ES2871045T3 - Moléculas de unión a antígeno que comprenden un trímero de ligando de la familia de TNF - Google Patents

Moléculas de unión a antígeno que comprenden un trímero de ligando de la familia de TNF Download PDF

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Abstract

Una molécula de unión a antígeno que contiene un trímero de ligando de la familia de TNF que comprende (a) al menos una molécula Fab que se puede unir específicamente a CD19, (b) un primer y un segundo polipéptido que están unidos entre sí por un enlace disulfuro, en la que la molécula de unión a antígeno se caracteriza por que (i) el primer polipéptido contiene un dominio CH1 o CL y el segundo polipéptido contiene un dominio CL o CH1, respectivamente, en el que el segundo polipéptido se une al primer polipéptido por un enlace disulfuro entre el dominio CH1 y CL, y en el que el primer polipéptido comprende dos ectodominios de 4-1BBL que comprenden la secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 96, SEQ ID NO: 373, SEQ ID NO: 374 y SEQ ID NO: 375 que están conectadas entre sí y al dominio CH1 o CL mediante un conector peptídico y en el que el segundo polipéptido comprende un ectodominio de dicho 4-1BBL que comprende la secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 96, SEQ ID NO: 373, SEQ ID NO: 374 y SEQ ID NO: 375 conectado por medio de un conector peptídico al dominio CL o CH1 de dicho polipéptido, o (ii) el primer polipéptido contiene un dominio CH3 y el segundo polipéptido contiene un dominio CH3, respectivamente, y en el que el primer polipéptido comprende dos ectodominios de 4-1BBL que comprenden la secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 96, SEQ ID NO: 373, SEQ ID NO: 374 y SEQ ID NO: 375 que están conectadas entre sí y al extremo C del dominio CH3 mediante un conector peptídico y en el que el segundo polipéptido comprende solo un ectodominio de dicho 4-1BBL que comprende la secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 96, SEQ ID NO: 373, SEQ ID NO: 374 y SEQ ID NO: 375 conectadas por medio de un conector peptídico al extremo C del dominio CH3 de dicho polipéptido, o (iii) el primer polipéptido contiene un dominio VH-CL o VL-CH1 y el segundo polipéptido contiene un dominio VL-CH1 o un dominio VH-CL, respectivamente, en el que el segundo polipéptido se une al primer polipéptido por un enlace disulfuro entre el dominio CH1 y CL, y en el que el primer polipéptido comprende dos ectodominios de 4-1BBL que comprenden la secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 96, SEQ ID NO: 373, SEQ ID NO: 374 y SEQ ID NO: 375 que están conectadas entre sí y a VH o VL mediante un conector peptídico y en el que el segundo polipéptido comprende un ectodominio de dicho 4-1BBL que comprende la secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 96, SEQ ID NO: 373, SEQ ID NO: 374 y SEQ ID NO: 375 conectadas por medio de un conector peptídico al VL o VH de dicho polipéptido, y (c) un dominio Fc compuesto de una primera y una segunda subunidad que se pueden asociar de manera estable.

Description

DESCRIPCIÓN
Moléculas de unión a antígeno que comprenden un trímero de ligando de la familia de TNF
Campo de la invención
La invención se refiere a moléculas de unión a antígeno que contienen un trímero de ligando de la familia de TNF novedosas que comprenden (a) al menos una molécula Fab que se puede unir específicamente a CD19, (b) un primer y un segundo polipéptido que están unidos entre sí por un enlace disulfuro, en las que la molécula de unión a antígeno se caracteriza por que
(i) el primer polipéptido contiene un dominio CH1 o CL y el segundo polipéptido contiene un dominio CL o CH1, respectivamente, en el que el segundo polipéptido se une al primer polipéptido por un enlace disulfuro entre el dominio CH1 y CL, y en el que el primer polipéptido comprende dos ectodominios de 4-1BBL que comprenden la secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 96, SEQ ID NO: 373, SEQ ID NO: 374 y SEQ ID NO: 375 que están conectadas entre sí y al dominio CH1 o CL mediante un conector peptídico y en el que el segundo polipéptido comprende un ectodominio de dicho 4-1BBL que comprende la secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 96, SEQ ID NO: 373, SEQ ID NO: 374 y SEQ ID NO: 375 conectado por medio de un conector peptídico al dominio CL o CH1 de dicho polipéptido, o
(ii) el primer polipéptido contiene un dominio CH3 y el segundo polipéptido contiene un dominio CH3, respectivamente, y en el que el primer polipéptido comprende dos ectodominios de 4-1BBL que comprenden la secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 96, SEQ ID NO: 373, SEQ ID NO: 374 y SEQ ID NO: 375 que están conectadas entre sí y al extremo C del dominio CH3 mediante un conector peptídico y en el que el segundo polipéptido comprende solo un ectodominio de dicho 4-1BBL que comprende la secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 96, SEQ ID NO: 373, SEQ ID NO: 374 y SEQ ID NO: 375 conectadas por medio de un conector peptídico al extremo C del dominio CH3 de dicho polipéptido, o
(iii) el primer polipéptido contiene un dominio VH-CL o VL-CH1 y el segundo polipéptido contiene un dominio VL-CH1 o un dominio VH-CL, respectivamente, en el que el segundo polipéptido se une al primer polipéptido por un enlace disulfuro entre el dominio CH1 y CL, y en el que el primer polipéptido comprende dos ectodominios de 4-1BBL que comprenden la secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 96, SEQ ID NO: 373, SEQ ID NO: 374 y SEQ ID NO: 375 que están conectadas entre sí y a VH o VL mediante un conector peptídico y en el que el segundo polipéptido comprende un ectodominio de dicho 4-1BBL que comprende la secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 96, SEQ ID NO: 373, SEQ ID NO: 374 y SEQ ID NO: 375 conectadas por medio de un conector peptídico al VL o VH de dicho polipéptido, y
(c) un dominio Fc compuesto de una primera y una segunda subunidad que se pueden asociar de manera estable. La invención se refiere además a procedimientos para producir estas moléculas y a procedimientos para el uso de las mismas.
Antecedentes
Los ligandos que interactúan con moléculas de la superfamilia de receptores de TNF (factor de necrosis tumoral) tienen papeles fundamentales en la organización y función del sistema inmunitario. Mientras regulan las funciones normales tales como las respuestas inmunitarias, la hematopoyesis y la morfogénesis, los ligandos de la familia de TNF (también llamados citocinas) juegan un papel en la oncogénesis, el rechazo de trasplantes, el choque séptico, la replicación vírica, la resorción ósea, la artritis reumatoide y la diabetes (Aggarwal, 2003). La familia de ligandos de TNF comprende 18 genes que codifican 19 proteínas transmembranales tipo II (es decir, extremo N intracelular y extremo C extracelular), caracterizadas por la presencia de un dominio C terminal conservado denominado "dominio de homología de TNF" (THD). Este dominio es responsable de la unión al receptor y, por tanto, es crítico para la actividad biológica de los miembros de la familia de ligandos de TNF. La identidad de secuencia entre los miembros de la familia es ~ 20-30 % (Bodmer, 2002). Los miembros de la familia de ligandos de TNF ejercen su función biológica como trímeros no covalentes de autoensamblaje (Banner et al., Cell 1993, 73, 431-445). Por tanto, los ligandos de la familia de TNF forman un trímero que se puede unir a y activar los receptores correspondientes de la superfamilia de TNFR.
4-1BB (CD137), un miembro de la superfamilia de receptores del TNF, se ha identificado en primer lugar como una molécula cuya expresión se induce por la activación de linfocitos T (Kwon y Weissman, 1989). Estudios posteriores demostraron la expresión de 4-1BB en linfocitos T y B (Snell et al., 2011; Zhang et al., 2010), linfocitos NK (Lin et al., 2008), linfocitos NKT (Kim et al., 2008), monocitos (Kienzle y von Kempis, 2000; Schwarz et al., 1995), neutrófilos (Heinisch et al., 2000), mastocitos (Nishimoto et al., 2005) y células dendríticas, así como células de origen no hematopoyético tal como las células endoteliales y del músculo liso (Broll et al., 2001; Olofsson et al., 2008). La expresión de 4-1BB en diferentes tipos de células es casi siempre inducible e impulsada por diversas señales estimuladoras, tales como la activación del receptor de linfocitos T (TCR) o del receptor de linfocitos B, así como la señalización que inducen moléculas coestimuladoras o receptores de citocinas proinflamatorias (Diehl et al., 2002; von Kempis et al., 1997; Zhang et al., 2010).
La expresión del ligando 4-1BB (4-1BBL o CD137L) está más restringida y se observa en células presentadoras de antígeno (APC) profesionales, tales como linfocitos B, células dendríticas (DC) y macrófagos. La expresión inducible de 4-1BBL es característica de los linfocitos T, incluyendo tanto subconjuntos de linfocitos T ap como y§, y células endoteliales (revisado en Shao y Schwarz, 2011).
Se sabe que la señalización de CD137 estimula la secreción de IFN y y la proliferaci ón de linfocitos NK (Buechele et al., 2012; Lin et al., 2008; Melero et al., 1998), así como también promueve la activación de DC, como se indica por su mayor supervivencia y capacidad para secretar citocinas y regular por incremento las moléculas coestimuladoras (Choi et al., 2009; Futagawa et al., 2002; Wilcox et al., 2002). Sin embargo, CD137 se caracteriza mejor como una molécula coestimuladora que modula la activación inducida por TCR en los subconjuntos CD4+ y CD8+ de linfocitos T. En combinación con la activación del TCR, los anticuerpos agonistas específicos 4-1BB potencian la proliferación de linfocitos T, estimulan la secreción de linfocinas y disminuyen la sensibilidad de los linfocitos T a la muerte celular inducida por activación (revisado en Snell et al., 2011).
En consonancia con estos efectos coestimuladores de los anticuerpos 4-1 BB sobre linfocitos T in vitro, su administración a ratones portadores de tumores da lugar a potentes efectos antitumorales en muchos modelos de tumores experimentales (Melero et al., 1997; Narazaki et al., 2010). Sin embargo, 4-1BB normalmente presenta su potencia como agente antitumoral solo cuando se administra en combinación con otros compuestos inmunomoduladores (Curran et al., 2011; Guo et al., 2013; Morales-Kastresana et al., 2013; Teng et al., 2009; Wei et al., 2013), reactivos quimioterapéuticos (Ju et al., 2008; Kim et al., 2009), vacunación específica para tumores (Cuadros et al., 2005; Lee et al., 2011) o radioterapia (Shi y Siemann, 2006). Los experimentos de disminución in vivo demostraron que los linfocitos T CD8+ juegan el papel más crítico en el efecto antitumoral de los anticuerpos específicos de 4-1BB. Sin embargo, dependiendo del modelo tumoral o del tratamiento combinado, que incluye anti-4-1BB, se han reportado contribuciones de otros tipos de células tales como DC, linfocitos NK o linfocitos T CD4+ (Melero et al., 1997; Murillo et al., 2009; Narazaki et al., 2010; Stagg et al., 2011).
Además de sus efectos directos sobre diferentes subconjuntos de linfocitos, los agonistas 4-1BB también pueden inducir la infiltración y retención de linfocitos T activados en el tumor a través de la regulación por incremento mediada por 4-1BB de la molécula de adhesión intercelular 1 (ICAM1) y la molécula de adhesión celular vascular 1 (VCAM1) en el endotelio vascular del tumor (Palazon et al., 2011).
La activación de 4-1BB también puede revertir el estado de anergia de los linfocitos T inducido por la exposición a un antígeno soluble que puede contribuir a la alteración de la tolerancia inmunológica en el microambiente tumoral o durante infecciones crónicas (Wilcox et al., 2004).
Parece que las propiedades inmunomoduladoras de los anticuerpos agonistas de 4-1 BB in vivo requieren la presencia de la porción Fc natural en la molécula de anticuerpo, que implica, de este modo, la unión del receptor Fc como un acontecimiento importante requerido para la actividad farmacológica de dichos reactivos como se ha descrito para anticuerpos agonistas específicos de otros miembros inmunomoduladores o inductores de apoptosis de la superfamilia de TNFR (Li y Ravetch, 2011; Teng et al., 2009). Sin embargo, la administración sistémica de anticuerpos agonistas específicos de 4-1BB con el dominio Fc funcionalmente activo induce también la expansión de linfocitos T CD8+ asociada con toxicidad hepática (Dubrot et al., 2010) que disminuye o mejora significativamente en ausencia de receptores Fc funcionales en ratones. En ensayos clínicos en humanos (ClinicalTrials.gov, NCT00309023), los anticuerpos agonistas 4-1 BB competentes en Fc (BMS-663513) administrados una vez cada tres semanas durante 12 semanas indujeron la estabilización de la enfermedad en pacientes con melanoma, carcinoma de células de ovario o renal. Sin embargo, el mismo anticuerpo administrado en otro ensayo (NCT00612664) causó hepatitis de grado 4 que dio lugar a la finalización del ensayo (Simeone y Ascierto, 2012).
Conjuntamente, los datos preclínicos y clínicos disponibles demuestran claramente que existe una gran necesidad clínica de agonistas 4-1 BB eficaces. Sin embargo, los candidatos a fármacos de nueva generación no solo deberían comprometer eficazmente el 4-1BB en la superficie de las células hematopoyéticas y endoteliales, sino que también deberían ser capaces de lograrlo a través de mecanismos distintos de la unión a receptores Fc para evitar efectos secundarios incontrolables. Esto último se puede lograr mediante la unión preferencial y la oligomerización de restos específicos de tumor o asociados a tumor.
Se han creado proteínas de fusión compuestas por un dominio extracelular de un ligando 4-1BB y un fragmento de anticuerpo monocatenario (Mueller et al., 2008; Hornig et al., 2012) o un único ligando 4-1BB fusionado al extremo C de una cadena pesada (Zhang et al., 2007). El documento WO 2010/010051 divulga la generación de proteínas de fusión que consisten en tres ectodominios de ligandos de TNF unidos entre sí y fusionados a una parte del anticuerpo.
Sin embargo, todavía existe la necesidad de nuevas moléculas de unión a antígeno que combinen un resto que se puede unir de forma preferente a dianas específicas de tumores o asociadas a tumores con un resto capaz de formar un trímero de ligando de TNF coestimulador y que tenga suficiente estabilidad para ser farmacéuticamente útil. Las moléculas de unión a antígeno de la presente invención comprenden ambas y sorprendentemente proporcionan un ligando de TNF trimérico y, por tanto, biológicamente activo, aunque uno de los ectodominios del ligando de TNF trimerizante se localiza en otro polipéptido diferente a los otros dos ectodominios de ligando de TNF de la molécula.
Sumario de la invención
En un aspecto, la invención proporciona una molécula de unión a antígeno que contiene trímero de ligando de la familia del TNF que comprende
(a) al menos una molécula Fab que se puede unir específicamente a CD19,
(b) un primer y segundo polipéptido que están unidos entre sí por un enlace disulfuro, en el que la molécula de unión a antígeno se caracteriza por que
(i) el primer polipéptido contiene un dominio CH1 o CL y el segundo polipéptido contiene un dominio CL o CH1, respectivamente, en el que el segundo polipéptido se une al primer polipéptido por un enlace disulfuro entre el dominio CH1 y CL, y en el que el primer polipéptido comprende dos ectodominios de 4-1BBL que comprenden la secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 96, SEQ ID NO: 373, SEQ ID NO: 374 y SEQ ID NO: 375 que están conectadas entre sí y al dominio CH1 o CL mediante un conector peptídico y en el que el segundo polipéptido comprende un ectodominio de dicho 4-1BBL que comprende la secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 96, SEQ ID NO: 373, SEQ ID NO: 374 y SEQ ID NO: 375 conectado por medio de un conector peptídico al dominio CL o CH1 de dicho polipéptido, o
(ii) el primer polipéptido contiene un dominio CH3 y el segundo polipéptido contiene un dominio CH3, respectivamente, y en el que el primer polipéptido comprende dos ectodominios de 4-1BBL que comprenden la secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 96, SEQ ID NO: 373, SEQ ID NO: 374 y SEQ ID NO: 375 que están conectadas entre sí y al extremo C del dominio CH3 mediante un conector peptídico y en el que el segundo polipéptido comprende solo un ectodominio de dicho 4-1BBL que comprende la secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 96, SEQ ID NO: 373, SEQ ID NO: 374 y SEQ ID NO: 375 conectadas por medio de un conector peptídico al extremo C del dominio CH3 de dicho polipéptido, o
(iii) el primer polipéptido contiene un dominio VH-CL o VL-CH1 y el segundo polipéptido contiene un dominio VL-CH1 o un dominio VH-CL, respectivamente, en el que el segundo polipéptido se une al primer polipéptido por un enlace disulfuro entre el dominio CH1 y CL, y en el que el primer polipéptido comprende dos ectodominios de 4-1BBL que comprenden la secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 96, SEQ ID NO: 373, SEQ ID NO: 374 y SEQ ID NO: 375 que están conectadas entre sí y a VH o VL mediante un conector peptídico y en el que el segundo polipéptido comprende un ectodominio de dicho 4-1BBL que comprende la secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 96, SEQ ID NO: 373, SEQ ID NO: 374 y SEQ ID NO: 375 conectadas por medio de un conector peptídico al VL o VH de dicho polipéptido, y
(c) un dominio Fc compuesto de una primera y una segunda subunidad que se pueden asociar de manera estable.
En otro aspecto, el ectodominio de un miembro de la familia de ligandos de TNF comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 96.
Más en particular, el ectodominio de un miembro de la familia de ligandos de TNF comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 96.
En otro aspecto, la molécula de unión a antígeno que contiene el trímero de ligando de la familia de TNF de la invención comprende
(a) al menos una molécula Fab que se puede unir específicamente a CD19, y
(b) un primer y segundo polipéptido que están unidos entre sí por un enlace disulfuro, en el que la molécula de unión a antígeno se caracteriza por que el primer polipéptido comprende la secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en la SEQ iD NO: 5, SEQ ID NO: 97, SEQ ID NO: 98 y SEQ ID NO: 99; y por que el segundo polipéptido comprende la secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en la SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 96, SEQ ID NO: 3 y SEQ ID NO: 4.
En otro aspecto, la molécula de unión a antígeno que contiene el trímero de ligando de la familia de TNF de la invención comprende
(a) al menos una molécula Fab que se puede unir específicamente a CD19, y
(b) un primer polipéptido que contiene un dominio CH1 o CL y un segundo polipéptido que contiene un dominio CL o CH1, respectivamente, en el que el segundo polipéptido se une al primer polipéptido por un enlace disulfuro entre el dominio CH1 y CL,
y en el que la molécula de unión a antígeno se caracteriza por que el primer polipéptido comprende dos ectodominios de 4-1BBL que comprenden la secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en la SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 96, SEQ ID NO: 373, SEQ ID NO: 374 y SEQ ID NO: 375 que están conectadas entre sí y al dominio CH1 o CL mediante un conector peptídico y por que el segundo polipéptido comprende solo un ectodominio de dicho 4-1BBL que comprende la secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en la SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 96, SEQ ID NO: 373, SEQ ID NO: 374 y SEQ ID NO: 375 conectadas por medio de un conector peptídico al dominio CL o CH1 de dicho polipéptido.
En un aspecto, se proporciona una molécula de unión a antígeno que contiene un trímero de ligando de la familia de TNF que comprende
(a) al menos una molécula Fab que se puede unir específicamente a CD19,
(b) un primer polipéptido que contiene un dominio CH1 y un segundo polipéptido que contiene un dominio CL, en el que el segundo polipéptido se une al primer polipéptido por un enlace disulfuro entre el dominio CH1 y CL,
y en el que la molécula de unión a antígeno se caracteriza por que el primer polipéptido comprende dos ectodominios de 4-1BBL que comprenden la secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en la SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 96, SEQ ID NO: 373, SEQ ID NO: 374 y SEQ ID NO: 375 que están conectadas entre sí y al dominio CH1 mediante un conector peptídico y por que el segundo polipéptido comprende solo un ectodominio de dicho 4-1 BBL que comprende la secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en la SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 96, SEQ ID NO: 373, SEQ ID NO: 374 y SEQ ID NO: 375 conectadas por medio de un conector peptídico al dominio CL de dicho polipéptido.
En otro aspecto, se proporciona una molécula de unión a antígeno que contiene un trímero de ligando de la familia de TNF que comprende
(a) al menos una molécula Fab que se puede unir específicamente a CD19,
(b) un primer polipéptido que contiene un dominio CL y un segundo polipéptido que contiene un dominio CH1, en el que el segundo polipéptido se une al primer polipéptido por un enlace disulfuro entre el dominio CH1 y CL,
y en el que la molécula de unión a antígeno se caracteriza por que el primer polipéptido comprende dos ectodominios de 4-1BBL que comprenden la secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en la SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 96, SEQ ID NO: 373, SEQ ID NO: 374 y SEQ ID NO: 375 que están conectadas entre sí y al dominio CL mediante un conector peptídico y por que el segundo polipéptido comprende solo un ectodominio de dicho 4-1 BBL que comprende la secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en la SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 96, SEQ ID NO: 373, SEQ ID NO: 374 y SEQ ID NO: 375 conectadas por medio de un conector peptídico al dominio CH1 de dicho polipéptido.
En un aspecto particular, la invención se refiere a una molécula de unión a antígeno que contiene trímero de ligando de la familia de TNF como se define anteriormente, en el que el conector peptídico es (G4S)2, es decir, un conector peptídico de SEQ ID NO: 13. En un aspecto, el primer conector peptídico es (G4S)2, el segundo conector peptídico es GSPGSSSSGS (SEQ ID NO: 57) y el tercer conector peptídico es (G4S)2. En otro aspecto, el primer, segundo y tercer conector peptídico es (G4S)2.
En otro aspecto, el dominio Fc es una IgG, en particular un dominio Fc de IgG1 o un dominio Fc de IgG4. Más en particular, el dominio Fc es un dominio Fc de IgG1. En un aspecto particular, el dominio Fc comprende una modificación que promueve la asociación de la primera y la segunda subunidad del dominio Fc.
En otro aspecto, la invención se refiere a una molécula de unión a antígeno que contiene un trímero de ligando de la familia de TNF como se define anteriormente en el presente documento, que comprende
(c) un dominio Fc compuesto de una primera y una segunda subunidad que se puede asociar de manera estable, en el que el dominio Fc comprende una o más sustituciones aminoacídicas que reduce la unión a un receptor Fc, en particular al receptor Fcy.
En particular, el dominio Fc comprende sustituciones aminoacídicas en las posiciones 234 y 235 (numeración EU) y/o 329 (numeración EU) de las cadenas pesadas de IgG. Más en particular, se proporciona una molécula de unión a antígeno que contiene un ligando de la familia de TNF trimérica de acuerdo con la invención que comprende un dominio Fc de IgG1 con las sustituciones aminoacídicas L234A, L235A y P329G (numeración EU).
En otro aspecto, la invención proporciona una molécula de unión a antígeno que contiene un trímero de ligando de la familia de TNF, en el que la molécula de unión a antígeno comprende
una primera cadena pesada y una primera cadena ligera, comprendiendo las dos una molécula Fab que se puede unir específicamente a CD19,
un primer péptido que comprende dos ectodominios de 4-1BBL que comprenden la secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en la SEQ ID NO: 1, SEQ ID nO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 96, SEQ ID NO: 373, SEQ ID NO: 374 y SEQ ID NO: 375 conectadas entre sí mediante un conector peptídico fusionado en su extremo C mediante un segundo conector peptídico a una segunda cadena pesada o ligera,
y un segundo péptido que comprende un ectodominio de dicho 4-1BBL que comprende la secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en la SEQ ID NO: 1, SEQ ID No : 2, s Eq ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 96, SEQ ID NO: 373, SeQ ID NO: 374 y SEQ ID NO: 375 fusionado en su extremo C mediante un tercer conector peptídico a una segunda cadena ligera o pesada, respectivamente.
En otro aspecto, se proporciona una molécula de unión a antígeno que contiene un trímero de ligando de la familia de TNF, en el que el primer péptido que comprende dos ectodominios de 4-1BBL que comprenden la secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en la SEQ ID NO: 1, SEQ ID nO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 96, SEQ ID NO: 373, SeQ ID NO: 374 y SEQ ID NO: 375 conectadas entre sí mediante un primer conector peptídico se fusiona en su extremo C mediante un segundo conector peptídico a un dominio CH1 que es parte de una cadena pesada,
y el segundo péptido que comprende un ectodominio de dicho 4-1 BBL que comprende la secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en la SEQ ID NO: 1, SEQ ID No : 2, s Eq ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 96, SEQ ID NO: 373, SeQ ID NO: 374 y SEQ ID NO: 375 se fusiona en su extremo C mediante un tercer conector peptídico a un dominio CL que es parte de una cadena ligera.
Aún en otro aspecto, se proporciona una molécula de unión a antígeno que contiene un trímero de ligando de la familia de TNF, en el que el primer péptido que comprende dos ectodominios de 4-1 BBL que comprenden la secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en la SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 96, SEQ ID NO: 373, SEQ ID NO: 374 y SEQ ID NO: 375 conectadas entre sí mediante un primer conector peptídico se fusiona en su extremo C mediante un segundo conector peptídico a un dominio CL que es parte de una cadena pesada,
y el segundo péptido que comprende un ectodominio de dicho 4-1 BBL que comprende la secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en la SEQ ID NO: 1, SEQ ID No : 2, s Eq ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 96, SEQ ID NO: 373, SeQ ID NO: 374 y SEQ ID NO: 375 se fusiona en su extremo C mediante un tercer conector peptídico a un dominio CH1 que es parte de una cadena ligera.
En otro aspecto, la invención proporciona una molécula de unión a antígeno que contiene un trímero de ligando de la familia de TNF, en el que el primer péptido que comprende dos ectodominios de 4-1BBL que comprenden la secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en la SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 96, SEQ ID NO: 373, SEQ ID NO: 374 y SEQ ID NO: 375 conectadas entre sí mediante un primer conector peptídico se fusiona en su extremo C mediante un segundo conector peptídico a un dominio VH que es parte de una cadena pesada,
y el segundo péptido que comprende un ectodominio de dicho 4-1 BBL que comprende la secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en la SEQ ID NO: 1, SEQ ID No : 2, s Eq ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 96, SEQ ID NO: 373, SeQ ID NO: 374 y SEQ ID NO: 375 se fusiona en su extremo C mediante un tercer conector peptídico a un dominio VL que es parte de una cadena ligera.
Se proporciona además una molécula de unión a antígeno que contiene un trímero de ligando de la familia de TNF, en el que en el dominio CL contiguo al miembro de la familia de ligando de TNF, el aminoácido en la posición 123 (numeración EU) se ha reemplazado por arginina (R) y el aminoácido en la posición 124 (numeración UE) se ha sustituido por lisina (K), y en el que en el dominio CH1 contiguo al miembro de la familia de ligando de TNF, los aminoácidos en la posición 147 (numeración UE) y en la posición 213 (numeración UE) se han sustituido por ácido glutámico (E).
En un aspecto, la invención proporciona una molécula de unión a antígeno que contiene un trímero de ligando de la familia de TNF, en el que la molécula de unión a antígeno comprende
(a) una molécula Fab que se puede unir específicamente a CD19, y
(b) una segunda cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en la SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 97, SEQ ID NO: 98 y SEQ ID NO: 99, y
una segunda cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en la SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 96, SEQ ID NO: 3 y SEQ ID NO: 4.
Aún en otro aspecto, la invención proporciona una molécula de unión a antígeno que contiene trímero de ligando de la familia de TNF que comprende
(a) al menos un resto que se puede unir específicamente a un antígeno de célula diana, y
(b) un primer y un segundo polipéptido que están unidos entre sí por un enlace disulfuro, en el que la molécula de unión a antígeno se caracteriza por que el primer polipéptido contiene un dominio CH3 y el segundo polipéptido contiene un dominio CH3, respectivamente, y en el que el primer polipéptido comprende dos ectodominios de 4-1BBL que comprenden la secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en la SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 96, SEQ ID NO: 373, SEQ ID NO: 374 y SEQ ID NO: 375 que están conectadas entre sí y al extremo C del dominio CH3 mediante un conector peptídico y en el que el segundo polipéptido comprende un ectodominio de dicho 4-1BBL que comprende la secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en la SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 96, SEQ ID NO: 373, SEQ ID NO: 374 y SEQ ID NO: 375 conectadas por medio de un conector peptídico al extremo C del dominio CH3 de dicho polipéptido.
En particular, dicha molécula de unión a antígeno que contiene un trímero de ligando de la familia de TNF comprende dos restos que se pueden unir específicamente a CD19.
En un aspecto, se proporciona una molécula de unión a antígeno que contiene un trímero de ligando de la familia de TNF, en la que la molécula Fab que se puede unir específicamente a CD19 comprende un dominio VH que comprende (i) CDR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 195 o SEQ ID NO: 252, (ii) CDR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 196 o SEQ ID NO: 253, y (iii) CDR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 197 o SEQ ID NO: 254, y un dominio Vl que comprende (iv) CDR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 198 o SEQ ID NO: 249, (v) CDR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 199 o SEQ ID NO: 250, y (vi) CDR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 200 o SEQ ID NO: 251.
En otro aspecto, se proporciona una molécula de unión a antígeno que contiene un trímero de ligando de la familia de TNF, en la que la molécula Fab que se puede unir específicamente a CD19 comprende una cadena pesada variable que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 201 y una cadena ligera variable que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 202 o en la que la molécula Fab que se puede unir específicamente a FAP comprende una cadena pesada variable que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 357 y una cadena ligera variable que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 358.
En un aspecto particular, se proporciona una molécula de unión a antígeno que contiene trímero de ligando de la familia de TNF, en el que la molécula de unión a antígeno comprende
(i) una primera cadena pesada que comprende el dominio VH que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 201 y una primera cadena ligera que comprende el dominio VL que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 202 o
una primera cadena pesada que comprende el dominio VH que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 357 y una primera cadena ligera que comprende el dominio VL que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 358,
(ii) una segunda cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en la SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 108, SEQ ID NO: 111 y SEQ ID NO: 113, y
(iii) una segunda cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 109, SEQ ID NO: 110, SEQ ID NO: 112 y SEQ ID NO: 114.
En otro aspecto, se proporciona una molécula de unión a antígeno que contiene un trímero de ligando de la familia de TNF, en el que la molécula de unión a antígeno comprende
(i) una primera cadena pesada que comprende el dominio VH que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 201 y una primera cadena ligera que comprende el dominio VL que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 202 o
una primera cadena pesada que comprende el dominio VH que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 357 y una primera cadena ligera que comprende el dominio VL que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 358,
(ii) una segunda cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en la SEQ ID NO: 115, SEQ ID NO: 117, SEQ ID NO: 119 y SEQ ID NO: 173, y
(iii) una segunda cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en la SEQ ID NO: 116, SEQ ID NO: 118, SEQ ID NO: 120 y SEQ ID NO: 174.
En un aspecto, la invención proporciona una molécula de unión a antígeno que contiene un trímero de ligando de la familia de TNF que comprende dos restos que se pueden unir específicamente a CD19. En particular, se proporciona una molécula de unión a antígeno que contiene trímero de ligando de la familia de TNF, en el que la molécula de unión a antígeno comprende
(i) una primera cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 209, una segunda cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 210 y dos cadenas ligeras que comprenden la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 206, o
(ii) una primera cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 213, una segunda cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 214 y dos cadenas ligeras que comprenden la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 206, o
(iii) una primera cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 309, una segunda cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 310 y dos cadenas ligeras que comprenden la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 279, o
(iv) una primera cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 313, una segunda cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 314 y dos cadenas ligeras que comprenden la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 279.
De acuerdo con otro aspecto de la invención, se proporciona un polinucleótido aislado que codifica una molécula de unión a antígeno que contiene trímero de ligando de la familia de TNF como se define anteriormente en el presente documento. La invención proporciona además un vector, en particular, un vector de expresión que comprende el polinucleótido aislado de la invención, y una célula huésped que comprende el polinucleótido aislado o el vector de expresión de la invención. En algunos modos de realización, la célula huésped es una célula eucariota, en particular una célula de mamífero.
En otro aspecto se proporciona un procedimiento de producción de la molécula de unión a antígeno que contiene trímero de ligando de la familia de TNF de la invención, que comprende las etapas de (i) cultivar la célula huésped de la invención en condiciones adecuadas para la expresión de la molécula de unión a antígeno y (ii) recuperar la molécula de unión a antígeno. La invención también engloba una molécula de unión a antígeno que contiene trímero de ligando de la familia de TNF producida por el procedimiento de la invención.
La invención proporciona además una composición farmacéutica que comprende la molécula de unión a antígeno que contiene trímero de ligando de la familia de TNF de la invención y al menos un excipiente farmacéuticamente aceptable.
La invención también engloba la molécula de unión a antígeno que contiene trímero de ligando de la familia de TNF de la invención, o la composición farmacéutica de la invención, para su uso como medicamento. En un aspecto se proporciona una molécula de unión a antígeno que contiene trímero de ligando de la familia de TNF de la invención o la composición farmacéutica de la invención para su uso en el tratamiento de una enfermedad en un individuo que necesita el mismo. En un modo de realización específico, se proporciona la molécula de unión a antígeno que contiene trímero de ligando de la familia de TNF de la invención, o la composición farmacéutica de la invención, para su uso en el tratamiento del cáncer.
T ambién se proporciona el uso de la molécula de unión a antígeno que contiene trímero de ligando de la familia de TNF de la invención para la fabricación de un medicamento para el tratamiento de una enfermedad en un individuo que necesita el mismo, en particular para la fabricación de un medicamento para el tratamiento del cáncer.
Breve descripción de los dibujos
La figura 1 muestra los componentes para el ensamblaje de ligandos 4-1BB humanos triméricos divididos. La figura (1A) muestra el ligando dimérico que se fusiona en el extremo C con un dominio CH1 o CL humano o un dominio VL o VH y la figura (1B) muestra el ligando monomérico fusionado con el dominio CL o CH1 humano o un dominio VL o VH. La figura (1C) muestra el ligando dimérico que se fusiona en el extremo N con un dominio CH3 humano y la figura (1D) muestra el ligando monomérico fusionado en el extremo N con un dominio CH3 humano.
La figura 2 muestra las moléculas de unión a antígeno que contienen un trímero 4-1BBL; construcciones 1.1 a 1.10 de la invención. La preparación y producción de estas construcciones se describe en el ejemplo 1. Los dominios VH y VL son los del anticuerpo anti-FAP 28H1, el punto negro grueso representa la modificación de botón en ojal. * simboliza modificaciones de aminoácidos en el dominio CH1 y CL (los llamados residuos cargados).
La figura 3 muestra los componentes para el ensamblaje de ligandos 4-1BB murinos triméricos divididos. La figura (3A) muestra el ligando dimérico que se fusiona en el extremo C con el dominio CL murino y la figura (3B) muestra el ligando monomérico fusionado en el extremo C con el dominio CH1 murino. Componentes para el ensamblaje del ligando 4-1BB murino trimérico dividido dirigido a FAP. La figura (3C) muestra las moléculas de unión a antígeno que contienen un trímero 4-1BBL murino ensambladas como se describe con más detalle en el ejemplo 1.3.
La figura 4 muestra las moléculas de unión a antígeno que contienen un trímero 4-1BBL; construcciones 2.1 a 2.6 de la invención. La preparación y producción de estas construcciones se describe en el ejemplo 2. Los dominios VH y VL son los del anticuerpo anti-FAP 4B9, el punto negro grueso representa la modificación de botón en ojal. * simboliza modificaciones de aminoácidos en el dominio CH1 y CL (los llamados residuos cargados).
La figura 5A y la figura 5B muestran las variantes "no dirigidas" de las construcciones 1.1 y 1.2 que comprenden una molécula Fab DP47 en lugar de la molécula Fab anti-FAP. Las moléculas se denominan control A y control B, respectivamente. La preparación se describe en el ejemplo 1.4. La figura 5C es un dibujo de la construcción de (kih) de Fc 4-1BB monomérico preparada en el ejemplo 3.
La figura 6 se refiere a la unión de la molécula de unión a antígeno de fusión (kih) de Fc que contiene un trímero de ligando 4-1 BB dirigido a FAP (trímero 4-1BBL dividido de FAP, círculos rellenos) o molécula de unión a antígeno de fusión (kih) de Fc que contiene un trímero de ligando 4-1BB no dirigido a DP-47 (trímero 4-1BBL dividido de DP47, círculos abiertos) a PMBC humanas en reposo (indiferenciadas) o activadas. Específicamente, la unión a los linfocitos T CD8+ humanos en reposo (indiferenciados) o activados se muestra en la figura (6A), a los linfocitos T CD4+ humanos en reposo (indiferenciados) o activados en la figura (6B) y a los linfocitos NK humanos en reposo (indiferenciados) o activados en la figura (6C). Se muestra la unión como mediana de la intensidad de fluorescencia (MFI) del fragmento F(ab')2 de IgG caprino específico de Fcy de anti-IgG humana marcado con ficoeritrina (R-PE) de algas macrofíticas rojas, el cual se usa como anticuerpo de detección secundaria. La MFI se midió mediante citometría de flujo y el valor de referencia se corrigió restando la MFI del control en blanco.
En la figura 7 se muestra la unión de diferentes construcciones (kih) de Fc ligando de 4-1BB humano trimérico dividido dirigido o no dirigido a FAP con linfocitos T que expresan 4-1 BB humano de PHA-L y proleucina preactivada y PBMC humanas reactivadas anti-CD3 humana/anti-CD28 humana. La unión se detectó con el fragmento F(ab')2 de IgG caprino específico de Fc y de anti-IgG humana conjugado con R-ficoeritrina-fluorocromo. Se muestra la mediana de la intensidad de fluorescencia (MFI) frente a la concentración de las construcciones sometidas a prueba 1.1 a 1.10 del ejemplo 1. Para una mejor visualización, las curvas de unión se dividen en cuatro transferencias diferentes con construcción 1.1 ((kih) de Fc ligando de 4-1BB humano trimérico dividido dirigido a FAP monovalente) y control B ((kih) de Fc ligando de 4-1BB humano trimérico dividido no dirigido monovalente con cruce de CH-CL y residuos cargados) como curvas de comparación. La unión se controló en linfocitos T CD3+ CD8+ (figura 7A) y linfocitos T CD3+ Cd 4+ (figura 7B). El nivel de expresión de 4-1BB en los linfocitos T CD8 es normalmente más alto que en los linfocitos T CD4. Todas las versiones se unen con una afinidad bastante similar al 4-1BB humano.
La figura 8 muestra la unión de diferentes construcciones (kih) de Fc ligando de 4-1BB humano trimérico dividido dirigido o no dirigido a FAP con linfocitos T CD4+ o CD8+ de PBMC frescos (figura 8A) o con 4-1BB humano que expresa PHA-L y proleucina preactivada y PBMC humanas reactivadas anti-CD3 humana/anti-CD28 humana (figura 8B). La unión se detectó con el fragmento F(ab')2 de IgG caprino específico de F cde anti -IgG humana conjugado con R-ficoeritrina-fluorocromo. Se muestra la mediana de la intensidad de fluorescencia (MFI) frente a la concentración de las construcciones sometidas a prueba 2.1, 2.3, 2.4, 2.5 y 2.6 del ejemplo 2 y las moléculas de control Control B, Control C, Control E y Control F. Para una mejor visualización de las curvas de unión se dividen en dos transferencias diferentes con la construcción 2.1 ((kih) de Fc ligando de 4-1BB humano trimérico dividido dirigido a FAP monovalente) y control B ((kih) de Fc ligando de 4-1BB humano trimérico dividido no dirigido monovalente con cruce de CH-CL y residuos cargados) como curvas de comparación. La unión se supervisó en linfocitos T CD45+ CD3+ CD8+ (transferencias en la parte inferior) y linfocitos T CD45+ CD3+ CD4+ (transferencias en la parte superior). El nivel de expresión de 4-1BB en los linfocitos T CD8 es normalmente más alto que en los linfocitos T CD4. Todas las construcciones se unen con una afinidad bastante similar al 4-1BB humano, mientras que la construcción bivalente 2.3 y su control C no dirigido muestran una MFI más baja. Esto se puede deber al impedimento estérico de la unión de 4-1BB y/o menos detección debido al segundo anticuerpo de detección inducido por el ligando 4-1BB dividido conjugado con Fc.
En la figura 9 , se muestra la unión de moléculas de unión a antígeno de fusión (kih) de Fc que contienen un trímero de ligando 4-1 BB dirigido a FAP (trímero 4-1BBL dividido de FAP, círculos rellenos) o moléculas de unión a antígeno de fusión (kih) de Fc que contienen un trímero de ligando 4-1BB no dirigido a DP47 (trímero 4-1BBL dividido de DP47; círculos abiertos) con esplenocitos de ratón activados. En particular, la unión a linfocitos T CD4+ de ratón activados se muestra en la figura (9A) y a linfocitos T CD8+ de ratón activados en la figura (9B). Se usó un anticuerpo LALA P329G de IgG1 humano específico de anti-CD137 ratón (clon Lob12.3) como control positivo (triángulos). La unión se caracteriza por el trazado de la MFI del fragmento F(ab')2 de IgG caprino específico de Fc y de anti-IgG humana marcado con R-PE que se usa como anticuerpo de detección secundario frente a la concentración en nM de las construcciones del trímero 4-1BBL dividido sometido a prueba. La MFI se midió mediante citometría de flujo y el valor de referencia se corrigió restando la MFI del control en blanco.
La figura 10 muestra la unión de moléculas de unión a antígeno de fusión (kih) de Fc que contienen un trímero de ligando 4-1BB (círculos rellenos: molécula de unión a antígeno de fusión (kih) de Fc que contiene un trímero de ligando 4-1BB dirigido a FAP, construcción 1.1, círculos abiertos: molécula de unión a antígeno de fusión (kih) de Fc que contiene un trímero de ligando 4-1BB no dirigido a DP47, control A, a la línea celular MV-3 (A) y la línea celular WM-266-4 (B) de melanoma humano que expresan proteína de activación de fibroblastos (FAP). La unión se caracteriza por el trazado de la MFI del fragmento F(ab')2 de IgG caprino específico de Fc y de anti-IgG humana marcado con R-PE que se usa como anticuerpo de detección secundario frente a la concentración en nM de las construcciones del trímero 4-1BBL dividido sometido a prueba. La MFI se midió mediante citometría de flujo y el valor de referencia se corrigió restando la MFI del control en blanco.
En la figura 11, se muestra la unión de diferentes construcciones (kih) de Fc ligando de 4-1BB humano trimérico dividido dirigido o no dirigido a FAP a células MV-3 de melanoma humano que expresan FAP humana (figura 11A) y/o células de fibroblastos embrionarios de ratón transfectado del clon 39 de NIH/3T3-huFAP (figura 11B). La unión se detectó con fragmentos F(ab')2 de IgG caprinos específicos de Fe anti -IgG humana conjugados con R-ficoeritrina-fluorocromo o fluoresceína-fluorocromo. Se muestra la mediana de la intensidad de fluorescencia (MFI) frente a la concentración de construcciones sometidas a prueba. Para una mejor visualización, las curvas de unión se distribuyeron en cuatro (figura 11A) o dos transferencias (figura 11B), mientras que la construcción 1.1 ((kih) de Fc ligando de 4-1BB humano trimérico dividido dirigido a FAP monovalente) se usa como curva de comparación. Todas las construcciones se unen con una afinidad similar a la FAP humana, excepto las construcciones dirigidas a FAP bivalente (construcciones 1.5, 1.7 y 1.8). Mostraron una tendencia a tener valores de EC50 más bajos y una intensidad de fluorescencia media más baja. Esto se puede explicar con su direccionamiento bivalente (mayor avidez, menos moléculas se pueden unir al mismo tiempo debido a la ocupación de dos epítopos que dan como resultado una MFI más baja). Las diferencias estructurales también pueden explicar la diferencia entre la construcción 1.8 (direccionamiento bivalente completo) y las construcciones 1.5 y 1.7 (solo direccionamiento bivalente parcial).
En la figura 12, se muestra la unión de diferentes construcciones 2.1, 2.3, 2.4, 2.5 y 2.6 (kih) de Fc ligando de 4-1 BB humano trimérico dividido dirigido o no dirigido a FAP a FAP humana que expresa células MV-3 de melanoma humano (figura 12A) y células WM-266-4 (figura 12B). La unión se detectó con los fragmento F(ab')2 de IgG caprinos específicos de Fy de anti -IgG humana conjugados con R-ficoeritrina-fluorocromo. Se muestra la mediana de la intensidad de fluorescencia (MFI) frente a la concentración de construcciones sometidas a prueba. Para una mejor visualización, las curvas de unión se distribuyeron en dos transferencias, mientras que la construcción 2.1 ((kih) de Fc ligando de 4-1BB humano trimérico dividido dirigido a FAP monovalente) se usa como curva de comparación. Todas las construcciones se unen con una afinidad similar a la FAP humana, excepto la construcción 2.3 dirigida a FAP bivalente. Tiene una tendencia a mostrar valores de EC50 más bajos y una intensidad de fluorescencia media más baja. Esto se puede explicar con su direccionamiento bivalente, que da como resultado una mayor avidez pero menos ocupación o moléculas de FAP en la superficie celular, lo que da como resultado una MFI más baja.
La figura 13 muestra la unión de diferentes construcciones (kih) de Fc ligando de 4-1BB de ratón trimérico dividido dirigido o no dirigido a FAP a linfocitos T CD4+ o CD8+ de esplenocitos frescos (figura 13A) o a esplenocitos de ratón activados de anticuerpos agonistas monoclonales anti-CD3 de ratón/anti-CD28 de ratón que expresan 4-1BB de ratón (figura 13B). La unión se detectó con el fragmento F(ab'F)2 de IgG caprino específico de Fcy de anti-IgG de ratón conjugado con FITC-fluorocromo. Se muestra la mediana de la intensidad de fluorescencia (MFI) frente a la concentración de construcciones sometidas a prueba. La unión se controló en linfocitos T CD3+ CD8+ (transferencia izquierda) y linfocitos T CD3+ CD4+ (transferencia derecha). El nivel de expresión de 4-1BB en los linfocitos T CD8 es normalmente más alto que en los linfocitos T CD4. Todas las construcciones se unen con una afinidad bastante similar al 4-1BB de ratón.
En la figura 14 se demuestra la unión de diferentes construcciones (kih) de Fc ligando de 4-1BB de ratón trimérico dividido dirigido o no dirigido a FAP a células tumorales que expresan FAP humana. La unión se detectó con el fragmento F(ab'F)2 de IgG caprino específico de Fc de anti -IgG de ratón conjugado con FITC-fluorocromo. Se muestra la mediana de la intensidad de fluorescencia (MFI) frente a la concentración de construcciones sometidas a prueba. La unión se supervisó en células MV-3 (figura 14A) y células WM-266-4 (figura 14B). Las construcciones (kih) de Fc ligando de 4-1BB de ratón trimérico dividido dirigido a FAP M.1 y M.2 se unen con una afinidad bastante similar a FAP.
La figura 15 muestra un esquema que ilustra el principio general del ensayo de actividad de NFkB descrito en el ejemplo 6.1 usando una línea celular indicadora. Se muestra el ensayo de activación configurado con 4-1BB humano que expresa la línea celular indicadora HeLa. Una reticulación de 4-1 BB expresada en las células indicadoras induce la activación de NF kB y la expresi ón de luciferasa mediada por NF kB. Después de la lisis de las células, la luciferasa puede catalizar la oxidación de luciferina a oxiluciferina. Esta reacción química se correlaciona positivamente con la fuerza de la expresión de luciferasa mediada por NFKB y se puede medir por la fuerza de la emisión de luz (unidades de luz liberada). La proporción de células tumorales que expresan FAP con respecto a la línea celular indicadora HeLa-huCD137-NFkB-luc fue de 5 a 1.
En la figura 16 se muestra que la activación de la vía de señalización de NFkB por la molécula de unión a antígeno de fusión (kih) de Fc que contiene un trímero de ligando 4-1 BB dirigido a FAP (construcción 1.1) depende estrictamente de su unión a las células diana que expresan FAP. Se cocultivaron células HeLa indicadoras de NFkB que expresaban CD137 humano con las élulas tumorales indicadas que presentan diferentes niveles de expresión de FAP en la superficie celular. La actividad luciferasa se evaluó como se describe en el ejemplo 6.1 después de cultivar células en ausencia o presencia de moléculas que contienen 4-1BBL a las concentraciones indicadas durante 6 horas. Los círculos rellenos se refieren a la construcción 1.1. Los círculos abiertos se refieren a la molécula de unión a antígeno de fusión (kih) de Fc que contiene un trímero de ligando 4-1BB no dirigido a DP47 (control A). Se usó el clon 39 de FAP NIH/3T3-humana de la línea celular como células diana en el gráfico (A), el gráfico (B) muestra la activación con la línea celular MV3 como células diana y el gráfico (C) con la línea celular WM-266-4 como células diana. La actividad se caracteriza por la transferencia de las unidades de luz liberada (URL) medidas durante 0,5 s frente a la concentración en nM de las construcciones del trímero 4-1BBL dividido sometido a prueba. Las URL se emiten debido a la oxidación mediada por luciferasa de luciferina a oxiluciferina.
La figura 17 muestra la expresión y actividad de luciferasa inducida por activación de NF kB medida con el ensayo descrito en el ejemplo 6.1. Los recuentos de luz liberada por segundo (CPS) se miden para 0,5 s/pocillo y se trazan frente a la concentración usada de construcciones (kih) de Fc ligando de 4-1BB humano trimérico dividido dirigido o no dirigido a FAP. Se incubaron células indicadoras HeLa humanas que expresan 4-1BB durante 6 horas en ausencia (figura 17A) o presencia de reticulación de la línea celular de melanoma humano que expresa FAP humana MV-3 (figura 17b ) o WM-266-4 (figura 17C). Los CPS se midieron y se transfirieron frente a las concentraciones de diferentes construcciones (kih) de Fc ligando de 4-1BB humano trimérico dividido dirigido o no dirigido a FAP. La proporción celular es de una célula indicadora HeLa que expresa 4-1BB humano por cinco células tumorales. Para una mejor visualización, las curvas de activación se dividieron en cuatro transferencias de visualización diferentes con la construcción 1.1 ((kih) de Fc ligando de 4-1BB humano trimérico dividido dirigido a FAP monovalente) y control B ((kih) de Fc ligando de 4-1BB humano trimérico dividido no dirigido monovalente con cruce de CH-CL y residuos cargados) como curvas de comparación. La figura 17A muestra la activación sin reticular de células tumorales que expresan FAP, la figura 17B muestra la activación en presencia de células tumorales MV-3 que expresan FAP con reticulación y la figura 17C muestra la activación en presencia de reticulación de células tumorales WM-266-4 que expresan FAP.
La figura 18 muestra la expresión y actividad de luciferasa inducida por activación de NF kB como se mide para las construcciones del ejemplo 2. Las unidades de luz liberada (URL) se miden para 0,5 s/pocillo y se trazan frente a la concentración usada de construcciones (kih) de Fc ligando de 4-1BB humano trimérico dividido dirigido o no dirigido a FAP. Se incubaron células indicadoras HeLa humanas que expresan 4-1BB durante 6 horas en ausencia o presencia de reticulación de la línea celular de melanoma humano que expresa FAP humana MV-3 o WM-266-4. Las URL se midieron y transfirieron frente a las concentraciones de diferentes construcciones 2.1,2.3, 2.4, 2.5 y 2.6 (kih) de Fc ligando de 4-1BB humano trimérico dividido dirigido o no dirigido a FAP y los controles B, C, E y F. La proporción celular es de una célula indicadora HeLa que expresa 4-1BB por cinco células tumorales. Para una mejor visualización, las curvas de activación se dividieron en dos transferencias de visualización diferentes con la construcción 2.1 ((kih) de Fc ligando de 4-1BB humano trimérico dividido dirigido a FAP monovalente).
En la figura 19 se muestra el ensayo de activación establecido con la línea celular indicadora T293-HEK que expresa 4-1BB de macaco cangrejero. Una reticulación de 4-1BB de macaco cangrejero expresado en las células indicadoras induce la activación de NF kB y la expresi ón de luciferasa mediada por n F kB. Después de la lisis de las células, la luciferasa puede catalizar la oxidación de luciferina a oxiluciferina. Esta reacción química se correlaciona positivamente con la fuerza de la expresión de luciferasa mediada por NKB y se puede medir por la fuerza de emisión de luz (unidades de luz liberada).
La figura 20 muestra la expresión y actividad de luciferasa inducida por activación de NFKB. Las unidades de luz liberada (URL) se miden para 0,5 s/pocillo y se trazan frente a la concentración usada de construcciones (kih) de Fc ligando de 4-1BB humano trimérico dividido dirigido o no dirigido a FAP. Se incubaron células indicadoras T293-HEK que expresan 4-1BB de macaco cangrejero durante 6 horas en ausencia o presencia de reticulación de la línea celular de melanoma humano que expresa FAP humana MV-3 o WM-266-4. Las URL se midieron y se transfirieron frente a las concentraciones de diferentes construcciones (kih) de Fc ligando de 4-1 BB humano trimérico dividido dirigido o no dirigido a FAP. La proporción celular es de una célula indicadora T293-HEK que expresa 4-1BB por cinco células MV-3 o dos células WM-266-4. Para una mejor visualización, las curvas de activación se dividieron en dos transferencias diferentes con la construcción 2.1 como curva de comparación.
Figura 21: Este esquema ilustra el principio del ensayo de activación de linfocitos T descrito en el ejemplo 6.3. Se muestra el esquema de activación del ensayo configurado con linfocitos T CD8 específico de HLA-A2-NLV y la línea celular de melanoma humano HLA-A2+FAP+ pulsado con NLV MV-3 en presencia de diferentes concentraciones tituladas de construcciones (kih) de Fc ligando de 4-1BB humano trimérico dividido dirigido o no dirigido a FAP. Las células se incubaron durante 28 horas, las últimas 4 horas en presencia de Golgi-Stop que contiene monesina. La proporción de linfocitos T CD8 específicos de NLV con respecto a células tumorales MV-3 es de 1:8.
Las figuras 22A-E y 23A-E se refieren al ensayo de activación con linfocitos T CD8 específicos de HLA-A2-NLV y la línea celular MV-3 de melanoma humano HLA-A2+FAP+ pulsado por NLV en presencia de diferentes concentraciones tituladas de diferentes construcciones (kih) de Fc ligando de 4-1BB humano trimérico dividido dirigido o no dirigido a FAP como se prepara en el ejemplo 1. Para una mejor visualización, las curvas de expresión se dividieron en varias transferencias de visualización diferentes con construcción 1.1 ((kih) de Fc ligando de 4-1BB humano trimérico dividido dirigido a FAP monovalente) y control B ((kih) de Fc ligando de 4-1 BB humano trimérico dividido no dirigido monovalente) como curvas de comparación. Los resultados se obtuvieron en cuatro experimentos similares independientes y muestran que la secreción prolongada de IFNy y la expresión de CD137 de linfocitos T CD8+ específicos de NLV dependen estrictamente de la activación simultánea de los linfocitos T por medio del reconocimiento de los complejos NLV-HLA-A2 (señal 1) y la activación de 4-1BB mediante 4-1BBL dividido humano dirigido a FAP (señal 2). El efecto de la regulación por incremento de 4-1BB se muestra en los gráficos de la figura 22, mientras que el efecto de la expresión de INF y de los linfocitos T CD8+ se presenta en los gráficos de la figura 23. Siempre se muestra la frecuencia en porcentaje de células positivas en la población total de linfocitos T CD8+. Todas las variantes dirigidas a FAP indujeron una mejora de activación similar de los linfocitos T CD8 activados con péptido NLV que se muestran en la figura 22 como regulación por incremento de 4-1BB (bucle de retroalimentación positiva) y en la figura 23 como expresión de IFN y después de 24 horas de estimulación. Las diferencias de curvas se encuentran en el rango de desviación del error normal y no son significativas.
Las figuras 24 y 25 se refieren al ensayo de activación con linfocitos T CD8 específicos de HLA-A2-NLV y la línea celular MV-3 de melanoma humano HLA-A2+FAP+ pulsado por NLV en presencia de concentración titulada de diferentes construcciones (kih) de Fc ligando de 4-1Bb humano trimérico dividido dirigido o no dirigido a FAP del ejemplo 2. Para una mejor visualización, las curvas de expresión se dividieron en dos transferencias de visualización diferentes con la construcción 2.1 ((kih) de Fc ligando de 4-1BB humano trimérico dividido dirigido a FAP monovalente) y el control B como curvas de comparación. Todas las construcciones (kih) de Fc ligando de 4-1BB humano trimérico dividido dirigido a FAP muestran una mejora de activación similar de los linfocitos T CD8 específicos del péptido HLA-A2-NLV que se muestran en la figura 24 como regulación por incremento de 4-1BB (bucle de retroalimentación positiva) y en la figura 25 como expresión de IFNydespués de 24 horas de estimulación. Las diferencias de curvas se encuentran en el rango de desviación del error normal y no son significativas.
Figura 26: Este esquema ilustra el experimento descrito en el ejemplo 6.4.
La figura 27 muestra la inducción de la proliferación de linfocitos T CD8+. Se muestra la frecuencia de proliferación de linfocitos T CD8+ frente a la concentración de construcciones sometidas a prueba.
La figura 28A se refiere al experimento de PK de dosis única de la construcción 1.2 y el control B en ratones NOG sanos. Se muestra la disminución de la concentración de construcción a lo largo del tiempo. La figura 28B muestra los resultados del experimento de PK de dosis única de las construcciones 2.1,2.3, del control B y del control C en ratones NOG que portan tumores humanizados con células madre. La figura 28C se refiere al experimento de PK de dosis única que compara la construcción 2.1 y 2.3 en ratones NOG sanos.
La figura 29 muestra componentes para el ensamblaje de ligandos 4-1BB humanos triméricos divididos. La figura (29A) muestra el ligando dimérico que se fusiona en el extremo C con un dominio CL humano con mutaciones E123R y Q124K (residuos cargados) y la figura (29B) muestra el ligando 4-1BB monomérico fusionado con el dominio CH1 humano con mutaciones K147E y K213E (residuos cargados). Componentes para el ensamblaje de la molécula de unión a antígeno del ligando 4-1BB (71-254) humano trimérico dividido dirigido a CD19 bivalente (construcción 3.3). La figura (29C) muestra el ligando dimérico que se fusiona con el extremo C de la cadena de ojal Fc de IgG1 humana. La figura (29D) muestra el ligando monomérico que se fusiona con el extremo C de la cadena de botón Fc de IgG1 humana.
La figura 30 muestra las construcciones 3.1 a 3.6 de la invención de las moléculas de unión a antígeno que contienen un trímero 4-1BBL dirigido a CD19. La preparación y producción de estas construcciones se describe en el ejemplo 3. Los dominios VH y VL son los del anticuerpo anti-CD198B8-018, el punto negro grueso representa la modificación de botón en ojal. * simboliza modificaciones de aminoácidos en el dominio CH1 y CL (los llamados residuos cargados).
En la figura 31A se ilustra la estrategia de aleatorización para las regiones CDR del clon original 8B8. Se muestran los dominios variables del clon original 8B8 y las regiones CDR (encuadradas) de acuerdo con la numeración de Kabat. (X) representa las posiciones aleatorizadas. La figura 31B muestra la descripción esquemática de las estrategias de generación de colecciones. Se muestra la estrategia de clonación y amplificación por PCR usada para la generación de la colección basado en 8B8 con A) regiones CDR1 y CDR2 aleatorizadas en la cadena ligera y pesada o B) regiones CDR1 y CDR3 aleatorizadas en la región ligera y CDR3 en la cadena pesada. Se indican las enzimas respectivas usadas para la clonación en la fagemida.
La figura 32 muestra la alineación del clon 8B8 anti-CD19 original con los aglutinantes maduros por afinidad seleccionados. Se muestran las secuencias del clon 8B8 y todos los aglutinantes maduros por afinidad seleccionados. Se enmarcan las CDR de cadenas pesadas y ligeras.
La figura 33 se refiere al análisis por SPR del clon 8B8 original y sus variantes maduradas por afinidad. Se muestran los sensogramas del clon 8B8 y sus derivados madurados por afinidad que están desprovistos de los puntos calientes LCDR1 N27d y N28.
La figura 34 ilustra la configuración del ensayo que mide la unión simultánea de la división trimérica de 4-1BBL dirigida a CD19 con 4-1BB hu y CD19 hu (ejemplo 8.2).
Los gráficos de la figura 35 muestran la unión simultánea de las construcciones 3.1,3.3, 3.4, 3.5, 3.6 y 4.4 (analito 1) de las moléculas de unión a antígeno de fusión FC de 4-1BBL trimérico dirigido a CD19 con 4-1BB humano inmovilizado y CD19 humano (analito 2).
La figura 36 muestra la unión de diferentes construcciones (kih) de Fc ligando de 4-1BB humano trimérico dividido dirigido o no dirigido a CD19 con linfocitos T CD4 y CD8 que expresan 4-1BB de PHA-L y proleucina preactivada y PBMC humanas reactivadas anti-CD3 humana/anti-CD28 humana. La unión se detectó con un fragmento F(ab')2 de IgG caprino específico de Fc de anti -IgG humana conjugado con R-ficoeritrina-fluorocromo. Se muestra la mediana de la intensidad de fluorescencia (MFI) frente a la concentración de construcciones sometidas a prueba. Para una mejor visualización, las curvas de unión se dividen en tres transferencias diferentes con la construcción 3.4 y el control F (control de isotipo huIgG1 P329G LALA) como curvas de comparación. La unión se controló en linfocitos T CD45+ CD3+ CD8+ (figura 36A) y linfocitos T CD45+ CD3+ CD4+ (figura 36B). El nivel de expresión de 4-1BB en los linfocitos T CD8 es normalmente más alto que en los linfocitos T CD4. Todas las construcciones se unen con una afinidad bastante similar al 4-1BB humano.
La figura 37 muestra la unión de moléculas de unión a antígeno (kih) de Fc ligando de 4-1BB humano trimérico dividido dirigido o no dirigido a CD19 a líneas celulares de linfoma de linfocitos B que expresan CD19 humano: linfoma difuso de linfocitos B no Hodgkin grandes SU-DHL-8 (37A), leucemia linfoide aguda precursora de linfocitos B Nalm6 (37B), linfoma difuso de linfoblastos de células grandes Toledo (37C) y linfoma difuso de linfocitos B grandes OCI-Ly18 (37D). La unión se detectó con fragmentos F(ab')2 de IgG caprinos específicos d^ He anti-IgG humana conjugados con R-ficoeritrina-fluorocromo. Se muestra la mediana de la intensidad de fluorescencia (MFI) frente a la concentración de construcciones sometidas a prueba. Para una mejor visualización, las curvas de unión se dividen en tres transferencias diferentes con la construcción 3.4 y el control F (control de isotipo huIgG1 P329G LALA) como curvas de comparación. Todas las construcciones se unen con una afinidad bastante similar al CD19 humano.
La figura 38 se refiere a la expresión y actividad de luciferasa inducida por activación de NFkB de moléculas de unión a antígeno (kih) de Fc ligando de 4-1BB humano trimérico dividido dirigido o no dirigido a CD19. Las unidades de luz liberada (URL) se miden para 0,5 s/pocillo y se trazan frente a la concentración usada de construcciones 3.1 y 3.3 de (kih) de Fc ligando de 4-1BB trimérico dividido dirigido o no dirigido a CD19 y moléculas de control B y C. Se incubaron células indicadoras HeLa que expresan 4-1BB humano durante 7,5 horas en ausencia o presencia de células SU-DHL-8 o de Pfeiffer que expresan CD19 humano reticulante. Las URL se midieron y se transfirieron frente a las concentraciones de diferentes construcciones (kih) de Fc ligando de 4-1BB humano trimérico dividido dirigido o no dirigido a CD19. La proporción celular es de una célula indicadora HeLa que expresa 4-1BB por 2,5 o cinco células tumorales.
La figura 39 muestra la unión de diferentes variantes humanizadas de IgG T84.66 en células de adenocarcinoma gástrico humano que expresan CEA. En base a los datos, se seleccionó la variante humanizada 1 para incluirla en moléculas de unión a antígeno (kih) de Fc ligando de 4-1BB humano trimérico dirigido a CEA.
La figura 40 muestra las construcciones 5.1 a 5.6 de la invención de las moléculas de unión a antígeno que contienen un trímero 4-1BBL dirigido a CEA. La preparación y producción de estas construcciones se describe en el ejemplo 11. Los dominios VH y VL son los del anticuerpo anti-CEA T84.66-LCHA, el punto negro grueso representa la modificación de botón en ojal. * simboliza modificaciones de aminoácidos en el dominio CH1 y CL (los llamados residuos cargados).
La figura 41A muestra una descripción esquemática de NA3B3A2-avi His humano, el antígeno usado para evaluar la unión de moléculas de unión a antígeno (kih) de Fc 4-1BBL dividido trimérico dirigido a CEA. La figura 41B ilustra la configuración del ensayo que mide la unión simultánea del 4-1BBL dividido trimérico dirigido a CEA a 4-1BB hu y NA3B3A2 humano (ejemplo 12.1).
Los gráficos de la figura 42 muestran la unión simultánea de las construcciones 5.4, 5.6, 5.7 y 5.8 (analito 1) de las moléculas de unión a antígeno de fusión Fc de 4-1BBL trimérico dirigido a CEA al 4-1BB humano inmovilizado y NA3B3A2 humano (analito 2).
En la figura 43 se muestra la unión de diferentes construcciones (kih) de Fc ligando de 4-1BB humano trimérico dividido dirigido o no dirigido a CEA a linfocitos T CD4 y CD8 que expresan 4-1BB de PHA-L y proleucina preactivada y PBMC humanas reactivadas anti-CD3 humana/anti-CD28 humana. La unión se detectó con un fragmento F(ab')2 de IgG caprino específico de Fc y de anti-IgG humana conjugado con R-ficoeritrina-fluorocromo. Se muestra la mediana de la intensidad de fluorescencia (MFI) frente a la concentración de construcciones sometidas a prueba. Para una mejor visualización, las curvas de unión se dividen en dos transferencias diferentes con la construcción 5.4 y el control F (control de isotipo huIgG1 P329G LALA) como curvas de comparación. La unión se supervisó en linfocitos T CD45+ CD3+ CD8+ (transferencias en la parte inferior) y linfocitos T CD45+ CD3+ CD4+ (transferencias en la parte superior). El nivel de expresión de 4-1BB en los linfocitos T CD8 es normalmente más alto que en los linfocitos T CD4. Todas las construcciones se unen con una afinidad bastante similar al 4-1BB humano.
La figura 44 muestra la unión de construcciones (kih) de Fc ligando de 4-1 BB humano trimérico dividido dirigido o no dirigido a CEA a la línea celular gástrica humana MKN-45 (izquierda) que expresa CEA humano y la línea celular de adenocarcinoma colorrectal humano LS180 (derecha). La unión se detectó con fragmentos F(ab')2 de IgG caprinos específicos de Fc de anti -IgG humana conjugados con R-ficoeritrina-fluorocromo. Se muestra la mediana de la intensidad de fluorescencia (MFI) frente a la concentración de construcciones sometidas a prueba.
La figura 45 se refiere a la expresión y actividad de luciferasa inducida por activación de NEB de moléculas de unión a antígeno (kih) de Fc ligando de 4-1BB humano trimérico dividido dirigido o no dirigido a CEA. Las unidades de luz liberada (URL) se miden para 0,5 s/pocillo y se trazan frente a la concentración usada de construcciones 5.4, 5.6, 5.7 y 5.8 (kih) de Fc ligando de 4-1BB humano trimérico dividido dirigido o no dirigido a CEA y moléculas de control. Se incubaron células indicadoras HeLa humanas que expresan 4-1 BB humano durante 6 horas en ausencia o presencia de la línea celular cancerosa gástrica humana que expresa CEA humano reticulante MKN-45. La proporción celular es de una célula indicadora HeLa que expresa 4-1BB por tres células tumorales.
En las figuras 46A y 46B se muestran los componentes para el ensamblaje del ligando OX40 humano trimérico dividido dirigido a FAP monovalente (construcción 6.1). La figura 46A se refiere al ligando dimérico fusionado con el dominio IgG1-CL humano; la figura 46B se refiere al ligando monomérico fusionado con el dominio IgG1-CH1 humano. La figura 46C muestra la construcción 6.1 de la molécula de unión a antígeno que contiene un trímero OX40L dirigido a FAP. En la figura 46D se muestra la IgG1 PGLALA humana "no dirigida" a DP47 (control F).
La figura 47A muestra la unión de Ox40L humano trimérico dividido dirigido a FAP a células WM-266-4 positivas para FAP. Las células WM-266-4 expresan niveles elevados de proteína de activación de fibroblastos humanos (huFAP). Solo las construcciones (kih) de Fc ligando de OX40 dirigidas a FAP (cuadrado relleno) pero no el control 5 (rombo relleno) se enlazan a las células WM-266-4. Se muestra la unión como mediana de la intensidad de fluorescencia (MFI) del fragmento F(ab')2 de IgG caprino específico de Yrde anti -IgG humana marcado con isotiocianato de fluoresceína (FITC), el cual se usa como anticuerpo de detección secundaria. La MFI se midió mediante citometría de flujo. El eje x muestra la concentración de construcciones de anticuerpo.La figura 47B muestra la unión de la construcción (kih) de Fc ligando de OX4O dirigido a FAP a glóbulos rojos A549 NucLight negativas para OX40 humano de FAP humana. La construcción (kih) de Fc ligando de Ox40 dirigido a FAP no mostró unión a células tumorales A549 negativas para FAP negativas para Ox40. Se muestra la unión como mediana de la intensidad de fluorescencia (MFI) del fragmento F(ab')2 de IgG caprino específico de Fc y de ant-IgG humana marcado con FITC, el cual se usa como anticuerpo de detección secundaria. La MFI se midió mediante citometría de flujo y el valor de referencia se corrigió restando la MFI del control en blanco.
En la figura 48A se muestra la unión de FAP-Ox40L a linfocitos T CD4 humanos en reposo y activados. Ox40 no se expresa en linfocitos T CD4 humanos en reposo (lado izquierdo). En ausencia de células que expresan Ox40 humanas, no se observó unión (gráficos de la izquierda). Después de la activación de las PBMC humanas, Ox40 se regula por incremento en linfocitos T CD4+ (lado derecho). FAP-Ox40L se unió a linfocitos T CD4 activados Ox40+. Se muestra la unión como mediana de la intensidad de fluorescencia (MFI) del fragmento F(ab')2 de IgG caprino específico de Fc y de ant-IgG humana marcado con FITC, el cual se usa como anticuerpo de detección secundaria. La MFI se midió mediante citometría de flujo y el valor de referencia se corrigió restando la MFI del control en blanco. El eje x muestra la concentración de construcciones de anticuerpo. La figura 48B muestra que Ox40 no se expresa en linfocitos T CD8 humanos en reposo (lado izquierdo). En ausencia de células que expresan Ox40 humanas, no se observó unión (gráficos de la izquierda). Después de la activación de las PBMC humanas, Ox40 se regula por incremento en linfocitos T CD8+ (lado derecho). La expresión de Ox40 en linfocitos T CD8+ humanos es menor que en linfocitos T CD4+ y varía entre donantes y puntos temporales. La expresión de Ox40 fue baja en los linfocitos T CD8 representados. FAp-Ox40L se unió a linfocitos T CD8 activados Ox40+. Se muestra la unión como mediana de la intensidad de fluorescencia (MFI) del fragmento F(ab')2 de IgG caprino específico de Fc y de an-IigG humana marcado con FITC, el cual se usa como anticuerpo de detección secundaria. La MFI se midió mediante citometría de flujo y el valor de referencia se corrigió restando la MFI del control en blanco. El eje x muestra la concentración de construcciones de anticuerpo.
En la figura 49 se demuestra la activación de la vía de señalización de NFkB por la molécula de unión a antígeno OX40L humano trimérico dividido dirigido a FAP (FAP-OX40L) en células indicadoras HeLa_hOx40_NFkB_Lucl. Se muestra la activación con (gráfico de la derecha) o sin (gráfico de la izquierda) reticulación por el anticuerpo secundario. Las células indicadoras se cultivaron durante 5 horas en presencia de FAP-OX40L a las concentraciones indicadas con o sin reticulación del fragmento F(ab)2 de IgG caprino específico de/ Fc anti-huIgG1 policlonal secundario en una proporción de 1:2. La actividad de luciferasa se evaluó como se describe en el ejemplo 6.1. La actividad se caracteriza por la transferencia de las unidades de luz liberada (URL) medidas durante 0,5 s frente a la concentración en nM de la construcción sometida a prueba. Las URL se emiten debido a la oxidación mediada por luciferasa de luciferina a oxiluciferina.
La activación de NFkB por FAP -OX40L en células indicadoras HeLa_hOx40_NFkB_Lucl en presencia de células positivas para FAP se muestra en la figura 50A. Se muestra la activación de la vía de señalización de NF kB en las células indicadoras por FAP-OX40L en presencia de células FAP humanas NIH-3T3 que expresan baja FAP (proporción de 3 células tumorales FAP+ por 1 célula indicadora). La actividad de luciferasa mediada por NF kB se caracterizó por la transferencia de las unidades de luz liberada (URL), medidas durante 0,5 s, frente a la concentración en nM de compuestos sometidos a prueba. Las URL se emiten debido a la oxidación mediada por luciferasa de luciferina a oxiluciferina. Los valores se corrigen según el valor de referencia restando las URL del control en blanco. Para una mejor comparación, se cuantificó el área bajo la curva de las respectivas curvas de dosis-respuesta transferidas como marcador de la capacidad agonista de cada construcción. La comparación se ilustra en la figura 50B. El área se calculó usando prisma GraphPad. Los valores se corrigen según el valor de referencia restando el valor del control en blanco.
La figura 51 muestra la coestimulación mediada por OX40 de PBMC humanas en reposo desencadenadas por TCR de forma subóptima (ejemplo 15.5). La hiperreticulación de FAP-Ox40L por las células presentes del clon 39 de NIH/3T3-huFAP promovió fuertemente la supervivencia y la proliferación en los linfocitos T CD4 y CD8 humanos. Se muestra el recuento de acontecimientos de los linfocitos T CD4+ (izquierda) y CD8+ (derecha) vitales. Se restaron los valores de referencia de las muestras que contenían solo el anti-CD3 humano (clon V9, huIgG1), PBMC humanas en reposo y el clon 39 de NIH/3T3-huFAP. Por tanto, aquí se muestra el efecto potenciador de la coestimulación con OX40 pero no el efecto de la estimulación anti-CD3 subóptima per se. En las figuras de la parte inferior se muestra el rescate de la estimulación por TCR subóptima de PBMC humanas en reposo con la proliferación de FAP-Ox40L inmovilizada en la superficie celular.
Descripción detallada de la invención
Definiciones
A menos que se defina de otro modo, los términos técnicos y científicos usados en el presente documento tienen el mismo significado que se usa en general en la técnica a la que pertenece la presente invención. Para propósitos de interpretación de esta memoria descriptiva, se aplicarán las siguientes definiciones y, cuando corresponda, los términos usados en singular también incluirán el plural y viceversa.
Como se usa en el presente documento, el término "molécula de unión a antígeno" se refiere en su sentido más amplio a una molécula que se une específicamente a un determinante antigénico. Ejemplos de moléculas de unión a antígeno son anticuerpos, fragmentos de anticuerpos y proteínas de unión a antígeno supercóntigos.
Como se usa en el presente documento, el término "resto que se puede unir específicamente a un antígeno de célula diana" se refiere a una molécula polipeptídica que se une específicamente a un determinante antigénico. En un aspecto, el resto de unión a antígeno puede activar la señalización a través de su antígeno de célula diana. En un aspecto particular, el resto de unión a antígeno puede dirigir la entidad a la que se une (por ejemplo, el trímero de ligando de la familia de TNF) a un sitio diana, por ejemplo a un tipo específico de célula tumoral o estroma tumoral que porta el determinante antigénico. Los restos que se pueden unir específicamente a un antígeno de célula diana incluyen anticuerpos y fragmentos de los mismos como se define además en el presente documento. Además, los restos que se pueden unir específicamente a un antígeno de célula diana incluyen proteínas de unión a antígeno supercóntigo como se define además en el presente documento, por ejemplo, dominios de unión que se basan en proteínas repetidas diseñadas o dominios repetidos diseñados (véase, por ejemplo, el documento WO 2002/020565).
En relación con un anticuerpo o fragmento del mismo, el término "resto que se puede unir específicamente a un antígeno de célula diana" se refiere a la parte de la molécula que comprende el área que se une específicamente a y es complementaria de parte o todo un antígeno. Se puede proporcionar un resto que se puede unir a un antígeno específico, por ejemplo, mediante uno o más dominios variables de anticuerpo (también denominados regiones variables de anticuerpo). En particular, un resto que se puede unir a un antígeno específico comprende una región variable de la cadena ligera (VL) de anticuerpo y una región variable de la cadena pesada (VH) de anticuerpo.
El término "anticuerpo" en el presente documento se usa en el sentido más amplio y engloba diversas estructuras de anticuerpo, incluyendo pero sin limitarse a anticuerpos monoclonales, anticuerpos policlonales, anticuerpos monoespecíficos y multiespecíficos (por ejemplo, anticuerpos biespecíficos) y fragmentos de anticuerpo siempre que presenten la actividad de unión a antígeno deseada.
El término “anticuerpo monoclonal” como se usa en el presente documento se refiere a un anticuerpo obtenido a partir de una población de anticuerpos sustancialmente homogéneos, es decir, los anticuerpos individuales que comprenden la población son idénticos y/o se unen al mismo epítopo, excepto por posibles anticuerpos variantes, por ejemplo, que contienen mutaciones naturales o surgen durante la producción de una preparación de anticuerpos monoclonales, estando presentes, en general, dichas variantes en cantidades insignificantes. A diferencia de las preparaciones de anticuerpos policlonales, que típicamente incluyen diferentes anticuerpos dirigidos frente a diferentes determinantes (epítopos), cada anticuerpo monoclonal de una preparación de anticuerpos monoclonales se dirige frente a un único determinante en un antígeno.
El término anticuerpo "monoespecífico", como se usa en el presente documento, indica un anticuerpo que tiene uno o más sitios de unión, cada uno de los cuales se une al mismo epítopo del mismo antígeno. El término "biespecífica" quiere decir que la molécula de unión a antígeno se puede unir específicamente a al menos dos determinantes antigénicos distintos. Típicamente, una molécula de unión a antígeno biespecífica comprende dos sitios de unión a antígeno, de los que cada uno es específico para un determinante antigénico diferente. En determinados modos de realización, la molécula de unión a antígeno biespecífica se puede unir simultáneamente a dos determinantes antigénicos, en particular dos determinantes antigénicos expresados en dos células distintas.
El término "valente", como se usa en la presente solicitud, indica la presencia de un número específico de sitios de unión en una molécula de unión a antígeno. Como tales, los términos "bivalente", "tetravalente" y "hexavalente" indican la presencia de dos sitios de unión, cuatro sitios de unión y seis sitios de unión, respectivamente, en una molécula de unión a antígeno.
Los términos "anticuerpo de longitud completa", "anticuerpo inalterado" y "anticuerpo completo" se usan en el presente documento de manera intercambiable para referirse a un anticuerpo que tiene una estructura sustancialmente similar a una estructura de anticuerpo natural. “Anticuerpos naturales” se refieren a moléculas de inmunoglobulina natural con estructuras variables. Por ejemplo, los anticuerpos de clase IgG naturales son glucoproteínas heterotetraméricas de aproximadamente 150.000 daltons, compuestas de dos cadenas ligeras y dos cadenas pesadas que se unen mediante enlaces disulfuro. Desde el extremo N al C, cada cadena pesada tiene una región variable (VH), también llamada dominio pesado variable o dominio variable de la cadena pesada, seguida de tres dominios constantes (CH1, CH2 y CH3), también llamados región constante de la cadena pesada. De forma similar, desde el extremo N al C, cada cadena ligera tiene una región variable (VL), también llamada dominio variable ligero o dominio variable de la cadena ligera, seguida de un dominio constante de la cadena ligera (CL), también llamado región constante de la cadena ligera. La cadena pesada de un anticuerpo se puede asignar a uno de los cinco tipos, llamados a (IgA), 6 (IgD), £ (IgE), y (IgG) o p (IgM), algunos de los cuales se pueden dividir en subtipos, por ejemplo, y1 (IgG1), y2 (IgG2), y3 (IgG3), y4 (IgG4), a1 (IgA1) y a2 (IgA2). La cadena ligera de un anticuerpo se puede asignar a uno de dos tipos, llamados kappa (k) y lambda (A), en base a la secuencia de aminoácidos de su dominio constante.
Un "fragmento de anticuerpo" se refiere a una molécula distinta de un anticuerpo intacto que comprende una parte de un anticuerpo intacto que se une al antígeno al que se une el anticuerpo intacto. Los ejemplos de fragmentos de anticuerpo incluyen pero no se limitan a Fv, Fab, Fab', Fab'-SH, F(ab')2 ; diacuerpos, triacuerpos, tetracuerpos, fragmentos cross-Fab; anticuerpos lineales; moléculas de anticuerpo monocatenarias (por ejemplo, scFv), y anticuerpos de dominio único. Para una revisión de determinados fragmentos de anticuerpo, véase Hudson et al., Nat Med 9, 129-134 (2003). Para una revisión de los fragmentos scFv, véase, por ejemplo, Plückthun, en The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg and Moore eds., Springer-Verlag, New York, págs. 269-315 (1994); véanse también el documento WO 93/16185; y las patentes de EE. UU. n.° 5.571.894 y 5.587.458. Para un análisis de los fragmentos Fab y F(ab')2 que comprenden residuos de epítopos de unión al receptor de rescate y que tienen una semivida in vivo incrementada, véase la patente de EE. UU. n.° 5.869.046. Los diacuerpos son fragmentos de anticuerpo con dos sitios de unión a antígeno que pueden ser bivalentes o biespecíficos, véanse, por ejemplo, el documento EP 404.097; el documento WO 1993/01161; Hudson et al., Nat. Med. 9, 129-134 (2003); y Holliger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90, 6444-6448 (1993). También se describen triacuerpos y tetracuerpos en Hudson et al., Nat. Med. 9, 129-134 (2003). Los anticuerpos de dominio único son fragmentos de anticuerpo que comprenden todo o una parte del dominio variable de la cadena pesada o todo o una parte del dominio variable de la cadena ligera de un anticuerpo. En determinados modos de realización, un anticuerpo de dominio único es un anticuerpo de dominio único humano (Domantis, Inc., Waltham, MA; véase, por ejemplo, la patente de EE. UU. n.° 6.248.516 B1). Se pueden preparar fragmentos de anticuerpo por diversas técnicas, incluyendo, pero sin limitarse a, digestión proteolítica de un anticuerpo intacto, así como la producción por células huésped recombinantes (por ejemplo, E. coli o fago), como se describe en el presente documento.
La digestión con papaína de anticuerpos intactos produce dos fragmentos de unión a antígeno idénticos, llamados fragmentos "Fab" que contienen cada uno los dominios variables de la cadena pesada y ligera y también el dominio constante de la cadena ligera y el primer dominio constante (CH1) de la cadena pesada. Por tanto, como se usa en el presente documento, un "fragmento Fab" se refiere a un fragmento de anticuerpo que comprende un fragmento de cadena ligera que comprende un dominio VL y un dominio constante de una cadena ligera (CL), y un dominio VH y un primer dominio constante (CH1) de una cadena pesada. Los fragmentos Fab' difieren de los fragmentos Fab en la adición de unos pocos residuos en el extremo carboxílico del dominio CH1 de la cadena pesada, incluyendo una o más cisteínas de la región bisagra de anticuerpo. Fab'-SH son fragmentos Fab' en los que el/los residuo(s) de cisteína de los dominios constantes contienen un grupo tiol libre. El tratamiento con pepsina produce un fragmento F(ab')2 que tiene dos sitios de combinación de antígenos (dos fragmentos Fab) y una parte de la región Fc.
El término "fragmento cross-Fab" o "fragmento xFab" o "fragmento Fab de entrecruzamiento" se refiere a un fragmento Fab, en el que se intercambian las regiones variables o las regiones constantes de la cadena pesada y ligera. Son posibles dos composiciones de cadena diferentes de una molécula Fab de entrecruzamiento y están comprendidas en los anticuerpos biespecíficos de la invención: por una parte, se intercambian las regiones variables de la cadena pesada y ligera de Fab, es decir, la molécula Fab de entrecruzamiento comprende una cadena peptídica compuesta por la región variable de la cadena ligera (VL) y la región constante de la cadena pesada (CH1), y una cadena peptídica compuesta por la región variable de la cadena pesada (VH) y la región constante de la cadena ligera (CL). Esta molécula Fab de entrecruzamiento también se denomina CrossFab(VLVH). Por otra parte, cuando se intercambian las regiones constantes de la cadena pesada y ligera de Fab, la molécula Fab de entrecruzamiento comprende una cadena peptídica compuesta por la región variable de la cadena pesada (VH) y la región constante de la cadena ligera (CL), y una cadena peptídica compuesta por la región variable de la cadena ligera (VL) y la región constante de la cadena pesada (CH1). Esta molécula Fab de entrecruzamiento también se denomina CrossFab(CLCH1).
Un "fragmento Fab monocatenario" o "scFab" es un polipéptido que consiste en un dominio variable de la cadena pesada (VH) de anticuerpo, un dominio constante 1 (CH1) de anticuerpo, un dominio variable de la cadena ligera (VL) de anticuerpo, un dominio constante de la cadena ligera (CL) de anticuerpo y un conector, en el que dichos dominios de anticuerpo y dicho conector tienen uno de los siguientes órdenes en sentido N terminal a C terminal: a) VH-CH1-conector-VL-CL, b) VL-CL-conector-VH-CH1, c) VH-CL-conector-VL-CH1 o d) VL-CH1-conector-VH-CL; y en el que dicho conector es un polipéptido de al menos 30 aminoácidos, preferentemente entre 32 y 50 aminoácidos. Dichos fragmentos Fab monocatenarios se estabilizan por medio del enlace disulfuro natural entre el dominio CL y el dominio CH1. Además, se podrían estabilizar adicionalmente estas moléculas Fab monocatenarias mediante la generación de enlaces disulfuro intercatenarios por medio de la inserción de residuos de cisteína (por ejemplo, en la posición 44 de la cadena pesada variable y la posición 100 de la cadena ligera variable de acuerdo con la numeración de Kabat).
Un "fragmento Fab monocatenario de entrecruzamiento" o "x-scFab" es un polipéptido que consiste en un dominio variable de la cadena pesada (VH) de anticuerpo, un dominio constante 1 (CH1) de anticuerpo, un dominio variable de la cadena ligera (VL) de anticuerpo, un dominio constante de la cadena ligera (CL) de anticuerpo y un conector, en el que dichos dominios de anticuerpo y dicho conector tienen uno de los siguientes órdenes en sentido N terminal a C terminal: a) VH-CL-conector-VL-CH1 y b) VL-CH1-conector-VH-CL; en el que VH y VL forman juntos un sitio de unión a antígeno que se une específicamente a un antígeno y en el que dicho conector es un polipéptido de al menos 30 aminoácidos. Además, se podrían estabilizar adicionalmente estas moléculas x-scFab mediante la generación de enlaces disulfuro intercatenarios por medio de la inserción de residuos de cisteína (por ejemplo, en la posición 44 de la cadena pesada variable y la posición 100 de la cadena ligera variable de acuerdo con la numeración de Kabat).
Un "fragmento variable monocatenario (scFv)" es una proteína de fusión de las regiones variables de las cadenas pesada (Vh) y ligera (Vl) de un anticuerpo, conectada con un conector peptídico corto de diez a aproximadamente 25 aminoácidos. El conector es normalmente rico en glicina para aportar flexibilidad, así como en serina o treonina para aportar solubilidad, y puede conectar el extremo N de Vh con el extremo C de Vl, o viceversa. Esta proteína conserva la especificidad del anticuerpo original, a pesar de la eliminación de las regiones constantes y la introducción del conector. Los anticuerpos scFv se describen, por ejemplo, en Houston, J.S., Methods in Enzymol. 203 (1991) 46-96). Además, los fragmentos de anticuerpo comprenden polipéptidos monocatenarios que tienen las características de un dominio VH, a saber, que se pueden ensamblar junto con un dominio VL, o de un dominio VL, a saber, que se pueden ensamblar junto con un dominio VH a un sitio de unión a antígeno funcional y que proporcionan, de este modo, la propiedad de unión a antígeno de los anticuerpos de longitud completa.
Las "proteínas de unión a antígeno supercóntigo" son conocidas en la técnica, por ejemplo, la fibronectina y las proteínas de repetición de anquirina diseñadas (DARPin) se han usado como supercóntigos alternativos para los dominios de unión a antígeno, véase, por ejemplo, Gebauer y Skerra, Engineered protein scaffolds as next-generation antibody therapeutics. Curr Opin Chem Biol 13:245-255 (2009) y Stumpp et al., Darpins: A new generation of protein therapeutics. Drug Discovery Today 13:695-701 (2008). En un aspecto de la invención, una proteína de unión a antígeno supercóntigo se selecciona del grupo que consiste en CTLA-4 (Evibody), Lipocalinas (Anticalin), una molécula derivada de la proteína A tal como el dominio Z de la proteína A (Affibody), un dominio A (Avimer/Maxibody), una transferrina sérica (cuerpo trans); una proteína de repetición de anquirina diseñada (DARPin), un dominio variable de la cadena ligera o cadena pesada del anticuerpo (anticuerpo de dominio único, sdAb), un dominio variable de la cadena pesada del anticuerpo (nanocuerpo, aVH), fragmentos Vnar, una fibronectina (AdNectin), un dominio de lectina de tipo C (tetranectina); un dominio variable de un nuevo receptor de antígeno beta-lactamasa (fragmentos Vnar), una gamma-cristalina o ubiquitina (moléculas de Affilin) humanas; un dominio de tipo kunitz de inhibidores de la proteasa humana, microcuerpos tales como las proteínas de la familia knottin, aptámeros peptídicos y fibronectina (adnectina).
CTLA-4 (antígeno 4 asociado a linfocitos T citotóxicos) es un receptor de la familia CD28 expresado principalmente en linfocitos T CD4+. Su dominio extracelular tiene un pliegue de Ig similar a un dominio variable. Los bucles correspondientes a las CDR de los anticuerpos se pueden sustituir por secuencias heterólogas para conferir diferentes propiedades de unión. Las moléculas de CTLA-4 diseñadas para tener diferentes especificidades de unión también se conocen como evicuerpos (por ejemplo, el documento US7166697B1). Los evicuerpos tienen aproximadamente el mismo tamaño que la región variable aislada de un anticuerpo (por ejemplo, un dominio de anticuerpo). Para obtener más detalles, véase Journal of Immunological Methods 248 (1-2), 31-45 (2001).
Las lipocalinas son una familia de proteínas extracelulares que transportan pequeñas moléculas hidrófobas tales como esteroides, bilinas, retinoides y lípidos. Tienen una estructura secundaria rígida de lámina beta con una serie de bucles en el extremo abierto de la estructura cónica que se pueden genomanipular para unirse a diferentes antígenos diana. Las anticalinas tienen un tamaño que oscila entre 160 y 180 aminoácidos y se derivan de las lipocalinas. Para más detalles, véase Biochim Biophys Acta 1482:337-350 (2000), los documentos US7250297B1 y US20070224633.
Un affibody es un supercóntigo derivado de la proteína A de staphylococcus aureus que se puede genomanipular para unirse al antígeno. El dominio consiste en un paquete de tres hélices de aproximadamente 58 aminoácidos. Se han generado bancos mediante la aleatorización de residuos superficiales. Para obtener más detalles, véase Protein Eng. Des. Sel. 17, 455-462 (2004) y el documento EP 1641818A1.
Los avímeros son proteínas multidominio derivadas de la familia de supercóntigos de dominio A. Los dominios naturales de aproximadamente 35 aminoácidos adoptan una estructura definida con enlaces disulfuro. La diversidad se genera al mezclar la variación natural presentada por la familia de dominios A. Para obtener más detalles, véase Nature Biotechnology 23(12), 1556 - 1561 (2005) y Expert Opinion on Investigational Drugs 16(6), 909-917 (junio de 2007).
Una transferrina es una glicoproteína transportadora de suero monomérica. Las transferrinas se pueden genomanipular para unirse a diferentes antígenos diana mediante la inserción de secuencias peptídicas en un bucle superficial permisivo. Ejemplos de supercóntigos de transferrina diseñados incluyen el cuerpo trans. Para más detalles, véase J. Biol. Chem. 274, 24066-24073 (1999).
Las proteínas de repetición de anquirina diseñadas (DARPin) se derivan de la anquirina, que es una familia de proteínas que interviene en la unión de proteínas de membrana integrales al citoesqueleto. Una sola repetición de anquirina es un motivo de 33 residuos que consiste en dos hélices alfa y un giro beta. Se pueden genomanipular para que se unan a diferentes antígenos diana aleatorizando los residuos en la primera hélice alfa y un giro beta de cada repetición. Su interfaz de enlace se puede incrementar al incrementar el número de módulos (un procedimiento de maduración por afinidad). Para más detalles, véase J. Mol. Biol. 332, 489-503 (2003), PNAS100(4), 1700-1705 (2003) y J. Mol. Biol. 369, 1015-1028 (2007) y el documento US20040132028A1.
Un anticuerpo de dominio único es un fragmento de anticuerpo que consiste en un dominio de anticuerpo variable monomérico único. Los primeros dominios únicos se derivaron del dominio variable de la cadena pesada del anticuerpo de camélidos (nanocuerpos o fragmentos VHH). Además, el término anticuerpo de dominio único incluye un dominio variable de la cadena pesada humana autónomo (aVH) o fragmentos Vnar derivados de los tiburones.
La fibronectina es un supercóntigo que se puede genomanipular para unirse al antígeno. Las adnectinas consisten en una columna vertebral de la secuencia de aminoácidos natural del décimo dominio de las 15 unidades repetidas de fibronectina humana tipo III (FN3). Se pueden genomanipular tres bucles en un extremo del sándwich beta para permitir que una adnectina reconozca específicamente una diana terapéutica de interés. Para obtener más detalles, véase Protein Eng. Des. Sel. 18, 435-444 (2005), el documento US20080139791, el documento WO2005056764 y el documento US6818418B1.
Los aptámeros peptídicos son moléculas de reconocimiento combinatorio que consisten en una proteína de supercóntigo constante, típicamente tiorredoxina (TrxA) que contiene un bucle peptídico variable restringido insertado en el sitio activo. Para obtener más detalles, véase Expert Opin. Biol. Ther. 5, 783-797 (2005).
Los microcuerpos se derivan de microproteínas naturales de 25-50 aminoácidos de longitud que contienen 3-4 puentes de cisteína: los ejemplos de microproteínas incluyen KalataBI y conotoxinas y knottinas. Las microproteínas tienen un bucle que se puede genomanipular para incluir hasta 25 aminoácidos sin afectar el pliegue general de la microproteína. Para obtener más detalles sobre los dominios de knottina genomanipulados, véase el documento WO2008098796.
Una "molécula de unión a antígeno que se une al mismo epítopo" que una molécula de referencia se refiere a una molécula de unión a antígeno que bloquea la unión de la molécula de referencia a su antígeno en un ensayo de competencia en un 50 % o más y, a la inversa, la molécula de referencia bloquea la unión de la molécula de unión a antígeno a su antígeno en un ensayo de competencia en un 50 % o más.
El término "dominio de unión a antígeno" se refiere a la parte de una molécula de unión a antígeno que comprende el área que se une específicamente a y es complementaria a parte o la totalidad de un antígeno. Cuando un antígeno es grande, una molécula de unión a antígeno solo se puede unir a una parte particular del antígeno, denominándose dicha parte epítopo. Se puede proporcionar un dominio de unión a antígeno, por ejemplo, por uno o más dominios variables (también llamados regiones variables). Preferentemente, un dominio de unión a antígeno comprende una región variable de la cadena ligera de anticuerpo (VL) y una región variable de la cadena pesada de anticuerpo (VH).
Como se usa en el presente documento, el término "determinante antigénico" es sinónimo de "antígeno" y "epítopo" y se refiere a un sitio (por ejemplo, un tramo contiguo de aminoácidos o una configuración conformacional constituida por diferentes regiones de aminoácidos no contiguos) en una macromolécula polipeptídica a la que se une un resto de unión a antígeno, formando un complejo resto de unión a antígeno-antígeno. Los determinantes antigénicos útiles se pueden encontrar, por ejemplo, en las superficies de células tumorales, en las superficies de células infectadas por virus, en las superficies de otras células afectadas, en la superficie de células inmunitarias, libres en suero sanguíneo y/o en la matriz extracelular (ECM). Las proteínas útiles como antígenos en el presente documento pueden ser cualquier forma natural de las proteínas de cualquier fuente de vertebrado, incluyendo mamíferos tales como primates (por ejemplo, humanos) y roedores (por ejemplo, ratones y ratas), a menos que se indique de otro modo. En un modo de realización particular, el antígeno es una proteína humana. Cuando se hace referencia a una proteína específica en el presente documento, el término engloba la proteína no procesada "de longitud completa" así como cualquier forma de la proteína que resulte del procesamiento en la célula. El término también engloba variantes naturales de la proteína, por ejemplo, variantes de empalme o variantes alélicas.
Por "unión específica" se quiere decir que la unión es selectiva para el antígeno y se puede discriminar de las interacciones no deseadas o no específicas. La capacidad de una molécula de unión a antígeno para unirse a un antígeno específico se puede medir mediante un ensayo de inmunoadsorción enzimática (ELISA) o bien otras técnicas familiares para un experto en la técnica, por ejemplo, la técnica de resonancia de plasmón superficial (SPR) (analizada en un instrumento BIAcore) (Liljeblad et al., Glyco J17, 323-329 (2000)), y ensayos de unión tradicionales (Heeley, Endocr Res 28, 217-229 (2002)). En un modo de realización, el grado de unión de una molécula de unión a antígeno con una proteína no relacionada es inferior a aproximadamente un 10 % de la unión de la molécula de unión a antígeno medida, por ejemplo, mediante SPR. En determinados modos de realización, una molécula que se une al antígeno tiene una constante de disociación (Kd) de 1 pM, < 100 nM, < 10 nM, < 1 nM, < 0,1 nM < 0,01 nM o < 0,001 nM (por ejemplo, 10-8 M o menos, por ejemplo, de 10-8 M a 10-13 M, por ejemplo, de 10-9 M a 10-13 M).
"Afinidad" o "afinidad de unión" se refiere a la fuerza de la suma total de las interacciones no covalentes entre un sitio de unión único de una molécula (por ejemplo, un anticuerpo) y su compañero de unión (por ejemplo, un antígeno). A menos que se indique de otro modo, como se usa en el presente documento, “afinidad de unión” se refiere a la afinidad de unión intrínseca que refleja una interacción 1:1 entre los miembros de un par de unión (por ejemplo, anticuerpo y antígeno). La afinidad de una molécula X por su compañera Y se puede representar en general por la constante de disociación (Kd), que es la proporción de las constantes de velocidad de disociación y asociación (kdis y kas, respectivamente). Por tanto, las afinidades equivalentes pueden comprender diferentes constantes de velocidad, siempre que la proporción de las constantes de velocidad permanezca igual. Se puede medir la afinidad por procedimientos comunes conocidos en la técnica, incluyendo los descritos en el presente documento. Un procedimiento particular para medir la afinidad es la resonancia de plasmón superficial (RPS).
Un "antígeno de célula diana" como se usa en el presente documento se refiere a un determinante antigénico presentado en la superficie de una célula diana, por ejemplo una célula en un tumor tal como una célula cancerosa o una célula del estroma tumoral. En determinadas modos de realización, el antígeno de la célula diana es un antígeno en la superficie de una célula tumoral. En un modo de realización, el antígeno de célula diana se selecciona del grupo que consiste en proteína de activación de fibroblastos (FAP), antígeno carcinoembrionario (CEA), proteoglucano de sulfato de condroitina asociado a melanoma (MCSP), receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGFR), CD19, CD20 y CD33. En particular, el antígeno de la célula diana es la proteína de activación de fibroblastos (FAP).
El término "proteína de activación de fibroblastos (FAP)", también conocido como FAP prolil endopeptidasa o Seprasa (EC 3.4.21), se refiere a cualquier FAP natural de cualquier fuente de vertebrado, incluyendo mamíferos tales como primates (por ejemplo, humanos), primates no humanos (por ejemplo, macacos cangrejeros) y roedores (por ejemplo, ratones y ratas), a menos que se indique de otro modo. El término engloba la FAP no procesada "de longitud completa", así como cualquier forma de FAP que resulte del procesamiento en la célula. El término también engloba variantes naturales de FAP, por ejemplo, variantes de empalme o variantes alélicas. En un modo de realización, la molécula de unión a antígeno de la invención se puede unir específicamente a la FAP humana, de ratón y/o de macaco cangrejero. La secuencia de aminoácidos de FAP humana se muestra en UniProt (www.uniprot.org), n.° de acceso Q12884 (versión 149, SEQ ID NO: 20) o NCBI (www.ncbi.nlm.nih.gov/) RefSeq NP_004451.2. El dominio extracelular (ECD) de la FAP humana se extiende desde la posición del aminoácido 26 hasta la 760. Las secuencias de aminoácidos y nucleótidos de un ECD de FAP humana marcado con His se muestran en las SEQ ID NO: 15 y 16, respectivamente. La secuencia de aminoácidos de FAP de ratón se muestra en UniProt, n.° de acceso P97321 (versión 126, SEQ ID NO: 23) o NCBI RefSeq NP_032012.1. El dominio extracelular (ECD) de la FAP de ratón se extiende desde la posición del aminoácido 26 hasta la 761. Las SEQ ID NO: 24 y 25 muestran las secuencias de aminoácidos y nucleótidos, respectivamente, de un ECD de FAP de ratón marcado con His. Las SEQ ID NO: 26 y 27 muestran las secuencias de aminoácidos y nucleótidos, respectivamente, de un ECD de FAP de macaco cangrejero marcado con His. Preferentemente, una molécula de unión a anti-FAP de la invención se une al dominio extracelular de FAP. En la solicitud de patente internacional n.° WO 2012/020006 A2 se describen moléculas de unión a anti-FAP ejemplares.
El término "antígeno carcinoembrionario (CEA)", también conocido como molécula 5 de adhesión celular relacionada con el antígeno carcinoembrionario (CEACAM5), se refiere a cualquier CEA natural de cualquier fuente de vertebrado, incluyendo mamíferos tales como primates (por ejemplo, humanos), primates no humanos (por ejemplo, macacos cangrejeros) y roedores (por ejemplo, ratones y ratas), a menos que se indique de otro modo. La secuencia de aminoácidos del CEA humano se muestra en UniProt, n.° de acceso P06731 (versión 151, SEQ ID NO: 28). El CEA se ha identificado durante mucho tiempo como un antígeno asociado a tumores (Gold and Freedman, J Exp Med., 121:439-462, 1965; Berinstein N. L., J Clin Oncol., 20:2197-2207, 2002). Originalmente clasificado como una proteína expresada solo en tejido fetal, el CEA ahora se ha identificado en varios tejidos adultos normales. Estos tejidos son principalmente de origen epitelial, incluidas las células del tracto gastrointestinal, respiratorio y genitourinario, y las células del colon, cuello uterino, glándulas sudoríparas y próstata (Nap et al., Tumour Biol., 9(2-3): 145-53, 1988; Nap et al, Cancer Res., 52(8):2329-23339, 1992). Los tumores de origen epitelial, así como sus metástasis, contienen el CEA como un antígeno asociado a un tumor. Si bien la presencia de CEA por sí misma no indica la transformación a una célula cancerosa, la distribución del CEA es indicativa. En el tejido normal, el CEA se expresa en general en la superficie apical de la célula (Hammarstrom S., Semin Cancer Biol. 9 (2): 67-81 (1999)), lo que lo hace inaccesible para los anticuerpos en el torrente sanguíneo. A diferencia del tejido normal, el CEA tiende a expresarse en toda la superficie de las células cancerosas (Hammarstrom S., Semin Cancer Biol. 9(2):67-81 (1999)). Este cambio en el patrón de expresión hace que el CEA sea accesible para la unión de anticuerpos en células cancerosas. Además, la expresión de CEA aumenta en células cancerosas. Además, la expresión incrementada de CEA promueve un aumento de las adhesiones intercelulares, que pueden dar lugar a metástasis (Marshall J., Semin Oncol., 30(a Suppl. 8):30-6, 2003). La prevalencia de expresión de CEA en diversas entidades tumorales es en general muy alta. En concordancia con los datos publicados, análisis propios realizados en muestras de tejido confirmaron su alta prevalencia, con aproximadamente el 95 % en carcinoma colorrectal (CCR), 90 % en cáncer de páncreas, 80 % en cáncer gástrico, 60 % en carcinoma de pulmón no microcítico (CPNM, donde se coexpresa con HER3), y 40 % en cáncer de mama; se descubrió una baja expresión en el carcinoma de pulmón microcítico y en el glioblastoma.
El CEA se escinde fácilmente de la superficie de la célula y se disemina al torrente sanguíneo desde los tumores, directamente o a través del sistema linfático. Debido a esta propiedad, el nivel de CEA en suero se ha utilizado como un marcador clínico para el diagnóstico de cánceres y las pruebas de detección de la recurrencia de cánceres, en particular el cáncer colorrectal (Goldenberg D M., The International Journal of Biological Markers, 7:183-188, 1992; Chau I., et al., J Clin Oncol., 22:1420-1429, 2004; Flamini et al., Clin Cancer Res; 12(23):6985-6988, 2006).
El término "proteoglucano de sulfato de condroitina asociado a melanoma (MCSP)", también conocido como proteoglucano 4 de sulfato de condroitina (CSPG4), se refiere a cualquier MCSP natural de cualquier fuente de vertebrado, incluyendo mamíferos tales como primates (por ejemplo, humanos), primates no humanos (por ejemplo, macacos cangrejeros) y roedores (por ejemplo, ratones y ratas), a menos que se indique de otro modo. La secuencia de aminoácidos del MCSP humano se muestra en UniProt, n.° de acceso Q6UVK1 (versión 103, SEQ ID NO: 29). El término "receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGFR)", también denominado protooncogén c-ErbB-1 o receptor de tirosina-proteína quinasa erbB-1, se refiere a cualquier EGFR natural de cualquier fuente de vertebrados, incluyendo mamíferos tales como primates (por ejemplo, humanos) primates no humanos (por ejemplo, monos cangrejeros) y roedores (por ejemplo, ratones y ratas), a menos que se indique de otro modo. La secuencia de aminoácidos del EGFR humano se muestra en UniProt, n.° de acceso P00533 (versión 211, SEQ ID NO: 30).
El término "CD19" se refiere al antígeno de linfocitos B CD19, también conocido como antígeno de superficie de linfocitos B B4 o antígeno de superficie de linfocitos T Leu-12, e incluye cualquier CD19 natural de cualquier fuente de vertebrado, incluyendo mamíferos tales como primates (por ejemplo, humanos), primates no humanos (por ejemplo, macacos cangrejeros) y roedores (por ejemplo, ratones y ratas), a menos que se indique de otro modo. La secuencia de aminoácidos del CD19 humano se muestra en el n.° de acceso Uniprot P15391 (versión 160, SEQ ID NO: 31). El término engloba el CD19 humano no procesado de "longitud completa", así como cualquier forma de CD19 humano que resulte del procesamiento en la célula siempre que el anticuerpo como se informa en el presente documento se una al mismo. El CD19 es un receptor de superficie celular estructuralmente distinto, expresado en la superficie de los linfocitos B humanos, incluyendo, pero sin limitarse a, prelinfocitos B, linfocitos B en desarrollo temprano (es decir, linfocitos B inmaduros), linfocitos B maduros a través de la diferenciación terminal en células plasmáticas y linfocitos B malignos. El CD19 se expresa en la mayoría de las leucemias linfoblásticas agudas (LLA), linfomas no Hodgkin, leucemias linfocíticas crónicas (LLC) de linfocitos B, leucemias prolinfocíticas, tricoleucemias, leucemias linfocíticas agudas comunes y algunas leucemias linfoblásticas agudas de linfocitos nulos. La expresión de CD19 en células plasmáticas sugiere además que se puede expresar en tumores de linfocitos B diferenciados, tales como el mieloma múltiple. Por lo tanto, el antígeno CD19 es una diana para la inmunoterapia en el tratamiento del linfoma no Hodgkin, la leucemia linfocítica crónica y/o la leucemia linfoblástica aguda.
"CD20" se refiere al antígeno de linfocitos B CD20, también conocido como miembro 1 de la subfamilia A de 4 dominios que abarcan membrana (MS4A1), antígeno de superficie de linfocitos B B1 o antígeno de superficie de leucocitos Leu-16, e incluye cualquier CD20 natural de cualquier fuente de vertebrado, incluyendo mamíferos tales como primates (por ejemplo, humanos), primates no humanos (por ejemplo, macacos cangrejeros) y roedores (por ejemplo, ratones y ratas), a menos que se indique de otro modo. La secuencia de aminoácidos del CD20 humano se muestra en el n.° de acceso Uniprot P11836 (versión 149, SEQ ID NO: 32). "CD33" se refiere al antígeno de superficie celular mieloide CD33, también conocido como SIGLEC3 o gp67, e incluye cualquier CD33 natural de cualquier fuente de vertebrados, incluyendo mamíferos tales como primates (por ejemplo, humanos), primates no humanos (por ejemplo, monos cangrejeros) y roedores (por ejemplo, ratones y ratas), a menos que se indique de otro modo. La secuencia de aminoácidos del CD33 humano se muestra en el n.° de acceso Uniprot P20138 (versión 157, SEQ ID NO: 33).
El término "región variable" o "dominio variable" se refiere al dominio de una cadena pesada o ligera de anticuerpo que está implicado en la unión de la molécula de unión a antígeno al antígeno. Los dominios variables de la cadena pesada y de la cadena ligera (VH y VL, respectivamente) de un anticuerpo natural tienen, en general, estructuras similares, comprendiendo cada dominio cuatro regiones estructurales (FR) conservadas y tres regiones hipervariables (HVR). Véase, por ejemplo, Kindt et al. Kuby Immunology, 6.a ed., W.H. Freeman and Co., página 91 (2007). Un dominio VH o VL único puede ser suficiente para conferir especificidad de unión a antígeno.
El término "región hipervariable" o "HVR", como se usa en el presente documento, se refiere a cada una de las regiones de un dominio variable de anticuerpo que son de secuencia hipervariable y/o forman bucles definidos estructuralmente ("bucles hipervariables"). En general, los anticuerpos tetracatenarios naturales comprenden seis HVR; tres en el Vh (H1, H2, H3) y tres en el VL (L1, L2, L3). Las HVR comprenden en general residuos de aminoácido de los bucles hipervariables y/o de las "regiones determinantes de la complementariedad" (CDR), siendo las últimas las de variabilidad de secuencia más alta y/o estando implicadas en el reconocimiento antigénico. Los bucles hipervariables ejemplares se producen en los residuos de aminoácido 26-32 (L1), 50-52 (L2), 91-96 (L3), 26-32 (H1), 53-55 (H2) y 96-101 (H3). (Chothia y Lesk, J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987)). Las CDR ejemplares (c Dr-L1, CDR-L2, Cd R-l3, CDR-H1, CDR-H2 y CDR-H3) se producen en los residuos de aminoácido 24-34 de L1, 50-56 de L2, 89-97 de L3, 31-35B de H1, 50-65 de H2 y 95-102 de H3. (Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5.a ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991)). Las regiones hipervariables (HVR) también se denominan regiones determinantes de la complementariedad (CDR), y estos términos se usan en el presente documento de manera intercambiable en referencia a porciones de la región variable que forman las regiones de unión a antígeno. Kabat et al., U.S. Dept. of Health and Human Services, "Sequences of Proteins of Immunological Interest" (1983) y Chothia et al., J. Mol. Biol.
196:901-917 (1987) han descrito esta región particular, donde las definiciones incluyen residuos de aminoácido superpuestos o subconjuntos de los mismos cuando se comparan entre sí. No obstante, se pretende que la aplicación de cualquier definición para referirse a una CDR de un anticuerpo o variantes del mismo esté dentro del alcance del término como se define y se usa en el presente documento. Los residuos de aminoácido apropiados que engloban las CDR, como se define en cada una de las referencias citadas anteriormente, se exponen a continuación en la tabla A como comparación. Los números de residuos exactos que engloba una CDR particular variarán dependiendo de la secuencia y tamaño de la CDR. Los expertos en la técnica pueden determinar de forma rutinaria qué residuos comprenden una CDR particular dada la secuencia de aminoácidos de la región variable del anticuerpo.
TABLA A. Definiciones de CDR 1
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1 La numeración de todas las definiciones de CDR en la tabla A está de acuerdo con las convenciones de numeración expuestas por Kabat et al. (véase a continuación).
2 "AbM" con una "b" minúscula como se usa en la tabla A se refiere a las CDR definidas por el programa informático de modelado de anticuerpos "AbM" de Oxford Molecular.
Kabat et al. también definieron un sistema de numeración para las secuencias de la región variable que es aplicable a cualquier anticuerpo. Un experto en la técnica puede asignar inequívocamente este sistema de "numeración de Kabat" a cualquier secuencia de la región variable, sin depender de ningún dato experimental más allá de la propia secuencia. Como se usa en el presente documento, "numeración de Kabat" se refiere al sistema de numeración expuesto por Kabat et al., U.S. Dept. of Health and Human Services, "Sequence of Proteins of Immunological Interest" (1983). A menos que se especifique de otro modo, las referencias a la numeración de posiciones de residuos aminoacídicos específicas en una región variable de anticuerpo son de acuerdo con el sistema de numeración de Kabat.
Con la excepción de CDR1 en VH, las CDR comprenden en general los residuos aminoacídicos que forman los bucles hipervariables. Las CDR también comprenden "residuos determinantes de la especificidad" o "SDR", que son los residuos que entran en contacto con el antígeno. Los SDR están contenidos dentro de regiones de las CDR llamadas CDR abreviadas o a-CDR. Las a-CDR ejemplares (a-CDR-L1, a-CDR-L2, a-CDR-L3, a-CDR-H1, a-CDR-H2 y a-CDR-H3) se producen en los residuos de aminoácido 31-34 de L1 ,50-55 de L2, 89-96 de L3, 31-35B de H1, 50-58 de H2 y 95-102 de H3. (Véase Almagro y Fransson, Front. Biosci. 13:1619-1633 (2008).) A menos que se indique de otro modo, los residuos de HVR y otros residuos del dominio variable (por ejemplo, los residuos de FR) se numeran en el presente documento de acuerdo con Kabat et al., supra.
Como se usa en el presente documento, el término "afinidad madurada" en el contexto de moléculas de unión a antígeno (por ejemplo, anticuerpos) se refiere a una molécula de unión a antígeno que se deriva de una molécula de unión a antígeno de referencia, por ejemplo, por mutación, se une al mismo antígeno, preferentemente se une al mismo epítopo, que el anticuerpo de referencia; y tiene una mayor afinidad por el antígeno que la de la molécula de unión a antígeno de referencia. La maduración de la afinidad en general implica la modificación de uno o más residuos de aminoácidos en una o más CDR de la molécula de unión a antígeno. Típicamente, la molécula de unión a antígeno con afinidad madurada se une al mismo epítopo que la molécula de unión a antígeno de referencia inicial.
"Región estructural" o "FR" se refiere a los residuos del dominio variable distintos de los residuos de la región hipervariable (HVR). La FR de un dominio variable consiste en general en cuatro dominios de FR: FR1, FR2, FR3 y FR4. En consecuencia, las secuencias de HVR y FR aparecen, en general, en la siguiente secuencia en VH (o VL): FR1-H1(L1)-FR2-H2(L2)-FR3-H3(L3)-FR4.
Una "región estructural humana aceptadora" para los propósitos en el presente documento es una región estructural que comprende la secuencia de aminoácidos de una región estructural del dominio variable de la cadena ligera (VL) o una región estructural del dominio variable de la cadena pesada (VH) derivada de una región estructural de inmunoglobulina humana o una región estructural consenso humana, como se define a continuación. Una región estructural humana aceptadora "derivada de" una región estructural de inmunoglobulina humana o una región estructural consenso humana puede comprender la misma secuencia de aminoácidos de la misma, o puede contener cambios en la secuencia de aminoácidos. En algunos modos de realización, el número de cambios de aminoácidos es de 10 o menos, 9 o menos, 8 o menos, 7 o menos, 6 o menos, 5 o menos, 4 o menos, 3 o menos, o 2 o menos. En algunos modos de realización, la región estructural humana aceptadora de VL tiene una secuencia idéntica a la secuencia de la región estructural de inmunoglobulina humana de VL o la secuencia de la región estructural consenso humana.
El término anticuerpo "quimérico" se refiere a un anticuerpo en el que una parte de la cadena pesada y/o ligera se deriva de una fuente o especie particular, mientras que el resto de la cadena pesada y/o ligera se deriva de una fuente o especie diferente.
La "clase" de un anticuerpo se refiere al tipo de dominio constante o región constante que posee su cadena pesada. Existen cinco clases principales de anticuerpos: IgA, IgD, IgE, IgG e IgM, y varias de estas se pueden dividir adicionalmente en subclases (isotipos), por ejemplo, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 e IgA2. Los dominios constantes de la cadena pesada que se corresponden con las diferentes clases de inmunoglobulinas se llaman a, ó, £, y y M, respectivamente.
Un anticuerpo "humanizado" se refiere a un anticuerpo quimérico que comprende residuos de aminoácido de HVR no humanas y residuos de aminoácido de FR humanas. En determinados modos de realización, un anticuerpo humanizado comprenderá sustancialmente todos de al menos uno, y típicamente dos, dominios variables, en los que todas o sustancialmente todas las HVR (por ejemplo, CDR) corresponden a las de un anticuerpo no humano, y todas o sustancialmente todas las FR corresponden a las de un anticuerpo humano. Un anticuerpo humanizado opcionalmente puede comprender al menos una parte de una región constante de anticuerpo derivada de un anticuerpo humano. Una "forma humanizada" de un anticuerpo, por ejemplo, un anticuerpo no humano, se refiere a un anticuerpo que se ha sometido a humanización. Otras formas de "anticuerpos humanizados" englobadas por la presente invención son aquellas en las que la región constante se ha modificado o cambiado adicionalmente con respecto a la del anticuerpo original para generar las propiedades de acuerdo con la invención, especialmente con respecto a la unión a C1q y/o la unión al receptor de Fc (FcR).
Un anticuerpo "humano" es uno que posee una secuencia de aminoácidos que se corresponde con la de un anticuerpo producido por un humano o una célula humana o derivado de una fuente no humana que utiliza repertorios de anticuerpos humanos u otras secuencias que codifican anticuerpos humanos. Esta definición de un anticuerpo humano excluye específicamente un anticuerpo humanizado que comprende residuos de unión a antígeno no humanos.
El término "dominio Fc" o "región Fc" en el presente documento se usa para definir una región C terminal de una cadena pesada de anticuerpo que contiene al menos una parte de la región constante. El término incluye regiones Fc de secuencia natural y regiones Fc variantes. Una región Fc de IgG comprende un dominio CH2 de IgG y un dominio CH3 de IgG. El "dominio CH2" de una región Fc de IgG humana normalmente se extiende de un residuo aminoacídico aproximadamente en la posición 231 a un residuo aminoacídico aproximadamente en la posición 340. En un modo de realización, una cadena de carbohidratos se une al dominio CH2. El dominio c H2 en el presente documento puede ser un dominio CH2 de secuencia natural o un dominio CH2 variante. El "dominio CH3" comprende el tramo de residuos C terminales a un dominio CH2 en una región Fc (es decir, de un residuo aminoacídico aproximadamente en la posición 341 a un residuo aminoacídico aproximadamente en la posición 447 de una IgG). La región CH3 en el presente documento puede ser un dominio CH3 de secuencia natural o un dominio CH3 variante (por ejemplo, un dominio CH3 con una "protuberancia" ("botón") introducida en una cadena del mismo y una "cavidad" ("ojal") introducida correspondiente en la otra cadena del mismo; véase la patente de EE. UU. n.° 5.821.333, incorporada expresamente en el presente documento por referencia). Se pueden usar dichos dominios CH3 variantes para promover la heterodimerización de dos cadenas pesadas de anticuerpo no idénticas como se describe en el presente documento. En un modo de realización, una región Fc de la cadena pesada de IgG humana se extiende desde Cys226, o desde Pro230, hasta el extremo carboxílico de la cadena pesada. Sin embargo, la lisina C terminal (Lys447) de la región Fc puede estar presente o no. A menos que se especifique de otro modo en el presente documento, la numeración de residuos aminoacídicos en la región Fc o región constante es de acuerdo con el sistema de numeración EU, también llamado índice EU, como se describe en Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5.a ed. Public Health Service, National Institutes de Health, Bethesda, MD, 1991.
La tecnología de "botón en ojal" se describe, por ejemplo, en los documentos US5.731.168; US7.695.936; Ridgway et al., Prot Eng 9, 617-621 (1996) y Carter, J Immunol Meth 248, 7-15 (2001). En general, el procedimiento implica introducir una protuberancia ("botón") en la interfase de un primer polipéptido y una correspondiente cavidad ("ojal") en la interfase de un segundo polipéptido, de modo que la protuberancia se puede situar en la cavidad para promover la formación de heterodímeros y dificultar la formación de homodímeros. Las protuberancias se construyen reemplazando cadenas laterales de aminoácidos pequeñas de la interfase del primer polipéptido por cadenas laterales más grandes (por ejemplo, tirosina o triptófano). Se crean cavidades compensadoras de tamaño idéntico o similar a las protuberancias en la interfase del segundo polipéptido reemplazando cadenas laterales de aminoácido grandes por otras más pequeñas (por ejemplo, alanina o treonina). La protuberancia y la cavidad se pueden realizar alterando el ácido nucleico que codifica los polipéptidos, por ejemplo, por mutagénesis específica de sitio o por síntesis peptídica. En un modo de realización específico, una modificación de botón comprende la sustitución aminoacídica T366W en una de las dos subunidades del dominio Fc, y la modificación de ojal comprende las sustituciones de aminoácidos T366S, L368A e Y407V en la otra de las dos subunidades del dominio Fc. En otro modo de realización específico, la subunidad del dominio Fc que comprende la modificación de botón comprende adicionalmente la sustitución aminoacídica S354C, y la subunidad del dominio Fc que comprende la modificación de ojal comprende adicionalmente la sustitución aminoacídica Y349C. La introducción de estos dos residuos de cisteína da como resultado la formación de un puente disulfuro entre las dos subunidades del dominio Fc, estabilizando por tanto adicionalmente el dímero (Carter, J Immunol Methods 248, 7-15 (2001)). La numeración es de acuerdo con el índice EU de Kabat et al., Sequences of proteins of immunological interest, 5.a ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD, 1991.
Una "región equivalente a la región Fc de una inmunoglobulina" pretende incluir variantes alélicas naturales de la región Fc de una inmunoglobulina, así como variantes que tienen alteraciones que producen sustituciones, adiciones o deleciones pero que no disminuyen sustancialmente la capacidad de la inmunoglobulina para mediar funciones efectoras (tales como la citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos). Por ejemplo, se pueden eliminar uno o más aminoácidos del extremo N o del extremo C de la región Fc de una inmunoglobulina sin pérdida sustancial de la función biológica. Dichas variantes se pueden seleccionar de acuerdo con las reglas generales conocidas en la técnica para que tenga un efecto mínimo sobre la actividad (véase, por ejemplo, Bowie, J. U. et al., Science 247:1306-10 (1990)).
El término "funciones efectoras" se refiere a las actividades biológicas atribuibles a la región Fc de un anticuerpo, que varían con el isotipo del anticuerpo. Los ejemplos de funciones efectoras de anticuerpo incluyen: unión a C1q y citotoxicidad dependiente del complemento (CDC), unión a receptor de Fc, citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (ADCC), fagocitosis celular dependiente de anticuerpos (ADCP), secreción de citocinas, captación de antígenos mediada por complejo inmunitario por células presentadoras de antígenos, regulación por disminución de receptores de superficie celular (por ejemplo, receptor de linfocitos B) y activación de linfocitos B.
Un "receptor Fc activador" es un receptor de Fc que después del acoplamiento por una región Fc de un anticuerpo provoca acontecimientos de señalización que estimulan a la célula que porta el receptor para realizar funciones efectoras. Los receptores Fc activadores incluyen FcYRIIIa (CD16a), FcyRI (CD64), FcYRIIa (CD32) y FcaRI (CD89). Un receptor Fc activador particular es FcYRIIIa humano (éase el n.° de acceso UniProt P08637, versión 141).
El término "miembro de la familia de ligandos de TNF" o "ligando de la familia de TNF" se refiere a una citocina proinflamatoria. Las citocinas en general, y en particular los miembros de la familia de ligandos de TNF, juegan un papel crucial en la estimulación y coordinación del sistema inmunitario. En la actualidad, se han identificado diecinueve citocinas como miembros de la superfamilia de ligandos de TNF (factor de necrosis tumoral) sobre la base de similitudes de secuencia, funcionales y estructurales. Todos estos ligandos son proteínas transmembrana de tipo II con un dominio extracelular C terminal (ectodominio), un dominio intracelular N terminal y un dominio transmembrana único. El dominio extracelular C terminal, conocido como dominio de homología de TNF (THD), tiene una identidad de aminoácidos del 20-30 % entre miembros de la superfamilia y es responsable de la unión al receptor. El ectodominio de TNF también es responsable de que los ligandos de TNF formen complejos triméricos que son reconocidos por sus receptores específicos.
Los miembros de la familia de ligandos de TNF se seleccionan del grupo que consiste en linfotoxina a (tamém conocida como LTA o TNFSF1), TNF (también conocido como TNFSF2), LTp(también conocido como TNFSF3), OX40L (también conocido como TNFSF4), CD40L (también conocido como CD154 o TNFSF5), FasL (también conocido como CD95L, CD178 o TNFSF6), CD27L (también conocido como CD70 o TNFSF7), CD30L (también conocido como CD153 o TNFSF8), 4-1BBL (también conocido como TNFSF9), TRAIL (también conocido como APO2L, CD253 o TNFSF10), RANKL (también conocido como CD254 o TNFSF11), TWEAK (también conocido como TNFSF12), APRIL (también conocido como CD256 o TNFSF13), BAFF (también conocido como CD257 o TNFSF13B), LiGhT (también conocido como CD258 o TNFSF14), TL1A (también conocido como VEGI o TNFSF15), GITRL (también conocido como TNFSF18), EDA-A1 (también conocido como ectodisplasina A1) y EDA-A2 (también conocido como ectodisplasina A2). El término se refiere a cualquier ligando de la familia de TNF de cualquier fuente de vertebrado, incluyendo mamíferos tales como primates (por ejemplo, humanos), primates no humanos (por ejemplo, macacos cangrejeros) y roedores (por ejemplo, ratones y ratas), a menos que se indique de otro modo. En modos de realización específicos de la invención, el miembro de la familia de ligandos de TNF se selecciona del grupo que consiste en OX40L, FasL, CD27L, TRAIL, 4-1BBL, CD40L y GITRL. En un modo de realización particular, el miembro de la familia de ligandos de TNF se selecciona de entre 4-1BBL y OX40L.
Se puede obtener más información, en particular secuencias, de los miembros de la familia de ligandos de TNF de bases de datos de acceso público tales como Uniprot (www.uniprot.org). Por ejemplo, los ligandos de TNF humanos tienen las siguientes secuencias de aminoácidos: linfotoxinaa humana (n° de acceso de UniProt P01374, SEQ ID NO: 34), TNF humano (n.° de acceso de UniProt P01375, SEQ ID NO: 35), linfotoxina p humana (n.° de acceso de UniProt Q06643, SEQ ID NO: 36), OX40L humano (n.° de acceso de UniProt P23510, SEQ ID NO: 37), CD40L humano (n.° de acceso de UniProt P29965, SEQ ID NO: 38), FasL humano (n.° de acceso de UniProt P48023, SEQ ID NO: 39), CD27L humano (n.° de acceso de UniProt P32970, SEQ ID NO: 40), CD30L humano (n.° de acceso de UniProt P32971, SEQ ID NO: 41), 4-1BBL (n.° de acceso de UniProt P41273, SEQ ID NO: 42), TRAIL (n.° de acceso de UniProt P50591, SEQ ID NO: 43), RANKL (n.° de acceso de UniProt O14788, SEQ ID NO: 44), TWEAK (n.° de acceso de UniProt O43508, SEQ ID NO: 45), ABRIL (n.° de acceso de UniProt O75888, SEQ ID NO: 46), BAFF (n.° de acceso de UniProt Q9Y275, SEQ ID NO: 47), LIGHT (n.° de acceso de UniProt O43557, SEQ ID NO: 48), TL1A (n.° de acceso de UniProt O95150, SEQ ID NO: 49), GITRL (n.° de acceso de UniProt Q9 UNG2, SEQ ID nO: 50) y ectodisplasina A (n.° de acceso de UniProt. Q92838, SEC ID NO: 51).
Un "ectodominio" es el dominio de una proteína de membrana que se extiende hacia el espacio extracelular (es decir, el espacio fuera de la célula diana). Los ectodominios son normalmente las partes de las proteínas que inician el contacto con las superficies, lo que da lugar a la transducción de señal. El ectodominio del miembro de la familia de ligandos de TNF, como se define en el presente documento, se refiere por tanto a la parte de la proteína del ligando de TNF que se extiende hacia el espacio extracelular (el dominio extracelular), pero también incluye partes más cortas o fragmentos de las mismas que son responsables de la trimerización y de la unión al correspondiente receptor de TNF. El término "ectodominio de un miembro de la familia de ligandos de TNF o un fragmento del mismo" se refiere por tanto al dominio extracelular del miembro de la familia de ligandos de TNF que forma el dominio extracelular o a partes del mismo que todavía se pueden unir al receptor (dominio de unión al receptor).
El término "miembro de la familia de ligandos de TNF coestimuladores" o "ligando de la familia de TNF coestimulador" se refiere a un subgrupo de miembros de la familia de ligandos de TNF, que son capaces de coestimular la proliferación y la producción de citocinas de linfocitos T. Los ligandos de la familia de TNF pueden coestimular las señales de TCR al interactuar con sus receptores de TNF correspondientes; y la interacción con sus receptores da lugar al reclutamiento de factores asociados a TNFR (TRAF), que inician cascadas de señalización que dan como resultado la activación de linfocitos T. Los ligandos de la familia de TNF coestimuladores se seleccionan del grupo que consiste en 4-1BBL, OX40L, GITRL, CD70, CD30L y LIGHT, más en particular, el miembro de la familia de ligandos de TNF coestimuladores se selecciona de entre 4-1BBL y OX40L.
Como se describe anteriormente en el presente documento, 4-1BBL es una proteína transmembrana de tipo II y un miembro de la familia de ligandos de TNF. Se ha descrito que el 4-1BBL de longitud completa o total que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 42 forma trímeros en la superficie de las células. La formación de trímeros está habilitada por motivos específicos del ectodominio de 4-1BBL. Dichos motivos se denominan en el presente documento "región de trimerización". Los aminoácidos 50-254 de la secuencia de 4-1BBL humano (SEQ ID NO: 52) forman el dominio extracelular de 4-1BBL, pero incluso fragmentos del mismo pueden formar los trímeros. En modos de realización específicos de la invención, el término "ectodominio de 4-1BBL o un fragmento del mismo" se refiere a un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada de SEQ ID NO: 4 (aminoácidos 52-254 de 4-1BBL humano), SEQ ID NO: 1 (aminoácidos 71-254 de 4-1BBL humano), SEQ ID NO: 3 (aminoácidos 80-254 de 4-1 BBL humano) y SEQ ID NO: 2 (aminoácidos 85-254 de 4-1 BBL humano) o polipéptidos que tienen una secuencia de aminoácidos seleccionada de SEQ ID NO: 96 (aminoácidos 71-248 de 4-1BBL humano), SEQ ID NO: 375 (aminoácidos 52-248 de 4-1BBL humano), SEQ ID No : 374 (aminoácidos 80-248 de 4-1BBL humano) y SEQ ID NO: 373 (aminoácidos 85-248 de 4-1BBL humano), pero también se incluyen en el presente documento otros fragmentos del ectodominio que se pueden trimerizar.
Como se describe anteriormente en el presente documento, OX40L es otra proteína transmembrana de tipo II y otro miembro de la familia de ligandos de TNF. El OX40L humano completo o de longitud completa tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 37. Los aminoácidos 51-183 de la secuencia de OX40L humano (SEQ ID NO: 53) forman el dominio extracelular de OX40L, pero incluso fragmentos del mismo pueden formar los trímeros. En modos de realización específicos de la invención, el término "ectodominio de OX40L o un fragmento del mismo" se refiere a un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada de SEQ ID NO: 53 (aminoácidos 51-183 de OX40L humano) o SEQ ID NO: 54 (aminoácidos 52-183 de OX40L humano), pero también se incluyen en el presente documento otros fragmentos del ectodominio que se pueden trimerizar.
El término "conector peptídico" se refiere a un péptido que comprende uno o más aminoácidos, típicamente aproximadamente de 2 a 20 aminoácidos. Los conectores peptídicos se conocen en la técnica o se describen en el presente documento. Los conectores peptídicos no inmunógenos adecuados son, por ejemplo, los conectores peptídicos (G4S)n, (SG4)n o G4(SG4)n en los que "n" es en general un número entre 1 y 10, típicamente entre 1 y 4, en particular 2; es decir, los péptidos seleccionados del grupo que consiste en GGGGS (SEQ ID NO: 128), GGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 13), SGGGGSGGGG (SEQ ID NO: 55) y GGGGS GGGGSGGGG(s e q ID NO: 56), pero también incluye las secuencias GSPGSSSSGS (SEQ ID NO: 57), GSGSGSGS (SEQ ID NO: 58), GSGSGNGS (SEQ ID NO: 59), GGSGSGSG (SEQ ID NO: 60), GGSGSG (SEQ ID NO: 61), GGSG (SEQ ID NO: 62), GGSGNGSG (SEQ ID NO: 63), GGNGSGSG (SEQ ID NO: 64) y GGNGSG (SEQ ID NO: 65). Los conectores peptídicos de particular interés son (G4S)i o GGGGS (SEQ ID NO: 128), (G4S)2 o GGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 13) y GSPGSSSSGS (SEQ ID NO: 57), más en particular (G4S)2 o GGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 13) y GSPGSSSSGS (SEQ ID NO: 57).
El término "aminoácido", como se usa en esta solicitud, indica el grupo de carboxi-a-aminoácidos naturales que comprenden alanina (código de tres letras: ala, código de una letra: A), arginina (arg, R), asparagina (asn, N), ácido aspártico (asp, D), cisteína (cys, C), glutamina (gln, Q), ácido glutámico (glu, E), glicina (gly, G), histidina (his, H), isoleucina (ile, I), leucina (leu, L), lisina (lys, K), metionina (met, M), fenilalanina (phe, F), prolina (pro, P), serina (ser, S), treonina (thr, T), triptófano (trp, W), tirosina (tyr, Y) y valina (val, V).
Una "proteína de fusión monocatenaria", como se usa en el presente documento, se refiere a un polipéptido monocatenario compuesto por uno o dos ectodominios de dicho miembro de la familia de ligandos de TNF fusionado con una parte del resto de unión a antígeno o parte Fc. La fusión se puede producir uniendo directamente el aminoácido N o C terminal del resto de unión a antígeno por medio de un conector peptídico al aminoácido C o N terminal del ectodominio de dicho miembro de la familia de ligandos de TNF.
Por "fusionados" o "conectados" se quiere decir que los componentes (por ejemplo, un polipéptido y un ectodominio de dicho miembro de la familia de ligandos de TNF) están unidos por enlaces peptídicos, ya sea directamente o por medio de uno o más conectores peptídicos.
El "porcentaje (%) de identidad de secuencia de aminoácidos" con respecto a una secuencia de polipéptidos (proteínas) de referencia se define como el porcentaje de residuos de aminoácido en una secuencia candidata que son idénticos a los residuos de aminoácido en la secuencia de polipéptido de referencia, después de alinear las secuencias e introducir huecos, si es necesario, para lograr el máximo porcentaje de identidad de secuencia, y sin considerar ninguna sustitución conservadora como parte de la identidad de secuencia. Se puede lograr la alineación para los propósitos de determinar el porcentaje de identidad de secuencia de aminoácidos de diversas maneras que están dentro de la habilidad de la técnica, por ejemplo, usando un programa informático disponible públicamente, tal como el programa informático BLAST, BlAsT-2, ALIGN, SaW i o Megalign (DNASTAR). Los expertos en la técnica pueden determinar los parámetros apropiados para alinear secuencias, incluyendo cualquier algoritmo necesario para lograr la máxima alineación sobre la longitud completa de las secuencias que se comparan. Sin embargo, para los propósitos en el presente documento, los valores de % de identidad de secuencia de aminoácidos se generan usando el programa informático de comparación de secuencias ALIGN-2. El programa de ordenador de comparación de secuencias ALIGN-2 se creó por Genentech, Inc., y el código fuente se ha presentado con la documentación de usuario en la Oficina de Derechos de Autor de e E. UU., Washington D.C., 20559, donde está registrado con el n.° de registro de derechos de autor de EE. UU. TXU510087. El programa ALIGN-2 está disponible públicamente de Genentech, Inc., South San Francisco, California, o se puede compilar a partir del código fuente. El programa ALIGN-2 se debe compilar para su uso en un sistema operativo UNIX, incluyendo UNIX V4,0D digital. Todos los parámetros de comparación de secuencias se establecen por el programa ALIGN-2 y no varían. En situaciones donde se emplea ALIGN-2 para las comparaciones de secuencias de aminoácidos, el % de identidad de secuencia de aminoácidos de una secuencia de aminoácidos A dada con respecto a, con o frente a una secuencia de aminoácidos B dada (que, de forma alternativa, se puede parafrasear como una secuencia de aminoácidos A dada que tiene o comprende un determinado % de identidad de secuencia de aminoácidos con respecto a, con o frente a una secuencia de aminoácidos B dada) se calcula como sigue:
100 veces la fracción X/Y
donde X es el número de residuos aminoacídicos puntuados como emparejamientos idénticos por el programa de alineación de secuencias ALIGN-2 en esa alineación del programa de A y B, y donde Y es el número total de residuos aminoacídicos de B. Se apreciará que, si la longitud de la secuencia de aminoácidos A no es igual a la longitud de la secuencia de aminoácidos B, el % de identidad de secuencia de aminoácidos de A con respecto a B no igualará el % de identidad de secuencia de aminoácidos de B con respecto a A. A menos que se indique específicamente de otro modo, todos los valores de % de identidad de secuencia de aminoácidos usados en el presente documento se obtienen como se describe en el párrafo inmediatamente precedente usando el programa informático ALIGN-2.
En determinados modos de realización, se contemplan variantes de secuencias de aminoácidos de las moléculas de unión a antígeno que contienen trímero de ligando de TNF proporcionadas en el presente documento. Por ejemplo, puede ser deseable mejorar la afinidad de unión y/u otras propiedades biológicas de las moléculas de unión a antígeno que contienen trímero de ligando de t Nf . Se pueden preparar variantes de secuencia de aminoácidos de las moléculas de unión a antígeno que contienen trímero de ligando de TNF introduciendo modificaciones apropiadas en la secuencia de nucleótidos que codifica las moléculas o por síntesis de péptidos. Dichas modificaciones incluyen, por ejemplo, deleciones de, y/o inserciones en y/o sustituciones de residuos dentro de las secuencias de aminoácidos del anticuerpo. Se puede realizar cualquier combinación de deleción, inserción y sustitución para llegar a la construcción final, siempre que la construcción final posea las características deseadas, por ejemplo, unión a antígeno. Los sitios de interés para la mutagénesis sustitutiva incluyen las HVR y las regiones estructurales (FR). Se proporcionan sustituciones conservadoras en la tabla B bajo el encabezamiento "Sustituciones preferentes" y se describen adicionalmente a continuación en referencia a las clases de cadenas laterales de aminoácidos (1) a (6). Se pueden introducir sustituciones aminoacídicas en la molécula de interés y cribar los productos para determinar una actividad deseada, por ejemplo, conservación/mejora de unión a antígeno, disminución en inmunogenicidad, o mejora en ADCC o CDC.
TABLA B
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Los aminoácidos se pueden agrupar de acuerdo con propiedades de cadena lateral comunes:
(1) hidrófobos: Norleucina, Met, Ala, Val, Leu, Ile;
(2) hidrófilos neutros: Cys, Ser, Thr, Asn, Gln;
(3) ácidos: Asp, Glu;
(4) básicos: His, Lys, Arg;
(5) residuos que influyen en la orientación de la cadena: Gly, Pro;
(6) aromáticos: Trp, Tyr, Phe.
Las sustituciones no conservadoras supondrán intercambiar un miembro de una de estas clases por otra clase. El término "variantes de secuencia de aminoácidos" incluye variantes sustanciales en las que hay sustituciones aminoacídicas en uno o más residuos de la región hipervariable de una molécula de unión a antígeno original (por ejemplo, un anticuerpo humanizado o humano). En general, la(s) variante(s) resultante(s) seleccionada(s) para su estudio adicional tendrá(n) modificaciones (por ejemplo, mejoras) en determinadas propiedades biológicas (por ejemplo, afinidad incrementada, inmunogenicidad reducida) con respecto a la molécula de unión a antígeno original y/o habrá(n) retenido sustancialmente determinadas propiedades biológicas de la molécula de unión a antígeno original. Una variante de sustitución ejemplar es un anticuerpo de afinidad madurada que se puede generar convenientemente, por ejemplo, usando técnicas de maduración de la afinidad basadasen presentación en fagos, tales como las descritas en el presente documento. En resumen, uno o más residuos de HVR mutan y las moléculas de unión a antígeno variables se muestran en el fago y se criban para una actividad biológica particular (por ejemplo, afinidad de unión). En determinados modos de realización se pueden producir sustituciones, inserciones o deleciones dentro de una o más HVR, siempre que dichas alteraciones no reduzcan sustancialmente la capacidad de la molécula de unión a antígeno de unirse al antígeno. Por ejemplo, en las HVR se pueden realizar alteraciones conservadoras (por ejemplo, sustituciones conservadoras como se proporciona en el presente documento) que no reduzcan sustancialmente la afinidad de unión. Un procedimiento útil para la identificación de residuos o regiones de un anticuerpo que se pueden seleccionar como diana para la mutagénesis se llama "mutagénesis por barrido de alanina" como se describe por Cunningham y Wells (1989) Science, 244:1081-1085. En este procedimiento se identifica un residuo o grupo de residuos diana (por ejemplo, residuos cargados, tales como Arg, Asp, His, Lys y Glu) y se reemplazan por un aminoácido neutro o cargado negativamente (por ejemplo, alanina o polialanina) para determinar si la interacción del anticuerpo con el antígeno se ve afectada. Se pueden introducir otras sustituciones en las localizaciones de aminoácidos que demuestren sensibilidad funcional a las sustituciones iniciales. De forma alternativa o adicionalmente, una estructura cristalina de un complejo molécula de unión a antígeno-antígeno para identificar los puntos de contacto entre el anticuerpo y el antígeno. Dichos residuos de contacto y residuos adyacentes se pueden seleccionar o eliminar como candidatos para sustitución. Se pueden cribar variantes para determinar si contienen las propiedades deseadas.
Las inserciones en la secuencia aminoacídica incluyen fusiones amino y/o carboxiterminales que varían en longitud desde un residuo a polipéptidos que contienen cien o más residuos, así como inserciones intrasecuenciales de residuos aminoacídicos únicos o múltiples. Los ejemplos de inserciones terminales incluyen moléculas de unión a antígeno que contienen trímero de ligando de la familia de TNF con un residuo de metionilo N terminal. Otras variantes de inserción de la molécula incluyen la fusión al extremo N o C con un polipéptido que incrementa la semivida en suero de las moléculas de unión a antígeno que contienen trímero de ligando de TNF.
En determinados modos de realización, las moléculas de unión a antígeno que contienen trímero de ligando de la familia de TNF proporcionadas en el presente documento se alteran para incrementar o disminuir el grado de glucosilación del anticuerpo. Las variantes de glucosilación de las moléculas se pueden obtener convenientemente alterando la secuencia de aminoácidos de modo que se creen o eliminen uno o más sitios de glucosilación. Cuando la molécula de unión a antígeno que contiene trímero de ligando de TNF comprende una región Fc, se puede alterar el carbohidrato unido a la misma. Los anticuerpos naturales producidos por células de mamífero típicamente comprenden un oligosacárido biantenario ramificado que se une, en general, por un enlace N a Asn297 del dominio CH2 de la región Fc. Véase, por ejemplo, Wright et al. TIBTECH 15:26-32 (1997). El oligosacárido puede incluir diversos carbohidratos, por ejemplo, manosa, N-acetilglucosamina (GlcNAc), galactosa y ácido siálico, así como una fucosa unida a una GlcNAc en el "tallo" de la estructura de oligosacárido biantenario. En algunos modos de realización, se pueden realizar modificaciones del oligosacárido en la molécula de unión a antígeno que contiene trímero de ligando de la familia de TNF para crear variantes con determinadas propiedades mejoradas. En un aspecto, se proporcionan variantes de moléculas de unión a antígeno que contienen un trímero de ligando de la familia de t Nf que tienen una estructura de carbohidrato que carece de fucosa unida (directa o indirectamente) a una región Fc. Dichas variantes de fucosilación pueden tener una función ADCC mejorada, véase, por ejemplo, la publicación de patente de EE.UU. n.° 2003/0157108 (Presta, L.) o el documento US2004/0093621 (Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd). Otras variantes de las moléculas de unión a antígeno que contienen un trímero de ligando de la familia de TNF de la invención incluyen aquellas con oligosacáridos bisectados, por ejemplo, en las que un oligosacárido biantenario unido a la región Fc está bisectado por GlcNAc. Dichas variantes pueden tener una fucosilación reducida o una función ADCC mejorada, véase, por ejemplo, el documento WO 2003/011878 (Jean-Mairet et al.); la patente de EE. UU. n.° 6.602.684 (Umana et al.); y el documento US 2005/0123546 (Umana et al.). También se proporcionan variantes con al menos un residuo de galactosa en el oligosacárido unido a la región Fc. Dichas variantes de anticuerpos pueden tener función de CDC mejorada y se describen, por ejemplo, en el documento WO 1997/30087 (Patel et al.); el documento WO 1998/58964 (Raju, S.); y el documento WO 1999/22764 (Raju, S.).
En determinados modos de realización puede ser deseable crear variantes genomanipuladas con cisteína de la molécula de unión a antígeno que contiene un trímero de ligando de la familia de TNF de la invención, por ejemplo, "tioMAb", en las que uno o más residuos de la molécula se sustituyen por residuos de cisteína. En modos de realización particulares, los residuos sustituidos se producen en sitios accesibles de la molécula. Al sustituir esos residuos por cisteína, los grupos tiol reactivos se sitúan, de este modo, en sitios accesibles del anticuerpo y se pueden usar para conjugar el anticuerpo a otros restos, tales como restos de fármaco o restos de conector-fármaco, para crear un inmunoconjugado. En determinados modos de realización se puede sustituir uno cualquiera o más de los siguientes residuos con cisteína: V205 (numeración de Kabat) de la cadena ligera; A118 (numeración EU) de la cadena pesada; y S400 (numeración EU) de la región Fc de la cadena pesada. Se pueden generar moléculas de unión a antígeno genomanipuladas con cisteína como se describe, por ejemplo, en la patente de EE. UU. n.° 7.521.541.
En determinados aspectos, las moléculas de unión a antígeno que contienen un trímero de ligando de la familia de TNF proporcionadas en el presente documento se pueden modificar además para que contengan restos no proteínicos adicionales que son conocidos en la técnica y están fácilmente disponibles. Los restos adecuados para la derivatización del anticuerpo incluyen, pero no se limitan a, polímeros hidrosolubles. Los ejemplos no limitantes de polímeros hidrosolubles incluyen, pero no se limitan a, polietilenglicol (PEG), copolímeros de etilenglicol/propilenglicol, carboximetilcelulosa, dextrano, poli(alcohol vinílico), polivinilpirrolidona, poli-1,3-dioxolano, poli-1,3,6-trioxano, copolímero de etileno/anhídrido maleico, poliaminoácidos (homopolímeros o bien copolímeros aleatorios) y dextrano o poli(n-vinilpirrolidona)/polietilenglicol, homopolímeros de propropilenglicol, copolímeros de poli(óxido de propileno)/óxido de etileno, polioles polioxietilados (por ejemplo, glicerol), poli(alcohol vinílico) y mezclas de los mismos. El polietilenglicol-propionaldehído puede tener ventajas en la fabricación debido a su estabilidad en agua. El polímero puede ser de cualquier peso molecular y puede estar ramificado o no ramificado. El número de polímeros unidos al anticuerpo puede variar y, si se une más de un polímero, pueden ser moléculas iguales o diferentes. En general, el número y/o tipo de polímeros usados para la derivatización se puede determinar en base a consideraciones que incluyen, pero no se limitan a, las propiedades o funciones particulares del anticuerpo que se van a mejorar, si el derivado de anticuerpo biespecífico se usará en un tratamiento en condiciones definidas, etc. En otro aspecto, se proporcionan conjugados de un anticuerpo y un resto no proteínico que se pueden calentar selectivamente por exposición a la radiación. En un modo de realización, el resto no proteínico es un nanotubo de carbono (Kam, N.W. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA102 (2005) 11600-11605). La radiación puede ser de cualquier longitud de onda, e incluye, pero no se limita a, longitudes de onda que no dañan células normales, pero que calientan el resto no proteínico hasta una temperatura a la que las células próximas al anticuerpo-resto no proteínico se destruyen.
En otro aspecto, se pueden obtener inmunoconjugados de las moléculas de unión a antígeno que contienen un trímero de ligando de la familia de TNF proporcionadas en el presente documento. Un " inmunoconjugado" es un anticuerpo conjugado con una o más moléculas heterógenas, incluyendo pero sin limitarse a un agente citotóxico.
El término "polinucleótido" se refiere a una molécula o construcción de ácido nucleico aislada, por ejemplo, ARN mensajero (ARNm), ARN derivado de virus o ADN de plásmido (ADNp). Un polinucleótido puede comprender un enlace fosfodiéster convencional o un enlace no convencional (por ejemplo, un enlace amida, tal como se encuentra en los ácidos peptidonucleicos (APN)). El término "molécula de ácido nucleico" se refiere a cualquiera de uno o más segmentos de ácido nucleico, por ejemplo, fragmentos de ADN o ARN, presentes en un polinucleótido.
Por molécula de ácido nucleico o polinucleótido "aislado" se entiende una molécula de ácido nucleico, ADN o ARN que se ha retirado de su entorno natural. Por ejemplo, un polinucleótido recombinante que codifica un polipéptido contenido en un vector se considera aislado para los propósitos de la presente invención. Otros ejemplos de un polinucleótido aislado incluyen polinucleótidos recombinantes mantenidos en células huésped heterógenas o polinucleótidos (parcial o sustancialmente) purificados en solución. Un polinucleótido aislado incluye una molécula polinucleotídica contenida en células que contienen normalmente la molécula polinucleotídica, pero la molécula polinucleotídica está presente de forma extracromosómica o en una localización cromosómica que es diferente de su localización cromosómica natural. Las moléculas de ARN aisladas incluyen transcritos de a Rn in vivo o in vitro de la presente invención, así como formas de hebras positivas y negativas y formas bicatenarias. Los polinucleótidos o ácidos nucleicos aislados de acuerdo con la presente invención incluyen además dichas moléculas producidas sintéticamente. Además, un polinucleótido o un ácido nucleico puede ser o puede incluir un elemento regulador tal como un promotor, sitio de unión a ribosoma o un finalizador de la transcripción.
Por un ácido nucleico o polinucleótido que tiene una secuencia de nucleótidos al menos, por ejemplo, un 95 % "idéntica" a una secuencia de nucleótidos de referencia de la presente invención se entiende que la secuencia de nucleótidos del polinucleótido es idéntica a la secuencia de referencia excepto en que la secuencia polinucleotídica puede incluir hasta cinco mutaciones puntuales por cada 100 nucleótidos de la secuencia de nucleótidos de referencia. En otras palabras, para obtener un polinucleótido que tiene una secuencia de nucleótidos al menos un 95 % idéntica a una secuencia de nucleótidos de referencia, hasta un 5 % de los nucleótidos en la secuencia de referencia se puede delecionar o sustituir con otro nucleótido, o un número de nucleótidos hasta un 5 % de los nucleótidos totales en la secuencia de referencia se puede insertar en la secuencia de referencia. Estas alteraciones de la secuencia de referencia se pueden producir en las posiciones terminales 5' o 3' de la secuencia de nucleótidos de referencia o en cualquier parte entre esas posiciones terminales, intercaladas individualmente entre residuos en la secuencia de referencia o bien en uno o más grupos contiguos dentro de la secuencia de referencia. Como cuestión práctica, si cualquier secuencia polinucleotídica particular es al menos un 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % idéntica a una secuencia de nucleótidos de la presente invención, se puede determinar convencionalmente usando programas informáticos conocidos, tales como los analizados anteriormente para polipéptidos (por ejemplo, ALIGN-2).
El término "casete de expresión" se refiere a un polinucleótido generado de forma recombinante o sintética, con una serie de elementos de ácido nucleico especificados que permiten la transcripción de un ácido nucleico particular en una célula diana. El casete de expresión recombinante se puede incorporar en un plásmido, cromosoma, ADN mitocondrial, ADN de plástido, virus o fragmento de ácido nucleico. Típicamente, la porción de casete de expresión recombinante de un vector de expresión incluye, entre otras secuencias, una secuencia de ácido nucleico que se va a transcribir y un promotor. En determinados modos de realización, el casete de expresión de la invención comprende secuencias polinucleotídicas que codifican moléculas de unión a antígeno biespecíficas de la invención o fragmentos de las mismas.
El término "vector" o "vector de expresión" es sinónimo de "construcción de expresión" y se refiere a una molécula de ADN que se usa para introducir y dirigir la expresión de un gen específico al que se asocia de forma funcional en una célula diana. El término incluye el vector como una estructura de ácido nucleico autorreplicante, así como el vector incorporado en el genoma de una célula huésped en la que se ha introducido. El vector de expresión de la presente invención comprende un casete de expresión. Los vectores de expresión permiten la transcripción de grandes cantidades de ARNm estable. Una vez que el vector de expresión está dentro de la célula diana, la molécula de ácido ribonucleico o proteína que se codifica por el gen se produce por el mecanismo de transcripción y/o traducción celular. En un modo de realización, el vector de expresión de la invención comprende un casete de expresión que comprende secuencias polinucleotídicas que codifican moléculas de unión a antígeno biespecíficas de la invención o fragmentos de las mismas.
Los términos "célula huésped", "línea celular huésped" y "cultivo de células huésped" se usan de manera intercambiable y se refieren a células en las que se ha introducido ácido nucleico exógeno, incluyendo la descendencia de dichas células. Las células huésped incluyen "transformantes" y "células transformadas" que incluyen la célula transformada primaria y la descendencia derivada de la misma independientemente del número de pases. La descendencia puede no ser completamente idéntica en contenido de ácido nucleico a una célula original, sino que puede contener mutaciones. La descendencia mutante que tiene la misma función o actividad biológica que la cribada o seleccionada en la célula transformada originalmente se incluye en el presente documento. Una célula huésped es cualquier tipo de sistema celular que se puede usar para generar las moléculas de unión a antígeno biespecíficas de la presente invención. Las células anfitrionas incluyen células cultivadas, p. ej., células cultivadas de mamíferos, tales como células CHO, células BHK, células NS0, células SP2/0, células de mieloma YO, células de mieloma de ratón P3X63, células PER, células PER.C6 o células de hibridoma, células de levadura, células de insectos y células vegetales, por nombrar solo algunas, pero también células comprendidas dentro de un animal transgénico, planta transgénica o tejido vegetal o animal cultivado.
Una "cantidad eficaz" de un agente se refiere a la cantidad que es necesaria para dar como resultado un cambio fisiológico en la célula o tejido al que se administra.
Una "cantidad terapéuticamente eficaz" de un agente, por ejemplo, una composición farmacéutica, se refiere a una cantidad eficaz, en las dosificaciones y durante los periodos de tiempo necesarios, para lograr el resultado terapéutico o profiláctico deseado. Una cantidad terapéuticamente eficaz de un agente, por ejemplo, elimina, disminuye, retrasa, minimiza o previene efectos adversos de una enfermedad.
Un "individuo" o "sujeto" es un mamífero. Los mamíferos incluyen, pero no se limitan a, animales domésticos (por ejemplo, vacas, ovejas, gatos, perros y caballos), primates (por ejemplo, seres humanos y primates no humanos, tales como monos), conejos y roedores (por ejemplo, ratones y ratas). En particular, el individuo o sujeto es un ser humano.
El término "composición farmacéutica" se refiere a una preparación que está en tal forma que permite que la actividad biológica de un ingrediente activo contenido en la misma sea eficaz, y que no contiene componentes adicionales que sean inaceptablemente tóxicos para un sujeto al que se administraría la formulación.
Un "excipiente farmacéuticamente aceptable" se refiere a un ingrediente en una composición farmacéutica, distinto de un ingrediente activo, que no es tóxico para un sujeto. Un excipiente farmacéuticamente aceptable incluye, pero no se limita a, un tampón, un estabilizador o un conservante.
El término "prospecto del envase" se usa para referirse a las instrucciones incluidas habitualmente en los envases comerciales de productos terapéuticos que contienen información sobre las indicaciones, uso, dosificación, administración, politerapia, contraindicaciones y/o advertencias en relación con el uso de dichos productos terapéuticos.
Como se usa en el presente documento, "tratamiento" (y variaciones gramaticales del mismo tales como "tratar" o "que trata") se refiere a la intervención clínica en un intento de alterar la evolución natural del individuo que se está tratando, y se puede realizar para profilaxis o bien durante la evolución de la enfermedad clínica. Los efectos deseables del tratamiento incluyen, pero no se limitan a, prevención de la aparición o recidiva de la enfermedad, alivio de los síntomas, disminución de cualquier consecuencia patológica directa o indirecta de la enfermedad, prevención de metástasis, disminución de la tasa de progresión de la enfermedad, mejora o atenuación del estado de la enfermedad y remisión o mejora del pronóstico. En algunos modos de realización, las moléculas de la invención se usan para retrasar el desarrollo de una enfermedad o para ralentizar la progresión de una enfermedad.
El término "cáncer" como se usa en el presente documento se refiere a enfermedades proliferativas, tales como linfomas, carcinoma, linfoma, blastoma, sarcoma, leucemia, leucemias linfocíticas, cáncer de pulmón, cáncer de pulmón no microcítico (CPNM), cáncer de pulmón de tipo bronquioloalveolar, cáncer de huesos, cáncer de páncreas, cáncer de piel, cáncer de cabeza o cuello, melanoma cutáneo o intraocular, cáncer uterino, cáncer ovárico, cáncer rectal, cáncer de la región anal, cáncer de estómago, cáncer gástrico, cáncer colorrectal (CCR), cáncer pancreático, cáncer de mama, cáncer de mama triple negativo, cáncer uterino, carcinoma de las trompas de Falopio, carcinoma endometrial, carcinoma de cuello uterino, carcinoma de la vagina, carcinoma de la vulva, enfermedad de Hodgking, cáncer del esófago, cáncer del intestino delgado, cáncer del sistema endocrino, cáncer de la glándula tiroidea, cáncer de la glándula paratiroidea, cáncer de la glándula suprarrenal, sarcoma de partes blandas, cáncer de uretra, cáncer de pene, cáncer de próstata, cáncer de vejiga, cáncer de riñón o uréter, carcinoma de células renales, carcinoma de la pelvis renal, mesotelioma, cáncer hepatocelular, cáncer biliar, neoplasias del sistema nervioso central (SNC), tumores de la médula espinal, glioma del tronco encefálico, glioblastoma multiforme, astrocitomas, schwanomas, ependimonas, meduloblastomas, meningiomas, carcinomas de células escamosas, adenoma hipofisario y sarcoma de Ewing, melanoma, mieloma múltiple, cáncer de linfocitos B (linfoma), leucemia linfocítica crónica (LLC), leucemia linfocítica aguda (LLA), leucemia de células pilosas, leucemia mieloblástica crónica, incluyendo versiones resistentes al tratamiento de cualquiera de los cánceres anteriores o una combinación de uno o más de los cánceres anteriores.
Moléculas de unión a antígeno que contienen un trímero de ligando de la familia de TNF
La divulgación proporciona moléculas de unión a antígeno que contienen un trímero de ligando de la familia de TNF novedosas con propiedades particularmente ventajosas tales como producibilidad, estabilidad, afinidad de unión, actividad biológica, eficacia de direccionamiento y toxicidad reducida.
En un primer aspecto, se proporciona una molécula de unión a antígeno que contiene un trímero de ligando de la familia de TNF que comprende
(a) al menos un resto que se puede unir específicamente a un antígeno de célula diana y
(b) un primer y un segundo polipéptido que están unidos entre sí por un enlace disulfuro, en el que la molécula de unión a antígeno se caracteriza por que el primer polipéptido comprende dos ectodominios de un miembro de la familia de ligandos de TNF o dos fragmentos de los mismos que están conectados entre sí mediante un conector peptídico y por que el segundo polipéptido comprende solo un ectodominio de dicho miembro de la familia de ligandos de TNF o un fragmento del mismo.
En un aspecto particular, se proporciona una molécula de unión a antígeno que contiene un trímero de ligando de la familia de TNF que comprende
(a) al menos un resto que se puede unir específicamente a un antígeno de célula diana,
(b) un primer y un segundo polipéptido que están unidos entre sí por un enlace disulfuro, en el que la molécula de unión a antígeno se caracteriza por que el primer polipéptido comprende dos ectodominios de un miembro de la familia de ligandos de TNF o dos fragmentos de los mismos que están conectados entre sí mediante un conector peptídico y por que el segundo polipéptido comprende solo un ectodominio de dicho miembro de la familia de ligandos de TNF o un fragmento del mismo, y
(c) un dominio Fc compuesto de una primera y una segunda subunidad que se pueden asociar de manera estable.
En un aspecto particular, la molécula de unión a antígeno que contiene un trímero de ligando de la familia de TNF comprende (a) al menos un resto que se puede unir específicamente a un antígeno de célula diana y (b) un primer y un segundo polipéptido que están unidos entre sí por un enlace disulfuro, en la que la molécula de unión a antígeno se caracteriza por que el primer polipéptido comprende dos ectodominios de un miembro de la familia de ligandos de TNF o dos fragmentos de los mismos que están conectados entre sí por un conector peptídico y por que el segundo polipéptido comprende solo un ectodominio de dicho miembro de la familia de ligandos de TNF o un fragmento del mismo, en el que el miembro de la familia de ligandos de TNF coestimula la activación del linfocito T humano.
En otro aspecto particular, la molécula de unión a antígeno que contiene un trímero de ligando de la familia de TNF comprende (a) al menos un resto que se puede unir específicamente a un antígeno de la célula diana y
(b) un primer y un segundo polipéptido que están unidos entre sí por un enlace disulfuro, en el que la molécula de unión a antígeno se caracteriza por que el primer polipéptido comprende dos ectodominios de un miembro de la familia de ligandos de TNF o dos fragmentos de los mismos que están conectados entre sí mediante un conector peptídico y por que el segundo polipéptido comprende solo un ectodominio de dicho miembro de la familia de ligandos de TNF o un fragmento del mismo, en el que los ectodominios de un miembro de la familia de ligandos de TNF son idénticos en todos los casos.
En otro aspecto, se proporciona una molécula de unión a antígeno que contiene un trímero de ligando de la familia de TNF que comprende
(a) al menos un resto que se puede unir específicamente a un antígeno de célula diana y
(b) un primer y segundo polipéptido que están unidos entre sí por un enlace disulfuro, en el que la molécula de unión a antígeno se caracteriza por que
(i) el primer polipéptido contiene un dominio CH1 o CL y el segundo polipéptido contiene un dominio CL o CH1, respectivamente, en el que el segundo polipéptido está unido al primer polipéptido por un enlace disulfuro entre el dominio CH1 y CL, y en el que el primer polipéptido comprende dos ectodominios de un miembro de la familia de ligandos de TNF o fragmentos de los mismos que están conectados entre sí y al dominio CH1 o CL mediante un conector peptídico, y en el que el segundo polipéptido comprende un ectodominio de dicho miembro de la familia de ligandos de TNF o un fragmento del mismo conectado por medio de un conector peptídico al dominio CL o CH1 de dicho polipéptido, o
(ii) el primer polipéptido contiene un dominio CH3 y el segundo polipéptido contiene un dominio CH3, respectivamente, y en el que el primer polipéptido comprende dos ectodominios de un miembro de la familia de ligandos de TNF o fragmentos de los mismos que están conectados entre sí y al extremo C del dominio CH3 mediante un conector peptídico y en el que el segundo polipéptido comprende solo un ectodominio de dicho miembro de la familia de ligandos de TNF o un fragmento del mismo conectado por medio de un conector peptídico al extremo C del dominio CH3 de dicho polipéptido, o
(iii) el primer polipéptido contiene un dominio VH-CL o un dominio VL-CH1 y el segundo polipéptido contiene un dominio VL-CH1 o un dominio VH-CL, respectivamente, en el que el segundo polipéptido está unido al primer polipéptido por un enlace disulfuro entre el dominio CH1 y CL, y en el que el primer polipéptido comprende dos ectodominios de un miembro de la familia de ligandos de TNF o fragmentos de los mismos que están conectados entre sí y al VH o VL mediante un conector peptídico y en el que el segundo polipéptido comprende un ectodominio de dicho miembro de la familia de ligandos de TNF o un fragmento del mismo conectado por medio de un conector peptídico a VL o VH de dicho polipéptido.
En un aspecto particular, la molécula de unión a antígeno que contiene un trímero de ligando de la familia de TNF comprende un miembro de la familia de ligandos de TNF que coestimula la activación de linfocitos T humanos que se selecciona de entre 4-1BBL y OX40L. Más en particular, el miembro de la familia de ligandos de TNF es 4-1BBL.
En otro aspecto, el ectodominio de un miembro de la familia de ligandos de TNF comprende la secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 96, SEQ ID NO: 373, SEQ ID NO: 374 y SEQ ID NO: 375, en particular la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 96. En un aspecto, el ectodominio de un miembro de la familia de ligandos de TNF o un fragmento del mismo comprende la secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ iD NO: 3, SEQ ID NO: 4 y SEQ ID NO: 96, en particular la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 96. En un aspecto particular, el ectodominio de un miembro de la familia de ligandos de TNF o fragmento del mismo comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 96.
En otro aspecto, la molécula de unión a antígeno que contiene un trímero de ligando de la familia de TNF comprende
(a) al menos un resto que se puede unir específicamente a un antígeno de célula diana y
(b) un primer y segundo polipéptido que están unidos entre sí por un enlace disulfuro, en el que la molécula de unión a antígeno se caracteriza por que el primer polipéptido comprende la secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en la SEQ iD NO: 5, SEQ ID NO: 97, SEQ ID NO: 98 y SEQ ID NO: 99; y por que el segundo polipéptido comprende la secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en la SeQ ID NO: 1, SeQ iD NO: 96, SEQ ID NO: 3 y SEQ ID NO: 4. En un aspecto particular, el primer polipéptido comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 97 y el segundo polipéptido comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 96.
En un aspecto, la molécula de unión a antígeno que contiene un trímero de ligando de la familia de TNF comprende
(a) al menos un resto que se puede unir específicamente a un antígeno de célula diana y
(b) un primer y un segundo polipéptido que están unidos entre sí por un enlace disulfuro, en el que la molécula de unión a antígeno se caracteriza por que el primer polipéptido comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 5 y por que el segundo polipéptido comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 6.
En otro aspecto, la molécula de unión a antígeno que contiene un trímero de ligando de la familia de TNF comprende
(a) al menos un resto que se puede unir específicamente a un antígeno de célula diana y
(b) un primer y un segundo polipéptido que están unidos entre sí por un enlace disulfuro, en el que la molécula de unión a antígeno se caracteriza por que el primer polipéptido comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 5 y por que el segundo polipéptido comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 183.
Aún en otro aspecto, la molécula de unión Aún a antígeno que contiene un trímero de ligando de la familia de TNF comprende
(a) al menos un resto que se puede unir específicamente a un antígeno de célula diana y
(b) un primer y un segundo polipéptido que están unidos entre sí por un enlace disulfuro, en el que la molécula de unión a antígeno se caracteriza por que el primer polipéptido comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 97 y por que el segundo polipéptido comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 184 o SEQ ID NO: 185.
En otro aspecto, el miembro de la familia de ligandos de TNF es OX40L. En un aspecto particular, se proporciona una molécula de unión a antígeno que contiene un trímero de ligando de la familia de TNF, en el que el ectodominio de un miembro de la familia de ligandos de TNF comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 53 o SEQ ID NO: 54, en particular la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 53.
En un aspecto, la divulgación se refiere a una molécula de unión a antígeno que contiene un trímero de ligando de la familia de TNF que comprende
(a) al menos un resto que se puede unir específicamente a un antígeno de célula diana y
(b) un primer y un segundo polipéptido que están unidos entre sí por un enlace disulfuro, en el que la molécula de unión a antígeno se caracteriza por que el primer polipéptido comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 371 o SEQ ID NO: 372 y por que el segundo polipéptido comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 53 o SEQ ID NO: 54, respectivamente.
En un aspecto, la molécula de unión a antígeno que contiene un trímero de ligando de la familia de TNF comprende (a) al menos un resto que se puede unir específicamente a un antígeno de célula diana,
(b) un primer polipéptido que contiene un dominio CH1 o CL y un segundo polipéptido que contiene un dominio CL o CH1, respectivamente, en el que el segundo polipéptido se une al primer polipéptido por un enlace disulfuro entre el dominio CH1 y CL,
y en el que la molécula de unión a antígeno se caracteriza por que el primer polipéptido comprende dos ectodominios de un miembro de la familia de ligandos de TNF o fragmentos del mismo que están conectados entre sí y al dominio CH1 o CL mediante un conector peptídico y por que el segundo polipéptido comprende solo un ectodominio de dicho miembro de la familia de ligandos de TNF o un fragmento del mismo conectado por medio de un conector peptídico al dominio CL o CH1 de dicho polipéptido.
En un aspecto, se proporciona una molécula de unión a antígeno que contiene un trímero de ligando de la familia de TNF que comprende
(a) al menos un resto que se puede unir específicamente a un antígeno de célula diana,
(b) un primer polipéptido que contiene un dominio CH1 y un segundo polipéptido que contiene un dominio CL, en el que el segundo polipéptido se une al primer polipéptido por un enlace disulfuro entre el dominio CH1 y CL, y en el que la molécula de unión a antígeno se caracteriza por que el primer polipéptido comprende dos ectodominios de un miembro de la familia de ligandos de TNF o fragmentos del mismo que están conectados entre sí y al dominio CH1 mediante un conector peptídico y por que el segundo polipéptido comprende un ectodominio de dicho miembro de la familia de ligandos de TNF o un fragmento del mismo conectado por medio de un conector peptídico al dominio CL de dicho polipéptido.
En otro aspecto, se proporciona una molécula de unión a antígeno que contiene un trímero de ligando de la familia de TNF que comprende
(a) al menos un resto que se puede unir específicamente a un antígeno de célula diana,
(b) un primer polipéptido que contiene un dominio CL y un segundo polipéptido que contiene un dominio CH1, en el que el segundo polipéptido se une al primer polipéptido por un enlace disulfuro entre el dominio CH1 y CL, y en el que la molécula de unión a antígeno se caracteriza por que el primer polipéptido comprende dos ectodominios de un miembro de la familia de ligandos de TNF o fragmentos del mismo que están conectados entre sí y al dominio CL mediante un conector peptídico y por que el segundo polipéptido comprende un ectodominio de dicho miembro de la familia de ligandos de TNF o un fragmento del mismo conectado por medio de un conector peptídico al dominio CH1 de dicho polipéptido.
En otro aspecto, se proporciona una molécula de unión a antígeno que contiene un trímero de ligando de la familia de TNF que comprende
(a) un resto que se puede unir específicamente a un antígeno de célula diana y
(b) un primer y un segundo polipéptido que están unidos entre sí por un enlace disulfuro, en el que la molécula de unión a antígeno se caracteriza por que el primer polipéptido comprende dos ectodominios de un miembro de la familia de ligandos de TNF o dos fragmentos de los mismos que están conectados entre sí mediante un conector peptídico y por que el segundo polipéptido comprende solo un ectodominio de dicho miembro de la familia de ligandos de TNF o un fragmento del mismo.
Aún en otro aspecto, se proporciona una molécula de unión a antígeno que contiene un trímero de ligando de la familia de TNF que comprende
(a) más de un resto que se puede unir específicamente a un antígeno de célula diana y
(b) un primer y un segundo polipéptido que están unidos entre sí por un enlace disulfuro, en el que la molécula de unión a antígeno se caracteriza por que el primer polipéptido comprende dos ectodominios de un miembro de la familia de ligandos de TNF o dos fragmentos de los mismos que están conectados entre sí mediante un conector peptídico y por que el segundo polipéptido comprende solo un ectodominio de dicho miembro de la familia de ligandos de TNF o un fragmento del mismo conectado por medio de un conector peptídico a dicho polipéptido. En un aspecto, se proporciona una molécula de unión a antígeno que contiene un trímero de ligando de la familia de TNF que comprende
(a) dos restos que se pueden unir específicamente a un antígeno de célula diana y
(b) un primer y un segundo polipéptido que están unidos entre sí por un enlace disulfuro, en el que la molécula de unión a antígeno se caracteriza por que el primer polipéptido comprende dos ectodominios de un miembro de la familia de ligandos de TNF o dos fragmentos de los mismos que están conectados entre sí mediante un conector peptídico y por que el segundo polipéptido comprende solo un ectodominio de dicho miembro de la familia de ligandos de TNF o un fragmento del mismo.
En un aspecto particular, se proporciona una molécula de unión a antígeno que contiene un trímero de ligando de la familia de TNF que comprende
(a) al menos un resto que se puede unir específicamente a un antígeno de célula diana, y
(b) un primer y un segundo polipéptido que están unidos entre sí por un enlace disulfuro,
en el que la molécula de unión a antígeno se caracteriza por que el primer polipéptido contiene un dominio CH3 y el segundo polipéptido contiene un dominio CH3, respectivamente, y en el que el primer polipéptido comprende dos ectodominios de un miembro de la familia de ligandos de TNF o fragmentos de los mismos que están conectados entre sí y al extremo C del dominio CH3 mediante un conector peptídico y en el que el segundo polipéptido comprende un ectodominio de dicho miembro de la familia de ligandos de TNF o un fragmento del mismo conectado por medio de un conector peptídico al extremo C del dominio CH3 de dicho polipéptido. En particular, dicha molécula de unión a antígeno que contiene un trímero de ligando de la familia de TNF comprende dos restos que se pueden unir específicamente a un antígeno de la célula diana.
En un aspecto, se proporciona una molécula de unión a antígeno que contiene un trímero de ligando de la familia de TNF que comprende
(a) dos restos que se pueden unir específicamente a un antígeno de célula diana y
(b) un primer y un segundo polipéptido que están unidos entre sí por un enlace disulfuro,
en el que la molécula de unión a antígeno se caracteriza por que el primer polipéptido comprende dos ectodominios de un miembro de la familia de ligandos de TNF o dos fragmentos de los mismos que están conectados entre sí mediante un conector peptídico y por que el segundo polipéptido comprende un ectodominio de dicho miembro de la familia de ligandos de TNF o un fragmento del mismo,
en el que los dos restos que se pueden unir específicamente a un antígeno de la célula diana se unen a dos antígenos diferentes de la célula diana.
En otro aspecto, se proporciona una molécula de unión a antígeno que contiene un trímero de ligando de la familia de TNF como se define anteriormente en el presente documento, en el que el resto que se puede unir específicamente a un antígeno de la célula diana se selecciona del grupo que consiste en un anticuerpo, un fragmento de anticuerpo y una proteína de unión a antígeno supercóntigo.
En un aspecto, se proporciona una molécula de unión a antígeno que contiene un trímero de ligando de la familia de TNF como se describe anteriormente en el presente documento, en el que el resto que se puede unir específicamente a un antígeno de la célula diana se selecciona del grupo que consiste en un fragmento de anticuerpo, una molécula Fab, una molécula Fab de entrecruzamiento, una molécula Fab monocatenaria, una molécula Fv, una molécula scFv, un anticuerpo de dominio único, un aVH y una proteína de unión a antígeno supercóntigo. En un aspecto, el resto que se puede unir específicamente a un antígeno de la célula diana es un aVH o una proteína de unión a antígeno supercóntigo. En un aspecto, el resto que se puede unir específicamente a un antígeno de la célula diana es una proteína de unión a antígeno supercóntigo que se puede unir específicamente a un antígeno de la célula diana.
En particular, la molécula de unión a antígeno que contiene un trímero de ligando de la familia de TNF comprende uno o dos restos que se pueden unir específicamente a un antígeno de la célula diana.
En un aspecto particular, se proporciona una molécula de unión a antígeno que contiene un trímero de ligando de la familia de t Nf , en el que el resto que se puede unir específicamente a un antígeno de la célula diana es una molécula Fab o una molécula Fab de entrecruzamiento que se puede unir específicamente a un antígeno de la célula diana. En particular, el resto que se puede unir específicamente a un antígeno de la célula diana es una Fab que se puede unir específicamente a un antígeno de la célula diana.
En otro aspecto, se proporciona una molécula de unión a antígeno que contiene un trímero de ligando de la familia de TNF, en el que un péptido que comprende dos ectodominios de un miembro de la familia de ligandos de TNF o fragmentos del mismo conectados entre sí mediante un primer conector peptídico se fusiona en su extremo C con el dominio CH1 de una cadena pesada mediante un segundo conector peptídico y en el que un ectodominio de dicho miembro de la familia de ligandos de TNF o un fragmento del mismo se fusiona en su extremo C con el dominio CL de una cadena ligera mediante un tercer conector peptídico.
En otro aspecto, se proporciona una molécula de unión a antígeno que contiene un trímero de ligando de la familia de TNF, en el que un péptido que comprende dos ectodominios de un miembro de la familia de ligandos de TNF o fragmentos del mismo conectados entre sí mediante un primer conector peptídico se fusiona en su extremo C con el dominio CL de una cadena pesada mediante un segundo conector peptídico y en el que un ectodominio de dicho miembro de la familia de ligandos de TNF o un fragmento del mismo se fusiona en su extremo C con el dominio CH1 de una cadena ligera mediante un tercer conector peptídico.
En otro aspecto, la divulgación se dirige a una molécula de unión a antígeno que contiene un trímero de ligando de la familia de TNF, en el que un péptido que comprende dos ectodominios de un miembro de la familia de ligandos de TNF o fragmentos del mismo conectados entre sí mediante un primer conector peptídico se fusiona en su extremo C con el dominio CL de una cadena ligera mediante un segundo conector peptídico y en el que un ectodominio de dicho miembro de la familia de ligandos de TNF o un fragmento del mismo se fusiona en su extremo C con el dominio CH1 de la cadena pesada mediante un tercer conector peptídico.
En un aspecto particular, la divulgación se refiere a una molécula de unión a antígeno que contiene un trímero de ligando de la familia de TNF como se define anteriormente, en el que el conector peptídico es (G4 S)2. En un aspecto, el primer conector peptídico es (G4 S )2 (SEQ ID NO: 13), el segundo conector peptídico es GSPGSSSSGS (SEQ ID NO: 57) y el tercer conector peptídico es (G4S) 2 (SEQ ID NO: 13). En particular, la invención se refiere a una molécula de unión a antígeno que contiene un trímero de ligando de TNF como se define anteriormente, en el que el primer conector peptídico es (G4 S )2 (SEQ ID NO: 13), el segundo conector peptídico es (G4 S )2 (SEQ ID NO: 13), y el tercer conector peptídico es (G4 S )2 (SEQ ID NO: 13).
En otro aspecto, la molécula de unión a antígeno que contiene un trímero de ligando de la familia de TNF como se define anteriormente en el presente documento comprende un dominio Fc compuesto de una primera y una segunda subunidad que se pueden asociar de manera estable.
En particular, la molécula de unión a antígeno que contiene un trímero de ligando de la familia de TNF comprende (a) una molécula Fab que se puede unir específicamente a un antígeno de la célula diana, en la que la cadena pesada de Fab se fusiona en el extremo C con el extremo N de un dominio CH2 en el dominio Fc y (c) un dominio Fc compuesto por una primera y una segunda subunidad que se pueden asociar de manera estable.
En otro aspecto, el dominio Fc es una IgG, en particular un dominio Fc de IgG1 o un dominio Fc de IgG4. Más en particular, el dominio Fc es un dominio Fc de IgG1. En un aspecto particular, el dominio Fc comprende una modificación que promueve la asociación de la primera y la segunda subunidad del dominio Fc.
Modificaciones en el dominio Fc que reducen la unión al receptor de Fc y/o la función efectora
El dominio Fc de las moléculas de unión a antígeno que contienen un trímero de ligando de la familia de TNF de la invención consiste en un par de cadenas polipeptídicas que comprenden dominios de la cadena pesada de una molécula de inmunoglobulina. Por ejemplo, el dominio Fc de una molécula de inmunoglobulina G (IgG) es un dímero, del que cada unidad comprende los dominios constantes de la cadena pesada de IgG CH2 y CH3. Las dos subunidades del dominio Fc se pueden asociar de forma estable entre sí.
El dominio Fc confiere propiedades farmacocinéticas favorables a las moléculas de unión a antígeno de la invención, que incluyen una larga semivida en suero que contribuye a una buena acumulación en el tejido diana y una proporción de distribución tejido-sangre favorable. Al mismo tiempo, sin embargo, puede dar lugar a una selección indeseable de los anticuerpos biespecíficos de la invención con respecto a células que expresen receptores Fc en lugar de con respecto a células que tengan el antígeno preferentes. En consecuencia, en aspectos particulares, el dominio Fc de la molécula de unión a antígeno que contiene un trímero de ligando de la familia de TNF de la invención presenta una afinidad de unión reducida por un receptor de Fc y/o una función efectora reducida, en comparación con un dominio Fc de IgG1 natural. En un aspecto, el Fc no se une sustancialmente a un receptor de Fc ni induce la función efectora. En un aspecto particular, el receptor de Fc es un receptor de Fcy. En un aspecto, el receptor de Fc es un receptor de Fc humano. En un aspecto específico, el receptor de Fc es un receptor de Fcy humano activador, m ás específicamente FcYRIIIa, FcyRI o FcYRlIa humano, lo más específicamente FcyRINa humano. En un aspecto, el dominio Fc no induce la funcón efectora. La función efectora reducida puede incluir, pero no se limita a, una o más de las siguientes: citotoxicidad dependiente del complemento (CDC) reducida, citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (ADCC) reducida, fagocitosis celular dependiente de anticuerpos (ADCP) reducida, secreción de citocinas reducida, captación de antígenos mediada por inmunocomplejos mediante células presentadoras de antígenos reducida, unión a linfocitos NK reducida, unión a macrófagos reducida, unión a monocitos reducida, unión a células polimorfonucleares reducida, señalización directa inductora de la apoptosis reducida, maduración de células dendríticas reducida o activación de linfocitos T reducida.
En determinados aspectos, se pueden introducir una o más modificaciones aminoacídicas en la región Fc de una molécula de unión a antígeno que contiene un trímero de ligando de la familia de TNF proporcionada en el presente documento, generando de este modo una variante de la región Fc. La variante de la región Fc puede comprender una secuencia de la región Fc humana (por ejemplo, una región Fc de IgG1, IgG2, IgG3 o IgG4 humana) que comprenda una modificación de aminoácidos (por ejemplo, una sustitución) en una o más posiciones de aminoácido.
En un aspecto particular, se proporciona una molécula de unión a antígeno que contiene un trímero de ligando de la familia de TNF que comprende
(a) al menos un resto que se puede unir específicamente a un antígeno de célula diana,
(b) un primer y un segundo polipéptido que están unidos entre sí por un enlace disulfuro, en el que la molécula de unión a antígeno se caracteriza por que el primer polipéptido comprende dos ectodominios de un miembro de la familia de ligandos de TNF o dos fragmentos de los mismos que están conectados entre sí mediante un conector peptídico y por que el segundo polipéptido comprende solo un ectodominio de dicho miembro de la familia de ligandos de TNF o un fragmento del mismo, y
(c) un dominio Fc compuesto de una primera y una segunda subunidad que se pueden asociar de manera estable, en el que el dominio Fc comprende una o más sustituciones aminoacídicas que reducen la unión a un receptor Fc, en particular al receptor Fcy.
En un aspecto, el dominio Fc de la molécula de unión a antígeno que contiene un trímero de ligando de la familia de TNF comprende una o más mutaciones aminoacídicas que reducen la afinidad de unión del dominio Fc por un receptor Fc y/o función efectora. Típicamente, la misma una o más mutaciones aminoacídicas están presentes en cada una de las dos subunidades del dominio Fc. En particular, el dominio Fc comprende una sustitución aminoacídica en una posición de E233, L234, L235, N297, P331 y P329 (numeración EU). En particular, el dominio Fc comprende sustituciones aminoacídicas en las posiciones 234 y 235 (numeración EU) y/o 329 (numeración EU) de las cadenas pesadas de IgG. Más en particular, se proporciona una molécula de unión a antígeno que contiene ligandos de la familia de TNF triméricos de acuerdo con la invención que comprende un dominio Fc de con las sustituciones aminoacídicas L234A, L235A y P329G ("P329G LALA", numeración) en las cadenas pesadas de IgG. Las sustituciones aminoacídicas L234A y L235A se refieren a la denominada mutación LALA. La combinación "P329G LALA" de sustituciones aminoacídicas anula casi por completo la unión al receptor de Fcy de un dominio Fc de IgG1 humana y se describe en la publicación de solicitud de patente internacional n.° WO2012/130831 A1 que también describe procedimientos para preparar dichos dominios Fc mutantes y procedimientos para determinar sus propiedades tales como la unión al receptor de Fc o funciones efectoras. La "numeración EU" se refiere a la numeración de acuerdo con el índice EU de Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5.a Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD, 1991.
Los dominios Fc con unión al receptor de Fc reducida y/o función efectora reducida incluyen también aquellas con sustitución de uno o más de los residuos de dominio Fc 238, 265, 269, 270, 297, 327 y 329 de la región Fc (patente de EE. UU. n.° 6.737.056). Dichos imitantes Fc incluyen mutantes Fc con sustituciones en dos o más de las posiciones aminoacídicas 265, 269, 270, 297 y 327, incluyendo el llamado mutante Fc "DANA" con sustitución de los residuos 265 y 297 con alanina (patente de EE. UU. n.° 7.332.581).
En otro aspecto, el dominio Fc es un dominio Fc de IgG4. Los anticuerpos de IgG4 presentan una afinidad de unión reducida por receptores de Fc y funciones efectoras reducidas en comparación con anticuerpos de IgG1. En un aspecto más específico, el dominio Fc es un dominio Fc de IgG4 que comprende una sustitución aminoacídica en la posición S228 (numeración de Kabat), en particular la sustitución aminoacídica S228P. En un aspecto más específico, el dominio Fc es un dominio Fc de IgG4 que comprende las sustituciones aminoacídicas L235E y S228P y P329G (numeración EU). Dichos mutantes del dominio Fcy de IgG4 y sus propiedades de unión al receptor de Fc se describen también en el documento WO 2012/130831.
Se pueden preparar dominios Fc mutantes por deleción, sustitución, inserción o modificación de aminoácidos usando procedimientos genéticos o químicos bien conocidos en la técnica. Los procedimientos genéticos pueden incluir mutagénesis específica de sitio de la secuencia de ADN codificante, PCR, síntesis génica y similares. Los cambios nucleotídicos correctos se pueden verificar, por ejemplo, por secuenciación.
La unión a receptores de Fc se puede determinar fácilmente, por ejemplo, por ELISA, o por resonancia de plasmón superficial (SPR) usando instrumentación estándar tal como un instrumento BIAcore (GE Healthcare), y receptores de Fc tales como los que se pueden obtener por expresión recombinante. Un ensayo de unión de este tipo adecuado se describe en el presente documento. De forma alternativa, se puede evaluar la afinidad de unión de dominios Fc o moléculas de unión a antígeno biespecíficas activadoras de linfocitos que comprenden un dominio Fc por los receptores de Fc usando líneas celulares conocidas por expresar receptores de Fc particulares, tales como linfocitos NK humanos que expresan el receptor de FcYlIIa.
La función efectora de un dominio Fc, o de los anticuerpos biespecíficos de la invención que comprenden un dominio Fc, se puede medir mediante procedimientos conocidos en la técnica. Un ensayo adecuado para medir la ADCC se describe en el presente documento. Otros ejemplos de ensayos in vitro para evaluar la actividad de ADCC de una molécula de interés se describen en la patente de EE. UU. n.° 5.500.362; Hellstrom et al., Proc Natl Acad Sci USA83, 7059-7063 (1986) y Hellstrom etal., Proc Natl Acad Sci USA 82, 1499-1502 (1985); patente de EE. UU. n.° 5.821.337; Bruggemann et al., J Exp Med 166, 1351-1361 (1987). De forma alternativa, se pueden emplear procedimientos de ensayos no radioactivos (véase, por ejemplo, el ensayo de citotoxicidad no radioactivo ACTI™ para citometría de flujo (CellTechnology, Inc. Mountain View, CA); y el ensayo de citotoxicidad no radioactivo CytoTox 96® (Promega, Madison, WI)). Las células efectoras útiles para dichos ensayos incluyen células mononucleares de sangre periférica (PBMC) y linfocitos citolíticos naturales (NK). De forma alternativa, o adicionalmente, la actividad de ADCC de la molécula de interés se puede evaluar in vivo, por ejemplo, en un modelo animal tal como el divulgado en Clynes et al., Proc Natl Acad Sci USA 95, 652-656 (1998).
En algunos modos de realización, se reduce la unión del dominio Fc a un componente del complemento, específicamente a C1q. En consecuencia, en algunos modos de realización en los que el dominio Fc se genomanipula para tener una función efectora reducida, dicha función efectora reducida incluye una CDC reducida. Se pueden llevar a cabo ensayos de unión a C1q para determinar si los anticuerpos biespecíficos de la invención se pueden unir a C1q y, de ahí que tengan actividad CDC. Véase, por ejemplo, ELISA de unión a C1q y C3c en los documentos WO2006/029879 y WO2005/100402. Para evaluar la activación del complemento se puede realizar un ensayo de CDC (véanse, por ejemplo, Gazzano-Santoro et al., J Immunol Methods 202, 163 (1996); Cragg et al., Blood 101, 1045-1052 (2003); y Cragg y Glennie, Blood 103, 2738-2743 (2004)).
En un aspecto particular, el dominio Fc comprende una modificación que promueve la asociación de la primera y la segunda subunidad del dominio Fc.
Modificaciones en el dominio Fc que promueven la heterodimerización
En un aspecto, las moléculas de unión a antígeno que contienen un trímero de ligando de la familia de TNF comprenden (a) al menos un resto que se puede unir específicamente a un antígeno de la célula diana, (b) un primer y un segundo polipéptido que están unidos entre sí por un enlace disulfuro, en el que la molécula de unión a antígeno se caracteriza por que el primer polipéptido comprende dos ectodominios de un miembro de la familia de ligandos de TNF o dos fragmentos de los mismos que están conectados entre sí mediante un conector peptídico y por que el segundo polipéptido comprende solo un ectodominio de dicho miembro de la familia de ligandos de TNF o un fragmento del mismo, y (c) un dominio Fc compuesto de una primera y una segunda subunidad que se pueden asociar de manera estable, en el que el dominio Fc comprende una o más sustituciones aminoacídicas que reducen la unión a un receptor Fc, en particular hacia el receptor Fc Por tanto, comprenden restos diferentes, fusionados a una u otra de las dos subunidades del dominio Fc que típicamente están comprendidas en dos cadenas polipeptídicas no idénticas ("cadenas pesadas"). La coexpresión recombinante de estos polipéptidos y la posterior dimerización dan lugar a varias combinaciones posibles de los dos polipéptidos. Para mejorar el rendimiento y la pureza de las moléculas de unión a antígeno que contienen un trímero de ligando de la familia de TNF en la producción recombinante, será ventajoso, por tanto, introducir en el dominio Fc de las moléculas de unión a antígeno que contienen un trímero de ligando de la familia de TNF de la invención una modificación que promueva la asociación de los polipéptidos deseados.
En consecuencia, el dominio Fc de las moléculas de unión a antígeno que contienen un trímero de ligando de la familia de TNF de la invención comprende una modificación que promueve la asociación de la primera y la segunda subunidad del dominio Fc. El sitio de interacción proteína-proteína más extensa entre las dos subunidades de un dominio Fc de IgG humana es en el dominio CH3 del dominio Fc. Por tanto, dicha modificación se encuentra en particular en el dominio CH3 del dominio Fc.
En un aspecto específico, dicha modificación es una modificación llamada "botón en ojal", que comprende una modificación de "botón" en una de las dos subunidades del dominio Fc y una modificación de "ojal" en la otra de las dos subunidades del dominio Fc. Por tanto, en un aspecto particular, la invención se refiere a una molécula de unión a antígeno que contiene un trímero de ligando de la familia de TNF como se describe anteriormente en el presente documento, que comprende una molécula de IgG, en el que la parte Fc de la primera cadena pesada comprende un primer módulo de dimerización y la parte Fc de la segunda cadena pesada comprende un segundo módulo de dimerización que permite una heterodimerización de las dos cadenas pesadas de la molécula de IgG y el primer módulo de dimerización comprende botones y el segundo módulo de dimerización comprende ojales de acuerdo con la tecnología de botón en ojal.
La tecnología de "botón-en-ojal" se describe, por ejemplo, en los documentos US 5.731.168; US 7.695.936; Ridgway et al., Prot Eng 9, 617-621 (1996) y Carter, J Immunol Meth 248, 7-15 (2001). En general, el procedimiento implica introducir una protuberancia ("botón") en la interfase de un primer polipéptido y una correspondiente cavidad ("ojal") en la interfase de un segundo polipéptido, de modo que la protuberancia se puede situar en la cavidad para promover la formación de heterodímeros y dificultar la formación de homodímeros. Las protuberancias se construyen reemplazando cadenas laterales de aminoácidos pequeñas de la interfase del primer polipéptido por cadenas laterales más grandes (por ejemplo, tirosina o triptófano). Se crean cavidades compensadoras de tamaño idéntico o similar a las protuberancias en la interfase del segundo polipéptido reemplazando cadenas laterales de aminoácido grandes por otras más pequeñas (por ejemplo, alanina o treonina).
En consecuencia, en un aspecto particular, en el dominio CH3 de la primera subunidad del dominio Fc de las moléculas de unión a antígeno que contienen un trímero de ligando de la familia de TNF de la invención, se reemplaza un residuo de aminoácido por un residuo de aminoácido que tenga un volumen de cadena lateral más grande, para generar de este modo una protuberancia en el dominio CH3 de la primera subunidad que se puede colocar en una cavidad dentro del dominio CH3 de la segunda subunidad, y en el dominio CH3 de la segunda subunidad del dominio Fc se reemplaza un residuo de aminoácido por un residuo de aminoácido que tenga un volumen de cadena lateral más pequeño, para generar de este modo una cavidad dentro del dominio CH3 de la segunda subunidad en la que se pueda colocar la protuberancia dentro del dominio CH3 de la primera subunidad.
La protuberancia y la cavidad se pueden realizar alterando el ácido nucleico que codifica los polipéptidos, por ejemplo, por mutagénesis específica de sitio o por síntesis peptídica.
En un aspecto específico, en el dominio CH3 de la primera subunidad del dominio Fc el residuo de treonina en la posición 366 se reemplaza con un residuo de triptófano (T366W), y en el dominio CH3 de la segunda subunidad del dominio Fc el residuo de tirosina en la posición 407 se reemplaza con un residuo de valina (Y407V). Más en particular, en la segunda subunidad del dominio Fc adicionalmente el residuo de treonina en la posición 366 se reemplaza por un residuo de serina (T366S) y el residuo de leucina en la posición 368 se reemplaza por un residuo de alanina (L368A). Más en particular, en la primera subunidad del dominio Fc adicionalmente el residuo de serina en la posición 354 se reemplaza por un residuo de cisteína (S354C), y en la segunda subunidad del dominio Fc adicionalmente el residuo de tirosina en la posición 349 se reemplaza por un residuo de cisteína (Y349C). La introducción de estos dos residuos de cisteína da como resultado la formación de un puente disulfuro entre las dos subunidades del dominio Fc. El puente disulfuro estabiliza adicionalmente el dímero (Carter, J Immunol Methods 248, 7-15 (2001)).
En un aspecto alternativo, una modificación que promueve la asociación de la primera y la segunda subunidad del dominio Fc comprende una modificación que media en los efectos de conducción electrostática, por ejemplo, como se describe en la publicación PCT WO2009/089004. En general, este procedimiento implica el reemplazo de uno o más residuos aminoacídicos en la interfase de las dos subunidades del dominio Fc por residuos aminoacídicos cargados de modo que la formación de homodímeros se vuelve electrostáticamente desfavorable pero la heterodimerización electrostáticamente favorable.
Modificaciones en los dominios CH1/CL
Para mejorar aún más el emparejamiento correcto, las moléculas de unión a antígeno que contienen un trímero de ligando de la familia de TNF pueden contener diferentes sustituciones aminoacídicas cargadas (los llamados "residuos cargados"). Estas modificaciones se introducen en los dominios CH1 y CL cruzados o no cruzados. En un aspecto particular, la invención se refiere a una molécula de unión a antígeno que contiene un trímero de ligando de la familia de TNF, en el que en uno de los dominios CL el aminoácido en la posición 123 (numeración EU) se ha reemplazado por arginina (R) y el aminoácido en la posición 124 (numeración EU) se ha sustituido por lisina (K) y en el que en uno de los dominios CH1 los aminoácidos en la posición 147 (numeración UE) y en la posición 213 (numeración UE) se han sustituido por ácido glutámico (E).
Más en particular, la invención se refiere a una molécula de unión a antígeno que contiene un trímero de ligando de la familia de TNF, en el que en el dominio CL contiguo al miembro de la familia de ligandos de TNF, el aminoácido en la posición 123 (numeración EU) se ha reemplazado por arginina (R) y el aminoácido en la posición 124 (numeración UE) se ha sustituido por lisina (K), y en el que en el dominio CH1 contiguo al miembro de la familia de ligandos de TNF, los aminoácidos en la posición 147 (numeración UE) y en la posición 213 (numeración UE) se han sustituido por ácido glutámico (E).
Moléculas de unión a antígeno que contienen un trímero de ligando de la familia de TNF particulares
En otro aspecto, se proporciona una molécula de unión a antígeno que contiene un trímero de ligando de la familia de TNF, en el que la molécula de unión a antígeno comprende
una primera cadena pesada y una primera cadena ligera, comprendiendo ambas una molécula Fab que se puede unir específicamente a un antígeno de la célula diana,
un primer péptido que comprende dos ectodominios de un miembro de la familia de ligandos de TNF o fragmentos del mismo conectados entre sí mediante un primer conector peptídico fusionado en su extremo C por un segundo conector peptídico a una segunda cadena pesada o ligera,
y un segundo péptido que comprende un ectodominio de dicho miembro de la familia de ligandos de TNF fusionado en su extremo C por un tercer conector peptídico a una segunda cadena ligera o pesada, respectivamente.
En otro aspecto, se proporciona una molécula de unión a antígeno que contiene un trímero de ligando de la familia de TNF, en el que el primer péptido que comprende dos ectodominios de un miembro de la familia de ligandos de TNF o fragmentos del mismo conectados entre sí por un primer conector peptídico se fusiona en su extremo C por un segundo conector peptídico a un dominio CH1 que es parte de una cadena pesada, y el segundo péptido que comprende un ectodominio de dicho miembro de la familia de ligandos de t Nf o un fragmento del mismo se fusiona en su extremo C mediante un tercer conector peptídico con un dominio CL que es parte de una cadena ligera.
Aún en otro aspecto, se proporciona una molécula de unión a antígeno que contiene un trímero de ligando de la familia de TNF, en el que el primer péptido que comprende dos ectodominios de un miembro de la familia de ligandos de TNF o fragmentos del mismo conectados entre sí por un primer conector peptídico se fusiona en su extremo C mediante un segundo conector peptídico con un dominio CL que es parte de una cadena pesada,
y el segundo péptido que comprende un ectodominio de dicho miembro de la familia de ligandos de TNF o un fragmento del mismo que se fusiona en su extremo C por un tercer conector peptídico a un dominio CH1 que es parte de una cadena ligera.
En otro aspecto, se proporciona una molécula de unión a antígeno que contiene un trímero de ligando de la familia de TNF, en el que el primer péptido que comprende dos ectodominios de un miembro de la familia de ligandos de TNF o fragmentos del mismo conectados entre sí mediante un primer conector peptídico se fusiona en su extremo C mediante un segundo conector peptídico con un dominio VH que es parte de una cadena pesada,
y el segundo péptido que comprende un ectodominio de dicho miembro de la familia de ligandos de TNF o un fragmento del mismo se fusiona en su extremo C mediante un conector peptídico con un dominio VL que es parte de una cadena ligera.
En un aspecto, se proporciona una molécula de unión a antígeno que contiene un trímero de ligando de la familia de TNF, en el que en el dominio CL contiguo al miembro de la familia de ligandos de TNF, el aminoácido en la posición 123 (numeración EU) se ha reemplazado por arginina (R) y el aminoácido en la posición 124 (numeración UE) se ha sustituido por lisina (K), y en el que en el dominio CH1 contiguo al miembro de la familia de ligandos de TNF, los aminoácidos en la posición 147 (numeración UE) y en la posición 213 (numeración UE) se han sustituido por ácido glutámico (E). Estas modificaciones dan lugar a los llamados residuos cargados con propiedades ventajosas que evitan efectos no deseados tales como, por ejemplo, el emparejamiento erróneo.
Moléculas de unión a antígeno que contienen un trímero de ligando de la familia de TNF, en el que el antígeno de la célula diana es CD19
En un aspecto particular, se proporciona una molécula de unión a antígeno que contiene un trímero de ligando de la familia de TNF, en el que el antígeno de la célula diana es CD19.
En un aspecto, la invención proporciona una molécula de unión a antígeno que contiene un trímero de ligando de la familia de TNF, en el que el resto que se puede unir específicamente a CD19 comprende un dominio VH que comprende (i) CDR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 195 o SEQ ID NO: 252, (ii) CDR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 196 o SEQ ID NO: 253, y (iii) CDR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 197 o SEQ ID NO: 254, y un dominio Vl que comprende (iv) CDR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 198 o SEQ ID NO: 249, (v) CDR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 199 o SEQ ID NO: 250, y (vi) CDR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 200 o SEQ ID NO: 251.
En un aspecto particular, se proporciona una molécula de unión a antígeno que contiene un trímero de ligando de la familia de TNF de la invención, en el que el resto que se puede unir específicamente a un antígeno de la célula diana es una molécula Fab que se puede unir específicamente a CD19 y comprende un dominio VH que comprende (i) CDR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 195, (ii) CDR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 196 y (iii) CDR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 197; y un dominio VL que comprende (iv) CDR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 198, (v) CDR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 199 y (vi) CDR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 200.
En otro aspecto, se proporciona una molécula de unión a antígeno que contiene un trímero de ligando de la familia de TNF de la invención, en el que el resto que se puede unir específicamente a un antígeno de la célula diana es una molécula Fab que se puede unir específicamente a CD19 y comprende un dominio VH que comprende (i) CDR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 252, (ii) CDR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 253 y (iii) CDR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 254; y un dominio VL que comprende (iv) CDR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 249, (v) CDR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 250 y (vi) CDR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 251.
En otro aspecto, el resto que se puede unir específicamente a CD19 comprende una región variable de la cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos aproximadamente un 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % idéntica a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 201 y una región variable de la cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos aproximadamente un 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % idéntica a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 202.
En otro aspecto, el resto que se puede unir específicamente a CD19 comprende una región variable de la cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos aproximadamente un 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % idéntica a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 357 y una región variable de la cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos aproximadamente un 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % idéntica a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 358.
En un aspecto, el resto que se puede unir específicamente a CD19 comprende una cadena pesada variable que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 201 y una cadena ligera variable que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 202 o en el que el resto que se puede unir específicamente a CD19 comprende una cadena pesada variable que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 357 y una cadena ligera variable que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 358.
En un aspecto particular, el resto que se puede unir específicamente a CD19 comprende una región variable de la cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 201 y la región variable de la cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 202. En otro aspecto particular, el resto que se puede unir específicamente a CD19 comprende una región variable de la cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 357 y la región variable de la cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 358.
En otro aspecto, la molécula de unión a antígeno que contiene un trímero de ligando de la familia de TNF comprende
(a) al menos un resto que se puede unir específicamente a un antígeno de la célula diana, que comprende una región variable de la cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 201 y una región variable de la cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 202, y
(b) un primer y segundo polipéptido que están unidos entre sí por un enlace disulfuro, en el que la molécula de unión a antígeno se caracteriza por que el primer polipéptido comprende la secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en la SEQ iD NO: 5, SEQ ID NO: 97, SEQ ID NO: 98 y SEQ ID NO: 99; y por que el segundo polipéptido comprende la secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en la SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 96, SEQ ID NO: 3 y SEQ ID NO: 4.
En un aspecto particular, la molécula de unión a antígeno que contiene un trímero de ligando de la familia de TNF comprende
(a) al menos un resto que se puede unir específicamente a un antígeno de la célula diana, que comprende una región variable de la cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 201 y una región variable de la cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 202, y
(b) un primer y un segundo polipéptido que están unidos entre sí por un enlace disulfuro, en el que la molécula de unión a antígeno se caracteriza por que el primer polipéptido comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 97 y el segundo polipéptido comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 96.
En otro aspecto, la molécula de unión a antígeno que contiene un trímero de ligando de la familia de TNF comprende
(a) al menos un resto que se puede unir específicamente a un antígeno de la célula diana, que comprende una región variable de la cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 357 y una región variable de la cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 358, y
(b) un primer y segundo polipéptido que están unidos entre sí por un enlace disulfuro, en el que la molécula de unión a antígeno se caracteriza por que el primer polipéptido comprende la secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en la SEQ iD NO: 5, SEQ ID NO: 97, SEQ ID NO: 98 y SEQ ID NO: 99; y por que el segundo polipéptido comprende la secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en la SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 96, SEQ ID NO: 3 y SEQ ID NO: 4.
En un aspecto particular, la molécula de unión a antígeno que contiene un trímero de ligando de la familia de TNF comprende
(a) al menos un resto que se puede unir específicamente a un antígeno de la célula diana, que comprende una región variable de la cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 357 y una región variable de la cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 358, y
(b) un primer y un segundo polipéptido que están unidos entre sí por un enlace disulfuro, en el que la molécula de unión a antígeno se caracteriza por que el primer polipéptido comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 97 y el segundo polipéptido comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 96.
En otro aspecto, se proporciona una molécula de unión a antígeno que contiene un trímero de ligando de la familia de TNF, en el que la molécula de unión a antígeno comprende
una primera cadena pesada y una primera cadena ligera, comprendiendo ambas una molécula Fab que se puede unir específicamente a un antígeno de la célula diana,
una segunda cadena pesada que comprende dos ectodominios de un miembro de la familia de ligandos de TNF o fragmentos del mismo conectados entre sí mediante un primer conector peptídico que se fusiona en su extremo C mediante un segundo conector peptídico con un dominio CH1, y una segunda cadena ligera que comprende un ectodominio de dicho miembro de la familia de ligandos de TNF o un fragmento del mismo se fusiona en su extremo C mediante un tercer conector peptídico con un dominio CL, y en el que la molécula de unión a antígeno comprende
(i) una primera cadena pesada que comprende el dominio VH que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 201 y una primera cadena ligera que comprende el dominio VL que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 202 o
una primera cadena pesada que comprende el dominio VH que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 357 y una primera cadena ligera que comprende el dominio VL que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 358,
(ii) una segunda cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en la SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 108, SEQ ID NO: 111 y SEQ ID NO: 113, y
(iii) una segunda cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 109, SEQ ID NO: 110, SEQ ID NO: 112 y SEQ ID NO: 114.
En otro aspecto particular, se proporciona una molécula de unión a antígeno que contiene un trímero de ligando de la familia de TNF, en el que la molécula de unión a antígeno comprende
una primera cadena pesada y una primera cadena ligera, comprendiendo ambas una molécula Fab que se puede unir específicamente a un antígeno de la célula diana,
una segunda cadena pesada que comprende dos ectodominios de un miembro de la familia de ligandos de TNF o fragmentos del mismo conectados entre sí mediante un primer conector peptídico se fusiona en su extremo C mediante un segundo conector peptídico con un dominio CL, y una segunda cadena ligera que comprende un ectodominio de dicho miembro de la familia de ligandos de TNF o un fragmento del mismo se fusiona en su extremo C mediante un tercer conector peptídico con un dominio CH1, y en el que la molécula comprende
(i) una primera cadena pesada que comprende el dominio VH que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 201 y una primera cadena ligera que comprende el dominio VL que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 202 o
una primera cadena pesada que comprende el dominio VH que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 357 y una primera cadena ligera que comprende el dominio VL que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 358,
(ii) una segunda cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en la SEQ ID NO: 115, SEQ ID NO: 117, SEQ ID NO: 119 y SEQ ID NO: 173, y
(iii) una segunda cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en la SEQ ID NO: 116, SEQ ID NO: 118, SEQ ID NO: 120 y SEQ ID NO: 174.
Además, se proporciona una molécula de unión a antígeno que contiene un trímero de ligando de la familia de TNF que comprende
(a) al menos un resto que se puede unir específicamente a un antígeno de célula diana, y
(b) un primer y un segundo polipéptido que están unidos entre sí por un enlace disulfuro,
en el que la molécula de unión a antígeno se caracteriza por que el primer polipéptido contiene un dominio CH3 y el segundo polipéptido contiene un dominio CH3, respectivamente, y en el que el primer polipéptido comprende dos ectodominios de un miembro de la familia de ligandos de TNF o fragmentos de los mismos que están conectados entre sí y al extremo C del dominio CH3 mediante un conector peptídico y en el que el segundo polipéptido comprende un ectodominio de dicho miembro de la familia de ligandos de TNF o un fragmento del mismo conectado por medio de un conector peptídico al extremo C del dominio CH3 de dicho polipéptido.
En un aspecto particular, dicha molécula de unión a antígeno que contiene un trímero de ligando de la familia de TNF comprende dos restos que se pueden unir específicamente a un antígeno de la célula diana.
Más en particular, la molécula de unión a antígeno que contiene un trímero de ligando de la familia de TNF comprende
(i) una primera cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 209, una segunda cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 210 y dos cadenas ligeras que comprenden la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 206, o
(ii) una primera cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 213, una segunda cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 214 y dos cadenas ligeras que comprenden la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 206, o
(iii) una primera cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 309, una segunda cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 310 y dos cadenas ligeras que comprenden la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 279, o
(iv) una primera cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 313, una segunda cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 314 y dos cadenas ligeras que comprenden la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 279.
En otro aspecto, la invención se refiere a una molécula de unión a antígeno que contiene un trímero de ligando de la familia de TNF, seleccionada del grupo que consiste en:
a) una molécula que comprende una primera cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 205, una primera cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 206, una segunda cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 115 y una segunda cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 116;
b) una molécula que comprende una primera cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 205, una primera cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 206, una segunda cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 117 y una segunda cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 118;
c) una molécula que comprende dos cadenas ligeras que comprenden la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 206, una primera cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 209 y una segunda cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 210;
d) una molécula que comprende una primera cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 205, una primera cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 206, una segunda cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 119 y una segunda cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 120;
e) una molécula que comprende una primera cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 205, una primera cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 206, una segunda cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 173 y una segunda cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 174; y
f) una molécula que comprende dos cadenas ligeras que comprenden la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 206, una primera cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 213 y una segunda cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 214.
En particular, se proporciona una molécula de unión a antígeno que contienen un trímero de ligando de la familia de TNF que comprende una primera cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 205, una primera cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 206, una segunda cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 119 y una segunda cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 120.
En otro aspecto, la divulgación se refiere a una molécula de unión a antígeno que contiene un trímero de ligando de la familia de TNF, seleccionada del grupo que consiste en:
a) una molécula que comprende una primera cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 357, una primera cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 358, una segunda cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 115 y una segunda cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 116;
b) una molécula que comprende una primera cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 357, una primera cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 358, una segunda cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 117 y una segunda cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 118;
c) una molécula que comprende dos cadenas ligeras que comprenden la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 358, una primera cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 209 y una segunda cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 210;
d) una molécula que comprende una primera cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 357, una primera cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 358, una segunda cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 119 y una segunda cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 120;
e) una molécula que comprende una primera cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 357, una primera cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 358, una segunda cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 173 y una segunda cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 174; y
f) una molécula que comprende dos cadenas ligeras que comprenden la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 358, una primera cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 213 y una segunda cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 214.
En particular, se proporciona una molécula de unión a antígeno que contienen un trímero de ligando de la familia de TNF que comprende una primera cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 357, una primera cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 358, una segunda cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 119 y una segunda cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 120.
Polinucleótidos
La divulgación proporciona además polinucleótidos aislados que codifican una molécula de unión a antígeno que contiene un trímero de ligando de la familia de TNF como se describe en el presente documento o un fragmento de la misma.
Los polinucleótidos aislados que codifican moléculas de unión a antígeno que contienen un trímero de ligando de TNF se pueden expresar como un polinucleótido único que codifica toda la molécula de unión a antígeno o como polinucleótidos múltiples (por ejemplo, dos o más) que se coexpresan. Los polipéptidos codificados por polinucleótidos que se coexpresan se pueden asociar a través de, por ejemplo, enlaces disulfuro u otros medios para formar una molécula de unión a antígeno funcional. Por ejemplo, se puede codificar la porción de la cadena ligera de una inmunoglobulina por un polinucleótido separado de la porción de la cadena pesada de inmunoglobulina. Cuando se coexpresan, los polipéptidos de cadena pesada se asociarán con los polipéptidos de cadena ligera para formar la inmunoglobulina.
En algunos aspectos, el polinucleótido aislado codifica toda la molécula de unión a antígeno que contiene un trímero de ligando de la familia de TNF como se describe en el presente documento. En particular, el polinucleótido aislado codifica un polipéptido comprendido en la molécula de unión a antígeno que contiene un trímero de ligando de la familia de TNF como se describe en el presente documento.
En un aspecto, la presente divulgación se dirige a un polinucleótido aislado que codifica una molécula de unión a antígeno que contiene un trímero de ligando de la familia de TNF, en el que el polinucleótido comprende (a) una secuencia que codifica un resto que se puede unir específicamente a un antígeno de la célula diana, (b) una secuencia que codifica un polipéptido que comprende dos ectodominios de un miembro de la familia de ligandos de TNF o dos fragmentos del mismo que están conectados entre sí mediante un conector peptídico y (c) una secuencia que codifica un polipéptido que comprende un ectodominio de dicho miembro de la familia de ligandos de TNF o un fragmento del mismo.
En otro aspecto, se proporciona un polinucleótido aislado que codifica una molécula de unión a antígeno que contiene un trímero de ligando de 4-1BB, en el que el polinucleótido comprende (a) una secuencia que codifica un resto que se puede unir específicamente a un antígeno de la célula diana, (b) una secuencia que codifica un polipéptido que comprende dos ectodominios de 4-1BBL o dos fragmentos del mismo que están conectados entre sí mediante un conector peptídico y (c) una secuencia que codifica un polipéptido que comprende un ectodominio de 4-1BBL o un fragmento del mismo.
En otro aspecto, la invención está dirigida a un polinucleótido aislado que comprende una secuencia que codifica un polipéptido que comprende dos fragmentos de 4-1BBL que comprenden una secuencia de aminoácidos que es al menos aproximadamente un 90 %, 95 %, 98 % o 100 % idéntica a una secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4 o SEQ ID NO: 96, y a un polinucleótido que comprende una secuencia que codifica un polipéptido que comprende un fragmento de 4-1BBL que comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos aproximadamente un 90 %, 95 %, 98 % o 100 % idéntica a una secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4 o SEQ ID NO: 96.
Además, se proporciona un polinucleótido aislado que codifica una molécula de unión a antígeno que contiene un trímero de ligando de OX40, en el que el polinucleótido comprende (a) una secuencia que codifica un resto que se puede unir específicamente a un antígeno de la célula diana, (b) una secuencia que codifica un polipéptido que comprende dos ectodominios de OX40L o dos fragmentos del mismo que están conectados entre sí mediante un conector peptídico y (c) una secuencia que codifica un polipéptido que comprende un ectodominio de OX40L o un fragmento del mismo.
En otro aspecto, se proporciona un polinucleótido aislado que comprende una secuencia que codifica un polipéptido que comprende dos fragmentos de 4-1BBL que comprenden una secuencia de aminoácidos que es al menos aproximadamente un 90 %, 95 %, 98 % o 100 % idéntica a una secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 53 o SEQ ID NO: 54, y a un polinucleótido que comprende una secuencia que codifica un polipéptido que comprende un fragmento de 4-1 b Bl que comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos aproximadamente un 90 %, 95 %, 98 % o 100 % idéntica a una secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 53 o SEQ ID NO: 54.
En otros aspectos, la divulgación se refiere a los polinucleótidos que comprenden una secuencia que es al menos aproximadamente un 90 %, 95 %, 98 % o 100 % idéntica a las secuencias de ADNc específicas divulgadas en el presente documento. En un aspecto particular, la invención se refiere a un polinucleótido que comprende una secuencia que es idéntica a una de las secuencias de ADNc específicas divulgadas en el presente documento.
En otros aspectos, la molécula de ácido nucleico comprende o consiste en una secuencia de nucleótidos que codifica una secuencia de aminoácidos como se establece en una cualquiera de las SEQ ID NO: 5, 6, 97, 98, 99, 183, 184 o 185. En otro aspecto, la molécula de ácido nucleico comprende o consiste en una secuencia de nucleótidos que codifica una secuencia de aminoácidos como se establece en una cualquiera de las SEQ ID NO: 14, 15, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115.116, 117, 118, 119, 120, 173 o 174.
Todavía en otros aspectos, la molécula de ácido nucleico comprende o consiste en una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 66, 67, 68, 69, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 137, 138, 141, 142, 143, 144, 146, 147, 150, 151, 152, 153, 162, 163, 165, 166, 167, 168, 169, 170, 171, 172, 175, 176, 177, 178, 203, 204, 207, 208, 211,212, 215, 216, 273, 274, 277, 278, 281, 282, 285, 286, 289, 290, 293, 294, 297, 298, 301, 302, 305, 307, 308, 311, 312, 315, 316, 331, 332, 335, 336, 339, 340, 343, 344, 347, 348, 353 o 354.
En determinados aspectos, el polinucleótido o ácido nucleico es ADN. En otros modos de realización, un polinucleótido de la presente invención es ARN, por ejemplo, en forma de ARN mensajero (ARNm). El ARN de la presente invención puede ser monocatenario o bicatenario.
Procedimientos recombinantes
Las moléculas de unión a antígeno que contienen un trímero de ligando de la familia de TNF de la invención se pueden obtener, por ejemplo, por síntesis de péptidos en estado sólido (por ejemplo, síntesis en fase sólida de Merrifield) o producción recombinante. Para la producción recombinante, uno o más polinucleótidos que codifican la molécula de unión a antígeno que contiene un trímero de ligando de la familia de TNF o fragmentos polipeptídicos de la misma, por ejemplo, como se describe anteriormente, se aíslan y se insertan en uno o más vectores para clonación y/o expresión adicional en una célula huésped. Dicho polinucleótido se puede aislar y secuenciar fácilmente usando procedimientos convencionales. En un aspecto de la invención, se proporciona un vector, preferentemente un vector de expresión, que comprende uno o más de los polinucleótidos de la invención. Se pueden usar procedimientos que son bien conocidos para los expertos en la técnica para construir vectores de expresión que contienen la secuencia codificante de una molécula de unión a antígeno que contiene un trímero de ligando de la familia de TNF (fragmento) junto con señales de control de transcripción/traducción apropiadas. Estos procedimientos incluyen técnicas de ADN recombinante in vitro, técnicas sintéticas y recombinación/recombinación genética in vivo. Véanse, por ejemplo, las técnicas descritas en Maniatis et al., MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, Cold Spring Harbor Laboratory, N Y. (1989); y Ausubel et al., CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, Greene Publishing Associates and Wiley Interscience, N.Y. (1989). El vector de expresión puede ser parte de un plásmido, virus, o puede ser un fragmento de ácido nucleico. El vector de expresión incluye un casete de expresión en el que el polinucleótido que codifica la molécula de unión a antígeno que contiene un trímero de ligando de la familia de TNF o fragmentos polipeptídicos de la misma (es decir, la región codificante) se clona en asociación funcional con un promotor y/u otros elementos de control de la transcripción o traducción. Como se usa en el presente documento, una "región codificante" es una porción de ácido nucleico que consiste en codones traducidos en aminoácidos. Aunque un "codón de terminación" (TAG, TGA o TAA) no se traduce en un aminoácido, se puede considerar que es parte de una región codificante, si está presente, pero cualquier secuencia flanqueante, por ejemplo promotores, sitios de unión a ribosomas, terminadores transcripcionales, intrones, regiones no traducidas 5' y 3' y similares, no es parte de una región codificante. Dos o más regiones codificantes pueden estar presentes en una única construcción polinucleotídica, por ejemplo, en un único vector, o en construcciones polinucleotídicas separadas, por ejemplo, en vectores separados (diferentes). Además, cualquier vector puede contener una región codificante individual, o puede comprender dos o más regiones codificantes, por ejemplo, un vector puede codificar uno o más polipéptidos, que se separan pos- o cotraduccionalmente en las proteínas finales por medio de escisión proteolítica. Además, un vector, polinucleótido o ácido nucleico de la invención puede codificar regiones codificantes heterógenas, fusionadas o bien no fusionadas a un polinucleótido que codifica la molécula de unión a antígeno que contiene un trímero de ligando de la familia de TNF o fragmentos polipeptídicos del mismo o variantes o derivados del mismo. Las regiones codificantes heterógenas incluyen sin limitación elementos o motivos especializados, tales como un péptido señal secretor o un dominio funcional heterógeno. Una asociación funcional es cuando una región codificante para un producto génico, por ejemplo, un polipéptido, se asocia con una o más secuencias reguladoras de tal forma que sitúa la expresión del producto génico bajo la influencia o control de la(s) secuencia(s) reguladora(s). Dos fragmentos de ADN (tales como una región codificante de polipéptido y un promotor asociado con la misma) se "asocian de forma funcional" si la inducción de la función promotora da como resultado la transcripción de ARNm que codifica el producto génico deseado y si la naturaleza del enlace entre los dos fragmentos de ADN no interfiere con la capacidad de las secuencias reguladoras de la expresión de dirigir la expresión del producto génico ni interfiere con la capacidad del molde de ADN para transcribirse. Por tanto, una región promotora se asociaría de forma funcional con un ácido nucleico que codifica un polipéptido si el promotor puede efectuar la transcripción de ese ácido nucleico. El promotor puede ser un promotor específico de célula que dirige la transcripción sustancial del ADN solo en células predeterminadas. Otros elementos de control de la transcripción, además de un promotor, por ejemplo potenciadores, operadores, represores y señales de finalización de la transcripción, se pueden asociar de forma funcional con el polinucleótido para dirigir la transcripción específica celular.
Los promotores adecuados y otras regiones de control de la transcripción se divulgan en el presente documento. Una variedad de regiones de control de la transcripción son conocidas por los expertos en la técnica. Estas incluyen, sin limitación, regiones de control de la transcripción, que funcionan en células de vertebrado, tales como, pero sin limitarse a, segmentos promotores y potenciadores de citomegalovirus (por ejemplo, el promotor temprano inmediato, conjuntamente con intrón-A), virus de simio 40 (por ejemplo, el promotor temprano) y retrovirus (tales como, por ejemplo, el virus del sarcoma de Rous). Otras regiones de control de la transcripción incluyen las derivadas de genes de vertebrados tales como actina, proteína de choque térmico, hormona del crecimiento bovina y a-globina de conejo, así como otras secuencias que pueden controlar la expresión génica en células eucariotas. Las regiones de control de la transcripción adecuadas adicionales incluyen promotores y potenciadores específicos tisulares, así como promotores inducibles (por ejemplo, promotores inducibles de tetraciclinas). De forma similar, una variedad de elementos de control de la traducción son conocidos por los expertos en la técnica. Estos incluyen, pero no se limitan a sitios de unión a ribosomas, codones de iniciación y finalización de la traducción y elementos derivados de sistemas víricos (en particular un sitio de entrada al ribosoma interno o IRES, también denominado secuencia CITE). El casete de expresión también puede incluir otros rasgos característicos tales como un origen de replicación y/o elementos de integración cromosómica tales como repeticiones terminales largas (LTR) retrovíricas o repeticiones terminales invertidas (ITR) víricas adenoasociadas (Aa V).
Se pueden asociar regiones codificantes de polinucleótidos y ácidos nucleicos de la presente invención con regiones codificantes adicionales que codifican péptidos secretores o señal, que dirigen la secreción de un polipéptido codificado por un polinucleótido de la presente invención. Por ejemplo, si se desea la secreción de la molécula de unión a antígeno que contiene un trímero de ligando de la familia de TNF o fragmentos polipeptídicos de la misma, se puede disponer el ADN que codifica una secuencia de señal corriente arriba del ácido nucleico que codifica una molécula de unión a antígeno que contiene un trímero de ligando de la familia de TNF de la invención o fragmentos polipeptídicos de la misma. De acuerdo con la hipótesis de señal, las proteínas secretadas por células de mamífero tienen un péptido señal o secuencia líder secretora que se escinde de la proteína madura una vez que se ha iniciado la exportación de la cadena de proteína en crecimiento a través del retículo endoplásmico rugoso. Los expertos en la técnica saben que los polipéptidos secretados por células de vertebrado en general tienen un péptido señal fusionado al extremo N del polipéptido, que se escinde del polipéptido traducido para producir una forma secretada o "madura" del polipéptido. En ciertos modos de realización se usa el péptido señalizador natural, p. ej., un péptido señalizador de la cadena pesada o de la cadena ligera de inmunoglobulina, o un derivado funcional de esa secuencia que conserva la capacidad de dirigir la secreción del polipéptido que está operativamente asociado a él. De forma alternativa, se puede usar un péptido señal de mamífero heterógeno, o un derivado funcional del mismo. Por ejemplo, la secuencia líder natural se puede sustituir con la secuencia líder del activador de plasminógeno tisular (TPA) humano o p-glucuronidasa de ratón.
El ADN que codifica una secuencia de proteínas corta que se podría usar para facilitar la purificación posterior (por ejemplo, una marca de histidina) o ayudar en el marcado de la proteína de fusión se puede incluir dentro de o en los extremos del polinucleótido que codifica una molécula de unión a antígeno que contiene un trímero de ligando de la familia de TNF de la invención o fragmentos polipeptídicos de la misma.
En otro aspecto de la invención se proporciona una célula huésped que comprende uno o más polinucleótidos de la invención. En determinados modos de realización se proporciona una célula huésped que comprende uno o más vectores de la invención. Los polinucleótidos y vectores pueden incorporar cualquiera de los rasgos característicos, individualmente o en combinación, descritos en el presente documento en relación con polinucleótidos y vectores, respectivamente. En un aspecto, una célula huésped comprende (por ejemplo, se ha transformado o transfectado con) un vector que comprende un polinucleótido que codifica (parte de) una moléculas de unión a antígeno que contiene un trímero de ligando de la familia de TNF. Como se usa en el presente documento, el término “célula huésped” se refiere a cualquier clase de sistema celular que se pueda genomanipular para generar las proteínas de fusión de la invención o fragmentos de las mismas. Las células huésped adecuadas para replicar y para soportar la expresión de moléculas de unión a antígeno son bien conocidas en la técnica. Dichas células se pueden transfectar o transducir según sea apropiado con el vector de expresión particular y se pueden cultivar grandes cantidades de células que contienen vectores para sembrar fermentadores a gran escala para obtener cantidades suficientes de la molécula de unión a antígeno para aplicaciones clínicas. Las células huésped adecuadas incluyen microorganismos procariotas, tales como E. coli, o diversas células eucariotas, tales como células de ovario de hámster chino (CHO), células de insecto o similares. Por ejemplo, se pueden producir polipéptidos en bacterias, en particular cuando no se necesita glucosilación. Después de la expresión, se puede aislar el polipéptido a partir de la pasta de células bacterianas en una fracción soluble y se puede purificar adicionalmente. Además de procariotas, los microbios eucariotas tales como hongos filamentosos o levaduras son huéspedes de clonación o expresión adecuados para vectores que codifican polipéptidos, incluyendo cepas de hongos y levaduras con vías de glucosilación que se han "humanizado", dando como resultado la producción de un polipéptido con un patrón de glucosilación parcial o completamente humano. Véanse Gerngross, Nat Biotech 22, 1409-1414 (2004), y Li et al., Nat Biotech 24, 210-215 (2006).
Las células huésped adecuadas para la expresión de polipéptidos (glucosilados) también se derivan de organismos multicelulares (invertebrados y vertebrados). Los ejemplos de células de invertebrado incluyen células vegetales y de insecto. Se han identificado numerosas cepas de baculovirus que se pueden usar conjuntamente con células de insecto, en particular para la transfección de células de Spodoptera frugiperda. T ambién se pueden utilizar cultivos de células vegetales como huéspedes. Véanse, por ejemplo, las patentes de EE. UU. n.° 5.959.177, 6.040.498, 6.420.548, 7.125.978 y 6.417.429 (que describen la tecnología PLANTIBODIES™ para producir anticuerpos en plantas transgénicas). También se pueden usar células de vertebrado como huéspedes. Por ejemplo, pueden ser útiles líneas de células de mamífero que se adaptan para el cultivo en suspensión. Otros ejemplos de líneas de células huésped útiles son línea CV1 de riñón de mono transformada por SV40 (COS-7); línea de riñón embrionario humano (células 293 o 293T como se describe, por ejemplo, en Graham et al., J Gen Virol 36, 59 (1977)), células de riñón de cría de hámster (BHK), células de Sertoli de ratón (células TM4 como se describe, por ejemplo, en Mather, Biol Reprod 23, 243-251 (1980)), células de riñón de mono (CV1), células de riñón de mono verde africano (VERO-76), células de carcinoma de cuello uterino humano (HELA), células de riñón canino (MDCK), células de hígado de rata búfalo (BRL3A), células de pulmón humano (W138), células de hígado humano (Hep G2), células de tumor mamario de ratón (MMT 060562), células TRI (como se describe, por ejemplo, en Mather et al., Annals N.Y. Acad Sci 383, 44-68 (1982)), células Mr C-5 y células FS4. Otras líneas de células huésped de mamífero útiles incluyen células de ovario de hámster chino (CHO), incluyendo células CHO-dhfr (Urlaub et al., Proc Natl Acad Sci USA 77, 4216 (1980)); y líneas celulares de mieloma, tales como YO, NS0, P3X63 y Sp2/0. Para una revisión de determinadas líneas de células huésped de mamífero adecuadas para la producción de proteínas, véase, por ejemplo, Yazaki y Wu, Methods in Molecular Biology, vol. 248 (B.K.C. Lo, ed., Humana Press, Totowa, NJ), pp. 255-268 (2003). Las células huésped incluyen células cultivadas, por ejemplo, células cultivadas de mamífero, células de levadura, células de insecto, células bacterianas y células vegetales, por nombrar solo algunas, pero también células comprendidas en un animal transgénico, planta transgénica o tejido animal o vegetal cultivado. En un modo de realización, la célula huésped es una célula eucariota, preferentemente una célula de mamífero, tal como una célula de ovario de hámster chino (CHO), una célula de riñón embrionario humano (HEK) o una célula linfoide (por ejemplo, célula Y0, NS0, Sp20). Las tecnologías estándar son conocidas en la técnica por expresar genes exógenos en estos sistemas. Se pueden genomanipular células que expresen un polipéptido que comprende la cadena pesada o bien la ligera de una inmunoglobulina para que también expresen la otra de las cadenas de inmunoglobulina de tal manera que el producto expresado sea una inmunoglobulina que tenga tanto una cadena pesada como una ligera.
En un aspecto, se proporciona un procedimiento para producir una molécula de unión a antígeno que contiene un trímero de ligando de la familia de TNF o fragmentos polipeptídicos de la misma, en el que el procedimiento comprende cultivar una célula huésped que comprende polinucleótidos que codifican la molécula de unión a antígeno que contiene un trímero de ligando de la familia de TNF de la invención o fragmentos polipeptídicos de la misma, como se proporciona en el presente documento, en condiciones adecuadas para la expresión de la molécula de unión a antígeno que contiene un trímero de ligando de la familia de TNF de la invención o fragmentos polipeptídicos de la misma, y recuperar la molécula de unión a antígeno que contiene un trímero de ligando de la familia de TNF de la invención o fragmentos polipeptídicos de la misma a partir de la célula huésped (o medio de cultivo de la célula huésped).
En la molécula de unión a antígeno que contiene un trímero de ligando de la familia de TNF de la invención, los componentes (al menos un resto que se puede unir específicamente a un antígeno de la célula diana, un polipéptido que comprende dos ectodominios de un miembro de la familia de ligandos de TNF o fragmentos del mismo y un polipéptido que comprende un ectodominio de dicho miembro de la familia de ligandos de la familia de TNF o un fragmento del mismo) no se fusionan genéticamente entre sí. Los polipéptidos se diseñan de modo que sus componentes (dos ectodominios de un miembro de la familia de ligandos de TNF o fragmentos del mismo y otros componentes tales como CH o CL) se fusionan entre sí directamente o a través de una secuencia conectora. La composición y longitud del conector se pueden determinar de acuerdo con procedimientos bien conocidos en la técnica y se pueden someter a prueba para determinar su eficacia. En las secuencias proporcionadas en el presente documento se encuentran ejemplos de secuencias conectoras entre diferentes componentes de las moléculas de unión a antígeno de la invención. Si se desea, también se pueden incluir secuencias adicionales para incorporar un sitio de escisión para separar los componentes individuales de la proteína de fusión, por ejemplo, una secuencia de reconocimiento de endopeptidasas.
En determinados modos de realización, los restos que se pueden unir específicamente a un antígeno de la célula diana (por ejemplo, fragmentos Fab) que forman parte de la molécula de unión a antígeno comprenden al menos una región variable de inmunoglobulina que se puede unir a un antígeno. Las regiones variables pueden formar parte de y derivar de anticuerpos naturales o no naturales y fragmentos de los mismos. Los procedimientos para producir anticuerpos policlonales y anticuerpos monoclonales son bien conocidos en la técnica (véase, por ejemplo Harlow y Lane, "Antibodies, a laboratory manual", Cold Spring Harbor Laboratory, 1988). Los anticuerpos no naturales se pueden construir usando síntesis peptídica en fase sólida, se pueden producir de forma recombinante (por ejemplo como se describe en la patente de EE. UU. n.° 4.186.567) o se pueden obtener, por ejemplo, cribando colecciones combinatorias que comprenden cadenas pesadas variables y cadenas ligeras variables (véase, por ejemplo la patente de EE. UU. n.° 5.969.108 para McCafferty).
Se puede usar cualquier especie animal de inmunoglobulina en la invención. Las inmunoglobulinas no limitantes útiles en la presente invención pueden ser de origen murino, de primate o humano. Si se pretende que la proteína de fusión sea para uso humano, se puede usar una forma quimérica de inmunoglobulina en la que las regiones constantes de la inmunoglobulina sean de un ser humano. También se puede preparar una forma humanizada o completamente humana de la inmunoglobulina de acuerdo con procedimientos bien conocidos en la técnica (véase, por ejemplo, la patente de EE. UU. n.° 5.565.332 concedida a Winter). La humanización se puede lograr por diversos procedimientos incluyendo, pero sin limitarse a (a) injertar las CDR no humanas (por ejemplo, anticuerpo donante) en regiones estructurales y constantes humanas (por ejemplo anticuerpo receptor) con o sin retención de los residuos estructurales críticos (por ejemplo, los que son importantes para conservar buena afinidad de unión a antígeno o funciones de anticuerpo), (b) injertar solo las regiones determinantes de especificidad no humanas (SDR o a-CDR; los residuos críticos para la interacción anticuerpo-antígeno) en regiones estructurales y constantes humanas, o (c) trasplantar todos los dominios variables no humanos, pero "enmascararlos" con una sección similar a humana por reemplazo de residuos de superficie. Los anticuerpos humanizados y procedimientos para prepararlos se revisan, por ejemplo, en Almagro y Fransson, Front Biosci 13, 1619-1633 (2008), y se describen además, por ejemplo, en Riechmann et al., Nature 332, 323-329 (1988); Queen et al., Proc Natl Acad Sci USA 86, 10029-10033 (1989); patentes de EE. UU. n.° 5.821.337, 7.527.791,6.982.321 y 7.087.409; Jones et al., Nature 321, 522-525 (1986); Morrison et al., Proc Natl Acad Sci 81, 6851-6855 (1984); Morrison y Oi, Adv Immunol 44, 65-92 (1988); Verhoeyen et al., Science 239, 1534-1536 (1988); Padlan, Molec Immun 31(3), 169-217 (1994); Kashmiri et al., Methods 36, 25-34 (2005) (que describen un injerto de SDR (a-CDR)); Padlan, Mol Immunol 28, 489-498 (1991) (que describe el "rebarnizado"); Dall'Acqua et al., Methods 36, 43-60 (2005) (que describe el "reordenamiento de FR"); y Osbourn et al., Methods 36, 61-68 (2005) y Klimka et al., Br J Cancer 83, 252-260 (2000) (que describe el enfoque de "selección guiada" al reordenamiento de FR). Las inmunoglobulinas particulares de acuerdo con la invención son inmunoglobulinas humanas. Los anticuerpos humanos y regiones variables humanas se pueden producir usando diversas técnicas conocidas en la técnica. Los anticuerpos humanos se describen en general en van Dijk y van de Winkel, Curr Opin Pharmacol 5, 368-74 (2001) y Lonberg, Curr Opin Immunol 20, 450-459 (2008). Las regiones variables humanas pueden formar parte de y derivar de anticuerpos monoclonales humanos preparados por el procedimiento de hibridoma (véase, por ejemplo, Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, pp. 51-63 (Marcel Dekker, Inc., New York, 1987)). T ambién se pueden preparar anticuerpos humanos y regiones variables humanas administrando un inmunógeno a un animal transgénico que se ha modificado para producir anticuerpos humanos inalterados o anticuerpos inalterados con regiones variables humanas en respuesta a una exposición antigénica (véase, por ejemplo, Lonberg, Nat Biotech 23, 1117-1125 (2005)). También se pueden generar anticuerpos humanos y regiones variables humanas aislando secuencias de regiones variables de clones de Fv seleccionadas de colecciones de presentación en fagos derivadas de humano (véase, por ejemplo, Hoogenboom et al. en Methods in Molecular Biology 178, 1-37 (O'Brien et al., ed., Human Press, Totowa, NJ, 2001); y McCafferty et al., Nature 348, 552-554; Clackson et al., Nature 352, 624-628 (1991)). Típicamente, los fagos presentan fragmentos de anticuerpo, como fragmentos Fv monocatenarios (scFv) o bien como fragmentos Fab.
En determinados aspectos, los restos que se pueden unir específicamente a un antígeno de la célula diana (por ejemplo, fragmentos Fab) comprendidos en las moléculas de unión a antígeno de la presente invención se genomanipulan para que tengan una afinidad de unión potenciada de acuerdo con, por ejemplo, los procedimientos divulgados en la publicación PCT WO 2012/020006 (véanse los ejemplos relacionados con la maduración de la afinidad) o la publicación de solicitud de patente de EE. UU. n.° 2004/0132066. Se puede medir la capacidad de las moléculas de unión a antígeno de la invención para unirse a un determinante antigénico específico a través de un ensayo de inmunoadsorción enzimática (ELISA) o bien a través de otras técnicas conocidas por un experto en la técnica, por ejemplo, la técnica de resonancia de plasmón superficial (Liljeblad, et al., Glyco J 17, 323-329 (2000)) y ensayos de unión tradicionales (Heeley, Endocr Res 28, 217-229 (2002)). Se pueden usar ensayos de competencia para identificar una molécula de unión a antígeno que compite con un anticuerpo de referencia por su unión a un antígeno particular. En determinados modos de realización, dicha molécula de unión a antígeno competidora se une al mismo epítopo (por ejemplo, un epítopo lineal o uno conformacional) al que se une la molécula de unión a antígeno de referencia. Se proporcionan procedimientos ejemplares detallados para mapear un epítopo al que se une una molécula de unión a antígeno en Morris (1996) "Epitope Mapping Protocols", en Methods en Molecular Biology vol. 66 (Humana Press, Totowa, NJ). En un ensayo de competencia ejemplar, se incuba antígeno inmovilizado en una solución que comprende una primera molécula de unión a antígeno marcada que se une al antígeno y una segunda molécula de unión a antígeno no marcada que se somete a prueba para determinar su capacidad de competir con la primera molécula de unión a antígeno por su unión al antígeno. La segunda molécula de unión a antígeno puede estar presente en un sobrenadante de hibridoma. Como control, se incuba antígeno inmovilizado en una solución que comprende la primera molécula de unión a antígeno marcada, pero no la segunda molécula de unión a antígeno no marcada. Después de la incubación en condiciones permisivas para la unión del primer anticuerpo al antígeno, se retira el exceso de anticuerpo no unido, y se mide la cantidad de marcador asociado con el antígeno inmovilizado. Si la cantidad de marcador asociado con el antígeno inmovilizado se reduce sustancialmente en la muestra de prueba con respecto a la muestra de control, entonces eso indica que la segunda molécula de unión a antígeno está compitiendo con la primera molécula de unión a antígeno por su unión al antígeno. Véase Harlow y Lane (1988) Antibodies: A Laboratory Manual cap.14 (Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY).
Las moléculas de unión a antígeno que contienen un trímero de ligando de TNF de la invención preparadas como se describe en el presente documento se pueden purificar por técnicas conocidas en la técnica tales como cromatografía de líquidos de alto rendimiento, cromatografía de intercambio iónico, electroforesis en gel, cromatografía de afinidad, cromatografía de exclusión por tamaño, y similares. Las condiciones reales usadas para purificar una proteína particular dependerán, en parte, de factores tales como carga neta, hidrofobia, hidrofilia, etc., y serán evidentes para los expertos en la técnica. Para la purificación por cromatografía de afinidad, se puede usar un anticuerpo, ligando, receptor o antígeno al que se une la molécula de unión a antígeno que contiene un trímero de ligando de TNF. Por ejemplo, para la purificación mediante cromatografía de afinidad de las proteínas de fusión de la invención, se puede usar una matriz con proteína A o proteína G. Se pueden usar la cromatografía de afinidad con proteína A o G y la cromatografía de exclusión por tamaño secuenciales para aislar una molécula de unión a antígeno esencialmente como se describe en los ejemplos. Se puede determinar la pureza de la molécula de unión a antígeno que contiene un trímero de ligando de TNF o fragmentos de la misma mediante cualquiera de una variedad de procedimientos analíticos bien conocidos, que incluyen electroforesis en gel, cromatografía de líquidos de alta presión y similares. Por ejemplo, se demostró que las moléculas de unión a antígeno que contienen un trímero de ligando de TNF, expresadas como se describe en los ejemplos, estaban intactas y apropiadamente ensambladas como se demuestra mediante SDS-PAGE reductora y no reductora.
Ensayos
Las moléculas de unión a antígeno proporcionadas en el presente documento se pueden identificar, cribar o caracterizar por sus propiedades físicas/químicas y/o sus actividades biológicas mediante diversos ensayos conocidos en la técnica.
1. Ensayos de afinidad
La afinidad de la molécula de unión a antígeno que contiene un trímero de ligando de la familia de TNF proporcionada en el presente documento por el correspondiente receptor se puede determinar de acuerdo con los procedimientos expuestos en los ejemplos mediante resonancia de plasmón superficial (SPR), usando instrumentación estándar tal como un instrumento BIAcore (GE Healthcare) y receptores o proteínas diana tales como los que se pueden obtener por expresión recombinante. La afinidad de la molécula de unión a antígeno que contiene un trímero de ligando de la familia de TNF por el antígeno de la célula diana se puede determinar también mediante resonancia de plasmón superficial (SPR), usando instrumentación estándar tal como un instrumento BIAcore (GE Healthcare) y receptores o proteínas diana tales como los que se pueden obtener por expresión recombinante. En el ejemplo 4 se describe un modo de realización ilustrativo y ejemplar específico para medir la afinidad de unión. De acuerdo con un aspecto, se mide KD por resonancia de plasmón superficial usando una máquina BIACORE® T100 (GE Healthcare) a 25 °C.
2. Ensayos de unión y otros ensayos
La unión de la molécula de unión a antígeno que contiene un trímero de ligando de la familia de TNF proporcionada en el presente documento a las células que expresan el receptor correspondiente se puede evaluar usando líneas celulares que expresan el receptor particular o el antígeno diana, por ejemplo, mediante citometría de flujo (FACS). En un aspecto, en el ensayo de unión se usan células mononucleares de sangre periférica (PBMC) frescas que expresan el receptor de TNF. Estas células se usan directamente después del aislamiento (PMBC indiferenciadas) o después de la estimulación (PMBC activadas). En otro aspecto, se usaron esplenocitos de ratón activados (que expresan la molécula receptora de TNF) para demostrar la unión de la molécula de unión a antígeno que contiene un trímero de ligando de la familia de TNF a las células que expresan el receptor de TNF correspondiente.
En otro aspecto, se usaron líneas de células cancerosas que expresan el antígeno de la célula diana para demostrar la unión de las moléculas de unión a antígeno al antígeno de la célula diana.
En otro aspecto, los ensayos de competición se pueden usar para identificar una molécula de unión a antígeno que compite con un anticuerpo específico o molécula de unión a antígeno por unirse a la diana o al receptor de TNF, respectivamente. En determinados modos de realización, dicha molécula de unión a antígeno competidora se une al mismo epítopo (por ejemplo, un epítopo lineal o conformacional) que está unido por un anticuerpo específico anti-diana o un anticuerpo específico del receptor anti-TNF. Se proporcionan procedimientos ejemplares detallados para cartografiar un epítopo al que se une un anticuerpo en Morris (1996) "Epitope Mapping Protocols", en Methods in Molecular Biology vol. 66 (Humana Press, Totowa, NJ).
3. Ensayos de actividad
En un aspecto, se proporcionan ensayos para identificar moléculas de unión a antígeno que contienen un trímero de ligando de la familia DE TNF que se unen a un antígeno específico de la célula diana y a un receptor de TNF específico que tiene actividad biológica. La actividad biológica puede incluir, por ejemplo, señalización agonista a través del receptor de TNF en células que expresan el antígeno de la célula diana. También se proporcionan moléculas de unión a antígeno que contienen trímeroS de ligandoS de la familia de TNF identificadas por los ensayos por tener dicha actividad biológica in vitro.
En determinados aspectos, una molécula de unión a antígeno que contiene un trímero de ligando de la familia de TNF se somete a prueba para determinar dicha actividad biológica. Los ensayos para detectar la actividad biológica de las moléculas de la invención son los descritos en el ejemplo 6. Además, los ensayos para detectar la lisis celular (por ejemplo, mediante medición de la liberación de LDH), la cinética de la apoptosis inducida (por ejemplo, mediante la medición de la actividad de la caspasa 3/7) o la apoptosis (por ejemplo, usando el ensayo de TUNEL) son bien conocidos en la técnica. Además, la actividad biológica de dichos complejos se puede evaluar evaluando sus efectos sobre la supervivencia, la proliferación y la secreción de linfocinas de diversos subconjuntos de linfocitos, tales como linfocitos NK, linfocitos NKT o linfocitos T y§ o evaluando su capacidad para modular el fenotipo y la función del antígeno que presentan células, tales como células dendríticas, monocitos/macrófagos o linfocitos B.
Composiciones farmacéuticas, formulaciones y vías de administración
En otro aspecto, la invención proporciona composiciones farmacéuticas que comprenden cualquiera de las moléculas de unión a antígeno que contienen un trímero de ligando de la familia de TNF proporcionadas en el presente documento, por ejemplo, para su uso en cualquiera de los procedimientos terapéuticos a continuación. En un modo de realización, una composición farmacéutica comprende cualquiera de las moléculas de unión a antígeno que contienen un trímero de ligando de la familia de TNF proporcionadas en el presente documento y al menos un excipiente farmacéuticamente aceptable. En otro modo de realización, una composición farmacéutica comprende cualquiera de las moléculas de unión a antígeno que contienen un trímero de ligando de la familia de TNF proporcionadas en el presente documento y al menos un agente terapéutico adicional, por ejemplo, como se describe a continuación.
Las composiciones farmacéuticas comprenden una cantidad terapéuticamente eficaz de una o más moléculas de unión a antígeno que contienen un trímero de ligando de la familia de TNF disueltas o dispersadas en un excipiente farmacéuticamente aceptable. La expresión "farmacéutica o farmacológicamente aceptable" se refiere a entidades moleculares y composiciones que son en general no tóxicas para los receptores en las dosificaciones y concentraciones empleadas, es decir no producen una reacción adversa, alérgica u otra reacción indeseable cuando se administra a un animal, tal como, por ejemplo, un ser humano, según sea apropiado. La preparación de una composición farmacéutica que contiene al menos una molécula de unión a antígeno que contiene un trímero de ligando de la familia de TNF y opcionalmente un ingrediente activo adicional serán conocidos para el experto en la técnica en vista de la presente divulgación, como se ejemplifica por Remington's Pharmaceutical Sciences, 18.a ed. Mack Printing Company, 1990, incorporada en el presente documento por referencia. En particular, las composiciones son formulaciones liofilizadas o soluciones acuosas. Como se usa en el presente documento, "excipiente farmacéuticamente aceptable" incluye todos y cada uno de los disolventes, tampones, medios de dispersión, recubrimientos, tensioactivos, antioxidantes, conservantes (por ejemplo, agentes antibacterianos, agentes antifúngicos), agentes isotónicos, sales, estabilizadores y combinaciones de los mismos, como sería conocido para un experto en la técnica.
Las composiciones parenterales incluyen las diseñadas para administración por inyección, por ejemplo, inyección subcutánea, intradérmica, intralesional, intravenosa, intraarterial, intramuscular, intratecal o intraperitoneal. Para inyección, las moléculas de unión a antígeno que contienen un trímero de ligando de la familia de TNF de la invención se pueden formular en soluciones acuosas, preferentemente en tampones fisiológicamente compatibles tales como solución de Hank, solución de Ringer o tampón salino fisiológico. La solución puede contener agentes de formulación tales como agentes de suspensión, estabilización y/o dispersión. De forma alternativa, las proteínas de fusión pueden estar en forma de polvo para su constitución con un vehículo adecuado, por ejemplo, agua estéril libre de pirógenos, antes de su uso. Se preparan soluciones inyectables estériles incorporando las proteínas de fusión de la invención en la cantidad requerida en el disolvente apropiado con varios de los demás ingredientes enumerados a continuación, según se requiera. La esterilidad se puede conseguir fácilmente, por ejemplo, por filtración a través de membranas de filtración estériles. En general, se preparan dispersiones incorporando los diversos ingredientes activos esterilizados en un vehículo estéril que contiene el medio de dispersión básico y/o los otros ingredientes. En el caso de polvos estériles para la preparación de soluciones, suspensiones o emulsiones inyectables estériles, los procedimientos preferentes de preparación son técnicas de secado al vacío o liofilización que proporcionan un polvo del ingrediente activo más cualquier ingrediente deseado adicional de un medio líquido previamente filtrado estéril del mismo. El medio líquido se debe tamponar adecuadamente si es necesario y el diluyente líquido se debe volver isotónico en primer lugar antes de la inyección con solución salina o glucosa suficiente. La composición debe ser estable en las condiciones de fabricación y almacenamiento, y conservarse frente a la acción contaminante de microorganismos, tales como bacterias y hongos. Se apreciará que la contaminación por endotoxinas se debe mantener al mínimo hasta un nivel seguro, por ejemplo, menos de 0,5 ng/mg de proteína. Los excipientes farmacéuticamente aceptables adecuados incluyen, pero no se limitan a: tampones tales como fosfato, citrato y otros ácidos orgánicos; antioxidantes incluyendo ácido ascórbico y metionina; conservantes (tales como cloruro de octadecildimetilbencilamonio; cloruro de hexametonio; cloruro de benzalconio; cloruro de bencetonio; fenol, alcohol butílico o bencílico; alquilparabenos tales como metil o propilparabeno; catecol; resorcinol; ciclohexanol; 3-pentanol; y m-cresol); polipéptidos de bajo peso molecular (menos de aproximadamente 10 residuos); proteínas, tales como seroalbúmina, gelatina o inmunoglobulinas; polímeros hidrófilos tales como polivinilpirrolidona; aminoácidos tales como glicina, glutamina, asparagina, histidina, arginina o lisina; monosacáridos, disacáridos y otros carbohidratos incluyendo glucosa, manosa o dextrinas; agentes quelantes tales como EDTA; glúcidos tales como sacarosa, manitol, trehalosa o sorbitol; contraiones formadores de sales tales como sodio; complejos metálicos (por ejemplo, complejos Zn-proteína); y/o tensioactivos no iónicos tales como polietilenglicol (PEG). Las suspensiones inyectables acuosas pueden contener compuestos que incrementan la viscosidad de la suspensión, tales como carboximetilcelulosa de sodio, sorbitol, dextrano, o similares. Opcionalmente, la suspensión también puede contener estabilizantes o agentes adecuados que incrementan la solubilidad de los compuestos para permitir la preparación de soluciones altamente concentradas. Adicionalmente, se pueden preparar suspensiones de los compuestos activos como suspensiones inyectables oleosas apropiadas. Los disolventes o vehículos lipófilos adecuados incluyen aceites grasos tales como aceite de sésamo, o ésteres de ácidos grasos sintéticos, tales como oleatos de etilo o triglicéridos, o liposomas.
Se pueden atrapar ingredientes activos en microcápsulas preparadas, por ejemplo, por técnicas de coacervación o por polimerización interfacial, por ejemplo, microcápsulas de hidroximetilcelulosa o gelatina y microcápsulas de poli(metacrilato de metilo), respectivamente, en sistemas de suministro de fármaco coloidales (por ejemplo, liposomas, microesferas de albúmina, microemulsiones, nanopartículas y nanocápsulas) o en macroemulsiones. Dichas técnicas se divulgan en Remington's Pharmaceutical Sciences (18,a ed. Mack Printing Company, 1990). Se pueden preparar preparaciones de liberación mantenida. Los ejemplos adecuados de preparaciones de liberación mantenida incluyen matrices semipermeables de polímeros hidrófobos sólidos que contienen el polipéptido, matrices que están en forma de artículos conformados, por ejemplo, películas o microcápsulas. En modos de realización particulares, la absorción prolongada de una composición inyectable se puede conseguir por el uso en las composiciones de agentes retardantes de la absorción, tales como, por ejemplo, monoestearato de aluminio, gelatina o combinaciones de los mismos.
Los excipientes farmacéuticamente aceptables ejemplares del presente documento incluyen, además, agentes de dispersión intersticial del fármaco, tales como glucoproteínas de hialuronidasa neutra-activa soluble (sHASEGP), por ejemplo, glucoproteínas de hialuronidasa PH-20 soluble humana, tales como rHuPH20 (HYLENEX®, Baxter International, Inc.). Determinadas sHASEGP ejemplares y procedimientos de uso, incluyendo rHuPH20, se describen en las publicaciones de patente de EE. UU. n.° 2005/0260186 y 2006/0104968. En un aspecto, una sHASEGP se combina con una o más glucosaminoglucanasas adicionales tales como condroitinasas.
Se describen formulaciones de anticuerpos liofilizadas ejemplares en la patente de EE. UU. n.° 6.267.958. Las formulaciones de anticuerpos acuosas incluyen las descritas en la patente de EE. UU. n.° 6.171.586 y en el documento WO2006/044908, incluyendo estas últimas formulaciones un tampón acetato-histidina.
Además de las composiciones descritas previamente, las proteínas de fusión también se pueden formular como una preparación de liberación lenta. Dichas formulaciones de acción prolongada se pueden administrar por implantación (por ejemplo, por vía subcutánea o intramuscular) o por inyección intramuscular. Por tanto, por ejemplo, las proteínas de fusión se pueden formular con materiales poliméricos o hidrófobos adecuados (por ejemplo, como emulsión en un aceite aceptable) o resinas de intercambio iónico, o como derivados escasamente solubles, por ejemplo, como una sal escasamente soluble.
Las composiciones farmacéuticas que comprenden las proteínas de fusión de la invención se pueden fabricar por medio de procedimientos convencionales de mezclado, disolución, emulsión, encapsulación, atrapamiento o liofilización. Las composiciones farmacéuticas se pueden formular de manera convencional usando uno o más vehículos, diluyentes, excipientes o coadyuvantes fisiológicamente aceptables que facilitan el procesamiento de las proteínas en preparaciones que se pueden usar farmacéuticamente. La formulación apropiada depende de la vía de administración elegida.
Las moléculas de unión a antígeno que contienen un trímero de ligando de la familia de TNF se pueden formular en una composición en forma de ácido o base libre, neutra o salina. Las sales farmacéuticamente aceptables son sales que conservan sustancialmente la actividad biológica del ácido o base libre. Estas incluyen las sales de adición de ácido, por ejemplo, las formadas con los grupos amino libres de una composición proteica, o que se forman con ácidos inorgánicos tales como, por ejemplo, los ácidos clorhídrico o fosfórico, o dichos ácidos orgánicos como ácido acético, oxálico, tartárico o mandélico. Las sales formadas con los grupos carboxilo libres también se pueden derivar de bases inorgánicas tales como, por ejemplo, hidróxidos de sodio, potasio, amonio, calcio o férrico; o dichas bases orgánicas como isopropilamina, trimetilamina, histidina o procaína. Las sales farmacéuticas tienden a ser más solubles en disolventes acuosos y otros disolventes próticos que las correspondientes formas de base libre.
La composición en el presente documento también puede contener más de un ingrediente activo según sea necesario para la indicación particular que se está tratando, preferentemente aquellos con actividades complementarias que no se vean afectadas de forma adversa entre sí. Dichos ingredientes activos están presentes adecuadamente en combinación en cantidades que son eficaces para el propósito pretendido.
Las formulaciones que se van a usar para la administración in vivo son, en general, estériles. La esterilidad se puede conseguir fácilmente, por ejemplo, por filtración a través de membranas de filtración estériles.
Procedimientos y composiciones terapéuticos
Se puede usar cualquiera de las moléculas de unión a antígeno que contienen un trímero de ligando de la familia de TNF proporcionadas en el presente documento en procedimientos terapéuticos.
Para su uso en procedimientos terapéuticos, las moléculas de unión a antígeno que contienen un trímero de ligando de la familia de TNF de la invención se pueden formular, dosificar y administrar de una manera consecuente con una buena práctica médica. Los factores que se deben tener en consideración en este contexto incluyen el trastorno particular que se está tratando, el mamífero particular que se está tratando, el estado clínico del paciente individual, la causa del trastorno, el sitio de administración del agente, el procedimiento de administración, la programación de la administración y otros factores conocidos por los médicos.
En un aspecto, se proporcionan moléculas de unión a antígeno que contienen un trímero de ligando de la familia de TNF para su uso como medicamento. En otros aspectos, se proporcionan moléculas de unión a antígeno que contienen un trímero de ligando de la familia de TNF para su uso en el tratamiento de una enfermedad, en particular para su uso en el tratamiento del cáncer. En determinados aspectos, se proporcionan moléculas de unión a antígeno que contienen un trímero de ligando de la familia de TNF para su uso en un procedimiento de tratamiento. En un aspecto, la divulgación proporciona una molécula de unión a antígeno que contiene un trímero de ligando de la familia de TNF como se describe en el presente documento para su uso en el tratamiento de una enfermedad en un individuo que necesita el mismo. En determinados aspectos, la enfermedad que se va a tratar es cáncer. Ejemplos de cánceres incluyen tumores sólidos, cáncer de vejiga, carcinoma de células renales, cáncer de cerebro, cáncer de cabeza y cuello, cáncer de páncreas, cáncer de pulmón, cáncer de mama, cáncer de ovario, cáncer de útero, cáncer de cuello uterino, cáncer de endometrio, cáncer de esófago, cáncer de colon, cáncer colorrectal, cáncer rectal, cáncer gástrico, cáncer de próstata, cáncer de sangre, cáncer de piel, carcinoma de células escamosas, cáncer de hueso y cáncer de riñón, melanoma, linfoma de linfocitos B, leucemia de linfocitos B, linfoma no Hodgkin y leucemia linfocítica aguda. Por tanto, se proporciona una molécula de unión a antígeno que contiene un trímero de ligando de la familia de TNF como se describe en el presente documento para su uso en el tratamiento del cáncer. El sujeto, paciente o "individuo" que necesita tratamiento es típicamente un mamífero, más específicamente un ser humano.
En otro aspecto, se proporciona una molécula de unión a antígeno que contiene un trímero de ligando de la familia de TNF como se describe en el presente documento para su uso en el tratamiento de enfermedades infecciosas, en particular para el tratamiento de infecciones virales. En otro aspecto, se proporciona una molécula de unión a antígeno que contiene un trímero de ligando de la familia de TNF como se describe en el presente documento para su uso en el tratamiento de enfermedades autoinmunitarias tales como, por ejemplo, la enfermedad del lupus.
En otro aspecto, la invención se refiere al uso de una molécula de unión a antígeno que contiene un trímero de ligando de la familia de TNF en la fabricación o preparación de un medicamento para el tratamiento de una enfermedad en un individuo que necesite el mismo. En un aspecto, el medicamento es para su uso en un procedimiento de tratamiento de una enfermedad que comprende administrar a un individuo que tiene la enfermedad una cantidad terapéuticamente eficaz del medicamento. En determinados modos de realización, la enfermedad que se va a tratar es un trastorno proliferativo, en particular cáncer. Por tanto, en un aspecto, la invención se refiere al uso de una molécula de unión a antígeno que contiene un trímero de ligando de la familia de TNF de la invención en la fabricación o preparación de un medicamento para el tratamiento del cáncer. Ejemplos de cánceres incluyen tumores sólidos, cáncer de vejiga, carcinoma de células renales, cáncer de cerebro, cáncer de cabeza y cuello, cáncer de páncreas, cáncer de pulmón, cáncer de mama, cáncer de ovario, cáncer de útero, cáncer de cuello uterino, cáncer de endometrio, cáncer de esófago, cáncer de colon, cáncer colorrectal, cáncer rectal, cáncer gástrico, cáncer de próstata, cáncer de sangre, cáncer de piel, carcinoma de células escamosas, cáncer de hueso y cáncer de riñón, melanoma, linfoma de células B, leucemia de células B, linfoma no Hodgkin y leucemia linfocítica aguda. Un experto en la técnica puede reconocer fácilmente que en muchos casos la molécula de unión a antígeno que contiene un trímero de ligando de la familia de TNF puede no proporcionar una cura sino que solo proporciona un beneficio parcial. En algunos aspectos, un cambio fisiológico que tiene algo de beneficio también se considera terapéuticamente beneficioso. Por tanto, en algunos aspectos, una cantidad de molécula de unión a antígeno que contiene un trímero de ligando de la familia de TNF que proporciona un cambio fisiológico se considera una "cantidad eficaz" o una "cantidad terapéuticamente eficaz".
En otro aspecto, la divulgación se refiere al uso de una molécula de unión a antígeno que contiene un trímero de ligando de la familia de TNF como se describe en el presente documento en la fabricación o preparación de un medicamento para el tratamiento de enfermedades infecciosas, en particular para el tratamiento de infecciones virales o para el tratamiento de enfermedades autoinmunitarias, por ejemplo, la enfermedad del lupus.
Para la prevención o tratamiento de la enfermedad, la dosificación apropiada de una molécula de unión a antígeno que contiene un trímero de ligando de la familia de TNF (cuando se usa sola o en combinación con uno o más de otros agentes terapéuticos adicionales) dependerá del tipo de enfermedad que se va a tratar, la vía de administración, el peso corporal del paciente, el tipo de proteína de fusión, la gravedad y la evolución de la enfermedad, si la proteína de fusión se administra con propósitos preventivos o terapéuticos, las intervenciones terapéuticas previas o simultáneas, la anamnesis del paciente y la respuesta a la proteína de fusión, y el criterio del médico especialista. El profesional responsable para su administración determinará, en cualquier caso, la concentración del/de los ingrediente(s) activo(s) en una composición y la(s) dosis apropiada(s) para el sujeto individual. En el presente documento se contemplan diversas pautas de dosificación incluyendo, pero sin limitarse a, administraciones individuales o múltiples durante diversos puntos temporales, administración en bolo e infusión pulsada.
La molécula de unión a antígeno que contiene un trímero de ligando de la familia de TNF se administra de forma adecuada al paciente de una vez o durante una serie de tratamientos. Dependiendo del tipo y gravedad de la enfermedad, aproximadamente de 1 pg/kg a 15 mg/kg (por ejemplo, 0,1 mg/kg - 10 mg/kg) de la molécula de unión a antígeno que contiene un trímero de ligando de la familia de TNF puede ser una dosificación candidata inicial para la administración al paciente, ya sea, por ejemplo, por una o más administraciones separadas, o por infusión continua. Una dosificación diaria típica podría variar de aproximadamente 1 pg/kg a 100 mg/kg o más, dependiendo de los factores mencionados anteriormente. Para administraciones repetidas durante varios días o más, dependiendo de la afección, el tratamiento en general se mantendría hasta que se produzca una supresión deseada de los síntomas de enfermedad. Una dosificación ejemplar de la proteína de fusión estaría en el intervalo desde aproximadamente 0.005 mg/kg a aproximadamente 10 mg/kg. En otros ejemplos, una dosis también puede comprender desde aproximadamente 1 pg/kg de peso corporal, aproximadamente 5 pg/kg de peso corporal, aproximadamente 10 pg/kg de peso corporal, aproximadamente 50 pg/kg de peso corporal, aproximadamente 100 pg/kg de peso corporal, aproximadamente 200 pg/kg de peso corporal, aproximadamente 350 pg/kg de peso corporal, aproximadamente 500 pg/kg de peso corporal, aproximadamente 1 mg/kg de peso corporal, aproximadamente 5 mg/kg de peso corporal, aproximadamente 10 mg/kg de peso corporal, aproximadamente 50 mg/kg de peso corporal, aproximadamente 100 mg/kg de peso corporal, aproximadamente 200 mg/kg de peso corporal, aproximadamente 350 mg/kg de peso corporal, aproximadamente 500 mg/kg de peso corporal, a aproximadamente 1000 mg/kg de peso corporal o más por administración y cualquier intervalo derivable en los mismos. En ejemplos de un intervalo derivable de los números enumerados en el presente documento, se puede administrar un intervalo de aproximadamente 5 mg/kg de peso corporal a aproximadamente 100 mg/kg de peso corporal, de aproximadamente 5 pg/kg de peso corporal a aproximadamente 500 mg/kg de peso corporal, etc., en base a los números descritos anteriormente. Por tanto, se pueden administrar al paciente una o más dosis de aproximadamente 0,5 mg/kg, 2,0 mg/kg, 5,0 mg/kg o 10 mg/kg (o cualquier combinación de las mismas). Se pueden administrar intermitentemente dichas dosis, por ejemplo, cada semana o cada tres semanas (por ejemplo, de tal manera que el paciente reciba desde aproximadamente dos a aproximadamente veinte, o, por ejemplo, aproximadamente seis dosis de la proteína de fusión). Se puede administrar una dosis de carga mayor inicial, seguido de una o más dosis menores. Sin embargo, pueden ser útiles otras pautas de dosificación. La progresión de este tratamiento se sigue fácilmente por técnicas y ensayos convencionales.
Las moléculas de unión a antígeno que contienen un trímero de ligando de la familia de TNF se usarán en general en una cantidad eficaz para lograr el propósito previsto. Para su uso para tratar o prevenir un estado de enfermedad, las moléculas de unión a antígeno que contienen un trímero de ligando de la familia de TNF o composiciones farmacéuticas de las mismas, se administran o se aplican en una cantidad terapéuticamente eficaz. La determinación de una cantidad terapéuticamente eficaz está dentro de las capacidades de los expertos en la técnica, en especial en vista de la divulgación detallada proporcionada en el presente documento.
Para la administración sistémica, se puede estimar inicialmente una dosis terapéuticamente eficaz a partir de ensayos in vitro, tales como ensayos de cultivo celular. A continuación se puede formular una dosis en modelos animales para lograr un intervalo de concentración en circulación que incluye la CI50 como se determina en cultivo celular. Se puede usar dicha información para determinar con más exactitud dosis útiles en seres humanos.
También se pueden estimar dosificaciones iniciales a partir de datos in vivo, por ejemplo, modelos animales, usando técnicas que son bien conocidas en la técnica. Un experto en la técnica podría optimizar fácilmente la administración a seres humanos en base a los datos en animales.
La cantidad e intervalo de dosificación se pueden ajustar individualmente para proporcionar niveles plasmáticos de las moléculas de unión a antígeno que contienen un trímero de ligando de la familia de TNF que sean suficientes para mantener un efecto terapéutico. Las dosificaciones de paciente habituales para administración por inyección varían de aproximadamente 0,1 a 50 mg/kg/día, típicamente de aproximadamente 0,5 a 1 mg/kg/día. Se pueden lograr niveles plasmáticos terapéuticamente eficaces administrando dosis múltiples cada día. Los niveles en plasma se pueden medir, por ejemplo, por HPLC.
En los casos de administración local o captación selectiva, la concentración local eficaz de las moléculas de unión a antígeno que contienen un trímero de ligando de la familia de TNF puede no estar relacionada con la concentración plasmática. Un experto en la técnica podrá optimizar dosificaciones locales terapéuticamente eficaces sin experimentación excesiva.
Una dosis terapéuticamente eficaz de las moléculas de unión a antígeno que contienen un trímero de ligando de la familia de TNF descritas en el presente documento proporcionará en general beneficio terapéutico sin provocar toxicidad sustancial. Se pueden determinar la toxicidad y la eficacia terapéutica de una proteína de fusión mediante procedimientos farmacéuticos estándar en cultivos de células o en animales de experimentación. Se pueden usar ensayos de cultivo celular y estudios en animales para determinar la DL50 (la dosis letal para un 50 % de una población) y la DE50 (la dosis terapéuticamente eficaz en un 50 % de una población). La proporción de dosis entre los efectos tóxicos y terapéuticos es el índice terapéutico, que se puede expresar como la proporción DL50/DE50. Se prefieren las moléculas de unión a antígeno que contienen un trímero de ligando de la familia de TNF que presentan altos índices terapéuticos. En un modo de realización, la molécula de unión a antígeno que contiene un trímero de ligando de la familia de TNF de acuerdo con la presente invención presenta un índice terapéutico alto. Los datos obtenidos a partir de ensayos de cultivo celular y estudios en animales se pueden usar en la formulación de un intervalo de dosificaciones adecuadas para su uso en seres humanos. Preferentemente, la dosificación se encuentra dentro de un intervalo de concentraciones en circulación que incluyen la DE50 con poca o ninguna toxicidad. La dosificación puede variar dentro de este intervalo dependiendo de una variedad de factores, por ejemplo, la forma de dosificación empleada, la vía de administración utilizada, la afección del sujeto, y similares. La formulación exacta, vía de administración y dosificación se pueden elegir por el médico individual en vista de la afección del paciente (véase, por ejemplo, Fingl et al., 1975, en: The Pharmacological Basis of Therapeutics, cap.
1, pág. 1, incorporado en el presente documento como referencia en su totalidad).
El médico especialista para pacientes tratados con las proteínas de fusión de la invención sabrá cómo y cuándo finalizar, interrumpir o ajustar la administración debido a la toxicidad, disfunción orgánica y similares. A la inversa, el médico especialista también sabrá ajustar el tratamiento a niveles mayores si la respuesta clínica no fuera adecuada (excluyendo la toxicidad). La magnitud de una dosis administrada en el abordaje del trastorno de interés variará con la gravedad de la afección que se va a tratar, con la vía de administración, y similares. La gravedad de la afección, por ejemplo, se puede evaluar, en parte, por procedimientos de evaluación de pronóstico estándar. Además, la dosis y quizás la frecuencia de dosis también variarán de acuerdo con la edad, peso corporal, y respuesta del paciente individual.
Otros agentes y tratamientos
Las moléculas de unión a antígeno que contienen un trímero de ligando de la familia de TNF se pueden administrar en combinación con uno o más de otros agentes en el tratamiento. Por ejemplo, se puede coadministrar una proteína de fusión de la invención con al menos un agente terapéutico adicional. El término "agente terapéutico" engloba cualquier agente que se puede administrar para tratar un síntoma o enfermedad en un individuo que necesita dicho tratamiento. Dicho agente terapéutico adicional puede comprender cualquier ingrediente activo adecuado para la indicación particular que se está tratando, preferentemente el que tiene actividades complementarias que no se ven afectadas de manera adversa entre sí. En determinados modos de realización, un agente terapéutico es un agente antineoplásico adicional.
Dichos otros agentes están presentes de forma adecuada en combinación en cantidades que son eficaces para el propósito pretendido. La cantidad eficaz de dichos otros agentes depende de la cantidad de proteína de fusión usada, el tipo de trastorno o tratamiento y otros factores analizados anteriormente. Las moléculas de unión a antígeno que contienen un trímero de ligando de la familia de TNF se usan en general en las mismas dosificaciones y con vías de administración como se describe en el presente documento, o aproximadamente de un 1 a un 99 % de las dosificaciones descritas en el presente documento, o en cualquier dosificación y por cualquier vía que se determine empírica/clínicamente como apropiada.
Dichas politerapias indicadas anteriormente engloban la administración combinada (donde dos o más agentes terapéuticos se incluyen en la misma composición o en composiciones separadas), y la administración separada, en cuyo caso se puede producir la administración de la molécula de unión a antígeno que contiene un trímero de ligando de la familia de TNF antes de, simultáneamente a y/o después de la administración del adyuvante y/o agente terapéutico adicional.
Artículos de fabricación
En otro aspecto, se proporciona un artículo de fabricación que contiene materiales útiles para el tratamiento, prevención y/o diagnóstico de los trastornos descritos anteriormente. El artículo de fabricación comprende un recipiente y una ficha técnica o prospecto del envase en o asociado con el recipiente. Los recipientes adecuados incluyen, por ejemplo, frascos, viales, jeringuillas, bolsas de solución i.v., etc. Los recipientes pueden estar formados por una variedad de materiales, tales como vidrio o plástico. El recipiente contiene una composición que por sí misma o combinada con otra composición es eficaz para tratar, prevenir y/o diagnosticar la afección y que puede tener un orificio de acceso estéril (por ejemplo, el recipiente puede ser una bolsa de solución intravenosa o un vial que tenga un tapón que sea perforable por una aguja de inyección hipodérmica). Al menos un agente activo en la composición es una molécula de unión a antígeno que contiene un trímero de ligando de TNF de la invención.
La ficha técnica o prospecto del envase indica que la composición se usa para tratar la afección de elección. Además, el artículo de fabricación puede comprender (a) un primer recipiente con una composición contenida en el mismo, en el que la composición comprende una molécula de unión a antígeno que contiene un trímero de ligando de TNF; y (b) un segundo recipiente con una composición contenida en el mismo, en el que la composición comprende otro agente citotóxico o de otro modo terapéutico. El artículo de fabricación en este modo de realización puede comprender además un prospecto del envase que indique que las composiciones se pueden usar para tratar una afección particular.
De forma alternativa, o adicionalmente, el artículo de fabricación puede comprender además un segundo (o tercer) recipiente que comprenda un tampón farmacéuticamente aceptable, tal como agua bacteriostática para inyectables (BWFI), solución salina tamponada con fosfato, solución de Ringer y solución de dextrosa. Puede incluir además otros materiales deseables desde un punto de vista comercial y del usuario, incluyendo otros tampones, diluyentes, filtros, agujas y jeringuillas.
Tabla C (Secuencias):
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La información general con respecto a las secuencias de nucleótidos de las cadenas ligera y pesada de inmunoglobulinas humanas se da en: Kabat, E.A., et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5,a ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991). Los aminoácidos de cadenas de anticuerpos están numerados y se mencionan de acuerdo con los sistemas de numeración EU de acuerdo con Kabat (Kabat, E.A., et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5.a ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991)) como se define anteriormente.
Ejemplos
Los siguientes son ejemplos de procedimientos y composiciones de la invención. Se entiende que se pueden poner en práctica otros modos de realización diversos, dada la descripción general proporcionada anteriormente. Técnicas de ADN recombinante
Se usaron procedimientos estándar para manipular ADN como se describe en Sambrook et al., Molecular cloning: A laboratory manual; Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, Nueva York, 1989. Se usaron los reactivos biológicos moleculares de acuerdo con las instrucciones del fabricante. La información general sobre las secuencias de nucleótidos de las cadenas ligera y pesada de inmunoglobulina humana se proporciona en: Kabat, E.A. et al., (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, quinta ed., publicación de los NIH n.° 91-3242.
Secuenciación de ADN
Se determinaron secuencias de ADN por secuenciación de doble hebra.
Síntesis génica
Se generaron segmentos de genes deseados por PCR usando moldes apropiados o bien se sintetizaron por Geneart AG (Regensburg, Alemania) a partir de oligonucleótidos sintéticos y productos de PCR por síntesis génica automatizada. En casos donde no estaba disponible ninguna secuencia génica exacta, se diseñaron cebadores oligonucleotídicos en base a las secuencias de los homólogos más cercanos y se aislaron los genes por RT-PCR del ARN que se origina en el tejido apropiado. Se clonaron los segmentos génicos flanqueados por sitios de escisión de endonucleasas de restricción singulares en vectores de clonación/secuenciación estándar. Se purificó el ADN plasmídico de bacterias transformadas y se determinó la concentración por espectroscopia UV. Se confirmó la secuencia de ADN de los fragmentos génicos subclonados por secuenciación de ADN. Se diseñaron segmentos génicos con sitios de restricción adecuados para permitir la subclonación en los respectivos vectores de expresión. Se diseñaron todas las construcciones con una secuencia de ADN del extremo 5' que codifica un péptido líder que se dirige a proteínas para su secreción en células eucariotas.
Técnicas de cultivo celular
Se usaron técnicas de cultivo celular estándar como se describe en Current Protocols in Cell Biology (2000), Bonifacino, J.S., Dasso, M., Harford, J.B., Lippincott-Schwartz, J. y Yamada, K.M. (eds.), John Wiley & Sons, Inc.
Purificación de proteinas
Se purificaron proteínas a partir de sobrenadantes de cultivo celular filtrados en referencia a los protocolos estándar. En resumen, se aplicaron anticuerpos a una columna de proteína A Sepharose (GE Healthcare) y se lavaron con PBS. La elución de los anticuerpos se logró a pH2,8 seguido de neutralización inmediata de la muestra. La proteína agregada se separaró de los anticuerpos monoméricos mediante cromatografía de exclusión por tamaño (Superdex 200; GE Healthcare) en PBS o en histidina 20 mM, NaCl 150 mM, pH6,0. Se combinaron las fracciones de los anticuerpos monoméricos, se concentraron (si era necesario) usando, por ejemplo, un concentrador centrífugo MILLIPORE Amicon Ultra (30 MWCO), se congelaron y se almacenaron a -20 °C o -80 °C. Parte de las muestras se proporcionaron para el análisis de proteínas posterior y la caracterización analítica, por ejemplo, mediante SDS-PAGE, cromatografía de exclusión por tamaño (CET) o espectrometría de masas.
SDS-page
El sistema de gel NuPAGE® Pre-Cast (Invitrogen Corp.) se usó de acuerdo con las instrucciones del fabricante. En particular, se usó un 10 % o un 4-12 % de geles NuPAGE® Novex® Bis-TRIS Pre-Cast (pH6,4) y un MES NuPAGE® (geles en condiciones reductoras, con aditivo de tampón de migración NuPAGE® Antioxidant) o tampón de migración MOPS (geles en condiciones no reductoras).
Cromatografía de exclusión por tamaño analítica
Se realizó una cromatografía de exclusión por tamaño (CET) para la determinación de la agregación y del estado oligomérico de los anticuerpos por cromatografía HPLC. En resumen, se aplicaron anticuerpos purificados por proteína A a una columna Tosoh TSKgel G3000SW en NaCl 300 mM, KH2PO4/K2HPO450 mM, pH7,5 en un sistema Agilent HPLC1100 o en una columna Superdex 200 (GE Healthcare) en PBS2 veces en un sistema HPLC Dionex. Se cuantificó la proteína eluida por absorbancia UV e integración de áreas de picos. BioRad Gel Filtration Standard 151-1901 sirvió como patrón.
Espectrometría de masas
Esta sección describe la caracterización de los anticuerpos multiespecíficos con intercambio de VH/VL (VH/VL CrossMabs) con hincapié en su correcto ensamblaje. Las estructuras primarias esperadas se analizaron mediante espectrometría de masas con ionización por electronebulización (EM-IEN) de los CrossMab intactos desglucosilados y los CrossMab desglucosilados/digeridos con plasmina o, de forma alternativa, desglucosilados/digeridos con LysC limitada.
Los CrossMab VH/VL se desglucosilaron con N-glucosidasa F en un tampón fosfato o Tris a 37 °C durante hasta 17 h a una concentración de proteína de 1 mg/ml. Las digestiones con plasmina o LysC limitada (Roche) se realizaron con 100 pg de CrossMab VH/VL desglucosilados en un tampón Tris pH8 a temperatura ambiente durante 120 horas y a 37 °C durante 40 min, respectivamente. Antes de la espectrometría de masas, las muestras se desalaron por medio de HPLC en una columna Sephadex G25 (GE Healthcare). La masa total se determinó por medio de EM-IEN en un sistema de EM maXis 4G UHR-QTOF (Bruker Daltonik) equipado con una fuente TriVersa NanoMate (Advion).
Determinación de la unión y afinidad de unión de anticuerpos multiespecíficos a los antígenos respectivos usando resonancia de plasmón de superficie (SPR)(BIACORE)
La unión de los anticuerpos generados a los antígenos respectivos se investiga mediante resonancia de plasmón superficial usando un instrumento BIACORE (GE Healthcare Biosciences AB, Uppsala, Suecia). En resumen, para las mediciones de la afinidad se inmovilizan anticuerpos de cabra contra IgG humana, JIR109-005-098, en un chip CM5 por medio de acoplamiento de aminas para la presentación de los anticuerpos contra el antígeno respectivo. La unión se mide en tampón HBS (HBS-P (HEPES10 mM, NaCl 150 mM, Tween 20 al 0.005 %, pH7,4), a 25 °C (o de forma alternativa a 37 °C). Se añadió antígeno (R&D Systems o se purificó localmente) en diversas concentraciones en solución. La asociación se midió mediante una inyección de antígeno de 80 segundos a 3 minutos; la disociación se midió lavando la superficie del chip con tampón HBS durante 3-10 minutos y se estimó el valor de KD usando un modelo de unión 1:1 de Langmuir. Los datos de control negativo (por ejemplo, curvas de tampón) se restan de las curvas de muestra para la correccion de la deriva intrínseca respecto al valor de referencia del sistema y para la reducción de la señal-ruido. El programa informático de evaluación de Biacore respectivo se usa para el análisis de sensogramas y para el cálculo de datos de afinidad.
Ejemplo 1
1.1 Preparación de moléculas de unión a antígeno de fusión Fc que contienen un trímero de ligando de 4-1BB humano dirigido
Se sintetizaron diferentes fragmentos de la secuencia de ADN que codifica parte del ectodominio (aminoácidos 71-254, 52-254 y 80-254) del ligando 4-1BB humano de acuerdo con la secuencia P41273 de la base de datos Uniprot (SEQ ID NO: 42).
Como componentes para el ensamblaje de una molécula de unión a antígeno que contiene un trímero de ligando de TNF, se clonó un polipéptido que comprende dos ectodominios del ligando 4-1BB, separados por conectores (G4S)2, y se fusionó con el dominio IgG1-CH1 o CL humano, como se representa en la figura 1A (ligando 4-1BB humano, conector (G4S)2 , ligando 4-1BB humano, conector (G4S)2 , CH1 o CL humano) o como se representa en la figura 1C (CH3 humano, conector (G4S)2, ligando 4-1BB humano, conector (G4S)2 , ligando 4-1BB humano).
Se clonó un polipéptido que comprendía un ectodominio del ligando 4-1BB y se fusionó con el dominio IgG1-CL o CH1 humano, como se describe en la figura 1B (ligando 4-1BB humano, conector (G4S)2 , CL o CH1 humano) o como se representa en la figura 1D (CH3 humano, conector (G4S)2 , ligando 4-1BB humano).
Los polipéptidos se subclonaron sin cambio de pauta de lectura con los dominios CH2 y CH3 de la cadena pesada de IgG1 humana con conectores peptídicos opcionales, por ejemplo, para la construcción 1, el polipéptido que codifica el ligando dimérico 4-1BB fusionado con un dominio CH1 humano se subclonó sin cambio de pauta de lectura con los dominios CH2 y CH3 de la cadena pesada de lgG1 humana en el botón (Merchant, Zhu et al. 1998) usando un conector (G4S)2 de SEQ ID NO: 130(GSPGSSSSGS)de SEQ ID NO: 57.
La región variable de secuencias de ADN de cadena pesada y ligera que codifican un aglutinante específico para la proteína de activación de fibroblastos (FAP), es decir, 28H1, se subclonó sin cambio de pauta de lectura con la cadena pesada constante del ojal (Carter, J. Immunol. Methods (2001), 248, 7-15) o la cadena ligera constante de IgG1 humana. La generación y preparación de los aglutinantes de FAP se describe en el documento WO 2012/020006 A2, que se incorpora en el presente documento como referencia.
La tabla 1 resume las características de las construcciones producidas. Las construcciones 1 a 10 difieren en su geometría, valencia para FAP, ectodominio del ligando 4-1 b B, entrecruzamiento del dominio CH1 y CL (tecnología CrossMab), mutaciones en los dominios CH1 y CL y diferentes conectores peptídicos en el polipéptido que comprende un ectodominio de ligando 4-1BB (cadena de 4-1BBL monomérico).
Tabla 1: Características de moléculas de unión a antígeno que contienen un trímero de ligando de TNF producidas (trímeros 4-1BBL divididos de FAP)
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Para evitar emparejamientos incorrectos, en la mayoría de las construcciones se reemplazó un par de dominios CH1 y CL entre sí (entrecruzamiento de dominios) como se describe en el documento WO 2009/080253 A1.
Para mejorar aún más el emparejamiento correcto, se introdujeron diferentes sustituciones aminoacídicas cargadas en los dominios CH1 y CL cruzados o no cruzados como residuos cargados en las construcciones 2 a 4 y 6 a 10. En el dominio CL humano se introdujeron las mutaciones E123R y Q124K, mientras que las mutaciones K147E y K213E se clonaron en el dominio CH1 humano.
Para todas las construcciones, se usó tecnología de heterodimerización de botones en ojales con las mutaciones S354C/T366W en el dominio CH3 de la cadena de botón y las correspondientes mutaciones Y349C/T366S/L368A/Y407V en el dominio CH3 de la cadena de ojal (Carter, J Immunol Methods 248, 7-15 (2001)).
Se han introducido las mutaciones Pro329Gly, Leu234Ala y Leu235Ala en la región constante de las cadenas pesadas de botón y ojal para anular la unión a los receptores gamma Fc de acuerdo con el procedimiento descrito en la publicación de patente internacional n.° WO 2012/130831 A1.
Por ejemplo, en la construcción 1, la combinación de la cadena de botón ligando-Fc que contiene las mutaciones S354C/T366W en el primer dominio CH3, con la cadena de ojal anti-FAP-Fc dirigida que contiene las mutaciones Y349C/T366S/L368A/Y407V en el segundo dominio CH3 permite la generación de un heterodímero, que incluye un ligando 4-1BB trimérico ensamblado y una Fab de unión a FAP (figura 2, gráfico 1.1).
La tabla 2 muestra las secuencias de ADNc y de aminoácidos de la molécula de unión a antígeno de fusión (kih) de Fc que contiene un trímero de ligando 4-1BB dirigido a FAP monovalente (construcción 1.1).
Tabla 2: Secuencias de molécula de fusión (kih) de Fc que contiene un trímero de ligando 4-1BB humano dirigido a FAP, construcción 1.1
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La tabla 3 muestra las secuencias de ADNc y de aminoácidos de la molécula de unión a antígeno de fusión (kih) de Fc que contiene un trímero de ligando 4-1BB dirigido a FAP monovalente (construcción 1.2) con entrecruzamiento CH1-CL y residuos cargados.
dirigido a FAP, construcción 1.2
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La tabla 4 muestra las secuencias de ADNc y de aminoácidos de la molécula de fusión (kih) de Fc que contiene un trímero de ligando 4-1BB dirigido a FAP monovalente, construcción 1.3 (trímero dividido de FAP con entrecruzamiento CH1-CL en Fab anti-FAP y residuos cargados en las cadenas que contienen 4-1BBL).
a a : ecuencas e mo cua e us n e e que con ene un rmero e gan o -humanodirigido a FAP, construcción 1.3
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La tabla 5 muestra las secuencias de ADNc y de aminoácidos de la molécula de fusión (kih) de Fc que contiene un trímero de ligando 4-1BB dirigido a FAP monovalente, construcción 1.4 (trímero dividido de FAP con Fab anti-FAP, ligando 4-1BB monomérico fusionado con la cadena de botón CH1 y residuos cargados en las cadenas que contienen 4-1BBL).
Tabla 5: Secuencias de molécula de fusión (kih) de Fc que contiene un trímero de ligando 4-1BB humano dirigido a FAP, construcción 1.4
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La tabla 6 muestra las secuencias de ADNc y de aminoácidos de la molécula de fusión (kih) de Fc que contiene un trímero de ligando 4-1BB dirigido a FAP bivalente, construcción 1.5 (trímero dividido de FAP con 2 Fabs anti-FAP, ligando 4-1BB dimérico y monomérico fusionado con el extremo C de cada cadena pesada, respectivamente).
Tabla 6: Secuencias de molécula de fusión (kih) de Fc que contiene un trímero de ligando 4-1BB humano dirigido a FAP, construcción 1.5
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La tabla 7 muestra las secuencias de ADNc y de aminoácidos de la molécula de fusión (kih) de Fc que contiene un trímero de ligando 4-1BB dirigido a FAP monovalente, construcción 1.6 (trímero dividido de FAP con Fab anti-FAP, ligando 4-1BB monomérico fusionado con CL* por medio de un conector (G4S)).
Tabla 7: Secuencias de molécula de fusión (kih) de Fc que contiene un trímero de ligando 4-1BB humano dirigido a FAP, construcción 1.6
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La tabla 8 muestra las secuencias de ADNc y de aminoácidos de la molécula de fusión (kih) de Fc que contiene un trímero de ligando 4-1BB dirigido a FAP bivalente, construcción 7 (trímero dividido de FAP con doble anti-FAP en el extremo N de la cadena de ojal Fc y residuos cargados en CH1 y CL cruzados fusionado con ligandos 4-1 BB).
Tabla 8: Secuencias de molécula de fusión (kih) de Fc que contiene un trímero de ligando 4-1BB humano dirigido a FAP, construcción 1.7
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La tabla 9 muestra las secuencias de ADNc y de aminoácidos de la molécula de fusión (kih) de Fc que contiene un trímero de ligando 4-1BB dirigido a FAP bivalente, construcción 1.8 (trímero dividido de FAP con ligandos 4-1BB fusionado con CrossFab anti-FAP, con residuos cargados, en la cadena de botón).
Tabla 9: Secuencias de molécula de fusión (kih) de Fc que contiene un trímero de ligando 4-1BB humano dirigido a FAP, construcción 1.8
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La tabla 10 muestra las secuencias de ADNc y de aminoácidos de la molécula de fusión (kih) de Fc que contiene trímeros de ligando 4-1BB (52-254) dirigido a FAP monovalente, construcción 1.9 (trímero dividido de FAP con aminoácidos 52-254 de ectodominio 4-1BBL y residuos cargados en cadenas de ligandos).
-humano dirigido a FAP, construcción 1.9
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La tabla 11 muestra las secuencias de ADNc y de aminoácidos de la molécula de fusión (kih) de Fc que contiene trímeros de ligando 4-1BB (80-254) dirigido a FAP monovalente, construcción 1.10 (trímero dividido de FAP con aminoácidos 80-254 de ectodominio 4-1BBL y residuos cargados en cadenas de ligandos).
Tabla 11: Secuencias de molécula de fusión (kih) de Fc que contiene un trímero de ligando 4-1BB humano dirigido a FAP, construcción 10
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1.2 Producción de construcciones de fusión Fc de ligando 4-1BB trimérico dividido dirigido a FAP (28H1)
Las secuencias que codifican la molécula de unión a antígeno de fusión (kih) de Fc que contiene un trímero de ligando de TNF dirigidos se clonaron en un vector plásmido, que dirige la expresión del inserto a partir de un promotor MPSV y contiene una secuencia poliA sintética localizada en el extremo 3' del CDS. Además, el vector contiene una secuencia de EBV OriP para el mantenimiento episomal del plásmido.
La molécula de unión a antígeno de fusión (kih) de Fc que contiene un trímero de ligando de TNF dirigidos se produjo cotransfectando células HEK293-EBNA con los vectores de expresión de mamíferos usando polietilenimina. Las células se transfectaron con los vectores de expresión correspondientes en una proporción de 1:1:1:1 (por ejemplo, "vector ligando dimérico-(CH1 o CL)-cadena de botón": "vector fusión de ligando monomérico-(CL o CH1)": "vector Fab anti-FAP-cadena pesada de ojal": "vector cadena ligera anti-FAP") para las construcciones 1, 2, 3, 4, 6 , 7, 8 , 9, 10. Para la construcción 5 bivalente, se usó una proporción de 1:1:1 ("vector cadena pesada de ojal": "vector cadena pesada de botón": "vector cadena ligera anti-FAP").
Para la producción en matraces de agitación de 500 mL, se sembraron 300 millones de células HEK293 EBNA 24 horas antes de la transfección. Para la transfección, se centrifugaron las células durante 10 minutos a 210 x g y se reemplazó el sobrenadante por 20 mL de medio CD CHO precalentado. Los vectores de expresión (200 pg de ADN total) se mezclaron en 20 mL de medio CD CHO. Después de la adición de 540 pL de PEI, la solución se agitó en vórtex durante 15 segundos y se incubó durante 10 minutos a temperatura ambiente. Después de esto, se mezclaron las células con la solución ADN/PEI, se transfirieron a un matraz de agitación de 500 mL y se incubó durante 3 horas a 37 °C en una incubadora con una atmósfera de CO2 al 5 %. Después de la incubación, se añadieron 160 mL de medio Excell suplementado con L-glutamina 6 mM, 5 g/L de PEPSOY y ácido valproico 1,2 mM y se cultivaron las células durante 24 horas. Un día después de la transfección se añadieron un 12 % de Feed 7 y glucosa (concentración final 3 g/L). Después de cultivarse durante 7 días, se recogió el sobrenadante mediante centrifugación durante 30-40 minutos a 400 x g. La solución se filtró en condiciones estériles (filtro de 0,22 pm), se suplementó con acida sódica hasta una concentración final de 0,01 % (p/v) y se mantuvo en 4 °C.
La molécula de unión a antígeno de fusión (kih) de Fc que contiene un trímero de ligando de TNF dirigido se purificó a partir de los sobrenadantes del cultivo celular mediante cromatografía de afinidad usando proteína A, seguido de cromatografía de exclusión por tamaño. Para la cromatografía de afinidad, se cargó el sobrenadante en una columna MabSelect Sure (CV = 5-15 mL, resina de GE Healthcare) equilibrado con fosfato de sodio 20 mM, tampón de citrato de sodio 20 mM (pH 7,5). La proteína no unida se eliminó lavando con al menos 6 volúmenes de columna del mismo tampón. La proteína unida se eluyó usando un gradiente lineal (20 CV) o una elución escalonada ( 8 CV) con citrato de sodio 20 mM, cloruro de sodio 100 mM, tampón de glicina 100 mM (pH 3,0). Para el gradiente lineal, se aplicó una elución escalonada adicional de 4 volúmenes de columna.
El pH de las fracciones recogidas se ajustó añadiendo 1/10 (v/v) de fosfato de sodio 0.5 M, pH 8,0. La proteína se concentró antes de cargarla en una columna HiLoad Superdex 200 (GE Healthcare) equilibrada con histidina 20 mM, cloruro de sodio 140 mM, solución Tween20 al 0,01 % (v/v) de pH 6,0.
Se determinó la concentración de proteína midiendo la densidad óptica (DO) a 280 nm, usando un coeficiente de extinción molar calculado en base a la secuencia de aminoácidos. La pureza y el peso molecular de la molécula de unión a antígeno de fusión (kih) de Fc que contiene un trímero de ligando de TNF dirigidos se analizaron mediante SDS-PAGE en presencia y ausencia de un agente reductor (1,4-ditiotreitol 5 mM) y tinción con Coomassie SimpleBlue™ SafeStain (Invitrogen USA) o CE-SDS usando Caliper LabChip GXII (Perkin Elmer). Se analizó el contenido de agregado de las muestras usando una columna analítica de exclusión por tamaño TSKgel G3000 SW XL (Tosoh) equilibrada en K2HPO425 mM, NaCl 125 mM, monoclorhidrato de L-arginina 200 mM, NaN3 al 0,02 % (p/v), tampón de migración a pH 6,7 a 25 °C.
La tabla 12 resume el rendimiento y el contenido final de monómero de las moléculas de unión a antígeno de fusión (kih) de Fc que contienen trímeros de 4-1BBL dirigido a FAP.
Tabla 12: Análisis bioquímico de las moléculas de unión a antígeno de fusión (kih) de Fc que contienen trímeros de 4-1BBL dirigido a FAP (28H1)
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1.3 Preparación de moléculas de unión a antígeno de fusión Fc que contienen un trímero de ligando 4-1BB murino dirigido
De forma similar a las moléculas de unión a antígeno de fusión Fc que contienen un trímero de ligando 4-1BB humano dirigido, se prepararon moléculas de unión a antígeno de fusión Fc que contienen trímeros de 4-1BBL dirigido a FAP murino.
Se sintetizó la secuencia de ADN que codifica parte del ectodominio (aminoácidos 104-309) del ligando 4-1BB murino de acuerdo con la secuencia Q3U1Z9-1 de la base de datos Uniprot (SEQ ID NO: 70). Para la construcción M.1, las cisteínas en las posiciones 137, 160 y 246 se mutaron a Serina mediante procedimientos de PCR estándar, mientras que para la construcción M.2, la cisteína en la posición 160 se mutó a Serina (C160S).
El ligando murino se ensambló como se describe para el 4-1BBL humano y como se representa en la figura 3A y 3B. El 4-1BBL dimérico, separado por conectores (G4 S2), se fusionó con el dominio IgG1-CL murino (Figura 3A) y el 4-1BBL monomérico se fusionó con el dominio IgG1-CH murino (Figura 3B). El polipéptido que codifica el ligando 4-1BB dimérico fusionado con el dominio CL murino se subclonó sin cambio de pauta de lectura con los dominios CH2 y CH3 de la cadena pesada de IgG1 murina para construir las construcciones como se representa en la figura 3C.
Para las construcciones murinas, se introdujeron las mutaciones Lys392Asp y Lys409Asp (DD) en la cadena pesada que contiene el 4-1BBL murino y las mutaciones Glu356Lys y Asp399Lys (k K) se introdujeron en la cadena pesada que contiene la Fab anti-FAP para obtener moléculas asimétricas (Gunasekaran K. et al., J Biol. Chem., 18 de junio de 2010; 285(25): 19637-46).
Las mutaciones Asp265Ala y Pro329Gly (DAPG) se introdujeron en la región constante de las cadenas pesadas para anular la unión a los receptores gamma Fc.
La tabla 13 muestra, respectivamente, las secuencias de ADNc y de aminoácidos de la contrucción M.1 de la molécula de unión a antígeno de fusión Fc que contiene un trímero de ligando 4-1BB murino dirigido a FAP.
Tabla 13: Secuencias de la construcción M.1 murina dirigida a FAP
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La tabla 14 muestra, respectivamente, las secuencias de ADNc y de aminoácidos del control M.1 de la molécula de unión a antígeno de fusión Fc que contiene un trímero de ligando 4-1BB murino (DP47) no dirigido.
Tabla 14: Secuencias de control M.1 murino no dirigido
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La tabla 15 muestra las secuencias de ADNc y de aminoácidos de la contrucción M.2 de la molécula de unión a antígeno de fusión Fc que contiene un trímero de ligando 4-1BB murino dirigido a FAP.
Tabla 15: Secuencias de la construcción M.2 murina dirigida a FAP
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La tabla 16 muestra las secuencias de ADNc y de aminoácidos del control de contrucción M.2 de la molécula de unión a antígeno de fusión Fc que contiene un trímero de ligando 4-1BB murino no dirigido a DP47.
Tabla 16: Secuencias de control M.2 murino dirigido a FAP
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Las moléculas de unión a antígeno de fusión Fc que contienen un trímero de ligando 4-1BB murino se produjeron y purificaron como se describe anteriormente en el presente documento para las construcciones de 4-1BBL humano.
La tabla 17 resume el rendimiento y el contenido final de monómero de la moléculas de unión a antígeno de fusión Fc que contienen trímeros de 4-1BBL murino dirigido y no dirigido a FAP.
Tabla 17: Resumen de la producción de moléculas de unión a antígeno de fusión Fc que contienen trímeros de 4-1BBL murino dirigido y no dirigido a FAP
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1.4 Preparación y purificación de moléculas de unión a antígeno de fusión Fc que contienen un trímero de ligando 4-1BB humano no dirigido (moléculas de control)
Las moléculas de control se prepararon como se describe anteriormente para las construcciones 1 y 2 dirigidas a FAP, con la única diferencia de que el aglutinante anti-FAP (VH-VL) se reemplazó por un control de línea germinal, denominado DP47, que no se unió al antígeno. El control es una (kih) de Fc ligando 4-1BB humano trimérico dividido monovalente no dirigido (control A, figura 5A) y para el control B, la construcción también contiene un entrecruzamiento de CH-CL con residuos cargados (figura 5B). La región variable de secuencias de ADN de la cadena pesada y ligera del aglutinante de FAP se reemplazó por las del control de línea germinal (DP47) y se subclonó sin cambio de pauta de lectura con la cadena pesada constante del ojal o la cadena ligera constante de IgG1 humana.
Las moléculas de unión a antígeno de fusión (kih) de Fc que contienen un trímero de ligando 4-1BB no dirigido se produjeron como se describe anteriormente para las construcciones dirigidas a FAP. Las células se transfectaron con los vectores de expresión correspondientes en una proporción de 1:1:1:1 ("vector ligando dimérico-CH1 o CL*-cadena de botón": "vector fusión de ligando monomérico-CL o CH1*": "vector Fab de Dp47-cadena de ojal": "vector cadena ligera DP47").
La tabla 18 muestra, respectivamente, las secuencias de ADNc y de aminoácidos del control A de la molécula de unión a antígeno de fusión (kih) de Fc que contiene un trímero de ligando 4-1BB no dirigido a DP47.
Tabla 18: Secuencias de la molécula de unión a antígeno de fusión (kih) de Fc que contiene un trímero de ligando 4-1BB no dirigido a DP47 (trímero 4-1BBL dividido de DP47), control A
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La tabla 19 muestra las secuencias de ADNc y de aminoácidos de la molécula de unión a antígeno de fusión (kih) de Fc que contiene un trímero de ligando 4-1BB no dirigido a DP47 con el entrecruzamiento de CH1-CL y los residuos cargados en los brazos que contienen el ligando 4-1BB (control B).
Tabla 19: Secuencias de la molécula de unión a antígeno de fusión (kih) de Fc que contiene un trímero de ligando 4-1BB no dirigido a DP47 (trímero 4-1BBL dividido de DP47), control B
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La tabla 20 resume el rendimiento y el contenido de monómero final de las moléculas de unión a antígeno de fusión (kih) de Fc que contienen un trímero de ligando 4-1BB no dirigido a DP47.
Tabla 20: Características de producción de moléculas de unión a antígeno de fusión (kih) de Fc que contienen trímeros de 4-1BBL no dirigidos a DP47 (moléculas de control)
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Ejemplo 2
2.1 Preparación de moléculas de unión a antígeno de fusión Fc que contienen un trímero de ligando 4-1BB dirigido a FAP (4B9)
Se sintetizaron diferentes fragmentos de la secuencia de ADN que codifica parte del ectodominio (aminoácidos 71-254 y 71-248) del ligando 4-1BB humano de acuerdo con la secuencia P41273 de la base de datos Uniprot (SEQ ID NO: 42).
2.1.1 Preparación de la molécula de unión a antígeno de fusión (kih) de Fc que contiene trímeros de ligando 4-1BB (71-254) dirigido a FAP (4B9) monovalente con dominios CH1-CL cruzados con residuos cargados (construcción 2.1)
Se clonó un polipéptido que contenía dos ectodominios del ligando 4-1BB (71-254), separado por conectores (G4S)2 y fusionado con el dominio de IgG1-CL humano, como se representa en la figura 1A: ligando 4-1BB humano, conector (G4S)2, ligando 4-1BB humano, conector (G4S)2, CL humano.
Se clonó un polipéptido que contenía un ectodominio del ligando 4-1BB (71-254) y fusionado con el dominio de IgG1-CH1 humano, como se representa en la figura 1B: ligando 4-1BB humano, conector (G4S)2, CH humano.
Se subclonó el polipéptido que codifica un ligando 4-1BB dimérico fusionado con el dominio CL humano sin cambio de pauta de lectura con los dominios CH2 y CH3 de la cadena pesada de lgG1 humana en el botón (Merchant, Zhu et al., 1998) usando un conector (G4S)2 o de forma alternativa(GSPGSSSSGS)..
Para mejorar el emparejamiento correcto, se han introducido las siguientes mutaciones en el CH-CL cruzado. En el ligando dimérico 4-1BB fusionado con CL humano se introdujeron las mutaciones E123R y Q124K. En el ligando monomérico 4-1BB fusionado con CH1 humano, las mutaciones K147E y K213E se clonaron en el dominio CH1 humano.
Se subclonó la región variable de secuencias de ADN de la cadena pesada y ligera que codifican un aglutinante específico para la proteína de activación de fibroblastos (FAP), el clon 4B9, sin cambio de pauta de lectura con la cadena pesada constante del ojal o la cadena ligera constante de IgG1 humana.
La generación y preparación de los aglutinantes de FAP se describe en el documento WO 2012/020006 A2, que se incorpora en el presente documento como referencia.
Se han introducido las mutaciones Pro329Gly, Leu234Ala y Leu235Ala en la región constante de las cadenas pesadas de botón y ojal para anular la unión a los receptores gamma Fc de acuerdo con el procedimiento descrito en la publicación de patente internacional n.° WO 2012/130831.
Para todas las construcciones, se usó tecnología de heterodimerización de botones en ojal con las mutaciones S354C/T366W en la cadena de botón y las correspondientes mutaciones Y349C/T366S/L368A/Y407V en la cadena de ojal.
La combinación de la cadena de botón de ligando dimérico-Fc que contiene las mutaciones S354C/T366W, la fusión CH1 monomérica, la cadena de ojal anti-FAP-Fc dirigida que contiene las mutaciones Y349C/T366S/L368A/Y407V y la cadena ligera anti-FAP permite la generación de un heterodímero, que incluye un ligando 4-1BB trimérico ensamblado y una Fab de unión a FAP (figura 4, construcción 2.1).
La tabla 21 muestra las secuencias de ADNc y de aminoácidos de la molécula de unión a antígeno de fusión (kih) de Fc ligando de 4-1BB (71-254) humano de FAP (4B9) monovalente que contiene entrecruzamiento CH1-CL y residuos cargados (construcción 2.1).
Tabla 21: Secuencias de molécula de fusión (kih) de Fc que contiene ligando de 4-1BB (71-254) humano dirigido a FAP(4B9) monovalente, construcción 2.1
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2.1.2 Preparación de la molécula de unión a antígeno de fusión (kih) de Fc que contiene trímeros de ligando 4-1BB (71-254) dirigido a FAP (4B9) monovalente con dominios CH1-CL cruzados sin residuos cargados (construcción 2.2)
Se clonó un polipéptido que contenía dos ectodominios del ligando 4-1BB (71-254), separado por conectores (G4S)2 y fusionado con el dominio de IgG1-CL humano, como se representa en la figura 1A: ligando 4-1BB humano, conector (G4S)2, ligando 4-1BB humano, conector (G4S)2, CL humano.
Se clonó un polipéptido que contenía un ectodominio del ligando 4-1BB (71-254) y fusionado con el dominio de IgG1-CH1 humano, como se representa en la figura 1B: ligando 4-1BB humano, conector (G4S)2, CH1 humano.
Se subclonó el polipéptido que codifica un ligando 4-1BB dimérico fusionado con el dominio CL humano sin cambio de pauta de lectura con los dominios CH2 y CH3 de la cadena pesada de lgG1 humana en el botón (Merchant, Zhu et al., 1998) usando un conector (G4S)2 o de forma alternativa(GSPGSSSSGS)-.
Se subclonó la región variable de secuencias de ADN de la cadena pesada y ligera que codifican un aglutinante específico para la proteína de activación de fibroblastos (FAP), el clon 4B9, sin cambio de pauta de lectura con la cadena pesada constante del ojal o la cadena ligera constante de IgG1 humana.
Se han introducido las mutaciones Pro329Gly, Leu234Ala y Leu235Ala en la región constante de las cadenas pesadas de botón y ojal para anular la unión a los receptores gamma Fc (documento WO 2012/130831).
La combinación de la cadena de botón de ligando dimérico-Fc que contiene las mutaciones S354C/T366W, la fusión CH1 monomérica, la cadena de ojal anti-FAP-Fc dirigida que contiene las mutaciones Y349C/T366S/L368A/Y407V y la cadena ligera anti-FAP permite la generación de un heterodímero, que incluye un ligando 4-1BB trimérico ensamblado y una Fab de unión a FAP (figura 4, construcción 2.2).
La tabla 22 muestra las secuencias de ADNc y de aminoácidos de la molécula de unión a antígeno de fusión (kih) de Fc ligando de 4-1BB (71-254) humano de FAP (4B9) monovalente que contiene entrecruzamiento CH1-CL sin residuos cargados (construcción 2.2).
Tabla 22: Secuencias de molécula de fusión (kih) de Fc que contiene ligando 4-1BB (71-254) humano dirigido a FAP(4B9) monovalente, construcción 2.2
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2.1.3 Preparación de la molécula de unión a antígeno de fusión (kih) de Fc que contiene trímeros de ligando 4-1BB (71-254) dirigido a FAP (4B9) bivalente con los ligandos 4-1BB diméricos y monoméricos fusionados en el extremo C de cada cadena pesada (construcción 2.3)
Se clonó un polipéptido que contenía dos ectodominios del ligando 4-1BB (71-254), separado por conectores (G4S)2 y fusionado con el extremo C de la cadena de ojal Fc de IgG1 humana, como se representa en la figura 1C: ojal Fc de IgG1 humana, conector (G4S)2, ligando 4-1BB humano, conector (G4S)2, ligando 4-1BB humano. Un polipéptido que contenía un ectodominio del ligando 4-1BB (71-254) se fusionó con el extremo C de la cadena de botón Fc de IgG1 humana como se describe en la figura 1D: botón Fc de IgG1 humana, conector (G4S)2, ligando 4-1BB humano.
El polipéptido que codifica el ligando dimérico 4-1BB se subclonó estructuralmente en el extremo C de los dominios CH2 y CH3 de la cadena pesada de IgG1 humana en el ojal (Merchant, Zhu et al. 1998) usando un conector (G4S)2. El polipéptido que codifica el ligando monomérico 4-1BB se subclonó estructuralmente en el extremo C de los dominios CH2 y CH3 de la cadena pesada de IgG1 humana en el botón (Merchant, Zhu et al. 1998) usando un conector (G4S)2.
Se subclonó la región variable de secuencias de ADN de la cadena pesada y ligera que codifican un aglutinante específico para la proteína de activación de fibroblastos (FAP), el clon 4B9, sin cambio de pauta de lectura con la cadena pesada constante del ojal, el botón o la cadena ligera constante de IgG1 humana.
Se han introducido las mutaciones Pro329Gly, Leu234Ala y Leu235Ala en la región constante de las cadenas pesadas de botón y ojal para anular la unión a los receptores gamma Fc de acuerdo con el procedimiento descrito en el documento W o 2012/130831.
La combinación de la cadena del ligando dimérico de ojal anti-FAP huIgG1 que contiene las mutaciones Y349C/T366S/L368A/Y407V, la cadena del ligando monomérico de botón anti-FAP huIgG1 que contiene las mutaciones S354C/T366W y la cadena ligera anti-FAP permite la generación de un heterodímero, que incluye un ligando 4-1BB trimérico ensamblado y dos Fabs de unión a FAP (figura 4, construcción 2.3)
La tabla 23 muestra las secuencias de ADNc y de aminoácidos de la molécula de fusión (kih) de Fc que contiene un trímero de ligando 4-1BB dirigido a FAP (4B9) bivalente, construcción 2.3 (trímero dividido de fA p con 2 Fabs anti-FAP, ligando 4-1BB dimérico y monomérico fusionado en el extremo C de cada cadena pesada, respectivamente).
Tabla 23: Secuencias de molécula de fusión (kih) de Fc que contiene ligando 4-1BB (71-254) humano dirigido a FAP(4B9) bivalente, construcción 2.3
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2.1.4 Preparación de la molécula de unión a antígeno de fusión (kih) de Fc que contiene trímeros de ligando 4-1BB (71-248) dirigido a FAP (4B9) monovalente con dominios CH1-CL cruzados con residuos cargados (construcción 2.4)
Se clonó un polipéptido que contenía dos ectodominios del ligando 4-1BB (71-248), separado por conectores (G4S)2 y fusionado con el dominio de IgG1-CL humano, como se representa en la figura 1A: ligando 4-1BB humano, conector (G4S)2, ligando 4-1BB humano, conector (G4S)2, Cl humano. Se clonó un polipéptido que contenía un ectodominio del ligando 4-1 BB (71-248) y se fusionó con el dominio IgG1- CH humano, como se representa en la figura 1B: ligando 4-1BB humano, conector (G4S)2, CH humano.
Se subclonó el polipéptido que codifica un ligando 4-1BB dimérico fusionado con el dominio CL humano sin cambio de pauta de lectura con los dominios CH2 y CH3 de la cadena pesada de lgG1 humana en el botón (Merchant, Zhu et al., 1998) usando un conector (G4S)2 o de forma alternativa (GSPGSSSSGS). Para mejorar el emparejamiento correcto, se han introducido las siguientes mutaciones en el CH-CL cruzado. En el ligando dimérico 4-1BB fusionado con CL, E123R y Q124K humanos. En el ligando monomérico 4-1BB fusionado con CH1, K147E y K213E humanos.
Se subclonó la región variable de secuencias de ADN de la cadena pesada y ligera que codifican un aglutinante específico para la proteína de activación de fibroblastos (FAP), el clon 4B9, sin cambio de pauta de lectura con la cadena pesada constante del ojal o la cadena ligera constante de IgG1 humana.
Se han introducido las mutaciones Pro329Gly, Leu234Ala y Leu235Ala en la región constante de las cadenas pesadas de botón y ojal para anular la unión a los receptores gamma Fc de acuerdo con el procedimiento descrito en el documento WO 2012/130831.
La combinación de la cadena de botón de ligando dimérico-Fc que contiene las mutaciones S354C/T366W, la fusión CH1 monomérica, la cadena de ojal anti-FAP-Fc dirigida que contiene las mutaciones Y349C/T366S/L368A/Y407V y la cadena ligera anti-FAP permite la generación de un heterodímero, que incluye un ligando 4-1BB trimérico ensamblado y una Fab de unión a FAP (figura 4, construcción 2.4).
La tabla 24 muestra las secuencias de ADNc y de aminoácidos de la molécula de unión a antígeno de fusión (kih) de Fc ligando de 4-1BB (71-248) humano de FAP (4B9) monovalente que contiene entrecruzamiento CH1-CL con residuos cargados (construcción 2.4).
Tabla 24: Secuencias de molécula de fusión (kih) de Fc que contiene ligando 4-1BB (71-248) humano dirigido a FAP(4B9) monovalente, construcción 2.4
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2.1.5 Preparación de la molécula de unión a antígeno de fusión (kih) de Fc que contiene trímeros de ligando 4-1BB (71-248) dirigido a FAP (4B9) monovalente con dominios CH1-CL cruzados sin residuos cargados (construcción 2.5)
Se clonó un polipéptido que contenía dos ectodominios del ligando 4-1BB (71-248), separado por conectores (G4S)2 y fusionado con el dominio de IgG1-CL humano, como se representa en la figura 1A: ligando 4-1BB humano, conector (G4S)2, ligando 4-1BB humano, conector (G4S)2, Cl humano. Se clonó un polipéptido que contenía un ectodominio del ligando 4-1 BB (71-248) y se fusionó con el dominio IgG1- CH humano, como se representa en la figura 1B: ligando 4-1BB humano, conector (G4S)2, CH humano.
Se subclonó el polipéptido que codifica un ligando 4-1BB dimérico fusionado con el dominio CL humano sin cambio de pauta de lectura con los dominios CH2 y CH3 de la cadena pesada de lgG1 humana en el botón (Merchant, Zhu et al., 1998) usando un conector (G4S)2 o de forma alternativa (GSPGSSSSGS).
Se subclonó la región variable de secuencias de ADN de la cadena pesada y ligera que codifican un aglutinante específico para la proteína de activación de fibroblastos (FAP), el clon 4B9, sin cambio de pauta de lectura con la cadena pesada constante del ojal o la cadena ligera constante de IgG1 humana.
Se han introducido las mutaciones Pro329Gly, Leu234Ala y Leu235Ala en la región constante de las cadenas pesadas de botón y ojal para anular la unión a los receptores gamma Fc de acuerdo con el procedimiento descrito en el documento W o 2012/130831.
La combinación de la cadena de botón de ligando dimérico-Fc que contiene las mutaciones S354C/T366W, la fusión CH1 monomérica, la cadena de ojal anti-FAP-Fc dirigida que contiene las mutaciones Y349C/T366S/L368A/Y407V y la cadena ligera anti-FAP permite la generación de un heterodímero, que incluye un ligando 4-1BB trimérico ensamblado y un Fab de unión a FAP (figura 4, construcción 2.5).
La tabla 25 muestra las secuencias de ADNc y de aminoácidos de la molécula de unión a antígeno de fusión (kih) de Fc ligando de 4-1BB (71-248) humano de FAP (4B9) monovalente que contiene entrecruzamiento CH1-CL sin residuos cargados (construcción 2.5).
a a : ecuencas e mo cua e us n e e que con ene gan o - - umano dirigido a FAP(4B9) monovalente, construcción 2.5
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2.1.6 Preparación de la molécula de unión a antígeno de fusión (kih) de Fc que contiene trímeros de ligando 4-1BB (71-248) dirigido a FAP (4B9) bivalente con los ligandos 4-1BB diméricos y monoméricos fusionados en el extremo C de cada cadena pesada (construcción 2.6)
Se clonó un polipéptido que contenía dos ectodominios del ligando 4-1BB (71-248), separado por conectores (G4S)2 y fusionado con el extremo C de la cadena de ojal Fc de IgG1 humana, como se representa en la figura 1C: ojal Fc de IgG1 humana, conector (G4S)2, ligando 4-1BB humano, conector (G4S)2, ligando 4-1BB humano. Un polipéptido que contenía un ectodominio del ligando 4-1BB (71-248) se fusionó con el extremo C de la cadena de botón Fc de IgG1 humana como se describe en la figura 1D: botón Fc de IgG1 humana, conector (G4S)2, ligando 4-1BB humano.
El polipéptido que codifica el ligando dimérico 4-1BB se subclonó estructuralmente en el extremo C de los dominios CH2 y CH3 de la cadena pesada de IgG1 humana en el ojal (Merchant, Zhu et al. 1998) usando un conector (G4S)2. El polipéptido que codifica el ligando monomérico 4-1BB se subclonó estructuralmente en el extremo C de los dominios CH2 y CH3 de la cadena pesada de IgG1 humana en el botón (Merchant, Zhu et al. 1998) usando un conector (G4S)2.
Se subclonó la región variable de secuencias de ADN de la cadena pesada y ligera que codifican un aglutinante específico para la proteína de activación de fibroblastos (FAP), el clon 4B9, sin cambio de pauta de lectura con la cadena pesada constante del ojal, el botón o la cadena ligera constante de IgG1 humana.
Se han introducido las mutaciones Pro329Gly, Leu234Ala y Leu235Ala en la región constante de las cadenas pesadas de botón y ojal para anular la unión a los receptores gamma Fc de acuerdo con el procedimiento descrito en el documento W o 2012/130831.
La combinación de la cadena del ligando dimérico de ojal anti-FAP huIgG1 que contiene las mutaciones Y349C/T366S/L368A/Y407V, la cadena del ligando monomérico de botón anti-FAP huIgG1 que contiene las mutaciones S354C/T366W y la cadena ligera anti-FAP permite la generación de un heterodímero, que incluye un ligando 4-1BB trimérico ensamblado y dos Fab de unión a FAP (figura 4, construcción 2.6).
La tabla 26 muestra las secuencias de ADNc y de aminoácidos de la molécula de fusión (kih) de Fc que contiene un trímero de ligando 4-1BB dirigido a FAP (4B9) bivalente, construcción 2.6 (trímero dividido de fA p con 2 Fabs anti-FAP, ligando 4-1BB dimérico y monomérico fusionado en el extremo C de cada cadena pesada, respectivamente).
Tabla 26: Secuencias de molécula de fusión (kih) de Fc que contiene ligando 4-1BB (71-248) humano dirigido a FAP(4B9) bivalente, construcción 2.6
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2.2 Preparación de moléculas de unión a antígeno de fusión Fc que contienen un trímero de ligando 4-1BB humano no dirigido (moléculas de control)
Se prepararon otras moléculas de control como se describe anteriormente en el ejemplo 1.4 para el control A y B. Se preparó una variante bivalente de control C en analogía con la construcción 2.3 y 2.6 bivalente y se preparó una variante monovalente de control E en analogía con la construcción 2.5 (que contiene un trímero de ligando 4-1BB (71-248), con la única diferencia que el aglutinante anti-FAP (VH-VL) se reemplazó por un control de la línea germinal, denominado DP47, que no se une al antígeno.
La tabla 27 muestra las secuencias de ADNc y de aminoácidos de la molécula de fusión (kih) de Fc ligando de 4-1BB (71-254) trimérico dividido no dirigido a DP47 bivalente; control C. La tabla 28 muestra las secuencias de ADNc y de aminoácidos de la molécula de fusión (kih) de Fc ligando de 4-1BB (71-248) trimérico dividido no dirigido a DP47 monovalente; control E.
Tabla 27: Secuencias de molécula de fusión (kih) de Fc que contiene ligando 4-1BB (71-254) humano no diri ido a DP47 bivalente control C
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Tabla 28: Secuencias de molécula de fusión (kih) de Fc que contiene ligando 4-1BB (71-248) humano no dirigido monovalente; control E
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2.3 Preparación de IgG1 humana no dirigida como control F
Una molécula de control adicional usada en los ensayos fue un DP47 no dirigido, control de línea germinal, IgG1 humana, que contiene las mutaciones Pro329Gly, Leu234Ala y Leu235Ala, para anular la unión a receptores gamma Fc de acuerdo con el procedimiento descrito en la publicación de solicitud de patente internacional n.° WO 2012/130831).
La tabla 29 muestra las secuencias de ADNc y de aminoácidos de PGLALA huIgG1 DP47 no dirigido (control F).
Tabla 29: Secuencias de DP47 huIgG1 no dirigido (control F)
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2.4 Producción de construcciones y moléculas de control de fusión Fc de ligando 4-1BB trimérico dividido dirigido a FAP (4B9) monovalente y bivalente
Las secuencias codificantes de fusión (kih) de Fc ligando de 4-1BB trimérico dividido dirigido y no dirigido se clonaron en un vector plásmido, que dirige la expresión del inserto a partir de un promotor MPSV y contiene una secuencia poliA sintética localizada en el extremo 3' del CDS. Además, el vector contiene una secuencia de EBV OriP para el mantenimiento episomal del plásmido.
Se produjo la fusión (kih) de Fc ligando de 4-1BB trimérico dividido cotransfectando células HEK293-EBNA con los vectores de expresión de mamífero usando polietilenimina. Se transfectaron las células con los correspondientes vectores de expresión. Para las construcciones 2.1, 2.2, 2.4 y 2.5 y las moléculas de control correspondientes, se usó una proporción de 1:1:1:1 (por ejemplo, "vector ligando dimérico-CL-cadena de botón": "vector fusión de ligando monomérico-CH1": "vector Fab anti-FAP-cadena de ojal": "vector cadena ligera anti-FAP"). Para las construcciones 2.3 y 2.6 y su molécula de control, se tomó una proporción de 1:1:1 ("vector cadena de ligando dimérico de ojal Fc de huIgG1": "vector cadena de ligando monomérico de botón Fc de huIgG1": "vector cadena ligera anti-FAP"). Las IgG humanas, usadas como control en el ensayo, se produjeron como para las construcciones biespecíficas (para la transfección solo se usaron un vector para la cadena ligera y un vector para la cadena pesada.
Para la producción en matraces de agitación de 500 mL, se sembraron 300 millones de células HEK293 EBNA 24 horas antes de la transfección. Para la transfección, se centrifugaron las células durante 10 minutos a 210 x g y se reemplazó el sobrenadante por 20 mL de medio CD CHO precalentado. Los vectores de expresión (200 |jg de ADN total) se mezclaron en 20 mL de medio CD CHO. Después de la adición de 540 jL de PEI, la solución se agitó en vórtex durante 15 segundos y se incubó durante 10 minutos a temperatura ambiente. Después de esto, se mezclaron las células con la solución ADN/PEI, se transfirieron a un matraz de agitación de 500 mL y se incubó durante 3 horas a 37 °C en una incubadora con una atmósfera de CO2 al 5 %. Después de la incubación, se añadieron 160 mL de medio Excell suplementado con L-glutamina 6mML, 5g/L de PEPSOY y ácido valproico 1,2 mM y se cultivaron las células durante 24 horas. Un día después de la transfección se añadieron un 12 % de Feed 7 y glucosa (concentración final 3g/L). Después de cultivarse durante 7 días, se recogió el sobrenadante mediante centrifugación durante 30-40 minutos al menos 400 x g. La solución se filtró en condiciones estériles (filtro de 0,22 |jm), se suplementó con acida sódica hasta una concentración final de 0,01 % (p/v) y se mantuvo en 4 °C.
La molécula de unión a antígeno de fusión (kih) de Fc que contiene un trímero de ligando de TNF dirigido o no dirigido y la IgG1 humana se purificaron a partir de los sobrenadantes del cultivo celular mediante cromatografía de afinidad usando proteína A, seguido de cromatografía de exclusión por tamaño. Para la cromatografía de afinidad, se cargó el sobrenadante en una columna MabSelect Sure (CV = 5-15 mL, resina de GE Healthcare) equilibrado con fosfato de sodio (20 mM), tampón de citrato de sodio (20 mM) (pH 7,5). La proteína no unida se eliminó lavando con al menos 6 volúmenes de columna del mismo tampón. La proteína unida se eluyó usando un gradiente lineal (20 CV) o una elución escalonada (8 CV) con citrato de sodio 20 mM, cloruro de sodio 100 mM, tampón de glicina 100 mM (pH 3,0). Para el gradiente lineal, se aplicó una elución escalonada adicional de 4 volúmenes de columna.
El pH de las fracciones recogidas se ajustó añadiendo 1/10 (v/v) de fosfato de sodio 0,5 M, pH 8,0. La proteína se concentró antes de cargarla en una columna HiLoad Superdex 200 (GE Healthcare) equilibrada con histidina 20 mM, cloruro de sodio 140 mM, solución Tween20 al 0,01 % (v/v) de pH 6,0.
Se determinó la concentración de proteína midiendo la densidad óptica (DO) a 280 nm, usando un coeficiente de extinción molar calculado en base a la secuencia de aminoácidos. La pureza y el peso molecular de la fusión (kih) de Fc ligando de 4-1BB trimérico dirigido se analizaron mediante SDS-PAGE en presencia y ausencia de un agente reductor (1,4-ditiotreitol 5 mM) y tinción con Coomassie SimpleBlue™ SafeStain (Invitrogen USA) o CE-SDS usando Caliper LabChip GXII (Perkin Elmer). Se analizó el contenido en agregado de las muestras usando una columna analítica de exclusión por tamaño TSKgel G3000 SW XL (Tosoh) equilibrada en K2HPO4 25 mM, NaCl 125 mM, monoclorhidrato de L-arginina 200 mM, NaN3 al 0,02 % (p/v), tampón de migración a pH 6,7 a 25 °C.
La tabla 30 resume el rendimiento y el contenido final de monómero de las moléculas de unión a antígeno de fusión (kih) de Fc que contienen un trímero de ligando 4-1BB dirigido y no dirigido a FAP(4B9 y las moléculas de control.
Tabla 30 Análisis bioquímico de las moléculas de unión a antígeno de fusión (kih) de Fc que contienen un trímero de ligando 4-1BB dirigido y no dirigido a FAP (4B9) y las moléculas de control
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Ejemplo 3
Preparación, purificación y caracterización de 4-1BB
Las secuencias de ADN que codifican los ectodominios de 4-1BB humano, de ratón o de macaco cangrejero (tabla 31) se subclonaron sin cambio de pauta de lectura con los dominios CH2 y CH3 de la cadena pesada de IgG1 humana en el botón (Merchant et al., 1998). Se introdujo un sitio de escisión de proteasa AcTEV entre un ectodominio de antígeno y la Fc de IgG1 humana. Se introdujo una marca Avi para la biotinilación dirigida en el extremo C del botón antígeno-Fc. La combinación de la cadena de botón antígeno-Fc que contiene las mutaciones S354C/T366W, con una cadena de ojal Fc que contiene las mutaciones Y349C/T366S/L368A/Y407V permite la generación de un heterodímero que incluye una sola copia de la cadena que contiene el ectodominio 4-1BB, creando por tanto una forma monomérica de antígeno unido a Fc (figura 5C). La tabla 32 muestra las secuencias de ADNc y de aminoácidos y ADNc de las construcciones de fusión Fc de antígeno.
Tabla 31: Numeración de aminoácidos de ectodominios de antígeno (ECD) y su origen
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Tabla 32: Secuencias de ADNc y de aminoácidos de moléculas de fusión (kih) de Fc antígeno monomérico
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Todas las secuencias codificantes de molécula de fusión 4-1BB- Fc se clonaron en un vector plásmido, que dirige la expresión del inserto a partir de un promotor MPSV y contiene una secuencia de señal poliA sintética localizada en el extremo 3' del CDS. Además, el vector contiene una secuencia de EBV OriP para el mantenimiento episomal del plásmido.
Para la preparación de las moléculas de fusión Fc/antígeno monoméricas biotiniladas, se cotransfectaron células HEK293 EBNA en suspensión en crecimiento exponencial con tres vectores que codifican los dos componentes de la proteína de fusión (cadenas botón en ojal), así como BirA, una enzima necesaria para la reacción de biotinilación. Los vectores correspondientes se usaron en una proporción 2: 1: 0,05 ("botón ECD-AcTEV-Fc de antígeno": "ojal Fc": "BirA").
Para la producción de proteínas en matraces de agitación de 500 ml, se sembraron 400 millones de células HEK293 EBNA 24 horas antes de la transfección. Para la transfección, las células se centrifugaron durante 5 minutos a 210 g y el sobrenadante se reemplazó por medio CD CHO precalentado. Los vectores de expresión se resuspendieron en 20 ml de medio CD CHO que contenía 200 |jg de ADN vector. Después de la adición de 540 |jl de polietilenimina (PEI), la solución se agitó en vórtex durante 15 segundos y se incubó durante 10 minutos a temperatura ambiente. Después de esto, se mezclaron las células con la solución ADN/PEI, se transfirieron a un matraz de agitación de 500 mL y se incubó durante 3 horas a 37°C en una incubadora con una atmósfera de CO2 al 5 %. Después de la incubación, se añadieron 160 ml de medio F17 y las células se cultivaron durante 24 horas. El medio de producción se complementó con kifunensina 5 |jM. Un día después de la transfección, se añadió ácido valproico 1 mM y Feed 1 al 7 % con suplementos al cultivo. Después de cultivar durante 7 días, se recogió el sobrenadante de las células mediante sedimentación por centrifugado durante 15 min a 210 x g. La solución se filtró en condiciones estériles (filtro de 0,22 jm ), se complement ó con acida sódica hasta una concentración final de 0,01 % (p/v) y se mantuvo a 4 °C.
Las proteínas secretadas se purificaron de los sobrenadantes de cultivo celular mediante cromatografía de afinidad usando proteína A, seguida de una cromatografía de exclusión por tamaño. Para la cromatografía de afinidad, se cargó el sobrenadante en una columna HiTrap Protein A HP (VC = 5 ml, GE Healthcare) equilibrada con 40 ml de fosfato de sodio 20 mM, citrato de sodio 20 mM, pH7,5. Se retiró la proteína no unida lavando con al menos 10 volúmenes de columna de fosfato de sodio 20 mM, citrato de sodio 20 mM, tampón que contenía cloruro de sodio 0,5 M, (pH 7,5). La proteína unida se eluyó usando un gradiente de pH lineal de cloruro de sodio (de 0 a 500 mM) creado sobre 20 volúmenes de columna de citrato de sodio 20 mM, Tween-20 al 0,01 % (v/v), pH 3,0. A continuación, se lavó la columna con 10 volúmenes de columna de citrato de sodio 20 mM, cloruro de sodio 500 mM, Tween-20 al 0,01 % (v/v), pH 3,0.
El pH de las fracciones recogidas se ajustó añadiendo 1/40 (v/v) de Tris 2 M, pH 8,0. La proteína se concentró y se filtró antes de cargarla en una columna HiLoad Superdex 200 (GE Healthcare) equilibrada con MOPS2 mM, cloruro de sodio 150 mM, solución de azida sódica al 0,02 % (p/v) de pH 7,4.
Para la determinación de la afinidad por el receptor humano, el ectodominio de 4-1BB humano también se subclonó sin cambio de pauta de lectura con una marca avi (G LN D IF E A Q K IE W H E ) y una hexahistidina.
La producción de proteínas se realizó como se describe anteriormente para la proteína de fusión Fc. Las proteínas secretadas se purificaron a partir de sobrenadantes de cultivos celulares mediante cromatografía quelante, seguida de cromatografía de exclusión por tamaño. La primera etapa cromatográfica se realizó en un cartucho NiNTA Superflow (5 ml, Qiagen) equilibrado en fosfato de sodio 20 mM, cloruro de sodio 500 nM, pH 7,4. La elución se realizó aplicando un gradiente sobre un volumen de 12 columnas desde el 5 % al 45 % de tampón de elución (fosfato de sodio 20 mM, cloruro de sodio 500 nM, imidazol 500 mM, pH 7,4). La proteína se concentró y se filtró antes de cargarla en una columna HiLoad Superdex 75 (GE Healthcare) equilibrada con MOPS2 mM, cloruro de sodio 150 mM, solución de azida sódica al 0,02 % (p/v) de pH 7,4 (tabla 33).
Tabla 33: Secuencias de molécula de 4-1BB humano monomérico His
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Ejemplo 4
Caracterización bioquímica de la molécula de unión a antígeno de fusión Fc que contiene un trímero de ligando 4-1BB dirigido a FAP mediante resonancia de plasmón superficial
La unión de moléculas de unión a antígeno de fusión (kih) de Fc que contienen un trímero de ligando 4-1BB dirigido a FAP a 4-1 BB recombinante se evaluó mediante resonancia de plasmón superficial (SPR). Todos los experimentos de SPR se realizaron en un Biacore T100 a 25 °C con HBS-EP como tampón de migración (HEPES 0,01 M, pH 7,4, NaCl 0,15 M, EDTA 3 mM, tensioactivo P20 al 0,005 %, Biacore, Friburgo/Alemania).
La avidez de la interacción entre las moléculas de unión a antígeno de fusión (kih) de Fc que contienen un trímero de ligando 4-1 BB dirigido o no dirigido a FAP y 4-1BB recombinante (humano, de macaco cangrejero y murino) se determinó como se describe a continuación. Los datos demostraron que tanto las moléculas de unión a antígeno de fusión (kih) de Fc que contienen trímeros del ligando 4-1 BB dirigido, así como las moléculas de unión a antígeno de fusión (kih) de Fc que contienen trímeros del ligando 4-1BB de DP47 no dirigido se unen con avideces comparables a las del 4-1BB humano y de macaco cangrejero, pero insignificante para el homólogo de ratón.
Las moléculas de fusión (kih) de Fc 4-1BB de macaco cangrejero y murino, humano biotinilado recombinante se acoplaron directamente en un chip SA usando las instrucciones de acoplamiento estándar (Biacore, Friburgo/Alemania). El nivel de inmovilización fue de aproximadamente 30 UR. Las moléculas de unión a antígeno de fusión (kih) de Fc que contienen un trímero de ligando 4-1BB dirigido a FAP, o los controles no dirigidos a DP47, se pasaron a un intervalo de concentración de 0,39 a 200 nM con un flujo de 30 pL/minuto a través de las células de flujo por más de 120 segundos. Se supervisó la disociación durante 180 segundos. Se corrigieron las diferencias en el índice de refracción aparente restando la respuesta obtenida en una cubeta de lectura de referencia vacía.
Para la medición de la afinidad, se realizó el acoplamiento directo de alrededor de 7200 unidades de resonancia (UR) de un anticuerpo específico Fc antihumano en un chip CM5 a pH 5,0 usando el kit de acoplamiento de amina estándar (GE Healthcare). Se capturaron moléculas de unión a antígeno de fusión (kih) de Fc que contenían un trímero de ligando 4-1BB dirigido o no dirigido a FAP, a 50 nM con un caudal de 30 pl/min durante 60 segundos en la cubeta de lectura 2. Se pasaron series de dilución (1,95 a 1000 nM) de 4-1BB-avi-His humano en ambas cubetas de lectura a 30 pl/min durante 180 segundos para registrar la fase de asociación. Se supervisó la fase de disociación durante hasta 180 s y se activó cambiando de la solución de muestra a HBS-EP. La superficie del chip se regeneró después de cada ciclo usando una inyección doble de 60 s de glicina-HCl 10 mM, pH2,1. Se corrigieron las diferencias en el índice de refracción aparente restando la respuesta obtenida en la cubeta de lectura de referencia 1. Para la interacción entre las moléculas de unión a antígeno de fusión de (kih) de Fc que contienen un trímero de ligando 4-1 BB y 4-1 BB hu avi His, las constantes de afinidad se derivaron de las constantes de velocidad ajustando una curva de unión de Langmuir 1:1 usando el software Biaeval (GE Healthcare).
Tabla 34: Ajustes a las constantes de afinidad y unión de Langmuir 1:1
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Ejemplo 5
Caracterización funcional de las moléculas de unión a antígeno de fusión Fc que contienen un trímero de ligando 4-1BB dirigido
5.1. Unión en PMBC humanas indiferenciadas frente a activadas de las moléculas de unión a antígeno de fusión (kih) de Fc que contienen trímeros del ligando 4-1BB dirigido a FAP
Se obtuvieron capas leucocitarias del centro de donación de sangre de Zúrich. Para aislar células mononucleares de sangre periférica (PBMC) frescas, la capa leucocitaria se diluyó con el mismo volumen de DPBS (Gibco de Life Technologies, n.° de cat. 14190326). Se suministraron tubos de centrífuga de polipropileno de 50 mL (TPP, n.° de cat. 91050) con 15 mL de Histopaque 1077 (SIGMA Life Science, n.° de cat. 10771, polisucrosa y diatrizoato de sodio, ajustados a una densidad de 1,077 g/mL) y la solución de capa leucocitaria diluida se estratificó sobre el Histopaque 1077. Los tubos se centrifugaron durante 30 minutos a 400 x g. A continuación, se recogieron las PBMC de la interfaz, se lavaron tres veces con DPBS y se resuspendieron en medio de linfocitos T que consistía en medio RPMI 1640 (Gibco de Life Technology, n.° de cat. 42401-042) suministrado con suero bovino fetal al 10 % (FBS, Gibco by Life Technology, n.° de cat. 16000-044, lote 941273, irradiado con rayos gamma, sin micoplasmas e inactivado por calor a 56 °C durante 35 min), GlutaMAX-I al 1 % (v/v) (GIBCO de Life Technologies, n.° de cat.
35050 038), piruvato de sodio 1 mM (SIGMA, n.° de cat. S8636), 1 % (v/v) de aminoácidos no esenciales MEM (SIGMA, n.° de cat. M7145) y 50 pM de p-mercaptoetanol (SIGMA, M3148).
Las PBMC se usaron directamente después del aislamiento o se estimularon para inducir la expresión de 4-1BB en la superficie celular de los linfocitos T y NK mediante el cultivo durante 4 días en medio de linfocitos T suplementado con 200 U/mL de proleucina (Novartis Pharma Schweiz AG, CHCLB-P-476-700-10340) y 2 pg/mL de PHA-L (SIGMA, n.° de cat. L2769) en una placa de cultivo de tejidos de 6 pocillos y a continuación, 1 día en una placa de cultivo de tejidos de 6 pocillos recubierta con 10 ug/mL de CD3 antihumano (clon OKT3, BioLegend, n.° de cat. 317315) y 2 pg/mL de CD28 antihumano (clon CD28.2, BioLegend, n.° de cat.: 302928) en medio de linfocitos T a 37 °C y CO2 al 5 %.
Para determinar la unión de moléculas de unión a antígeno de fusión Fc que contienen trímeros de 4-1BBL a PBMC humanas, 0,1 x 106 PBMC indiferenciadas o activadas se añadieron a cada pocillo de una placa de 96 pocillos de célula en suspensión de fondo redondo (Greiner bio-one, cellstar, n.° de cat. 650185). Las placas se centrifugaron durante 4 minutos a 400 x g y a 4 °C. Se descartó el sobrenadante. Posteriormente, las células se tiñeron en 100 pL/pocillo de DPBS que contenía un kit de tinción de células muertas azul fijable VIVO/MUERTO diluido de 1:1000, para excitación UV (Life Technologies, Molecular Probes, L-23105) o colorante de viabilidad fijable eF660 (eBioscience 65-0864-18) o un kit de tinción de células muertas verde fijable VIVO/MUERTO (Life T echnologies, Molecular Probes, L-23101) durante 30 minutos a 4 °C en la oscuridad. Si se usó DAPI como tinción en vivo/muerto, se omitió esta etapa de tinción. Las células se lavaron una vez con 200 pL de tampón FACS frío (DPBS suministrado con FBS al 2 % (v/v), EDTA 5 mM pH 8 (Amresco, n.° de cat. E177) y azida sódica 7,5 mM (Sigma-Aldrich S2002).
A continuación, se añadieron 50 pL/pocillo de tampón FACS frío a 4 °C que contenía diferentes concentraciones tituladas de moléculas de unión a antígeno de fusión Fc que contienen trímeros de 4-1BBL y las células se incubaron durante 120 minutos a 4 °C, se lavaron cuatro veces con 200 pL/pocillo de tampón FACS a 4 °C y se volvieron a suspender. Las células se tiñeron adicionalmente con 50 pL/pocillo de tampón FACS frío a 4 °C que contenía 0,67 pg/mL de CD3-PerCP-Cy5.5 antihumano (clon UCHT1, IgG1K de rat, BioLegend, n.° de cat.
300430) o 0,16 pL de CD3-PE/Cy7 antihumano (clon SP34-2, IgG1 k de rat ón, BD Pharmingen, n.° de cat. 557749, lote 33324597), 0,67 pg/mL de CD45-AF488 antihumano (clon HI30, IgG1K de ratón, BioLegend, n.° de cat.
304017) o 0,12 pg/mL de CD56-FITC antihumano (clon NCAM16.2, IgG2bK de ratón, BD Pharmingen, n.° de cat.
345811) o 1 pL de CD56-APC antihumano (clon b 159, IgG1 k de ratón, BD Pharmingen, n.° de cat. 555518, lote 3098894), 0,25 pg/mL de CD4-BV421 antihumano (clon RPA-T4, IgG1K de rat ón, BioLegend, n.° de cat. 300532) o 0,23 pg/mL de CD4-BV421 antihumano (clon OKt 4, IgG2bK de ratón, BioLegend, n.° de cat. 317434), 0,25 pL de CD8a-APC antihumano (clon RPA-T8, IgG1K de róh, BD P harmingen, n.° de cat. 555369) o 0,67 pL de CD8a-APC/Cy7 antihumano (clon RPA-T8, IgG1K de raón, BioLegend, n.° de cat. 301016) o 0,83 ng/mL de CD8a-BV711 antihumano (clon RPA-T8, IgG1K de raón, BD Pharmingen, n.° de cat. 301044) y 5 pg/mL de fragmento F(ab')2 de IgG de cabra específico de fragmento Fcy de IgG antihumana de AffmiPure conjugado con PE (Jackson ImmunoResearch, n.° de cat. 109 116 098 o 109 116 170). Las células se lavaron dos veces con tampón FACS. Si las células se tiñeron con tintes de viabilidad fijables, se fijaron con 50 pL/pocillo de DPBS que contenía formaldehído al 1 % (Sigma, HT501320-9,5L). Las células se resuspendieron en tampón FACS y se adquirieron al día siguiente o el mismo día usando un LSR-Fortessa de 5 láseres (BD Bioscience con software DIVA) o un analizador cuántico 10 Miltenyi de 3 láseres (Mitenyi Biotec) y Flow Jo (FlowJo X10.0.7). Si se usó tinción DAPI para detectar células muertas, se resuspendieron en 80 pL/pocillo de tampón FACS que contenía 0,2 pg/mL de DAPI (Santa Cruz Biotec, n.° de cat. Sc-3598) y se adquirieron el mismo día usando un LSR-Fortessa de 5 láseres (BD Bioscience con software DIVA).
Como se muestra en la figura 6, las moléculas de unión a antígeno de fusión Fc que contienen un trímero de ligando 4-1BB dirigido o no dirigido a FAP no se unieron a linfocitos T CD4+ humanos en reposo y no mostraron unión detectable a linfocitos T CD8+ en reposo y linfocitos NK. Por el contrario, ambas construcciones se unieron fuertemente a los linfocitos T NK, CD8+ o c D4+ activados, aunque los últimos mostraron una intensidad de fluorescencia específica aproximadamente 10 veces menor en comparación con los linfocitos NK y una intensidad 20 veces menor de fluorescencia específica en comparación con los linfocitos T CD8+.
Las figuras 7A y 7B muestran la unión de las construcciones 1.1 a 1.10 preparadas en el ejemplo 1 en linfocitos T CD3+ CD8+ humanos activados que expresan 4-1BB y linfocitos T CD3+ CD4+ humanos activados que expresan 4-1BB, respectivamente. La tabla 35 muestra los valores de EC50 como se mide para las construcciones 1.1 a 1.10.
Tabla 35: Unión a linfocitos T CD3+ CD8+ humanos activados y linfocitos T CD3+ CD4
Figure imgf000156_0001
Las figuras 8A y 8B muestran la unión de las Construcciones 2.1, 2.3, 2.4, 2.5 y 2.6 preparadas en el ejemplo 2 en CD4+ y CD8+ de sangre humana fresca y en linfocitos T CD4+ y linfocitos T CD8+ que expresan 4-1 b B activados, respectivamente. Las puertas se establecieron en linfocitos T CD45+ CD3+ CD4+ o CD45+ CD3+ CD8+ vivos y el MFI del fragmento F(ab')2 de cabra específico del fragmento Fcy de IgG antihumana de AffmiPure conjugado con PE se transfirieron frente a la concentración titulada de variantes de fusión Fc de ligando 4-1BB trimérico dividido dirigido. La tabla 36 muestra los valores de EC50 como se mide para las construcciones 2.1, 2.3, 2.4, 2.5 y 2.6.
Tabla 36: Unión a linfocitos T CD4+ activados que expresan 4-1BB y linfocitos T CD8+
Figure imgf000156_0002
5.2 Unión de la molécula de unión a antígeno de fusión Fc que contiene un trímero de ligando 4-1BB dirigido a FAP a esplenocitos de ratón activados
Se recogieron bazos de ratón en 3 mL de PBS y se generó una suspensión de células individuales usando tubos MACS suaves (Miltenyi Biotec, n.° de cat. 130-096-334) y un disociador Octo MACS suave (Miltenyi Biotec). Posteriormente, los esplenocitos se filtraron a través de filtros de separación previa de 30 pm (Miltenyi Biotec, n.° de cat. 130-041-407) y se centrifugaron durante 7 minutos a 350 x g y 4 °C. Se aspiró el sobrenadante y las células se resuspendieron en medio RPMI 1640 suministrado con FBS al 10 % (v/v), GlutaMAX-I al 1 % (v/v), piruvato de sodio 1 mM, aminoácidos no esenciales de MEM al 1 % (v/v), p-mercaptoetanol 50 pM y penicilina-estreptomicina al 10 % (SIGMA, n.° de cat. P4333). 106 células/mL se cultivaron durante 2 días en una placa de cultivo tisular de 6 pocillos recubiertos con 10 pg/mL de IgG de hámster armenio anti-CD3s de rat ón (clon 145-2C11, BioLegend, n. de cat. 100331) y 2 pg/mL de IgG de hámster sirio anti-CD28 de ratón (clon 37.51, BioLegend, n.° de cat. 102102).
Se recogieron esplenocitos de ratón activados, se lavaron en DPBS, se contaron y 0,1 x 106 células se transfirieron a cada pocillo de una placa de 96 pocillos tratada de cultivo no tisular de fondo en U. Se eliminó el sobrenadante y las células se tiñeron en 100 pL/pocillo de DPBS que contenía tinte de viabilidad fijable eF660 diluido a 1:5000 (Bioscience, n.° de cat. 65-0864-18) durante 30 minutos a 4 °C. Las células se lavaron con PBS y se tiñeron en 50 uL de tampón FACS que contenía diferentes concentraciones de moléculas de unión a antígeno de fusión Fc que contienen un trímero de ligando 4-1BB dirigido a FAP (trímero 4-1BBL dividido de FAP), moléculas de unión a antígeno de fusión Fc que contienen un trímero de ligando 4-1BB no dirigido (trímero 4-1BBL dividido de DP47) o mAb P329G LALA de IgG1 humana de CD137 anti-ratón (clon Lob. 12.3, # de catálogo de BioXcell: BE0169). Las células se incubaron durante 120 minutos a 4 °C. Las células se lavaron cuatro veces con tampón FACS y se tiñeron en 50 pL/pocillo de tampón FACS que contenía 10 pg/mL de bloque IgG-Fc de rata de anti-CD16/CD32 de ratón purificado (BD Pharmingen, n.° de cat. 553142, clon 2.4G2), 5 pg/mL de IgG2tx -FITC de rata de anti-CD8b de ratón (BioLegend, n.° de cat. 126606, clon YTS156.7.7), 0,67 pg/mL de IgG2b -APC-Cy7 de rata anti-CD3 de ratón (BioLegend, n.° de cat. 100222, clon 17A2), 0,67 pg/mL de IgG2b -PE-Cy7 de rata de anti-CD4 de ratón (BioLegend, n.° de cat. 100422, clon GK1.5), 2 pg/mL de (C3H x BALB/c) IgG2a PerCp-Cy5,5 de ratón anti-NK1,1 de ratón (BioLegend, n.° de cat. 108728, clon PK136) y 10 pg/mL de anti-IgG humana caprino de fragmento F(ab')2 policlonal de AffmiPure conjugado con PE, fragmento Fcy especifico, reacción cruzada mínima con proteínas de suero de conejo y ratón bovino (Jackson ImmunoResearch, n.° de cat. 109-116-170) durante 30 minutos a 4 °C. Las células se lavaron dos veces con 200 pL/pocillo de tampón FACS frío. Las células se fijaron dos veces con 50 pL/pocillo de DPBS que contiene formaldehído al 1 %. Las células se resuspendieron en tampón FACS y se adquirieron al día siguiente usando un LSR-Fortessa de 5 láseres (BD Bioscience con software DIVA).
Como se muestra en la figura 9, moléculas de unión a antígeno de fusión de Fc que contienen un trímero de ligando 4-1BB hu dirigido a FAP (trímero de 4-1BBL hu dividido de FAP) y moléculas de unión a antígeno de fusión Fc que contienen un trímero de ligando 4-1BB hu no dirigido (trímero de 4-1BBL hu dividido de DP47) no se unen al 4-1BB de ratón. Por lo tanto, la actividad no se puede someter a prueba en ratones inmunocompetentes. Para los estudios de modo de acción in vivo, se deben usar modelos de ratón humanizados en ratones inmunocompetentes o sustitutos que contienen trímeros de 4-1BBL de ratón como se muestra en la figura 3.
5.3 Unión a células tumorales que expresan FAP
Para ensayos de unión en células que expresan FAP, se usó la línea celular de melanoma humano MV-3 (véase Ruiter et al., Int. J. Cancer 1991, 48(1), 85-91), WM-266-4 (ATTC CRL-1676) o la línea celular del clon 39 de NIH/3T3-huFAP. Para generar la última línea celular, se transfectaron células NIH/3T3 con FAP humana (clon 39 de NIH/3T3-huFAP). Las células se generaron por transfección de células NIH/3T3 de fibroblasto embrionario de ratón (ATCC CRL-1658) con el plásmido de expresión pETR4921 que codifica FAP humana bajo un promotor de CMV. Las células se mantuvieron en presencia de 1,5 pg/mL de puromicina (InvivoGen, n.° de cat.: ant-pr-5). Se añadieron 0,1 x 106 de células tumorales que expresan FAP a cada pocillo de placas de suspensión de 96 pocillos de fondo redondo (Greiner bio-one, cellstar, n.° de cat. 650185). Las células se lavaron una vez con 200 pL de DPBS y se resuspendieron los sedimentos. Se añadieron 100 pL/pocillo de tampón DPBS frío a 4 °C que contiene tinte de viabilidad fijable eFluor 450 (eBioscience, n.° de catálogo 65-0863-18) diluido a 1:5000 o tinte de viabilidad fijable eFluor 660 (eBioscience, n.° de cat. 65-0864-18) y las placas se incubaron durante 30 minutos a 4 °C. Las células se lavaron una vez con 200 pL de tampón DPBSfrío a 4 °C y se resuspendieron en 50 pL/pocillo de tampón FACS frío a 4 °C (DPBS suministrado con FBS al 2 % (v/v), EDTA 5 mM pH8 (Amresco, n.° de cat. E177) y azida sódica 7,5 mM (Sigma-Aldrich S2002) que contiene diferentes concentraciones de moléculas de unión a antígeno de fusión Fc que contienen trímeros de 4-1BBL tituladas, seguido de incubación durante 1 hora a 4 °C. Después de lavar cuatro veces con 200 pL/pocillo, las células se tiñeron con 50 pL/pocillo de tampón FACS frío a 4 °C que contenía 30 pg/mL de fragmento F(ab')2 caprino específico del fragmento Fcy de anti -IgG humana de AffiniPure conjugado con FITC (Jackson ImmunoResearch, n.° de cat. 109-096-098) o 5 pg/mL de fragmento F(ab')2 caprino específico del fragmento FgY de anti-IgG humana de AffiniPure conjugado con PE (Jackson ImmunoResearch, n.° de cat. 109-116-098 o 109- 116-170) durante 30 minutos a 4 °C. Las células se lavaron dos veces con 200pL de tampón FACS a 4 °C y a continuación, se resuspendieron en 50 pL/pocillo de DPBS que contenía formaldehído al 1 %. El mismo día o al día siguiente las células se resuspendieron en 100 pL de tampón FACS y se adquirieron usando LSR-Fortessa de 5 láseres (BD Bioscience con software DIVA) o Miltenyi Quant Analyzer 10 de 3 láseres (Mitenyi Biotec) y Flow Jo (FlowJo X 10.0.7).
Como se muestra en la figura 10, la molécula de unión a antígeno de fusión (kih) de Fc que contiene un trímero de ligando 4-1BB dirigido a FAP (trímero de 4-1BBL dividido de FAP), construcción 1.1, pero no la construcción no dirigida, que contiene DP47-Fab (trímero de 4-1BBL dividido de DP47), control A, se unió eficazmente a células (10A) MV-3 de melanoma que expresan proteína de activación de fibroblastos humanos (FAP) o células (10B) WM-266-4.
La figura 11A muestra la unión de las construcciones 1.1 a 1.10 como se preparan en el ejemplo 1 a células MV-3 de melanoma humano que expresan FAP humana y en la figura 11B se presenta la unión de las construcciones 1.1, 1.2, 1.3 y 1.5 a células de fibroblasto embrionario de ratón transfectado del clon 39 de NIH/3T3-huFAP que expresan FAP humana. La tabla 37 muestra los valores de EC50 como se mide para las construcciones 1.1 a 1.10.
Tabla 37: Unión a células tumorales que expresan FAP humana
Figure imgf000157_0001
Figure imgf000158_0001
La figura 12 muestra la unión de diferentes construcciones (kih) de Fc ligando de 4-1BB humano trimérico dividido dirigido o no dirigido a FAP (4B9) a células MV-3 de melanoma humano que expresan FAP humana (figura 12A) y células WM-266-4 (figura 12B). Las construcciones 2.1, 2.3, 2.4, 2.5 y 2.6 se prepararon como se describe en el ejemplo 2 y los controles se prepararon como se describe anteriormente en el presente documento. Se establecieron puertas en células tumorales vivas y se transfirieron MFI de fragmento F(ab')2 caprino específico de fragmento Fcy anti-IgG humana de AffiniPure conjugado con PE frente a la concentración titulada de construcciones de fusión Fc de ligando 4-1BB trimérico dividido dirigido. La tabla 38 muestra los valores de EC50 como medidos.
Tabla 38: Unión a células tumorales que expresan FAP humana
Figure imgf000158_0002
5.4 Caracterización funcional de las moléculas de unión a antígeno de fusión (kih) de Fc que contienen un trímero de ligando 4-1BB dirigido murino
5.4.1 Unión a esplenocitos de ratón activados
Se recogieron bazos de ratón en 3 mL de PBS y se generó una suspensión de células individuales usando tubos MACS suaves (Miltenyi Biotec, n.° de cat. 130-096-334) y un disociador Octo MACS suave (Miltenyi Biotec). Posteriormente, los esplenocitos se filtraron a través de filtros de separación previa de 30 pm (Miltenyi Biotec, n.° de cat. 130-041-407) y se centrifugaron durante 7 minutos a 350 x g y 4 °C. Se aspiró el sobrenadante y las células se resuspendieron en medio RPMI 1640 suministrado con FBS al 10 % (v/v), GlutaMAX-1 al 1 % (v/v), piruvato de sodio 1 mM, aminoácidos no esenciales de MEM al 1 % (v/v), p-mercaptoetanol 50 pM.
Para la unión a esplenocitos de ratón frescos se usaron directamente células. Para inducir la expresión de 4-1BB de ratón en células T, los esplenocitos de ratón se activaron como sigue: 106 células/mL se cultivaron durante 2 días en una placa de cultivo tisular de 6 pocillos recubiertos con 10 pg/mL de IgG de hámster armenio anti-CD3s de ratón (clon 145-2C11, BioLegend, n. de cat. 100331) y 2 pg/mL de IgG de hámster sirio anti-CD28 de ratón (clon 37.51, BioLegend, n.° de cat. 102102).
Se recogieron esplenocitos de ratón fresco o esplenocitos de ratón activados, se lavaron en DPBS (Gibco Life technologies, n.° de cat. 14190-136), se contaron y 0,1 x 106 células se transfirieron a cada pocillo de una placa tratada de 96 pocillos de fondo en U de cultivo no tisular (Greiner bio-one, cell star, n.° de cat. 650185). Se eliminó el sobrenadante y las células se tiñeron en 100 pL/pocillo de DPBS frío a 4 °C que contenía el kit de tinción de células muertas Aqua fijable VIVO/MUERTO diluido en 1:1000 (Life Technologies, L34957) durante 30 minutos a 4 °C. Las células se lavaron con DPBS frío y se tiñeron en 50 uL/pocillo de tampón FACS frío (DPBS suministrado con FBS al 2 % (v/v), EDTA 5 mM pH 8 (Amresco, n.° de cat. E177) y azida sódica 7,5 mM (Sigma- Aldrich S2002)) que contiene diferentes concentraciones de moléculas de fusión (kih) de Fc que contienen un trímero de ligando 4-1BB de ratón o control de isotipo de IgG1 k de ratón (BioLegend, n.° de cat. 400153, clon MOPG21). Las células se incubaron durante 120 minutos a 4 °C, se lavaron cuatro veces con DPBS frío y se tiñeron en 50 pL/pocillo de tampón FACS frío que contenía 30 pg/mL de F(ab')2 de IgG caprino específico de Fc gamma de anti-IgG de ratón conjugado con FITC (Jackson Inmunoresearch, n.° de cat. 115-096-071) durante 30 minutos a 4 °C. Posteriormente, las células se lavaron dos veces con DPBS frío y se tiñeron con 50 pL/pocillo de tampón FACS suministrado con 10 pg/mL de bloque de IgG-Fc de rata de anti-CD16/CD32 de ratón purificado (BD Pharmingen, n.° de cat. 553142 clon 2.4G2), 0,67 pg/mL de anti-CD8a-APC-Cy7 de ratón (BioLegend, n.° de cat. 100714, clon 53-6.7), 0,67 pg/mL de anti-CD3s-PerCP-Cy5,5 de ratón (BioLegend, n.° de cat. 100328, clon 145-2C11), 0,67 pg/mL de IgG2bK-PE-Cy7 de rata anti-CD4 de ratón (BioLegend, n.° de cat. 100422, clon GK1.5) durante 30 minutos a 4 °C. Las células se lavaron dos veces con 200 pL/pocillo de DPBS frío, se fijaron con 50 pL/pocillo de DPBS que contenía formaldehído al 1 % y se resuspendieron en tampón FACS. Las células se adquirieron usando MACSQuant Analyzer 10 de 3 láseres (Miltenyi Biotech) y Flow Jo v10.0.7 (FlowJo LLC). Las puertas se establecieron en linfocitos T CD3+ CD8+ o CD3+ CD4+ y la intensidad de fluorescencia media (MFI) de F(ab')2 de IgG caprino específico de Fc-gamma de anti-IgG de ratón conjugado con FITC se analizó y normalizó mediante la sustracción de la MFI del control en blanco (sin adición de molécula de fusión (kih) de Fc que contiene un trímero de ligando 4-1BB de ratón). La MFI se transfirió frente a la concentración de moléculas de fusión (kih) de Fc que contienen un trímero de ligando 4-1BB de ratón usadas para mostrar la unión a la molécula de unión celular de 4-1BB de ratón.
Como se puede observar en la figura 13, las construcciones M.1 y M.2 de 4-1BBL murino, así como las moléculas de control correspondientes Control M.1 y Control M.2 se unen con una afinidad bastante similar a 4-1BB de ratón. La tabla 39 muestra los valores de EC50 como se mide para las construcciones M.1 y M.2 y las moléculas de control.
Tabla 39: Unión a linfocitos T CD4+ activados que expresan 4-1BB y linfocitos T CD8+
Figure imgf000159_0001
5.4.2 Unión a células tumorales que expresan FAP
Para ensayos de unión en células que expresan FAP, se usó la línea celular de melanoma humano MV-3 (véase Ruiter et al., Int. J. Cancer 1991,48(1), 85-91) y WM-266-4 (ATTC CRL-1676) (el clon 28H1 específico de anti-FAP es de reacción cruzada de ratón/humano). Se añadieron 0,1 x 106 de células tumorales que expresan FAP a cada pocillo de placas de suspensión de 96 pocillos de fondo redondo (Greiner bio-one, cellstar, n.° de cat. 650185). Las células se lavaron una vez con 200 pL de DPBS frío y los sedimentos se resuspendieron en 100 pL/pocillo de tampón DPBS frío a 4 °C que contenía el kit de tinción de células muertas Aqua fijable VIVO/MUERTo diluido en 1:1000 (Life Technologies, L34957) y se incubaron durante 30 minutos a 4 °C. Las células se lavaron una vez con 200 pL de tampón DPBS frío y se resuspendieron en 50 pL/pocillo de tampón FACS frío (DPBS suministrado con FBS al 2 % (v/v), EDTA 5 mM pH 8 (Amresco, n.° de cat. E177) y azida sódica 7,5 (Sigma-Aldrich S2002)) que contiene moléculas de fusión (kih) de Fc que contienen un trímero de ligando 4-1BB murino en una serie de concentraciones seguido de incubación durante 1 hora a 4 °C. Después de lavar cuatro veces con 200 pL de DPBS/pocillo, las células se tiñeron con 50 pL/pocillo de tampón FACS frío a 4 °C que contenía 30 pg/mL de F(ab')2 de IgG caprino específico de Fc-gamma de anti- IgG de ratón conjugado con FITC (Jackson Immunoresearch, n.° de cat. 115-096-071) durante 30 minutos a 4 °C. Las células se lavaron dos veces con 200 pL/pocillo de tampón DPBS frío, se fijaron con 50 pL/pocillo de DPBS que contenía formaldehído al 1 % y se resuspendieron en tampón FACS. Las células se adquirieron usando MACSQuant Analyzer 10 de 3 láseres (Miltenyi Biotech) y Flow Jo v10.0.7 (FlowJo LLC). Las puertas se establecieron en células vivas y la intensidad de fluorescencia media (MFI) de F(ab')2 de IgG caprino específico de Fc-gamma de anti-IgG de ratón conjugado con FITC se analizó y normalizó mediante la sustracción de la MFI del control en blanco (sin adición de molécula de fusión (kih) de Fc que contiene un trímero de ligando 4-1BB de ratón). La MFI se transfirió frente a la concentración de moléculas de fusión (kih) de Fc que contienen un trímero de ligando 4-1 BB murino usadas para mostrar la unión a la molécula de unión celular de 4-1BB murino. Como se esperaba, las construcciones M.1 y M.2 de 4-1BBL murino se unen con una afinidad bastante similar a FAP mientras que las moléculas de control no se unen.
La figura 14 muestra la unión de las construcciones M.1 y M.2 de (kih) de Fc ligando de 4-1 BB murino trimérico dividido dirigido o no dirigido a FAP a células MV-3 de melanoma humano que expresan FAP humana (figura 14A) y células WM-266-4 (figura 14B). La tabla 40 muestra los valores de EC50 como medidos.
Tabla 40: Unión a células tumorales que expresan FAP humana
Figure imgf000159_0002
4-1BB dirigido
6.1. Activación de NF-kB en células HeLa que expresan 4-1BB humano
Generación de células HeLa que expresan 4-1BB y NF-KB-luciferasa humanos
La línea celular de carcinoma de cuello uterino HeLa (ATCC CCL-2) se transdujo con un plásmido basado en el vector de expresión pETR10829, que contiene la secuencia de 4-1BB humano (n.° de acceso de Uniprot Q07011) bajo el control de un promotor de CMV y un gen de resistencia a la puromicina. Las células se cultivaron en medio DMEM suplementado con FBS al 10 % (v/v), GlutaMAX-I al 1 % (v/v) y 3 pg/mL de puromicina.
Las células HeLa transducidas con 4-1BB se sometieron a prueba para determinar la expresión de 4-1BB mediante citometría de flujo: 0,2 x 106 células vivas se resuspendieron en 100 pL de tampón FACS que contenía 0,1 pg de 4B4-1 de IgGlK de ratón de 4-1BB antihumano conjugado con PerCP/Cy5,5 (BioLegend n.° de cat. 309814) o su control de isotipo (clon MOPC-21 de anticuerpo de control de isotipo IgGlK de ratón conjugado con PerCP/Cy5,5, BioLegend n.° de cat. 400150) y se incubó durante 30 minutos a 4 °C. Las células se lavaron dos veces con tampón FACS, se resuspendieron en 300 pL de tampón FACS que contenía 0,06 pg de DAPI (Santa Cruz Biotec, n.° de cat. Sc-3598) y se adquirieron usando un LSR-Fortessa de 5 láseres (BD Bioscience, software DIVA). Se realizaron diluciones limitadas para generar clones individuales como se describe: las células HeLa transducidas con 4-1BB humano se resuspendieron en medio a una densidad de 10, 5 y 2,5 células/ml y se transfirieron 200 pl de suspensiones celulares a placas de 96 pocillos tratadas con cultivo de tejido de fondo redondo (6 placas/concentración celular, TPP n.° de cat. 92697). Los clones individuales se recolectaron, expandieron y sometieron a prueba para la expresión de 4-1 BB como se describe anteriormente. El clon con la expresión más alta de 4-1BB (clon 5) se eligió para la transfección posterior con el vector de expresión 5495p translúcido HygB de NF-KB-luciferasa. El vector confiere a las células transfectadas tanto resistencia a la higromicina B como capacidad para expresar luciferasa bajo el control del elemento de respuesta a NF-kB (vector de columna vertebral Panomics, n.° de cat. LR0051 con resistencia introducida a HyB). Se cultivaron células del clon 5 HeLa de 4-1BB humano hasta una confluencia del 70 %. Se añadieron 50 pg (40 pL) de vector de expresión 5495p translúcido HygB linealizado (enzimas de restricción Asel y Sail) a una cubeta Gene Pulser/MicroPulser estéril de 0,4 cm (Biorad, n.° de cat. 165-2081). Se añadieron 2,5 x106 células de clon 5 HeLa de 4-1BB humano en 400 pl de medio Dm EM libre de suplemento y se mezclaron cuidadosamente con la solución de plásmido. La transfección de las células se realizó usando un sistema total Gene Pulser Xcell (Biorad, n.° de cat. 165-2660) bajo las siguientes configuraciones: pulso exponencial, capacitancia 500 pF, voltaje 160 V, resistencia ~. Inmediatamente después de que las células transfectadas por pulso se transfirieron a un matraz de cultivo tisular de 75 cm2 (TPP, n.° de cat.
90075) con 15 mL de medio d Me M caliente a 37 °C suministrado con FBS al 10 % (v/v) GlutaMAX-1 al 1 % (v/v). Al día siguiente, se añadió medio de cultivo que contenía 3 pg/mL de puromicina y 200 pg/mL de higromicina B (Roche, n.° de cat. 10843555001). Las células supervivientes se expandieron y se realizó una dilución limitada como se describe anteriormente para generar clones individuales.
Los clones se sometieron a prueba para determinar la expresión de 4-1BB como se describe anteriormente y para la actividad de la NF-KB-Luciferasa como sigue: los clones se recogieron en medio de selección y se contaron usando un contador celular Vi-cell xr 2.03 (Beckman Coulter, n.° de cat. 731050). Las células se fijaron a una densidad celular de 0,33 x 106 células/mL y 150 pL de esta suspensión celular fueron transferidos a cada pocillo de una placa de cultivo tisular estéril de fondo plano de 96 pocillos con tapa (greiner bio-one, n.° de 655083) y, como control, a una placa de cultivo tisular de fondo plano normal de 96 pocillos (TPP, n.° de cat. 92096) para probar la supervivencia y la densidad celular al día siguiente. Las células se incubaron durante la noche a 37 °C y CO2 al 5 %. Al día siguiente, se añadieron 50 pL de medio que contenía diferentes concentraciones de factor alfa de necrosis tumoral humano recombinante (rhTNF-a, PeproTech, n.° de cat. 300-01A) a cada pocillo de una placa de 96 pocillos, lo que dio como resultado la concentración final de rhTNF-a de 100, 50, 25, 12,5, 6,25 y 0 ng/pocillo. Las células se incubaron durante 6 horas a 37 °C y CO2 al 5 % y a continuación, se lavaron tres veces con 200 pL/pocillo de DPBS. Se añadió tampón de lisis indicador (Promega, n.° de cat.: E3971) a cada pocillo (40 pl) y las placas se almacenaron durante la noche a -20 °C. Al día siguiente, las placas de células congeladas y el tampón de detección (Luciferase 1000 Assay System, Promega, n.° de cat. E4550) se descongelaron a temperatura ambiente. Se añadieron 100 uL de tampón de detección a cada pocillo y la placa se midió lo más rápido posible usando un lector de microplacas SpectraMax M5/M5e y el software SoftMax Pro (Molecular Devices). Las unidades de luz liberada medidas durante 500 ms/pocillo (URL) por encima del control (sin adición de rhTNF-a) se tomaron como actividad luciferasa. El clon 26 de NF-KB-luc-4-1BB-HeLa que presenta la mayor actividad luciferasa y un nivel considerable de expresión de 4-1BB se eligió para su uso posterior.
Activación de NF-kB en élulas Hela que expresan 4 -1BB humano cocultivadas con células tumorales que expresan FAP
Se recolectaron las células HeLa de 4-1BB humano de NF-KB-luciferasa y se resuspendieron en medio DMEM suministrado con FBS al 10 % (v/v) y GlutaMAX-1 al 1 % (v/v) a una concentración de 0,2 x 106 células/ml. 100 pl (2 x 104 células) de esta suspensión celular se transfirieron a cada pocillo de una placa de cultivo tisular estéril blanca de 96 pocillos de fondo plano con tapa (greiner bio-one, n.° de cat. 655083) y la placa se incubaron a 37 °C y CO2 al 5 % durante la noche. Al día siguiente, 50 pL de medio que contiene concentraciones tituladas de moléculas de unión a antígeno de fusión Fc que contienen un trímero de ligando 4-1BB dirigido a FAP (trímero de 4-1BBL dividido de FAP) o moléculas de unión a antígeno de fusión Fc que contienen un trímero de ligando 4-1BB no dirigido a DP47 (trímero 4-1BBL dividido de DP47). Las células tumorales que expresan FAP (MV3, WM-266-4 o el clon 39 de NIH/3T3-huFAP) se resuspendieron en medio DMEM suministrado con FBS al 10 % (v/v) y GlutaMAX-1 al 1 % (v/v) a un concentración de 2 x 106 células/ml.
Se añadió la suspensión de células tumorales que expresan FAP (50 pl, proporción final 1:5) o solo medio a cada pocillo y las placas se incubaron durante 6 horas a 37 °C y CO2 al 5 %. Se lavaron las células dos veces con 200 pL/pocillo de DPBS. 40 pl de tampón de lisis indicador de reciente preparación (Promega, n.° de cat.: E3971) se añadieron a cada pocillo y las placas se almacenaron durante la noche a -20 °C. Al día siguiente, las placas de células congeladas y el tampón de detección (Luciferase 1000 Assay System, Promega, n.° de cat. E4550) se descongelaron a temperatura ambiente. Se agregaron 100 pL de tampón de detección a cada pocillo y se midió la actividad de luciferasa lo más rápido posible usando un lector de microplacas SpectraMax M5/M5e y un software SoftMax Pro (Molecular Devices) contando la emisión de luz en URL (unidades de luz liberada por 0,5s/pocillo) o el lector de placas de contador de marcador múltiple Victor3 1420 (Perkin Elmer) y el software de gestión Perkin Elmer 2030 que cuenta la emisión de luz como recuentos por segundo (CPS) y se transfiere frente a la concentración de las construcciones sometidas a prueba.
La molécula de unión a antígeno de fusión Fc que contiene un trímero de ligando 4-1BB dirigido a FAP (trímero 4-1BBL dividido de FAP) desencadenó la activación de la vía de señalización dB INF laírhea celular indicadora en presencia de células tumorales que expresan FAP. Por el contrario, la variante no dirigida de la misma molécula no logró desencadenar dicho efecto en ninguna de las concentraciones sometidas a prueba (figura 16). Esta actividad de 4-1BBL dirigido dependía estrictamente de la expresión de FAP en la superficie celular de las células tumorales, ya que no se pudo detectar ninguna activación de NF-kB tras el cultivo de la línea celular indicadora de NF-kB con células tumorales negativas para FAP incluso en presencia de la molécula de unión a antígeno de fusión Fc que contiene un trímero de ligando 4-1BB dirigido a FAP. Las actividades medidas para las construcciones 1.1 a 1.10 se muestran en la figura 17 y los datos medidos para las construcciones 2.1,2.4 y 2.5 se presentan en la figura 18.
6.2. Activación de NFkB en células HEK T293 que expresan 4-1BB de macaco cangrejero
Generación de células HEK T293 que expresan 4-1BB de macaco cangrejero y NFKB-luciferasa
Para la producción de partículas de tipo vírico (VLP), se transfectó el riñón embrionario humano (HEK) T293/17 (ATCC CRL-11268) usando reactivo LTX Lipofectamine® con reactivo PLUS™ (Life Technologies, n.° de cat.
15338100) con el vector pETR14372 que codifica un casete de gen indicador de NFKB-luciferasa-IRIS-GFP (NFkB-1uc-GFP) de acuerdo con el protocolo del fabricante. Seis horas más tarde se realizó DMEM suministrado con un 10 % de reemplazo de medio FBS y las VLP se recogieron 4 días después. Se transdujeron células HEK293T frescas a una confluencia del 70-80 % con el pETR14372-VLP producido y polibreno de 4 pg/mL. Las células se cultivaron durante 24 horas y se realizó un intercambio de medio. Se recogieron las células h Ek T293/17 transducidas y se realizó una dilución limitada de 1 célula/pocillo para cribar clones individuales estables. Los clones individuales se estimularon con 25 ng/mL de TNF-a (PeproTech Inc., n.° de cat. 300-01 A) en el medio y se cribaron para detectar una señal de GFP positiva a lo largo del tiempo usando el sistema de microscopio de fluorescencia Incuyte Zoom (Essen Bioscience). Posteriormente, las células de registro de señales de GFP se sometieron a prueba para determinar la actividad de luciferasa usando el kit de luciferasa Nano Glo (Promega, N1120) de acuerdo con el protocolo del fabricante. La actividad de luciferasa se midió usando un lector de placas de contador de marcador múltiple Victor3 1420 (Perkin Elmer) y el software de gestión Perkin Elmer 2030. La emisión de luz se contó en recuentos por segundo (CPS) durante 0,5 s/pocillo. El clon 61 mostró la expresión más alta de GFP y luciferasa después de la activación de TNF-a y se us ó adicionalmente para la generación de la línea celular indicadora.
Como se describe anteriormente, se produjeron nuevas VLP usando el vector pETR14879 que codifica 4-1BB de macaco cangrejero y una resistencia a la puromicina y la línea celular del clon 61 de NFkB -fluc-GFP HEK293T se transdujo a una confluencia del 70-80 % con el pETR14879-VLP producido y 4 pg/mL de polibreno. Las células se cultivaron durante 24 horas y se realizó un intercambio de medio. Cuatro días después de la transducción, las células se tiñeron con anticuerpo 4-1BB de reacción cruzada de macaco cangrejero antihumano conjugado con PE (IgG1K de ratón, clon MOPC-21, BioLegend, n.° de cat. 309804) en DPBS que contenía FBS al 1 %, se clasificaron por FACS (ARIA, BD) y se sembraron con 5 células/pocillo en DMEM provisto de medio FBS al 10 % que contenía 1 pg/mL de puromicina (InvivoGen, n.° de cat. ant-pr). Los clones en crecimiento se sometieron a prueba como se describe para la actividad de GFP y luciferasa después de la estimulación con TNF-a y para una alta expresión de 4-1BB de macaco cangrejero por citometría de flujo. Se eligieron clones doblemente positivos y se sometió a prueba la actividad luficerasa en presencia de la construcción 2.1 dirigida a FAP monovalente o el control B y células MV-3 o WM-266-4 que expresan FAP. Se eligió el clon 61-13 que expresa He K T293/17-NF-KB-luc-GFP-cy4-1BB para su uso en todos los experimentos posteriores.
Activación de NFB de las édulas indicadoras HEK T293/17 que expresan 4 -1BB de macaco cangrejero cocultivado con células tumorales que expresan FAP
Se recogieron células del clon 61-13 que expresan HEK T293/17-NFKB-luc-GFP-cy4-1BB y se resuspendieron en medio DMEM suministrado con FBS al 10 % (v/v) y GlutaMAX-I al 1 % (v/v) a un concentración de 0,2 x 106 células/mL. 100 pl (2 x 104 células) de esta suspensión celular se transfirieron a cada pocillo de una placa de cultivo tisular estéril blanca de 96 pocillos de fondo plano con tapa (greiner bio-one, n.° de cat. 655083) y la placa se incubaron a 37 °C y CO2 al 5 % durante la noche. Al día siguiente, se añadieron 50 pL de medio que contenía diferentes concentraciones tituladas de moléculas de unión a antígeno de fusión Fc que contenían un trímero de ligando 4-1BB dirigido o no dirigido a FAP. Las células tumorales que expresan FAP (MV3 y WM-266-4) se resuspendieron en medio a una concentración de 2 x 106 células/ml. Se añadió suspensión de células tumorales que expresan FAP (50 pl) a cada pocillo y las placas se incubaron durante 6 horas a 37 °C y CO2 al 5 %. El principio de este ensayo se muestra en la figura 19. Después de la incubación, las células se lavaron tres veces con 200 pL/pocillo de DPBS. 40 pl de tampón de lisis indicador de reciente preparación (Promega, n.° de cat.: E3971) se añadieron a cada pocillo y las placas se almacenaron durante la noche a -20 °C. Al día siguiente, las placas de células congeladas y el tampón de detección (Luciferase 1000 Assay System, Promega, n.° de cat. E4550) se descongelaron a temperatura ambiente. Se añadieron 100 pL de tampón de detección a cada pocillo y se midió la actividad luciferasa lo más rápido posible usando un lector de microplacas SpectraMax M5/M5e (Molecular Devices) (tiempo de integración de 500 ms, sin filtro que recoja toda la longitud de onda). La emisión de luz se contó en unidades de luz liberada (URL) durante 0,5 s/pocillo y se transfirió frente a la concentración de moléculas de unión a antígeno de fusión Fc que contienen un trímero de ligando 4-1BB dirigido o no dirigido a FAP sometidas a prueba. Los resultados de las construcciones del ejemplo 2 se muestran en la figura 20.
6.3 Ensayo basado en linfocitos T CD8+ específicos de antígeno
Aislamiento y cultivo de linfocitos T CD8 específicos de antígeno
Se obtuvo sangre fresca de un voluntario infectado con CMV HLA-A2+. Se aislaron PBMC como se describe anteriormente. Los linfocitos T CD8 se purificaron a partir de PBMC usando un kit de aislamiento de linfocitos T CD8 humanos de selección negativa de acuerdo con las recomendaciones del fabricante (Miltenyi Biotec, n.° de cat. 130-094-156). Se resuspendieron diez millones de linfocitos T CD8 aislados en 1 mL de DPBS estéril suplementado con FBS al 1 % (v/v) junto con 50 pL de pentámero HLA-A2 marcado con PE que contenía el péptido NLVPMVATV derivado de CMV (Prolmmune, n.° de cat. F008-2B) y se incubó durante 10 minutos a temperatura ambiente. Las células se lavaron dos veces con 3 mL de DPBS estéril suministrado con FBS al 1 % (v/v). Las células se resuspendieron en 1 mL de células DPBS suministradas con FBS al 1 % (v/v) que contiene 1 pg/mL de anti-CD8-FITC humano (clon LT8, Abcam, n.° de cat. Ab28010) y se incubaron durante 30 minutos a 4 °C. Las células se lavaron dos veces, se resuspendieron a una concentración de 5 x 106 células/mL en DPBS suministrado con FBS al 1 % (v/v), y se filtraron a través de un tamiz celular de red de nailon de separación previa de 30 pm (Miltenyi Biotec, n.° de cat. 130- 041-407). Se aislaron linfocitos T CD8+ específicos del péptido NLV mediante clasificación de FACS usando un clasificador de células ARIA (BD Bioscience con software DIVA) con las siguientes configuraciones: boquilla de 100 pm y mascarilla de clasificación de pureza. Las células clasificadas se recogieron en un tubo de centrífuga de polipropileno de 15 ml (TPP, n.° de cat. 91015) que contenía 5 ml de medio RPMI 1640 suministrado con FBS al 10 % (v/v), GlutaMAX-I al 1 % (v/v) y 400 U/mL de proleucina. Las células clasificadas se centrifugaron durante 7 minutos a 350 x g a temperatura ambiente y se resuspendieron en el mismo medio hasta una concentración de 0,53 x 106 células/mL. Se añadieron 100 pL/pocillo de esta suspensión celular a cada pocillo de una placa de alimentación preparada previamente.
Se prepararon células alimentadoras alogénicas irradiadas activadas con PHA-L a partir de PBMC como se describe previamente (Levitsky et al., 1998) y se distribuyeron en placas de cultivo de 96 pocillos a razón de 2 x 105 células alimentadoras por pocillo.
Después de un día de cultivo, se retiraron 100 pL de medio/pocillo del pocillo que contenía linfocitos T CD8+ clasificados y se reemplazaron por un nuevo medio RPMI 1640 complementado con FBS al 10 % (v/v) y GlutaMAX-I al 1 % (v/v) y 400 U/mL de proleucina. Esto se repitió durante el cultivo de forma regular (cada 2-4 días). Tan pronto como las células comenzaron a proliferar, se transfirieron a una placa de cultivo tisular de fondo plano de 24 pocillos (TPP, 92024). Las células se expandieron/dividieron y se reactivaron con una nueva preparación de células alimentadoras de forma regular.
Ensayo de activación de linfocitos T CD8+ específicos de antígeno
Las células MV3 se recolectaron y se lavaron con DPBS y 2 x 107 células se resuspendieron en 250 pL de C diluyente del kit de conector celular de fluorescencia rojo PKH-26 (Sigma, n.° de cat. PKH26GL). Se diluyó 1 pL de solución de tinción roja PKH26 con 250 pL de diluyente C y se añadió a la suspensión de células MV3 que a continuación se incubaron durante 5 minutos a temperatura ambiente en la oscuridad. A esto le siguió la adición de 0,5 mL de FBS y las células se incubaron durante 1 minuto y se lavaron una vez con medio de linfocitos T que consistía en medio RPMI 1640 complementado con FBS al 10 % (v/v), GlutaMAX-I al 1 % (v/v), piruvato de sodio 1 mM, aminoácidos no esenciales de MEM al 1 % (v/v) y 50 pm de p-mercaptoetanol. 1 x 106 de células MV3 células/mL se resuspendieron en medio de linfocitos T y se separaron en tres tubos. Se añadió péptido sintético NLVPMVATV (obtenido a partir de thinkpeptides) a una concentración final de 1 x 10-9 M o 1 x 10-8 M y las células se incubaron durante 90 minutos. Las células MV3 se lavaron una vez con medio de linfocitos T y se resuspendieron a una densidad de 0,5 x 106 células/mL, se distribuyeron (100 pL/pocillo) en una placa de suspensión celular de fondo redondo de 96 pocillos (Greiner bio-one, cellstar, n.° de cat. 650185) y se incubaron durante la noche a 37 °C y CO2 al 5 %. El principio de este ensayo se muestra en la figura 21.
Al día siguiente, se añadieron 50 pL/pocillo de medio de linfocitos T que contenía diferentes concentraciones tituladas de moléculas de unión a antígeno de fusión Fc que contienen un trímero de ligando 4-1BB dirigido. Se recogieron linfocitos T CD8 específicos de NLV, se añadió CFDA-SE (5(6)-carboxifluoresceindiacetato-N-succinimidiléster, SIGMA-Aldrich, n.° de cat. 21888-25MG-F) hasta una concentración final de 40 nM y las células se incubaron en rotación durante 15 minutos a 37 °C. Se detuvo el marcado añadiendo FBS, las células se lavaron y se resuspendieron en medio de linfocitos T a una concentración final de 0,125 x 106 células/mL. Se añadieron 50 pL de esta suspensión de linfocitos T CD8 marcados con CFSE a cada pocillo (proporción final E:T = 1:8). Las placas celulares se incubaron durante 24 horas, se retiraron 50 pL/pocillo y se añadieron 50 pL de medio de linfocitos T que contiene 2,64 pL/mL de parada de Golgi (inhibidor del transporte de proteínas que contiene monesina, BD Bioscience, n.° de cat. 554724) (concentración final 0,66 pL/mL). Las células se incubaron durante 4 horas y a continuación las placas se lavaron con 200 pL/pocillo de DPBS y se tiñeron con 100 pL/pocillo de DPBS a 4 °C que contenía tinte de viabilidad fijable eF450 diluido en 1:5000 (eBioscience, n.° de cat. 65-0864) durante 30 minutos a 4 °C. Las placas celulares se lavaron con 200 pL/pocillo de DPBS seguido de tinción con anticuerpos conjugados con colorante fluorescente: anti-CD137-PerCP/Cy5,5 humano (clon 4B4-1, IgGlK de ratón, BioLegend, n.° de cat. 309814), anti-CD8-BV605 humano (clon RPA-T8, IgGlK de róti, BioLegend, n.° de cat. 301012) o 0,67 pg/mL de CD8a -APC/Cy7 antihumano (clon RPA-T8, IgG1K de rat ón, BioLegend, n.° de cat. 301016) y CD25 PE/Cy7 antihumano (clon Bc 96, IgG1K de rat ón, BioLegend, n.° de cat. 302612). Después de la incubación durante 30 minutos a 4 °C, las células se lavaron dos veces con 200 pL/pocillo de tampón de FACS, se resuspendieron en 50 pL/pocillo de tampón FoxP3 fijo/permanente recién preparado (eBioscience, n.° de cat. 00-5123 y 00-5223) y se incubaron durante 30 minutos a 4 °C. Las placas se lavaron dos veces con 200 pL/pocillo de tampón permanente (DPBS suministrado con FBS al 2 % (v/v), saponina al 1 % (p/v) (Sigma Life Science, S7900) y azida sódica al 1 % (p/v) (Sigma-Aldrich, S2002) y se tiñieron con 50 pL/pocillo de tampón permanente (eBioscience, n.° de cat. 00-8333-56) que contiene 0,25 pg/mL de anti-IFNY-APC humano (clon B27, IgG1K déi,raBioLegend, n.° de cat. 506510) o 0,33 pg/mL de anti-IFNY-BV510 humano (clon 4S.B3, IgG1K de ratón, BioLegend, n.° de cat. 502543). Las placas se incubaron durante 1 hora a 4 °C y se lavaron dos veces con 200 pL/pocillo de tampón permanente. Para la fijación, se añadieron 50 pL/pocillo de DPBS que contenía formaldehído al 1 %. El mismo día o al día siguiente las células se resuspendieron en 100 pL/pocillo de tampón de FACS y se adquirieron usando un citómetro de flujo Fortessa de 5 láseres (BD Bioscience con software DlVA) o Miltenyi Quant Analyzer 10 de 3 láseres (Mitenyi Biotec) y Flow Jo (FlowJo X 10.0.7).
Como se muestra en las figuras 22 y 23 para las construcciones 1.1 a 1.10 y en las figuras 24 y 25 para las construcciones 2.1, 2.3 y 2.4, los linfocitos T CD8+ específicos de antígeno, pero no los controles no estimulados, presentaron mayores niveles de expresión de 4-1BB superficial en presencia de la molécula de unión a antígeno de fusión Fc que contiene un trímero de ligando 4-1BB dirigido a FAP (trímero 4-1BBL dividido de FAP). Este efecto de 4-1BBL dependía de la dosis y requería que se hiciera el direccionamiento de FAP ya que la adición de la molécula de control no dirigida no afectó el nivel de expresión de 4-1 BB. Además, los linfocitos T activadas a la concentración de péptido más alta (1 x 10-8 M) mostraron secreción sostenida de INFy en presencia de la mol écula de unión a antígeno de fusión Fc que contiene un trímero de ligando 4-1BB dirigido a FAP (trímero 4-1BBL dividido de FAP). Conjuntamente, estos datos demuestran que la molécula de unión a antígeno de fusión Fc que contiene un trímero de ligando 4-1BB dirigido a antígeno modula el fenotipo superficial y la capacidad de respuesta de los linfocitos T específicas de antígeno de una manera dependiente del direccionamiento.
6.4 Comparación de moléculas de unión a antígeno de fusión Fc de 4-1BBL Fc de ratón dirigido y no dirigido a la célula
Se prepararon moléculas de unión a antígeno de fusión Fc que contienen un trímero de ligando 4-1BB de ratón dirigido y no dirigido (trímero 4-1BBL de ratón dividido de FAP y trímero 4-1BBL de ratón dividido de DP47) como se describe en el ejemplo 1.3.
Para comparar la bioactividad de las moléculas de unión a antígeno de fusión Fc que contienen un trímero de ligando 4-1 BB de ratón dirigido y no dirigido a la célula, el tinte de proliferación marcado con eFlour670 (eBioscience, n.° de catálogo 65-0840-90) o el tinte de proliferación celular violeta marcado con CellTrace (Cell tracer, n.° de cat. C34557) se cocultivaron esplenocitos de ratón frescos durante 3-4 días en placas de fondo en U de cultivo tisular de 96 pocillos (TTP, n.° de cat. 92097) con células del clon 39 de NIH/3T3-huFAP irradiadas con 50 Gy de adhesión (para generación véase 5.3) en medio RPMI 1640 (Gibco, n.° de cat. 42401-042) suministrados con FBS al 10 % (v/v), GlutaMAX-I al 1 % (v/v), piruvato de sodio 1 mM, aminoácidos no esenciales de MEM al 1 % (v/v) y se añadió 50 pm dep -mercaptoetanolina, la presencia de 0,5 pg/mL de IgG de hámster sirio anti-CD3 de ratón (clon 145-2C11, BD, n.° de cat. 553057) y la molécula candidata al fármaco indicado en un intervalo de concentraciones (figura 26). Después de tres o cuatro días, las células se lavaron con tampón de FACS y se tiñeron durante 30 minutos a 4 °C en 25 uL de tampón de FACS/pocillo que contenía IgG2a-BV711de rata de anti-CD8 de ratón (BioLegend, n.° de cat. 100747, clon 53-6.7,) y IgG2a-BV421 de rata de anti-CD4 de ratón (BioLegend, n.° de cat. 100544, clon RM4-5) y 0,67 pg/mL de IgG-PE de hámster sirio (4-1BB) de anti-CD137 de ratón (BioLegend, n.° de cat. 106106, clon 17B5) y IgG2b de rata de anti-CD25-PErCP-Cy5,5 de ratón (BioLegend, n.° de cat. 1019112). Las células se lavaron y se incubaron durante 1 hora a temperatura ambiente en tampón fijo/permanente preparado (Foxp3/conjunto de tampón de tinción de factor de transcripción, eBioscience, n.° de cat. 00-5523-00). Las células se lavaron dos veces con tampón permanente recién preparado y se tiñeron conjuntamente con 25 pL/pocillo de tampón permanente que contenía anticuerpos marcados con fluorescencia frente al factor de transcripción de linaje citotóxico Eomes, es decir, Eomes anti-ratIgG2a-AlexaFluor488 de ratón (eBioscience, n.° de cat. 534875, clon Dan11mag) y, si CD137 no se tiñó, frente a la molécula efectora citotóxica granzima B, es decir, granzima B de IgG2a de rata-PE (eBioscience, n.° de cat. 128822, clon 16G6) durante 1 hora a temperatura ambiente. A continuación, las células se lavaron dos veces, se resuspendieron en tampón de FACs y se adquirieron usando un citómetro de flujo láser Fortessa (BD Bioscience con software DIVA) o el MACSQuant Analyzer 10 de 3 láseres (Miltenyi Biotech) y Flow Jo v10.0.7 (FlowJo LLC). Se establecieron puertas en linfocitos T c D8+ vivos y linfocitos T CD4+ y se determinó la frecuencia de proliferación celular, así como los niveles de expresión de CD25, Eomas y la granzima B o CD137. La frecuencia de proliferación y las frecuencias y MFI de los marcadores de activación se transfirieron frente a la concentración de moléculas de fusión (kih) de Fc que contienen un trímero de ligando 4-1BB de ratón usadas para mostrar la actividad funcional. Como se puede observar en la figura 27, se pudo observar un aumento en la proliferación de linfocitos T CD8+ para las construcciones M.1 y M.2.
6.5 Cambios en el hígado en ratones tratados con anticuerpo anti-murino 4-1BB Lob 12.3 (muIgGI Wt) o con la construcción M.2
Se trataron ratones C57BL/6 portadores de MC38-muFAP (modelo de cáncer colorrectal murino) s.c. una vez por semana durante 3 semanas con anticuerpos agonistas anti-murinos 4-1BB dirigidos a FAP (Estudio de eficacia 020-GA1401: "Experimento para demostrar la eficacia del tratamiento dirigido a 4-1BB en combinación con a-PD-L1 en el modelo MC38-muFAP s.c. en ratones C57B6"). Los anticuerpos usados fueron Lob 12.3 muIgG1 Wt (con Fc "natural", clon Lob 12.3 de BioXcell # de catálogo: BE0169) o la construcción M.2 con mutación de DAPG (Fc inactivo). Los dos anticuerpos se administraron una vez a la semana durante tres semanas consecutivas. Se sacrificaron cuatro animales/grupo 7 días después del último tratamiento y se examinaron microscópicamente los hígados.
Se observaron cambios hepáticos solo en animales que recibieron Lob 12.3 muIgG1 Wt, que consiste en focos de degeneración hepatocelular con acumulación de macrófagos positivos para F4/80 y una menor cantidad de población mixta de células inflamatorias (principalmente linfocitos) que muestran frecuentemente una distribución vasocéntrica. Ocasionalmente se observó necrosis unicelular de hepatocitos e infiltrados de células mononucleares perivasculares en los espacios de acceso. No se observaron hallazgos relacionados con el tratamiento en el hígado de los animales que recibieron la construcción M.2 (tabla 41).
Tabla 41: Incidencia de hallazgos histopatológicos (n = 4/grupo)
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Se ha observado hepatitis, atribuida a la reticulación por FcyR en el hígado, en pacientes tratados con Urelumab BMS-663513 (Ascierto PA et al. 2010) y en ratones que usan el sustituto de ratón. La ausencia de hallazgos hepáticos en animales tratados con un anticuerpo con Fc inactivo apoya esta hipótesis.
6.6 Determinación de los parámetros farmacocinéticos de moléculas de unión a antígeno de fusión Fc que contienen un trímero de ligando 4-1BB humano
Con el fin de probar si las moléculas de unión a antígeno de fusión Fc que contienen un trímero de ligando 4-1BB humano de la invención son adecuadas para uso farmacéutico, se determinaron los parámetros farmacocinéticos (datos de PK) tales como el aclaramiento, el volumen de distribución o el tiempo medio de eliminación (t1/2) en ratones. Por tanto, se llevaron a cabo los siguientes experimentos:
Experimento A: PK de dosis única de la construcción 1.2 y el control B en ratones NOG sanos
Ratones hembra NOG de una edad promedio de 8 a 10 semanas al inicio del experimento (adquiridos de Taconic, instalación SOPF) se mantuvieron en condiciones libres de patógenos específicos con ciclos diarios de 12 h de luz y 12 h de oscuridad de acuerdo con las directrices acordadas (GV-Solas; Felasa; TierschG). El protocolo del estudio experimental se revisó y aprobó por el gobierno local (P 2011128). Después de su llegada, los animales se mantuvieron durante una semana para acostumbrarse al nuevo entorno y para su observación. Se llevó a cabo un seguimiento de salud continuo regularmente.
Se realizó un estudio farmacocinético de dosis única (SDPK) para evaluar la exposición de la construcción 1.2 y el control B. Se administró un bolo por vía intravenosa de 2,5 mg/kg a ratones NOG y se obtuvieron muestras de sangre en los puntos temporales seleccionados para la evaluación farmacocinética. Las muestras de suero de ratón se analizaron mediante ELISA. Se añadieron gradualmente 4-1BB humano biotinilado, muestras de prueba, anticuerpo anti-huCH1 marcado con digoxigenina y anticuerpo de detección anti-digoxigenina (POD) a una placa de microtitulación recubierta con estreptavidina de 96 pocillos y se incubaron después de cada etapa durante 1 hora a temperatura ambiente. La placa se lavó tres veces después de cada etapa para eliminar las sustancias no unidas. Finalmente, el complejo unido a peroxidasa se visualizó añadiendo solución de sustrato ABTS para formar un producto de reacción coloreado. La intensidad del producto de reacción que se determinó fotométricamente a 405 nm (con una longitud de onda de referencia a 490 nm) es proporcional a la concentración de analito en la muestra de suero. El intervalo de calibración de la curva estándar para las construcciones fue de 0,156 a 10 ng/ml, donde 3 ng/ml es el límite inferior de cuantificación (LLOQ). La figura 28A muestra la disminución de la concentración a lo largo del tiempo como se observa en este experimento.
Experimento B: PK de dosis única de las construcciones 2.1,2.3, del control B y del control C en ratones NOG que portan tumores humanizados con células madre
Se realizó un estudio farmacocinético de dosis única (SDPK) para evaluar la exposición de las construcciones 2.1, 2.3, el control B y el control C. Jackson Laboratories suministró ratones hembra NSG transferidos con células madre humanas. Los ratones se mantuvieron en condiciones libres de patógenos específicos con ciclos diarios de 12 h de luz/12 h de oscuridad de acuerdo con las directrices acordadas (GV-Solas; Felasa; TierschG). El protocolo del estudio experimental fue revisado y aprobado por el gobierno local (ZH193-2014). Después de su llegada, los animales se mantuvieron durante una semana para acostumbrarse al nuevo entorno y para su observación. Se llevó a cabo un seguimiento de salud continuo regularmente.
Se obtuvieron originalmente las células MKN45 humanas (carcinoma gástrico humano) de ATCC y después de su expansión se depositaron en el banco celular interno Glycart. Las células se cultivaron en DMEM que contenía FCS al 10 %. Las células se cultivaron a 37 °C en una atmósfera saturada de agua con CO2 al 5 %. El paso 9 in vitro se usó para inyección subcutánea, con una viabilidad de un 97 %. Los fibroblastos humanos NIH-3T3 se diseñaron en Roche Nutley para expresar FAP humana. El clon 39 se usó en un paso in vitro número 12 y con una viabilidad del 98 %. Se inyectaron 50 microlitros de suspensión celular (1 x 106 células MKN45 1 x 106 3T3-huFAP) mezclada con 50 microlitros de Matrigel por vía subcutánea en el costado de ratones anestesiados. Se administró una inyección intravenosa rápida de 10 mg/kg a ratones humanizados cuando el tumor alcanzó un tamaño medio de 190 mm3. Se tomaron muestras de sangre en momentos seleccionados para la evaluación farmacocinética. Las muestras de suero de ratón se analizaron mediante ELISA. Se añadieron gradualmente 4-1BB humano biotinilado, muestras de prueba, anticuerpo anti-huCH1 marcado con digoxigenina y anticuerpo de detección anti-digoxigenina (POD) a una placa de microtitulación recubierta con estreptavidina de 96 pocillos y se incubaron después de cada etapa durante 1 hora a temperatura ambiente. La placa se lavó tres veces después de cada etapa para eliminar las sustancias no unidas. Finalmente, el complejo unido a peroxidasa se visualiza añadiendo solución de sustrato ABTS para formar un producto de reacción coloreado. La intensidad del producto de reacción que se determinó fotométricamente a 405 nm (con una longitud de onda de referencia a 490 nm) es proporcional a la concentración de analito en la muestra de suero. El intervalo de calibración de la curva estándar para las construcciones fue de 0,156 a 10 ng/ml, donde 3 ng/ml es el límite inferior de cuantificación (LLOQ). La figura 28B muestra la disminución de la concentración de la construcción a lo largo del tiempo como se observa en este experimento.
Experimento C: PK de dosis única de la construcción 2.1 y 2.3 en ratones NOG sanos
Ratones hembra NOG de una edad promedio de 8 a 10 semanas al inicio del experimento (adquiridos de Taconic, instalación SOPF) se mantuvieron en condiciones libres de patógenos específicos con ciclos diarios de 12 h de luz y 12 h de oscuridad de acuerdo con las directrices acordadas (GV-Solas; Felasa; TierschG). El protocolo del estudio experimental se revisó y aprobó por el gobierno local (P 2011128). Después de su llegada, los animales se mantuvieron durante una semana para acostumbrarse al nuevo entorno y para su observación. Se llevó a cabo un seguimiento de salud continuo regularmente.
Se realizó un estudio farmacocinético de dosis única (SDPK) para evaluar la exposición de las construcciones 2.1 y 2.3. Se administró una administración intravenosa rápida i.v. de 2,5 mg/kg a ratones NOG y se obtuvieron muestras de sangre en los puntos temporales seleccionados para la evaluación farmacocinética. Las muestras de suero de ratón se analizaron mediante ELISA. Se añadieron gradualmente 4-1BB humano biotinilado, muestras de prueba, anticuerpo anti-huCH1 marcado con digoxigenina y anticuerpo de detección anti-digoxigenina (POD) a una placa de microtitulación recubierta con estreptavidina de 96 pocillos y se incubaron después de cada etapa durante 1 hora a temperatura ambiente. La placa se lava tres veces después de cada etapa para eliminar las sustancias no unidas. Finalmente, el complejo unido a peroxidasa se visualiza añadiendo solución de sustrato ABTS para formar un producto de reacción coloreado. La intensidad del producto de reacción que se determina fotométricamente a 405 nm (con una longitud de onda de referencia a 490 nm) es proporcional a la concentración de analito en la muestra de suero. El intervalo de calibración de la curva estándar para las construcciones fue de 0,156 a 10 ng/ml, donde 3 ng/ml es el límite inferior de cuantificación (LLOQ). La figura 28C muestra la disminución observada en la concentración a lo largo del tiempo.
Las construcciones sometidas a prueba 2.1 y 2.3 son lo suficientemente estables en el cuerpo y poseen parámetros PK en un intervalo adecuado para el desarrollo farmacéutico. También se puede concluir a partir de los resultados que la construcción 2.1 es ligeramente más estable.
6.7 Prevalencia de FAP en tumores humanos
La prevalencia de FAP en tumores humanos se evaluó como se describe en el documento WO 2014/161845 para comprender el posible uso clínico de las construcciones dirigidas a FAP.
Se usó anticuerpo de rata anti-seprasa humana (IgG2a, clon D8) de Vitatex (MABS1001) para inmunoteñir secciones de FFPET de 2,5 pm a partir de diversas indicaciones tumorales en el Ventana Benchmark XT. Las secciones se sometieron a un tratamiento estándar CC1 seguido de incubación de anticuerpos durante 60 segundos a 37 °C a una concentración de 5 pg/mL en diluyente de anticuerpos Dako (S3022) y se detectó tinción positiva usando el sistema de detección de DAB Ultraview (Ventana # 760-4456). Se usó como control negativo el anticuerpo de isotipo emparejado de Abeam (ab 18450). El infiltrado estromal FAP+ estuvo presente en tumores humanos de diferentes indicaciones que incluyen carcinoma de células escamosas de cabeza y cuello (HNSCC), cáncer de mama, cáncer colorrectal (CRC), cáncer de páncreas (PAC), cáncer gástrico, carcinoma de pulmón no microcítico (NSCLC) y mesotelioma que marca indicaciones clínicas potencialmente interesantes para construcciones dirigidas a FAP (tabla 42).
Tabla 42: Prevalencia de FAP en tumores humanos
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Ejemplo 7
7.1 Preparación de moléculas de unión a antígeno de fusión Fc que contienen un trímero de ligando 4-1BB dirigido a CD19 (8B8-018)
7.1.1 Preparación, purificación y caracterización de la fusión Fc del antígeno CD19 para la campaña de presentación de fagos
Para expresar y purificar el ectodominio CD19 humano y de macaco cangrejero en un estado monomérico (CD19 humano, véase SEQ ID NO: 31), el fragmento de ADN respectivo se fusionó con un segmento del gen Fc de IgG1 humana que contenía las mutaciones de "botón" (humano: SEQ ID NO: 186; macaco cangrejero: SEQ ID NO: 188) y se transfectó con un homólogo de "ojal Fc" (SEQ ID NO: 86) (Merchant et al., 1998). Se introdujo un sitio de escisión de IgA (PTPPTP) entre un ectodominio de antígeno y la cadena de botón Fc. Se introdujo una marca Avi para la biotinilación dirigida en el extremo C de la cadena de botón antígeno-Fc y se introdujeron las mutaciones H435R e Y436F en el ojal Fc con propósitos de purificación (Jendeberg L. et al, J. Immunological methods, 1997). La combinación de la cadena de botón antígeno-Fc que contiene las mutaciones S354C/T366W (humano: SEQ ID NO: 187; macaco cangrejero: SEQ ID NO: 189), con una cadena de ojal Fc que contiene las mutaciones Y349C/T366S/L368A/Y407v (SEQ ID NO: 90) permite la generación de un fragmento de fusión Fc heterodimérico que incluye una única copia del ectodominio c D19 (similar a la construcción de 4-1BB en la figura 5C). La Tabla 43 enumera las secuencias de ADNc y de aminoácidos de la construcción de fusión Fc de antígeno.
Tabla 43: Secuencias de ADNc y de aminoácidos de la molécula de fusión (kih) de Fc antígeno CD19 humano y de macaco cangrejero monomérico
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Para la producción de las moléculas de fusión antígeno monomérico/Fc, se cotransfectaron células CHO en suspensión de crecimiento exponencial con dos plásmidos que codifican los dos componentes de la proteína de fusión (cadenas de botón y ojal) usando procedimientos estándar.
La proteína secretada se purificó de los sobrenadantes de cultivo celular mediante cromatografía de afinidad usando proteína A, seguido de una cromatografía de exclusión por tamaño. Para la cromatografía de afinidad, se cargó el sobrenadante en una columna MabSelect Sure de volumen (CV)= 5-15 mL, resina de GE Healthcare, equilibrado con fosfato de sodio (20 mM), citrato de sodio (20 mM), tampón de cloruro de sodio 0,5 M (pH 7,5). La proteína no unida se eliminó lavando con al menos 6 volúmenes de columna del mismo tampón. La proteína unida se eluyó usando un gradiente lineal; etapa 1, 10 CV de tampón de elución del 0 al 60 % (citrato de sodio 20 mM, tampón de cloruro de sodio 500 mM (pH2,5)); etapa 2, 2 CV de tampón de elución del 60 al 100 %. Para el gradiente lineal, se aplicó una etapa de elución adicional de 2 volúmenes de columna con tampón de elución al 100 %.
El pH de las fracciones recogidas se ajustó añadiendo 1/40 (v/v) de Tris 2 M, pH 8,0. La proteína se concentró y se filtró antes de cargarla en una columna HiLoad Superdex 200 (GE Healthcare) equilibrada con MOPS2 mM, cloruro de sodio 150 mM, solución de azida sódica al 0,02 % (p/v) de pH 7,4.
La tabla 44 resume el rendimiento y el contenido de monómero final de la proteína de fusión (kih) de Fc antígeno CD19 humano y de macaco cangrejero monomérico.
Tabla 44: Análisis bioquímico de la de proteína de fusión (kih) de Fc antígeno CD19 humano y de macaco cangrejero monomérico
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Parte del antígeno purificado se biotiniló in vitro usando el kit de reacción estándar de biotina-proteína ligasa BirA (Avidity, # de cat. BirA500) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. El grado de biotinilación para la fusión que contiene CD19 humano fue del 94 %, para la construcción de CD19 de macaco cangrejero respectiva del 100 %. La proteína biotinilada se usó a continuación para la selección, cribado y caracterización de clones derivados de 8B8 madurados por afinidad desprovistos de los puntos calientes de desamidación N27d y N28.
7.1.2 Generación del clon anti-CD198B8-018
7.1.2.1 Inmunización y generación de anticuerpos de ratón anti-CD19 humano (hibridomas)
Se inmunizó seis veces a ratones Balb/c y se aplicó una dosis de refuerzo con células HEK293 transfectadas con CD19 (densidad media de receptores 35.000 por célula). Se controló la respuesta inmunitaria analizando muestras de suero con un ELISA en células de CD19 en células NIH-3T3 transfectadas con CD19 humano. Se usaron células esplénicas de ratones con valores suficientes de anticuerpo anti-CD19 humano para su inmortalización por fusión con la línea celular de mieloma de ratón P3X63 Ag8.653. Se llevaron a cabo tres fusiones y se cribaron los sobrenadantes de hibridoma mediante ELISA en células NIH-3T3 transfectadas con CD19 humano y ensayo de unión por FACS usando células Daudi (CD19+) y CD19- para determinar los anticuerpos específicos anti-CD19 humano (véase el example 1 del documento w O 2011/147834).
7.1.2.2 Cribado de hibridomas y evaluación funcional biológica celular del anticuerpo anti-CD19
ELISA en células para el cribado de anticuerpos frente al CD19 humano
Se aplicó un ELISA en células para el cribado de hibridomas y para identificar aquellos hibridomas que segregan anticuerpos contra el CD19 humano. Se usaron células NIH3T3 transfectadas con CD19 humano como células positivas; se usaron células NIH3T3 no transfectadas como células de control negativo. Para la evaluación de los hibridomas positivos se cuantificó la proporción de DO entre las células NIH3T3 transfectadas y no transfectadas.
- Medio de cultivo: DMEM con alto contenido de glucosa (4,5 mg/ml), SBF al 10 %, piruvato Na, AANE, glutamina.
- Control positivo de anticuerpos: anticuerpo monoclonal anti-CD19 (IgG1) Pharmingen n.° cat. 555409 c = 1 mg/ml
- Anticuerpo de detección: anticuerpo de cabra anti-IgG de ratón (H+L) conjugado con HRP Bio-Rad n.° cat.
170-06516.
- Dilución 1:2000 en reactivo de bloqueo ELISA lx
- Otros reactivos: Fibronectina Roche # de cat. 838039 c = 1 mg/ml
- Glutardialdehído: solución madre al 25 % // Grade Agar Scientific # R102 concentración final: 0,05 % en PBS
- Reactivo de bloqueo ELISA: 10x de solución madre // Roche, # de cat. 1112589
- Sustrato TMB: Roche, # de cat. 11432559
- Solución de parada: 1 M H2SO4
- BioRad n.° cat. 170-6516 Dilución 1:2000 en 1x reactivo de bloqueo de ELISA
Día 1:
- Recubrimiento de fibronectina: 5 pg/cm2 en PBS; placa de 96 pocillos = 32 cm2; 160 pg/placa en 6 ml. - PBS, 50 pl/pocillo
- Incubar 45 min a TA, aspirar la solución de recubrimiento.
- Sembrar 1,25 x 104 células/pocillo en 50 pl de medio de cultivo en una placa de 96 pocillos
- Incubar 40 horas a 37 °C.
- Agregar a la mitad superior de la placa: células NIH3T3 que expresan CD19.
- Agregar a la mitad inferior de la placa: células NIH3T3 no transfectadas.
Día 3:
- Adición de anticuerpo de control positivo o muestras (sobrenadante o suero de ratón) en 50 pl de medio de cultivo.
- Incubar durante 2 h a 4 °C.
- Eliminar el medio, fijar las células con 100 pl de glutardialdehído (0,05 % en PBS).
- Lavar dos veces con 200 pl de PBS.
- Adición del anticuerpo de detección 1:2000, 50 pl/pocillo.
- Incubar 2 h a TA.
- Lavar tres veces con 200 pl de PBS.
- Agregar 50 pl de TMB, incubar durante 30 min a TA,
- parar mediante la adición de 25 pl de H2SO4 1 M; leer la extinción a 450 nm/620 nm
- Cálculo de resultados: proporción de DO NIH3T3 CD19: DO NIH3T3 no transfectadas.
El anticuerpo seleccionado demostró unión específica a células NIH3T3 transfectadas con CD19 en comparación con células NIH3T3 no transfectadas (véase el ejemplo 2 del documento WO 2011/147834).
7.1.2.3 Humanización del anticuerpo anti-CD19
La especificidad de unión a CD19 del anticuerpo murino se transfirió a una región estructural aceptora humana para eliminar potenciales problemas de inmunogenicidad debidos a tramos de secuencia que el cuerpo humano reconocerá como exógenos. Esto se realizó injertando todas las regiones determinantes de la complementariedad (CDR) del anticuerpo murino (donante) en un región estructural del anticuerpo humano (aceptor), y se denomina injerto de CDR o humanización de anticuerpos.
La secuencia de aminoácidos murina se alineó con una colección de genes V de anticuerpos de la línea germinal humana, y se clasificó de acuerdo con la identidad de secuencia y la homología. Antes de seleccionar una secuencia aceptora concreta, se deben determinar las llamadas estructuras clásicas de bucle del anticuerpo donante (Morea, V.,et al., Methods, Vol 20, n.° 3 (2000) 267-279). Estas estructuras clásicas de bucle están determinadas por el tipo de residuos presentes en las llamadas posiciones clásicas. Estas posiciones se encuentran (parcialmente) fuera de las regiones CDR, y se deben mantener funcionalmente equivalentes en la construcción final para conservar la conformación de las CDR del anticuerpo original (donante). Se eligió la secuencia VBASE_VH1_1 de la línea germinal humana como el aceptor para la cadena pesada y se eligió la secuencia VBASE_VK2_5 para la cadena ligera.
7.1.2.4 Eliminación de puntos calientes de desamidación
Se ha descubierto que el anticuerpo anti-CD19 humano humanizado natural tiene tres puntos calientes de desamidación en el HVR-L1: nsng nt (SEQ ID NO: 190). Adicionalmente, se ha descubierto que en la HVR-H2 está presente un punto caliente de desamidación adicional: KFNG (SEQ ID NO: 191). Para abordar el punto caliente de desamidación en la HVR-H2, se ha introducido una mutación puntual de N (Asn) a Q (Gln) en la posición 64 (numeración de acuerdo con Kabat). Por tanto, el anticuerpo como se informa en el presente documento tiene una HVR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos TEKFQGRVTM (SEQ ID NO: 192).
Para abordar los puntos calientes de desamidación en la cadena ligera y obtener un anticuerpo anti-CD19 humano humanizado con una estabilidad de desamidación mejorada, se introdujeron mutaciones individuales en las posiciones 27d, 27e, 28 y 29 de Kabat y una doble mutación en las posiciones 27e y 28 (numeración de acuerdo con Kabat). En total se han generado 9 variantes (var. 1 a var. 9) del anticuerpo humanizado natural (var. 0) (véase la tabla 45).
Tabla 45: Variantes del anticuerpo CD19 natural humanizado
Kabat 2222 Kabat 6
posición 7789 posición 4
LC: de HC:
var.0:wt QSLENSNGNTYLNW TEKFNGKATM var.1:N27dH QSLEHSNGNTYLNW TEKFQGRVTM var.2:N27dQ QSLEQSNGNTYLNW TEKFQGRVTM var.3:S27eA QSLENANGNTYLNW TEKFQGRVTM var.4:S27eV QSLENVNGNTYLNW TEKFQGRVTM var.5:S27eP QSLENPNGNTYLNW TEKFQGRVTM var.6:N28Q QSLENSQGNTYLNW TEKFQGRVTM var.7:G29A QSLENSNANTYLNW TEKFQGRVTM var.8:G29V QSLENSNVNTYLNW TEKFQGRVTM var.9:S27eP/N28S QSLENPSGNTYLNW TEKFQGRVTM
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Se ha descubierto que con una sola mutación en la posición 27e de acuerdo con Kabat de S (serina) a P (prolina) se pueden resolver todos los puntos calientes de desamidación de la HVR-L1. Esta es una mutación no del residuo de N (asparagina) propenso a la desamidación, sino de un residuo cercano.
Por tanto, el anticuerpo como se informa en el presente documento tiene una HVR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos LENPNGNT (SEQ ID NO: 193). En un modo de realización, el anticuerpo anti-CD19 humano humanizado comprende una HVR-L1 que tiene la secuencia de aminoácidos LENPSGN I (SEQ ID NO: 194).
Adicionalmente, estos anticuerpos mantienen la reactividad cruzada contra el CD19 de macaco cangrejero como se muestra en la tabla 46 siguiente.
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El anticuerpo humanizado anti-CD19 humano natural (var.0) muestra después de la purificación aprox. un 7,5 % de desamidación. Después de almacenarlo durante dos semanas a pH7,4, la cantidad de anticuerpo desamidado se incrementa aprox. al 18,5 %. El anticuerpo variante con una mutación S27eP (var.5) muestra aprox. un 2 % de desamidación y un 2 % de formación de succinimida después de la purificación. Durante el almacenamiento a pH7,4 durante dos semanas solo está presente aprox. el 7,5 % de anticuerpo desamidado. La var. 5 se denomina clon 8B8-018 y se eligió para la preparación de moléculas de unión a antígeno que contienen un trímero de ligando de la familia de TNF dirigido a CD19.
7.1.3 Preparación de la molécula de unión a antígeno de fusión (kih) de Fc que contiene trímeros de ligando 4-1BB (71-254) dirigido a CD19(8B8-018) monovalente con dominios CH1-CL cruzados con residuos cargados (construcción 3.1)
Se clonó un polipéptido que contenía dos ectodominios del ligando 4-1BB (71-254), separados por conectores (G4S)2 y fusionado con el dominio de IgG1-CL humano, como se representa en la figura 29A: ligando 4-1BB humano, conector (G4S)2, ligando 4-1BB humano, conector (G4S)2, CL humano. Se clonó un polipéptido que contenía un ectodominio del ligando 4-1BB (71-254) y se fusionó con el dominio IgG1- CH humano, como se representa en la figura 29B: ligando 4-1BB humano, conector (G4S)2, CH humano.
Se subclonó el polipéptido que codifica el ligando dimérico de 4-1BB fusionado al dominio CL humano sin cambio de pauta de lectura con los dominios CH2 y CH3 de la cadena pesada de IgG1 humana en el botón (Merchant, Zhu et al. 1998). Para mejorar el emparejamiento correcto, se han introducido las siguientes mutaciones en el CH-CL cruzado. En el ligando dimérico 4-1Bb fusionado con CL, E123R y Q124K humanos. En el ligando monomérico 4-1BB fusionado con CH1, K147E y K213E humanos.
Se subclonó la región variable de secuencias de ADN de la cadena pesada y ligera que codifican una proteína de unión específica para CD19, clon 8B8-018, sin cambio de pauta de lectura con la cadena pesada constante del ojal o la cadena ligera constante de IgG1 humana. Se han introducido las mutaciones Pro329Gly, Leu234Ala y Leu235Ala en la región constante de las cadenas pesadas de botón y ojal para anular la unión a los receptores gamma Fc de acuerdo con el procedimiento descrito en el documento WO 2012/130831.
La combinación de la cadena de botón de ligando dimérico-Fc que contiene las mutaciones S354C/T366W, la fusión CH1 monomérica, la cadena de ojal Fc anti-CD19 dirigida que contiene las mutaciones Y349C/T366S/L368A/Y407V y la cadena ligera anti-CD19 permite la generación de un heterodímero, que incluye un ligando 4-1BB trimérico ensamblado y una Fab de unión a CD19 (figura 30, construcción 3.1).
La tabla 47 muestra las secuencias de ADNc y de aminoácidos de la molécula de unión a antígeno de fusión (kih) de Fc ligando de 4-1BB (71-254) trimérico dividido dirigido a CD19(8B8-018) monovalente con CH-CL cruzado y residuos cargados (construcción 3.1).
Tabla 47: Secuencias de ADNc y de aminoácidos de fusión (kih) de Fc ligando de 4-1BB (71-254) trimérico dividido dirigido a CD19 (8B8-018) monovalente que contiene cruce de CH-CL con residuos cargados (construcción 3.1). * para residuos cargados
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7.1.4 Preparación de la molécula de unión a antígeno de fusión (kih) de Fc que contiene trímeros de ligando 4-1BB (71-254) dirigido a CD19 (8B8-018) monovalente con dominios CH1-CL cruzados sin residuos cargados (construcción 3.2)
Se clonó un polipéptido que contenía dos ectodominios del ligando 4-1BB (71-254), separado por conectores (G4S)2 y fusionado con el dominio de IgG1-CL humano, de forma similar a como se representa en la figura (29A), pero sin mutaciones aminoacídicas en el dominio CL: ligando 4-1BB humano, conector (G4S)2, ligando 4-1BB humano, conector (G4S)2, CL humano. Se clonó un polipéptido que contenía un ectodominio del ligando 4-1BB (71-254) y se fusionó con el dominio de IgG1-CH1 humano, de forma similar a como se representa en la figura (29B), pero sin mutaciones aminoacídicas en el dominio CH1: ligando 4-1BB humano, conector (G4S)2, CH1 humano.
Se subclonó la región variable de secuencias de ADN de la cadena pesada y ligera que codifican una proteína de unión específica para CD19, clon 8B8-018, sin cambio de pauta de lectura con la cadena pesada constante del ojal o la cadena ligera constante de IgG1 humana.
Se han introducido las mutaciones Pro329Gly, Leu234Ala y Leu235Ala en la región constante de las cadenas pesadas de botón y ojal para anular la unión a los receptores gamma Fc de acuerdo con el procedimiento descrito en el documento W o 2012/130831. La combinación de la cadena de botón ligando dimérico-Fc que contiene las mutaciones S354C/T366W, la fusión CH1 monomérica, la cadena de ojal Fc anti-CD19 dirigida que contiene las mutaciones Y349C/T366S/L368A/Y407V y la cadena ligera anti-CD19 permite la generación de un heterodímero, que incluye un ligando 4-1BB trimérico ensamblado y una Fab de unión a CD19 (figura 30, construcción 3.2).
La tabla 48 muestra las secuencias de ADNc y de aminoácidos de la molécula de unión a antígeno de fusión (kih) de Fc ligando de 4-1BB (71-254) trimérico dividido dirigido a CD19(8B8-018) monovalente que contiene cruce de CH-CL cruzado sin residuos cargados (construcción 3.2).
Tabla 48: Secuencias de ADNc y de aminoácidos de fusión (kih) de Fc ligando de 4-1BB (71-254) trimérico dividido dirigido a CD19(8B8-018) que contiene cruce de CH-CL sin residuos cargados (construcción 3.2).
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7.1.5 Preparación de la unión a antígeno de fusión (kih) de Fc que contiene trímeros de ligando 4-1BB (71-254) dirigido a CD19(8B8-018) bivalente (construcción 3.3)
Se clonó un polipéptido que contenía dos ectodominios del ligando 4-1BB (71-254), separado por conectores (G4S)2 y fusionado con el extremo C de la cadena de ojal Fc de IgG1 humana, como se representa en la figura 29C: ojal Fc de IgG1 humana, conector (G4S)2, ligando 4-1BB humano, conector (G4S)2, ligando 4-1BB humano. Un polipéptido que contenía un ectodominio del ligando 4-1BB (71-254) se fusionó con el extremo C de la cadena de botón Fc de IgG1 humana como se describe en la figura 29D: botón Fc de IgG1 humana, conector (G4S)2, ligando 4-1BB humano.
La región variable de secuencias de ADN de cadena pesada y ligera que codifican un aglutinante específico para CD19, clon 8B8-018, se subclonó sin cambio de pauta de lectura con la cadena pesada constante del ojal, el botón o la cadena ligera constante de IgG1 humana. Se han introducido las mutaciones Pro329Gly, Leu234Ala y Leu235Ala en la región constante de las cadenas pesadas de botón y ojal para anular la unión a los receptores gamma Fc de acuerdo con el procedimiento descrito en el documento WO 2012/130831. La combinación de la cadena del ligando dimérico de ojal anti-CD19 huIgG1 que contiene las mutaciones Y349C/T366S/L368A/Y407V, la cadena del ligando monomérico de botón anti-CD19 huIgG1 que contiene las mutaciones S354C/T366W y la cadena ligera anti-CD19 permite la generación de un heterodímero, que incluye un ligando 4-1BB trimérico ensamblado y dos Fab de unión a CD19 (figura 30, construcción 3.3).
La tabla 49 muestra las secuencias de ADNc y de aminoácidos de la molécula de unión a antígeno de fusión (kih) de Fc ligando de 4-1BB (71-254) trimérico dividido dirigido a CD19(8B8-018) bivalente (construcción 3.3).
Tabla 49: Secuencias de pares de bases de fusión PGLALA (kih) de Fc ligando de 4-1BB trimérico dividido dirigido a CD19(8B8-018) bivalente (construcción 3.3)
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7.1.6 Preparación de la molécula de unión a antígeno de fusión (kih) de Fc que contiene trímeros de ligando 4-1BB (71-248) dirigido a CD19(8B8-018) monovalente con dominios CH1-CL cruzados con residuos cargados (construcción 3.4)
Se clonó un polipéptido que contenía dos ectodominios del ligando 4-1BB (71-248), separados por conectores (G4S) 2, y fusionados con el dominio IgG1-CL humano, de forma análoga al representado en la figura 29A: ligando 4-1BB humano, conector (G4S)2, ligando 4-1BB humano, conector (G4S)2, Cl humano. Se clonó un polipéptido que contenía un ectodominio del ligando 4-1BB (71-248) y se fusionó con el dominio IgG1- CH humano, de forma análoga al descrito en la figura 29B: ligando 4-1BB humano, conector (G4S)2, CH humano.
Se subclonó el polipéptido que codifica el ligando dimérico de 4-1BB fusionado al dominio CL humano sin cambio de pauta de lectura con los dominios CH2 y CH3 de la cadena pesada de IgG1 humana en el botón (Merchant, Zhu et al. 1998). Para mejorar el emparejamiento correcto, se han introducido las siguientes mutaciones en el CH-CL cruzado. En el ligando dimérico 4-1Bb fusionado con CL, E123R y Q124K humanos. En el ligando monomérico 4-1BB fusionado con CH1, K147E y K213E humanos.
Se subclonó la región variable de secuencias de ADN de la cadena pesada y ligera que codifican una proteína de unión específica para CD19, clon 8B8-018, sin cambio de pauta de lectura con la cadena pesada constante del ojal o la cadena ligera constante de IgG1 humana. Las mutaciones Pro329Gly, Leu234Ala y Leu235Ala se han introducido en la región constante de las cadenas pesadas de botón y ojal para anular la unión a los receptores gamma de Fc de acuerdo con el procedimiento descrito en el documento w O 2012/130831. La combinación de la cadena de botón ligando dimérico-Fc que contiene las mutaciones S354C/T366W, la fusión CH1 monomérica, la cadena de ojal Fc anti-CD19 dirigida que contiene las mutaciones Y349C/T366S/L368A/Y407V y la cadena ligera anti-CD19 permite la generación de un heterodímero, que incluye un ligando 4-1BB trimérico ensamblado y una Fab de unión a CD19 (figura 30, contrucción 3.4).
La tabla 50 muestra las secuencias de ADNc y de aminoácidos de la molécula de unión a antígeno de fusión (kih) de Fc ligando de 4-1BB (71-248) trimérico dividido dirigido a CD19 (8B8-018) monovalente con CH-CL cruzado y residuos cargados (construcción 3.4).
Tabla 50: Secuencias de ADNc y de aminoácidos de fusión (kih) de Fc ligando de 4-1BB (71-248) trimérico dividido dirigido a CD19 (8B8-018) monovalente que contiene cruce de CH-CL con residuos cargados (construcción 3.4). * residuos cargados
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7.1.7 Preparación de la molécula de unión a antígeno de fusión (kih) de Fc que contiene trímeros de ligando 4-1BB (71-248) dirigido a CD19 (8B8-018) monovalente con dominios CH1-CL cruzados sin residuos cargados (construcción 3.5)
Se clonó un polipéptido que contenía dos ectodominios del ligando 4-1BB (71-248), separado por conectores (G4S)2 y fusionado con el dominio de IgG1-CL humano, de forma similar a como se representa en la figura (29A), pero sin mutaciones aminoacídicas en el dominio CL: ligando 4-1BB humano, conector (G4S)2, ligando 4-1BB humano, conector (G4S)2, CL humano. Se clonó un polipéptido que contenía un ectodominio del ligando 4-1BB (71-248) y se fusionó con el dominio de IgG1-CH1 humano, de forma similar a como se representa en la figura (29B), pero sin mutaciones aminoacídicas en el dominio CH1: ligando 4-1BB humano, conector (G4S)2, CH1 humano.
Se subclonó la región variable de secuencias de ADN de la cadena pesada y ligera que codifican una proteína de unión específica para CD19, clon 8B8-018, sin cambio de pauta de lectura con la cadena pesada constante del ojal o la cadena ligera constante de IgG1 humana. Se han introducido las mutaciones Pro329Gly, Leu234Ala y Leu235Ala en la región constante de las cadenas pesadas de botón y ojal para anular la unión a los receptores gamma Fc de acuerdo con el procedimiento descrito en el documento WO 2012/130831. La combinación de la cadena de botón ligando dimérico-Fc que contiene las mutaciones S354C/T366W, la fusión CH1 monomérica, la cadena de ojal Fc anti-CD19 dirigida que contiene las mutaciones Y349C/T366S/L368A/Y407V y la cadena ligera anti-CD19 permite la generación de un heterodímero, que incluye un ligando 4-1BB trimérico ensamblado y una Fab de unión a CD19 (figura 30, construcción 3.5).
La tabla 51 muestra las secuencias de ADNc y de aminoácidos de la molécula de unión a antígeno de fusión (kih) de Fc ligando 4-1BB (71-248) trimérico dividido dirigido a CD19(8B8-018) monovalente que contiene cruce de CH-CL cruzado sin residuos cargados (construcción 3.5).
Tabla 51: Secuencias de ADNc y de aminoácidos de fusión (kih) de Fc ligando 4-1BB (71-248) trimérico dividido dirigido a CD19(8B8-018) que contiene cruce de CH-CL sin residuos cargados (construcción 3.5).
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7.1.8 Preparación de la unión a antígeno de fusión (kih) de Fc que contiene trímeros de ligando 4-1BB (71-248) dirigido a CD19(8B8-018) bivalente (construcción 3.6)
Se clonó un polipéptido que contenía dos ectodominios del ligando 4-1BB (71-248), separado por conectores (G4S)2 y fusionado con el extremo C de la cadena de ojal Fc de IgG1 humana, como se representa en la Figura 29C: ojal Fc de IgG1 humana, conector (G4S)2, ligando 4-1BB humano, conector (G4S)2, ligando 4-1BB humano. Un polipéptido que contenía un ectodominio del ligando 4-1BB (71-254) se fusionó con el extremo C de la cadena de botón Fc de IgG1 humana como se describe en la figura 29D: botón Fc de IgG1 humana, conector (G4S)2, ligando 4-1BB humano.
La región variable de secuencias de ADN de cadena pesada y ligera que codifican un aglutinante específico para CD19, clon 8B8-018, se subclonó sin cambio de pauta de lectura con la cadena pesada constante del ojal, el botón o la cadena ligera constante de IgG1 humana. Se han introducido las mutaciones Pro329Gly, Leu234Ala y Leu235Ala en la región constante de las cadenas pesadas de botón y ojal para anular la unión a los receptores gamma Fc de acuerdo con el procedimiento descrito en el documento Wo 2012/130831. La combinación de la cadena del ligando dimérico de ojal anti-CD19 huIgG1 que contiene las mutaciones Y349C/T366S/L368A/Y407V, la cadena del ligando monomérico de botón anti-CD19 huIgG1 que contiene las mutaciones S354C/T366W y la cadena ligera anti-CD19 permite la generación de un heterodímero, que incluye un ligando 4-1BB trimérico ensamblado y dos Fab de unión a CD19 (figura 30, construcción 3.6).
La tabla 52 muestra las secuencias de ADNc y de aminoácidos de la molécula de unión a antígeno de fusión (kih) de Fc ligando 4-1BB (71-248) trimérico dividido dirigido a CD19(8B8-018) bivalente (construcción 3.6).
Tabla 52: Secuencias de ADNc y de aminoácidos de la de fusión (kih) de Fc ligando 4-1BB (71-248) trimérico dividido dirigido a CD19(8B8-018) bivalente (construcción 3.6)
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7.2 Preparación de moléculas de unión a antígeno de fusión Fc que contienen un trímero de ligando 4-1BB dirigido a CD19 (maduradas por afinidad derivada de 8B8) y moléculas de control correspondientes 7.2.1 Generación de aglutinantes anti-CD19 madurados por afinidad derivados de 8B8 desprovistos de puntos calientes
7.2.1.1 Selección de anticuerpos específicos de CD19 madurados por afinidad
La desamidación de los residuos de asparagina en las posiciones 27d y 28, localizados en la CDR1 de la cadena ligera del clon 8B8 humanizado, da lugar a una reducción significativa de la actividad biológica. Por lo tanto, se generaron 2 colecciones de presentación en fagos en las que a) se eliminaron ambos residuos de asparagina en las posiciones 27d y 28 y b) se aleatorizaron CDR adicionales de cadena pesada y ligera para seleccionar variantes de 8B8 con una afinidad mejorada.
7.2.1.2 Generación de colecciones de maduración de la afinidad 8B8 sin puntos calientes LCDR1
La generación de anticuerpos derivados de 8B8 madurados por afinidad sin los sitios de desamidación N27d y N28, ubicados en LCDR1, se llevó a cabo por presentación de fagos mediante protocolos estándares (Silacci et al., 2005). En una primera etapa, las secuencias de ADN VL y VH del clon original humanizado 8B8 (Se Q ID NO: 215 y SEQ ID NO: 216) se clonaron en nuestro fagémido que a continuación se usó como plantilla para la aleatorización. En una etapa posterior, se generaron dos colecciones para la selección de clones favorables por presentación de fagos. Para eliminar las posiciones de puntos calientes mencionadas anteriormente, se usó un cebador de aleatorización LCDR1 (SEQ ID NO: 217) que solo permitía los aminoácidos S T Q E en las posiciones 27d y 28 para ambas colecciones. La colección de maduración 1 se aleatorizó en CDR1 y 2 de la cadena ligera y pesada, mientras que la colección de maduración 2 se aleatorizó en CDR1 y 3 de la cadena ligera y en CDR3 de la cadena pesada. Las posiciones aleatorizadas en las respectivas regiones CDR se muestran en la figura 31A. Para la generación de la colección de maduración 1, aleatorizada en CDR1 y 2 de la cadena ligera y pesada, se ensamblaron tres fragmentos mediante PCR de "empalme por extensión de superposición" (SOE) y se clonaron en el vector de fago (figura 31B). Se utilizaron las siguientes combinaciones de cebadores para generar los fragmentos de la colección: fragmento 1 (LMB3 (SEQ ID NO: 222) y CD19 L1 aleatorio inverso (Se Q ID NO: 217), fragmento 2 (CD19 L2 aleatorio directo (SEQ iD NO: 218) y CD19 H1 aleatorio inverso (SEQ ID NO: 219), y el fragmento 3 (CD19 H2 aleatorio directo (SEQ ID NO: 220) y CD19 H3 constante inverso (Se Q ID NO: 221) (tabla 53). Después del ensamblaje de cantidades suficientes de fragmento aleatorizado de longitud completa, se digirió con NcoI/Nhel junto con el vector fagémido aceptor tratado de manera idéntica. Se ligó un exceso molar de 3 veces el inserto de colección con 10 pg de vector fagémido. Se utilizaron ligaduras purificadas para 20 transformaciones que dieron como resultado 2 x109 transformantes. Las partículas de fagémido que presentan la colección de maduración de la afinidad 8B8 se rescataron y se purificaron mediante purificación con PEG/NaCl para usarse para las selecciones.
La generación de la segunda colección, aleatorizada en CDR1 y 3 de la cadena ligera y en CDR3 de la cadena pesada, se realizó de manera similar. Se usaron las siguientes combinaciones de cebadores para generar los fragmentos de la colección: fragmento 1 (LMB3 (SEQ ID NO: 222) y CD19 L1 aleatorio inverso (SEQ ID NO: 217), fragmento 2 (CD19 L1 constante directo (Se Q ID NO223) y Cd 19 L3 aleatorio inverso (SEQ ID NO224) y fragmento 3 (constante directo de CD19 l3 (SEQ ID NO: 225) y CD19 H3 aleatorio inverso (SEQ ID NO: 226) (tabla 54). Después del ensamblaje de cantidades suficientes de fragmento aleatorizado de longitud completa, se digirió con NcoI/Kpn I junto con el vector fagémido aceptor tratado de manera idéntica. Se ligó un exceso molar de 3 veces el inserto de colección con 20 pg de vector fagémido. Se utilizaron ligaduras purificadas para 40 transformaciones que dieron como resultado 2 x109 transformantes. Las partículas de fagémido que presentan la colección de maduración de la afinidad 8B8 se rescataron y se purificaron mediante purificación con PEG/NaCl para usarse para las selecciones.
Tabla 53: Cebadores para la biblioteca de eliminación de puntos calientes L1_L2/H1_H2 y maduración de la afinidad 8B8
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Tabla 54: Cebadores para la biblioteca de eliminación de puntos calientes L1_L3/H3 y maduración de la afinidad 8B8
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7.2.1.3 Selección de clones derivados de 8B8 madurados por afinidad desprovistos de los puntos calientes LCDR1 N27d y N28
Para la selección de clones maduros por afinidad desprovistos de los puntos calientes LCDRI N27d y N28, se realizaron dos enfoques de selección por presentación en fagos:
En el primer enfoque, la selección se ejecutó en la proteína de fusión Fc CD19 humana usando ambas colecciones de presentación en fagos. Se realizaron rondas de selección (panning) en solución de acuerdo con el siguiente patrón: 1. unión de ~1012 partículas de fagémidos a 30nM de proteína Fc CD19 biotinilada durante 0,5 h en un volumen total de 1 ml, 2, captura de proteína Fc CD19 biotinilada y partículas de fagos específicamente unidas mediante la adición de 5,4 * 107 perlas magnéticas recubiertas con estreptavidina durante 10 min, 3, lavado de perlas usando 5 * 1 ml de PBS/Tween20 y 5* 1 ml de PBS, 4, elución de las partículas de fagos mediante la adición de 1 ml de TEA100 mM (trietilamina) durante 10 min y neutralización mediante la adición de 500 pl 1M de Tris/HCl pH7,4, 5, reinfección con bacterias E. coli TG1 en crecimiento exponencial, y 6, infección por el fago auxiliar VCSM13 y posterior precipitación en PEG/NaCl de partículas de fagémidos para su uso en las rondas de selección subsiguientes. Las selecciones se llevaron a cabo más de 3 rondas usando concentraciones decrecientes de antígeno (30 x 10-9 M, 10 x 10-9 M y 3 x 10-9 M). En la ronda 2 y 3, la captura de los complejos antígeno-fago se realizó usando placas de neutravidina en lugar de microsesferas de estreptavidina. Las placas de neutralvidina se lavaron con 5 x PBS/Tween20 y 5 x PBS. En la ronda 3, la placa de neutravidina se incubó durante la noche en 2 litros de PBS para una selección "sin velocidad" antes de que se eluyera el fago de la placa. Además, la proteína del macaco cangrejero Fc CD19 se usó en la ronda 2 para enriquecer los aglutinantes de reacción cruzada.
En el segundo enfoque de selección, la selección de fagos se ejecutó en células que expresan transitoriamente el ECD de CD19 humano o de macaco cangrejero en la superficie celular. Para la transfección transitoria de células HEK, se generaron plásmidos de expresión que albergan las secuencias de ADN (de 5' a 3') para los siguientes segmentos de proteínas: Una marca Flag, una marca SNAP, el CD19 ECD de origen humano o de macaco cangrejero y la región transmembranal del receptor del factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGFR) (SEQ ID NO: 227 y 228). La expresión de las proteínas respectivas (SEQ ID NO: 229 y 230) en la superficie celular se confirmó por citometría de flujo usando un anticuerpo anti-Flag para la detección. Ambas colecciones se expusieron en la primera ronda de selección a células que expresaban la fusión proteica que contiene CD19 ECD humana o de macaco cangrejero. Para las siguientes rondas de selección (panning), las especies de CD19 ECD se alternaron en consecuencia. Se usaron células transfectadas transitoriamente con una proteína de membrana irrelevante para el aclaramiento previo.
Se realizaron rondas de selección (panning) de acuerdo con el siguiente patrón:
1. Transfección de células HEK con construcciones que expresan CD19 ECD o una proteína transmembranal irrelevante de acuerdo con el procedimiento estándar descrito anteriormente.
2. La incubación de las células durante 48 h en total a 37 °C en una incubadora con una atmósfera al 5 % de CO2, 3. Aislamiento de células por centrifugación (3 min a 250 x g) y resuspensión de 1 x 10E7 CD19 ECD de células positivas y 1 x 10E7 de células negativas en PBS/5 % BSA, respectivamente,
3. Eliminación previa de fagos inespecíficos por incubación de la colección de fagos con 1 x 107 de células negativas CD19 durante 60 min a 4°C usando un rotador de tubo que gira suavemente,
4. Centrifugación de células a 250 x g durante 3 min y transferencia del sobrenadante a un tubo nuevo y adición de 1 x 10E7 células positivas para CD19 e incubación durante 60 min a 4°C mediante rotación suave en un rotador de tubo.
5. Lavado de células por centrifugación durante 1 min a 250 x g, aspiración del sobrenadante y resuspensión en 1 ml de PBS (8 veces),
6. Elución de fago con 1 ml de TEA100 mM, incubación durante 5 min a TA y neutralización del eluido con 500 ul de Tris-HCl 1 M, pH 7,6,
7. reinfección de bacterias E. coli TG1 de crecimiento exponencial, y
8. infección con fago auxiliar VCSM13 y posterior precipitación con PEG/NaCl de partículas de fagémido que se van a usar en rondas de selección posteriores. Las selecciones se llevaron a cabo en 3 rondas.
Para ambos enfoques de selección, ELISA identificó aglutinantes específicos de la siguiente manera: Se recubrieron 100 ul de proteína Fc CD19 biotinilada 30 nM por pocillo en placas con neutravidina. Se añadieron sobrenadantes bacterianos que contenían Fab y se detectaron los Fab de unión por medio de sus marcas Flag usando un anticuerpo secundario anti-Flag/HRP.
Los clones que dieron positivos en el ELISA en CD19 humano recombinante se probaron además en un ELISA basado en células usando células que se transfectaron transitoriamente con el plásmido de expresión que contiene ECD de CD19 humano (SEQ ID NO: 227). Este análisis se realizó como sigue: 48 h después de la transfección, las células HEK se recolectaron y se centrifugaron a 250 x g durante 5 min. A continuación, las células se volvieron a suspender en PBS BSA enfriado con hielo al 2 % hasta 4 x 106 células/ml y se incubaron durante 20 min en hielo para bloquear los sitios de unión inespecíficos. 4 x 105 células en 100 ul se distribuyeron en cada pocillo de una placa de 96 pocillos y se centrifugaron a 250 x g y 4°C durante 3 min. Se aspiró el sobrenadante y se diluyeron 50 ul de sobrenadante bacteriano que contenía fragmentos Fab diluidos con 50 ul de PBS/BSA al 2 % enfriado en hielo, se añadieron a la placa, se mezclaron con las células y se incubaron durante 1 h a 4 °C. Posteriormente, las células se lavaron 3 veces con PBS enfriado con hielo antes de que se añadieran 100 pl de PBS BSA al 2 % por pocillo que contenía una dilución de anticuerpo anti-Fab-HRP de 1:2000. Después de un tiempo de incubación de 1 h, las células se lavaron nuevamente 3 veces con PBS enfriado con hielo. Para el desarrollo, se añadieron 100 ul de sustrato "ultra TMB-ELISA de 1 etapa" por pocillo. Después de un tiempo de incubación de 10 minutos, el sobrenadante se transfirió a una nueva placa de 96 pocillos que contenía 40 ul de H2SO41 M por pocillo y se midió la absorbancia a 450 nM. Los clones que mostraron señales significativas sobre el fondo se sometieron a un experimento de cribado cinético mediante análisis SPR usando ProteOn XPR36.
7.2.1.4 identificación de variantes derivadas de 8B8 maduradas por afinidad mediante SPR
Para caracterizar adicionalmente los clones que dieron positivos en el ELISA, se midió la tasa de desviación por resonancia de plasmón superficial y se comparó con el clon humanizado original 8B8.
Para este experimento, se inmovilizaron 7000 RU de anticuerpo policlonal anti-Fab humano en los 6 canales de un chip GLM mediante acoplamiento de amina (acetato de Na pH4.5, 25 pl/min, 240 s) (orientación vertical). Cada sobrenadante bacteriano que contenía anticuerpo se filtró y se diluyó 2 veces con PBS, y a continuación se inyectó durante 360 s a 25 pl/minuto para lograr niveles de inmovilización de entre 100 y 400 unidades de respuesta (RU) en orientación vertical. Inyección de Fc CD19 monomérico: Para mediciones de cinética con dosis única, la dirección de la inyección se cambió a orientación horizontal, se inyectaron simultáneamente series de dilución triple de Fc CD19 monomérico purificado (rangos de concentración variables entre 150 y 6 nM) a 50 pl/min a lo largo de canales separados 1-4, con tiempos de asociación de 180 s y tiempos de disociación de 300 s. Se inyectó un fragmento Fc de IgG humano (150 nM) en el canal 5 como control negativo para la unión específica al tampón Fc CD19 monomérico (PBST) a lo largo del sexto canal para proporcionar un blanco «en línea» para la referencia. La regeneración se realizó mediante dos pulsos de glicina 10 mM pH1,5 y NaOH50 mM durante 30 s a 90 ul/min (orientación horizontal). Se calcularon las constantes de velocidad de disociación (kdis) usando un modelo de Langmuir sencillo de unión uno a uno en el programa informático ProteOn Manager v 3.1 ajustando simultáneamente los sensogramas. Se identificaron los clones que expresan Fabs con las constantes de velocidad de disociación más lentas (Tabla 55). Es de destacar que las constantes de velocidad de disociación de los clones 5A07 y 5B08 no se pudieron determinar debido a un ajuste inadecuado. No obstante, se seleccionaron ambos clones porque los resultados obtenidos sugirieron una disociación muy lenta. Se secuenciaron los dominios variables de los fagémidos correspondientes. Es importante destacar que ambos residuos de asparagina en LCDR1 (posición 27d y 28) se reemplazaron por una serina o una treonina, lo que demuestra que se eliminaron ambos sitios de desamidación. Un ejemplo de una alineación se muestra en la figura 32. Las CDR de los mejores clones se enumeran en la Tabla 56 (regiones variables de la cadena ligera) y la Tabla 57 (regiones variables de la cadena pesada) (clon 5H09: (SEQ ID NO: 231-236); clon 7H07: (SEQ ID NO: 237-242); clon 2B03: (SEQ ID NO: 243-248); clon 2B11: (SEQ ID NO: 249-254); clon 5A07: (SEQ ID NO: 255-260); clon 5B08: (SEQ ID NO: 261-266); clon 5D08: (SEQ ID NO: 267-272).
Tabla 55: Constantes de disociación de clones seleccionados obtenidos en análisis de cribado con sobrenadante bacteriano
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Tabla 56: Secuencias de CDR de las cadenas ligeras 8B8 seleccionadas
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Tabla 57: Secuencias de CDR de las cadenas pesadas de 8B8 seleccionadas
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7.2.2 Caracterización de anticuerpos derivados de 8B8 madurados por afinidad
7.2.2.1 Clonación de dominios de anticuerpos variables en vectores de expresión
Se subclonaron las regiones variables de secuencias de ADN de la cadena pesada y ligera de los aglutinantes anti-CD19 seleccionados en el marco de la cadena pesada constante o de la cadena ligera constante de la IgG1 humana. En la cadena pesada, se han introducido mutaciones Pro329Gly, Leu234Ala y Leu235Ala con el fin de anular la unión a los receptores Fc gamma de acuerdo con el procedimiento descrito en la publicación de patente internacional n.° WO2012/130831.
Las secuencias de ADNc y de aminoácidos de las IgG anti-CD19 se muestran en la Tabla 58 y en la Tabla 59, respectivamente. Todas las secuencias codificantes de anticuerpos se clonaron en un vector de expresión, que dirige la transcripción del inserto con un promotor MPSV quimérico y contiene una secuencia señal poliA sintética ubicada en el extremo 3' del CDS. Además, el vector contiene una secuencia de EBV OriP para el mantenimiento episomal del plásmido.
Tabla 58: Secuencias de ADNc y de aminoácidos del clon 8B8 anti-CD19 en formato de IgG1 humana P329GLALA
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Tabla 59: Secuencias de ADNc y de aminoácidos de clones anti-CD19 madurados por afinidad en formato de lgG1 humana P329GLALA
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7.2.2.2 Determinación de la afinidad de anticuerpos seleccionados por SPR
Para la determinación exacta de las afinidades por SPR, los anticuerpos anti-CD19 seleccionados se produjeron mediante la co-transfección de células HEK293-EBNA con los vectores de expresión de mamíferos utilizando polietilenimina. Se transfectaron las células con los correspondientes vectores de expresión en una proporción 1:1 ("vector de cadena pesada": "vector de cadena ligera") de acuerdo con el procedimiento estándar. 7 días después de la transfección, se midió el título de anticuerpos en el sobrenadante y todos los títulos se equilibraron a 10 pg/ml.
La afinidad (KD) del anticuerpo original 8B8 así como sus derivados se midió mediante SPR usando un instrumento ProteOn XPR36 (Biorad) a 25°C. Se inmovilizaron 7000 RU de anticuerpo policlonal anti-Fab humano en los 6 canales de un chip GLM mediante acoplamiento de amina (acetato de Na pH4,5, 25 ul/min, 240 s) (orientación vertical). Cada sobrenadante de HEK que contenía anticuerpo se filtró, se diluyó con PBST (10 mM de fosfato, 150 mM de cloruro de sodio pH 7,4, Tween 20 al 0,005 %) a una concentración de 10 ug/ml, y luego se inyectó durante 360 s a 25 pl/minuto para lograr niveles de inmovilización entre 500 y 800 unidades de respuesta (RU) en orientación vertical. Inyección de Fc CD19 monomérico: Para mediciones de cinética con dosis única, se cambió la dirección de inyección a la orientación horizontal, se inyectaron simultáneamente tres series de dilución de Fc CD19 monomérico purificado (intervalos de concentración variables entre 150 y 6 nM) a 50 pl/min a lo largo de canales 1-4 separados, con tiempos de asociación de 180 s y tiempos de disociación de 300 s. Se inyectó un fragmento Fc de IgG humana (150 nM) en el canal 5 como control negativo para la unión específica a Fc CD19 monomérico. Se inyectó el tampón (PBST) a lo largo del sexto canal para proporcionar un blanco "en línea" como referencia. Una vista general de los sensogramas respectivos se ilustra en la Figura 33. La regeneración se realizó mediante dos pulsos de glicina 10 mM pH 1,5 y NaOH 50 mM durante 30 s a 90 ul/min (orientación vertical). Se calcularon las constantes de velocidad de asociación (kas) y las constantes de velocidad de disociación (kd¡s) usando un modelo de Langmuir sencillo de unión uno a uno en el programa informático ProteOn Manager v3,1 ajustando simultáneamente los sensogramas de asociación y disociación. Se calculó la constante de disociación en equilibrio (Kd) como la proporción kdis/kas. En la Tabla 60 se muestra un resumen de los datos cinéticos y termodinámicos. La constante de disociación de todos los clones maduros por afinidad mejoró en comparación con su clon original 8B8.
Tabla 60: Resumen de los datos cinéticos y termodinámicos para la interacción entre anti-CD19 huIgG1 y CD19 humano
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7.2.2.3 Preparación y purificación de anti-CD19 IgG1 P329G LALA
Los anticuerpos anti-CD19 seleccionados se produjeron cotransfectando células HEK293-EBNA con los vectores de expresión de mamífero usando polietilenimina. Se transfectaron las células con los correspondientes vectores de expresión en una proporción 1:1 ("vector de cadena pesada": "vector cadena ligera").
Para la producción en matraces de agitación de 500 ml, se sembraron 400 millones de células HEK293 EBNA 24 horas antes de la transfección. Antes de la transfección, las células se centrifugaron durante 5 minutos a 210 x g y el sobrenadante se reemplazó por medio CD CHO precalentado. Los vectores de expresión (200 pg de ADN total) se mezclaron en 20 mL de medio CD CHO. Después de la adición de 540 pL de PEI, la solución se agitó en vórtex durante 15 segundos y se incubó durante 10 minutos a temperatura ambiente. Posteriormente, se mezclaron las células con la solución ADN/PEI, se transfirieron a un matraz de agitación de 500 mL y se incubó durante 3 horas a 37°C en una incubadora con una atmósfera de CO2 al 5 %. Después de la incubación, se añadieron 160 ml de medio F17 y las células se cultivaron durante 24 horas. Un día después de la transfección, se añadieron 1 mM de ácido valproico y Feed al 7 %. Después de cultivarse durante 7 días, se recogió el sobrenadante mediante centrifugación durante 15 minutos a 210 x g. La solución se filtró en condiciones estériles (filtro de 0,22 pm), se suplementó con acida sódica hasta una concentración final de 0,01 % (p/v) y se mantuvo en 4 °C.
La purificación de moléculas de anticuerpo a partir de sobrenadantes de cultivos celulares se llevó a cabo mediante cromatografía de afinidad usando proteína A como se describe anteriormente para la purificación de fusiones de antígeno Fc. Se concentró la proteína y se filtró antes de cargarla en una columna HiLoad Superdex 200 (GE Healthcare) equilibrada con 20 mM de histidina, 140 mM de cloruro de sodio con pH 6,0.
La concentración de proteína de los anticuerpos purificados se determinó midiendo la DO a 280 nm, usando el coeficiente de extinción molar calculado en base a la secuencia de aminoácidos. La pureza y el peso molecular de los anticuerpos se analizaron mediante CE-SDS en presencia y ausencia de un agente reductor (Invitrogen, EE.UU.) usando un LabChipGXII (Caliper). El contenido agregado de las muestras de anticuerpos se analizó usando una columna de exclusión por tamaño analítica TSKgel G3000 SW XL (Tosoh) equilibrada en 25 mM de K2HPO4 , 125 mM de NaCl, 200 mM de monoclorhidrato de L-arginina, NaN3 al 0,02 % (p/v), tampón de funcionamiento de pH6,7 a 25 °C (Tabla 61).
Tabla 61: Análisis bioquímico de clones IgG1 de P329G LALA anti-CD19
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Para la preparación de construcciones biespecíficas se eligió el clon 2B11 porque carece de los tres puntos calientes de desamidación.
La secuencia de ADN que codifica parte del ectodominio (aminoácidos 71-254 y 71-248) del ligando humano 4-1BB se sintetizó de acuerdo con la secuencia P41273 de la base de datos Uniprot.
7.2.3 Preparación de la molécula de unión a antígeno de fusión (kih) de Fc que contiene trímeros de ligando 4-1BB (71-254) dirigido a CD19 (8B8-2B11) monovalente con dominios CH1-CL cruzados con residuos cargados (construcción 4.1)
La construcción 4.1 se preparó como se describe para la construcción 3.1 (Figura 30), pero usando la región variable de secuencias de ADN de cadena pesada y ligera que codifican un ligante específico para CD19, clon 8B8-2B11.
La tabla 62 muestra las secuencias de ADNc y de aminoácidos de la molécula de unión a antígeno de fusión (kih) de Fc ligando de 4-1BB (71-254) trimérico dividido dirigido a CD19 (8B8-2B11) monovalente con CH-CL cruzado y residuos cargados (construcción 4.1).
Tabla 62: Secuencias de ADNc y de aminoácidos de fusión (kih) de Fc ligando de 4-1BB (71-254) trimérico dividido dirigido a CD19(8B8-2B11) monovalente que contiene cruce de CH-CL con residuos cargados (construcción 4.1). * para residuos cargados
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7.2.4 Preparación de la molécula de unión a antígeno de fusión (kih) de Fc que contiene trímeros de ligando 4-1BB (71-254) dirigido a CD19 (8B8-2B11) monovalente con dominios CH1-CL cruzados sin residuos cargados (construcción 4.2)
La construcción 4.2 se preparó como se describe para la construcción 3.2 (Figura 30), pero usando la región variable de secuencias de ADN de cadena pesada y ligera que codifican un ligante específico para CD19, clon 8B8-2B11.
La tabla 63 muestra las secuencias de ADNc y de aminoácidos de la molécula de unión a antígeno de fusión (kih) de Fc ligando de 4-1BB (71-254) trimérico dividido dirigido a CD19(8B8-2B11) monovalente que contiene cruce de CH-CL cruzado sin residuos cargados (construcción 4.2).
Tabla 63: Secuencias de ADNc y de aminoácidos de fusión (kih) de Fc ligando de 4-1BB (71-254) trimérico dividido dirigido a CD19 (8B8-2B11) monovalente que contiene cruce de CH-CL sin residuos cargados (construcción 4.2).
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7.2.5 Preparación de la unión a antígeno de fusión (kih) de Fc que contiene trímeros de ligando 4-1BB (71-254) dirigido a CD19(8B8-2B11) bivalente (construcción 4.3)
La construcción 4.3 se preparó como se describe para la construcción 3.3 (figura 30), pero usando la región variable de secuencias de ADN de cadena pesada y ligera que codifican un aglutinante específico para CD19, clon 8B8-2B11.
La tabla 64 muestra las secuencias de ADNc y de aminoácidos de la molécula de unión a antígeno de fusión (kih) de Fc ligando de 4-1BB (71-254) trimérico dividido dirigido a CD19 (8B8-2B11) bivalente (construcción 4.3). Tabla 64: Secuencias de ADNc y de aminoácidos de fusión de PGLALA (kih) de Fc ligando de 4-1BB trimérico dividido dirigido a CD19(8B8-2B11) bivalente (construcción 4.3)
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7.2.6 Preparación de la molécula de unión a antígeno de fusión (kih) de Fc que contiene trímeros de ligando 4-1BB (71-248) dirigido a CD19(8B8-2B11) monovalente con dominios CH1-CL cruzados con residuos cargados (construcción 4.4)
La construcción 4.4 se preparó como se describe para la construcción 3.4 (figura 30), pero usando la región variable de secuencias de ADN de cadena pesada y ligera que codifican un aglutinante específico para CD19, clon 8B8-2B11.
La tabla 65 muestra las secuencias de ADNc y de aminoácidos de la molécula de unión a antígeno de fusión (kih) de Fc ligando de 4-1BB (71-248) trimérico dividido dirigido a CD19 (8B8-2B11) monovalente con CH-CL cruzado y residuos cargados (construcción 4.4).
trimérico 15 dividido dirigido a CD19 (8B8-2B11) monovalente que contiene cruce de CH-CL con residuos cargados (construcción 4.4). * residuos cargados
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7.2.7 Preparación de la molécula de unión a antígeno de fusión (kih) de Fc que contiene trímeros de ligando 4-1BB (71-248) dirigido a CD19 (8B8-2B11) monovalente con dominios CH1-CL cruzados sin residuos cargados (construcción 4.5)
La construcción 4.5 se preparó como se describe para la construcción 3.5 (figura 30), pero usando la región variable de secuencias de ADN de cadena pesada y ligera que codifican un aglutinante específico para CD19, clon 8B8-2B11.
La tabla 66 muestra las secuencias de ADNc y de aminoácidos de la molécula de unión a antígeno de fusión (kih) de Fc ligando 4-1BB (71-248) trimérico dividido dirigido a CD19(8B8-2B11) monovalente que contiene cruce de CH-CL cruzado sin residuos cargados (construcción 4.5).
Tabla 66: Secuencias de ADNc y de aminoácidos de fusión (kih) de Fc ligando 4-1BB (71-248)trimérico dividido dirigido a CD19(8B8-2B11) monovalente que contiene cruce de CH-CL sin residuos cargados (construcción 4.5).
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7.2.8 Preparación de la unión a antígeno de fusión (kih) de Fc que contiene trímeros de ligando 4-1BB (71-248) dirigido a CD19(8B8-2B11) bivalente (construcción 4.6)
La construcción 4.6se preparó como se describe para la construcción 3.6 (figura 30), pero usando la región variable de secuencias de ADN de cadena pesada y ligera que codifican un aglutinante específico para CD19, clon 8B8-2B11.
La tabla 67 muestra las secuencias de ADNc y de aminoácidos de la molécula de unión a antígeno de fusión (kih) de Fc ligando 4-1BB (71-248) trimérico dividido dirigido a CD19(8B8-2B11) bivalente (construcción 3.6).
Tabla 67: Secuencias de ADNc y de aminoácidos de la de fusión (kih) de Fc ligando 4-1BB (71-248) trimérico dividido dirigido a CD19(8B8-2B11) bivalente (construcción 4.6)
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7.3 Preparación de la fusión Fc del ligando 4-1BB trimérico dividido no dirigido e IgG humana como moléculas de control
7.3. 1 Preparación de moléculas de unión a antígeno de fusión Fc que contienen un trímero de ligando 4-1BB humano no dirigido (moléculas de control)
Estas moléculas de control se prepararon como se describe anteriormente para la construcción 3.1 dirigida a CD19 (denominado control B), 3.3 (denominado control C), 3.4 (denominado control D) y 3.5 (denominado control E) con la única diferencia de que el aglutinante anti-CD19 (VH-VL) se reemplazó por un control de línea germinal, denominado DP47, que no se une al antígeno (véase la figura 30).
La tabla 68 muestra, respectivamente, las secuencias de ADNc y de aminoácidos de la fusión (kih) de Fc ligando de 4-1BB (71-254) trimérico dividido no dirigido a DP47 monovalente que contiene CH-CL cruzado con residuos cargados, control B.
La tabla 69 muestra, respectivamente, las secuencias de ADNc y de aminoácidos de la fusión (kih) de Fc ligando de 4-1BB (71-254) trimérico dividido no dirigido a DP47 bivalente, control C.
La tabla 70 muestra, respectivamente, las secuencias de ADNc y de aminoácidos de la fusión (kih) de Fc ligando 4-1BB (71-248) trimérico dividido no dirigido a DP47 monovalente que contiene cruce de CH-CL con residuos cargados, control D.
La tabla 71 muestra, respectivamente, las secuencias de ADNc y de aminoácidos de la fusión (kih) de Fc ligando 4-1BB (71-248) trimérico dividido no dirigido a DP47 monovalente sin residuos cargados en el cruce de CH-CL, control E.
Tabla 68: Secuencias de ADNc y de aminoácidos de fusión (kih) de Fc ligando de 4-1BB (71-254) humano trimérico dividido no dirigido a DP47 monovalente con cruce de CH-CL y con residuos cargados (control B). * residuos cargados
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Tabla 69: Secuencias de ADNc y de aminoácidos de fusión (kih) de Fc ligando de 4-1BB (71-254) humano trimérico dividido no dirigido a DP47 bivalente (control C).
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Tabla 70: Secuencias de ADNc y de aminoácidos de fusión (kih) de Fc ligando 4-1 BB (71-248) humano trimérico dividido no dirigido a DP47 monovalente con cruce de CH-CL y con residuos cargados (control D). * residuos cargados
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82 cadena ligera DP47 véase la tabla 18
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Tabla 71: Secuencias de ADNc y de aminoácidos de fusión (kih) de Fc ligando 4-1BB (71-248) humano trimérico dividido no dirigido a DP47 monovalente con cruce de CH-CL y sin residuos cargados (control E).
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7.3.2 Anticuerpos como moléculas de control
Se prepararon dos IgG1humanas de control que contenían PGLALA.
La tabla 72 muestra las secuencias de ADNc y de aminoácidos del anti-CD19 PGLALA huIgG1 (clon 8B8-018), es decir, el control G.
La tabla 73 muestra las secuencias de ADNc y de aminoácidos del control de la línea germinal DP47 PGLALA huIgG1 (control F).
Tabla 72: Secuencias de ADNc y de aminoácidos de anti-CD19(8B8-018) PGLALA huIgG1 (control G)
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206 cadena ligera CD19(8B8-018) véase la tabla 47
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Tabla 73: Secuencias de ADNc y de aminoácidos del control de la línea germinal DP47 PGLALA huIgGI (control F)
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7.4 Producción de moléculas de unión a antígeno de fusión Fc del ligando 4-1BB trimérico dividido dirigido a CD19 y sus moléculas de control
Las secuencias codificantes de la molécula de unión a antígeno de fusión (kih) de Fc ligando de 4-1BB trimérico dividido dirigido y no dirigido se clonaron en un vector plásmido, que dirige la expresión del inserto a partir de un promotor MPSV y contiene una secuencia poli A sintética localizada en el extremo 3' del CDS. Además, el vector contiene una secuencia de EBV OriP para el mantenimiento episomal del plásmido.
Se produjo la molécula de unión a antígeno de fusión (kih) de Fc ligando de 4-1 BB trimérico dividido cotransfectando células HEK293-EBNA con los vectores de expresión de mamífero usando polietilenimina. Se transfectaron las células con los correspondientes vectores de expresión. Para las variantes 1, 2, 4, 5 y su control B, D y E, en una proporción de 1:1:1:1 ("vector ligando dimérico-CL-cadena de botón": "vector fusión de ligando monomérico-CH1": "vector Fab anti-CD19-cadena de ojal": "vector cadena ligera anti-CD19"). Para la variante 3, 6 y su control C, a una proporción de 1:1:1 ("vector cadena de ligando dimérico de ojal Fc de huIgG1": "vector cadena de ligando monomérico de botón Fc de huIgG1": "vector cadena ligera anti-CD19"). Las IgG humanas, usadas como control en el ensayo, se produjeron como para la construcción biespecífica (para la transfección solo se usó un vector para la cadena ligera y un vector para la cadena pesada en una proporción de 1:1).
Para la producción en matraces de agitación de 500 mL, se sembraron 300 millones de células HEK293 EBNA 24 horas antes de la transfección. Para la transfección, se centrifugaron las células durante 10 minutos a 210 x g y se reemplazó el sobrenadante por 20 mL de medio CD CHO precalentado. Los vectores de expresión (200 |jg de ADN total) se mezclaron en 20 mL de medio CD CHO. Después de la adición de 540 jL de PEI, la solución se agitó en vórtex durante 15 segundos y se incubó durante 10 minutos a temperatura ambiente.
Después de esto, se mezclaron las células con la solución ADN/PEI, se transfirieron a un matraz de agitación de 500 mL y se incubó durante 3 horas a 37 °C en una incubadora con una atmósfera de CO2 al 5 %. Después de la incubación, se añadieron 160 mL de medio Excell complementado con L-glutamina 6 mM, 5g/L de PEPSOY y ácido valproico 1,2 mM y se cultivaron las células durante 24 horas. Un día después de la transfección se añadió Feed al 12 % (aminoácidos y glucosa). Después de cultivarse durante 7 días, se recogió el sobrenadante mediante centrifugación durante 30-40 minutos al menos 400 x g. La solución se filtró en condiciones estériles (filtro de 0,22 |jm), se suplementó con acida sódica hasta una concentración final de 0,01 % (p/v) y se mantuvo en 4 °C.
La molécula de unión a antígeno de fusión (kih) de Fc ligando de 4-1BB trimérico dividido, así como la IgG, se purificó a partir de sobrenadantes de cultivo celular mediante cromatografía de afinidad usando la proteína A, seguido de cromatografía de exclusión por tamaño. Para la cromatografía de afinidad, se cargó el sobrenadante en una columna Mab Select Sure (CV = 5-15 mL, resina de GE Healthcare) equilibrado con fosfato de sodio (20 mM), tampón de citrato de sodio (20 mM) (pH 7,5). La proteína no unida se eliminó lavando con al menos 6 volúmenes de columna del mismo tampón. La proteína unida se eluyó usando un gradiente lineal (20 CV) o una elución escalonada (8 CV) con citrato de sodio 20 mM, cloruro de sodio 100 mM, tampón de glicina 100 mM (pH 3,0). Para el gradiente lineal, se aplicó una elución escalonada adicional de 4 volúmenes de columna.
El pH de las fracciones recogidas se ajustó añadiendo 1/10 (v/v) de fosfato de sodio 0,5 M, pH 8,0. La proteína se concentró antes de cargarla en una columna HiLoad Superdex 200 (GE Healthcare) equilibrada con histidina 20 mM, cloruro de sodio 140 mM, solución Tween20 al 0,01 % (v/v) de pH 6,0.
Se determinó la concentración de proteína midiendo la densidad óptica (DO) a 280 nm, usando un coeficiente de extinción molar calculado en base a la secuencia de aminoácidos. La pureza y el peso molecular de la fusión (kih) de Fc ligando de 4-1BB trimérico dirigido se analizaron mediante SDS-PAGE en presencia y ausencia de un agente reductor (1,4-ditiotreitol 5 mM) y tinción con Coomassie SimpleBlue™ SafeStain (Invitrogen USA). Se analizó el contenido en agregado de las muestras usando una columna analítica de exclusión por tamaño TSKgel G3000 SW XL (Tosoh) equilibrada en K2 HPO425 mM, NaCl 125 mM, monoclorhidrato de L-arginina 200 mM, NaN3 al 0,02 % (p/v), tampón de migración a pH 6,7 a 25 °C.
La Tabla 74 resume el rendimiento y el contenido final de monómero de las moléculas de antígeno de fusión (kih) de Fc ligando de 4-1BB trimérico dividido dirigido a CD19.
Tabla 74: Análisis bioquímico de moléculas de unión a antígeno de fusión (kih) de Fc ligando de 4-1BB trimérico dividido dirigido a CD19
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La tabla 75 resume el rendimiento y el contenido final de monómero de la fusión (kih) de Fc ligando de 4-1BB trimérico dividido no dirigido de DP47, tanto monovalente (control B, D y E) como bivalente (control C).
Tabla 75: Análisis bioquímico de la fusión (kih) de Fc ligando de 4-1BB trimérico dividido no dirigido a DP47
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La tabla 76 resume el rendimiento y el contenido final de monómero de anti-CD19 (8B8-018) y PGLALA de IgG1 humana línea germinal DP47 (control F).
Tabla 76: Análisis bioquímico de PGLALA de IgG1 humana de control
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Ejemplo 8
Caracterización funcional de las moléculas de unión a antígeno de fusión Fc que contienen un trímero de ligando 4-1BB dirigido a CD19
8.1. Resonancia de plasmón superficial (afinidad)
La unión de moléculas de unión a antígeno de fusión Fc del ligando 4-1BB trimérico dividido dirigido a CD19 (construcciones 3.4 y 3.6) a (kih) de Fc 4-1BB recombinante y CD19 se evaluó mediante resonancia de plasmón superficial (SPR). Todos los experimentos de SPR se realizaron en un Biacore T200 a 25 °C con HBS-EP como tampón de migración (HEPEs 0,01 M, pH7,4, NaCl 0,15 M, EDTA3 mM, tensioactivo P20 al 0.005 %, Biacore, Friburgo/Alemania).
Interacción con 4-1BB humano y de macaco cangrejero
El anticuerpo anti-Fab humano (Biacore, Friburgo/Alemania) se acopló directamente en un chip CM5 a pH 5,0 usando el kit de acoplamiento de amina estándar (Biacore, Friburgo/Alemania). El nivel de inmovilización fue de aproximadamente 8000 UR. Las fusiones Fc del ligando 4-1BB trimérico dividido dirigido a CD19 se capturaron durante 60 segundos a 2 y 5 nM (también se inyectó el control D). El 4-1BB avi His humano o de macaco cangrejero recombinante se pasó a un intervalo de concentración de 2,7 a 2000 nM (diluido 3 veces) con un caudal de 30 pL/minuto a través de las cubetas de lectura durante 120 segundos. Se supervisó la disociación durante 180 segundos. Se corrigieron las diferencias en el índice de refracción aparente restando la respuesta obtenida en la cubeta de lectura de referencia. Aquí, los antígenos se pasaron sobre una superficie con anticuerpo anti-Fab humano inmovilizado, pero en el que se había inyectado HBS-EP en lugar de los anticuerpos.
Interacción con CD19 humano
El anticuerpo anti-Fab humano (Biacore, Friburgo/Alemania) se acopló directamente en un chip CM5 a pH 5,0 usando el kit de acoplamiento de amina estándar (Biacore, Friburgo/Alemania). El nivel de inmovilización fue de aproximadamente 8000 UR. Las fusiones Fc del ligando 4-1BB trimérico dividido dirigido a CD19 o el anticuerpo de control (anti-CD19 (8B8-018) PGLALA huIgG1) se capturaron durante 60 segundos a 20 nM. (kih) de Fc Cd 19 humano recombinante se pasó a un intervalo de concentración de 7,8 a 500 nM (diluido 2 veces) con un caudal de 30 pL/minuto a través de las cubetas de lectura durante 120 segundos. Se supervisó la disociación durante 120/1800 segundos. Se corrigieron las diferencias en el índice de refracción aparente restando la respuesta obtenida en la cubeta de lectura de referencia. Aquí, los antígenos se pasaron sobre una superficie con anticuerpo anti-Fab humano inmovilizado, pero en el que se había inyectado HBS-EP en lugar de los anticuerpos.
Las constantes cinéticas se derivaron usando el programa informático de evaluación Biacore T200 (vAA, Biacore AB, Uppsala/Suecia), para ajustar las ecuaciones de velocidad para la unión de Langmuir 1:1 por integración numérica.
Las construcciones biespecíficas 3.4, 3.6 y el control D se unen de manera similar a 4-1BB. La tabla 77 muestra el promedio con desviación estándar (entre paréntesis) de los dos experimentos (usando la solución de captura de construcción a 2 nM o 5 nM). Las construcciones biespecíficas 3.4 y 3.6 se unen a CD19 humano con una afinidad similar a la IgG. Las constantes de afinidad para la interacción se determinaron ajustando a una unión de Langmuir de 1:1. Para las mediciones con 4-1BB hu y 4-1BB cy, se muestran la desviación promedio y estándar (entre paréntesis) (dos experimentos con solución de captura de 2 o 5 nM).
Tabla 77: Unión de la fusión Fc del ligando 4-1BB trimérico dividido dirigido a CD19 a 4-1BB humano (hu) recombinante, 4-1BB de macaco cangrejero (cy) y CD19 humano (hu).
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8.2. Resonancia de plasmón superficial (unión simultánea)
La capacidad de unir simultáneamente (kih) de Fc 4-1BB humano y CD19 humano se evaluó mediante resonancia de plasmón superficial (SPR). Todos los experimentos de SPR se realizaron en un Biacore T200 a 25 °C con HBS-EP como tampón de migración (HEp Es 0,01 M, pH 7,4, NaCl 0,15 M, EDTA 3 mM, tensioactivo P20 al 0,005 %, Biacore, Friburgo/Alemania). Se acopló directamente (kih) de Fc 4-1BB humano biotinilado a una cubeta de lectura de un chip sensor de estreptavidina (SA). Se usaron niveles de inmovilización de hasta 250 unidades de resonancia (UR).
Las construcciones de 4-1BBL dividido trimérico dirigido a CD19 (construcciones 3.1, 3.3, 3.4, 3.5, 3.6, 4.4) se pasaron a un intervalo de concentración de 200 nM con un caudal de 30 pL/minuto a través de las cubetas de lectura durante 90 segundos y la disociación se estableció en cero segundos. Se inyectó CD19 humano como segundo analito con un caudal de 30 pL/minuto a través de las cubetas de lectura durante 90 segundos a una concentración de 500 nM (figura 34A). Se supervisó la disociación durante 120 segundos. Las diferencias en el índice de refracción aparente se corrigieron sustrayendo la respuesta obtenida en una cubeta de lectura de referencia, donde no se inmovilizó ninguna proteína.
Como se puede observar en los gráficos de la figura 35, todas las construcciones biespecíficas se podrían unir simultáneamente a 4-1BB humano y CD19 humano.
Ejemplo 9
Caracterización funcional de las moléculas de unión a antígeno de fusión Fc que contienen un trímero de ligando 4-1BB dirigido a CD-19
9.1. Unión en PMBC humanas activadas de las moléculas de unión a antígeno de fusión (kih) de Fc que contienen trímeros del ligando 4-1BB dirigido a CD19
Para determinar la unión de moléculas de unión a antígeno de fusión Fc que contienen trímeros de 4-1BBL a PBMC humanas, se usaron diferentes concentraciones tituladas de las moléculas de unión a antígeno de fusión Fc que contienen trímeros de 4-1BBL dirigido a CD19 en el ensayo como se describe en el ejemplo 5.2.
Las figuras 36A y 36B muestran la unión de las construcciones 3.1, 3.3, 3.4, 3.5 y 3.6 como las preparadas en el ejemplo 7 en linfocitos T CD4+ y linfocitos T CD8+ que expresan 4-1BB activados, respectivamente. Las puertas se establecieron en linfocitos T CD45+ CD3+ CD4+ o CD45+ CD3+ CD8+ vivos y la MFI del fragmento F(ab')2 caprino específico del fragmento Fc y de IgG de ant-IgG humana de AffiniPure conjugado con PE se transfirieron frente a la concentración titulada de variantes de fusión Fc del ligando 4-1BB trimérico dividido dirigido. La tabla 78 muestra los valores de EC50 como se mide para las construcciones 3.1, 3.3, 3.4, 3.5 y 3.6 y moléculas de control.
Tabla 78: Unión a linfocitos T CD4+ activados que expresan 4-1BB y linfocitos T CD8+
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9.2 Unión a células tumorales que expresan CD19
Para los ensayos de unión en células tumorales que expresan CD19, se usaron las siguientes líneas celulares de linfoma que expresan CD19: línea celular (B-NHL) de linfoma difuso de linfocitos B grandes no Hodgkin SU-DHL-8 (DSMZ ACC573), línea celular de leucemia linfoide precursora de linfocitos B aguda Nalm6 (DSMZ ACC-128), línea celular de linfoma difuso de linfoblastos de células grandes Toledo (ATCC CRL-2631) y línea celular de linfoma difuso de linfocitos B grandes OCI-Ly18 (DSMZ ACC-699). Los ensayos se realizaron como se describe para las líneas de células tumorales MV-3 y WM-266-4 que expresan FAP en el ejemplo 5.3.
Se establecieron puertas en células tumorales vivas y se transfirieron MFI de fragmento F(ab')2 caprino específico de fragmento Fcy de IgG anti-IgG humana de AffiniPure conjugado con PE frente a la concentración titulada de construcciones de fusión Fc de ligando 4-1BB trimérico dividido dirigido.
La figura 37A muestra la unión de las construcciones 3.1, 3.3, 3.4, 3.5 y 3.6 como se preparó en el ejemplo 7.1 para difundir la línea celular difusa de linfoma de linfocitos B no Hodgkin (B-NHL) SU-DHL-8 y en la figura 37B se presenta la unión de las construcciones 3.1, 3.3, 3.4, 3.5 y 3.6 a la línea celular de leucemia linfoide aguda precursora de linfocitos B Nalm6. La figura 37C muestra la unión de las construcciones 3.1, 3.3, 3.4, 3.5 y 3.6 a la línea celular difusa de linfoma de linfoblastos de células grandes Toledo y la figura 37D muestra la unión de las construcciones 3.1,3.3, 3.4, 3.5 y 3.6 a la línea celular difusa de linfoma de linfocitos B grandes OCI-Ly18. La tabla 79 muestra los valores de EC50 como se mide para las construcciones 3.1, 3.3, 3.4, 3.5 y 3.6 y las moléculas de control.
Tabla 79: Unión a células tumorales que expresan CD19
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Ejemplo 10
Actividad biológica de las moléculas de unión a antígeno de fusión Fc que contienen el trímero del ligando 4-1BB dirigido a CD19
10,1. Activación de NF-kB en células HeLa que expresan 4-1BB humano
Se generaron células HeLa que expresan 4-1BB humano y NF-KB-luciferasa como se describe en el ejemplo 6.1.
Activación de NF-kB en élulas Hela que expresan 4 -1BB humano cocultivadas con células tumorales que expresan CD19
Se cosecharon células humanas 4-1BB HeLa con NF-kB-luciferasa y se resuspendieron en un medio DMEM complementado con 10 % (v/v) de FBS y 1 % (v/v) GlutaMAX-I a una concentración de 0,2 x 106 células/ml. 100 pl (2 x 104 células) de esta suspensión celular se transfirieron a cada pocillo de una placa de cultivo tisular estéril blanca de 96 pocillos de fondo plano con tapa (greiner bio-one, n.° de cat. 655083) y la placa se incubaron a 37 °C y CO2 al 5 % durante la noche. Al día siguiente, 50 pl del medio que contiene concentraciones tituladas de moléculas de unión a antígeno de fusión Fc que contienen trímero de ligando 4-1BB dirigido a CD19 (trímero de fusión 4-1BBL de CD19 dividido) o moléculas de unión a antígeno de fusión Fc que contienen trímero de ligando 4-1 BB no dirigido a DP47 (Trímero DP47 dividido 4-1BBL). Líneas celulares de linfoma de linfocitos B que expresan CD19 (línea celular grande difusa de linfoma de linfocitos B no Hodgkin (B-NHL) SU-DHL-8 (DSMZ a Cc 573) y línea celular de linfoma de linfocitos B no Hodgkin humano Pfeiffer (ATCC CRL-2632) se resuspendieron en un medio DMEM suplementado con 10 % (v/v) de FBS y 1 % (v/v) GlutaMAX-I a una concentración de 2 x 106 células/ml.
Suspensión celular de linfocitos B de linfoma que expresan CD 19 (50 pl, proporción final 1:5) o sólo medio se añadieron a cada pocillo y las placas se incubaron durante 6 horas a 37 °C y 5 % de CO2. Se lavaron las células dos veces con 200 pL/pocillo de Dp BS. 40 pl de tampón de lisis indicador de reciente preparación (Promega, n.° de cat.: E3971) se añadieron a cada pocillo y las placas se almacenaron durante la noche a -20 °C. Al día siguiente, las placas de células congeladas y el tampón de detección (Luciferase 1000 Assay System, Promega, n.° de cat. E4550) se descongelaron a temperatura ambiente. Se agregaron 100 pL de tampón de detección a cada pocillo y se midió la actividad de luciferasa lo más rápido posible usando un lector de microplacas SpectraMax M5/M5e y un software SoftMax Pro (Molecular Devices) contando la emisión de luz en URL (unidades de luz liberada por 0,5s/pocillo) o el lector de placas de contador de marcador múltiple Victor3 1420 (Perkin Elmer) y el software de gestión Perkin Elmer 2030 que cuenta la emisión de luz como recuentos por segundo (CPS) y se transfiere frente a la concentración de las construcciones sometidas a prueba.
Moléculas de unión a antígeno de fusión Fc que contienen trímero de ligando 4-1BB dirigido a CD19, las construcciones 3.1 y 3.3, desencadenaron la activación de la vía de señalización NF-kB en la línea de células indicadoras en presencia de células de linfoma de linfocitos B que expresan CD19. Por el contrario, las moléculas de control no dirigidas no lograron desencadenar tal efecto en ninguna de las concentraciones probadas (Figura 38).
Ejemplo 11
11.1 Preparación de moléculas de unión a antígeno de fusión Fc que contienen trímero de ligando 4-1BB dirigido a CEA (T84.66-LCHA)
11.1.1 Humanización del clon T84.66 anti-CEA
Se desarrollaron nuevas variantes humanizadas del anticuerpo murino T84.66 (Wagener et al., J Immunol 130, 2308 (1983), Neumaier et al., J Immunol 135, 3604 (1985)) mediante injerto de CDRs en las secuencias aceptoras de la región estructural de la línea germinal humana.
Para la humanización de un anticuerpo de origen no humano, se deben trasplantar los residuos de CDR del anticuerpo no humano (donante) a la región estructural de un anticuerpo humano (aceptor). En general, la región estructural aceptora se selecciona alineando la secuencia del donante con una colección de secuencias aceptoras potenciales y eligiendo una que tenga una homología razonable con el donante o que muestre aminoácidos similares en algunas posiciones críticas en cuanto a estructura y actividad. En el presente caso, la búsqueda de la región aceptora del anticuerpo se realizó alineando la proteína T84.66 de ratón (NCBI Acc No: CAA36980 para la cadena pesada (SEQ ID NO: 317), y CAA36979 (s Eq ID NO: 318) para la cadena ligera) secuencia de una colección de secuencias de la línea germinal humana y seleccionando esa secuencia humana que mostró una alta identidad de secuencias. Aquí, la secuencia IGHV1-69* 08 de la base de datos IMGT se eligió como la secuencia aceptora de la región estructural de la cadena pesada (IMGT Acc No. Z14309, SEQ ID NO: 319), y la secuencia IGKV3-11* 01 (IMGT Acc No. X01668, SEQ ID NO: 320) se eligió como aceptor de la región estructural para la cadena ligera. En estas dos regiones estructurales aceptoras, se injertaron las tres regiones determinantes de complementariedad (CDR) de los dominios variables pesado y ligero del ratón. Dado que la región estructural 4 (FR4) no forma parte de la región variable del gen de la línea germinal V, la alineación para esta posición se realizó individualmente. La secuencia JH4 se eligió para la cadena pesada y la secuencia JK2 se eligió para la cadena ligera.
11.1.2 Unión de diferentes variantes humanizadas de IgG T84.66 a las células
La unión de diferentes variantes humanizadas de T84.66 IgG se probó en células de adenocarcinoma gástrico humano que expresan CEA (MKN45, DSMZ ACC409).
En resumen, las células se cosecharon, se contaron, se comprobó su viabilidad y se resuspendieron a 2 x 106 células/ml en tampón FACS (100 pl de PBS, BSA al 0,1 %). Se incubaron 100 pl de suspensión celular (que contenía 0,2 x 106 células) en una placa de 96 pocillos de fondo redondo durante 30 minutos a 4 °C con concentraciones crecientes del CEA (4 ng/ml - 60 pg/ml), se lavaron dos veces con PBS frío, BSA al 0,1 %, se reincubaron durante otros 30 minutos a 4 °C con anticuerpo secundario específico del fragmento Fcg anti-IgG humana caprino del fragmento F(ab')2 de AffiniPure conjugado con PE (Jackson Immuno Research Lab PE # 109-116-170), se lavaron dos veces con PBS frío, BSA al 0,1 % y se analizaron de inmediato por FACS usando un FACS CantoII (programa informático FACS Diva). Las curvas de unión y los valores de EC50 se obtuvieron y calcularon usando GraphPadPrism5.
La figura 39 muestra el patrón de unión diferente de variantes humanizadas seleccionadas de la IgG T84.66 a CEA humano, expresado en células MKN45. Basándose en los valores de unión de EC50 calculados (Tabla 80), se seleccionó la variante humanizada 1 para una evaluación adicional.
Tabla 80: Unión de diferentes variantes humanizadas de IgG T84.66 a las células (valores de CE50, basados en las curvas de unión mostradas en la Figura 39, calculadas por Graph Pad Prism).
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La variante humanizada 1 se denomina a continuación T84.66-LCHA. Las secuencias de aminoácidos de sus CDRs y de VH y VL así como las secuencias de aminoácidos del dominio VH y VL del clon quimérico original T84.66 se muestran en la Tabla 81.
Tabla 81: Secuencias de aminoácidos de los dominios variables del clon T84.66-LCHA de CEA y su anticuerpo original T84.66
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11.2 Preparación de moléculas de unión a antígeno de fusión Fc que contienen trímero de ligando 4-1BB dirigido a CEA (T84.66-LCHA)
Se sintetizaron diferentes fragmentos de la secuencia de ADN que codifica parte del ectodominio (aminoácidos 71-254 y 71-248) del ligando 4-1BB humano de acuerdo con la secuencia P41273 de la base de datos Uniprot (SEQ ID NO: 42).
11.2.1 Preparación de molécula de unión a antígeno de fusión (kih) de Fc que contiene trímero de ligando 4-1BB (71-254) dirigido a CEA monovalente (T84.66-LCHA) con dominios CH1-CL cruzados con residuos cargados (construcción 5.1)
Se clonó un polipéptido que contenía dos ectodominios del ligando 4-1BB (71-254), separados por conectores (G4S)2 y fusionado al dominio IgG1-CL humano, como se representa en la figura 29A: ligando 4-1BB humano, conector(G4S)2, ligando 4-1BB humano, conector (G4S)2, c L humano. Se clonó un polipéptido que contenía un ectodominio del ligando 4-1BB (71-254) y fusionado al dominio IgG1-CH humano, como se describe en la Figura 29B: ligando 4-1BB humano, conector (G4S)2, CH humano.
Para mejorar el emparejamiento correcto, se han introducido las siguientes mutaciones en el CH-CL cruzado. En el ligando dimérico 4-1BB fusionado con CL, E123R y Q124K humanos. En el ligando monomérico 4-1BB fusionado con CH1, K147E y K213E humanos.
Se subclonó la región variable de secuencias de ADN de la cadena pesada y ligera que codifican un aglutinante específico para CEA, clon T84.66-LCHA, sin cambio de pauta de lectura con la cadena pesada constante del ojal o con la cadena ligera constante de IgG1 humana. Se han introducido las mutaciones Pro329Gly, Leu234Ala y Leu235Ala en la región constante de las cadenas pesadas de botón y ojal para anular la unión a los receptores gamma Fc de acuerdo con el procedimiento descrito en el documento WO 2012/130831.
La combinación de la cadena de botón de ligando dimérico-Fc que contiene las mutaciones S354C/T366W, la fusión CH1 monomérica, la cadena de ojal anti-CEA-Fc dirigida que contiene las mutaciones Y349C/T366S/L368A/Y407V y la cadena ligera anti-CEA permite la generación de un heterodímero, que incluye un ligando 4-1BB trimérico ensamblado y una Fab de unión a CEA (figura 40, construcción 5.1).
La tabla 82 muestra las secuencias de ADNc y de aminoácidos de la molécula de unión a antígeno de fusión (kih) de Fc ligando de 4-1BB (71-254) trimérico dividido dirigido a CEA monovalente (T84.66-LCHA) con CH-CL cruzado y residuos cargados (construcción 5.1).
Tabla 82: Secuencias de ADNc y de aminoácidos de la fusión (kih) de Fc ligando de 4-1BB (71-254) trimérico dividido dirigido a CEA monovalente (T84.66-LCHA) que contiene cruce de CH-CL con residuos cargados (construcción 5.1). * para residuos cargados
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. .
ligando 4-1BB (71-254) dirigido a CEA monovalente (T84.66-LCHA) con dominios CH1-CL cruzados sin residuos cargados (construcción 5.2)
Se clonó un polipéptido que contenía dos ectodominios del ligando 4-1BB (71-254), separado por conectores (G4S)2 y fusionado con el dominio de IgG1-CL humano, de forma similar a como se representa en la figura (29A), pero sin mutaciones aminoacídicas en el dominio CL: ligando 4-1BB humano, conector (G4S)2, ligando 4-1BB humano, conector (G4S)2, CL humano. Se clonó un polipéptido que contenía un ectodominio del ligando 4-1BB (71-254) y se fusionó con el dominio de IgG1-CH1 humano, de forma similar a como se representa en la figura (29B), pero sin mutaciones aminoacídicas en el dominio CH1: ligando 4-1BB humano, conector (G4S)2, CH1 humano.
Se subclonó la región variable de secuencias de ADN de la cadena pesada y ligera que codifican un aglutinante específico para CEA, clon T84.66-LCHA, sin cambio de pauta de lectura con la cadena pesada constante del ojal o con la cadena ligera constante de IgG1 humana.
Se han introducido las mutaciones Pro329Gly, Leu234Ala y Leu235Ala en la región constante de las cadenas pesadas de botón y ojal para anular la unión a los receptores gamma Fc de acuerdo con el procedimiento descrito en el documento WO 2012/130831. La combinación de la cadena de botón de ligando dimérico-Fc que contiene las mutaciones S354C/T366W, la fusión CH1 monomérica, la cadena de ojal anti-CEA-Fc dirigida que contiene las mutaciones Y349C/T366S/L368A/Y407V y la cadena ligera anti-CEA permite la generación de un heterodímero, que incluye un ligando 4-1BB trimérico ensamblado y una Fab de - unión a CEA (figura 40, construcción 5.2).
La tabla 83 muestra las secuencias de ADNc y de aminoácidos de la molécula de unión al antígeno de fusión (kih) de Fc ligando de 4-1BB (71-254) trimérico dividido dirigido a CEA monovalente (T84.66-LCHA) que contiene cruce de CH-CL cruzado sin residuos cargados (construcción 5.2).
Tabla 83: Secuencias de ADNc y de aminoácidos de la fusión (kih) de Fc ligando de 4-1 BB (71-254) trimérico dividido dirigido a CEA monovalente (T84.66-LCHA) que contiene cruce de CH-CL sin residuos cargados (construcción 5.2)
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11.2.3 Preparación de unión a antígeno de fusión (kih) de Fc que contiene el trímero de ligando 4-1BB (71-254) dirigido a CEA bivalente (T84.66-LCHA) (construcción 5.3)
Se clonó un polipéptido que contenía dos ectodominios del ligando 4-1BB (71-254), separado por conectores (G4S)2 y fusionado con el extremo C de la cadena de ojal Fc de IgG1 humana, como se representa en la figura 29C: ojal Fc de IgG1 humana, conector (G4S)2, ligando 4-1BB humano, conector (G4S)2, ligando 4-1BB humano. Un polipéptido que contenía un ectodominio del ligando 4-1BB (71-254) se fusionó con el extremo C de la cadena de botón Fc de IgG1 humana como se describe en la figura 29D: botón Fc de IgG1 humana, conector (G4S)2, ligando 4-1BB humano.
Se subclonó la región variable de secuencias de ADN de las cadenas pesada y ligera que codifican un aglutinante específico para CEA, clon T84.66- LCHA, sin cambio de pauta de lectura con la cadena pesada constante del ojal o con la cadena ligera constante de IgG1 humana. Se han introducido las mutaciones Pro329Gly, Leu234Ala y Leu235Ala en la región constante de las cadenas pesadas de botón y ojal para anular la unión a los receptores gamma Fc de acuerdo con el procedimiento descrito en el documento W o 2012/130831. La combinación de la cadena pesada del ligando dimérico del ojal anti-CEA huIgG1 que contiene las mutaciones Y349C/T366S/L368A/Y407V, la cadena pesada del ligando monomérico del botón anti-CEA huIgG1 que contiene las mutaciones S354C/T366W y las cadenas ligeras anti-CEA permitió la generación de un heterodímero, que incluía un ligando de 4-1BB trimérico ensamblado y dos Fab de unión a CEA (figura 40, construcción 5.3).
La tabla 84 muestra las secuencias de ADNc y de aminoácidos de la molécula de unión a antígeno de fusión (kih) de Fc ligando de 4-1BB (71-254) trimérico dividido dirigido a CEA bivalente (T84.66-LCHA) (construcción 5.3).
Tabla 84: Secuencias de ADNc y de aminoácidos de la fusión de PGLALA (kih) de Fc ligando de 4-1BB (71-254) trimérico dividido dirigido de CEA bivalente (T84.66-LCHA) (construcción 5.3)
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11.2.4 Preparación de molécula de unión a antígeno de fusión (kih) de Fc que contiene trímero de ligando 4-1BB (71-248) dirigido a CEA monovalente (T84.66-LCHA) con dominios CH1-CL cruzados con residuos cargados (construcción 5.4)
Se clonó un polipéptido que contenía dos ectodominios del ligando 4-1BB (71-248), separados por conectores (G4S) 2, y fusionados con el dominio IgG1-CL humano, de forma análoga al representado en la figura 29A: ligando 4-1BB humano, conector (G4S)2, ligando 4-1BB humano, conector (G4S)2, CL humano. Se clonó un polipéptido que contenía un ectodominio del ligando 4-1BB (71-248) y fusionado al dominio IgG1-CH humano, de forma análoga al descrito en la Figura 29B: ligando 4-1BB humano, conector (G4S)2, humano CH.
Se subclonó el polipéptido que codifica el ligando dimérico de 4-1BB fusionado al dominio CL humano sin cambio de pauta de lectura con los dominios CH2 y CH3 de la cadena pesada de IgG1 humana en el botón (Merchant, Zhu et al. 1998). Para mejorar el emparejamiento correcto, se han introducido las siguientes mutaciones en el CH-CL cruzado. En el ligando dimérico 4-1Bb fusionado con CL, E123R y Q124K humanos. En el ligando monomérico 4-1BB fusionado con CH1, K147E y K213E humanos.
Se subclonó la región variable de secuencias de ADN de la cadena pesada y ligera que codifican un aglutinante específico para CEA, clon T84.66-LCHA, sin cambio de pauta de lectura con la cadena pesada constante del ojal o con la cadena ligera constante de IgG1 humana. Las mutaciones Pro329Gly, Leu234Ala y Leu235Ala se han introducido en la región constante de las cadenas pesadas de botón y ojal para anular la unión a los receptores gamma de Fc de acuerdo con el procedimiento descrito en el documento w O 2012/130831. La combinación de la cadena de botón ligando dimérico-Fc que contiene las mutaciones S354C/T366W, la fusión CH1 monomérica, la cadena de ojal Fc anti-CD19 dirigida que contiene las mutaciones Y349C/T366S/L368A/Y407V y la cadena ligera anti-CD19 permite la generación de un heterodímero, que incluye un ligando 4-1BB trimérico ensamblado y una Fab de unión a CEA (figura 40, contrucción 5.4).
La tabla 85 muestra las secuencias de ADNc y de aminoácidos de la molécula de unión a antígeno de fusión (kih) de Fc ligando de 4-1BB (71-248) trimérico dividido dirigido a CEA monovalente (T84.66-LCHA) con CH-CL cruzado y residuos cargados (construcción 5.4).
Tabla 85: Secuencias de ADNc y de aminoácidos de la fusión (kih) de Fc ligando de 4-1BB (71-248) trimérico dividido dirigido a CEA monovalente (T84.66-LCHA) que contiene cruce de CH-CL con residuos cargados (construcción 5.4). * residuos cargados
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11.2.5 Preparación de molécula de unión a antígeno de fusión (kih) de Fc que contiene trímero de ligando 4-1BB (71-248) dirigido a CEA monovalente (T84.66-LCHA) con dominios CH1-CL cruzados sin residuos cargados (construcción 5.5)
Se clonó un polipéptido que contenía dos ectodominios del ligando 4-1BB (71-248), separado por conectores (G4S)2 y fusionado con el dominio de IgG1-CL humano, de forma similar a como se representa en la figura (29A), pero sin mutaciones aminoacídicas en el dominio CL: ligando 4-1BB humano, conector (G4S)2, ligando 4-1BB humano, conector (G4S)2, CL humano. Se clonó un polipéptido que contenía un ectodominio del ligando 4-1BB (71-248) y se fusionó con el dominio de IgG1-CH1 humano, de forma similar a como se representa en la figura (29B), pero sin mutaciones aminoacídicas en el dominio CH1: ligando 4-1BB humano, conector (G4S)2, CH1 humano.
Se subclonó la región variable de secuencias de ADN de la cadena pesada y ligera que codifican un aglutinante específico para CEA, clon T84.66-LCHA, sin cambio de pauta de lectura con la cadena pesada constante del ojal o con la cadena ligera constante de IgG1 humana. Se han introducido las mutaciones Pro329Gly, Leu234Ala y Leu235Ala en la región constante de las cadenas pesadas de botón y ojal para anular la unión a los receptores gamma Fc de acuerdo con el procedimiento descrito en el documento Wo 2012/130831. La combinación de la cadena de botón de ligando dimérico-Fc que contiene las mutaciones S354C/T366W, la fusión CH1 monomérica, la cadena de ojal anti-CEA-Fc dirigida que contiene las mutaciones Y349C/T366S/L368A/Y407V y la cadena ligera anti-CEA permite la generación de un heterodímero, que incluye un ligando 4-1BB trimérico ensamblado y una Fab de unión a CD19 (figura 40, construcción 5.5).
La tabla 86 muestra las secuencias de ADNc y de aminoácidos de la molécula de unión al antígeno de fusión (kih) de Fc ligando de 4-1BB (71-248) trimérico dividido dirigido a CEA monovalente (T84.66-LCHA) que contiene cruce de CH-CL cruzado sin residuos cargados (construcción 5.5).
Tabla 86: Secuencias de ADNc y de aminoácidos de la fusión (kih) de Fc ligando de 4-1BB (71-248) trimérico dividido dirigido a CEA monovalente (T84.66-LCHA) que contiene cruce de CH-CL sin residuos cargados (construcción 5.5).
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11.2.6 Preparación de unión a antígeno de fusión (kih) de Fc que contiene el trímero de ligando 4-1BB (71-248) dirigido a CEA bivalente (T84.66-LCHA) (construcción 5.6)
Se clonó un polipéptido que contenía dos ectodominios del ligando 4-1BB (71-248), separado por conectores (G4S)2 y fusionado con el extremo C de la cadena de ojal Fc de IgG1 humana, como se representa en la Figura 29C: ojal Fc de IgG1 humana, conector (G4S)2, ligando 4-1BB humano, conector (G4S)2, ligando 4-1BB humano. Un polipéptido que contenía un ectodominio del ligando 4-1BB (71-254) se fusionó con el extremo C de la cadena de botón Fc de IgG1 humana como se describe en la figura 29D: botón Fc de IgG1 humana, conector (G4S)2, ligando 4-1BB humano.
Se subclonó la región variable de secuencias de ADN de las cadenas pesada y ligera que codifican un aglutinante específico para CEA, clon T84.66- LCHA, sin cambio de pauta de lectura con la cadena pesada constante del ojal o con la cadena ligera constante de IgG1 humana. Se han introducido las mutaciones Pro329Gly, Leu234Ala y Leu235Ala en la región constante de las cadenas pesadas de botón y ojal para anular la unión a los receptores gamma Fc de acuerdo con el procedimiento descrito en el documento WO 2012/130831. La combinación de la cadena pesada del ligando dimérico del ojal anti-CEA huIgG1 que contiene las mutaciones Y349C/T366S/L368A/Y407V, la cadena pesada del ligando monomérico del botón anti-CEA huIgG1 que contiene las mutaciones S354C/T366W y las cadenas ligeras anti-CEA permitió la generación de un heterodímero, que incluía un ligando de 4-1BB trimérico ensamblado y dos Fab de unión a CEA (figura 40, construcción 5.6).
La tabla 87 muestra las secuencias de ADNc y de aminoácidos de la molécula de unión a antígeno de fusión (kih) de Fc ligando de 4-1BB (71-248) trimérico dividido dirigido a CEA(T84.66-LCHA) bivalente (construcción 5.6).
Tabla 87: Secuencias de ADNc y de aminoácidos de fusión (kih) de Fe ligando de 4-1BB (71-248) trimérico dividido dirigido a CEA (T84.66-LCHA) bivalente (construcción 5.6)
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11.2.7 Preparación de la molécula de unión a antígeno de fusión (kih) de Fc que contiene trímeros de ligando 4-1BB (71-254) dirigido a CEA (T84.66) monovalente con dominios CH1-CL cruzados con residuos cargados (construcción 5.7)
Se clonó un polipéptido que contenía dos ectodominios del ligando 4-1BB (71-254), separados por conectores (G4S)2 y fusionado con el dominio de IgG1-CL humano, como se representa en la figura 29A: ligando 4-1BB humano, conector (G4S)2, ligando 4-1BB humano, conector (G4S)2, CL humano. Se clonó un polipéptido que contenía un ectodominio del ligando 4-1BB (71-254) y se fusionó con el dominio IgG1- CH humano, como se representa en la figura 29B: ligando 4-1BB humano, conector (G4S)2, CH humano.
Para mejorar el emparejamiento correcto, se han introducido las siguientes mutaciones en el CH-CL cruzado. En el ligando dimérico 4-1BB fusionado con CL, E123R y Q124K humanos. En el ligando monomérico 4-1BB fusionado con CH1, K147E y K213E humanos.
Se subclonó la región variable de secuencias de ADN de la cadena pesada y ligera que codifican una proteína de unión específica para CEA, clon T84.66, sin cambio de pauta de lectura con la cadena pesada constante del ojal o la cadena ligera constante de IgG1 humana. Se han introducido las mutaciones Pro329Gly, Leu234Ala y Leu235Ala en la región constante de las cadenas pesadas de botón y ojal para anular la unión a los receptores gamma Fc de acuerdo con el procedimiento descrito en el documento w O 2012/130831.
La combinación de la cadena de botón de ligando dimérico-Fc que contiene las mutaciones S354C/T366W, la fusión CH1 monomérica, la cadena de ojal Fc anti-CD19 dirigida que contiene las mutaciones Y349C/T366S/L368A/Y407V y la cadena ligera anti-CD19 permite la generación de un heterodímero, que incluye un ligando 4-1 BB trimérico ensamblado y una Fab de unión a CEA. La construcción 5.7 corresponde a la construcción 5.1 como se muestra en la figura 40.
La tabla 88 muestra las secuencias de ADNc y de aminoácidos de la molécula de unión a antígeno de fusión (kih) de Fc ligando de 4-1BB (71-254) trimérico dividido dirigidido a CEA(T84.66) monovalente con CH-CL cruzado y residuos cargados (construcción 5.7).
Tabla 88: Secuencias de ADNc y de aminoácidos de la fusión (kih) de Fc ligando de 4-1BB (71-254) trimérico dividido dirigido a c Ea (T84.66) monovalente que contiene CH-CL cruzado con residuos cargados (construcción 5.7). * para residuos cargados
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11.2.8 Preparación de molécula de unión a antígeno de fusión (kih) de Fc que contiene trímero de ligando 4-1BB (71-254) dirigido a CEA (T84.66) bivalente (construcción 5.8)
Se clonó un polipéptido que contenía dos ectodominios del ligando 4-1BB (71-254), separado por conectores (G4S)2 y fusionado con el extremo C de la cadena de ojal Fc de IgG1 humana, como se representa en la figura 29C: ojal Fc de IgG1 humana, conector (G4S)2, ligando 4-1BB humano, conector (G4S)2, ligando 4-1BB humano. Un polipéptido que contenía un ectodominio del ligando 4-1BB (71-254) se fusionó con el extremo C de la cadena de botón Fc de IgG1 humana como se describe en la figura 29D: botón Fc de IgG1 humana, conector (G4S)2, ligando 4-1BB humano.
Se subclonó la región variable de secuencias de ADN de la cadena pesada y ligera que codifican un aglutinante específico para CEA, clon T84.66, sin cambio de pauta de lectura con la cadena pesada constante del ojal o la cadena ligera constante de IgG1 humana. Se han introducido las mutaciones Pro329Gly, Leu234Ala y Leu235Ala en la región constante de las cadenas pesadas de botón y ojal para anular la unión a los receptores gamma Fc de acuerdo con el procedimiento descrito en el documento W o 2012/130831. La combinación de la cadena del ligando dimérico del ojal anti-CEA huIgG1 que contiene las mutaciones Y349C/T366S/L368A/Y407V, la cadena del ligando monomérico del botón anti-CEA huIgGI que contiene las mutaciones S354C/T366W y la cadena ligera anti-CEA permitió la generación de un heterodímero, que incluía un ligando de 4-1BB trimérico ensamblado y dos Fab de unión a CEA. La construcción 5.8 corresponde a la construcción 5.3 como se muestra en la figura 40.
La tabla 89 muestra las secuencias de ADNc y de aminoácidos de la molécula de unión a antígeno de fusión (kih) de Fc ligando de 4-1BB (71-254) trimérico dividido dirigido a CEA(T84.66) bivalente (construcción 5.8).
Tabla 89: Secuencias de ADNc y de aminoácidos de fusión de PGLALA (kih) de Fc ligando de 4-1BB (71-254) trimérico dividido dirigido a CEA(T84.66) bivalente (construcción 5.8)
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11.3 Preparación de las moléculas de fusión Fc del ligando 4-1BB trimérico dividido no dirigido e IgG humana como moléculas de control
11.3. 1 Preparación de moléculas de unión a antígeno de fusión Fc que contienen un trímero de ligando 4-1BB humano no dirigido (moléculas de control)
Estas moléculas de control se prepararon como se describe anteriormente para la construcción 3.1 dirigida a CEA (denominado control B), 3.3 (denominado control C), 3.4 (denominado control D) y 3.5 (denominado control E) con la única diferencia de que el aglutinante anti-CD19 (VH-VL) se reemplazó por un control de línea germinal, denominado DP47, que no se une al antígeno (véase la figura 40). Las secuencias de ADNc y de aminoácidos del control B, la fusión (kih) de Fc ligando 4-1BB (71-254) trimérico dividido no dirigido a DP47 monovalente que contiene CH-CL cruzado con residuos cargados, se muestran en la tabla 68 anterior (véase el ejemplo 7.3.1). La tabla 69 muestra las secuencias de ADNc y de aminoácidos de la fusión (kih) de Fc ligando de 4-1BB (71-254) trimérico dividido no dirigido a DP47 bivalente, control C. La tabla 70 muestra las secuencias de ADNc y de aminoácidos de la fusión (kih) de Fc ligando 4-1BB (71-248) trimérico dividido no dirigido a DP47 monovalente que contiene cruce de CH-CL con residuos cargados, control D. La tabla 71 muestra las secuencias de ADNc y de aminoácidos de la fusión (kih) de Fcl ligando 4-1BB (71-248) trimérico dividido no dirigido a DP47 monovalente sin residuos cargados en el cruce de CH-CL, control E.
11.3.2 Anticuerpos como moléculas de control
Un control adicional usado en los ensayos, denominado control F, fue un DP47 no dirigido, control de la línea germinal, IgG1 humana, que contenía las mutaciones Pro329Gly, Leu234Ala y Leu235Ala, para anular la unión a los receptores Fc gamma. Las secuencias de ADNc y de aminoácidos del control F se pueden encontrar en la tabla 73 anterior.
11.4 Producción de moléculas de unión a antígeno de fusión Fc del ligando 4-1BB trimérico dividido dirigido a CEA y sus moléculas de control
Las secuencias codificantes de la molécula de unión a antígeno de fusión (kih) de Fc ligando de 4-1BB trimérico dividido dirigido y no dirigido se clonaron en un vector plásmido, que dirige la expresión del inserto a partir de un promotor MPSV y contiene una secuencia poliA sintética localizada en el extremo 3' del CDS. Además, el vector contiene una secuencia de EBV OriP para el mantenimiento episomal del plásmido.
Se produjo la fusión (kih) de Fc ligando de 4-1BB trimérico dividido cotransfectando células HEK293-EBNA con los vectores de expresión de mamífero usando polietilenimina. Se transfectaron las células con los correspondientes vectores de expresión. Para las variantes 1, 2, 4, 5 y su control B, D y E, en una proporción de 1:1:1:1 ("vector ligando dimérico-CL-cadena de botón": "vector fusión de ligando monomérico-CH1": "vector Fab anti-CEA-cadena de ojal": "vector cadena ligera anti-CEA"). Para la variante 3, 6 y su control C, a una proporción de 1:1:1 ("vector cadena de ligando dimérico de ojal Fc de huIgG1": "vector cadena de ligando monomérico de botón Fc de huIgG1": "vector cadena ligera anti-CEA"). Las IgG humanas, usadas como control en el ensayo, se produjeron como para la construcción biespecífica (para la transfección solo se usó un vector para la cadena ligera y un vector para la cadena pesada en una proporción de 1:1).
Para la producción en matraces de agitación de 500 mL, se sembraron 300 millones de células HEK293 EBNA 24 horas antes de la transfección. Para la transfección, se centrifugaron las células durante 10 minutos a 210 x g y se reemplazó el sobrenadante por 20 mL de medio CD CHO precalentado. Los vectores de expresión (200 pg de ADN total) se mezclaron en 20 mL de medio CD CHO. Después de la adición de 540 pL de PEI, la solución se agitó en vórtex durante 15 segundos y se incubó durante 10 minutos a temperatura ambiente. Después de esto, se mezclaron las células con la solución ADN/PEI, se transfirieron a un matraz de agitación de 500 mL y se incubó durante 3 horas a 37°C en una incubadora con una atmósfera de CO2 al 5 %. Después de la incubación, se añadieron 160 mL de medio Excell suplementado con L-glutamina 6mM, 5g/L de PEPSOY y ácido valproico 1,2 mM y se cultivaron las células durante 24 horas. Un día después de la transfección se añadió Feed al 12 % (aminoácidos y glucosa). Después de cultivarse durante 7 días, se recogió el sobrenadante mediante centrifugación durante 30-40 minutos al menos 400 x g. La solución se filtró en condiciones estériles (filtro de 0,22 |jm), se suplementó con acida sódica hasta una concentración final de 0,01 % (p/v) y se mantuvo en 4 °C.
La fusión (kih) de Fc ligando de 4-1 BB trimérico dividido, así como la IgG, se purificó a partir de sobrenadantes de cultivo celular mediante cromatografía de afinidad usando la proteína A, seguido de cromatografía de exclusión por tamaño. Para la cromatografía de afinidad, se cargó el sobrenadante en una columna MabSelect Sure (CV = 5-15 mL, resina de GE Healthcare) equilibrado con fosfato de sodio (20 mM), tampón de citrato de sodio (20 mM) (pH 7,5). La proteína no unida se eliminó lavando con al menos 6 volúmenes de columna del mismo tampón. La proteína unida se eluyó usando un gradiente lineal (20 CV) o una elución escalonada (8 CV) con citrato de sodio 20 mM, cloruro de sodio 100 mM, tampón de glicina 100 mM (pH 3,0). Para el gradiente lineal, se aplicó una elución escalonada adicional de 4 volúmenes de columna.
El pH de las fracciones recogidas se ajustó añadiendo 1/10 (v/v) de fosfato de sodio 0,5 M, pH 8,0. La proteína se concentró antes de cargarla en una columna HiLoad Superdex 200 (GE Healthcare) equilibrada con histidina 20 mM, cloruro de sodio 140 mM, solución Tween20 al 0,01 % (v/v) de pH 6,0.
Se determinó la concentración de proteína midiendo la densidad óptica (DO) a 280 nm, usando un coeficiente de extinción molar calculado en base a la secuencia de aminoácidos. La pureza y el peso molecular de la molécula de unión a antígeno de fusión (kih) de Fc ligando de 4-1BB trimérico dirigido se analizaron mediante SDS-PAGE en presencia y ausencia de un agente reductor (1,4-ditiotreitol 5 mM) y tinción con Coomassie SimpleBlue™ SafeStain (Invitrogen USA) o CE-SDS usando Caliper LabChip GXII (Perkin Elmer). Se analizó el contenido de agregado de las muestras usando una columna analítica de exclusión por tamaño TSKgel G3000 SW XL (Tosoh) en K2HPO4 25 mM, NaCl 125 mM, monoclorhidrato de L-arginina 200 mM, NaN3 al 0,02 % (p/v), tampón de migración a pH 6,7 a 25 °C.
La tabla 90 resume el rendimiento y el contenido final de monómero de las moléculas de unión a antígeno de fusión (kih) de Fc ligando de 4-1BB trimérico dividido dirigido a CEA.
Tabla 90: Análisis bioquímico de la fusión (kih) de Fc ligando de 4-1BB trimérico dividido dirigido a CEA.
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La tabla 91 resume el rendimiento y el contenido final de monómero de las moléculas de fusión (kih) de Fc ligando de 4-1BB trimérico dividido no dirigido a DP47, tanto monovalente (control B, D y E) como bivalente (control C), y de PGLALA de IgG1 humana línea germinal DP47 (control F).
Tabla 91: Análisis bioquímico de la fusión (kih) de Fc ligando de 4-1BB trimérico dividido no dirigido a DP47
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Ejemplo 12
Caracterización funcional de las moléculas de unión a antígeno de fusión Fc que contienen un trímero de ligando 4-1BB dirigido a CEA
12.1 Resonancia de plasmón superficial (unión simultánea)
Producción de hu NA3B3 A2 como antígeno para construcciones de 4-1BBL dividido trimérico dirigido a CEA
El antígeno usado para evaluar la unión de SPR a CEA era una molécula híbrida compuesta por dominios A3 y B3 de CEACAM5 humano (CEA) y dominios N y A2 de CEACAM1 humano (BGP1) de forma similar a lo que se ha descrito para NABA (Durbin H. et al, Proc Natl Acad Sci USA. mayo de 1994 10:91(10):4313-7). El antígeno se denomina aquí NA3B3A2 y se puede encontrar una descripción esquemática en la figura 41A.
La tabla 92 muestra las secuencias de nucleótidos y aminoácidos de hu NA3B3A2-avi-His.
Figure imgf000242_0001
La producción de proteínas se realizó como se describe anteriormente para la proteína de fusión Fc (ejemplo 7.1.1). Las proteínas secretadas se purificaron a partir de sobrenadantes de cultivos celulares mediante cromatografía quelante, seguida de cromatografía de exclusión por tamaño. La primera etapa cromatográfica se realizó en un cartucho NiNTA Superflow (5 ml, Qiagen) equilibrado en fosfato de sodio 20 mM, cloruro de sodio 500 nM, pH 7,4. La elución se realizó aplicando un gradiente sobre un volumen de 12 columnas desde el 5% al 45% de tampón de elución (fosfato de sodio 20 mM, cloruro de sodio 500 nM, imidazol 500 mM, pH 7,4).
La proteína se concentró y filtró antes de cargarla en una columna HiLoad Superdex 75 (GE Healthcare) equilibrada con histidina 20 mM, NaCl 140 mM, Tween-20 al 0,01 % pH 6,0. La tabla 93 resume el rendimiento y el contenido de monómero final de NA3B3A2-avi-His humano.
Tabla 93: Análisis bioquímico de NA3B3A2-avi-His humano
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La capacidad de unir simultáneamente (kih) de Fc 4-1BB humano y NA3B3A2 humano se evaluó mediante resonancia de plasmón superficial (SPR). Todos los experimentos de SPR se realizaron en un Biacore T200 a 25 °C con HBS-EP como tampón de migración (HEPES 0,01 M, pH 7,4, NaCl 0,15 M, EDTA 3 mM, tensioactivo P20 al 0,005 %, Biacore, Friburgo/Alemania). Se acopló directamente (kih) de Fc 4-1BB humano biotinilado a una cubeta de lectura de un chip sensor de estreptavidina (SA). Se usaron niveles de inmovilización de hasta 250 unidades de resonancia (UR).
Las construcciones de 4-1BBL dividido trimérico dirigido a CEA (construcciones 5.4, 5.6, 5.7 y 5.8) se pasaron a un intervalo de concentración de 200 nM con un caudal de 30 pL/minuto a través de las cubetas de lectura durante 90 segundos y la disociación se estableció en cero segundos. Se inyectó NA3B3A2 humano como segundo analito con un caudal de 30 pL/minuto a través de las cubetas de lectura durante 90 segundos a una concentración de 500 nM (figura 41B). Se supervisó la disociación durante 120 segundos. Se corrigieron las diferencias en el índice de refracción aparente restando la respuesta obtenida en una cubeta de lectura de referencia.
Como se puede observar en los gráficos de la figura 42, todas las construcciones biespecíficas se podrían unir simultáneamente a 4-1BB humano y NA3B3A2 humano.
12.2. Unión en PMBC humanas activadas de las moléculas de unión a antígeno de fusión (kih) de Fc que contienen trímeros del ligando 4-1BB dirigido a CEA
Para determinar la unión de moléculas de unión a antígeno de fusión Fc que contienen trímeros de 4-1BBL a PBMC humanas, se usaron diferentes concentraciones tituladas de las moléculas de unión a antígeno de fusión Fc que contienen trímeros de 4-1BBL dirigido a CEA en el ensayo como se describe en el ejemplo 5.2.
La figuras 43 muestra la unión de las construcciones 5.4, 5.6, 5.7 y 5.8 como las preparadas en el ejemplo 11 en linfocitos T CD4+ y linfocitos T CD8+ que expresan 4-1 BB activados, respectivamente. Las puertas se establecieron en linfocitos T CD45+ CD3+ c D4+ o CD45+ CD3+ CD8+ vivos y la MFI del fragmento F(ab')2 caprino específico del fragmento F c / de IgG de anti-IgG humana de AffiniPure conjugado con PE se transfirieron frente a la concentración titulada de variantes de fusión Fc del ligando 4-1BB trimérico dividido dirigido.
La tabla 94 muestra los valores de EC50 como se mide para las construcciones 5.4, 5.6, 5.7 y 5.8 y las moléculas de control.
Tabla 94: Unión a linfocitos T CD4+ activados que expresan 4-1BB y linfocitos T CD8+
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12.2 Unión a células tumorales que expresan CEA
Para ensayos de unión en células tumorales que expresan CEA, se usaron las siguientes líneas celulares de linfoma que expresan CEA humano: líneas celulares tumorales que expresan CEA, línea celular de cáncer gástrico humano MKN-45 (ATCC TCP-1008) y línea celular de adenocarcinoma colorrectal humano LS180 (ATCC CL-187). Los ensayos se realizaron como se describe para las líneas de células tumorales MV-3 y WM-266-4 que expresan FAP en el ejemplo 5.3.
Se establecieron puertas en células tumorales vivas y se transfirieron MFI de fragmento F(ab')2 caprino específico de fragmento Fcy de IgG anti-IgG humana de AffiniPure conjugado con PE frente a la concentración titulada de construcciones de fusión Fc de ligando 4-1BB trimérico dividido dirigido.
La figura 44 muestra la unión de las construcciones 5.7 preparadas en el ejemplo 11.2.7 a la línea celular gástrica humana MKN-45 que expresa CEA humano (izquierda) y la línea celular de adenocarcinoma colorrectal humano LSI80 (derecha). La tabla 95 muestra los valores EC50 como se mide para la línea celular gástrica humana MKN-45 que expresa CEA humano.
Tabla 95: Unión a células tumorales que expresan CEA
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Ejemplo 13
Actividad biológica de las moléculas de unión a antígeno de fusión Fc que contienen trímeros del ligando 4-1BB dirigido a CEA
13.1. Activación de NF-kB en células HeLa que expresan 4-1BB humano
Se generaron células HeLa que expresan 4-1BB humano y NF-KB-luciferasa como se describe en el ejemplo 6.1.
Activación de NF-kB en élulas Hela que expresan 4 -1BB humano cocultivadas con células tumorales que expresan CEA humano
Se cosecharon células humanas 4-1BB HeLa con NF-kB-luciferasa y se resuspendieron en un medio DMEM complementado con 10 % (v/v) de FBS y 1 % (v/v) GlutaMAX-I a una concentración de 0,2 x 106 células/ml. 100 pl ( 2 x 104 células) de esta suspensión celular se transfirieron a cada pocillo de una placa de cultivo tisular estéril blanca de 96 pocillos de fondo plano con tapa (greiner bio-one, n.° de cat. 655083) y la placa se incubaron a 37 °C y CO2 al 5 % durante la noche. Al día siguiente, 50 pL de medio que contiene concentraciones tituladas de moléculas de unión a antígeno de fusión Fc que contienen un trímero de ligando 4-1BB dirigido a CEA (trímero de 4-1BBL dividido de CEA) o moléculas de unión a antígeno de fusión Fc que contienen un trímero de ligando 4-1BB no dirigido a DP47 (trímero 4-1BBL dividido de DP47). De las líneas celulares tumorales que expresan CEA, la línea celular de cáncer gástrico humano MKN-45 (ATCC TCP-1008) se resuspendió en medio DMEM suministrado con FBS al 10 % (v/v) y GlutaMAX-I al 1 % (v/v) a una concentración de 2 x 106 células/ml.
La suspensión celular de linfoma de linfocitos B que expresan CEA (50 pl, proporción final 1:5) o solo medio se añadieron a cada pocillo y las placas se incubaron durante 6 horas a 37 °C y CO2 al 5 %. Se lavaron las células dos veces con 200 pL/pocillo de DPBS. 40 pl de tampón de lisis indicador de reciente preparación (Promega, n.° de cat.: E3971) se añadieron a cada pocillo y las placas se almacenaron durante la noche a -20 °C. Al día siguiente, las placas de células congeladas y el tampón de detección (Luciferase 1000 Assay System, Promega, n.° de cat. E4550) se descongelaron a temperatura ambiente. Se agregaron 100 pL de tampón de detección a cada pocillo y se midió la actividad de luciferasa lo más rápido posible usando un lector de microplacas SpectraMax M5/M5e y un software SoftMax Pro (Molecular Devices) contando la emisión de luz en URL (unidades de luz liberada por 0,5s/pocillo) o el lector de placas de contador de marcador múltiple Victor3 1420 (Perkin Elmer) y el software de gestión Perkin Elmer 2030 que cuenta la emisión de luz como recuentos por segundo (CPS) y se transfiere frente a la concentración de las construcciones sometidas a prueba.
Moléculas de unión a antígeno de fusión Fc que contienen un trímero de ligando 4-1 BB dirigido a CEA, construcciones 5.7 y 5.8, desencadenaron la activación de la vía de señalización NF-kB en la ín ea celular indicadora en presencia de células MKN-45 de la línea celular de cáncer gástrico humano. Por el contrario, las moléculas de control no dirigidas no lograron desencadenar tal efecto en ninguna de las concentraciones probadas (Figura 45). La tabla 96 muestra los valores de CE50 correspondientes.
Tabla 96: Unión a células tumorales que expresan CEA
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Ejemplo 14
14.1 Preparación de moléculas de unión a antígeno de fusión Fc que contienen un trímero de ligando OX40 dirigido a FAP
La secuencia de ADN que codifica parte del ectodominio (aminoácidos 51-183) del ligando humano OX40 se sintetizó de acuerdo con la secuencia P23510 de la base de datos Uniprot. Para disminuir la heterogeneidad del ligando humano Ox40 debido a la glicosilación, los residuos de asparagina en la posición 90 y 114 se mutaron a ácido aspártico mediante mutagénesis dirigida al sitio (de acuerdo con Compaan D.M., Hymowitz S.G., Structure (2006) 14(8), 1321-30).
Se clonó un polipéptido que contenía dos ectodominios del ligando OX40, separados por conectores (G4S)2 y fusionado al dominio de IgG1-CL humano, como se representa en la figura 46A: ligando humano OX40, conector (G4S)2, ligando humano OX40, conector (G4S)2, CL humano.
Se clonó un polipéptido que contenía un ectodominio del ligando OX40 y se fusionó con el dominio IgG1-CH humano, como se describe en la figura 46B: ligando humano OX40, conector (G4S)2, CH humano.
Para mejorar el emparejamiento correcto, se han introducido las siguientes mutaciones en el CH-CL cruzado. En el ligando dimérico 4-1BB fusionado con CL, E123R y Q124K humanos. En el ligando monomérico 4-1BB fusionado con CH1, K147E y K213E humanos.
La generación y preparación de los aglutinantes de FAP se describe en el documento WO 2012/020006 A2, que se incorpora en el presente documento como referencia.
Se subclonó la región variable de secuencias de ADN de la cadena pesada y ligera que codifican una proteína de unión específica para FAP, clon 28H11, sin cambio de pauta de lectura con la cadena pesada constante del ojal o la cadena ligera constante de IgG1 humana. Se han introducido las mutaciones Pro329Gly, Leu234Ala y Leu235Ala en la región constante de las cadenas pesadas de botón y ojal para anular la unión a los receptores gamma Fc de acuerdo con el procedimiento descrito en el documento WO 2012/130831.
La combinación de la cadena de botón de ligando dimérico-Fc que contiene las mutaciones S354C/T366W, la fusión CH1 monomérica, la cadena de ojal anti-FAP-Fc dirigida que contiene las mutaciones Y349C/T366S/L368A/Y407V y la cadena ligera anti-FAP permite la generación de un heterodímero, que incluye un ligando OX40 trimérico ensamblado y una Fab de unión a FAP (figura 46C, construcción 6.1).
La tabla 97 muestra las secuencias de ADNc y de aminoácidos de la molécula de unión a antígeno de fusión (kih) de Fc ligando de OX40 (51-183) trimérico dividido dirigido a CEA (T84.66-LCHA) monovalente con CH-CL cruzado y residuos cargados (construcción 6.1).
dirigido a FAP(28H1) monovalente que contiene el cruce de CH-CL con residuos cargados (construcción 6.1). * para residuos cargados
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14.2 Preparación de IgG1 humana no dirigida como control F
Una molécula de control usada en los ensayos, denominada control F (figura 46D), fue un DP47 no dirigido, control de línea germinal, IgG1 humana, que contiene las mutaciones Pro329Gly, Leu234Ala y Leu235Ala, para anular la unión a receptores gamma Fc de acuerdo con el procedimiento descrito en la publicación de solicitud de patente internacional n.° WO 2012/130831). Su preparación se describe en el ejemplo 2.3. La tabla 29 muestra las secuencias de ADNc y de aminoácidos de las secuencias de ADNc y de aminoácidos de PGLALA huIgG1 de DP47 no dirigido (control F).
14.3 Producción de moléculas de unión a antígeno de fusión Fc del ligando OX40 trimérico dividido dirigido a FAP y sus moléculas de control
Las secuencias codificantes de fusión (kih) de Fc ligando de OX40 trimérico dividido dirigido y no dirigido se clonaron en un vector plásmido, que dirige la expresión del inserto a partir de un promotor MPSV y contiene una secuencia poliA sintética localizada en el extremo 3' del CDS. Además, el vector contiene una secuencia de EBV OriP para el mantenimiento episomal del plásmido.
Se produjo la fusión (kih) de Fc ligando de Ox40 trimérico dividido cotransfectando células HEK293-EBNA con los vectores de expresión de mamífero usando polietilenimina. Se transfectaron las células con los correspondientes vectores de expresión. Para las variantes 1, 2, 4, 5 y su control B, D y E, en una proporción de 1:1:1:1 ("vector ligando dimérico-CL-cadena de botón": "vector fusión de ligando monomérico-CH1": "vector Fab anti-FAP-cadena de ojal": "vector cadena ligera anti-FAP"). Para la variante 3, 6 y su control C, a una proporción de 1:1:1 ("vector cadena de ligando dimérico de ojal Fc de huIgG1": "vector cadena de ligando monomérico de botón Fc de huIgG1": "vector cadena ligera anti-FAP"). Las IgG humanas, usadas como control z en el ensayo, se produjeron como para la construcción biespecífica (para la transfección solo se usó un vector para la cadena ligera y un vector para la cadena pesada en una proporción de 1:1).
Para la producción en matraces de agitación de 500 mL, se sembraron 300 millones de células HEK293 EBNA 24 horas antes de la transfección. Para la transfección, se centrifugaron las células durante 10 minutos a 210 x g y se reemplazó el sobrenadante por 20 mL de medio CD CHO precalentado. Los vectores de expresión (200 pg de ADN total) se mezclaron en 20 mL de medio CD CHO. Después de la adición de 540 pL de PEI, la solución se agitó en vórtex durante 15 segundos y se incubó durante 10 minutos a temperatura ambiente. Posteriormente, se mezclaron las células con la solución ADN/PEI, se transfirieron a un matraz de agitación de 500 mL y se incubó durante 3 horas a 37°C en una incubadora con una atmósfera de CO2 al 5 %. Después de la incubación, se añadieron 160 mL de medio Excell complementado con L-glutamina 6 mM, 5 g/L de PEPSOY y ácido valproico 1,2 mM y se cultivaron las células durante 24 horas. Un día después de la transfección se añadió Feed al 12 % (aminoácidos y glucosa). Después de cultivarse durante 7 días, se recogió el sobrenadante mediante centrifugación durante 30-40 minutos al menos 400 x g. La solución se filtró en condiciones estériles (filtro de 0,22 |jm), se suplementó con acida sódica hasta una concentración final de 0,01 % (p/v) y se mantuvo en 4°C.
La molécula de unión a antígeno de fusión (kih) de Fc ligando de OX40 trimérico dividido, así como la IgG, se purificó a partir de sobrenadantes de cultivo celular mediante cromatografía de afinidad usando la proteína A, seguido de cromatografía de exclusión por tamaño. Para la cromatografía de afinidad, se cargó el sobrenadante en una columna MabSelect Sure (CV = 5-15 mL, resina de GE Healthcare) equilibrado con fosfato de sodio (20 mM), tampón de citrato de sodio (20 mM) (pH 7,5). La proteína no unida se eliminó lavando con al menos 6 volúmenes de columna del mismo tampón. La proteína unida se eluyó usando un gradiente lineal (20 CV) o una elución escalonada (8 CV) con citrato de sodio 20 mM, cloruro de sodio 100 mM, tampón de glicina 100 mM (pH 3,0). Para el gradiente lineal, se aplicó una elución escalonada adicional de 4 volúmenes de columna.
El pH de las fracciones recogidas se ajustó añadiendo 1/10 (v/v) de fosfato de sodio 0,5 M, pH 8,0. La proteína se concentró antes de cargarla en una columna HiLoad Superdex 200 (GE Healthcare) equilibrada con histidina 20 mM, cloruro de sodio 140 mM, solución Tween20 al 0,01 % (v/v) de pH 6,0.
Se determinó la concentración de proteína midiendo la densidad óptica (DO) a 280 nm, usando un coeficiente de extinción molar calculado en base a la secuencia de aminoácidos. La pureza y el peso molecular de la fusión (kih) de Fc ligando de 4-1BB trimérico dirigido se analizaron mediante SDS-PAGE en presencia y ausencia de un agente reductor (1,4-ditiotreitol 5 mM) y tinción con Coomassie SimpleBlue™ SafeStain (Invitrogen USA) o CE-SDS usando Caliper LabChip GXII (Perkin Elmer). Se analizó el contenido de agregado de las muestras usando una columna analítica de exclusión por tamaño TSKgel G3000 SW XL (Tosoh) en K2HPO4 25 mM, NaCl 125 mM, monoclorhidrato de L-arginina 200 mM, NaN3 al 0,02 % (p/v), tampón de migración a pH 6,7 a 25 °C.
La tabla 98 resume el rendimiento y el contenido final de monómero de la molécula de unión a antígeno de fusión (kih) de Fc ligando de Ox40 trimérico dividido dirigido a FAP, y de la PGLALA de IgG1 humana línea germinal DP47 (control F).
Tabla 98: Análisis bioquímico de la fusión kih de Fc li ando de 4-1BB trimérico dividido diri ido a CEA.
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Ejemplo 15
Caracterización funcional de la molécula de unión a antígeno de fusión Fc que contiene un trímero de ligando OX40 dirigido
15.1 Unión a células tumorales que expresan FAP humana
La unión a la FAP de la superficie celular se probó usando células WM-266-4 (ATCC CRL-1676). Se añadieron 0,5 x 105 de células WM-266-4 a cada pocillo de placas de 96 pocillos de fondo redondo (greiner bio-one, cellstar, n.° de cat. 650185). Las células se tiñeron durante 120 minutos a 4 °C en la oscuridad en 50 pL/pocillo de tampón FACS frío a 4 °C (DPBS (Gibco by Life Technologies, n.° de cat. 14190326) con BSA (0,1 % p/v, Sigma -Aldrich, n.° de cat. A9418) que contiene la construcción de anticuerpo anti-Ox40 titulado. Después de lavar tres veces con exceso de tampón FACS, las células se tiñeron durante 45 minutos a 4 °C en la oscuridad en 25 pL/pocillo de tampón FACS frío a 4 °C que contenía fragmentos F(ab')2 de IgG caprino específico de fragmento Fc de IgG antihumana de AffniPure conjugado con isotiocianato de fluoresceína (FITC) (Jackson ImmunoResearch, n.° de cat. 109096098).
Las placas se resuspendieron finalmente en 90 pL/pocillo de tampón FACS que contenía 0,2 pg/mL de DAPI (Santa Cruz Biotec, n.° de cat. Sc-3598) y se adquirieron el mismo día usando LSR-Fortessa de 5 láseres (BD Bioscience con software DIVA).
Como se muestra en la figura 47A, la molécula de unión a antígeno (FAP-OX40L) de fusión (kih) de Fc ligando de trimérico Ox40 dividido dirigido a FAP(28H1) monovalente, aunque no el control negativo F, se unió eficazmente a las células diana que expresan FAP humana. El valor de EC50 de unión a WM-266-4 positiva para FAP fue de [6,9 nM].
15.2 Unión a células tumorales negativas para OX40 y FAP
La falta de unión a células tumorales humanas negativas para FAP negativas para OX40 se probó usando glóbulos rojos A549 NucLight™ (Essenbioscience, n.° de cat. 4491) que expresaban la proteína fluorescente roja NucLight restringida al núcleo para permitir la separación de células WM266-4 positivas para FAP humanas no marcadas. Se transdujeron las A549 originales (ATCC CCL-185) con el lentivirus rojo NucLight de Essen CellPlayer (Essenbioscience, n.° de cat. 4476; EFa, puromicina) a una MOI de 3 (TU/élula) en presencia de 8 pg/ml de polibreno siguiendo el protocolo estándar de Essen.
Se añadió una mezcla de 5 x 104 células WM266-4 no marcadas y glóbulos rojos A549 NucLight™ no marcados en tampón FACS a cada pocillo de una placa de 96 pocillos de células en suspensión de fondo redondo y se realizó el ensayo de unión como se describe en la sección 15.1.
Como se muestra en la figura 47B, FAP-OX40L no se unió a células tumorales humanas negativas para FAP negativas para OX40.
15.3 Unión a células que expresan OX40 humana: leucocitos mononucleares de sangre periférica humana (PBMC) indiferenciados y activados
Las capas leucocitarias se obtuvieron del centro de donación de sangre de Zúrich. Para aislar células mononucleares de sangre periférica (PBMC) frescas, la capa leucocitaria se diluyó con el mismo volumen de DPBS (Gibco de Life Technologies, n.° de cat. 14190 326). Se suministraron tubos de centrífuga de polipropileno de 50 mL (TPP, n.° de cat. 91050) con 15 mL de Histopaque 1077 (SIGMA Life Science, n.° de cat. 10771, polisucrosa y diatrizoato de sodio, ajustados a una densidad de 1,077 g/mL) y la solución de capa leucocitaria diluida se estratificó sobre el Histopaque 1077. Los tubos se centrifugaron durante 30 minutos a 400 x g, temperatura ambiente y con baja aceleración y sin pausa. Posteriormente, las PBMC se recolectaron de la interfase, se lavaron tres veces con DPBS y se resuspendieron en medio de linfocitos T que consistía en medio RPMI 1640 (Gibco de Life Technology, n.° de cat. 42401-042) suministrado con suero bovino fetal al 10 % (FBS, Gibco de Life Technology, n.° de cat. 16000-044, lote 941273, irradiado con rayos gamma, sin micoplasma e inactivado por calor a 56 °C durante 35 minutos), GlutaMAX I al 1 % (v/v) (GIBCO de Life Technologies, n.° de cat. 35050038), piruvato de sodio 1 mM (SIGMA, n.° de cat. S8636), 1 % (v/v) de aminoácidos no esenciales MEM (SIGMA, n.° de cat. M7145) y p- mercaptoetanol 50 pM (SIGMA, M3148).
Las PBMC se usaron directamente después del aislamiento (unión a PBMC humanas en reposo) o se estimularon para recibir una fuerte expresión de Ox40 humana en la superficie celular de los linfocitos T (unión a PBMC humanas activadas). Por lo tanto, las PBMC indiferenciadas se cultivaron durante cuatro días en un medio de linfocitos T suministrado con 200 U/mL de proleucina (Novartis) y 2 ug/mL de PHA-L (Sigma-Aldrich, L2769-10) en una placa de cultivo tisular de 6 pocillos y, a continuación, durante la noche, en placas de cultivo tisular de 6 pocillos recubiertas previamente [4 ug/mL] de anti-CD3 humano (clon OKT3, eBioscience, n.° de cat. 16-0037-85) y [2 ug/mL] de anti-CD28 humano (clon CD28.2, eBioscience, n.° de cat. 16-0289-85) en un medio de linfocitos T suministrado con 200 U/mL de proleucina a 37 °C y CO2 al 5 %.
Para la detección de Ox40 se mezclaron PBMC humanas indiferenciadas y PBMC humanas activadas. Para permitir la distinción de las PBMC humanas indiferenciadas de las activadas, se marcaron células nativas antes del ensayo de unión usando el colorante de proliferación celular eFluor670 (eBioscience, n.° de cat. 65-0840-85).
Para el marcado, las células se recolectaron, se lavaron con DPBS precalentado (37 °C) y se ajustaron a una densidad celular de 1 x 107 células/mL en DPBS. Se añadió colorante de proliferación celular eFluor670 (eBioscience, n.° de cat. 65-0840-85) a la suspensión de PBMC humanas indiferenciadas a una concentración final de 2,5 mM y una densidad celular final de 0,5 x 107 células/mL en DPBS. A continuación, las células se incubaron durante 10 minutos a temperatura ambiente en la oscuridad. Para detener la reacción de marcado, se añadieron 4 mL de FBS inactivado por calor y las células se lavaron tres veces con medio de linfocitos T. Una mezcla de dos a uno de 1 x 105 PBMC humana marcada con eFluor670 en reposo y 0,5 x 105 de PBMC humana activada no marcada se añadió a continuación a cada pocillo de una placa de 96 pocillos de fondo redondo para células en suspensión (greiner bio-one, cellstar, n.° de cat. 650185).
Las células se tiñeron durante 120 minutos a 4 °C en la oscuridad en 50 pL/pocillo de tampón FACS frío a 4 °C que contenía construcciones de anticuerpos anti-Ox40 titulados. Después de lavar tres veces con exceso de tampón FACS, las células se tiñeron durante 45 minutos a 4 °C en la oscuridad en tampón FACS frío de 25 pL/pocillo a 4 °C que contenía una mezcla de anti-CD4 humano marcado con fluorescencia (clon RPA-T4, IgGl k de ratón, BioLegend, n.° de cat. 300532), anti-CD8 humano (clon RPa-T8, IgG1k de ratón, BioLegend, n.° de cat. 3010441) y fragmento F(ab')2 de IgG caprino específico de fragmento Fy: de anti -IgG humana de AffniPure conjugado con isotiocianato de fluoresceína (FITC) (Jackson ImmunoResearch, n.° de cat. 109096098).
Las placas se resuspendieron finalmente en 90 pL/pocillo de tamp FACS que contenía 0,2j g/mL de DAPI (Santa Cruz Biotec, n.° de cat. Sc-3598) y se adquirieron el mismo día usando LSR-Fortessa de 5 láseres (BD Bioscience con software DIVA).
Como se muestra en las figuras 48A y 48 B, FAP-OX40L no se unió a los linfocitos T CD4+ o a los linfocitos T CD8+ humanos en reposo, que son negativos para OX40. Por el contrario, FAP-OX40L se unió a los linfocitos T CD8+ o CD4+ activados, que sí expresan OX40. La unión a los linfocitos T CD4+ fue mucho más fuerte que a los linfocitos T CD8+. Los linfocitos T CD8+ humanos activados expresan solo una fracción de los niveles de OX40 detectados en los linfocitos T CD4+ activados. Los niveles de expresión de OX40 dependen de la cinética y la fuerza de estimulación y las condiciones se optimizaron aquí para la expresión de OX40 en linfocitos T CD4+ pero no para linfocitos T CD8+. Por tanto, solo se indujo una pequeña expresión de OX40 en los linfocitos T CD8. El valor de EC 50 de la unión a linfocitos T CD4+ o CD8+ positivos para OX40 fue de [0,15 nM].
15.4 Activación de NFkB en células HeLa que expresan OX40 humano y el gen indicador NFKB-luciferasa
La unión agonista de Ox40 a su ligando induce la señalización descendente mediante la activación del factor nuclear kappa B (NFkB) (A. D. Weinberg et al., J. Leukoc. Biol. 2004, 75(6), 962-972). Se generó la línea celular indicadora recombinante HeLa_hOx40_NFKB_Lucl para expresar Ox40 humano en su superficie. Adicionalmente, alberga un plásmido indicador que contiene el gen de la luciferasa bajo el control de un segmento potenciador sensible a NFkB. La activaci ón de Ox40 induce la activación dependiente de la dosis de NF kB, que se transloca en el núcleo, donde se une al potenciador sensible a NFcB del plásmido indicador para aumentar la expresión de la proteína luciferasa. La luciferasa cataliza la oxidación de la luciferina dando como resultado oxiluciferina que emite luz. Esto se puede cuantificar con un luminómetro. Por tanto, se analizó la capacidad de las diversas moléculas anti-Ox40 para inducir la activación de NRB en células indicadoras HeLa_hOx40_NFkB_Lucl como medida de bioactividad.
Se recolectaron células adherentes HeLa_hOx40_NFkB_Lucl usando tampón de disociación celular (Invitrogen, n.° de cat. 13151-014) durante 10 minutos a 37 °C. Las células se lavaron una vez con DPBS y se ajustaron a una densidad celular de 1,33 x 105 en medio de ensayo que comprende MEM (Invitrogen, n.° de cat. 22561-021), FBS inactivado por calor al 10 % (v/v), piruvato de sodio 1 mM y 1 % (v/v) de aminoácidos no esenciales. Las células fueron sembradas en una densidad de 0,2 x 105 células por pocillo en una placa de cultivo tisular de fondo plano de 96 pocillos blanca estéril con tapa (Greiner Bio-One, n.° de cat. 655083) y se mantuvieron durante la noche a 37 °C y CO2 al 5 % en una incubadora (Hera Cell 150).
Al día siguiente, se estimularon HeLa_hOx40_NFkB_Lucl durante 5 horas mediante la adición de medio de ensayo que contenía FAP-Ox40L titulado o control negativo F. Para probar el efecto de la hiperreticulación en los anticuerpos anti-Ox40, se añadieron 25pL/pocillo de medio que conte nía el fragmento F(ab')2 de IgG caprino específico de Fcy de anti-IgG humana de anticuerpo secundario (Jackson ImmunoResearch, 109-006-098) en una proporción de 1:2 (2 veces más anticuerpo secundario que el anticuerpo primario). Después de la incubación, se aspiró el sobrenadante y las placas se lavaron dos veces con DPBS. La cuantificación de la emisión de luz se realizó usando el sistema de ensayo de luciferasa 100 y el tampón de lisis indicador (ambos de Promega, n.° de cat. E4550 y n.° de cat. E3971) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. En resumen, las células se lisaron durante 10 minutos a -20 °C mediante la adición de 30 uL por pocillo de tampón de lisis 1x. Las células se descongelaron durante 20 minutos a 37 °C antes de suministrar 90 uL por pocillo del reactivo de ensayo de luciferasa. La emisión de luz se cuantificó inmediatamente con un lector de microplacas SpectraMax M5/M5e (Molecular Devices, EE. UU.), usando un tiempo de integración de 500 ms, sin ningún filtro para captar todas las longitudes de onda. Las unidades de luz relativa emitidas (URL) se corrigieron mediante luminiscencia basal de células HeLa_hOx40_NFkB_Lucl y se transfirieron frente a la concentración de anticuerpo primario logarítmico usando Prism4 (software GraphPad, EE. UU.). Las curvas se ajustaron usando la respuesta a la dosis sigmoidea incorporada.
Como se muestra en la figura 49, ya se indujo una activación de NFkB dependiente de la dosis limitada mediante la adición de FAP-Ox40L (lado izquierdo) a la línea celular indicadora. La hiperreticulación de FAP-Ox40L por anticuerpos secundarios específicos de anti-IgG humana aumentó la inducción de la activación de luciferasa mediada por NFkB de una manera dependiente de la concentración (lado derecho).
En consecuencia, se sometió a prueba la capacidad de activación de NFkB de FAP-Ox40L con hiperreticulación de las construcciones por líneas de células tumorales FAP+.
La línea celular tumoral sometida a prueba fue el clon 39 de NIH/3T3-huFAP. El clon 39 de NIH/3T3-huFAP se generó mediante la transfección de la línea celular NIH/3T3 de fibroblastos embrionarios de ratón (ATCC CRL-1658) con el vector de expresión pETR4921 para expresar huFAP en una selección de puromicina de 1,5 |jg/mL. La expresión superficial de FAP se cuantificó usando el Quifikit (Dako, n.° de cat. K0078) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. El anticuerpo primario usado para detectar la expresión de FAP en la superficie celular fue el clon F11-24 de reacción cruzada humano/ratón (IgG1 de ratón, Calbiochem, n.° de cat. OP188). La expresión superficial en el clon 39 de NIH/3T3-huFAP fue de aproximadamente 90000 huFAP por célula.
Como se describe anteriormente en el presente documento, las células HeLa_hOx40_NFB_Lucl adherentes se cultivaron durante la noche a una densidad celular de 0,2 x 105 células por pocillo y se estimularon durante 5 horas con medio de ensayo que contenía FAP-OX40L titulada. Para someter a prueba el efecto de la hiperreticulación mediante la unión de FAP de la superficie celular, se cocultivaron 25 pL/pocillo de medio que conte'a células tumorales del clon 39 de FAP+NIH/3T3-huFAP en una proporción de 3 a 1 (tres veces más células tumorales FAP+ que células indicadoras por pocillo). El NF kB activado se cuantific ó al medir a emisión de luz usando el sistema de ensayo de luciferasa 100 y el tampón de lisis indicador (ambos de Promega, n.° de cat. E4550 y n.° de cat. E3971.
Como se muestra en la figura 50A, la presencia de células tumorales que expresan FAP aumentó fuertemente la inducción de la activación de luciferasa mediada por NF kB cuando se añadió FAP-Ox40L. El área bajo la curva de las respectivas curvas de respuesta a la dosis transferida se cuantificó como un marcador de la capacidad agonista de cada construcción. Como se muestra en la figura 50A, la presencia de superficie celular presente en FAP aseguró una mayor reticulación y por tanto un mejor efecto agonista de FAP-Ox40L que la adición de un anticuerpo secundario específico de Fc.
15.5 La coestimulación mediada por OX40 de TCR subóptima desencadenó PBMC humanas en reposo e hiperreticulación por FAP de la superficie celular
En el ejemplo 15.4 se demostró que la adición de células tumorales FAP+ puede aumentar fuertemente la actividad de NFkB inducida por OX40L dirigido a FAP en líneas celulares indicadoras positivas para Ox40 humanas proporcionando una fuerte oligomerización de los receptores OX40. De forma similar, se sometieron a prueba las construcciones FAP-OX40L en presencia de células del clon 39 de NIH/3T3-huFAP para determinar su capacidad para rescatar la estimulación subóptima de TCR de células PBMC humanas en reposo.
Las preparaciones de PBMC humanas contienen (1) linfocitos T CD4+ y CD8+ negativos para Ox40 en reposo y (2) células presentadoras de antígeno con diversas moléculas receptoras de Fc-y en su superficie celular, por ejemplo, linfocitos B y monocitos. El anticuerpo anti-CD3 humano del isotipo de IgG1 humano se puede unir con su parte Fc a las presentes moléculas receptoras de Fc-y y mediar una activación prolongada de TCR en linfocitos T CD4+ y CD8+ negativos para Ox40 en reposo. Estas células a continuación comienzan a expresar Ox40 en varias horas. Los compuestos agonistas funcionales frente a Ox40 pueden señalizar por medio del receptor Ox40 presente en los linfocitos T CD8+ y CD4+ activados y apoyar la estimulación mediada por TCR.
Se estimularon PBMC humanas marcadas con CFSE en reposo durante cinco días con una concentración subóptima de anticuerpo anti-CD3 en presencia de células del clon 39 de NIH/3T3-huFAP FAP+ irradiadas y FAP-Ox40L titulado. Los efectos sobre la supervivencia y proliferación de los linfocitos T se analizaron mediante la supervisión del recuento total de células y la dilución de CFSE en células vivas mediante citometría de flujo.
Se recolectaron células del clon 39 de NIH/3T3-huFAP de fibroblasto embrionario de ratón (véase el ejemplo 15.4) usando tampón de disociación celular (Invitrogen, n.° de cat. 13151-014) durante 10 minutos a 37 °C. Las células se lavaron una vez con DPBS. Células del clon 39 de NIH/3T3-huFAP se cultivaron a una densidad de 0,2 x 105 células por pocillo en medios de linfocitos T en una placa de cultivo tisular de adhesión de fondo redondo de 96 pocillos estéril (TPP, n.° de cat. 92097) durante la noche a 37 °C y CO2 al 5 % en una incubadora (Hera Cell 150). Al día siguiente, se irradiaron en un irradiador de rayos x usando una dosis de 4500 RAD para prevenir el posterior crecimiento excesivo de PBMC humanas por la línea de células tumorales.
Se aislaron PBMC humanas mediante centrifugación de densidad ficoll como se describe en el ejemplo 15.3. Las células se marcaron a continuación con CFSE a una densidad celular de 1x106 células/mL con CFDA-SE (Sigma-Aldrich, n.° de cat. 2188) a una concentración final de [50 nM] durante 10 minutos a 37 °C. Posteriormente, las células se lavaron dos veces con un exceso de DPBS que contenía FBS (10 % v/v). Las células marcadas se dejaron reposar en medio de linfocitos T a 37 °C durante 30 minutos. Después de esto, el CFDA-SE no convertido se eliminó mediante dos etapas de lavado adicionales con DPBS. Se añadieron PBMC humanas en reposo marcadas con CFSE a cada pocillo a una densidad de 0,5 x 105 células por pocillo. El anticuerpo anti-CD3 humano (clon V9, IgG1 humana, descrito en Rodrigues et al., Int J Cancer Suppl 7, 45-50 (1992) y la patente de EE.UU. n.° 6.054.297) a una concentración final de [20 nM] y FAP-OX40L se añadieron a las concentraciones indicadas. Las células se activaron durante cinco días a 37 °C y CO2 al 5 % en una incubadora (Hera Cell 150). A continuación, las células se tiñeron superficialmente con anticuerpos anti-CD4 humanos conjugados con colorante fluorescente (clon RPA-T4, BioLegend, n.° de cat. 300532) y CD8 (clon RPa-T8, BioLegend, n.° de cat. 3010441) durante 20 minutos a 4 °C. Después de una etapa de lavado con tampón FACS, las células se resuspendieron en tampón FACS a 85 pL/pocillo y se adquirieron usando un óitn etro de flujo Fortessa de 5 láseres (BD Bioscience con software DIVA).
Como se muestra en la figura 51, la hiperreticulación de las construcciones FAP-OX40L por las células presentes del clon 39 de NIH/3T3-huFAP promovió fuertemente la proliferación (véanse los gráficos de "Acontecimientos" en la parte superior) y la supervivencia (véanse los gráficos de "proliferación" en la parte inferior) en linfocitos T CD4 y c D8 humanos estimulados con TCR. En consonancia con una menor expresión de OX40 en los linfocitos T CD8+ humanos, el efecto agonista de FAP-OX40L fue menos fuerte en los linfocitos T CD8+ que en los linfocitos T CD4+.
Citas:
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Claims (23)

REIVINDICACIONES
1. Una molécula de unión a antígeno que contiene un trímero de ligando de la familia de TNF que comprende
(a) al menos una molécula Fab que se puede unir específicamente a CD19,
(b) un primer y un segundo polipéptido que están unidos entre sí por un enlace disulfuro, en la que la molécula de unión a antígeno se caracteriza por que
(i) el primer polipéptido contiene un dominio CH1 o CL y el segundo polipéptido contiene un dominio CL o CH1, respectivamente, en el que el segundo polipéptido se une al primer polipéptido por un enlace disulfuro entre el dominio CH1 y CL, y en el que el primer polipéptido comprende dos ectodominios de 4-1BBL que comprenden la secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 96, SEQ ID NO: 373, SEQ ID NO: 374 y SEQ ID NO: 375 que están conectadas entre sí y al dominio CH1 o CL mediante un conector peptídico y en el que el segundo polipéptido comprende un ectodominio de dicho 4-1BBL que comprende la secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 96, SEQ ID NO: 373, SEQ ID NO: 374 y SEQ ID NO: 375 conectado por medio de un conector peptídico al dominio CL o CH1 de dicho polipéptido, o
(ii) el primer polipéptido contiene un dominio CH3 y el segundo polipéptido contiene un dominio CH3, respectivamente, y en el que el primer polipéptido comprende dos ectodominios de 4-1BBL que comprenden la secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 96, SEQ ID NO: 373, SEQ ID NO: 374 y SEQ ID NO: 375 que están conectadas entre sí y al extremo C del dominio CH3 mediante un conector peptídico y en el que el segundo polipéptido comprende solo un ectodominio de dicho 4-1BBL que comprende la secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 96, SEQ ID NO: 373, SEQ ID NO: 374 y SEQ ID NO: 375 conectadas por medio de un conector peptídico al extremo C del dominio CH3 de dicho polipéptido, o
(iii) el primer polipéptido contiene un dominio VH-CL o VL-CH1 y el segundo polipéptido contiene un dominio VL-CH1 o un dominio VH-CL, respectivamente, en el que el segundo polipéptido se une al primer polipéptido por un enlace disulfuro entre el dominio CH1 y CL, y en el que el primer polipéptido comprende dos ectodominios de 4-1BBL que comprenden la secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 96, SEQ ID NO: 373, SEQ ID NO: 374 y SEQ ID NO: 375 que están conectadas entre sí y a VH o VL mediante un conector peptídico y en el que el segundo polipéptido comprende un ectodominio de dicho 4-1BBL que comprende la secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 96, SEQ ID NO: 373, SEQ ID NO: 374 y SEQ ID NO: 375 conectadas por medio de un conector peptídico al VL o VH de dicho polipéptido, y
(c) un dominio Fc compuesto de una primera y una segunda subunidad que se pueden asociar de manera estable.
2. La molécula de unión a antígeno que contiene un trímero de ligando de la familia de TNF de acuerdo con las reivindicaciones 1 o 2, en la que el ectodominio de 4-1BBL comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 96.
3. La molécula de unión a antígeno que contiene un trímero de ligando de la familia de TNF de las reivindicaciones 1 o 2, en la que el ectodominio de 4-1BBL comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 96.
4. La molécula de unión a antígeno que contiene un trímero de ligando de la familia de TNF de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, que comprende
(a) al menos una molécula Fab que se puede unir específicamente a CD19, y
(b) un primer y segundo polipéptido que están unidos entre sí por un enlace disulfuro, en el que la molécula de unión a antígeno se caracteriza por que el primer polipéptido comprende la secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en la SEQ iD NO: 5, SEQ ID NO: 97, SEQ ID NO: 98 y SEQ ID NO: 99; y por que el segundo polipéptido comprende la secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en la SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 96, SEQ ID NO: 3 y SEQ ID NO: 4.
5. La molécula de unión a antígeno que contiene un trímero de ligando de la familia de TNF de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, que comprende
(a) al menos una molécula Fab que se puede unir específicamente a CD19, y
(b) un primer polipéptido que contiene un dominio CH1 o CL y un segundo polipéptido que contiene un dominio CL o CH1, respectivamente, en el que el segundo polipéptido se une al primer polipéptido por un enlace disulfuro entre el dominio CH1 y CL, y en el que la molécula de unión a antígeno se caracteriza por que el primer polipéptido comprende dos ectodominios de 4-1BBL que comprenden la secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 96, SEQ ID NO: 373, SEQ ID NO: 374 y SEQ ID NO: 375 que están conectadas entre sí y al dominio CH1 o CL mediante un conector peptídico y por que el segundo polipéptido comprende solo un ectodominio de dicho 4-1BBL que comprende la secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 96, SEQ ID NO: 373, SEQ ID NO: 374 y SEQ ID NO: 375 conectado por medio de un conector peptídico al dominio CL o CH1 de dicho polipéptido.
6. La molécula de unión a antígeno que contiene un trímero de ligando de la familia de TNF de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en la que el dominio Fc es un dominio Fc de IgG, en particular un dominio Fc de IgG1 o un dominio Fc de IgG4.
7. La molécula de unión a antígeno que contiene un trímero de ligando de la familia de TNF de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en la que el dominio Fc es un dominio Fc de IgG1 que comprende las sustituciones aminoacídicas en las posiciones 234 y 235 (numeración EU) y/o 329 (numeración EU).
8. La molécula de unión a antígeno que contiene un trímero de ligando de la familia de TNF de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en la que la molécula de unión a antígeno comprende
una primera cadena pesada y una primera cadena ligera, comprendiendo las dos una molécula Fab que se puede unir específicamente a CD19,
un primer péptido que comprende dos ectodominios de 4-1BBL que comprenden la secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en la SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 96, SEQ ID NO: 373, SEQ ID NO: 374 y SEQ ID NO: 375 conectadas entre sí mediante un conector peptídico fusionado en su extremo C mediante un segundo conector peptídico a una segunda cadena pesada o ligera,
y un segundo péptido que comprende un ectodominio de dicho 4-1BBL que comprende la secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en la SEQ ID NO: 1, SEQ ID No : 2, s Eq ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 96, SEQ ID NO: 373, Se Q ID NO: 374 y SEQ ID NO: 375 fusionada en su extremo C mediante un tercer conector peptídico con una segunda cadena ligera o pesada, respectivamente.
9. La molécula de unión a antígeno que contiene un trímero de ligando de la familia de TNF de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en la que la molécula de unión a antígeno comprende
(a) una primera cadena pesada y una primera cadena ligera, comprendiendo las dos una molécula Fab que se puede unir específicamente a CD19,
(b) una segunda cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en la SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 97, SEQ ID NO: 98 y SEQ ID NO: 99, y una segunda cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en la SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 96, SEQ ID NO: 3 y SEQ ID NO: 4.
10. La molécula de unión a antígeno que contiene un trímero de ligando de la familia de TNF de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en la que la molécula Fab que se puede unir específicamente a CD19 comprende un dominio VH que comprende (i) CDR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 195 o SEQ ID NO: 252, (ii) CDR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 196 o SEQ ID NO: 253, y (iii) CDR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 197 o SEQ ID NO: 254, y un dominio VL que comprende (iv) CDR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 198 o SEQ ID NO: 249, (v) CDR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 199 o SEQ ID NO: 250, y (vi) CDR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 200 o SEQ ID NO: 251.
11. La molécula de unión a antígeno que contiene un trímero de ligando de la familia de TNF de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, en la que la molécula Fab que se puede unir específicamente a CD19 comprende una cadena pesada variable que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 201 y una cadena ligera variable que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 202 o en la que la molécula Fab que se puede unir específicamente a CD19 comprende una cadena pesada variable que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 357 y una cadena ligera variable que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 358.
12. La molécula de unión a antígeno que contiene un trímero de ligando de la familia de TNF de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, en la que la molécula de unión a antígeno comprende
(i) una primera cadena pesada que comprende el dominio VH que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 201 y una primera cadena ligera que comprende el dominio VL que comprende la secuencia de aminoácidos de s Eq ID No : 202 o
una primera cadena pesada que comprende el dominio VH que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 357 y una primera cadena ligera que comprende el dominio VL que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 358,
(ii) una segunda cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en la SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 108, SEQ ID NO: 111 y SEQ ID NO: 113, y
(iii) una segunda cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 109, SEQ ID NO: 110, SEQ ID NO: 112 y SEQ ID NO: 114.
13. La molécula de unión a antígeno que contiene un trímero de ligando de la familia de TNF de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, en la que la molécula de unión a antígeno comprende
(i) una primera cadena pesada que comprende el dominio VH que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 201 y una primera cadena ligera que comprende el dominio VL que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 202 o
una primera cadena pesada que comprende el dominio VH que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 357 y una primera cadena ligera que comprende el dominio VL que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 358,
(ii) una segunda cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en la SEQ ID NO: 115, SEQ ID NO: 117, SEQ ID NO: 119 y SEQ ID NO: 173, y
(iii) una segunda cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en la SEQ ID NO: 116, SEQ ID NO: 118, SEQ ID NO: 120 y SEQ ID NO: 174.
14. La molécula de unión a antígeno que contiene un trímero de ligando de la familia de TNF de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11 o 13, que comprende una primera cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 205, una primera cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 206, una segunda cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 119 y una segunda cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 120.
15. La molécula de unión a antígeno que contiene un trímero de ligando de la familia de TNF de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11 o 13, que comprende una primera cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 306, una primera cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 279, una segunda cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 119 y una segunda cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 120.
16. La molécula de unión a antígeno que contiene un trímero de ligando de la familia de TNF de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, en la que la molécula de unión a antígeno comprende
(i) una primera cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 209, una segunda cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 210 y dos cadenas ligeras que comprenden la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 206, o
(ii) una primera cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 213, una segunda cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 214 y dos cadenas ligeras que comprenden la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 206, o
(iii) una primera cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 309, una segunda cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 310 y dos cadenas ligeras que comprenden la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 279, o
(iv) una primera cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 313, una segunda cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 314 y dos cadenas ligeras que comprenden la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 279.
17. Un polinucleótido aislado que codifica la molécula de unión a antígeno que contiene un trímero de ligando de la familia de TNF de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 16.
18. Un vector, en particular, un vector de expresión, que comprende el polinucleótido aislado de la reivindicación 16.
19. Una célula huésped que comprende el polinucleótido aislado de la reivindicación 17 o el vector de la reivindicación 18.
20. Un procedimiento para producir la molécula de unión a antígeno que contiene un trímero de ligando de la familia de TNF de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 16, que comprende las etapas de
(i) cultivar la célula huésped de la reivindicación 19 en condiciones adecuadas para la expresión de la molécula de unión a antígeno, y
(ii) recuperar la molécula de unión a antígeno.
21. Una composición farmacéutica que comprende la molécula de unión a antígeno que contiene un trímero de ligando de la familia de TNF de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 16 y al menos un excipiente farmacéuticamente aceptable.
22. La molécula de unión a antígeno que contiene un trímero de ligando de la familia de TNF de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 16 o la composición farmacéutica de la reivindicación 21 para su uso como medicamento.
23. La molécula de unión a antígeno que contiene un trímero de ligando de la familia de TNF de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 16 o la composición farmacéutica de la reivindicación 21 para su uso en el tratamiento de cáncer.
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