む培地（ｐＨ６．０）５Ｌを１０Ｌジャー
ファーメンターに入れ、１２０℃で３０分間殺菌した。
実施例１で得たモルティエレラ・アルピナ（Mortierell
a alpina）ＳＡＭ２１５３（ＦＥＲＭ Ｐ−１５７６
７）を接種し、通気量１ｖｖｍ、１０日間の通気攪拌培
養を行った。培養温度は、培養開始時は２０℃で培養３
日目より１２℃に下げて行った。なお培養１日目のみ１
％のグルコースを添加した。
【００５８】培養２日目より培養液１２ｍｌのサンプリ
ングを行い、実施例１と同様にメチルエステル化を行
い、得られた脂肪酸メチルエステルをガスクロマトグラ
フィーで分析した。図１ａ，ｂ，ｃ，ｄにそれぞれアラ
キドン酸の生産量（ｇ／ｌ）、全脂肪酸に対するアラキ
ドン酸の割合（％）、生育度（ｇ／ｌ）、培地中のグル
コース濃度（％）の変化を示す。１０Ｌジャーファーメ
ンターでの低温条件下での培養が確かめられ、培養１０
日目にはアラキドン酸の全脂肪酸に対する割合が実に５
６．４％に達した。
ングを行い、実施例１と同様にメチルエステル化を行
い、得られた脂肪酸メチルエステルをガスクロマトグラ
フィーで分析した。図１ａ，ｂ，ｃ，ｄにそれぞれアラ
キドン酸の生産量（ｇ／ｌ）、全脂肪酸に対するアラキ
ドン酸の割合（％）、生育度（ｇ／ｌ）、培地中のグル
コース濃度（％）の変化を示す。１０Ｌジャーファーメ
ンターでの低温条件下での培養が確かめられ、培養１０
日目にはアラキドン酸の全脂肪酸に対する割合が実に５
６．４％に達した。
【００５９】実施例６．グルコース２％、大豆タンパク
１．５％、ＫＨ2 ＰＯ4 ０．３％、ＭｇＣｌ2・６Ｈ2
Ｏ０．０５％、ＣａＣｌ2 ・２Ｈ2 Ｏ０．０５％、Ｎａ
2 ＳＯ4 ０．１％および大豆油を０．１％含む培地（pH
６．０）５Ｌを１０Ｌジャーファーメンターに入れ、１
２０℃で３０分間殺菌した。そして、実施例１と同様に
モルティエレラ・アルピナ（Mortierella alpina) ＩＦ
Ｏ８５６８を親株として、再度変異処理を施し、モルテ
ィエレラ・アルピナ（Mortierella alpina) ω３不飽和
化酵素低下株ＳＡＭ２２３９を取得した。
１．５％、ＫＨ2 ＰＯ4 ０．３％、ＭｇＣｌ2・６Ｈ2
Ｏ０．０５％、ＣａＣｌ2 ・２Ｈ2 Ｏ０．０５％、Ｎａ
2 ＳＯ4 ０．１％および大豆油を０．１％含む培地（pH
６．０）５Ｌを１０Ｌジャーファーメンターに入れ、１
２０℃で３０分間殺菌した。そして、実施例１と同様に
モルティエレラ・アルピナ（Mortierella alpina) ＩＦ
Ｏ８５６８を親株として、再度変異処理を施し、モルテ
ィエレラ・アルピナ（Mortierella alpina) ω３不飽和
化酵素低下株ＳＡＭ２２３９を取得した。
【００６０】そして、このＳＡＭ２２３９を植菌し、通
気量１vvm 、１２日間の通気攪拌培養を行った。培養温
度は、培養開始時は２４℃で培養３日目より１２℃に下
げて行った。なお、培養１，２，３日目の１％のグルコ
ースを添加した。培養最終日の１２日目にサンプリング
を行い、実施例１と同様にメチルエステル化を行い、得
られた脂肪酸メチルエステルをガスクロマトグラフィー
で分析した。その結果、全脂肪酸に対するアラキドン酸
の割合は７５．１％に達し、生産量は４．１ｇ／Ｌであ
った。
気量１vvm 、１２日間の通気攪拌培養を行った。培養温
度は、培養開始時は２４℃で培養３日目より１２℃に下
げて行った。なお、培養１，２，３日目の１％のグルコ
ースを添加した。培養最終日の１２日目にサンプリング
を行い、実施例１と同様にメチルエステル化を行い、得
られた脂肪酸メチルエステルをガスクロマトグラフィー
で分析した。その結果、全脂肪酸に対するアラキドン酸
の割合は７５．１％に達し、生産量は４．１ｇ／Ｌであ
った。
─────────────────────────────────────────────────────
【手続補正書】
【提出日】平成１１年９月２９日（１９９９．９．２
９）
９）
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】特許請求の範囲
【補正方法】変更
【補正内容】
【特許請求の範囲】
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００２
【補正方法】変更
【補正内容】
【０００２】
【従来の技術】アラキドン酸はドコサヘキサエン酸と同
じく母乳中に含まれており、乳児の発育に役立つとの報
告（「Advances in Polyunsaturated Fatty Acid Resea
rch 」, Elsevier Science Publishers, 1993, pp.261-
264 ）や、胎児の身長や脳の発育における重要性に関す
る報告（Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90, 1073-1077
(1993), Lancet, 344, 1319-1322 (1994) ）がなされ、
母乳と調製粉乳の脂肪酸組成の大きな違いであるアラキ
ドン酸及びドコサヘキサエン酸を調製粉乳に添加しよう
とする動きがある。
じく母乳中に含まれており、乳児の発育に役立つとの報
告（「Advances in Polyunsaturated Fatty Acid Resea
rch 」, Elsevier Science Publishers, 1993, pp.261-
264 ）や、胎児の身長や脳の発育における重要性に関す
る報告（Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90, 1073-1077
(1993), Lancet, 344, 1319-1322 (1994) ）がなされ、
母乳と調製粉乳の脂肪酸組成の大きな違いであるアラキ
ドン酸及びドコサヘキサエン酸を調製粉乳に添加しよう
とする動きがある。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００５
【補正方法】変更
【補正内容】
【０００５】脂質中のアラキドン酸の全脂肪酸に占める
割合を高める方法として、いくつかの方法が知られてい
る。例えば、モルティエレラ・アルピナ（Mortierella
alpina) を２８℃の通常の通気攪拌培養で培養し、グル
コースが完全に枯渇した状態で、さらに６日間培養を続
けることで６７．４％までアラキドン酸の割合を高める
ことに成功している（Appl. Microbial. Biotechnol, 3
1, 11-6 (1989)) 。しかし、この方法は、飢餓状態の菌
が生命を維持するために菌体内のトリグリセリドの飽和
度の低い脂肪酸をβ酸化しエネルギーに変換することを
利用している。
割合を高める方法として、いくつかの方法が知られてい
る。例えば、モルティエレラ・アルピナ（Mortierella
alpina) を２８℃の通常の通気攪拌培養で培養し、グル
コースが完全に枯渇した状態で、さらに６日間培養を続
けることで６７．４％までアラキドン酸の割合を高める
ことに成功している（Appl. Microbial. Biotechnol, 3
1, 11-6 (1989)) 。しかし、この方法は、飢餓状態の菌
が生命を維持するために菌体内のトリグリセリドの飽和
度の低い脂肪酸をβ酸化しエネルギーに変換することを
利用している。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００６
【補正方法】変更
【補正内容】
【０００６】従ってアラキドン酸の総量には変化が無
く、低不飽和度の脂肪酸が減少することによって、相対
的にアラキドン酸の割合が高まっているに過ぎない。即
ち、アラキドン酸を高含有率で含むトリグリセリドの生
成量が上昇しているわけではなく、逆にβ酸化によりト
リグリセリドの割合も低下していると考えられる。
く、低不飽和度の脂肪酸が減少することによって、相対
的にアラキドン酸の割合が高まっているに過ぎない。即
ち、アラキドン酸を高含有率で含むトリグリセリドの生
成量が上昇しているわけではなく、逆にβ酸化によりト
リグリセリドの割合も低下していると考えられる。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００８
【補正方法】変更
【補正内容】
【０００８】この性質を利用した方法として、モルティ
エレラ・アルピナ（Mortierella alpina) を２０℃の通
気攪拌培養で１６日間培養し、７１．２％までアラキド
ン酸の割合を高めることに成功している（「Industrial
Applications of Single Cell Oils 」, American Oil
Chemists' Society Champaign, 1992, pp.52-60) 。し
かし、この方法では培養に時間がかかりすぎて工業生産
には好ましくないばかりでなく、低温培養では、せっか
く生産されたアラキドン酸の一部が、低温で働くω３不
飽和化酵素（Biochem. Biophys. Res. Commun., 150, 3
35-341 (1988)）によってエイコサペンタエン酸に変換
されてしまい、全脂肪酸に占めるアラキドン酸の割合が
減少し、エイコサペンタエン酸の割合が増加してしまう
ことが知られている。
エレラ・アルピナ（Mortierella alpina) を２０℃の通
気攪拌培養で１６日間培養し、７１．２％までアラキド
ン酸の割合を高めることに成功している（「Industrial
Applications of Single Cell Oils 」, American Oil
Chemists' Society Champaign, 1992, pp.52-60) 。し
かし、この方法では培養に時間がかかりすぎて工業生産
には好ましくないばかりでなく、低温培養では、せっか
く生産されたアラキドン酸の一部が、低温で働くω３不
飽和化酵素（Biochem. Biophys. Res. Commun., 150, 3
35-341 (1988)）によってエイコサペンタエン酸に変換
されてしまい、全脂肪酸に占めるアラキドン酸の割合が
減少し、エイコサペンタエン酸の割合が増加してしまう
ことが知られている。
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２５
【補正方法】変更
【補正内容】
【００２５】さらに費用効果の優れた基質を効率よく用
いて、対応する野生株と同量の不飽和脂肪酸を産生する
ように設計された微生物も含まれる。例えばΔ１２不飽
和化活性が欠失しかつΔ６不飽和化活性が上昇した変異
株としてモルティエレラ・アルピナＳＡＭ２０８６（微
工研条寄第６０３２号、ＦＥＲＭ ＢＰ−６０３２）
や、人為的にジホモ−γ−リノレン酸の生産性を増加さ
せるために誘発したΔ５不飽和化活性が欠失した変異株
としてモルティエレラ・アルピナＳＡＭ１８６０（微工
研条寄第３５８９号、ＦＥＲＭ ＢＰ−３５８９）を挙
げることができる。
いて、対応する野生株と同量の不飽和脂肪酸を産生する
ように設計された微生物も含まれる。例えばΔ１２不飽
和化活性が欠失しかつΔ６不飽和化活性が上昇した変異
株としてモルティエレラ・アルピナＳＡＭ２０８６（微
工研条寄第６０３２号、ＦＥＲＭ ＢＰ−６０３２）
や、人為的にジホモ−γ−リノレン酸の生産性を増加さ
せるために誘発したΔ５不飽和化活性が欠失した変異株
としてモルティエレラ・アルピナＳＡＭ１８６０（微工
研条寄第３５８９号、ＦＥＲＭ ＢＰ−３５８９）を挙
げることができる。
【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３０
【補正方法】変更
【補正内容】
【００３０】本発明において変異処理は、放射線（Ｘ
線、ガンマー線、中性子線、重イオン）照射や紫外線照
射、高熱処理等を行って突然変異を誘発させたり、また
微生物を適当なバッファー中などに懸濁し、変異原を加
えて一定時間インキュベート後、適当に希釈して寒天培
地に植菌し、変異株のコロニーを得るといった一般的な
突然変異操作により行うことができる。
線、ガンマー線、中性子線、重イオン）照射や紫外線照
射、高熱処理等を行って突然変異を誘発させたり、また
微生物を適当なバッファー中などに懸濁し、変異原を加
えて一定時間インキュベート後、適当に希釈して寒天培
地に植菌し、変異株のコロニーを得るといった一般的な
突然変異操作により行うことができる。
【手続補正８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３１
【補正方法】変更
【補正内容】
【００３１】変異原としては、ナイトロジェンマスター
ド、メチルメタンサルホネート（MMS ）、Ｎ−メチル−
N −ニトロ−N −ニトロソグアニジン（ＮＴＧ）等のア
ルキル化剤や、５−ブロモウラシル等の塩基類似体や、
マイトマイシンC 等の抗生物質や、６−メルカプトプリ
ン等の塩基合成阻害剤や、プロフラビン等の色素類（そ
の他の誘導体）や、４−ニトロキノリン−N −オキシド
等のある種の発がん剤や塩化マンガン、ホルムアルデヒ
ド等のその他の化合物を挙げることができる。また使用
する微生物は、生育菌体（菌糸など）でも良いし、胞子
でも良い。
ド、メチルメタンサルホネート（MMS ）、Ｎ−メチル−
N −ニトロ−N −ニトロソグアニジン（ＮＴＧ）等のア
ルキル化剤や、５−ブロモウラシル等の塩基類似体や、
マイトマイシンC 等の抗生物質や、６−メルカプトプリ
ン等の塩基合成阻害剤や、プロフラビン等の色素類（そ
の他の誘導体）や、４−ニトロキノリン−N −オキシド
等のある種の発がん剤や塩化マンガン、ホルムアルデヒ
ド等のその他の化合物を挙げることができる。また使用
する微生物は、生育菌体（菌糸など）でも良いし、胞子
でも良い。
【手続補正９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３３
【補正方法】変更
【補正内容】
【００３３】本発明に使用される菌株を培養する為に
は、その菌株の胞子、菌糸、又は予め培養して得られた
前培養液を、液体培地又は固体培地に接種し培養する。
液体培地の場合に、炭素源としてはグルコース、フラク
トース、キシロース、サッカロース、マルトース、可溶
性デンプン、糖蜜、グリセロール、マンニトール等の一
般的に使用されているものが、いずれも使用できるが、
これらに限られるものではない。窒素源としてはペプト
ン、酵母エキス、麦芽エキス、肉エキス、カザミノ酸、
コーンスティープリカー、大豆タンパク、脱脂ダイズ、
綿実カス等の天然窒素源の他に、尿素等の有機窒素源、
ならびに硝酸ナトリウム、硝酸アンモニウム、硫酸アン
モニウム等の無機窒素源を用いることができる。脂肪酸
又はそれを含有する脂質の工業的大量生産のためには、
液体培地を用いるのが好ましい。
は、その菌株の胞子、菌糸、又は予め培養して得られた
前培養液を、液体培地又は固体培地に接種し培養する。
液体培地の場合に、炭素源としてはグルコース、フラク
トース、キシロース、サッカロース、マルトース、可溶
性デンプン、糖蜜、グリセロール、マンニトール等の一
般的に使用されているものが、いずれも使用できるが、
これらに限られるものではない。窒素源としてはペプト
ン、酵母エキス、麦芽エキス、肉エキス、カザミノ酸、
コーンスティープリカー、大豆タンパク、脱脂ダイズ、
綿実カス等の天然窒素源の他に、尿素等の有機窒素源、
ならびに硝酸ナトリウム、硝酸アンモニウム、硫酸アン
モニウム等の無機窒素源を用いることができる。脂肪酸
又はそれを含有する脂質の工業的大量生産のためには、
液体培地を用いるのが好ましい。
【手続補正１０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４５
【補正方法】変更
【補正内容】
【００４５】
【実施例】実施例１．モルティエレラ・アルピナ（Mort
ierella alpina）ＩＦＯ８５６８を、Ｃｚａｐｅｋ寒天
培地（０．２％ＮａＮＯ3 、０．１％Ｋ2 ＨＰＯ4 、
０．０５％ＭｇＳＯ4 ・７Ｈ2 Ｏ、０．０５％ＫＣｌ、
０．００１％ＦｅＳＯ4 ・７Ｈ2 Ｏ、３％シュークロー
ス、２％寒天、ｐＨ６．０）３００ｍｌを含む大型スラ
ント瓶に植菌し、２週間、２８℃で培養した。培養後、
大型スラント瓶にＴｗｅｅｎ８０を２滴加えた滅菌水５
０ｍｌを加えてよく振り、４重のガーゼで濾過した。こ
の操作を２回繰り返し、濾液を８０００x g で１０分間
遠心した。このようにして得られた胞子を５０ｍＭ Ｔ
ｒｉｓ／ｍａｌｅａｔｅ緩衝溶液（ｐＨ７．５）で１ x
１０6 /ml になるように懸濁し、胞子溶液を調製した。
ierella alpina）ＩＦＯ８５６８を、Ｃｚａｐｅｋ寒天
培地（０．２％ＮａＮＯ3 、０．１％Ｋ2 ＨＰＯ4 、
０．０５％ＭｇＳＯ4 ・７Ｈ2 Ｏ、０．０５％ＫＣｌ、
０．００１％ＦｅＳＯ4 ・７Ｈ2 Ｏ、３％シュークロー
ス、２％寒天、ｐＨ６．０）３００ｍｌを含む大型スラ
ント瓶に植菌し、２週間、２８℃で培養した。培養後、
大型スラント瓶にＴｗｅｅｎ８０を２滴加えた滅菌水５
０ｍｌを加えてよく振り、４重のガーゼで濾過した。こ
の操作を２回繰り返し、濾液を８０００x g で１０分間
遠心した。このようにして得られた胞子を５０ｍＭ Ｔ
ｒｉｓ／ｍａｌｅａｔｅ緩衝溶液（ｐＨ７．５）で１ x
１０6 /ml になるように懸濁し、胞子溶液を調製した。
【手続補正１１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４９
【補正方法】変更
【補正内容】
【００４９】実施例２．ＧＹ寒天プレート（１％グルコ
ース、０．５％酵母エキス、０．００５％トリトン（Tr
iton）X-１００、１．５％寒天、ｐＨ６．０）にモルテ
ィエレラ・アルピナ（Mortierella alpina）ＩＦＯ８５
６８および実施例１で得たモルティエレラ・アルピナＳ
ＡＭ２１５３（ＦＥＲＭ Ｐ−１５７６７）を植菌し静
置培養した。培養温度は下記の６条件で行った。
ース、０．５％酵母エキス、０．００５％トリトン（Tr
iton）X-１００、１．５％寒天、ｐＨ６．０）にモルテ
ィエレラ・アルピナ（Mortierella alpina）ＩＦＯ８５
６８および実施例１で得たモルティエレラ・アルピナＳ
ＡＭ２１５３（ＦＥＲＭ Ｐ−１５７６７）を植菌し静
置培養した。培養温度は下記の６条件で行った。
【手続補正１２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５３
【補正方法】変更
【補正内容】
【００５３】実施例３．グルコース４％および酵母エキ
ス１％を含む培地（ｐＨ６．０）２ｍｌを１０ｍｌのエ
ルレンマイヤーフラスコに入れ、１２０℃で２０分間殺
菌した。モルティエレラ・アルピナ（Mortierella alpi
na）ＩＦＯ８５６８および実施例１で得たモルティエレ
ラ・アルピナＳＡＭ２１５３（ＦＥＲＭ Ｐ−１５７６
７）を培地に一白金耳接種し、レシプロシェーカー（１
５０ｒｐｍ）により、１２℃で７日間、あるいは１２℃
で１０日間培養した。表２にその結果を示す。１２℃で
培養を行ってもエイコサペンタエン酸を全く産生せず、
アラキドン産の含有率並びに生産量を高めることが、液
体培養でも確かめられた。
ス１％を含む培地（ｐＨ６．０）２ｍｌを１０ｍｌのエ
ルレンマイヤーフラスコに入れ、１２０℃で２０分間殺
菌した。モルティエレラ・アルピナ（Mortierella alpi
na）ＩＦＯ８５６８および実施例１で得たモルティエレ
ラ・アルピナＳＡＭ２１５３（ＦＥＲＭ Ｐ−１５７６
７）を培地に一白金耳接種し、レシプロシェーカー（１
５０ｒｐｍ）により、１２℃で７日間、あるいは１２℃
で１０日間培養した。表２にその結果を示す。１２℃で
培養を行ってもエイコサペンタエン酸を全く産生せず、
アラキドン産の含有率並びに生産量を高めることが、液
体培養でも確かめられた。
【手続補正１３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５５
【補正方法】変更
【補正内容】
【００５５】実施例４．グルコース４％および酵母エキ
ス１％を含む培地（ｐＨ６．０）２ｍｌに表３に示した
アラキドン酸の生合成基質又はそれを含有する油脂をそ
れぞれ０．５％添加し、１０ｍｌのエルレンマイヤーフ
ラスコに入れ、１２０℃で２０分間殺菌した。実施例１
で得たモルティエレラ・アルピナ（Mortierella alpin
a）ＳＡＭ２１５３（ＦＥＲＭ Ｐ−１５７６７）を培
地に一白金耳接種し、レシプロシェーカー（１５０ｒｐ
ｍ）により、１２℃で１０日間培養した。表３にその結
果を示す。
ス１％を含む培地（ｐＨ６．０）２ｍｌに表３に示した
アラキドン酸の生合成基質又はそれを含有する油脂をそ
れぞれ０．５％添加し、１０ｍｌのエルレンマイヤーフ
ラスコに入れ、１２０℃で２０分間殺菌した。実施例１
で得たモルティエレラ・アルピナ（Mortierella alpin
a）ＳＡＭ２１５３（ＦＥＲＭ Ｐ−１５７６７）を培
地に一白金耳接種し、レシプロシェーカー（１５０ｒｐ
ｍ）により、１２℃で１０日間培養した。表３にその結
果を示す。
【手続補正１４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５７
【補正方法】変更
【補正内容】
【００５７】実施例５．グルコース２％、大豆タンパク
１．５％、ＫＨ2 ＰＯ4 ０．３％、ＭｇＣｌ2・６Ｈ2
Ｏ ０．０５％、Ｎａ2 ＳＯ4 ０．１％および大豆油
０．１％を含む培地（ｐＨ６．０）５Ｌを１０Ｌジャー
ファーメンターに入れ、１２０℃で３０分間殺菌した。
実施例１で得たモルティエレラ・アルピナ（Mortierell
a alpina）ＳＡＭ２１５３（ＦＥＲＭ Ｐ−１５７６
７）を接種し、通気量１ｖｖｍ、１０日間の通気攪拌培
養を行った。培養温度は、培養開始時は２０℃で培養３
日目より１２℃に下げて行った。なお培養１日目のみ１
％のグルコースを添加した。
１．５％、ＫＨ2 ＰＯ4 ０．３％、ＭｇＣｌ2・６Ｈ2
Ｏ ０．０５％、Ｎａ2 ＳＯ4 ０．１％および大豆油
０．１％を含む培地（ｐＨ６．０）５Ｌを１０Ｌジャー
ファーメンターに入れ、１２０℃で３０分間殺菌した。
実施例１で得たモルティエレラ・アルピナ（Mortierell
a alpina）ＳＡＭ２１５３（ＦＥＲＭ Ｐ−１５７６
７）を接種し、通気量１ｖｖｍ、１０日間の通気攪拌培
養を行った。培養温度は、培養開始時は２０℃で培養３
日目より１２℃に下げて行った。なお培養１日目のみ１
％のグルコースを添加した。
【手続補正１５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５８
【補正方法】変更
【補正内容】
【００５８】培養２日目より培養液１２ｍｌのサンプリ
ングを行い、実施例１と同様にメチルエステル化を行
い、得られた脂肪酸メチルエステルをガスクロマトグラ
フィーで分析した。図１ａ，ｂ，ｃ，ｄにそれぞれアラ
キドン酸の生産量（ｇ／ｌ）、全脂肪酸に対するアラキ
ドン酸の割合（％）、生育度（ｇ／ｌ）、培地中のグル
コース濃度（％）の変化を示す。１０Ｌジャーファーメ
ンターでの低温条件下での培養が確かめられ、培養１０
日目にはアラキドン酸の全脂肪酸に対する割合が実に５
６．４％に達した。また培養１０日目の菌体内脂質へ脂
肪画分を分析した結果、トリアシルグリセロールが８
５．８％、遊離脂肪酸が２．１％、ジアシルグリセロー
ルが０．５％、フォスファチジルエタノールアミンが
３．８％、フォスファチジルコリンが３．９％、フォス
ファチジルセリンが２．０％、フォスファチジン酸が
１．９％であった。
ングを行い、実施例１と同様にメチルエステル化を行
い、得られた脂肪酸メチルエステルをガスクロマトグラ
フィーで分析した。図１ａ，ｂ，ｃ，ｄにそれぞれアラ
キドン酸の生産量（ｇ／ｌ）、全脂肪酸に対するアラキ
ドン酸の割合（％）、生育度（ｇ／ｌ）、培地中のグル
コース濃度（％）の変化を示す。１０Ｌジャーファーメ
ンターでの低温条件下での培養が確かめられ、培養１０
日目にはアラキドン酸の全脂肪酸に対する割合が実に５
６．４％に達した。また培養１０日目の菌体内脂質へ脂
肪画分を分析した結果、トリアシルグリセロールが８
５．８％、遊離脂肪酸が２．１％、ジアシルグリセロー
ルが０．５％、フォスファチジルエタノールアミンが
３．８％、フォスファチジルコリンが３．９％、フォス
ファチジルセリンが２．０％、フォスファチジン酸が
１．９％であった。
Claims (20)
- 【請求項１】 モルティエレラ（Mortierella ）属、コ
ニディオボラス（Conidiobolus）属、フィチウム（Pyth
ium ）属、フィトフトラ（Phytophthora）属、ペニシリ
ューム（Penicillium ）属、クラドスポリューム（Clad
osporium）属、ムコール（Mucor ）属、フザリューム
（Fusarium）属、アスペルギルス（Aspergillus ）属、
ロードトルラ（Rhodotorula ）属、エントモフトラ（En
tomophthora ）属、エキノスポランジウム（Echinospor
angium）属またはサプロレグニア（Saprolegnia ）属に
属しアラキドン酸生産能を有する微生物に変異処理を施
して得られる、ω３不飽和化活性の低下または欠失した
変異株を、培地中で培養開始から、又は最適生育温度で
培養した後に、最適生育温度より低い温度で培養し、そ
の培養物からアラキドン酸を含有する脂質を採取するこ
とを特徴とするアラキドン酸含有脂質の製造方法。 - 【請求項２】 上記変異株を、炭化水素、脂肪酸、脂肪
酸エステル、脂肪酸塩またはこれらを構成成分として含
む油脂を添加した培地で培養するか、あるいは該変異株
が培養されている培養液に炭化水素、脂肪酸、脂肪酸エ
ステル、脂肪酸塩またはこれらを構成成分として含む油
脂を添加してさらに培養することを特徴とする請求項１
記載のアラキドン酸含有脂質の製造方法。 - 【請求項３】 モルティエレラ（Mortierella ）亜属に
属する微生物に変異処理を施して得られる、ω３不飽和
化活性の低下または欠失した変異株を、培地中で培養開
始から、又は２０〜４０℃で培養した後に、２０℃より
低い温度で培養し、その培養物からアラキドン酸を含有
する脂質を採取することを特徴とするアラキドン酸含有
脂質の製造方法。 - 【請求項４】 上記変異株を、炭化水素、脂肪酸、脂肪
酸エステル、脂肪酸塩またはこれらを構成成分として含
む油脂を添加した培地で培養するか、あるいは該変異株
が培養されている培養液に炭化水素、脂肪酸、脂肪酸エ
ステル、脂肪酸塩またはこれらを構成成分として含む油
脂を添加してさらに培養することを特徴とする請求項３
記載のアラキドン酸含有脂質の製造方法。 - 【請求項５】 モルティエレラ（Mortierella ）属、コ
ニディオボラス（Conidiobolus）属、フィチウム（Pyth
ium ）属、フィトフトラ（Phytophthora）属、ペニシリ
ューム（Penicillium ）属、クラドスポリューム（Clad
osporium）属、ムコール（Mucor ）属、フザリューム
（Fusarium）属、アスペルギルス（Aspergillus ）属、
ロードトルラ（Rhodotorula ）属、エントモフトラ（En
tomophthora ）属、エキノスポランジウム（Echinospor
angium）属、サプロレグニア（Saprolegnia ）属に属し
アラキドン酸生産能を有する微生物に変異処理を施して
得られるω３不飽和化活性の低下または欠失した変異株
を、培地中で培養開始から、又は最適生育温度で培養し
た後に、最適生育温度より低い温度で培養し、その培養
物からジホモ−γ−リノレン酸を含有する脂質を採取す
ることを特徴とするジホモ−γ−リノレン酸含有脂質の
製造方法。 - 【請求項６】 前記変異株が、さらにΔ５不飽和化活性
の低下又は欠失した変異株である、請求項５記載のジホ
モ−γ−リノレン酸含有脂質の製造方法。 - 【請求項７】 上記変異株を、炭化水素、脂肪酸、脂肪
酸エステル、脂肪酸塩またはこれらを構成成分として含
む油脂を添加した培地で培養するか、あるいは該変異株
が培養されている培養液に炭化水素、脂肪酸、脂肪酸エ
ステル、脂肪酸塩またはこれらを構成成分として含む油
脂を添加してさらに培養することを特徴とする請求項５
又は６記載のジホモ−γ−リノレン酸含有脂質の製造方
法。 - 【請求項８】 モルティエレラ（Mortierella ）亜属に
属する微生物に変異処理を施して得られるω３不飽和化
活性の低下または欠失した変異株を、培地中で培養開始
から、又は２０〜４０℃で培養した後に、２０℃より低
い温度で培養し、その培養物からジホモ−γ−リノレン
酸を含有する脂質を採取することを特徴とするジホモ−
γ−リノレン酸含有脂質の製造方法。 - 【請求項９】 前記変異株が、さらにΔ５不飽和化活性
の低下又は欠失した変異株である、請求項８記載のジホ
モ−γ−リノレン酸含有脂質の製造方法。 - 【請求項１０】 上記変異株を、炭化水素、脂肪酸、脂
肪酸エステル、脂肪酸塩またはこれらを構成成分として
含む油脂を添加した培地で培養するか、あるいは該変異
株が培養されている培養液に炭化水素、脂肪酸、脂肪酸
エステル、脂肪酸塩またはこれらを構成成分として含む
油脂を添加してさらに培養することを特徴とする請求項
８又は９記載のジホモ−γ−リノレン酸含有脂質の製造
方法。 - 【請求項１１】 アラキドン酸を脂質中の全脂肪酸に対
して７２重量％以上含有するアラキドン酸含有脂質。 - 【請求項１２】 エイコサペンタエン酸の脂質中の全脂
肪酸に対する割合が０．５重量％以下である請求項１１
記載のアラキドン酸含有脂質。 - 【請求項１３】 モルティエレラ（Mortierella ）属、
コニディオボラス（Conidiobolus）属、フィチウム（Py
thium ）属、フィトフトラ（Phytophthora）属、ペニシ
リューム（Penicillium ）属、クラドスポリューム（Cl
adosporium）属、ムコール（Mucor ）属、フザリューム
（Fusarium）属、アスペルギルス（Aspergillus ）属、
ロードトルラ（Rhodotorula ）属、エントモフトラ（En
tomophthora ）属、エキノスポランジウム（Echinospor
angium）属、サプロレグニア（Saprolegnia ）属に属
し、アラキドン酸生産能を有する微生物に変異処理を施
して得られる、ω３不飽和化活性が低下または欠失した
微生物。 - 【請求項１４】 変異処理を施すアラキドン酸生産能を
有する微生物が、モルティエレラ（Mortierella ）属モ
ルティエレラ（Mortierella ）亜属に属する微生物であ
る、請求項１３記載のω３不飽和化酵素活性の低下また
は欠失した微生物。 - 【請求項１５】 変異処理を施すアラキドン酸生産能を
有する微生物が、モルティエレラ・アルピナである、請
求項１４記載のω３不飽和化酵素活性の低下または欠失
した微生物。 - 【請求項１６】 前記ω３不飽和化酵素活性の低下また
は欠失した微生物が、モルティエレラ・アルピナＳＡＭ
２１５３（ＦＥＲＭ Ｐ−１５７６７）である請求項１
５記載のω３不飽和化酵素活性の低下または欠失した微
生物。 - 【請求項１７】 請求項１３乃至１６記載のω３不飽和
化酵素活性の低下または欠失した微生物を培養して得ら
れる、脂質中の全脂肪酸に対するアラキドン酸の含量が
５０重量％以上であるアラキドン酸含有脂質。 - 【請求項１８】 請求項１３乃至１６記載のω３不飽和
化酵素活性の低下または欠失した微生物を培養して得ら
れる、脂質中の全脂肪酸に対するアラキドン酸の含量が
５０重量％以上であり、かつエイコサペンタエン酸の含
量が０．５重量％以下であるアラキドン酸含有脂質。 - 【請求項１９】 脂質中の全脂肪酸に対するアラキドン
酸の含量が６０重量％以上である請求項１７又は１８記
載のアラキドン酸含有脂質。 - 【請求項２０】 脂質中の全脂肪酸に対するアラキドン
酸の含量が７０重量％以上である請求項１７又は１８記
載のアラキドン酸含有脂質。
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