JP7285076B2 - Tnfファミリーリガンドトリマーとテネイシン結合部分とを含む抗原結合分子 - Google Patents
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Description
(a)テネイシンC(TnC)と特異的に結合することができる少なくとも1つの部分と、
(b)ジスルフィド結合により互いに連結されている第1及び第2のポリペプチドと
を含み、
第1のポリペプチドが、ペプチドリンカーにより互いに接続されているTNFリガンドファミリーメンバーの2つのエクトドメイン又はそれらの2つの断片を含むこと、及び第2のポリペプチドが、前記TNFリガンドファミリーメンバーの1つだけのエクトドメイン又はその断片を含むことを特徴とする抗原結合分子を提供する。
(a)TnCと特異的に結合することができる少なくとも1つの部分と、
(b)ジスルフィド結合により互いに連結されている第1及び第2のポリペプチドと
を含み、
第1のポリペプチドが、ペプチドリンカーにより互いに接続されているTNFリガンドファミリーメンバーの2つのエクトドメイン又はそれらの2つの断片を含むこと、及び第2のポリペプチドが、前記TNFリガンドファミリーメンバーの1つだけのエクトドメイン又はその断片を含むことを特徴とする抗原結合分子であり、
(c)安定的に結合することができる第1及び第2のサブユニットから構成されるFcドメイン
を含む、TNFファミリーリガンドトリマー含有抗原結合分子を提供する。
(a)TnCと特異的に結合することができる少なくとも1つの部分と、
(b)ジスルフィド結合により互いに連結されている第1及び第2のポリペプチドと
を含み、
(i)第1のポリペプチドがCH1若しくはCLドメインを含有すること、及び第2のポリペプチドがCL若しくはCH1ドメインを含有することをそれぞれ特徴とし、第2のポリペプチドが、CH1ドメインとCLドメイン間のジスルフィド結合により第1のポリペプチドと連結されており、第1のポリペプチドが、ペプチドリンカーにより互いに及びCH1若しくはCLドメインに接続されているTNFリガンドファミリーメンバーの2つのエクトドメイン若しくはそれらの断片を含み、第2のポリペプチドが、ペプチドリンカーによって前記ポリペプチドのCL若しくはCH1ドメインに接続されている前記TNFリガンドファミリーメンバーの1つのエクトドメイン若しくはその断片を含む、又は
(ii)第1のポリペプチドがCH3ドメインを含有すること、及び第2のポリペプチドがCH3ドメインを含有することをそれぞれ特徴とし、第1のポリペプチドが、ペプチドリンカーにより互いに及びCH3ドメインのC末端に接続されているTNFリガンドファミリーメンバーの2つのエクトドメイン若しくはそれらの断片を含み、第2のポリペプチドが、ペプチドリンカーによってポリペプチドのCH3ドメインのC末端に接続されている前記TNFリガンドファミリーメンバーの1つだけのエクトドメイン若しくはその断片を含む、又は
(iii)第1のポリペプチドがVH-CL若しくはVL-CH1ドメインを含有すること、及び第2のポリペプチドがVL-CH1ドメイン若しくはVH-CLドメインを含有することをそれぞれ特徴とし、第2のポリペプチドが、CH1ドメインとCLドメイン間のジスルフィド結合により第1のポリペプチドと連結されており、第1のポリペプチドが、ペプチドリンカーにより互いに及びVH若しくはVLに接続されているTNFリガンドファミリーメンバー2つのエクトドメイン若しくはそれらの断片を含み、第2のポリペプチドが、ペプチドリンカーによって前記ポリペプチドのVL若しくはVHに接続されている前記TNFリガンドファミリーメンバーの1つのエクトドメイン若しくはその断片を含む、抗原結合分子を提供する。
(a)TnCと特異的に結合することができる少なくとも1つの部分と、
(b)ジスルフィド結合により互いに連結されている第1及び第2のポリペプチドと
を含み、
第1のポリペプチドが、ペプチドリンカーにより互いに接続されているTNFリガンドファミリーメンバーの2つのエクトドメイン又はそれらの2つの断片を含むこと、及び第2のポリペプチドが、前記TNFリガンドファミリーメンバーの1つだけのエクトドメイン又はその断片を含むことを特徴とし、この場合、前記TNFリガンドファミリーメンバーは、ヒトT細胞活性化を共刺激する。より特に、TNFリガンドファミリーメンバーは、4-1BBL及びOX40Lから選択される。
(a)TnCと特異的に結合することができる少なくとも1つの部分と、
(b)ジスルフィド結合により互いに連結されている第1及び第2のポリペプチドと
を含み、
第1のポリペプチドが、配列番号176、配列番号184、配列番号185及び配列番号186からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むこと、及び第2のポリペプチドが、配列番号172、配列番号174及び配列番号175及び配列番号183からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むことを特徴とする。
(a)TnCと特異的に結合することができる少なくとも1つの部分と、
(b)ジスルフィド結合により互いに連結されている第1及び第2のポリペプチドと
を含み、
第1のポリペプチドが、配列番号176のアミノ酸配列を含むこと、及び第2のポリペプチドが、配列番号177のアミノ酸配列を含むことを特徴とする。
(a)TnCと特異的に結合することができる少なくとも1つの部分と、
(b)ジスルフィド結合により互いに連結されている第1及び第2のポリペプチドと
を含み、
第1のポリペプチドが、配列番号176のアミノ酸配列を含むこと、及び第2のポリペプチドが、配列番号187のアミノ酸配列を含むことを特徴とする。
(a)TnCと特異的に結合することができる少なくとも1つの部分と、
(b)ジスルフィド結合により互いに連結されている第1及び第2のポリペプチドと
を含み、
第1のポリペプチドが、配列番号184のアミノ酸配列を含むこと、及び第2のポリペプチドが、配列番号188又は配列番号189のアミノ酸配列を含むことを特徴とする。
(a)TnCと特異的に結合することができる少なくとも1つの部分と、
(b)CH1又はCLドメインを含有する第1のポリペプチド、及びCL又はCH1ドメインを含有する第2のポリペプチドと
をそれぞれ含み、第2のポリペプチドが、CH1ドメインとCLドメイン間のジスルフィド結合により第1のポリペプチドと連結されており、
第1のポリペプチドが、ペプチドリンカーにより互いに及びCH1又はCLドメインに接続されているTNFリガンドファミリーメンバーの2つのエクトドメイン又はそれらの2つの断片を含むこと、及び第2のポリペプチドが、ペプチドリンカーによって前記ポリペプチドのCL又はCH1ドメインに接続されている前記TNFリガンドファミリーメンバーの1つだけのエクトドメイン又はその断片を含むことを特徴とする。
(a)TnCと特異的に結合することができる少なくとも1つの部分と、
(b)CH1ドメインを含有する第1のポリペプチド、及びCLドメインを含有する第2のポリペプチドと
を含み、第2のポリペプチドが、CH1ドメインとCLドメイン間のジスルフィド結合により第1のポリペプチドと連結されており、
第1のポリペプチドが、ペプチドリンカーにより互いに及びCH1ドメインに接続されているTNFリガンドファミリーメンバーの2つのエクトドメイン又はそれらの断片を含むこと、及び第2のポリペプチドが、ペプチドリンカーによって前記ポリペプチドのCLドメインに接続されている前記TNFリガンドファミリーメンバーの1つのエクトドメイン又はその断片を含むことを特徴とする抗原結合分子を提供する。
(a)TnCと特異的に結合することができる少なくとも1つの部分と、
(b)CLドメインを含有する第1のポリペプチド、及びCH1ドメインを含有する第2のポリペプチドと
を含み、第2のポリペプチドが、CH1ドメインとCLドメイン間のジスルフィド結合により第1のポリペプチドと連結されており、
第1のポリペプチドが、ペプチドリンカーにより互いに及びCLドメインに接続されているTNFリガンドファミリーメンバーの2つのエクトドメイン又はそれらの断片を含むこと、及び第2のポリペプチドが、ペプチドリンカーによって前記ポリペプチドのCH1ドメインに接続されている前記TNFリガンドファミリーメンバーの1つのエクトドメイン又はその断片を含むことを特徴とする抗原結合分子を提供する。
(c)安定的に結合することができる第1及び第2のサブユニットから構成されるFcドメイン
を含み、Fcドメインが、Fc受容体との、特に、Fcγ受容体への結合を低減させる1つ又は複数のアミノ酸置換を含む、上文で定義された通りのTNFファミリーリガンドトリマー含有抗原結合分子に関する。
(a)TnCと特異的に結合することができるFab分子を両方が含む、第1の重鎖及び第1の軽鎖、
(b)配列番号176、配列番号184、配列番号185及び配列番号186からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む第2の重鎖、並びに配列番号172、配列番号174、配列番号175及び配列番号183からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む第2の軽鎖
を含む、上文に記載のTNFファミリーリガンドトリマー含有抗原結合分子が提供される。
(i)配列番号46のアミノ酸配列を含むVHドメインを含む第1の重鎖、及び配列番号45のアミノ酸配列を含むVLドメインを含む第1の軽鎖、又は配列番号48のアミノ酸配列を含むVHドメインを含む第1の重鎖、及び配列番号47のアミノ酸配列を含むVLドメインを含む第1の軽鎖と、
(ii)配列番号178のアミノ酸配列を含む第2の重鎖と、
(iii)配列番号179のアミノ酸配列を含む第2の軽鎖と
を含む、抗原結合分子が提供される。
(i)配列番号46のアミノ酸配列を含むVHドメインを含む第1の重鎖、及び配列番号45のアミノ酸配列を含むVLドメインを含む第1の軽鎖、又は配列番号48のアミノ酸配列を含むVHドメインを含む第1の重鎖、及び配列番号47のアミノ酸配列を含むVLドメインを含む第1の軽鎖と、
(ii)配列番号102、配列番号108、配列番号116及び配列番号120からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む第2の重鎖と、
(iii)配列番号103、配列番号109、配列番号117及び配列番号121からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む第2の軽鎖と
を含む、抗原結合分子を提供する。
(a)TnCと特異的に結合することができる少なくとも1つの部分と、
(b)ジスルフィド結合により互いに連結されている第1及び第2のポリペプチドと
を含み、
第1のポリペプチドがCH3ドメインを含有すること、及び第2のポリペプチドがCH3ドメインを含有することをそれぞれ特徴とし、第1のポリペプチドが、ペプチドリンカーにより互いに及びCH3ドメインのC末端に接続されているTNFリガンドファミリーメンバーの2つのエクトドメイン若しくはそれらの断片を含み、第2のポリペプチドが、ペプチドリンカーによって前記ポリペプチドのCH3ドメインのC末端に接続されている前記TNFリガンドファミリーメンバーの1つのエクトドメイン若しくはその断片を含む抗原結合分子を提供する。
(a)TnCと特異的に結合することができる少なくとも1つのFabドメインと、
(b)安定的に結合することができる第1及び第2のサブユニットから構成されるFcドメインと、
(c)ペプチドリンカーにより互いに接続されているTNFリガンドファミリーメンバーの2つのエクトドメイン又はそれらの断片を含む第1のポリペプチド、及び前記TNFリガンドファミリーメンバーの1つのエクトドメイン又はその断片を含む第2のポリペプチドと
を含み、第1のポリペプチドは、そのN末端でFcドメインのサブユニットの一方のC末端側に融合されており、第2のポリペプチドは、そのN末端でFcドメインのサブユニットの他方のC末端に融合されており、TNFリガンドファミリーメンバーの2つのエクトドメイン又はそれらの断片を含む第1のポリペプチドは、配列番号176及び配列番号184からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、前記TNFリガンドファミリーメンバーの1つのエクトドメイン又はその断片を含む第2のポリペプチドは、配列番号172及び配列番号183からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。一態様では、TNFリガンドファミリーメンバーの2つのエクトドメイン又はそれらの断片を含む第1のポリペプチドは、配列番号176のアミノ酸配列を含み、前記TNFリガンドファミリーメンバーの1つのエクトドメイン又はその断片を含む第2のポリペプチドは、配列番号172のアミノ酸配列を含む。特定の態様では、TNFリガンドファミリーメンバーの2つのエクトドメイン又はそれらの断片を含む第1のポリペプチドは、配列番号184のアミノ酸配列を含み、前記TNFリガンドファミリーメンバーの1つのエクトドメイン又はその断片を含む第2のポリペプチドは、配列番号183のアミノ酸配列を含む。
(a)TnCと特異的に結合することができる少なくとも1つのFabドメインと、
(b)安定的に結合することができる第1及び第2のサブユニットから構成されるFcドメインと、
(c)ペプチドリンカーにより互いに接続されているTNFリガンドファミリーメンバーの2つのエクトドメイン又はそれらの断片を含む第1のポリペプチド、及び前記TNFリガンドファミリーメンバーの1つのエクトドメイン又はその断片を含む第2のポリペプチドと
を含み、第1のポリペプチドが、そのN末端でFcドメインのサブユニットの一方のC末端側に融合されており、第2のポリペプチドが、そのN末端でFcドメインのサブユニットの他方のC末端に融合されている抗原結合分子を提供する。したがって、本発明は、標的細胞抗原への結合について一価である、TNFファミリーリガンドトリマー含有抗原結合分子に関する。
(a)TnCと特異的に結合することができる少なくとも1つのFabドメインと、
(b)安定的に結合することができる第1及び第2のサブユニットから構成されるFcドメインと、
(c)ペプチドリンカーにより互いに接続されているTNFリガンドファミリーメンバーの2つのエクトドメイン又はそれらの断片を含む第1のポリペプチド、及び前記TNFリガンドファミリーメンバーの1つのエクトドメイン又はその断片を含む第2のポリペプチドであって、第1のポリペプチドは、そのN末端でFcドメインのサブユニットの一方のC末端側に融合されており、第2のポリペプチドは、そのN末端でFcドメインの他方のサブユニットのC末端に融合されている、ポリペプチドと、
(d)標的細胞抗原と特異的に結合することができないFabドメインと
を含む、抗原結合分子を提供する。
(i)配列番号127のアミノ酸配列を含む第1の重鎖、配列番号125のアミノ酸配列を含む第2の重鎖、及び配列番号77のアミノ酸配列を含む1つの軽鎖、又は
(ii)配列番号130のアミノ酸配列を含む第1の重鎖、配列番号131のアミノ酸配列を含む第2の重鎖、及び配列番号77のアミノ酸配列を含む1つの軽鎖、又は
(ii)配列番号124のアミノ酸配列を含む第1の重鎖、配列番号133のアミノ酸配列を含む第2の重鎖、及び配列番号77のアミノ酸配列を含む1つの軽鎖、又は
(ii)配列番号136のアミノ酸配列を含む第1の重鎖と、配列番号137のアミノ酸配列を含む第2の重鎖、及び配列番号77のアミノ酸配列を含む1つの軽鎖
を含む、上文に記載のTNFファミリーリガンドトリマー含有抗原結合分子が提供される。
(i)配列番号112のアミノ酸配列を含む第1の重鎖、配列番号113のアミノ酸配列を含む第2の重鎖、及び配列番号77のアミノ酸配列を含む2つの軽鎖、又は
(ii)配列番号124のアミノ酸配列を含む第1の重鎖、配列番号125のアミノ酸配列を含む第2の重鎖、及び配列番号77のアミノ酸配列を含む2つの軽鎖
を含む、上文に記載のTNFファミリーリガンドトリマー含有抗原結合分子が提供される。
(a)TnCと特異的に結合することができる少なくとも1つの部分と、
(b)ジスルフィド結合により互いに連結されている第1及び第2のポリペプチドと
を含み、
第1のポリペプチドが、配列番号190又は配列番号191のアミノ酸配列を含むこと、及び第2のポリペプチドが、配列番号181又は配列番号182のアミノ酸配列を含むことを特徴とする、上文に記載の抗原結合分子が提供される。
(i)配列番号46のアミノ酸配列を含むVHドメインを含む第1の重鎖、及び配列番号45のアミノ酸配列を含むVLドメインを含む第1の軽鎖、又は配列番号48のアミノ酸配列を含むVHドメインを含む第1の重鎖、及び配列番号47のアミノ酸配列を含むVLドメインを含む第1の軽鎖と、
(ii)配列番号195からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む第2の重鎖と、
(iii)配列番号196のアミノ酸配列を含む第2の軽鎖と
を含む、本明細書に記載のTNFファミリーリガンドトリマー含有抗原結合分子が提供される。
別途定義がない限り、本明細書で使用される専門及び科学用語は、本発明が属する技術分野において一般に使用されているのと同じ意味を有する。本明細書を解釈するため、以下の定義を適用することとし、適切な場合にはいつでも、単数形で使用される用語は複数形も含むことになり、また逆に複数形で使用される用語は単数形も含むことになる。
1 表A中の全てのCDR定義の番号付けは、カバット等により記載された番号付け規定によるものである(下記参照)。
2 表A中で使用されている小文字「b」を伴う「AbM」は、Oxford Molecularの「AbM」抗体モデル化ソフトウェアによって定義されるようなCDRを指す。
100×分数X/Y
(ここで、Xは、配列アライメントプログラムALIGN-2により該プログラムのAとBのアライメントで同一マッチとしてスコアされるアミノ酸残基の数であり、Yは、B中のアミノ酸残基の総数である)。アミノ酸配列Aの長さがアミノ酸配列Bの長さと同一でない場合、AのBに対しての%アミノ酸配列同一性が、BのAに対しての%アミノ酸配列同一性と同一にならないことは理解されるであろう。別途特に指定のない限り、本明細書で使用される全ての%アミノ酸同一異性は、ALIGN-2コンピュータプログラムを使用して直ぐ前の段落で説明したように得たものである。
(1)疎水性:ノルロイシン、Met、Ala、Val、Leu、Ile、
(2)中性親水性:Cys、Ser、Thr、Asn、Gln、
(3)酸性:Asp、Glu、
(4)塩基性:His、Lys、Arg、
(5)鎖配向に影響を及ぼす残基:Gly、Pro、
(6)芳香族:Trp、Tyr、Phe。
テネイシンC(TnC)の選択的スプライシングを受けた異なるアイソフォームは、ある特定の病的状態で特異的に発現されるが健常成人組織には本質的に存在せず、したがって、TnC標的抗原結合分子には大きな治療上の可能性がある。本発明は、生産性、安定性、結合アフィニティー、生物活性、標的指向化効率、及び毒性低下等の、特に有利な特性を有する、新規TNFファミリーリガンドトリマー含有抗原結合分子を提供する。本発明は、TnCと結合する抗原結合分子、特に、アフィニティー及び異種間反応性が向上した抗原結合分子を、さらに提供する。本発明の抗原結合分子は、例えば、TnCの発現を特徴とする疾患、例えばがんの診断又は治療に、有用である。
(a)テネイシンC(TnC)と特異的に結合することができる少なくとも1つの部分と、
(b)ジスルフィド結合により互いに連結されている第1及び第2のポリペプチドと
を含み、
第1のポリペプチドが、ペプチドリンカーにより互いに接続されているTNFリガンドファミリーメンバーの2つのエクトドメイン又はそれらの2つの断片を含むこと、及び第2のポリペプチドが、前記TNFリガンドファミリーメンバーの1つだけのエクトドメイン又はその断片を含むことを特徴とする抗原結合分子を提供する。
(a)TnCと特異的に結合することができる少なくとも1つの部分と、
(b)ジスルフィド結合により互いに連結されている第1及び第2のポリペプチドと
を含み、
第1のポリペプチドが、ペプチドリンカーにより互いに接続されている、TNFリガンドファミリーメンバーの2つのエクトドメイン又はそれらの2つの断片を含むこと、及び第2のポリペプチドが、前記TNFリガンドファミリーメンバーの1つだけのエクトドメイン又はその断片を含むことを特徴とする抗原結合分子であり、
(c)安定的に結合することができる第1及び第2のサブユニットから構成されるFcドメイン
を含む、抗原結合分子を提供する。
(a)TnCと特異的に結合することができる少なくとも1つの部分と、
(b)ジスルフィド結合により互いに連結されている第1及び第2のポリペプチドと
を含み、
第1のポリペプチドが、ペプチドリンカーにより互いに接続されている、TNFリガンドファミリーメンバーの2つのエクトドメイン又はそれらの2つの断片を含むこと、及び第2のポリペプチドが、前記TNFリガンドファミリーメンバーの1つだけのエクトドメイン又はその断片を含むことを特徴とし、この場合、TNFリガンドファミリーメンバーは、ヒトT細胞活性化を共刺激する。
(a)TnCと特異的に結合することができる少なくとも1つの部分と、
(b)ジスルフィド結合により互いに連結されている第1及び第2のポリペプチドと
を含み、
第1のポリペプチドが、ペプチドリンカーにより互いに接続されているTNFリガンドファミリーメンバーの2つのエクトドメイン又はそれらの2つの断片を含むこと、及び第2のポリペプチドが、前記TNFリガンドファミリーメンバーの1つだけのエクトドメイン又はその断片を含むことを特徴とし、この場合、TNFリガンドファミリーメンバーのエクトドメインは、全ての場合、同一である。
(a)TnCと特異的に結合することができる少なくとも1つの部分と、
(b)ジスルフィド結合により互いに連結されている第1及び第2のポリペプチドと
を含み、
(i)第1のポリペプチドがCH1若しくはCLドメインを含有すること、及び第2のポリペプチドがCL若しくはCH1ドメインを含有することをそれぞれ特徴とし、第2のポリペプチドが、CH1ドメインとCLドメイン間のジスルフィド結合により第1のポリペプチドと連結されており、第1のポリペプチドが、ペプチドリンカーにより互いに及びCH1若しくはCLドメインに接続されているTNFリガンドファミリーメンバーの2つのエクトドメイン若しくはそれらの断片を含み、第2のポリペプチドが、ペプチドリンカーによって前記ポリペプチドのCL若しくはCH1ドメインに接続されている前記TNFリガンドファミリーメンバーの1つのエクトドメイン若しくはその断片を含む、又は
(ii)第1のポリペプチドがCH3ドメインを含有すること、及び第2のポリペプチドがCH3ドメインを含有することをそれぞれ特徴とし、第1のポリペプチドが、ペプチドリンカーにより互いに及びCH3ドメインのC末端に接続されているTNFリガンドファミリーメンバーの2つのエクトドメイン若しくはそれらの断片を含み、第2のポリペプチドが、ペプチドリンカーによって前記ポリペプチドのCH3ドメインのC末端に接続されている前記TNFリガンドファミリーメンバーの1つだけのエクトドメイン若しくはその断片を含む、又は
(iii)第1のポリペプチドがVH-CL若しくはVL-CH1ドメインを含有すること、及び第2のポリペプチドがVL-CH1ドメイン若しくはVH-CLドメインを含有することをそれぞれ特徴とし、第2のポリペプチドが、CH1ドメインとCLドメイン間のジスルフィド結合により第1のポリペプチドと連結されており、第1のポリペプチドが、ペプチドリンカーにより互いに及びVH若しくはVLに接続されているTNFリガンドファミリーメンバー2つのエクトドメイン若しくはそれらの断片を含み、第2のポリペプチドが、ペプチドリンカーによって前記ポリペプチドのVL若しくはVHに接続されている前記TNFリガンドファミリーメンバーの1つのエクトドメイン若しくはその断片を含む、本明細書に記載の抗原結合分子が提供される。
(a)TnCと特異的に結合することができる少なくとも1つの部分と、
(b)ジスルフィド結合により互いに連結されている第1及び第2のポリペプチドと
を含み、
(i)第1のポリペプチドがCH1若しくはCLドメインを含有すること、及び第2のポリペプチドがCL若しくはCH1ドメインを含有することをそれぞれ特徴とし、第2のポリペプチドが、CH1ドメインとCLドメイン間のジスルフィド結合により第1のポリペプチドと連結されており、第1のポリペプチドが、ペプチドリンカーにより互いに及びCH1若しくはCLドメインに接続されているTNFリガンドファミリーメンバーの2つのエクトドメイン若しくはそれらの断片を含み、第2のポリペプチドが、ペプチドリンカーによって前記ポリペプチドのCL若しくはCH1ドメインに接続されている前記TNFリガンドファミリーメンバーの1つのエクトドメイン若しくはその断片を含む、又は
(ii)第1のポリペプチドがCH3ドメインを含有すること、及び第2のポリペプチドがCH3ドメインを含有することをそれぞれ特徴とし、第1のポリペプチドが、ペプチドリンカーにより互いに及びCH3ドメインのC末端に接続されているTNFリガンドファミリーメンバーの2つのエクトドメイン若しくはそれらの断片を含み、第2のポリペプチドが、ペプチドリンカーによって前記ポリペプチドのCH3ドメインのC末端に接続されている前記TNFリガンドファミリーメンバーの1つだけのエクトドメイン若しくはその断片を含む、請求項1に記載の抗原結合分子が提供される。
(a)TnCと特異的に結合することができる少なくとも1つの部分と、
(b)ジスルフィド結合により互いに連結されている第1及び第2のポリペプチドと
を含み、第1のポリペプチドが、配列番号176、配列番号184、配列番号185及び配列番号186からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むこと、及び第2のポリペプチドが、配列番号172、配列番号174、配列番号175及び配列番号183からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むことを特徴とする。特定の実施態様では、第1のポリペプチドは、配列番号184のアミノ酸配列を含み、第2のポリペプチドは、配列番号183のアミノ酸配列を含む。
(a)TnCと特異的に結合することができる少なくとも1つの部分と、
(b)ジスルフィド結合により互いに連結されている第1及び第2のポリペプチドと
を含み、第1のポリペプチドが、配列番号176のアミノ酸配列を含むこと、及び第2のポリペプチドが、配列番号177のアミノ酸配列を含むことを特徴とする。
(a)TnCと特異的に結合することができる少なくとも1つの部分と、
(b)ジスルフィド結合により互いに連結されている第1及び第2のポリペプチドと
を含み、第1のポリペプチドが、配列番号176のアミノ酸配列を含むこと、及び第2のポリペプチドが、配列番号187のアミノ酸配列を含むことを特徴とする。
(a)TnCと特異的に結合することができる少なくとも1つの部分と、
(b)ジスルフィド結合により互いに連結されている第1及び第2のポリペプチドと
を含み、第1のポリペプチドが、配列番号184のアミノ酸配列を含むこと、及び第2のポリペプチドが、配列番号188又は配列番号189のアミノ酸配列を含むことを特徴とする。
(a)TnCと特異的に結合することができる少なくとも1つの部分と、
(b)ジスルフィド結合により互いに連結されている第1及び第2のポリペプチドと
を含み、
第1のポリペプチドが、配列番号190又は配列番号191のアミノ酸配列を含むこと、及び第2のポリペプチドが、配列番号181又は配列番号182のアミノ酸配列を含むことを、それぞれ特徴とする抗原結合分子に関する。
(a)TnCと特異的に結合することができる少なくとも1つの部分と、
(b)CH1又はCLドメインを含有する第1のポリペプチド、及びCL又はCH1ドメインを含有する第2のポリペプチドと
をそれぞれ含み、第2のポリペプチドが、CH1ドメインとCLドメイン間のジスルフィド結合により第1のポリペプチドと連結されており、
抗原結合分子は、第1のポリペプチドが、ペプチドリンカーにより互いに及びCH1又はCLドメインに接続されているTNFリガンドファミリーメンバーの2つのエクトドメイン又はそれらの断片を含むこと、及び第2のポリペプチドが、ペプチドリンカーによって前記ポリペプチドのCL又はCH1ドメインに接続されている前記TNFリガンドファミリーメンバーの1つだけのエクトドメイン又はその断片を含むことを特徴とする。
(a)TnCと特異的に結合することができる少なくとも1つの部分と、
(b)CH1ドメインを含有する第1のポリペプチド、及びCLドメインを含有する第2のポリペプチドと
を含み、
第2のポリペプチドが、CH1ドメインとCLドメイン間のジスルフィド結合により第1のポリペプチドと連結されており、
第1のポリペプチドが、ペプチドリンカーにより互いに及びCH1ドメインに接続されているTNFリガンドファミリーメンバーの2つのエクトドメイン又はそれらの断片を含むこと、及び第2のポリペプチドが、ペプチドリンカーによって前記ポリペプチドのCLドメインに接続されている前記TNFリガンドファミリーメンバーの1つのエクトドメイン又はその断片を含むことを特徴とする抗原結合分子が提供される。
(a)TnCと特異的に結合することができる少なくとも1つの部分と、
(b)CLドメインを含有する第1のポリペプチド、及びCH1ドメインを含有する第2のポリペプチドと
を含み、
第2のポリペプチドが、CH1ドメインとCLドメイン間のジスルフィド結合により第1のポリペプチドと連結されており、
第1のポリペプチドが、ペプチドリンカーにより互いに及びCLドメインに接続されているTNFリガンドファミリーメンバーの2つのエクトドメイン又はそれらの断片を含むこと、及び第2のポリペプチドが、ペプチドリンカーによって前記ポリペプチドのCH1ドメインに接続されている前記TNFリガンドファミリーメンバーの1つのエクトドメイン又はその断片を含むことを特徴とする抗原結合分子が提供される。
(a)TnCと特異的に結合することができる1つの部分と、
(b)ジスルフィド結合により互いに連結されている第1及び第2のポリペプチドと
を含み、
第1のポリペプチドが、ペプチドリンカーにより互いに接続されているTNFリガンドファミリーメンバーの2つのエクトドメイン又はそれらの2つの断片を含むこと、及び第2のポリペプチドが、前記TNFリガンドファミリーメンバーの1つだけのエクトドメイン又はその断片を含むことを特徴とする抗原結合分子を提供する。
(a)TnCと特異的に結合することができる1つより多くの部分と、
(b)ジスルフィド結合により互いに連結されている第1及び第2のポリペプチドと
を含み、
第1のポリペプチドが、ペプチドリンカーにより互いに接続されているTNFリガンドファミリーメンバーの2つのエクトドメイン又はそれらの2つの断片を含むこと、及び第2のポリペプチドが、ペプチドリンカーによって前記ポリペプチドに接続されている、前記TNFリガンドファミリーメンバーの1つだけのエクトドメイン又はその断片を含むことを特徴とする、抗原結合分子を提供する。
(a)TnCと特異的に結合することができる2つの部分と、
(b)ジスルフィド結合により互いに連結されている第1及び第2のポリペプチドと
を含み、
第1のポリペプチドが、ペプチドリンカーにより互いに接続されているTNFリガンドファミリーメンバーの2つのエクトドメイン又はそれらの2つの断片を含むこと、及び第2のポリペプチドが、前記TNFリガンドファミリーメンバーの1つだけのエクトドメイン又はその断片を含むことを特徴とする抗原結合分子を提供する。
(a)TnCと特異的に結合することができる少なくとも1つの部分と、
(b)ジスルフィド結合により互いに連結されている第1及び第2のポリペプチドと
を含み、
第1のポリペプチドがCH3ドメインを含有すること、及び第2のポリペプチドがCH3ドメインを含有することをそれぞれ特徴とし、第1のポリペプチドが、ペプチドリンカーにより互いに及びCH3ドメインのC末端に接続されているTNFリガンドファミリーメンバーの2つのエクトドメイン若しくはそれらの断片を含み、第2のポリペプチドが、ペプチドリンカーによって前記ポリペプチドのCH3ドメインのC末端に接続されている前記TNFリガンドファミリーメンバーの1つのエクトドメイン若しくはその断片を含む抗原結合分子が提供される。特に、そのようTNFファミリーリガンドトリマー含有抗原結合分子は、TnCと特異的に結合することができる2つの部分を含む。
本発明のTNFファミリーリガンドトリマー含有抗原結合分子のFcドメインは、免疫グロブリン分子の重鎖を含む一対のポリペプチド鎖からなる。例えば、免疫グロブリンG(IgG)分子のFcドメインは、各々のサブユニットがCH2及びCH3 IgG重鎖定常ドメインを含む、ダイマーである。Fcドメインの2つのサブユニットは、互いに安定的に結合することができる。
(a)TnCと特異的に結合することができる少なくとも1つの部分と、
(b)ジスルフィド結合により互いに連結されている第1及び第2のポリペプチドと
を含み、
第1のポリペプチドが、ペプチドリンカーにより互いに接続されているTNFリガンドファミリーメンバーの2つのエクトドメイン又はそれらの2つの断片を含むこと、及び第2のポリペプチドが、前記TNFリガンドファミリーメンバーの1つだけのエクトドメイン又はその断片を含むことを特徴とする抗原結合分子であり、
(c)安定的に結合することができる第1及び第2のサブユニットから構成されるFcドメイン
を含み、Fcドメインが、Fc受容体との、特に、Fcγ受容体への結合を低減させる1つ又は複数のアミノ酸置換を含む、抗原結合分子を提供する。
一態様では、本発明のTNFファミリーリガンドトリマー含有抗原結合分子は、
(a)TnCと特異的に結合することができる少なくとも1つの部分と、
(b)ジスルフィド結合により互いに連結されている第1及び第2のポリペプチドと
を含み、
第1のポリペプチドが、ペプチドリンカーにより互いに接続されているTNFリガンドファミリーメンバーの2つのエクトドメイン又はそれらの2つの断片を含むこと、及び第2のポリペプチドが、前記TNFリガンドファミリーメンバーの1つだけのエクトドメイン又はその断片を含むことを特徴とし、
(c)安定的に結合することができる第1及び第2のサブユニットから構成されるFcドメイン
を含み、Fcドメインは、Fc受容体との、特に、Fcγ受容体への結合を低減させる1つ又は複数のアミノ酸置換を含む。したがって、TNFファミリーリガンドトリマー含有抗原結合分子は、2つの非同一のポリペプチド鎖(「重鎖」)に通常は含まれているFcドメインの2つのサブユニットの一方又は他方に融合されている、異なる部分を含む。これらのポリペプチドの組換え共発現及びその後の二量体化は、2つのポリペプチドの幾つかの可能な組合せをもたらす。したがって、組換え産生でのTNFファミリーリガンドトリマー含有抗原結合分子の収量及び純度を向上させるために、本発明のTNFファミリーリガンドトリマー含有抗原結合分子のFcドメインに所望のポリペプチドの結合を促進する修飾を導入することは、有利であるであろう。
正しいペアリングをさらに増進するために、TNFファミリーリガンドトリマー含有抗原結合分子は、異なる荷電アミノ酸置換(いわゆる「荷電残基」)を含有することができる。これらの修飾は、クロスした又はクロスしていないCH1及びCLドメインに導入される。特定の態様では、本発明は、CLドメインのうちの1つにおいて123位(EU番号付け)のアミノ酸がアルギニン(R)に置換されており、124位(EU番号付け)のアミノ酸がリジン(K)に置換されている、及びCH1ドメインのうちの1つにおいて147位(EU番号付け)及び213位(EU番号付け)のアミノ酸がグルタミン酸(E)に置換されている、TNFファミリーリガンドトリマー含有抗原結合分子に関する。
別の態様では、本発明は、TNFファミリーリガンドトリマー含有抗原結合分子であって、TnCと特異的に結合することができるFab分子を両方が含む、第1の重鎖及び第1の軽鎖と、第2のペプチドリンカーによりそのC末端で第2の重鎖又は軽鎖に融合されている、第1のペプチドリンカーによって互いに接続されているTNFリガンドファミリーメンバーの2つのエクトドメイン又はそれらの断片を含む、第1のペプチドと、第3のペプチドリンカーによりそのC末端で第2の軽鎖又は重鎖に融合されている前記TNFリガンドファミリーメンバーの1つのエクトドメインを含む、第2のペプチドとをそれぞれ含む、抗原結合分子を提供する。
(a)TnCと特異的に結合することができる少なくとも1つのFabドメインと、
(b)安定的に結合することができる第1及び第2のサブユニットから構成されるFcドメインと、
(c)ペプチドリンカーにより互いに接続されているTNFリガンドファミリーメンバーの2つのエクトドメイン又はそれらの断片を含む第1のポリペプチド、及び前記TNFリガンドファミリーメンバーの1つのエクトドメイン又はその断片を含む第2のポリペプチドと
を含み、
第1のポリペプチドが、そのN末端で、ノブ突然変異を含むFcドメインの第2のサブユニットのC末端側に融合されており、第2のポリペプチドが、そのN末端で、ホール突然変異を含むFcドメインの第1のサブユニットのC末端に融合されている、抗原結合分子が提供される。
(a)TnCと特異的に結合することができる少なくとも1つのFabドメインと、
(b)安定的に結合することができる第1及び第2のサブユニットから構成されるFcドメインと、
(c)ペプチドリンカーにより互いに接続されているTNFリガンドファミリーメンバーの2つのエクトドメイン又はそれらの断片を含む第1のポリペプチド、及び前記TNFリガンドファミリーメンバーの1つのエクトドメイン又はその断片を含む第2のポリペプチドと
を含み、
第1のポリペプチドが、そのN末端で、ノブ突然変異を含むFcドメインの第2のサブユニットのC末端側に融合されており、第2のポリペプチドが、そのN末端で、ホール突然変異を含むFcドメインの第1のサブユニットのC末端に融合されており、Fab重鎖が、そのC末端で、ノブ突然変異を含むFcドメインの第2のサブユニットのN末端側に融合されている、抗原結合分子を提供する。
(a)TnCと特異的に結合することができる少なくとも1つのFabドメインと、
(b)安定的に結合することができる第1及び第2のサブユニットから構成されるFcドメインと、
(c)ペプチドリンカーにより互いに接続されているTNFリガンドファミリーメンバーの2つのエクトドメイン又はそれらの断片を含む第1のポリペプチド、及び前記TNFリガンドファミリーメンバーの1つのエクトドメイン又はその断片を含む第2のポリペプチドと
を含み、
第1のポリペプチドが、そのN末端で、ノブ突然変異を含むFcドメインの第2のサブユニットのC末端側に融合されており、第2のポリペプチドが、そのN末端で、ホール突然変異を含むFcドメインの第1のサブユニットのC末端に融合されており、Fab重鎖が、そのC末端で、ホール突然変異を含むFcドメインの第1のサブユニットのN末端に融合されている、抗原結合分子を提供する。
(a)TnCと特異的に結合することができる少なくとも1つのFabドメインと、
(b)安定的に結合することができる第1及び第2のサブユニットから構成されるFcドメインと、
(c)ペプチドリンカーにより互いに接続されているTNFリガンドファミリーメンバーの2つのエクトドメイン又はそれらの断片を含む第1のポリペプチド、及び前記TNFリガンドファミリーメンバーの1つのエクトドメイン又はその断片を含む第2のポリペプチドと
を含み、
第1のポリペプチドが、そのN末端で、ホール突然変異を含むFcドメインの第1のサブユニットのC末端側に融合されており、第2のポリペプチドが、そのN末端で、ノブ突然変異を含むFcドメインの第2のサブユニットのC末端に融合されている、抗原結合分子が提供される。
(a)TnCと特異的に結合することができる少なくとも1つのFabドメインと、
(b)安定的に結合することができる第1及び第2のサブユニットから構成されるFcドメインと、
(c)ペプチドリンカーにより互いに接続されているTNFリガンドファミリーメンバーの2つのエクトドメイン又はそれらの断片を含む第1のポリペプチド、及び前記TNFリガンドファミリーメンバーの1つのエクトドメイン又はその断片を含む第2のポリペプチドと
を含み、
第1のポリペプチドが、そのN末端で、ホール突然変異を含むFcドメインの第1のサブユニットのC末端側に融合されており、第2のポリペプチドが、そのN末端で、ノブ突然変異を含むFcドメインの第2のサブユニットのC末端側に融合されており、Fab重鎖が、そのC末端で、ノブ突然変異を含むFcドメインの第2のサブユニットのN末端に融合されている、抗原結合分子を提供する。
(a)TnCと特異的に結合することができる少なくとも1つのFabドメインと、
(b)安定的に結合することができる第1及び第2のサブユニットから構成されるFcドメインと、
(c)ペプチドリンカーにより互いに接続されているTNFリガンドファミリーメンバーの2つのエクトドメイン又はそれらの断片を含む第1のポリペプチド、及び前記TNFリガンドファミリーメンバーの1つのエクトドメイン又はその断片を含む第2のポリペプチドと
を含み、
第1のポリペプチドが、そのN末端で、ホール突然変異を含むFcドメインの第1のサブユニットのC末端側に融合されており、第2のポリペプチドが、そのN末端で、ノブ突然変異を含むFcドメインの第2のサブユニットのC末端側に融合されており、Fab重鎖が、そのC末端で、ホール突然変異を含むFcドメインの第1のサブユニットのN末端に融合されている、抗原結合分子を提供する。
一態様では、本発明は、TnC結合部分を提供する。別の態様では、本発明のTNC結合部分に、本明細書に記載の二価又は多価結合分子を含めることができる。一実施態様態では、TnCと特異的に結合することができる部分は、抗体断片、Fab分子、クロスオーバーFab分子、単鎖Fab分子、Fv分子、scFv分子、単一ドメイン抗体、並びにaVH及び足場抗原結合タンパク質からなる群から選択される。別の態様では、本発明は、TnCと特異的に結合することができる1つ又は複数の部分を含む抗原結合分子を提供する。本明細書に記載のTnC結合部分を含む本発明の分子は、1つ又は複数のTnCドメインに対する高いアフィニティー、及び/又は異種間反応性を有する。
(a)配列番号67の重鎖CDR1、
(b)配列番号68の重鎖CDR2、
(c)配列番号69の重鎖CDR3
を含む重鎖可変領域と、
(a)配列番号55の軽鎖CDR1、
(b)配列番号56の軽鎖CDR2、及び
(c)配列番号57の軽鎖CDR3
を含む軽鎖可変領域と
を含む抗原結合分子を提供する。
(a)配列番号70の重鎖CDR1、
(b)配列番号71の重鎖CDR2、
(c)配列番号72の重鎖CDR3
を含む重鎖可変領域と、
(a)配列番号58の軽鎖CDR1、
(b)配列番号59の軽鎖CDR2、及び
(c)配列番号60の軽鎖CDR3
を含む軽鎖可変領域と
を含む抗原結合分子を提供する。
一態様では、本発明は、TnCと特異的に結合することができる部分が、(i)配列番号67又は配列番号70のアミノ酸配列を含むCDR-H1と、(ii)配列番号68又は配列番号71のアミノ酸配列を含むCDR-H2と、(iii)配列番号69又は配列番号72のアミノ酸配列を含むCDR-H3とを含むVHドメイン、及び(iv)配列番号55又は配列番号58のアミノ酸配列を含むCDR-L1と、(v)配列番号56又は配列番号59のアミノ酸配列を含むCDR-L2と、(vi)配列番号57又は配列番号60のアミノ酸配列を含むCDR-L3とを含むVLドメインを含む、TNFファミリーリガンドトリマー含有抗原結合分子を提供する。
(a)TnCと特異的に結合することができるFab分子を両方が含む、第1の重鎖及び第1の軽鎖、
(b)配列番号176、配列番号184、配列番号185及び配列番号186からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む第2の重鎖、並びに配列番号172、配列番号174、配列番号175及び配列番号183からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む第2の軽鎖
を含む。
(a)配列番号46のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号45のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とを含む、TnCと特異的に結合することができる少なくとも1つの部分と、
(b)ジスルフィド結合により互いに連結されている第1及び第2のポリペプチドと
を含み、
第1のポリペプチドが、配列番号176、配列番号184、配列番号185及び配列番号186からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むこと、及び第2のポリペプチドが、配列番号172、配列番号174、配列番号175及び配列番号183からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むことを特徴とする。
(a)配列番号46のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号45のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とを含む、TnCと特異的結合することができる少なくとも1つの部分と、
(b)ジスルフィド結合により互いに連結されている第1及び第2のポリペプチドと
を含み、
第1のポリペプチドが、配列番号176のアミノ酸配列を含むこと、及び第2のポリペプチドが、配列番号172のアミノ酸配列を含むことを特徴とする。
(a)配列番号46のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号45のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とを含む、TnCと特異的結合することができる少なくとも1つの部分と、
(b)ジスルフィド結合により互いに連結されている第1及び第2のポリペプチドと
を含み、
第1のポリペプチドが、配列番号184のアミノ酸配列を含むこと、及び第2のポリペプチドが、配列番号183のアミノ酸配列を含むことを特徴とする。
(a)配列番号48のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号47のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とを含む、TnCと特異的に結合することができる少なくとも1つの部分と、
ジスルフィド結合により互いに連結されている第1及び第2のポリペプチドと
を含み、
第1のポリペプチドが、配列番号176、配列番号184、配列番号185及び配列番号186からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むこと、及び第2のポリペプチドが、配列番号172、配列番号174、配列番号175及び配列番号183からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むことを特徴とする。
(a)配列番号48のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号47のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とを含む、TnCと特異的に結合することができる少なくとも1つの部分と、
(b)ジスルフィド結合により互いに連結されている第1及び第2のポリペプチドと
を含み、
第1のポリペプチドが、配列番号176のアミノ酸配列を含むこと、及び第2のポリペプチドが、配列番号172のアミノ酸配列を含むことを特徴とする。
(a)配列番号48のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号47のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とを含む、TnCと特異的結合することができる少なくとも1つの部分と、
(b)ジスルフィド結合により互いに連結されている第1及び第2のポリペプチドと
を含み、
第1のポリペプチドが、配列番号184のアミノ酸配列を含むこと、及び第2のポリペプチドが、配列番号183のアミノ酸配列を含むことを特徴とする。
(i)配列番号46のアミノ酸配列を含むVHドメインを含む第1の重鎖、及び配列番号45のアミノ酸配列を含むVLドメインを含む第1の軽鎖、又は
配列番号48のアミノ酸配列を含むVHドメインを含む第1の重鎖、及び配列番号47のアミノ酸配列を含むVLドメインを含む第1の軽鎖と、
(ii)配列番号178のアミノ酸配列を含む第2の重鎖と、
(iii)配列番号179のアミノ酸配列を含む第2の軽鎖と
を含む、抗原結合分子が提供される。
(i)配列番号46のアミノ酸配列を含むVHドメインを含む第1の重鎖、及び配列番号45のアミノ酸配列を含むVLドメインを含む第1の軽鎖、又は配列番号48のアミノ酸配列を含むVHドメインを含む第1の重鎖、及び配列番号47のアミノ酸配列を含むVLドメインを含む第1の軽鎖と、
(ii)配列番号178のアミノ酸配列を含む第2の重鎖と、
(iii)配列番号179のアミノ酸配列を含む第2の軽鎖と
を含む抗原結合分子が提供される。
(i)配列番号46のアミノ酸配列を含むVHドメインを含む第1の重鎖、及び配列番号45のアミノ酸配列を含むVLドメインを含む第1の軽鎖、又は配列番号48のアミノ酸配列を含むVHドメインを含む第1の重鎖、及び配列番号47のアミノ酸配列を含むVLドメインを含む第1の軽鎖と、
(ii)配列番号102、配列番号108、配列番号116及び配列番号120からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む第2の重鎖と、
(iii)配列番号103、配列番号109、配列番号117及び配列番号121からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む第2の軽鎖と
を含む抗原結合分子が提供される。
(i)配列番号46のアミノ酸配列を含むVHドメインを含む第1の重鎖、及び配列番号45のアミノ酸配列を含むVLドメインを含む第1の軽鎖、又は
配列番号48のアミノ酸配列を含むVHドメインを含む第1の重鎖、及び配列番号47のアミノ酸配列を含むVLドメインを含む第1の軽鎖と、
(ii)配列番号102、配列番号108、配列番号116及び配列番号120からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む第2の重鎖と、
(iii)配列番号103、配列番号109、配列番号117及び配列番号121からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む第2の軽鎖と
を含む、抗原結合分子を提供する。
(a)TnCと特異的に結合することができる少なくとも1つの部分と、
(b)ジスルフィド結合により互いに連結されている第1及び第2のポリペプチドと
を含み、
第1のポリペプチドがCH3ドメインを含有すること、及び第2のポリペプチドがCH3ドメインを含有することをそれぞれ特徴とし、第1のポリペプチドが、ペプチドリンカーにより互いに及びCH3ドメインのC末端に接続されているTNFリガンドファミリーメンバーの2つのエクトドメイン若しくはそれらの断片を含み、第2のポリペプチドが、ペプチドリンカーによって前記ポリペプチドのCH3ドメインのC末端に接続されている前記TNFリガンドファミリーメンバーの1つのエクトドメイン若しくはその断片を含む抗原結合分子を提供する。
(a)TnCと特異的に結合することができる少なくとも1つのFabドメインと、
(b)安定的に結合することができる第1及び第2のサブユニットから構成されるFcドメインと、
(c)ペプチドリンカーにより互いに接続されているTNFリガンドファミリーメンバーの2つのエクトドメイン又はそれらの断片を含む第1のポリペプチド、及び前記TNFリガンドファミリーメンバーの1つのエクトドメイン又はその断片を含む第2のポリペプチドと
を含み、第1のポリペプチドは、そのN末端でFcドメインのサブユニットの一方のC末端側に融合されており、第2のポリペプチドは、そのN末端でFcドメインの他方のサブユニットのC末端に融合されており、TNFリガンドファミリーメンバーの2つのエクトドメイン又はそれらの断片を含む第1のポリペプチドは、配列番号176及び配列番号184からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、前記TNFリガンドファミリーメンバーの1つのエクトドメイン又はその断片を含む第2のポリペプチドは、配列番号172及び配列番号183からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。一態様では、TNFリガンドファミリーメンバーの2つのエクトドメイン又はそれらの断片を含む第1のポリペプチドは、配列番号176のアミノ酸配列を含み、前記TNFリガンドファミリーメンバーの1つのエクトドメイン又はその断片を含む第2のポリペプチドは、配列番号172のアミノ酸配列を含む。特定の態様では、TNFリガンドファミリーメンバーの2つのエクトドメイン又はそれらの断片を含む第1のポリペプチドは、配列番号184のアミノ酸配列を含み、前記TNFリガンドファミリーメンバーの1つのエクトドメイン又はその断片を含む第2のポリペプチドは、配列番号183のアミノ酸配列を含む。
(a)TnCと特異的に結合することができる少なくとも1つのFabドメインと、
(b)安定的に結合することができる第1及び第2のサブユニットから構成されるFcドメインと、
(c)ペプチドリンカーにより互いに接続されているTNFリガンドファミリーメンバーの2つのエクトドメイン又はそれらの断片を含む第1のポリペプチド、及び前記TNFリガンドファミリーメンバーの1つのエクトドメイン又はその断片を含む第2のポリペプチドと
を含み、第1のポリペプチドが、そのN末端でFcドメインのサブユニットの一方のC末端側に融合されており、第2のポリペプチドが、そのN末端でFcドメインの他方のサブユニットのC末端に融合されているTNFファミリーリガンドトリマー含有抗原結合分子を提供する。したがって、本発明は、標的細胞抗原への結合について一価である、TNFファミリーリガンドトリマー含有抗原結合分子に関する。
(a)配列番号46のアミノ酸配列を含むVHドメイン及び配列番号45のアミノ酸配列を含むVLドメイン、又は配列番号48のアミノ酸配列を含むVHドメイン及び配列番号47のアミノ酸配列を含むVLドメインを含む、TnCと特異的に結合することができるFabドメインと、
(b)安定的に結合することができる第1及び第2のサブユニットから構成されるFcドメインと、
(c)ペプチドリンカーにより互いに接続されているTNFリガンドファミリーメンバーの2つのエクトドメイン又はそれらの断片を含む第1のポリペプチド、及び前記TNFリガンドファミリーメンバーの1つのエクトドメイン又はその断片を含む第2のポリペプチドと
を含み、第1のポリペプチドが、そのN末端でFcドメインのサブユニットの一方のC末端側に融合されており、第2のポリペプチドが、そのN末端でFcドメインの他方のサブユニットのC末端に融合されているTNFファミリーリガンドトリマー含有抗原結合分子を提供する。
(a)配列番号46のアミノ酸配列を含むVHドメイン及び配列番号45のアミノ酸配列を含むVLドメイン、又は配列番号48のアミノ酸配列を含むVHドメイン及び配列番号47のアミノ酸配列を含むVLドメインを含む、TnCと特異的に結合することができるFabドメインと、
(b)安定的に結合することができる第1及び第2のサブユニットから構成されるFcドメインと、
(c)ペプチドリンカーにより互いに接続されているTNFリガンドファミリーメンバーの2つのエクトドメイン又はそれらの断片を含む第1のポリペプチド、及び前記TNFリガンドファミリーメンバーの1つのエクトドメイン又はその断片を含む第2のポリペプチドと
を含み、第1のポリペプチドが、そのN末端でFcドメインのサブユニットの一方のC末端側に融合されており、第2のポリペプチドが、そのN末端でFcドメインの他方のサブユニットのC末端に融合されており、TNFリガンドファミリーメンバーの2つのエクトドメイン又はそれらの断片を含む第1のポリペプチドが、配列番号176及び配列番号184からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、前記TNFリガンドファミリーメンバーの1つのエクトドメイン又はその断片を含む第2のポリペプチドが、配列番号172及び配列番号183からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むTNFファミリーリガンドトリマー含有抗原結合分子を提供する。
(a)配列番号46のアミノ酸配列を含むVHドメイン及び配列番号45のアミノ酸配列を含むVLドメインを含む、TnCと特異的に結合することができるFabドメインと、
(b)安定的に結合することができる第1及び第2のサブユニットから構成されるFcドメインと、
(c)ペプチドリンカーにより互いに接続されているTNFリガンドファミリーメンバーの2つのエクトドメイン又はそれらの断片を含む第1のポリペプチド、及びTNFリガンドファミリーメンバーの1つのエクトドメイン又はその断片を含む第2のポリペプチドと
を含み、第1のポリペプチドが、そのN末端でFcドメインのサブユニットの一方のC末端側に融合されており、第2のポリペプチドが、そのN末端でFcドメインの他方のサブユニットのC末端に融合されており、TNFリガンドファミリーメンバーの2つのエクトドメインを含む第1のポリペプチドが、配列番号184のアミノ酸配列を含み、前記TNFリガンドファミリーメンバーの1つのエクトドメインを含む第2のポリペプチドが、配列番号183のアミノ酸配列を含む、抗原結合分子が提供される。
(i)TnCと特異的に結合することができるFabドメインのVLドメインを含む軽鎖と、
(ii)Fcドメインの第1のサブユニットと、ペプチドリンカーにより互いに接続されているTNFリガンドファミリーメンバーの2つのエクトドメイン又はそれらの断片を含む第1のポリペプチドとを含む融合ポリペプチドであって、第1のポリペプチドがそのN末端でFcドメインの第1のサブユニットに融合されている、融合ポリペプチドと、
(iii)TnCと特異的に結合することができるFabドメインのVHドメインと、Fcドメインの第2のサブユニットと、TNFリガンドファミリーメンバーの1つのエクトドメイン又はその断片を含む第2のポリペプチドとを含む重鎖であって、TnCと特異的に結合することができるFabドメインの可変重鎖が、そのC末端でFcドメインの第2のサブユニットのN末端に融合されており、前記TNFリガンドファミリーメンバーの1つのエクトドメイン又はその断片を含む第2のポリペプチドが、そのN末端でFcドメインの第2のサブユニットのC末端に融合されている重鎖と
を含む、抗原結合分子が提供される。
(a)TnCと特異的に結合することができるFabドメインと、
(b)安定的に結合することができる第1及び第2のサブユニットから構成されるFcドメインと、
(c)ペプチドリンカーにより互いに接続されているTNFリガンドファミリーメンバーの2つのエクトドメイン又はそれらの断片を含む第1のポリペプチド、及び前記TNFリガンドファミリーメンバーの1つのエクトドメイン又はその断片を含む第2のポリペプチドと
を含み、第1のポリペプチドが、そのN末端でFcドメインのサブユニットの一方のC末端側に融合されており、第2のポリペプチドが、そのN末端でFcドメインの他方のサブユニットのC末端に融合されており、
(d)標的細胞抗原と特異的に結合することができないFabドメイン
を含む、抗原結合分子を提供する。
(a)TnCと特異的に結合することができるFab分子を両方が含む、第1の重鎖及び第1の軽鎖(この場合、第1の重鎖は、配列番号46のアミノ酸配列を含み、第1の軽鎖は配列番号45のアミノ酸配列を含む)と、
(b)第2のペプチドリンカーによりそのC末端でCLドメインに融合されている第1のペプチドリンカーによって互いに接続されているTNFリガンドファミリーメンバーの2つのエクトドメイン又はそれらの断片を含む第2の重鎖、及び第3のペプチドリンカーによりそのC末端がCH1ドメインに融合されているTNFリガンドファミリーメンバーの1つのエクトドメイン又はその断片を含む第2の軽鎖(この場合、第2の重鎖は、配列番号116又は配列番号120のアミノ酸配列を含み、第2の軽鎖は配列番号117又は配列番号121のアミノ酸配列を含む)と
を含むTNFファミリーリガンドトリマー含有抗原結合分子が提供される。特に、第2の重鎖は、配列番号116のアミノ酸配列を含み、第2の軽鎖は、配列番号117のアミノ酸配列を含む。
(a)TnCと特異的に結合することができる少なくとも1つの部分と、
(b)ジスルフィド結合により互いに連結されている第1及び第2のポリペプチドと
を含み、
第1のポリペプチドがCH3ドメインを含有すること、及び第2のポリペプチドがCH3ドメインを含有することをそれぞれ特徴とし、第1のポリペプチドが、ペプチドリンカーにより互いに及びCH3ドメインのC末端に接続されているTNFリガンドファミリーメンバーの2つのエクトドメイン若しくはそれらの断片を含み、第2のポリペプチドが、ペプチドリンカーによって前記ポリペプチドのCH3ドメインのC末端に接続されている前記TNFリガンドファミリーメンバーの1つのエクトドメイン若しくはその断片を含む抗原結合分子を提供する。
(i)配列番号127のアミノ酸配列を含む第1の重鎖、配列番号125のアミノ酸配列を含む第2の重鎖、及び配列番号77のアミノ酸配列を含む1つの軽鎖、又は
(ii)配列番号130のアミノ酸配列を含む第1の重鎖、配列番号131のアミノ酸配列を含む第2の重鎖、及び配列番号77のアミノ酸配列を含む1つの軽鎖、又は
(ii)配列番号124のアミノ酸配列を含む第1の重鎖、配列番号133のアミノ酸配列を含む第2の重鎖、及び配列番号77のアミノ酸配列を含む1つの軽鎖、又は
(ii)配列番号136のアミノ酸配列を含む第1の重鎖と、配列番号137のアミノ酸配列を含む第2の重鎖と、配列番号77のアミノ酸配列を含む1つの軽鎖
を含む、上文に記載のTNFファミリーリガンドトリマー含有抗原結合分子が提供される。
(i)配列番号112のアミノ酸配列を含む第1の重鎖、配列番号113のアミノ酸配列を含む第2の重鎖、及び配列番号77のアミノ酸配列を含む2つの軽鎖、又は
(ii)配列番号124のアミノ酸配列を含む第1の重鎖、配列番号125のアミノ酸配列を含む第2の重鎖、及び配列番号77のアミノ酸配列を含む2つの軽鎖
を含む、上文に記載のTNFファミリーリガンドトリマー含有抗原結合分子が提供される。
(i)TNCと特異的に結合することができるFabドメインのVLドメインを含む軽鎖と、
(ii)Fcドメインの第1のサブユニットと、TNFリガンドファミリーメンバーの1つのエクトドメイン又はその断片を含む第2のポリペプチドとを含む融合ポリペプチドであって、第2のポリペプチドが、そのN末端でFcドメインの第1のサブユニットのC末端に融合されている、融合ポリペプチドと、
(iii)TNCと特異的に結合することができるFabドメインのVHドメインと、Fcドメインの第2のサブユニットと、ペプチドリンカーにより互いに接続されているTNFリガンドファミリーメンバーの2つのエクトドメイン又はそれらの断片を含む第1のポリペプチドとを含む重鎖であって、TnCと特異的に結合することができるFabドメインの可変重鎖が、そのC末端でFcドメインの第2のサブユニットのN末端に融合されており、TNFリガンドファミリーメンバーの2つのエクトドメイン又はそれらの断片を含む第1のポリペプチドが、そのN末端でFcドメインの第2のサブユニットのC末端に融合されている、重鎖と
を含む、抗原結合分子が提供される。
(i)TnCと特異的に結合することができるFabドメインのVLドメインを含む第1の軽鎖と、
(ii)TnCと特異的に結合することができるFabドメインのVHドメインと、Fcドメインの第1のサブユニットと、前記TNFリガンドファミリーメンバーの1つのエクトドメイン又はその断片を含む第2のポリペプチドとを含む第1の重鎖であって、TnCと特異的に結合することができるFabドメインの可変重鎖が、そのC末端でFcドメインの第2のサブユニットのN末端に融合されており、第2のポリペプチドが、そのN末端でFcドメインの第1のサブユニットのC末端に融合されている、第1の重鎖と、
(iii)標的細胞抗原と特異的に結合することができないFabドメインのVHドメインと、Fcドメインの第2のサブユニットと、ペプチドリンカーにより互いに接続されているTNFリガンドファミリーメンバーの2つのエクトドメイン又はそれらの断片を含む第1のポリペプチドとを含む第2の重鎖であって、標的細胞抗原と特異的に結合することができないFabドメインの可変重鎖が、そのC末端でFcドメインの第2のサブユニットのN末端に融合されており、TNFリガンドファミリーメンバーの2つのエクトドメイン又はそれらの断片を含む第1のポリペプチドが、そのN末端でFcドメインの第2のサブユニットのC末端に融合されている第2の重鎖と、
(iv)標的細胞抗原と特異的に結合することができないFabドメインのVLドメインを含む第2の軽鎖と
を含む、抗原結合分子が提供される。
(i)TnCと特異的に結合することができるFabドメインのVLドメインを含む第1の軽鎖と、
(ii)TnCと特異的に結合することができるFabドメインのVHドメインと、Fcドメインの第1のサブユニットと、ペプチドリンカーにより互いに接続されているTNFリガンドファミリーメンバーの2つのエクトドメイン又はそれらの断片を含む第1のポリペプチドとを含む第1の重鎖であって、TnCと特異的に結合することができるFabドメインの可変重鎖が、そのC末端でFcドメインの第2のサブユニットのN末端に融合されており、TNFリガンドファミリーメンバーのエクトドメイン又はそれらの断片を含む第1のポリペプチドが、そのN末端でFcドメインの第1のサブユニットのC末端に融合されている、第1の重鎖と、
(iii)標的細胞抗原と特異的に結合することができないFabドメインのVHドメインと、Fcドメインの第2のサブユニットと、前記TNFリガンドファミリーメンバーの1つのエクトドメイン又はその断片を含む第2のポリペプチドとを含む第2の重鎖であって、標的細胞抗原と特異的に結合することができないFabドメインの可変重鎖が、そのC末端でFcドメインの第2のサブユニットのN末端に融合されており、TNFリガンドファミリーメンバーの1つのエクトドメイン又はその断片を含む第2のポリペプチドが、そのN末端でFcドメインの第2のサブユニットのC末端に融合されている、第2の重鎖と、
(iv)標的細胞抗原と特異的に結合することができないFabドメインのVLドメインを含む第2の軽鎖と
を含む抗原結合分子が提供される。
a)配列番号104のアミノ酸配列と少なくとも約95%、96%、97%、98%、99%若しくは100%同一であるアミノ酸配列を含む第1の重鎖、配列番号77のアミノ酸配列と少なくとも約95%、96%、97%、98%、99%若しくは100%同一であるアミノ酸配列を含む第1の軽鎖、配列番号102のアミノ酸配列と少なくとも約95%、96%、97%、98%、99%若しくは100%同一であるアミノ酸配列を含む第2の重鎖、及び配列番号103のアミノ酸配列と少なくとも約95%、96%、97%、98%、99%若しくは100%同一であるアミノ酸配列を含む第2の軽鎖、又は
b)配列番号104のアミノ酸配列と少なくとも約95%、96%、97%、98%、99%若しくは100%同一であるアミノ酸配列を含む第1の重鎖、配列番号77のアミノ酸配列と少なくとも約95%、96%、97%、98%、99%若しくは100%同一であるアミノ酸配列を含む第1の軽鎖、配列番号108のアミノ酸配列と少なくとも約95%、96%、97%、98%、99%若しくは100%同一であるアミノ酸配列を含む第2の重鎖、及び配列番号109のアミノ酸配列と少なくとも約95%、96%、97%、98%、99%若しくは100%同一であるアミノ酸配列を含む第2の軽鎖、又は
(c)配列番号112のアミノ酸配列と少なくとも約95%、96%、97%、98%、99%若しくは100%同一であるアミノ酸配列を含む第1の重鎖、配列番号113のアミノ酸配列と少なくとも約95%、96%、97%、98%、99%若しくは100%同一であるアミノ酸配列を含む第2の重鎖、及び配列番号77のアミノ酸配列と少なくとも約95%、96%、97%、98%、99%若しくは100%同一であるアミノ酸配列を含む2つの軽鎖、又は
d)配列番号104のアミノ酸配列と少なくとも約95%、96%、97%、98%、99%若しくは100%同一であるアミノ酸配列を含む第1の重鎖、配列番号77のアミノ酸配列と少なくとも約95%、96%、97%、98%、99%若しくは100%同一であるアミノ酸配列を含む第1の軽鎖、配列番号116のアミノ酸配列と少なくとも約95%、96%、97%、98%、99%若しくは100%同一であるアミノ酸配列を含む第2の重鎖、及び配列番号117のアミノ酸配列と少なくとも約95%、96%、97%、98%、99%若しくは100%同一であるアミノ酸配列を含む第2の軽鎖、又は
e)配列番号104のアミノ酸配列と少なくとも約95%、96%、97%、98%、99%若しくは100%同一であるアミノ酸配列を含む第1の重鎖、配列番号77のアミノ酸配列と少なくとも約95%、96%、97%、98%、99%若しくは100%同一であるアミノ酸配列を含む第1の軽鎖、配列番号120のアミノ酸配列と少なくとも約95%、96%、97%、98%、99%若しくは100%同一であるアミノ酸配列を含む第2の重鎖、及び配列番号121のアミノ酸配列と少なくとも約95%、96%、97%、98%、99%若しくは100%同一であるアミノ酸配列を含む第2の軽鎖、又は
(f)配列番号124のアミノ酸配列と少なくとも約95%、96%、97%、98%、99%若しくは100%同一であるアミノ酸配列を含む第1の重鎖、配列番号125のアミノ酸配列と少なくとも約95%、96%、97%、98%、99%若しくは100%同一であるアミノ酸配列を含む第2の重鎖、及び配列番号77のアミノ酸配列と少なくとも約95%、96%、97%、98%、99%若しくは100%同一であるアミノ酸配列を含む2つの軽鎖、又は
(g)配列番号127のアミノ酸配列と少なくとも約95%、96%、97%、98%、99%若しくは100%同一であるアミノ酸配列を含む第1の重鎖、配列番号128のアミノ酸配列と少なくとも約95%、96%、97%、98%、99%若しくは100%同一であるアミノ酸配列を含む第2の重鎖、及び配列番号77のアミノ酸配列と少なくとも約95%、96%、97%、98%、99%若しくは100%同一であるアミノ酸配列を含む1つの軽鎖、又は
(h)配列番号130のアミノ酸配列と少なくとも約95%、96%、97%、98%、99%若しくは100%同一であるアミノ酸配列を含む第1の重鎖、配列番号131のアミノ酸配列と少なくとも約95%、96%、97%、98%、99%若しくは100%同一であるアミノ酸配列を含む第2の重鎖、及び配列番号77のアミノ酸配列と少なくとも約95%、96%、97%、98%、99%若しくは100%同一であるアミノ酸配列を含む1つの軽鎖、又は
(i)配列番号124のアミノ酸配列と少なくとも約95%、96%、97%、98%、99%若しくは100%同一であるアミノ酸配列を含む第1の重鎖、配列番号133のアミノ酸配列と少なくとも約95%、96%、97%、98%、99%若しくは100%同一であるアミノ酸配列を含む第2の重鎖、及び配列番号77のアミノ酸配列と少なくとも約95%、96%、97%、98%、99%若しくは100%同一であるアミノ酸配列を含む1つの軽鎖、又は
(j)配列番号136のアミノ酸配列と少なくとも約95%、96%、97%、98%、99%若しくは100%同一であるアミノ酸配列を含む第1の重鎖、配列番号137のアミノ酸配列と少なくとも約95%、96%、97%、98%、99%若しくは100%同一であるアミノ酸配列を含む第2の重鎖、及び配列番号77のアミノ酸配列と少なくとも約95%、96%、97%、98%、99%若しくは100%同一であるアミノ酸配列を含む1つの軽鎖
を含むTNFファミリーリガンドトリマー含有抗原結合分子が提供される。
a)配列番号104のアミノ酸配列を含む第1の重鎖、配列番号77のアミノ酸配列を含む第1の軽鎖、配列番号102のアミノ酸配列を含む第2の重鎖、及び配列番号103のアミノ酸配列を含む第2の軽鎖を含む分子、
b)配列番号104のアミノ酸配列を含む第1の重鎖、配列番号77のアミノ酸配列を含む第1の軽鎖、配列番号108のアミノ酸配列を含む第2の重鎖、及び配列番号109のアミノ酸配列を含む第2の軽鎖を含む分子、
(c)配列番号112のアミノ酸配列を含む第1の重鎖、配列番号113のアミノ酸配列を含む第2の重鎖、及び配列番号77のアミノ酸配列を含む2つの軽鎖を含む分子、
d)配列番号104のアミノ酸配列を含む第1の重鎖、配列番号77のアミノ酸配列を含む第1の軽鎖、配列番号116のアミノ酸配列を含む第2の重鎖、及び配列番号117のアミノ酸配列を含む第2の軽鎖を含む分子、
e)配列番号104のアミノ酸配列を含む第1の重鎖、配列番号77のアミノ酸配列を含む第1の軽鎖、配列番号120のアミノ酸配列を含む第2の重鎖、及び配列番号121のアミノ酸配列を含む第2の軽鎖を含む分子、
(f)配列番号124のアミノ酸配列を含む第1の重鎖、配列番号125のアミノ酸配列を含む第2の重鎖、及び配列番号77のアミノ酸配列を含む2つの軽鎖を含む分子、
(g)配列番号127のアミノ酸配列を含む第1の重鎖、配列番号128のアミノ酸配列を含む第2の重鎖、及び配列番号77のアミノ酸配列を含む1つの軽鎖を含む分子、
(h)配列番号130のアミノ酸配列を含む第1の重鎖、配列番号131のアミノ酸配列を含む第2の重鎖、及び配列番号77のアミノ酸配列を含む1つの軽鎖を含む分子、
(i)配列番号124のアミノ酸配列を含む第1の重鎖、配列番号133のアミノ酸配列を含む第2の重鎖、及び配列番号77のアミノ酸配列を含む1つの軽鎖を含む分子、
(j)配列番号136のアミノ酸配列を含む第1の重鎖、配列番号137のアミノ酸配列を含む第2の重鎖、及び配列番号77のアミノ酸配列を含む1つの軽鎖を含む分子
からなる群から選択されるTNFファミリーリガンドトリマー含有抗原結合分子に関する。
(i)配列番号67又は配列番号70のアミノ酸配列を含むCDR-H1と、
(ii)配列番号68又は配列番号71のアミノ酸配列を含むCDR-H2と、
(iii)配列番号69又は配列番号72のアミノ酸配列を含むCDR-H3と
を含むVHドメイン、及び
(iv)配列番号55又は配列番号58のアミノ酸配列を含むCDR-L1と、
(v)配列番号56又は配列番号59のアミノ酸配列を含むCDR-L2と、
(vi)配列番号57又は配列番号60のアミノ酸配列を含むCDR-L3と
を含むVLドメイン
を含むTNFファミリーリガンドトリマー含有抗原結合分子が提供される。
(i)配列番号46のアミノ酸配列を含むVHドメインを含む第1の重鎖、及び配列番号45のアミノ酸配列を含むVLドメインを含む第1の軽鎖、又は配列番号48のアミノ酸配列を含むVHドメインを含む第1の重鎖、及び配列番号47のアミノ酸配列を含むVLドメインを含む第1の軽鎖と、
(ii)配列番号195からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む第2の重鎖と、
(iii)配列番号196のアミノ酸配列を含む第2の軽鎖と
を含む。
本発明は、本明細書に記載の抗原結合分子をコードする単離されたポリヌクレオチド又はその断片をさらに提供する。
本発明の抗原結合分子は、例えば、固相ペプチド合成(例えば、メリフィールド固相合成)又は組換え産生によって得ることができる。組換え産生の場合、抗原結合分子又はそのポリペプチド断片をコードする1つ又は複数のポリヌクレオチド、例えば上で説明したようなポリヌクレオチドは、宿主細胞におけるさらなるクローニング及び/又は発現のために、単離され、1つ又は複数のベクターに挿入される。そのようなポリヌクレオチドは、従来の手順を使用して容易に単離及び配列決定することができる。本発明の一態様では、本発明のポリヌクレオチドのうちの1つ又は複数を含むベクター、好ましくは、発現ベクターが提供される。当業者に周知である方法を使用して、抗原結合分子(断片)のコード配列を適切な転写/翻訳制御シグナルと共に含有する発現ベクターを構築することができる。これらの方法には、インビトロ組換えDNA手法、合成手法及びインビボ組換え/遺伝子組換えが含まれる。例えば、Maniatis等、MOLECULAR CLONING:A LABORATORY MANUAL、Cold Spring Harbor Laboratory、N.Y.(1989);及びAusubel等、CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY、Greene Publishing Associates and Wiley Interscience、N.Y.(1989)に記載の手法を参照されたい。発現ベクターは、プラスミドの一部、ウイルスであることができ、又は核酸断片であってもよい。発現ベクターは、発現カセットを含む、抗原結合分子又はそのポリペプチド断片(すなわち、コード化領域)をコードするポリヌクレオチドが、プロモーター及び/又は他の転写若しくは翻訳制御エレメントと作動可能に結合した状態で発現カセットにクローニングされる。本明細書で使用される「コード化領域」は、アミノ酸に翻訳されるコドンからなる核酸の一部分である。「終止コドン」(TAG、TGA又はTAA)は、アミノ酸に翻訳されないが、存在する場合にはコード化領域の一部とみなされることがあり、しかし、何れの隣接配列も、例えば、プロモーター、リボソーム結合部位、転写ターミネーター、イントロン、5’及び3’非翻訳領域等は、コード化領域の一部ではない。2つ以上のコード化領域が、単一のポリヌクレオチドコンストラクト内に、例えば単一のベクター上に、存在することができ、又は別々のポリヌクレオチドコンストラクト内に、例えば、別々の(異なる)ベクター上に存在することができる。さらに、何れのベクターも、単一のコード化領域を含有することができ、又は2つ以上のコード化領域を含むことができ、例えば、本発明のベクターは、タンパク質切断による後翻訳又は共翻訳によって最終タンパク質に分離される1つ又は複数のポリペプチドをコードすることができる。加えて、本発明のベクター、ポリヌクレオチド又は核酸は、本発明の抗原結合分子若しくはそのポリペプチド断片又はそれらの変異体若しくは誘導体をコードするポリヌクレオチドに融合されている又は融合されていない、異種コード化領域をコードすることができる。異種コード配列には、限定ではないが、特殊化したエレメント又はモチーフ、例えば、分泌シグナルペプチド又は異種機能性ドメインが含まれる。作動可能な結合は、遺伝子産物の発現が調節配列の影響下又は制御下で起こるように遺伝子産物、例えばポリペプチド、のコード化領域が1つ又は複数の調節配列と結合している場合である。2つのDNA断片(例えば、ポリペプチドコード化領域及びそれと結合しているプロモーター)は、プロモーター機能の誘導が、所望の遺伝子産物をコードするmRNAの転写をもたらす場合、及び2つのDNA断片間の結合の性質が、遺伝子産物の発現を指示する発現調節配列の能力に干渉しない、又は転写されるDNAテンプレートの能力に干渉しない場合、「作動可能に結合している」。したがって、プロモーター領域とポリペプチドをコードする核酸とは、プロモーターがその核酸の転写を果たすことができた場合、作動可能に結合していることになる。プロモーターは、所定の細胞内でのみDNAの実質的転写を指示する細胞特異的プロモーターであってもよい。プロモーターに加えて他の転写制御エレメント、例えば、エンハンサー、オペレーター、リプレッサー、及び転写終結シグナルを、ポリヌクレオチドと作動可能に結合させて、細胞特異的転写を指示することもできる。
本明細書で提供される抗原結合分子を、当該技術分野で公知の様々なアッセイにより、同定することができ、それらの物理的/化学的特性及び/又は生物活性についてスクリーニングすること又は特徴を明らかにすることができる。
本明細書で提供される抗原結合分子のTnCに対する及び/又は対応するTNF受容体に対するアフィニティーを、BIAcore装置(GE Healthcare)等の標準的計測手段と、受容体又は標的タンパク質、例えば組換え発現により得ることができるものとを使用して、表面プラズモン共鳴(SPR)により、実施例に記載の方法に従って判定することができる。TNFファミリーリガンドトリマー含有抗原結合分子の標的細胞抗原に対するアフィニティーも、BIAcore装置(GE Healthcare)等の標準的計測手段と、受容体又は標的タンパク質、例えば組換え発現により得ることができるものとを使用して、表面プラズモン共鳴(SPR)により判定することができる。結合アフィニティーの測定についての説明に役立つ例示的な具体的実施態様を実施例4に記載する。一態様によれば、KDは、BIACORE(登録商標)T100マシン(GE Healthcare)を使用して25℃で表面プラズモン共鳴により測定される。
本明細書で提供されるTNFファミリーリガンドトリマー含有抗原結合分子の対応する受容体発現細胞への結合は、特定の受容体又は標的細胞抗原を発現する細胞株を使用して、例えばフローサイトメトリー(FACS)により、評価することができる。一態様では、TNF受容体を発現する新鮮な抹消血単核細胞(PBMC)が結合アッセイに使用される。これらの細胞は、単離後に直接使用される(ナイーブPMBC)か、又は刺激後に使用される(活性化PMBC)。別の態様では、活性化マウス脾細胞(TNF受容体分子を発現する)を使用して、本発明のTNFファミリーリガンドトリマー含有抗原結合分子の対応するTNF受容体発現細胞への結合を実証した。
一態様では、特定の標的細胞抗原と結合し、生物活性を有する特定のTNF受容体と結合する、TNFファミリーリガンドトリマー含有抗原結合分子を同定するためのアッセイが提供される。生物活性としては、例えば、標的細胞抗原を発現する細胞上のTNF受容体によるアゴニストシグナル伝達を挙げることができる。アッセイによりインビトロでそのような生物活性を有すると同定されたTNFファミリーリガンドトリマー含有抗原結合分子も提供される。
さらなる態様では、本発明は、本明細書で提供される抗原結合分子の何れかを含む薬学的組成物であって、例えば、下記治療方法の何れかにおいて使用するための薬学的組成物が提供される。一実施態様では、薬学的組成物は、本明細書で提供される抗原結合分子の何れかと、少なくとも1つの薬学的に許容される添加剤とを含む。別の実施態様では、薬学的組成物は、本明細書で提供される抗原結合分子の何れかと、少なくとも1つのさらなる治療剤、例えば下記のものとを含む。
本明細書で提供される抗原結合分子の何れを治療方法に使用してもよい。治療方法での使用のために、本発明の抗原結合分子を、医学行動規範と一致した様式で製剤化、投薬及び投与することができる。これに関連して考慮する因子としては、治療されることになる特定の障害、治療されることになる特定の哺乳動物、個々の患者の臨床症状、障害の原因、薬剤の送達部位、投与方法、投与スケジュール、及び医療施術者に公知の他の因子が挙げられる。
本発明の抗原結合分子を治療の際に1つ又は複数の他の薬剤と組み合わせて投与してもよい。例えば、本発明の融合タンパク質を少なくとも1つのさらなる治療剤と共投与してもよい。用語「治療剤」は、そのような治療を必要とする個体において症候又は疾患を治療するために投与することができる任意の薬剤を包含する。そのようなさらなる薬剤は、治療することになる特定の適応症に好適な任意の活性成分、好ましくは、互いに有害に作用しない相補的活性を有するものを含み得る。ある特定の実施態様では、さらなる治療剤は、別の抗がん剤である。
本発明の別の態様では、上記の障害の治療、予防及び/又は診断に有用な材料を含有する製造品が提供される。製造品は、容器と、その容器上の又はその容器に付随するラベル又は添付文書を含む。好適な容器としては、例えば、ボトル、バイアル、注射器、IV溶液バッグ等が挙げられる。容器は、ガラス又はプラスチック等の様々な材料から形成されたものであり得る。容器は、単独である組成物を保持するか、又は状態の治療、予防及び/若しくは診断に有効な別の組成物と組み合わされた組成物を保持し、滅菌アクセスポートを有することができる(例えば、容器は、静脈内溶液バッグであってもよく、又は皮下注射針によって穿刺可能なストッパーを有するバイアルであってもよい)。組成物中の少なくとも1種の活性薬剤は、本発明の抗原結合分子である。
1. TNFファミリーリガンドトリマー含有抗原結合分子であって、
(a)テネイシンC(TnC)と特異的に結合することができる少なくとも1つの部分と、
(b)ジスルフィド結合により互いに連結されている第1及び第2のポリペプチドと
を含み、
第1のポリペプチドが、ペプチドリンカーにより互いに接続されているTNFリガンドファミリーメンバーの2つのエクトドメイン又はそれらの断片を含むこと、及び第2のポリペプチドが、前記TNFリガンドファミリーメンバーの1つだけのエクトドメイン又はその断片を含むことを特徴とする抗原結合分子。
(a)テネイシンC(TnC)と特異的に結合することができる少なくとも1つの抗原結合部分と、
(b)ジスルフィド結合により互いに連結されている第1及び第2のポリペプチドと
を含み、
第1のポリペプチドが、ペプチドリンカーにより互いに接続されているTNFリガンドファミリーメンバーの2つのエクトドメイン又はそれらの断片を含むこと、及び第2のポリペプチドが、前記TNFリガンドファミリーメンバーの1つだけのエクトドメイン又はその断片を含むことを特徴とする抗原結合分子。
をさらに含む、実施態様1又は2のTNFファミリーリガンドトリマー含有抗原結合分子。
(a)TnCと特異的に結合することができる少なくとも1つの部分と、
(b)ジスルフィド結合により互いに連結されている第1及び第2のポリペプチドと
を含み、
(i)第1のポリペプチドがCH1若しくはCLドメインを含有すること、及び第2のポリペプチドがCL若しくはCH1ドメインを含有することをそれぞれ特徴とし、第2のポリペプチドが、CH1ドメインとCLドメイン間のジスルフィド結合により第1のポリペプチドと連結されており、第1のポリペプチドが、ペプチドリンカーにより互いに及びCH1若しくはCLドメインに接続されているTNFリガンドファミリーメンバーの2つのエクトドメイン若しくはそれらの断片を含み、第2のポリペプチドが、ペプチドリンカーによって前記ポリペプチドのCL若しくはCH1ドメインに接続されている、前記TNFリガンドファミリーメンバーの1つのエクトドメイン若しくはその断片を含む、又は
(ii)第1のポリペプチドがCH3ドメインを含有すること、及び第2のポリペプチドがCH3ドメインを含有することをそれぞれ特徴とし、第1のポリペプチドが、ペプチドリンカーにより互いに及びCH3ドメインのC末端に接続されているTNFリガンドファミリーメンバーの2つのエクトドメイン若しくはそれらの断片を含み、第2のポリペプチドが、ペプチドリンカーによって前記ポリペプチドのCH3ドメインのC末端に接続されている前記TNFリガンドファミリーメンバーの1つだけのエクトドメイン若しくはその断片を含む、又は
(iii)第1のポリペプチドがVH-CL若しくはVL-CH1ドメインを含有すること、及び第2のポリペプチドがVL-CH1ドメイン若しくはVH-CLドメインを含有することをそれぞれ特徴とし、第2のポリペプチドが、CH1ドメインとCLドメイン間のジスルフィド結合により第1のポリペプチドと連結されており、第1のポリペプチドが、ペプチドリンカーにより互いに及びVH若しくはVLに接続されているTNFリガンドファミリーメンバー2つのエクトドメイン若しくはそれらの断片を含み、第2のポリペプチドが、ペプチドリンカーによって前記ポリペプチドのVL若しくはVHに接続されている前記TNFリガンドファミリーメンバーの1つのエクトドメイン若しくはその断片を含む、
実施態様1から3の何れか一実施態様の抗原結合分子。
(a)TnCと特異的に結合することができる少なくとも1つの部分と、
(b)ジスルフィド結合により互いに連結されている第1及び第2のポリペプチドと
を含み、
第1のポリペプチドが、配列番号176、配列番号184、配列番号185及び配列番号186からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むこと、及び第2のポリペプチドが、配列番号172、配列番号174、配列番号175及び配列番号183からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むことを特徴とする、実施態様1から9の何れか一実施態様の抗原結合分子。
(a)TnCと特異的に結合することができる少なくとも1つの部分と、
(b)CH1又はCLドメインを含有する第1のポリペプチド、及びCL又はCH1ドメインを含有する第2のポリペプチドと
をそれぞれ含み、第2のポリペプチドが、CH1ドメインとCLドメイン間のジスルフィド結合により第1のポリペプチドと連結されており、
第1のポリペプチドが、ペプチドリンカーにより互いに及びCH1又はCLドメインに接続されているTNFリガンドファミリーメンバーの2つのエクトドメイン又はそれらの断片を含むこと、及び第2のポリペプチドが、ペプチドリンカーによって前記ポリペプチドのCL又はCH1ドメインに接続されている前記TNFリガンドファミリーメンバーの1つだけのエクトドメイン又はその断片を含むことを特徴とする、実施態様1から10の何れか一実施態様の抗原結合分子。
(b)配列番号176、配列番号184、配列番号185及び配列番号186からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む第2の重鎖、並びに配列番号172、配列番号174、配列番号175及び配列番号183からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む第2の軽鎖
を含む、実施態様1から23の何れか一実施態様のTNFファミリーリガンドトリマー含有抗原結合分子。
配列番号48のアミノ酸配列を含むVHドメインを含む第1の重鎖、及び配列番号47のアミノ酸配列を含むVLドメインを含む第1の軽鎖と、
(ii)配列番号178のアミノ酸配列を含む第2の重鎖と、
(iii)配列番号179のアミノ酸配列を含む第2の軽鎖と
を含む、実施態様1から20の何れか一実施態様のTNFファミリーリガンドトリマー含有抗原結合分子。
配列番号48のアミノ酸配列を含むVHドメインを含む第1の重鎖、及び配列番号47のアミノ酸配列を含むVLドメインを含む第1の軽鎖と、
(ii)配列番号102、配列番号108、配列番号116及び配列番号120からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む第2の重鎖と、
(iii)配列番号103、配列番号109、配列番号117及び配列番号121からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む第2の軽鎖と
を含む、実施態様1から19及び21の何れか一実施態様のTNFファミリーリガンドトリマー含有抗原結合分子。
(b)ジスルフィド結合により互いに連結されている第1及び第2のポリペプチドと
を含み、
第1のポリペプチドがCH3ドメインを含有すること、及び第2のポリペプチドがCH3ドメインを含有することをそれぞれ特徴とし、第1のポリペプチドが、ペプチドリンカーにより互いに及びCH3ドメインのC末端に接続されているTNFリガンドファミリーメンバーの2つのエクトドメイン若しくはそれらの断片を含み、第2のポリペプチドが、ペプチドリンカーによって前記ポリペプチドのCH3ドメインのC末端に接続されている前記TNFリガンドファミリーメンバーの1つのエクトドメイン若しくはその断片を含む、実施態様1から18の何れか一実施態様のTNFファミリーリガンドトリマー含有抗原結合分子。
(ii)配列番号130のアミノ酸配列を含む第1の重鎖、配列番号131のアミノ酸配列を含む第2の重鎖、及び配列番号77のアミノ酸配列を含む1つの軽鎖、又は
(ii)配列番号124のアミノ酸配列を含む第1の重鎖、配列番号133のアミノ酸配列を含む第2の重鎖、及び配列番号77のアミノ酸配列を含む1つの軽鎖、又は
(ii)配列番号136のアミノ酸配列を含む第1の重鎖と、配列番号137のアミノ酸配列を含む第2の重鎖、及び配列番号77のアミノ酸配列を含む1つの軽鎖
を含む、実施態様27のTNFファミリーリガンドトリマー含有抗原結合分子。
(ii)配列番号124のアミノ酸配列を含む第1の重鎖、配列番号125のアミノ酸配列を含む第2の重鎖、及び配列番号77のアミノ酸配列を含む2つの軽鎖
を含む、実施態様27又は29の何れか一実施態様のTNFファミリーリガンドトリマー含有抗原結合分子。
(b)ジスルフィド結合により互いに連結されている第1及び第2のポリペプチドと
を含み、
第1のポリペプチドが、配列番号190又は配列番号191のアミノ酸配列を含むこと、及び第2のポリペプチドが、配列番号181又は配列番号182のアミノ酸配列を含むことを特徴とする、実施態様1から6、11から23、27から29、31及び32の何れか一実施態様のTNFファミリーリガンドトリマー含有抗原結合分子。
配列番号48のアミノ酸配列を含むVHドメインを含む第1の重鎖、及び配列番号47のアミノ酸配列を含むVLドメインを含む第1の軽鎖と、
(ii)配列番号195からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む第2の重鎖と、
(iii)配列番号196のアミノ酸配列を含む第2の軽鎖と
を含む、実施態様1から6、11から23、27から29及び31から36の何れか一実施態様のTNFファミリーリガンドトリマー含有抗原結合分子。
(i)実施態様48の宿主細胞を抗原結合分子の発現に好適な条件下で培養するステップ、及び
(ii)抗原結合分子を回収するステップ
を含む方法
Sambrook,J.等、Molecular cloning:A laboratory manual;Cold Spring Harbor Laboratory Press、Cold Spring Harbor、New York、1989に記載されているような標準的方法を使用してDNAを操作した。分子生物学試薬は、製造業者の説明書に従って使用した。DNA配列は、二本鎖配列決定により決定した。一部のケースでは、Geneart AG(Regensburg、Germany)が自動遺伝子合成により合成オリゴヌクレオチド及びPCR産物から所望の遺伝子セグメントを調製した。単一の制限エンドヌクレアーゼ切断部位が隣接している遺伝子セグメントを、記述のプラスミドにクローニングした。形質転換された細菌からプラスミドDNAを精製し、UV分光法により濃度を決定した。サブクローニングされた遺伝子断片のDNA配列をDNA配列決定により確認した。好適な制限部位を用いて、それぞれの発現ベクターへのサブクローニングを可能にするように遺伝子セグメントを設計した。
Current Protocols in Cell Biology(2000)、Bonifacino,J.S.、Dasso,M.、Harford,J.B.、Lippincott-Schwartz,J及びYamada,K.M.(編)、John Wiley & Sons,Incに記載されているような、標準的な細胞培養手法を使用した。
標準的プロトコールを参照して、濾過した細胞培養上清からタンパク質を精製した。簡単に言うと、抗体をプロテインAセファロースカラム(GE healthcare)に供し、PBSで洗浄した。抗体の溶出をpH2.8で行い、その直後に試料を中和した。凝集したタンパク質を、モノマー抗体から、PBS中又は20mM ヒスチジン、150mM NaCl pH6.0中で、サイズ排除クロマトグラフィー(Superdex 200、GE Healthcare)により分離した。モノマー抗体画分をプールし、例えばMILLIPORE Amicon Ultra(30 MWCO)遠心濃縮器を(必要に応じて)使用して濃縮し、凍結し、-20℃又は-80℃で保管した。試料の一部は、例えばSDS-PAGE、サイズ排除クロマトグラフィー(SEC)又は質量分析による、後のタンパク質分析及び分析的特徴づけに供した。
NuPAGE(登録商標)Pre-Castゲルシステム(Invitrogen)を製造業者の説明書に従って使用した。具体的には、10%又は4-12%NuPAGE(登録商標)Novex(登録商標)Bis-TRIS Pre-Castゲル(pH6.4)及びNuPAGE(登録商標)MES(還元ゲル、NuPAGE(登録商標)抗酸化剤ランニングバッファー添加剤を伴う)又はMOPS(非還元ゲル)ランニングバッファーを使用した。
抗体の凝集及びオリゴマー状態を判定するためのサイズ排除クロマトグラフィー(SEC)を、HPLCクロマトグラフィーにより行った。簡単に言うと、300mM NaCl、50mM KH2PO4/K2HPO4、pH7.5中のプロテインA精製抗体をAgilent HPLC 1100システム上のTosoh TSKgel G3000SWカラムに、又は2xPBS中のプロテインA精製抗体をDionex HPLCシステム上のSuperdex 200カラム(GE Healthcare)に供した。UV吸光度、及びピーク面積の積分により、溶出タンパク質を定量した。BioRadゲル濾過スタンダード151-1901が、標準として用いられた。
このセクションは、VH/VL交換された多重特異性抗体(VH/VL CrossMabs)の特徴づけを、それらの正しい構築に重点を置いて説明する。予想一次構造を、脱グリコシル化されたインタクトなCrossMabについての及び脱グリコシル化/プラスミン消化された又は代替的に脱グリコシル化/限定LysC消化されたCrossMabについてのエレクトロスプレーイオン化質量分析(ESI-MS)により分析した。
生成された抗体のそれぞれの抗原への結合は、BIACORE装置(GE Healthcare Biosciences AB、Uppsala、Sweden)を使用して、表面プラズモン共鳴により調査する。簡単に言うと、アフィニティー測定のために、ヤギ抗ヒトIgG、JIR 109-005-098抗体を、それぞれの抗原に対する抗体の提示のためにCM5チップ上にアミンカップリングによって固定化する。結合を、HBSバッファー(HBS-P(10mM HEPES、150mM NaCl、0.005%Tween 20、ph7.4)中、25℃で(又は代替的に37℃で)測定する。抗原(R&D Systems又は社内で精製したもの)を溶液中の様々な濃度で添加する。80秒から3分の抗原注入により結合を測定し、チップ表面をHBSバッファーで3-10分間洗浄することにより解離を測定し、1:1ラングミュア結合モデルを使用してKD値を推定した。系固有のベースラインドリフトの補正のために、及びノイズシグナル低減のために、試料曲線からネガティブコントロールデータ(例えば、緩衝曲線)を減算する。センサーグラムの分析に、及びアフィニティーデータの計算に、それぞれのBiacore Evaluation Softwareを使用する。
TnC抗原配列及び抗原の産生
表3及び表4の全てのコンストラクトをGSTのC末端に融合させ、大腸菌BL21(DE3)において発現させる。部位特異的ビオチン化のために、テネイシン配列のC末端にAviタグを付加させ、BirAビオチンリガーゼを別のプラスミド(Avidity、Colorado、USA)上で共発現させた。増殖培地は、100μg/mlのアンピシリン及び20μg/mlのクロラムフェニコールを含有する2YTであった。ビオチンを添加して50μMの最終濃度にした。1mM IPTGを用いて22℃で一晩、タンパク質発現を誘導した。細胞を遠心分離により回収し、B-PER試薬(pierce 78260)及び1mg/mlのリゾチーム(Sigma L6876)の存在下での超音波処理により細胞溶解を行った。溶解物を遠心分離し、清澄化された溶解物をグルタチオンセファロースカラム(GE Healthcare;製品番号17-0756-01)に負荷した。洗浄後、TnC分子をトロンビン(Sigma Aldrich、製品番号10602400001)によって一晩、4℃でGSTから切断した。溶出は、50mM Trisバッファー pH8.0、200mM NaCl、5mM MgCl2、1mM DTT及び10%グリセロール中で行った。最終精製ステップは、ゲル濾過カラム(Superdex 75 16/60、GE Healthcare)を用いて行った。試料は、処理するまで液体窒素で急速冷凍しておいた。
一般的Fabライブラリーからの抗TnC抗体の選択
抗TnC抗体を、DP88-4(クローン18D4)及びラムダDP47(クローン11C7)という2つの異なる一般的ファージディスプレイライブラリーから選択した。
Dp88-4ライブラリーは、軽鎖(L3、3つの異なる長さ)のCDR3及び重鎖(H3、3つの異なる長さ)のCDR3内に無作為化配列スペースを含むVk1_5(カッパ軽鎖)及びVH1_69(重鎖)のVドメインペアリングを使用して、ヒト生殖細胞系遺伝子に基づいて構築した。ライブラリー生成は、オーバーラップ伸長スプライシング(SOE)PCRによる3つのpPCR増幅断片のアセンブリーによって行った。断片1は、無作為化L3を含む抗体遺伝子の5’末端を含み、断片2は、L3からH3に及ぶ中心コンストラクト断片であるのに対して、断片3は、無作為化H3、及び抗体遺伝子の3’部分を含む。次のプライマーの組合せをそれぞれ使用して、DP88-4ライブラリー用のこれらのライブラリー断片を生成した:断片1(リバースプライマーVk1_5_L3r_S又はVk1_5_L3r_SY又はVk1_5_L3r_SPYと組み合わせたフォワードプライマーLMB3)、断片2(リバースプライマーRJH32と組み合わせたフォワードプライマーRJH31)及び断片3(リバースプライマーfdseqlongと組み合わせたフォワードプライマーDP88-v4-4又はDP88-v4-6又はDP88-v4-8)。ライブラリー断片の生成のためのPCRパラメータは、94℃での5分の初期変性、1分94℃、1分58℃、1分72℃の25サイクル、そして10分間72℃での末端伸長であった。等モル比のゲル精製された単一断片を鋳型として使用するアセンブリーPCRのためのパラメータは、94℃で3分の初期変性、そして30秒94℃、1分58℃、2分72℃の5サイクルであった。この段階で、外部プライマー(LMB3及びfdseqlong)を添加し、さらなる20サイクルを行った後、10分間72℃で末端伸長を行った。十分な量の完全長無作為化Fabコンストラクトのアセンブリー後、それらをNcoI/NheI消化し、同様に処理したアクセプターファージミドベクターにライゲーションした。精製されたライゲーション体を、エレクトロコンピテント大腸菌TG1への~60回の形質転換に使用した。Fabライブラリーを呈示するファージミド粒子をレスキューし、選択に使用することができるようにPEG/NaCl精製により精製した。これらのライブラリー構築ステップを3回繰り返して、4.4x109の最終ライブラリーサイズを得た。機能性クローンのパーセンテージは、ドットブロットでのC末端タグ検出により判定して、それぞれ、軽鎖については92.6%、重鎖については93.7%であった。
ファージディスプレイ選択のための抗原としてのヒトGST融合TnC fn5 A1234 BC fn6を大腸菌において発現させ、融合タンパク質のC末端に位置するaviタグ認識配列でのBirAビオチンリガーゼの共発現によりインビボで部位特異的にビオチン化した(抗原の産生は実施例1に従い、配列は表4から導かれる)。この抗原は、2つのフィブロネクチンIII型ドメイン5と6の間に位置するヒトTnC追加スプライスドメインA1、A2、A3、A4、B及びCを含む。ファージディスプレイ選択は、これらの追加スプライスドメインの何れかへの結合物質の選択を目的とするものであった。後続のステップでより少数の追加スプライスドメインを含むさらなる抗原コンストラクトを使用して表面プラズモン共鳴によりドメイン特異性を判定する。
ニュートラアビジン捕捉によりNLCチップ上に固定化したビオチン化ヒト及びマウスTnC抗原に関して25℃でProteOn XPR36装置(Biorad)を使用して表面プラズモン共鳴(SPR)により選択クローンのアフィニティー(KD)を測定した。抗原(リガンド)の固定化:組換え抗原をPBST(10mM リン酸塩、150mM 塩化ナトリウム pH7.4、0.005%Tween 20)で10μg/mlに希釈し、次いで30μl/分で垂直の向きに注入した。被分析物の注入:「ワンショット動態(one-shot kinetics)」測定のために、注入方向を水平の向きに変え、精製Fabの2倍希釈系列を別々のチャネル1-5に沿って同時に注入し、200秒の結合時間及び240秒の解離時間をそれぞれ用いた。参照用の「インライン」ブランクを得るために、バッファー(PBST)を第6のチャネルに沿って注入した。ProteOn Manager v3.1ソフトウェアの単純1対1ラングミュア結合モデルを使用して、結合センソグラムと解離センソグラムの同時フィッティングにより、結合速度定数(kon)及び解離速度定数(Koff)を算出した。平衡解離定数(KD)をkoff/kon比として算出した。表5は、種及び追加スプライスドメインの組成が異なる幾つかのTnC抗原についての2つの選択クローン18D4及び11C7の平衡解離定数(KD)を収載するものである。
下線付きの塩基:60%所与の配列及び40%N;イタリック体の塩基:60%所与の配列及び40%M。
1: G/D = 20%, E/V/S = 10%, A/P/R/L/T/Y=5%; 2: G/Y/S=15%, A/D/T/R/P/L/V/N/W/F/I/E = 4,6%; 3: G/A/Y = 20%, P/W/S/D/T = 8%; 4: F = 46%, L/M = 15%, G/I/Y = 8%.
無作為化プライマー中のトリヌクレオチド混合物:1 (G/D=20%, E/V/S=10%, A/P/R/L/T/Y=5%); 2 (G/Y/S=15%, A/D/T/R/P/L/V/N/W/F/I/E=4,6%); 3 (G/A/Y=20, P/W/S/D/T=8%); 4 (F=46%, L/M=15%, G/I/Y=8%); 5 (K=70%, R=30%)
可変抗体ドメインの発現ベクターへのクローニング
選択抗TnC結合物質(表14から表19)の重鎖及び軽鎖DNA配列の可変領域をヒトIgG1の定常重鎖又は定常軽鎖のどちらかと共にインフレームでサブクローニングした。抗体を、野生型ヒトIgG1骨格として調製したか、又は特許出願公開番号・国際公開第2012/130831号A1に記載の方法に従ってFcガンマ受容体への結合を妨げるために導入されるPro329Gly、Leu234Ala及びLeu235Ala突然変異を含有する変異体として調製した。
抗TnC IgGの精製
CMVプロモーターエンハンサー断片と組み合わせたMPSVコアプロモーターからなるキメラMPSVプロモーターの制御下で全ての遺伝子を一過性に発現させた。発現ベクターは、EBNA(エプスタイン・バーウイルス核抗原)含有宿主細胞におけるエピソーム複製のためのoriP領域も含有する。
表面プラズモン共鳴(TnC結合)
ヒト、マウス及びカニクイザルTnC(表4による抗原)への、抗TnC IgG 18D4の結合、抗TnC IgG 11C7の結合、及び抗TnC 18D4のFab断片の結合を、表面プラズモン共鳴(SPR)により評定した。全てのSPR実験は、ランニングバッファーとしてHBS-EP(0.01M HEPES pH7.4、0.15M NaCl、3mM EDTA、0.005%Surfactant P20、Biacore、Freiburg/Germany)を用いて、25℃で、Biacore T200で行った。
静的光散乱(SLS)により、及び加えた温度ストレスに対する固有タンパク質蛍光を測定することにより、熱安定性をモニターした。1mg/mlのタンパク質濃度を有する30μgの濾過したタンパク質試料をOptim 2装置(Avacta Analytical Ltd)に2回ずつ適用した。半径及び全散乱強度を収集しながら、温度を0.1℃/分で25℃から85℃に上昇させた。固有タンパク質蛍光の決定のために、試料を266nmで励起させ、放出を275nmと460nmの間で収集した。両方のIgGは、62℃の凝集温度を有する(表26)。
LS174T異種移植片由来腫瘍組織及びヒト組織アレイにおけるTnC染色の結果
免疫組織化学手法でのTnCの検出のために、LS174T異種移植片由来腫瘍組織及びヒト組織アレイにおいてウサギIgG抗体としての抗TnCクローン18D4及び11C7を試験した。
4-1BBの調製、精製及び特徴づけ
ヒト、マウス又はカニクイザル4-1BBのエクトドメインをコードするDNA配列(表27)をヒトIgG1重鎖CH2及びCH3ドメインと共にインフレームでノブ上にサブクローニングした(Merchant等、1998)。AcTEVプロテアーゼ切断部位を抗原エクトドメインとヒトIgG1のFcとの間に導入した。ビオチン化の指向のためにAviタグを抗原-FcノブのC末端に導入した。S354C/T366W突然変異を含有する抗原-Fcノブ鎖と、Y349C/T366S/L368A/Y407V突然変異を含有するFcホール鎖の組合せにより、4-1BBエクトドメイン含有鎖の単一コピーを含むヘテロ二量体の生成が可能になり、かくてモノマー形態のFc結合抗原を作出する。表28は、抗原Fc融合コンストラクトのcDNA及びアミノ酸配列を示す。
TnC標的スプリットトリマー4-1BBリガンドFc融合分子の調製
ヒト4-1BBリガンドのエクトドメインの一部(アミノ酸71-254及び71-248)をコードするDNA配列をUniprotデータベースのP41273配列に従って合成した。トリマー4-1BBリガンドを標的指向化するために使用したTnC結合物質は、クローン18D4であった。
(G4S)2リンカーにより隔てられた4-1BBリガンド(71-254)の2つのエクトドメインを含有し、ヒトIgG1-CLドメインに融合されているポリペプチドを、図5a[ヒト4-1BBリガンド、(G4S)2コネクター、ヒト4-1BBリガンド、(G4S)2コネクター、ヒトCL]に示されているようにクローニングした。4-1BBリガンド(71-254)の1つのエクトドメインを含有し、ヒトIgG1-CHドメインに融合されているポリペプチドを、図5b[ヒト4-1BBリガンド、(G4S)2コネクター、ヒトCH]に示されているようにクローニングした。
(G4S)2リンカーにより隔てられた4-1BBリガンド(71-254)の2つのエクトドメインを含有し、ヒトIgG1-CLドメインに融合されているポリペプチドを、図7a[ヒト4-1BBリガンド、(G4S)2コネクター、ヒト4-1BBリガンド、(G4S)2コネクター、ヒトCL]に示されているようにクローニングした。
(G4S)2リンカーにより隔てられた4-1BBリガンド(71-254)の2つのエクトドメインを含有するポリペプチドを、ヒトIgG1 Fcホール鎖のC末端に、図9a[ヒトIgG1 Fcホール、(G4S)2コネクター、ヒト4-1BBリガンド、(G4S)2コネクター、ヒト4-1BBリガンド]に示されているように、融合させた。
(G4S)2リンカーにより隔てられた4-1BBリガンド(71-248)の2つのエクトドメインを含有し、ヒトIgG1-CLドメインに融合されているポリペプチドを、図11a[ヒト4-1BBリガンド、(G4S)2コネクター、ヒト4-1BBリガンド、(G4S)2コネクター、ヒトCL]に示されているようにクローニングした。4-1BBリガンド(71-248)の1つのエクトドメインを含有し、ヒトIgG1-CHドメインに融合されているポリペプチドを、図11b[ヒト4-1BBリガンド、(G4S)2コネクター、ヒトCH]に示されているようにクローニングした。
(G4S)2リンカーにより隔てられた4-1BBリガンド(71-248)の2つのエクトドメインを含有し、ヒトIgG1-CLドメインに融合されているポリペプチドを、図13a[ヒト4-1BBリガンド、(G4S)2コネクター、ヒト4-1BBリガンド、(G4S)2コネクター、ヒトCL]に示されているようにクローニングした。
(G4S)2リンカーにより隔てられた4-1BBリガンド(71-248)の2つのエクトドメインを含有するポリペプチドを、図15a[ヒトIgG1 Fcホール、(G4S)2コネクター、ヒト4-1BBリガンド、(G4S)2コネクター、ヒト4-1BBリガンド]に示されているように、ヒトIgG1 Fcホール鎖のC末端に融合させた。
(G4S)2リンカーにより隔てられた4-1BBリガンドの2つのエクトドメインを含有するポリペプチドを、図17a[ヒトIgG1 Fc、(G4S)2コネクター、ヒト4-1BBリガンド、(G4S)2コネクター、ヒト4-1BBリガンド]に示されているように、ヒトIgG1 Fcホール又はノブ鎖のC末端にインフレームでサブクローニングした(Merchant, Zhu等、1998)。4-1BBリガンドの1つのエクトドメインを含有するポリペプチドを、図17b[ヒトIgG1 Fc、(G4S)2コネクター、ヒト4-1BBリガンド]に示されているように、ヒトIgG1 Fcノブ又はホール鎖のC末端にインフレームでサブクローニングした。
(G4S)2リンカーにより隔てられた4-1BBリガンドの2つのエクトドメインを含有するポリペプチドを、図17a[ヒトIgG1 Fc、(G4S)2コネクター、ヒト4-1BBリガンド、(G4S)2コネクター、ヒト4-1BBリガンド]に示されているように、ヒトIgG1 Fcホール又はノブ鎖のC末端にインフレームでサブクローニングした(Merchant, Zhu等、1998)。4-1BBリガンドの1つのエクトドメインを含有するポリペプチドを、図17b[ヒトIgG1 Fc、(G4S)2コネクター、ヒト4-1BBリガンド]に示されているように、ヒトIgG1 Fcノブ又はホール鎖のC末端にインフレームでサブクローニングした。
抗TnC結合物質(VH-VL)が、DP47と称される抗原と結合しない生殖系列コントロールに置き換えたことのみが異なる、TnC標的コンストラクト6.1のコントロール分子(コントロールBと名付けた)、6.3のコントロール分子(コントロールCと名付けた)及び6.5のコントロール分子(コントロールEと名付けた)を、上述の通り調製した。
TnC標的スプリットトリマーC末端4-1BBリガンドFc融合体及びそれらのコントロールの産生
MPSVプロモーターからインサートの発現を駆動するプラスミドベクターであって、CDSの3’末端に位置する合成ポリA配列を含有するプラスミドベクターに、標的指向性及び非標的指向性トリマー4-1BBリガンドC末端Fc(kih)融合体配列をクローニングした。加えて、このベクターは、プラスミドのエピソーム維持のためのEBV OriP配列を含有する。スプリットトリマー4-1BBリガンドFc(kih)融合分子は、ポリエチレンイミンを使用して哺乳動物発現ベクターをHEK293-EBNA細胞にコトランスフェクトすることにより産生させた。対応する発現ベクターを細胞にトランスフェクトした。コンストラクト6.1、6.2、6.4、6.6並びにそのコントロールB、D及びEについては、1:1:1:1比(「ベクターFcホール鎖」:「ベクターPD1軽鎖」:「ベクターFcノブ鎖」:「ベクター4-1BBL軽鎖」)で。コンストラクト6.3、6.6、6.11、6.12、6.13、6.14及びそのコントロールCについては、1:1:1比(「ベクターFcホール鎖」:「ベクターFcノブ鎖」:「ベクター抗PD1軽鎖」)で。アッセイにおいてコントロールとして使用したヒトIgGは、二重特異性コンストラクトの場合と同様に産生させた(トランスフェクションには、軽鎖用のベクター及び重鎖用のベクターのみを1:1比で使用した)。
TnC標的4-1BBスプリットトリマーリガンドFc融合抗原結合分子の表面プラズモン共鳴による同時結合
ヒト4-1BB Fc(kih)及びヒトTnCに同時に結合する能力を表面プラズモン共鳴(SPR)により評定した。全てのSPR実験は、ランニングバッファーとしてHBS-EP(0.01M HEPES pH7.4、0.15M NaCl、3mM EDTA、0.005%Surfactant P20、Biacore、Freiburg/Germany)を用いて、25℃で、Biacore T200で行った。
一価のTnC標的4-1BBスプリットトリマーリガンドFc融合抗原結合分子の表面プラズモン共鳴によるアフィニティー判定
TnC標的4-1BBリガンドトリマー含有Fc(kih)融合抗原結合分子の組換えTnCへの結合を表面プラズモン共鳴(SPR)によって評定した。全てのSPR実験は、ランニングバッファーとしてHBS-EP(0.01M HEPES pH7.4、0.15M NaCl、3mM EDTA、0.005 %Surfactant P20、Biacore、Freiburg/Germany)を用いて、25℃で、Biacore T100で行った。
TnC標的4-1BBスプリットトリマーリガンドFc融合抗原結合分子の機能的特徴づけ
A)TnC標的スプリットトリマー4-1BBリガンドの新鮮及び活性化ヒトPBMCに対する結合
バフィーコートをチューリッヒ献血センター(Zurich blood donation center)から入手した。新鮮抹消血単核細胞(PBMC)を単離するために、バフィーコートを同体積のDPBS(Gibco by Life Technologies、カタログ番号14190 326)で希釈した。50mLポリプロピレン製遠心分離管(TPP、カタログ番号91050)に、15mL Histopaque 1077(SIGMA Life Science、カタログ番号10771、密度1.077g/mLに調整された、ポリスクロース及びジアトリゾ酸ナトリウム)を供給し、希釈バフィーコート含有量をHistopaque 1077の上に積層した。管を30分間、450xgで遠心分離した。次いで、PBMCを接触面から収集し、DPBSで3回洗浄し、10%(v/v)ウシ胎児血清(FBS、原産地米国、PAN biotech、P30-2009、ロットP150307GI、ガンマ線照射によりマイコプラズマ不含、35分間56℃で熱不活化済み)と、1%(v/v)GlutaMAX I(GIBCO by Life Technologies、カタログ番号35050 038)と、1mM ピルビン酸ナトリウム(SIGMA、カタログ番号S8636)と、1%(v/v)MEM非必須アミノ酸(SIGMA、カタログ番号M7145)と、50μM β-メルカプトエタノール(SIGMA、M3148)とを補充した、RPMI 1640培地(Gibco by Life Technology、カタログ番号42401-042)からなるT細胞培地に再懸濁させた。
TnC発現腫瘍細胞に関する結合アッセイには、ヒト膠芽細胞腫細胞株U87-MG(ATCC HTB-14)を使用した。
ヒト4-1B及びNF-κB-ルシフェラーゼを発現するHeLa細胞の生成
CMV-プロモーターの制御下にあるヒト4-1BBの配列(Uniprot寄託Q07011)とピューロマイシン耐性遺伝子とを含有する発現ベクターpETR10829に基づくプラスミドを用いて、ヒトパピローマウイルス18誘発子宮頚がん細胞株HeLa(ATCC CCL-2)に形質導入した。10%ウシ胎児血清(FBS、GIBCO by Life Technologies、カタログ番号16000-044、ロット番号941273、ガンマ線照射によりマイコプラズマ不含、35分間56℃で熱不活化済み)と、1%GlutaMAX-I(GIBCO by Life Technologies、カタログ番号35050-038)と、3μg/mLのピューロマイシン(InvivoGen、カタログ番号ant-pr)とを補充した、DMEM培地(Gibco by Life Technology、カタログ番号42430-025)で、細胞を培養した。4-1BB形質導入HeLa細胞をフローサイトメトリーにより4-1BB発現について試験した:0.1μg PerCP/Cy5.5がコンジュゲートされた抗ヒト4-1BBマウスIgG1κクローン4B4-1(BioLegendカタログ番号309814)又はそのアイソタイプコントロール(PerCP/Cy5.5がコンジュゲートされたマウスIgG1κアイソタイプコントロール抗体クローンMOPC 21、BioLegendカタログ番号400150)を含有する、100μL FACSバッファー(2%FBSと、5mM EDTA pH8(Amresco、カタログ番号E177)と7.5mM アジ化ナトリウム(Sigma-Aldrich、カタログ番号S2002)とを補充したDPBA)に、0.2x106個の生存細胞を再懸濁させ、30分間4℃でインキュベートした。細胞をFACSバッファーで2回洗浄し、0.06μgのDAPI(Santa Cruz Biotec、カタログ番号Sc-3598)を含有する300μLのFACSバッファーに再懸濁させ、5レーザー搭載LSR-Fortessa(BD Bioscience、DIVA software)を使用して捕捉した。次のように、限界希釈を行って単一クローンを生成した:ヒト4-1BB形質導入HeLa細胞を培地に再懸濁させて細胞10、5及び2.5個/mLの濃度にし、200μLの細胞懸濁液を丸底組織培養処理96ウェルプレート(6プレート/細胞濃度、TPPカタログ番号92697)に移した。単一クローンを回収し、増殖させ、4-1BB発現について上で説明したように試験した。4-1Bbの最高発現を有したクローン(クローン5)を、NFκB-ルシフェラーゼ発現ベクター5495p Tranlucent HygBを用いるその後のトランスフェクションに選択した。このベクターは、トランスフェクトされた細胞に、ハイグロマイシンBに対する耐性と、NFkB応答エレメント(Panomics、カタログ番号LR0051)の制御下でルシフェラーゼを発現する能力との両方を付与する。ヒト4-1BB HeLaクローン5細胞を培養して70%コンフルエンスにした。50μg(40μL)の直線化(制限酵素AseI及びSalI)5495p Tranlucent HygB発現ベクターを、滅菌0.4 cm Gene Pulser/MicroPulser Cuvette(Biorad、カタログ番号165-2081)に添加した。400μlのサプリメント不含DMEM中の2.5X106個のヒト4-1BB HeLaクローン5を添加し、注意深くプラスミド溶液と混合した。Gene Pulser Xcell total system(Biorad、カタログ番号165 2660)を、次の設定のもとで使用して細胞のトランスフェクションを行った:指数パルス、キャパシタンス500μF、電圧160V、抵抗∞。パルス後直ちに、トランスフェクト細胞を、10%FBSと1%GlutaaMAX I(GIBCO by Life Technologies、カタログ番号35050 038)とを補充した15mL 37℃温DMEM培地(Gibco by Life Technologies カタログ番号42430-025)が入っている組織培養フラスコ75cm2(TPP、カタログ番号90075)に移した。翌日、3μg/mLのピューロマイシン(InvivoGen、カタログ番号ant pr)及び200μg/mLのハイグロマイシンB(Roche、カタログ番号10843555001)を含有する培地を添加した。生存細胞を増殖させ、上で説明したように限界希釈を行って、単一クローンを生成した。クローンを4-1BB発現については上で説明したように、NFκB-ルシフェラーゼ活性については次のように試験した。クローンを選択培地に採取し、Cell Counter Vi-cell xr 2.03(Beckman Coulter、カタログ番号731050)を使用して計数した。細胞を、細胞0.33x106個/mLの細胞密度に設定し、翌日、この細胞懸濁液の150μLを、蓋付きの滅菌白色96ウェル平底組織培養プレート(Greiner Bio-One、カタログ番号655083)に移して、及びコントロールとして通常の96ウェル平底組織培養プレート(TPPカタログ番号92096)に移して、生存及び細胞密度について試験した。細胞を37℃及び5%CO2で一晩インキュベートした。翌日、異なる濃度の組換えヒト腫瘍壊死因子アルファ(rhTNFα、PeproTech、カタログ番号300 01A)を含有する培地50μLを、結果として100、50、25、12.5、6.25及び0ng rhTNFα/ウェルの最終濃度になるように、96ウェルプレートの各ウェルに添加した。細胞を6時間、37℃及び5 %CO2でインキュベートし、その後、200μL/ウェルのDPBSで3回洗浄した。レポーター溶解バッファー(Promega、カタログ番号E3971)を各ウェルの添加し(30μL)、プレートを-20℃で一晩保管した。翌日、凍結細胞プレート及び検出バッファー(Luciferase 1000 Assay System、Promega、カタログ番号E4550)を解凍して室温にした。100uLの検出バッファーを各ウェルに添加し、SpectraMax M5/M5eマイクロプレートリーダー及びSoftMax Pro Software(Molecular Devices)を使用してできる限り迅速にプレートを測定した。コントロール(rhTNF-αの添加なし)より上の測定URLをルシフェラーゼ活性とみなした。最高ルシフェラーゼ活性及びかなりのレベルの4-1BB発現を呈示するNFκB-luc-4-1BB-HeLaクローン26を、さらなる使用に選択した。
接着ヒト膠芽細胞腫細胞株U87MG(ATCC HTB-14)をDPBS(Gibco by Life Technologies、カタログ番号14190 326)で洗浄し、酵素不含、PBSベースの細胞解離バッファー(Gibco by Life Technologies、カタログ番号13151-014)で10分間、37℃で処理した。その後、細胞を回収し、細胞計数器Vi-cell xr 2.03を使用して計数した。10%ウシ胎児血清(FBS、原産地米国、PAN biotech、P30-2009、ロットP150307GI、ガンマ線照射によりマイコプラズマ不含、35分間56℃で熱不活化済み)と1%GlutaMAX-I(GIBCO by Life Technologies、カタログ番号35050 038)とを補充したDMEM培地((Gibco by Life Technologies カタログ番号42430 025)に細胞を再懸濁させて細胞1x106個/ウェルにし、100μLを蓋付き滅菌白色96ウェル平底組織培養プレート(Greiner Bio-One、カタログ番号655083)のウェルに添加した。ネガティブコントロールについては、100μLの培地を添加した。プレートを37℃及び5%CO2で一晩インキュベートした。
TnC結合媒介架橋のために、TnC発現接着ヒト膠芽細胞腫細胞株U87-MG(ATCC HTB-14)を使用した。U87MG細胞をDPBS(Gibco by Life Technologies、カタログ番号14190 326)で洗浄し、酵素不含、PBSベースの細胞解離バッファー(Gibco by Life Technologies、カタログ番号13151-014)で10分間、37℃で処理した。細胞を回収し、10%ウシ胎児血清(FBS、原産地米国、PAN biotech、P30-2009、ロットP150307GI、ガンマ線照射によりマイコプラズマ不含、35分間56℃で熱不活化済み)と、1%L-GlutaMAX-I(GIBCO by Life Technologies、カタログ番号35050-038)と、1mM ピルビン酸ナトリウム(SIGMA-Aldrich、カタログ番号S8636)と、1%MEM-非必須アミノ酸溶液(SIGMA-Aldrich、カタログ番号M7145)と、50μM β-メルカプトエタノール(Sigma-Aldrich、Cyt.-No.M3148)とを補充したRPMI 1640(GIBCO by Life Technologies、カタログ番号42401-042)からなるT細胞培地に再懸濁させ、50Gyを照射した(X-Ray Irradiator RS 2000、Rad source)。50μL T細胞培地中の2x104個のU87MG細胞を丸底組織培養96ウェルプレート(TTP、カタログ番号92697)に播種した。異なる滴定濃度のコンストラクト6.5及び6.6又は適合するコントロール(コントロールF、コントロールL及びコントロールE)を含有する、50μLのT細胞培地を添加した。40nM CFDA-SE(SIGMA-Aldrich、カタログ番号21888-25MG-F)を含有する37℃温DPBS中でヒトPBMCを15分間、37℃で標識した。CFSEへの標識づけをFBSの添加により停止させ、PBMCを2回洗浄し、T細胞培地に再懸濁させて、細胞1.5x106個/mLの最終濃度にした。このPBMC細胞溶液の50μLを各ウェルに播種した、例えば、7.5x104個のCFSE標識PBMCを各ウェルに添加した。最後に、8nM アゴニスト抗ヒトCD3ヒトIgG1クローンV9を含有するT細胞培地の保存液を調製し、50μL/ウェルを各ウェルに添加して、2nM 抗ヒトCD3ヒトIgG1クローンV9の最終濃度を得た。
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Claims (24)
- TNFファミリーリガンドトリマー含有抗原結合分子であって、
(a)テネイシンC(TnC)と特異的に結合することができる少なくとも1つの抗原結合部分と、
(b)ジスルフィド結合により互いに連結されている第1及び第2のポリペプチドと
を含み、
第1のポリペプチドが、ペプチドリンカーにより互いに接続されているTNFリガンドファミリーメンバーの2つのエクトドメインを含むこと、及び第2のポリペプチドが、前記TNFリガンドファミリーメンバーの1つだけのエクトドメインを含むことを特徴とするTNFファミリーリガンドトリマー含有抗原結合分子。 - 請求項1に記載のTNFファミリーリガンドトリマー含有抗原結合分子であって、
(a)TnCと特異的に結合することができる少なくとも1つの部分と、
(b)ジスルフィド結合により互いに連結されている第1及び第2のポリペプチドと
を含み、
(i)第1のポリペプチドがCH1若しくはCLドメインを、及び第2のポリペプチドがCL若しくはCH1ドメインをそれぞれ含有し、第2のポリペプチドが、CH1ドメインとCLドメイン間のジスルフィド結合により第1のポリペプチドと連結されており、第1のポリペプチドが、ペプチドリンカーにより互いに接続され且つペプチドリンカーによりCH1若しくはCLドメインに接続されているTNFリガンドファミリーメンバーの2つのエクトドメインを含み、第2のポリペプチドが、ペプチドリンカーによって前記第2のポリペプチドのCL若しくはCH1ドメインに接続されている前記TNFリガンドファミリーメンバーの1つのエクトドメインを含むこと、又は
(ii)第1のポリペプチドがCH3ドメインを、及び第2のポリペプチドがCH3ドメインをそれぞれ含有し、第1のポリペプチドが、ペプチドリンカーにより互いに接続され且つペプチドリンカーによりCH3ドメインのC末端に接続されているTNFリガンドファミリーメンバーの2つのエクトドメインを含み、第2のポリペプチドが、ペプチドリンカーによって前記第2のポリペプチドのCH3ドメインのC末端に接続されている前記TNFリガンドファミリーメンバーの1つだけのエクトドメインを含むこと、又は
(iii)第1のポリペプチドがVH-CL若しくはVL-CH1ドメインを、及び第2のポリペプチドがVL-CH1ドメイン若しくはVH-CLドメインをそれぞれ含有し、第2のポリペプチドが、第1のポリペプチドのVH-CLドメインと第2のポリペプチドのVL-CH1ドメインとの間若しくは第1のポリペプチドのVL-CH1ドメインと第2のポリペプチドのVH-CLドメインとの間のジスルフィド結合により第1のポリペプチドと連結されており、第1のポリペプチドが、ペプチドリンカーにより互いに接続され且つペプチドリンカーにより第1のポリペプチドのVH-CLドメイン若しくはVL-CH1ドメインに接続されているTNFリガンドファミリーメンバーの2つのエクトドメインを含み、第2のポリペプチドが、ペプチドリンカーによって第2のポリペプチドのVL-CH1ドメイン若しくはVH-CLドメインに接続されている前記TNFリガンドファミリーメンバーの1つのエクトドメインを含むこと
を特徴とする、TNFファミリーリガンドトリマー含有抗原結合分子。 - TNFリガンドファミリーメンバーが、ヒトT細胞活性化を共刺激する、請求項1又は2に記載のTNFファミリーリガンドトリマー含有抗原結合分子。
- TNFリガンドファミリーメンバーが、4-1BBL及びOX40Lから選択される、請求項1から3の何れか一項に記載のTNFファミリーリガンドトリマー含有抗原結合分子。
- TNFリガンドファミリーメンバーが4-1BBLである、請求項1から4の何れか一項に記載のTNFファミリーリガンドトリマー含有抗原結合分子。
- 請求項1から5の何れか一項に記載のTNFファミリーリガンドトリマー含有抗原結合分子であって、
(a)TnCと特異的に結合することができる少なくとも1つの抗原結合部分、及び
(b)CH1又はCLドメインを含有する第1のポリペプチド及びCL又はCH1ドメインを含有する第2のポリペプチドであって、第2のポリペプチドがCH1ドメインとCLドメイン間のジスルフィド結合により第1のポリペプチドと連結されている、第1のポリペプチド及び第2のポリペプチド
を含み、
第1のポリペプチドが、ペプチドリンカーにより互いに接続され且つペプチドリンカーによりCH1又はCLドメインに接続されているTNFリガンドファミリーメンバーの2つのエクトドメインを含むこと、及び第2のポリペプチドが、ペプチドリンカーによって前記第2のポリペプチドのCL又はCH1ドメインに接続されている前記TNFリガンドファミリーメンバーの1つだけのエクトドメインを含むことを特徴とする、
TNFファミリーリガンドトリマー含有抗原結合分子。 - TnCと特異的に結合することができる部分が、抗体断片、Fab分子、クロスオーバーFab分子、単鎖Fab分子、Fv分子、scFv分子、単一ドメイン抗体、aVH及び足場抗原結合タンパク質からなる群から選択される、請求項1から6の何れか一項に記載のTNFファミリーリガンドトリマー含有抗原結合分子。
- TnCと特異的に結合することができる1つ又は2つの部分を含む、請求項1から7の何れか一項に記載のTNFファミリーリガンドトリマー含有抗原結合分子。
- TnCと特異的に結合することができる抗原結合部分が、TnCと特異的に結合することができるFab分子である、請求項1から8の何れか一項に記載のTNFファミリーリガンドトリマー含有抗原結合分子。
- TnCと特異的に結合することができる抗原結合部分が、(i)配列番号67のアミノ酸配列を含むCDR-H1と、(ii)配列番号68のアミノ酸配列を含むCDR-H2と、(iii)配列番号69のアミノ酸配列を含むCDR-H3とを含むVHドメイン、及び(iv)配列番号55のアミノ酸配列を含むCDR-L1と、(v)配列番号56のアミノ酸配列を含むCDR-L2と、(vi)配列番号57のアミノ酸配列を含むCDR-L3とを含むVLドメインを含む、請求項1から9の何れか一項に記載のTNFファミリーリガンドトリマー含有抗原結合分子。
- TnCと特異的に結合することができる抗原結合部分が、(i)配列番号70のアミノ酸配列を含むCDR-H1と、(ii)配列番号71のアミノ酸配列を含むCDR-H2と、(iii)配列番号72のアミノ酸配列を含むCDR-H3とを含むVHドメイン、及び(iv)配列番号58のアミノ酸配列を含むCDR-L1と、(v)配列番号59のアミノ酸配列を含むCDR-L2と、(vi)配列番号60のアミノ酸配列を含むCDR-L3とを含むVLドメインを含む、請求項1から9の何れか一項に記載のTNFファミリーリガンドトリマー含有抗原結合分子。
- Fcドメインが、234及び235位(EU番号付け)、並びに/又は329位(EU番号付け)にアミノ酸置換を含むIgG1 Fcドメインである、請求項2から11の何れか一項に記載のTNFファミリーリガンドトリマー含有抗原結合分子。
- TnCに特異的に結合することができるFab分子を含む第1の重鎖及びTnCに特異的に結合することができるFab分子を含む第1の軽鎖;
第2の重鎖及び第2の軽鎖;並びに
(i)C末端で第2のペプチドリンカーにより第2の重鎖に融合されている第1のペプチドであって、第1のペプチドリンカーによって互いに接続されているTNFリガンドファミリーメンバーの2つのエクトドメインを含む第1のペプチド及びC末端で第3のペプチドリンカーにより第2の軽鎖に融合されている第2のペプチドであって、前記TNFリガンドファミリーメンバーの1つのエクトドメインを含む第2のペプチド、又は、
(ii)C末端で第2のペプチドリンカーにより第2の軽鎖に融合されている第1のペプチドであって、第1のペプチドリンカーによって互いに接続されているTNFリガンドファミリーメンバーの2つのエクトドメインを含む第1のペプチド及びC末端で第3のペプチドリンカーにより第2の重鎖に融合されている第2のペプチドであって、前記TNFリガンドファミリーメンバーの1つのエクトドメインを含む第2のペプチド
を含む、
請求項1から12の何れか一項に記載のTNFファミリーリガンドトリマー含有抗原結合分子。 - 第1のペプチドリンカーにより互いに接続されているTNFリガンドファミリーメンバーの2つのエクトドメインを含む第1のペプチドが、そのC末端で第2のペプチドリンカーにより重鎖の一部であるCH1ドメインに融合されており、前記TNFリガンドファミリーメンバーの1つのエクトドメインを含む第2のペプチドが、そのC末端で第3のペプチドリンカーにより軽鎖の一部であるCLドメインに融合されている、請求項1から13の何れか一項に記載のTNFファミリーリガンドトリマー含有抗原結合分子。
- 第1のペプチドリンカーにより互いに接続されているTNFリガンドファミリーメンバーの2つのエクトドメインを含む第1のペプチドが、そのC末端で第2のペプチドリンカーにより重鎖の一部であるCLドメインに融合されており、前記TNFリガンドファミリーメンバーの1つのエクトドメインを含む第2のペプチドが、そのC末端で第3のペプチドリンカーにより軽鎖の一部であるCH1ドメインに融合されている、請求項1から13の何れか一項に記載のTNFファミリーリガンドトリマー含有抗原結合分子。
- 第1のペプチドリンカーにより互いに接続されているTNFリガンドファミリーメンバーの2つのエクトドメインを含む第1のペプチドが、そのC末端で第2のペプチドリンカーにより重鎖の一部であるVHドメインに融合されており、前記TNFリガンドファミリーメンバーの1つのエクトドメインを含む第2のペプチドが、そのC末端で第3のペプチドリンカーにより軽鎖の一部であるVLドメインに融合されている、請求項1から13の何れか一項に記載のTNFファミリーリガンドトリマー含有抗原結合分子。
- 抗原結合部分が、ヒト、マウス及びカニクイザルTnCと結合する、請求項1から16の何れか一項に記載のTNFファミリーリガンドトリマー含有抗原結合分子。
- 抗原結合部分が、ヒト、マウス及びカニクイザルTnCのうちの少なくとも1つと2nM未満のKD値で結合する、請求項1から17の何れか一項に記載のTNFファミリーリガンドトリマー含有抗原結合分子。
- 請求項1から18の何れか一項に記載のTNFファミリーリガンドトリマー含有抗原結合分子と少なくとも1つの薬学的に許容される添加剤とを含む薬学的組成物。
- 医薬としての使用のための、請求項1から18の何れか一項に記載のTNFファミリーリガンドトリマー含有抗原結合分子、又は請求項19に記載の薬学的組成物。
- がんの治療における使用のための、請求項1から18の何れか一項に記載のTNFファミリーリガンドトリマー含有抗原結合分子、又は請求項19に記載の薬学的組成物。
- がんの治療のための医薬の製造のための、請求項1から18の何れか一項に記載のTNFファミリーリガンドトリマー含有抗原結合分子の使用。
- 個体における疾患を治療するための医薬であって、薬学的に許容される形態の請求項1から18の何れか一項に記載のTNFファミリーリガンドトリマー含有抗原結合分子を含む組成物の治療有効量を含む医薬。
- 前記疾患ががんである、請求項23に記載の医薬。
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