ES2712854T3 - Aceite microbiano y procedimientos para su procesamiento - Google Patents

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Daniel Verkoeijen
Albert Schaap
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Abstract

Un aceite microbiano bruto o sin refinar, que tiene un contenido en triglicéridos de al menos 90% y un índice de peróxidos (IP) menor que 2,5, y que comprende al menos 40% de ácido araquidónico (AA).

Description

DESCRIPCION
Aceite microbiano y procedimientos para su procesamiento
Campo de la invencion
La presente invencion se refiere a un aceite microbiano bruto o sin reinar, que comprende acido araquidonico (AA).
Introduccion
Los acidos grasos poliinsaturados, o AGPI, se encuentran en la naturaleza, y diferentes organismos unicelulares (algas, hongos, etc.) producen una gran variedad de AGPI. Un AGPI particularmente importante es el acido araquidonico (AA), el cual es uno de tantos acidos grasos poliinsaturados de cadena larga (AGPI-CL). Quimicamente, el acido araquidonico es el acido c/s-5,8,11,14-eicosatetraenoico (20:4), y pertenece a la familia (n-6) de los AGPI-CL.
El acido araquidonico es un precursor principal de una gran variedad de compuestos biologicos activos, conocidos colectivamente como eicosanoides, un grupo que comprende prostaglandinas, tromboxanos y leucotrienos. El acido araquidonico tambien es uno de los componentes de la fraccion lipidica de la leche materna humana, y se considera esencial para un desarrollo neurologico optimo del lactante. El acido araquidonico tiene una gran variedad de aplicaciones diferentes, incluyendo su uso en preparados para lactantes, productos alimentarios y piensos.
El documento WO-A-97/37032 (Gist-Brocades) se refiere a la preparacion de un aceite microbiano, que contiene AGPI, a partir de biomasa pasteurizada. Sin embargo, no se informa de un calentamiento rapido hasta, o un enfriamiento partiendo de, una temperatura a la cual tiene lugar la pasteurizacion. Ademas, no se tiene en cuenta la cantidad total de energia empleada durante el proceso de pasteurizacion.
Tanto el documento WO-A-00/15045 como el WO-A-01/67886 se refieren al uso de hongos Mucorales en la preparacion de productos alimentarios. El primero de estos documentos se refiere a la necesidad de realizar una reduccion de ARN antes de incluir las celulas en los alimentos, y sugiere utilizar una etapa de calentamiento. Se puede realizar una pasteurizacion o choque termico por separado. El segundo documento sugiere que se puede evitar el paso de calentamiento para reducir el contenido de ARN, si se permite que las celulas fungicas se conserven en la vasija de fermentacion y se dejen “madurar”.
La solicitud de patente internacional n° PCT/EP01/08902 se refiere al procedimiento para la preparacion de mezclas de aceites mediante la combinacion de un aceite bruto que contiene AGPI w6 con un aceite bruto que contiene AGPI w3, para producir una mezcla de aceites, y posterior purificacion de la mezcla de aceites brutos.
Se conocen procedimientos que implican calentar biomasa o celulas microbianas. Tambien se sabe, desde el documento WO-A-97/37032, que las celulas microbianas pueden pasteurizarse antes de la extraccion de un AGPI de las mismas, en forma de un aceite. Sin embargo, los presentes solicitantes han descubierto un nuevo procedimiento de pasteurizacion que es capaz de mejorar la calidad del aceite que se puede extraer de las celulas pasteurizadas. En particular, el aceite resultante puede oxidarse menos, o ser menos oxidado, y puede tener un bajo indice de peroxidos (IP) y/o un bajo indice de anisidina (IAn). Ademas, los solicitantes han descubierto que este nuevo procedimiento de pasteurizacion es mas eficaz porque requiere menos energia. El procedimiento es, por lo tanto, beneficioso porque no solo es capaz de mejorar la calidad del aceite, sino que tambien puede reducir costes, ya que se requiere menos energia.
El documento US-B1-6255505 se refiere a un aceite microbiano que contiene un acido graso poliinsaturado (AGPI) con un contenido elevado de trigliceridos y una elevada estabilidad oxidativa. Ademas, se describe un metodo para la recuperacion de tal aceite a partir de una biomasa microbiana derivada de un caldo de fermentacion pasteurizado, en el que la biomasa microbiana se somete a extrusion para formar particulas granulares, se seca, y el aceite se extrae entonces de los granulos secos usando un disolvente apropiado.
El documento EP-A-1178103 se refiere a un procedimiento para preparar una mezcla de aceites de un AGPI m6 (tal como AA) con AGPI m3 (tal como DHA y/o EPA), que se puede incluir en formulaciones comestibles tales como materias alimentarias, y en particular formulas para lactantes. Un aceite bruto que contiene AGPI m6 (por ejemplo AA) se mezcla con un aceite bruto que contiene AGPI m3 (por ejemplo DHA o EPA) para producir una mezcla (o mezcla) bruta de aceites. Esta mezcla se purifica entonces antes de la adicion a una materia alimentaria.
Breve descripcion de las figuras
La Figura 1 es una grafica de la temperatura (°C) frente al tiempo (minutos) para tres protocolos de pasteurizacion (A y C pertenecen a la invencion, B se proporciona para comparacion);
La Figura 2 es una grafica de la temperatura (°C) frente al tiempo (minutos) para la pasteurizacion en tres mesetas de temperatura diferentes (40, 70 y 85°C);
Las Figuras 2 y 4 son graficas del lAn (y del IP para la Fig.3) frente al tiempo (horas);
La Figura 5 es una grafica del IP (meq/kg) y del IAn frente a la temperatura (°C) para la pasteurizacion a dos tiempos diferentes (permanencia/meseta) (8 y 300 segundos);
Las Figuras 6 y 7 son graficas de la temperatura (°C) frente al tiempo (segundos) para dos tiempos diferentes (permanencia/meseta) (8 segundos para la Figura 6, 5 minutos para la Figura 7) a cinco temperaturas diferentes (60, 80, 100, 120 y 140°C).
Descripcion de la invencion
La presente invencion proporciona un aceite microbiano bruto o sin refinar que tiene un contenido en trigliceridos de al menos 90% y un indice de peroxidos (IP) menor que 2,5, y que comprende al menos 40% de acido araquidonico (AA).
Un primer aspecto de la presente descripcion se refiere a un procedimiento para pasteurizar celulas microbianas, el cual comprende calentar las celulas (a una temperatura comprendida) entre 40°C a (60°C o) 70°C en no mas de 30 minutos, o calentar las celulas a una velocidad de al menos 0,5°C/minuto. Este aspecto proporciona por lo tanto un calentamiento rapido de las celulas microbianas durante la pasteurizacion, y una velocidad tan alta no se ha descrito en la tecnica. Mientras que en la tecnica se dan temperaturas de pasteurizacion, no se aprecia ni se discute la velocidad de calentamiento, o que este parametro pueda ser importante, ni que una velocidad relativamente rapida pueda proporcionar ventajas. De hecho, altas velocidades de calentamiento van en contra de toda logica, ya que se podria esperar que causasen oxidacion, o bien degradacion, del AGPI o del aceite que se puede extraer de las celulas.
Un segundo aspecto de la segunda descripcion se refiere a un procedimiento para pasteurizar celulas microbianas, el cual comprende un protocolo de pasteurizacion que comprende (al menos) tres etapas. Estas son, a saber: una (primera) etapa de calentamiento, una (segunda) etapa de meseta (durante la cual las celulas microbianas se mantienen a una temperatura deseada, o durante la cual las celulas se mantienen a una temperatura constante y/o maxima), y una (tercera) etapa de enfriamiento. Este aspecto de la descripcion se conoce como el protocolo de pasteurizacion de tres etapas. Si este protocolo se representa en una grafica del tiempo frente a la temperatura, se puede obtener un trapecio.
Un tercer aspecto de la descripcion se refiere a un procedimiento para pasteurizar celulas microbianas, el cual comprende utilizar un protocolo de pasteurizacion tal que el area bajo la grafica del tiempo (minutos) frente a la temperatura (°C) sea menor de 13000°C.min. El area bajo la grafica del tiempo frente a la temperatura proporciona la cantidad de energia consumida para calentar las celulas durante el procedimiento de pasteurizacion. Se ha descubierto que un calentamiento rapido y/o enfriamiento rapido (que se corresponden, respectivamente, con la primera y la tercera etapa del segundo aspecto) pueden proporcionar ventajas, tales como un aceite de mejor calidad. Ademas, la cantidad de energia requerida para el procedimiento de pasteurizacion se puede reducir en comparacion con los procedimientos de pasteurizacion descritos en la tecnica. Este tercer aspecto, por lo tanto, concierne al aporte energetico requerido para el procedimiento de pasteurizacion.
Un cuarto aspecto de la descripcion se refiere a un procedimiento para pasteurizar celulas microbianas, el cual comprende (calentar las celulas, y de esta manera) mantener las celulas a una temperatura elevada (T, °C) durante un tiempo (t, minutos), por ejemplo en una etapa de meseta, en la cual el producto t.T (es decir, la multiplicacion del parametro del tiempo por el de la temperatura, por ejemplo durante la etapa de meseta) es de 140 a 100,800°C.minuto. Como se notara, este cuarto aspecto es similar al segundo aspecto, por cuanto contiene una etapa de meseta. Las celulas se pueden mantener en esta etapa a una temperatura constante o maxima. El producto t.T puede, por lo tanto, representar el area bajo la grafica del tiempo frente a la temperatura para esta etapa de meseta.
Primer aspecto — Calentamiento rapido
En este aspecto, las celulas se calientan de manera que la temperatura de las celulas pasa de 40°C a 70°C (o 60°C) en no mas de 30 minutos (tal como en no mas de 15 minutos). Preferiblemente, el tiempo transcurrido para pasar de 40 a 70°C no tarda mas de 40 o 50 minutos. Como alternativa, o ademas, las celulas se calientan a una velocidad de al menos 0,5°C/minuto. Por supuesto, las celulas microbianas pueden partir de (o calentarse desde) una temperatura menor de 40°C. Por ejemplo, las celulas pueden estar a temperatura del entorno o temperatura ambiente. Las celulas pueden estar a la temperatura de fermentacion, tal como 30° ± 5°C. De este modo, cuando comienza el calentamiento, las celulas pueden estar a una temperatura de 20 a 40°C, tal como de 23 a 27°C (o de 25 o 29 a 32 o 37°C). En algunos casos, las celulas microbianas se pueden haber enfriado, por ejemplo despues de que haya terminado la fermentacion. De este modo, cuando comienza el calentamiento, las celulas pueden tener una temperatura (inicial) de 5 a 10°C, tal como de 7 a 9°C.
Las celulas microbianas se pueden calentar de forma que su temperatura aumente por encima de (60 o) 702C. De este modo, puede que esta no sea la temperatura final de las celulas microbianas durante la pasteurizacion. De hecho, las celulas pueden calentarse a una temperatura mayor que (60 o) 70°C. La temperatura puede aumentar hasta que se alcance una temperatura de 70 a 90, 110 o 130°C, tal como de 75 a 87°C, y de forma optima de 78 a 84°C. La temperatura maxima durante la pasteurizacion puede, por lo tanto, entrar dentro de estos intervalos, pero para algunas realizaciones puede alcanzar hasta 100, 120 o 140°C. Preferentemente, las celulas se conservan o mantienen a esa temperatura (maxima).
De lo cual se deducirra que las celulas se pueden calentar a una temperatura menor que, o que parte de, 40°C, hasta una temperatura mayor o igual a 70°C. El intervalo de 40 a 70°C puede producir un “clic” que extienda el calentamiento/intervalo de temperatura para el cual se puede especificar (y por lo tanto calcular) un tiempo (y por lo tanto una velocidad).
Se calculara que la velocidad del calentamiento rapido (de 40 a 70°C en 30 minutos) es de 1°C/minuto. Sin embargo, si es necesario, la velocidad puede ser ligeramente menor que esta, y en el primer aspecto, el calentamiento rapido supone una velocidad de calentamiento mayor de 0,5°C/minuto. Preferentemente, la velocidad es de al menos 0,6, 1,0 o incluso 1,5°C/minuto. Sin embargo, se contemplan velocidades de calentamiento particularmente rapidas, dependiendo del equipo y del volumen o del peso de las celulas microbianas a calentar. De este modo, la descripcion incluye velocidades de calentamiento de mas de 2,0 o incluso 2,5°C/minuto.
Se pueden obtener velocidades de calentamiento particularmente altas utilizando un equipo especializado. Este puede alcanzar una temperatura alta en un periodo corto de tiempo, y, al hacerlo, esto puede minimizar cualquier oxidacion o deterioro del AGPI o aceite microbiano que puede ser aislado posteriormente. De este modo, el calentamiento puede tener lugar hasta una temperatura maxima de hasta 140, 150 o 160°C. Preferiblemente, el calentamiento puede alcanzar un intervalo de temperatura de 100 a 180°C, tal como de 120 a 160°C, preferiblemente de 130 a 150°C. Al emplear calentadores particularmente rapidos, estas temperaturas se pueden alcanzar de forma particularmente rapida, por ejemplo en un tiempo menor que un minuto (30 segundos). Tales temperaturas se pueden alcanzar en 20, 30, 40 o 50 segundos, o pueden tardar hasta 150, 175, 200, 225 o 250 segundos. Sin embargo, tales temperaturas se pueden alcanzar en tan solo 2, 4, 6, 8 o 10 segundos, por ejemplo si se esta utilizando un calentador de infusion, o con muestras relativamente pequenas. De este modo, se pueden alcanzar velocidades de calentamiento de hasta 50, 100, 150 o incluso 200°C por minuto. De este modo, son posibles velocidades de calentamiento algo menores, de 5 o 10 a 50 o 60°C por minuto, tales como de 15 a 45°C por minuto.
Se ha descubierto que este rapido calentamiento durante una rapida pasteurizacion no solo es mas eficaz, y requiere menos energia, sino que parece que es al menos un factor responsable de la obtencion de un aceite microbiano de mejor calidad (una vez extraido de las celulas tras la pasteurizacion).
Segundo aspecto — Protocolo de pasteurizacion en tres etapas
La primera etapa puede ser una etapa de calentamiento. Esta, de hecho, corresponde al calentamiento rapido descrito en el primer aspecto de la descripcion, y, por lo tanto, todas las peculiaridades y caracteristicas del primer aspecto se aplican a la primera etapa (de calentamiento) del segundo aspecto mutatis mutandis.
La segunda etapa corresponde a cuando las celulas estan en una meseta (de temperatura). Las celulas pueden, de este modo, conservarse a una temperatura particular deseada (mas o menos 1 o 2, 5 o incluso 10°C) durante el tiempo deseado. Las celulas pueden, de este modo, mantenerse a una temperatura constante. Preferiblemente, esta temperatura (o intervalo de temperaturas), en la etapa de meseta, es la temperatura maxima alcanzada durante el protocolo de pasteurizacion. La temperatura en la etapa de meseta (y/o la temperatura maxima durante la pasteurizacion) es, preferiblemente, de al menos 70°C. Puede ser menor que 90 o 100°C, convenientemente de 70 a 85°C, tal como de 70 a 77°C. Como alternativa, puede ser de 80-160°C, tal como de 100-140°C.
La duracion de la etapa de meseta, o el tiempo que las celulas se mantienen a la temperatura deseada o maxima, puede ser de 5 segundos a 90 minutos, tal como de 1 o 10 a 80 minutos, por ejemplo de 20 a 70 minutos. De forma optima, este tiempo es de 40 o 50 a 60 o 70 minutos, tal como de 45 a 65 minutos, y convenientemente de 55 a 63 minutos. Tambien son posibles tiempos particularmente cortos, por ejemplo de 8 segundos a 5 minutos.
La tercera etapa es una etapa de enfriamiento. Preferiblemente, las celulas se enfrian a una temperatura que es igual a, o entra dentro de, los intervalos mencionados para el inicio del calentamiento (o primera etapa). Preferiblemente, las celulas microbianas se enfrian y/o calientan linealmente (en la primera y/o tercera etapa, segun proceda), es decir, cuando se representa en una grafica del tiempo frente a la temperatura, el perfil de enfriamiento o calentamiento toma la forma de (aproximadamente) una linea recta. Las celulas se pueden dejar enfriar, o se pueden enfriar de forma activa, por ejemplo utilizando un intercambiador de calor y/o una sustancia refrigerante, por ejemplo (bajando) a temperatura en condiciones normales o a temperatura ambiente, o una temperatura menor.
Preferiblemente, la velocidad de enfriamiento es de al menos 0,4, 0,6, 1,0 o 1,52C/minuto. Estos valores representan velocidades de enfriamiento alcanzables cuando las celulas se dejan enfriar. Sin embargo, son posibles velocidades de enfriamiento mas rapidas, especialmente si se emplea un enfriamiento activo. De este modo, se pueden alcanzar velocidades de enfriamiento de al menos 2,0, 2,5, 3,0 o incluso 3,5°C/minuto. Sin embargo, son posibles velocidades de enfriamiento mayores, tales como mayores que 5°C por minuto, por ejemplo de 7 o 10 a 50 o 60°C por minuto, preferiblemente de 15 a 45°C por minuto.
La velocidad de calentamiento y/o enfriamiento preferida se mantiene preferiblemente durante al menos 10, 20 o 30°C, aunque en algunas realizaciones esto puede conseguirse durante al menos un intervalo de 40 o 50°C.
Se observara que con una etapa rapida de calentamiento y con una etapa rapida de enfriamiento, la cantidad de energia empleada para la pasteurizacion se puede reducir. Esto no solo puede dar lugar a un ahorro en los costes, sino que puede que no afecte negativamente a la calidad del aceite microbiano (final); de hecho, parece tener efectos beneficiosos sobre el aceite.
Tercer aspecto — Area bajo la grafica del tiempo frente a la temperatura (aporte energetico)
Se observara del segundo aspecto, que si el protocolo de pasteurizacion de la descripcion se representa en una grafica del tiempo frente a la temperatura, se obtiene una forma de trapecio. La primera etapa (de calentamiento) y la tercera etapa (de enfriamiento) pueden tener cada una forma triangular, mientras que la intermedia o segunda etapa (de meseta) (el objeto del cuarto aspecto) es (normalmente) rectangular. El area bajo la grafica del tiempo frente a la temperatura representa la cantidad de energia aportada al sistema. Al dividir el protocolo de pasteurizacion en tres partes, se puede calcular el area de la grafica, y por consiguiente, el aporte energetico.
En el tercer aspecto, el area bajo la grafica del tiempo (en minutos) frente a la temperatura (en °C) es menor que 13.000°C/minuto. Sin embargo, se han conseguido cantidades mucho menores que esta, y son posibles valores menores que 11.000, 10.000, 9.000, 8.000 o incluso 1.000°C/minuto. En aspectos preferidos de esta descripcion, estos valores no pueden ser mayores que 7.000, 6.000 u 800°C/minuto. En la grafica a la cual se hace referencia, el tiempo se representa en el eje x (o eje horizontal o de abscisas), y 0°C representa el origen. La temperatura se representara, de este modo, en el eje y (o eje vertical o de ordenas), y 0°C representa el origen.
Una vez que las celulas microbianas han sido calentadas hasta su temperatura de pasteurizacion, entonces pueden enfriarse (o son enfriadas). Las celulas normalmente se enfrian a temperatura en condiciones normales o ambiente, o al menos a una temperatura menor que 30°C. Por lo tanto, existe un tiempo, no solo para que las celulas se calienten de 30°C a 60°C, sino que tambien existe un tiempo para que las celulas se enfrien de 60°C a 30°C. Se pueden sumar estos dos tiempos para obtener un tiempo combinado de calentamiento y enfriamiento de 30-60 a 30°C. Preferiblemente, este conjunto es unicamente menor que 150 minutos, tal como menor que 120 o 100 minutos. Sin embargo, con muestras mas pequenas, se pueden conseguir tiempos mucho mas rapidos, y el tiempo combinado (de 30 a 60, y vuelta a 30°C) puede ser menor que 70, 50 o incluso 30 minutos.
Cuarto aspecto — Protocolo de pasteurizacion con etapa de meseta
Este protocolo puede ser un protocolo conforme al segundo aspecto, en el cual existen una (por ejemplo, primera) etapa de calentamiento, y una (por ejemplo, segunda) etapa de enfriamiento y, entre medias, una etapa (por ejemplo, segunda, media o intermedia) de meseta. Sin embargo, esto no es esencial, y se pueden considerar otros protocolos de pasteurizacion. El cuarto aspecto se refiere a las peculiaridades preferidas de esta etapa de meseta. Todas las peculiaridades y caracteristicas del segundo (y de otros) aspectos se aplican a este cuarto aspecto mutatis mutandis.
Las celulas se mantienen o se conservan a una temperatura deseada particular (mas o menos 1, 2, 5 o incluso 10°C) para una temperatura T (°C) durante un tiempo t (minutos). Estos dos parametros se pueden multiplicar entre si para dar el producto t.T. Este es convenientemente de 140 o 280 a 50.000 o 100.800°C/minuto. Preferiblemente, este producto es de 500, 1.000, 2.000 o 3.000, o incluso 6.000 hasta 10.000, 18.000 o 25.000°C/minuto. De forma optima, el producto t.T es de 2.000 a 6.000, tal como de 3.000 a 5.000, y de forma optima de 4.000 a 4.500°C/minuto. En algunas realizaciones, el producto t.T es de 13 a 900, tal como de 100 o 200 a 700 o 800, y de forma optima de 300 a 400 a 600 o 700°C/minuto.
De este modo, de una forma similar al tercer aspecto, se notara que el producto t.T representa el area bajo la grafica del tiempo frente a la temperatura para las celulas, cuando se mantienen a la temperatura elevada. De este modo, el factor de multiplicacion t.T es, efectivamente, el area bajo la grafica para la etapa de meseta unicamente (sin incluir el calentamiento ni el enfriamiento).
Extraccion de un AGPI
Un quinto aspecto de la presente descripcion se refiere a un procedimiento para obtener un AGPI a partir de celulas microbianas, el cual comprende pasteurizar las celulas conforme a cualquiera del primer, segundo, tercero o cuarto aspectos de la descripcion, como se describieron anteriormente, y extraer y/o aislar de las celulas pasteurizadas un AGPI.
Como se explica, la presente invencion se refiere a un aceite microbiano bruto o sin refinar, que tiene un contenido de trigliceridos de al menos el 90% y un indice de peroxidos (IP) menor que 2,5, y que comprende al menos 40% de acido araquidonico (AA). El aceite puede tener un IP menor que 2,5, 1,5, 0,8, 0,6, o incluso 0,5, y/o un lAn menor que 1,0. El aceite se prepara mediante el procedimiento del quinto aspecto.
Acidos grasos poliinsaturados (AGPI) y aceites microbianos
El AA se puede obtener mediante las celulas pasteurizadas en el procedimiento de la descripcion, tales como una celula microbiana. Puede tratarse de una celula de bacteria, alga, hongo o levadura. La fuente de AA preferida es la Mortierella alpina, Blakeslea trispora, Aspergillus terreus o Pythium insidiosum. El aceite microbiano puede ser un liquido (a temperatura ambiente).
Se prefiere que la mayor parte del AGPI este en forma de trigliceridos. De estos trigliceridos, preferiblemente al menos 40%, tal como al menos 50%, y de forma optima al menos 60% del AGPI esta presente en la posicion a del glicerol (presente en la cadena principal de los trigliceridos), tambien conocida como la posicion 1 o 3. Se prefiere que al menos 20%, tal como al menos 30%, de forma optima al menos 40% del AGPI este en la posicion b(2).
El aceite microbiano comprende al menos 40 o 45% de acido araquidonico, y tiene un contenido de trigliceridos de al menos 90%. Preferiblemente, el aceite microbiano tiene un contenido de trigliceridos de 90 a 100%, tal como al menos 96%, preferiblemente al menos 98%, mas preferiblemente al menos 99%, y de forma optima mas de 99,5%. Tipicamente, el aceite microbiano tendra un contenido de acido eicosapentenoico (EPA) menor que 5%, preferiblemente menor que 1%, y mas preferiblemente menor que 0,5%. El aceite puede tener menos de 5%, menos de 2%, menos de 1% de cada acido graso poliinsaturado (AGPI) C2o, C20:3, C22:0 y/o C24:0. El contenido de acidos grasos libres (AGL) puede ser <0,4, 0,2 o 0,1. El aceite puede tener un poco o nada de AGL y/o ADGL.
El aceite microbiano puede ser un aceite bruto. Puede haber sido extraido de las celulas utilizando un disolvente, tal como dioxido de carbono supercritico, hexano o isopropanol.
Procedimiento de pasteurizacion
La pasteurizacion tendra lugar, en general, una vez haya terminado la fermentacion. En una realizacion preferida, la pasteurizacion dara fin a la fermentacion, ya que durante la pasteurizacion el calor matara a las celulas. Por lo tanto, la pasteurizacion se puede realizar sobre el caldo de fermentacion (o las celulas en el medio liquido (acuoso)), aunque se puede realizar sobre la biomasa microbiana obtenida del caldo. En el primer caso, la pasteurizacion se puede llevar a cabo mientras las celulas microbianas estan aun dentro del fermentador. La pasteurizacion, preferiblemente tiene lugar antes de cualquier procesamiento adicional de las celulas microbianas, por ejemplo desmenuzado en forma de granulos (por ejemplo, por extrusion) o amasado.
Preferiblemente, el protocolo de pasteurizacion es suficiente para inhibir o inactivar una o mas enzimas que pueden afectar negativamente o degradar un AGPI o aceite microbiano, por ejemplo una lipasa.
Una vez haya terminado la fermentacion, el caldo de fermentacion se puede filtrar, o tratar de otro modo para eliminar agua o liquidos acuosos. Tras la eliminacion del agua, se puede obtener una “torta” de biomasa. Si la pasteurizacion no ha tenido lugar, las celulas deshidratadas (o torta de biomasa) se puede someter a la pasteurizacion.
Procedimiento de extraccion de AGPI
El AGPI (o aceite microbiano, que normalmente comprende el AGPI) puede entonces extraerse de las celulas microbianas (pasteurizadas). Preferiblemente, se extrae de granulos (por ejemplo, secos) (por ejemplo, extrusados) que contienen las celulas. La extraccion se puede llevar a cabo utilizando un disolvente. Preferiblemente, se utiliza un disolvente apolar, por ejemplo un alcano de C1-8 , preferiblemente de C2-6, por ejemplo hexano. Se puede utilizar dioxido de carbono (en forma liquida, por ejemplo en estado supercritico).
Preferiblemente, se deja que el disolvente se filtre a traves de los granulos secos. En el documento WO-A-97/37032 se describen tecnicas adecuadas de granulacion y de extrusion de microorganismos, y la subsecuente extraccion de un aceite microbiano que contiene AGPI.
El disolvente permite obtener un aceite bruto que contiene AGPI. Este aceite se puede utilizar en ese estado, sin procesamiento adicional, o puede someterse a una o mas etapas de refinado. Sin embargo, un aceite bruto es normalmente aquel que contiene un disolvente, tal como un disolvente usado para extraer el aceite (por ejemplo, hexano, o un alcohol tal como alcohol isopropilico), o que no ha sido sometido a una (preferiblemente a ninguna) de las siguientes etapas de refinado. En la solicitud de patente internacional n° PCT/EP01/08902 se describen protocolos de refinado adecuados. Por ejemplo, el aceite se puede someter a una o mas etapas de refinado, que pueden incluir tratamiento con acido o desgomado, tratamiento alcalino o eliminacion de acidos grasos libres, decoloracion o eliminacion de pigmentos, filtracion, invernacion (o enfriamiento, por ejemplo para eliminar trigliceridos saturados), desodorizacion (o eliminacion de acidos grasos libres) y/o pulido (o eliminacion de sustancias insolubles en aceite). Todas estas etapas de refinado se describen con mas detalle en el documento PCT/EP01/08902, y se pueden aplicar a las etapas descritas en la presente solicitud mutatis mutandis.
El aceite resultante es particularmente adecuado para fines nutricionales, y puede anadirse a alimentos (para humanos) o a productos alimentarios (para animales). Los ejemplos incluyen leche, preparados para lactantes, bebidas saludables, pan y piensos.
Celulas microbianas
Las celulas microbianas (o microorganismos) que se utilizan en la presente invencion pueden ser cualquiera de las descritas anteriormente, especialmente en la seccion referente a los AGPI y aceites microbianos. Pueden comprender, o ser capaces de producir, un AGPI o aceite microbiano, y convenientemente el aceite que contiene AGPI puede extraerse o aislarse de las celulas. Pueden estar en forma de filamentos, como hongos o bacterias, o como celulas individuales, como levaduras, algas y bacterias. Las celulas pueden comprender microorganismos que son levaduras, hongos, bacterias o algas. Se prefieren los hongos del orden de Mucorales, por ejemplo los hongos pueden ser del genero Mortierella, Phycomyces, Blakeslea o Aspergillus. Se prefieren los hongos de las especies Mortierella alpina, Blakeslea trispora y Aspergillus terreus.
Calentamiento
Se puede llevar a cabo por calentamiento (de las celulas) directo o indirecto. El calentamiento, si es directo, puede hacerse haciendo pasar vapor al fermentador. Un metodo indirecto puede utilizar intercambiadores de calor, bien a traves de la pared del fermentador, o con serpentines calentadores, o con un intercambiador de calor externo, tal como un intercambiador de calor de placas.
Normalmente, la pasteurizacion tendra lugar en la vasija de fermentacion en la cual se ha realizado la fermentacion. Sin embargo, para algunos organismos (tales como bacterias), a menudo se prefiere eliminar antes las celulas de la vasija, y despues pasteurizar. La pasteurizacion puede tener lugar antes de otro procesamiento de los organismos, por ejemplo secado o granulacion.
La pasteurizacion normalmente matara a la mayoria de, si no a todos, los microorganismos. Tras la pasteurizacion, al menos 95%, 96 o incluso 98% de los microorganismos han sido eliminados, es decir, no estan vivos.
Acidificacion
En algunos casos es deseable reducir el riesgo de crecimiento de las celulas pasteurizadas. Una posibilidad es acidificar las celulas con un acido adecuado. De este modo, para prevenir el crecimiento de las especies microbianas, puede ser deseable ajustar el pH de las celulas a un intervalo de 3 a 4. Sin embargo, se pueden emplear intervalos de pH mas amplios, dependiendo de las celulas, y asi el pH se puede ajustar de 2 a 5, de forma optima a un intervalo de aproximadamente 3,3 a 3,7.
La acidificacion de las celulas puede tener lugar antes de la pasteurizacion. Sin embargo, se realiza preferiblemente despues.
El pH se puede ajustar por cualquier medio conveniente, o con cualquier acido adecuado. Preferiblemente, esto se consigue utilizando acido fosforico, tal como al 85%, o diluido al 55%, o acido fosforico al 33%.
Indice de peroxidos (IP)
Preferiblemente, el IP del aceite microbiano es menor que 2,5. Sin embargo, el IP puede ser no mayor que 2,0. Sin embargo, se pueden obtener valores de IP mucho mas bajos utilizando el procedimiento de la descripcion, y estos valores pueden ser menores quee 1,5 o menores que 1,0. Se pueden obtener valores de IP menores que 0,8 o 0,6, e incluso menores que 0,4. Los valores (de las realizaciones) oscilaron entre 1,3 (o 0,8) y 0,4. La unidad (de IP) es generalmente meq/kg.
Indice de anisidina (IAn)
Este valor puede dar una medida del contenido de aldehidos. Preferiblemente, el indice de anisidina del aceite microbiano es de 5, 6, 7 o 10 a 15, 20 o 25, especialmente para un aceite bruto. Convenientemente, el IAn es menor que 20, por ejemplo, menor que 15. Puede ser no mayor que 10 o incluso no mayor que 5. Preferiblemente, los valores del IP y/o del IAn hacen referencia a un aceite bruto en lugar de uno refinado. Los valores de IAn (en los experimentos preferidos) oscilaron entre 15 a 5, opcionalmente entre 12 a 7.
Aceites brutos frente a refinados
A continuacion se presentan algunas diferencias entre estos dos aceites. Cada aceite bruto o refinado puede tener una o mas de las caracteristicas en la siguiente Tabla para el aceite bruto o refinado, segun sea oportuno. Un aceite bruto contendra normalmente un antioxidante (por ejemplo, tocoferol, palmitato de ascorbilo).
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Convenientemente, el aceite bruto en la presente invencion puede tener una o mas de las siguientes caracteristicas:
(a) un contenido de insaponificables de 2,0 a 3,5% (p/p);
(b) un contenido de disolvente (por ejemplo, hexano) de 10, 50 o 100 ppm hasta 1000, 1500 o 2000 ppm;
(c) un contenido de acidos grasos libres de 0,1 o 0,2% a 1%, por ejemplo 0,2-0,6 o 0,3-0,5%;
(d) un contenido de fosforo de al menos 2, 3 o 5 mg/kg;
(e) un contenido de silicio de 50 o 100 ppm a 500 ppm; y/o un contenido de agua menor que 1%, o de 0,5 a 1 o 2%.
Usos de aceites y AGPI
Un sexto aspecto de la descripcion se refiere a una composicion que comprende el aceite del quinto aspecto, y, cuando sea oportuno, una o mas sustancias (adicionales). La composicion puede ser un producto alimentario, y/o un suplemento alimentario para animales o seres humanos. En realizaciones de la invencion que son para consumo humano, los aceites pueden resultar adecuados para el consumo humano, tipicamente mediante el refinado o la purificacion del aceite obtenido de los microorganismos.
La composicion puede ser un preparado para lactantes o un producto alimentario (para seres humanos). La composicion del preparado se puede ajustar de forma que tenga una cantidad similar de lipidos o AGPI a la leche materna natural. Esto puede implicar mezclar el aceite microbiano de la invencion con otros aceites para conseguir la composicion adecuada.
La composicion puede ser una composicion de piensos o un suplemento para animales o para especies marinas. Dichos piensos y suplementos se pueden suministrar a cualquier animal de una explotacion agraria, en particular a ganado ovino, bovino y avicola. Ademas, los piensos o suplementos se pueden suministrar a organismos marinos criados en piscifactorias, tales como peces y mariscos. La composicion puede, de este modo, incluir una o mas sustancias o ingredientes alimentarios para tales animales.
El aceite de la invencion puede venderse directamente como un aceite contenido en un envase apropiado, tipicamente botellas de aluminio de una pieza recubiertas internamente con una laca epoxifenolica, y purgado con nitrogeno. El aceite puede contener uno o mas antioxidantes (por ejemplo, tocoferol, vitamina E, palmitato), cada uno, por ejemplo, a una concentracion de 50 a 800 ppm, tal como 100 a 700 ppm.
Se pueden incluir en las composiciones adecuadas composiciones farmaceuticas o veterinarias, por ejemplo para administracion oral, o composiciones cosmeticas. El aceite puede tomarse como tal, o puede encapsularse, por ejemplo con una cubierta, y de este modo puede estar en forma de capsulas. La cubierta o las capsulas pueden contener gelatina y/o glicerol. La composicion puede contener otros ingredientes, por ejemplo saborizantes (por ejemplo, sabor a limon o lima), o un vehiculo o excipiente farmaceutica o veterinariamente aceptable.
Las peculiaridades o caracteristicas preferidas de un aspecto de la invencion son aplicables a otro aspecto mutatis mutandis.
La invencion se describira ahora, a modo de ejemplo, con referencia a los siguientes Ejemplos, los cuales se proporcionan a modo de ilustracion, y no con la intencion de limitar el alcance.
EJEMPLOS
Ejemplo 1
Se cree que la actividad enzimatica causa la oxidacion durante la produccion de un aceite microbiano que contiene AGPI. Se considero la pasteurizacion como un metodo para estabilizar la oxidacion durante el procesamiento de celulas microbianas para obtener el aceite microbiano. Se descubrio que el grado de estabilizacion era dependiente de las condiciones de pasteurizacion.
Por lo tanto, se llevaron a cabo varios experimentos para determinar que condiciones de pasteurizacion podrian afectar el nivel de oxidacion, y en particular el indice de peroxidos (IP) del aceite. Los indices de peroxidos se determinaron utilizando el protocolo estandar detallado en AOCS:Cd8-53.
Los experimentos siguen el siguiente protocolo: fermentacion; conservacion; pasteurizacion; extraccion (del aceite microbiano); y analisis del aceite.
El hongo Mortierella alpina se cultivo en un fermentador. La fermentacion duro aproximadamente 148 horas. El M. alpina produjo el AGPI llamado acido araquidonico (AA). La biomasa se elimino del fermentador, y se conservo (a una temperatura menor que -18°C).
Las muestras de la biomasa de M. alpina se eliminaron del caldo de fermentacion, mientras este se encontraba aun dentro del fermentador, y se congelaron inmediatamente.
Se evaluaron varios protocolos de pasteurizacion. La pasteurizacion se llevo a cabo a tres temperaturas diferentes, a saber: 40, 70 y 85°C. El protocolo siguio un procedimiento de tres etapas, con una primera etapa de calentamiento rapido, seguida de una meseta (una segunda etapa o etapa intermedia) a la temperatura deseada, que fue la temperatura maxima utilizada. Despues, hubo una (tercera) etapa de enfriamiento rapido. Se sometieron diferentes muestras de la biomasa a una etapa (de meseta) intermedia con tres tiempos diferentes, a saber: una, dos y 24 horas.
Tras la pasteurizacion, el aceite microbiano se obtuvo utilizando una tecnica de extraccion por via humeda. Esta muestra de la biomasa se filtro, se prenso (a presion) y se extrajo el aceite.
El aceite microbiano se analizo posteriormente, fundamentalmente para obtener el indice de peroxidos (IP) utilizando un metodo de la AOCS. Se determino el contenido de AA para algunas de las muestras. Los analisis mostraron que el aceite microbiano obtenido contenia aproximadamente 420 g de AA por kg.
Protocolo detallado: fermentacion y extraccion de muestras
Se recogio un litro del caldo de fermentacion de la vasija de fermentacion y se filtro (filtro Seitz de dos litros, F-FA10). La torta resultante se lavo entonces con 600 ml de agua desmineralizada. La torta humeda se seco durante un minuto con una corriente de aire caliente, y se prenso (utilizando un aparato HAFICO™, prensa de tintura, C-OAO21, 300-400 atm) a 400 bares. El extrusado humedo se utilizo despues para extraer un aceite microbiano con 500 ml de hexano (Merck) a temperatura ambiente (20 a 25°C) durante una hora utilizando una maquina Ultra Turrax™. Entonces, el hexano se decanto. La torta restante se lavo entonces con 250 ml de hexano reciente (con agitacion, durante 30 minutos) a temperatura ambiente. El hexano se decanto, y se anadio despues al hexano extraido previamente.
Posteriormente, el extracto se filtro utilizando un filtro de vidrio combinado con un filtro de vidrio GFA. Despues, el hexano se evaporo del extracto transparente, utilizando una maquina Rotavapor™, a aproximadamente 50°C durante unos 15 minutos. El aceite se transfirio despues a copas hermeticas, y cada copa de la muestra se purgo entonces con nitrogeno durante 30 segundos. Despues, la copa de la muestra se cerro y se almaceno a -182C.
Protocolos de pasteurizacion
Se evaluaron tres protocolos diferentes (A, B y C). Cada uno se componia de tres etapas, una primera etapa de calentamiento, una segunda etapa de meseta (a una temperatura maxima), y una tercera etapa de enfriamiento. La Tabla 1 muestra, a continuacion, los protocolos para los tres perfiles de pasteurizacion.
Figure imgf000011_0001
Los tres perfiles de pasteurizacion A, B y C se muestran adicionalmente de forma grafica en la Figura 1. Como se puede notar, el area bajo la grafica de la temperatura (T, °C) frente al tiempo (t, minutos) se puede calcular para cada una de las tres etapas en cada perfil, y despues se pueden sumar para dar el area total bajo la grafica para cada uno de los tres perfiles. Estos calculos se muestran adicionalmente en la Tabla 1 anterior.
El indice de peroxidos (IP) se determino para los aceites que resultan de la extraccion de las celulas, siguiendo los tres protocolos de pasteurizacion A, B y C. El IP para los aceites extraidos fue 8,7, 14,3 y 2,4, respectivamente. El perfil B tuvo velocidades de calentamiento y de enfriamiento lentas, y se presenta unicamente para comparacion. Este dio el IP mas alto, de 14,3.
Por el contrario, tanto el perfil A como el C estan dentro de la invencion. El perfil A tiene una velocidad de calentamiento y una velocidad de enfriamiento mas rapidas en la primera y la tercera etapa que el perfil B. Preferiblemente, en la invencion, las velocidades de calentamiento y de enfriamiento son al menos tan rapidas como las que se muestran en el perfil A. El perfil A dio un IP de 8,7.
Sin embargo, los mejores resultados se obtuvieron utilizando el perfil C, el cual tuvo un IP de solo 2,4. Como se puede observar a la vista de la Figura 1, este tuvo una etapa de calentamiento muy rapida, y una (tercera) etapa de enfriamiento rapida.
Ejemplo 2
Se realizaron experimentos similares a los del Ejemplo 1, excepto que esta vez la temperatura de pasteurizacion se vario mucho mas, a saber: a 40°C (para comparacion), 70°C y 85°C. El perfil de la temperatura (°C) frente al tiempo (minutos) se muestra en la Figura 2 y en la Tabla 2 a continuacion. El perfil fue esencialmente el mismo para todas las muestras, pero por supuesto, con una prolongacion de la meseta de pasteurizacion (desde una hora hasta 4 o 24 horas) segun corresponda.
Tabla 2
Figure imgf000012_0001
Se analizaron muestras de dos fermentaciones distintas (ambas de M. alpina) de diferente duracion. Muestras del n° 11 al 20. La Tabla 3 tuvo una fermentacion que duro un poco mas, en la que aproximadamente 2 m3 del caldo se transfirieron a un fermentador para inoculos, y la fermentacion se prolongo durante 48 horas sin anadir mas glucosa.
Tras la pasteurizacion, las muestras se procesaron, empezando por la filtracion a una presion de aproximadamente 1 bar de nitrogeno. La torta resultante se lavo despues con agua de procedimiento (aproximadamente 0,6 del volumen inicial del caldo). La deshidratacion se llevo a cabo utilizando una prensa para fruta, ejerciendo una presion sobre el piston de 300 a 400 bares. Posteriormente, se anadieron 500 ml de hexano reciente, y se mezclo durante un minuto utilizando una maquina Ultra-Turrax. Despues, la extraccion tuvo lugar durante aproximadamente una hora a temperatura ambiente. Tras la filtracion, la torta resultante se lavo con 250 ml de hexano reciente, y el disolvente resultante se evaporo a vacfo a 60 a 70°C. Se purgo despues con nitrogeno y se almaceno a -182C.
Los resultados se muestran en la Tabla 3, la cual incluye el primer y el segundo fndice de peroxidos medido, y la media de estos dos valores, asf como el fndice de anisidina (lAn). La disminucion del IP y del lAn se muestran tambien en las Figuras 3 y 4 (para las fermentaciones de menor y de mayor duracion, respectivamente).
Tabla 3
Figure imgf000013_0001
Se podra observar a la vista de los resultados que, sin pasteurizacion, el IP fue 5,6 o 5,7. La pasteurizacion a 40°C disminuyo el IP, pero se requirio un tiempo relativamente largo (tal como 24 horas) a la temperatura de pasteurizacion para disminuir el IP hasta un valor aceptable de 2,1.
Se obtuvieron mejores resultados para temperaturas mas altas. Por ejemplo, la pasteurizacion durante solo 1 hora a 70°C dio un IP de 2,2, comparado con un IP de 2,1 durante 24 horas a 40°C. Incluso se obtuvieron mejores valores a temperaturas mas altas, obteniendo un valor de IP de solo 1,2 a 85°C durante 1 hora. (Estas cifras se refieren a la fermentacion de menor duracion, aunque se pueden obtener resultados similares con celulas cultivadas durante la fermentacion de mayor duracion).
De este modo, las Figuras 3 y 4 muestran graficamente como varfan los valores de IP y de IAn con respecto a diferentes tiempos de pasteurizacion. Como cabfa esperar, tiempos de pasteurizacion mas largos dan menores valores de IP y de IAn. Sin embargo, tiene mayor importancia el uso de temperaturas relativamente altas durante la pasteurizacion. Cuando se aumento la temperatura de pasteurizacion (Tpast) hasta 70°C, se observo una marcada disminucion del IAn y del IP, y se dieron valores aun menores a 852C. (Las tres lineas superiores, representadas por cruces, circulos rellenos y asteriscos, muestran los valores de IAn, mientras que las tres lineas inferiores, representadas por diamantes, cuadrados y triangulos, dan los valores de IP).
La Tabla 4 muestra a continuacion el producto calculado t.T (en °C.minuto) para los nueve protocolos de pasteurizacion diferentes (para tres temperaturas de meseta diferentes y para tres tiempos diferentes). De hecho, este producto representa el area bajo la grafica (del tiempo, t, minutos, frente a la temperatura, T, °C) para la etapa de meseta (despues de la etapa de calentamiento, pero antes de la etapa de enfriamiento).
Tabla 4
Figure imgf000014_0001
Ejemplo 3
Se realizaron mas analisis de pasteurizacion utilizando el caldo de fermentacion, obtenido tras la fermentacion a escala de produccion, utilizando el hongo M. alpina, como se utilizo previamente de ejemplo. El caldo sin pasteurizar (800 litros) se transporto y se almaceno a 4°C. El caldo se transfirio despues a una vasija de 700 litros agitada, y se llevaron a cabo 10 protocolos de pasteurizacion diferentes.
En primer lugar, la pasteurizacion se llevo a cabo a cinco temperaturas (maximas) diferentes, a saber: 140, 120, 100, 80 y 60°C, con un tiempo de permanencia (meseta) de 8 segundos (a temperatura maxima). En segundo lugar, la pasteurizacion se llevo a cabo a 140, 120, 100, 80 y 60°C, con un tiempo de permanencia (meseta) de 300 segundos a temperatura maxima.
Se tomaron muestras (2 litros) y entonces se congelaron directamente a -18°C. Se tomaron muestras esteriles (200 ml) y se congelaron, y se recupero de las muestras un aceite bruto que contenia AA, utilizando el siguiente protocolo.
Se filtro una muestra del caldo de fermentacion (1,7 litros) a 1 bar de N2. La torta se lavo con 0,6 volumenes de agua condensada, y se comprimio durante aproximadamente 5 minutos a 400 kg/cm2. Posteriormente, se anadio n-hexano (500 ml) al residuo humedo, y se granulo utilizando una maquina Ultra-Turrax a 24.000 rpm. El aceite se extrajo a temperatura ambiente (aproximadamente 21°C) durante unos 110 minutos. La suspension se filtro a vacio utilizando un medio de filtro GF/A Whatman. La torta se lavo con 250 ml de hexano reciente. El hexano se evaporo durante 15 minutos en un bano de agua a una temperatura de aproximadamente 60 a 70°C. El aceite resultante se transfirio despues a copas hermeticas de muestras, las cuales se purgaron con nitrogeno durante 30 segundos, despues se cerraron y se conservaron a -18°C antes del analisis.
Las Figuras 5, 6 y 7 proporcionan los datos tras el analisis. Las Figuras 6 y 7 muestran los perfiles del tiempo frente a la temperatura para los dos conjuntos de experimentos, en primer lugar del tiempo de meseta (permanencia) de 8 segundos, y en segundo lugar para el tiempo de meseta (permanencia) de 5 minutos, para cada una de las 5 condiciones de temperatura, respectivamente. Como se observa a la vista de las graficas, la linea horizontal intermedia (que representa 8 segundos o 5 minutos) muestra la etapa de meseta.
La Figura 5 muestra los valores resultantes del IP y del IAn para los 10 regimenes de pasteurizacion. Como se puede observar, se obtuvieron menores valores de IP con temperaturas cada vez mayores, y el mayor tiempo de residencia (5 minutos) dio el valor de IP mas bajo.

Claims (5)

REIVINDICACIONES
1. Un aceite microbiano bruto o sin refinar, que tiene un contenido en trigliceridos de al menos 90% y un indice de peroxidos (IP) menor que 2,5, y que comprende al menos 40% de acido araquidonico (AA).
2. Un aceite microbiano bruto o sin refinar de acuerdo con la reivindicacion 1, que tiene un IP menor que 1,5.
3. Un procedimiento que comprende someter al aceite de acuerdo con la reivindicacion 1 o 2 a una o mas etapas de refinado, que incluyen preferiblemente el tratamiento con acido o desgomado, tratamiento alcalino o eliminacion de acidos grasos libres, filtracion, invernacion, desodorizacion y/o pulido.
4. Un procedimiento de acuerdo con la reivindicacion 3, que comprende anadir el aceite resultante a alimentos para seres humanos o a productos alimentarios para animales.
5. Un procedimiento de acuerdo con la reivindicacion 3 o 4, que comprende anadir el aceite resultante a preparados para lactantes.
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