ES2872009T3 - Método de aislamiento de lípidos a partir de una biomasa que contiene lípidos - Google Patents

Abstract

Un método de aislamiento de un lípido que contiene ácidos grasos poliinsaturados (PUFA) a partir de una biomasa, que comprende las siguientes etapas: a) proporcionar una suspensión de una biomasa que comprende células que contienen un lípido que contiene PUFA; b) opcionalmente lisar las células de la biomasa; c) concentrar la suspensión hasta un contenido de materia seca total (TDM) del 20 al 60% en peso, si la suspensión tiene un contenido de TDM menor; d) ajustar en la suspensión una temperatura de 20ºC a 100ºC, preferiblemente de 25, 30, 40, 50 o 60ºC a 100ºC, más preferiblemente de 65ºC a 95ºC, en particular de 70 a 90ºC; e) mantener la temperatura en el intervalo descrito en (d) durante al menos 1 hora, preferiblemente durante al menos 2, 3, 4, 5, 6, 7 u 8 horas, más preferiblemente durante de 1 a 36 horas, en particular durante de 2, 3, 4, 5, 6, 7 u 8 horas a 36 horas, más preferiblemente de 10 a 24 horas, al tiempo que se añaden en total de 7,5 a 25 moles, preferiblemente de 8,5 a 22 moles, en particular de 10 a 20, más preferiblemente de 11 a 18, sobre todo de 12 a 17 moles, de equivalente de base a 10 kg de materia seca total contenida en la suspensión.

Description

DESCRIPCIÓN

Método de aislamiento de lípidos a partir de una biomasa que contiene lípidos

La presente invención se refiere a un método de aislamiento de lípidos que contienen ácidos grasos poliinsaturados a partir de una biomasa que contiene lípidos.

Los lípidos que contienen PUFA (ácidos grasos poliinsaturados) son de alto interés en la industria de los piensos, alimenticia y farmacéutica. Debido a la sobreexplotación pesquera hay una alta necesidad de fuentes alternativas para lípidos que contienen PUFA además del aceite de pescado. Resultó que además de ciertas cepas de levadura y algas, en particular las células de microalgas como aquellas del orden Thraustochytriales son una fuente muy buena para lípidos que contienen PUFA.

Pero con respecto a organismos microbianos y en particular células del orden Thraustochytriales, que producen los lípidos que contienen PUFA, el aislamiento del aceite a partir de las células resultó ser un problema particular. El modo más efectivo de aislar el aceite era el uso de disolventes orgánicos como el hexano. Pero el uso de disolventes orgánicos conduce a condiciones de funcionamiento peligrosas, requiere el uso de equipamiento a prueba de explosiones caro y requiere la implementación de un proceso de recuperación de disolvente caro para evitar la contaminación del medio ambiente.

En el intento por evitar el uso de disolventes orgánicos, ha resultado ser un modo alternativo efectivo para aislar el aceite la precipitación por sales del aceite con altas cantidades de cloruro de sodio. Pero el uso de altas cantidades de cloruro de sodio conduce a un subproducto de biomasa deslipidada que, debido al alto contenido de sal, no puede utilizarse como ingrediente de pienso, de modo que el proceso no es muy sostenible. Además, la alta concentración de sal conduce a una rápida corrosión del equipamiento de acero usado.

Por tanto, era el objeto de la presente invención proporcionar un método efectivo para aislar un lípido, en particular un lípido que contiene PUFA, a partir de células que contienen lípidos, en particular del orden Thraustochytriales, y simultáneamente evitar no solo la necesidad de disolventes orgánicos, sino evitar además la necesidad de altas cantidades de sales para realizar el aislamiento efectivo del aceite a partir de las células.

Era un objeto adicional de la presente invención proporcionar un método para aislar un lípido, en particular un lípido que contiene PUFA, a partir de células que contienen lípidos, en particular del orden Thraustochytriales, y simultáneamente proporcionar una biomasa deslipidada que pueda utilizarse de un modo comercial, preferiblemente en el campo agrícola.

Resultó que puede realizarse un aislamiento efectivo del lípido a partir de la biomasa si la biomasa, en particular tras el lisado, se incuba con una cantidad específica de equivalentes de base, preferiblemente a un pH alcalino bajo y a una temperatura de no más de 100°C. Manteniendo la temperatura muy por debajo de 100°C, fue posible excluir al menos esencialmente la saponificación de los ésteres de ácidos grasos.

Fue muy sorprendente según la invención encontrar que cuando se añade una cantidad específica, bien definida, de equivalentes de base a la cantidad de biomasa contenida en la suspensión, que no tiene que ser ni demasiado baja ni demasiado alta, entonces el pH y la temperatura e incluso el tiempo de exposición no parecen desempeñar un papel importante para realizar una desemulsificación eficiente. Esto significa que la separación del aceite de la biomasa residual podría llevarse a cabo en condiciones muy suaves para los PUFA contenidos, así como en circunstancias muy económicas, ya que una baja temperatura y un bajo tiempo de exposición significan un bajo aporte de energía y además un ahorro de tiempo.

Por tanto, un primer objeto de la presente invención es un método de aislamiento de un lípido que contiene ácidos grasos poliinsaturados (PUFA) a partir de una biomasa, que comprende las siguientes etapas:

a) proporcionar una suspensión de una biomasa que comprende células que contienen un lípido que contiene PUFA;

b) opcionalmente lisar las células de la biomasa;

c) concentrar la suspensión hasta un contenido de materia seca total (TDM, total dry matter) del 20 al 60% en peso, preferiblemente del 25 al 60% en peso, más preferiblemente del 30 al 55% en peso, si la suspensión tiene un contenido de TDM menor;

d) ajustar en la suspensión una temperatura de 20°C a 100°C, preferiblemente de 25, 30, 40, 50 o 60°C a 100°C, más preferiblemente de 65°C a 95°C, en particular de 70 a 90°C;

e) mantener la temperatura en los intervalos descritos en (d) durante al menos 1 hora, preferiblemente durante al menos 2, 3, 4, 5, 6, 7 u 8 horas, más preferiblemente durante de 1 a 36 horas, en particular durante de 2, 3, 4, 5, 6, 7 u 8 horas a 36 horas, más preferiblemente de 10 a 24 horas, al tiempo que se añaden en total de 7,5 a 25 moles, preferiblemente de 8,5 a 22 moles, en particular de 10 a 20, más preferiblemente de 11 a 18, sobre todo de 12 a 17, en particular de 12 a 15, moles de equivalente de base a 10 kg de materia seca total contenida en la suspensión de la biomasa opcionalmente lisada.

Fue muy sorprendente en este contexto que la desemulsificación pudiera llevarse a cabo de manera eficiente incluso a una temperatura por debajo de 80°C, y en particular a una temperatura por debajo de 60°C.

Por tanto, un objeto particular de la presente invención es un método de aislamiento de un lípido que contiene ácidos grasos poliinsaturados (PUFA) a partir de una biomasa, que comprende las siguientes etapas:

a) proporcionar una suspensión de una biomasa que comprende células que contienen un lípido que contiene PUFA;

b) opcionalmente lisar las células de la biomasa;

c) concentrar la suspensión hasta un contenido de materia seca total (TDM) del 20 al 60% en peso, preferiblemente del 25 al 60% en peso, más preferiblemente del 30 al 55% en peso, si la suspensión tiene un contenido de TDM menor;

d) ajustar en la suspensión una temperatura de 20°C a por debajo de 80°C, preferiblemente una temperatura de 25°C a por debajo de 60°C, más preferiblemente de 25°C a 58°C, en particular de 30 a 55°C, sobre todo una temperatura de 30°C a 50°C;

e) mantener la temperatura en los intervalos descritos en (d) durante al menos 1 hora, preferiblemente durante al menos 2, 3, 4, 5, 6, 7 u 8 horas, más preferiblemente durante de 1 a 36 horas, en particular durante de 2, 3, 4, 5, 6, 7 u 8 horas a 36 horas, más preferiblemente de 10 a 24 horas, al tiempo que se añaden en total de 7,5 a 25 moles, preferiblemente de 8,5 a 22 moles, en particular de 10 a 20, más preferiblemente de 11 a 18, sobre todo de 12 a 17, en particular de 12 a 15, moles de equivalente de base a 10 kg de materia seca total contenida en la suspensión de la biomasa opcionalmente lisada.

También fue muy sorprendente en este contexto que la desemulsificación pudiera llevarse a cabo de manera eficiente a un pH por debajo de 9,0.

Por tanto, un objeto particular adicional de la presente invención es un método de aislamiento de un lípido que contiene ácidos grasos poliinsaturados (PUFA) a partir de una biomasa, que comprende las siguientes etapas:

a) proporcionar una suspensión de una biomasa que comprende células que contienen un lípido que contiene PUFA;

b) opcionalmente lisar las células de la biomasa;

c) concentrar la suspensión hasta un contenido de materia seca total (TDM) del 20 al 60% en peso, preferiblemente del 25 al 60% en peso, más preferiblemente del 30 al 55% en peso, si la suspensión tiene un contenido de TDM menor;

d) ajustar en la suspensión una temperatura de 20°C a 100°C, preferiblemente de 25, 30, 40, 50 o 60°C a 100°C, más preferiblemente de 65°C a 95°C, en particular de 70 a 90°C;

e) mantener la temperatura en los intervalos descritos en (d) durante al menos 1 hora, preferiblemente durante al menos 2, 3, 4, 5, 6, 7 u 8 horas, más preferiblemente durante de 1 a 36 horas, en particular durante de 2, 3, 4, 5, 6, 7 u 8 horas a 36 horas, más preferiblemente de 10 a 24 horas, al tiempo que se añaden en total de 7,5 a 25 moles, preferiblemente de 8,5 a 22 moles, en particular de 10 a 20, más preferiblemente de 11 a 18, sobre todo de 12 a 17, en particular de 12 a 15, moles de equivalente de base a 10 kg de materia seca total contenida en la suspensión de la biomasa opcionalmente lisada, al tiempo que el pH de la composición se mantiene siempre por debajo 9,0, preferiblemente se mantiene siempre por debajo de 8,5, en particular se mantiene en el intervalo de 8,0 a 8,9, en particular en el intervalo de 8,0 a 8,4.

También fue sorprendente en este contexto que la desemulsificación puede llevarse a cabo de manera eficiente a un tiempo de exposición de por debajo de 10 horas.

Por tanto, un objeto adicional de la presente invención es un método de aislamiento de un lípido que contiene ácidos grasos poliinsaturados (PUFA) a partir de una biomasa, que comprende las siguientes etapas:

a) proporcionar una suspensión de una biomasa que comprende células que contienen un lípido que contiene PUFA;

b) opcionalmente lisar las células de la biomasa;

c) concentrar la suspensión hasta un contenido de materia seca total (TDM) del 20 al 60% en peso, preferiblemente del 25 al 60% en peso, más preferiblemente del 30 al 55% en peso, si la suspensión tiene un contenido de TDM menor;

d) calentar la suspensión hasta una temperatura de 20°C a 100°C, preferiblemente de 25, 30, 40, 50 o 60°C a 100°C, más preferiblemente de 65°C a 95°C, en particular de 70 a 90°C;

e) mantener la temperatura en los intervalos descritos en (c) durante de 1 a menos de 10 horas, preferiblemente de 1 o 2 a 8 horas, más preferiblemente de 1, 2 o 3 a 6 horas, al tiempo que se añaden en total de 7,5 a 25 moles, preferiblemente de 8,5 a 22 moles, en particular de 10 a 20, más preferiblemente de 11 a 18, sobre todo de 12 a 17, en particular de 12 a 15, moles de equivalente de base a 10 kg de materia seca total contenida en la suspensión de la biomasa opcionalmente lisada.

También fue sorprendente según la invención que la desemulsificación pudiera llevarse a cabo sin lisado previo de las células de la biomasa.

Por tanto, un objeto adicional de la presente invención es un método de aislamiento de un lípido que contiene ácidos grasos poliinsaturados (PUFA) a partir de una biomasa, que comprende las siguientes etapas:

a) proporcionar una suspensión de una biomasa que comprende células que contienen un lípido que contiene PUFA;

c) concentrar la suspensión hasta un contenido de materia seca total (TDM) del 20 al 60% en peso, preferiblemente del 25 al 60% en peso, más preferiblemente del 30 al 55% en peso, si la suspensión tiene un contenido de TDM menor;

d) calentar la suspensión hasta una temperatura de 20°C a 100°C, preferiblemente de 25, 30, 40, 50 o 60°C a 100°C, más preferiblemente de 65°C a 95°C, en particular de 70 a 90°C;

e) mantener la temperatura en el intervalo descrito en (c) durante al menos 1 hora, preferiblemente durante al menos 2, 3, 4, 5, 6, 7 u 8 horas, más preferiblemente durante de 1 a 36 horas, en particular durante de 2, 3, 4, 5, 6, 7 u 8 horas a 36 horas, más preferiblemente de 10 a 24 horas, al tiempo que se añaden en total de 7,5 a 25 moles, preferiblemente de 8,5 a 22 moles, en particular de 10 a 20, más preferiblemente de 11 a 18, sobre todo de 12 a 17, en particular de 12 a 15, moles de equivalente de base a 10 kg de materia seca total contenida en la suspensión,

caracterizado porque las etapas (d) y (e) se llevan a cabo sin lisado previo de las células de la biomasa. Si no se indica lo contrario, entonces el pH se mantiene según la invención preferiblemente en la etapa (e) por debajo de 11,5, más preferiblemente por debajo de 11, más preferiblemente por debajo de 10,5, en particular en el intervalo de 8 a 11,5, más preferiblemente en el intervalo de 9 a 11, en particular en el intervalo de 10 a 11. Esto se realiza añadiendo la base en la etapa (e) no de una vez, sino o bien de manera continua o bien paso a paso, de modo que pueda evitarse que se superen los valores de pH indicados.

En los métodos según la invención, las etapas (d) y (e) conducen a la ruptura de la emulsión contenida en la suspensión en una fase ligera que contiene aceite y una fase pesada que contiene agua, restos celulares y sales. Esta ruptura de la emulsión se denomina también “desemulsificación” en el contexto de esta solicitud.

Preferiblemente, en las etapas (b) a (e) del método la suspensión se mezcla de manera continua, usando un mezclador y/o un agitador. En las etapas de método (d) y/o (e) preferiblemente se aplica agitación de baja cizalladura y/o agitación de flujo axial, en particular tal como se da a conocer en el documento WO 2015/095694. Los propulsores adecuados para agitar antes de y durante las etapas (d) y/o (e) incluyen en particular propulsores de palas rectas, propulsores de palas Rushton, propulsores de flujo axial, propulsores de flujo radial, propulsores de discos de palas cóncavas, propulsores de alta eficiencia, hélices, paletas, turbinas y combinaciones de los mismos.

El término “equivalente de base” tiene en cuenta el hecho de que no solo existen bases monovalentes, sino también bi- o multivalentes y que pueden usarse según la invención. En el caso de que se use una base bivalente en lugar de o además de una base monovalente, entonces solo tiene que usarse la mitad de la cantidad molar de esta base bivalente para realizar la misma cantidad de equivalentes de base en comparación con la cantidad de base monovalente que tendría que haberse usado; en el caso de que se use una base trivalente, entonces solo tiene que usarse un tercio de la cantidad molar de base monovalente; etc. En el caso de que se use una base monovalente, como hidróxido de sodio, la cantidad de equivalentes de base es idéntica a la cantidad de base.

La cantidad en peso de base puede calcularse fácilmente basándose en la cantidad molar haciendo uso del peso molar de la base. Por ejemplo, en el caso de la base muy preferida hidróxido de sodio, el peso molar es igual a 40 g/mol. Esto significa que un mol de hidróxido de sodio corresponde a 40 g de hidróxido de sodio.

Las bases preferidas usadas según la invención se seleccionan de hidróxidos, en particular hidróxido de sodio, hidróxido de litio, hidróxido de potasio y/o hidróxido de calcio, carbonatos, en particular carbonato de sodio, carbonato de potasio y/o carbonato de magnesio, y/o bicarbonatos, en particular bicarbonato de litio, bicarbonato de sodio y/o bicarbonato de potasio. En una realización muy preferida de la invención, la base usada según la invención es solo o casi solo hidróxido de sodio. - Debido a la facilidad de manipulación, las bases se usan preferiblemente en forma líquida, en particular como disoluciones concentradas, estando la concentración de base en la disolución preferiblemente en el intervalo del 10 al 60% en peso, en particular en el intervalo del 20 al 50% en peso.

Según la invención, tras proporcionar la suspensión según la etapa (a) preferiblemente se lleva a cabo una etapa de lisado. La etapa de lisado puede omitirse, si - por ejemplo, debido a las condiciones de fermentación aplicadas - las células o una gran parte de las mismas ya están lisadas o pueden romperse fácilmente en una de las siguientes etapas del procedimiento sin ninguna etapa de lisado explícita.

El lisado de las células de la biomasa según la etapa (b) puede llevarse a cabo mediante métodos conocidos por los expertos en la técnica, en particular enzimática, mecánica, física o químicamente, o aplicando combinaciones de los mismos.

Dependiendo del tiempo de exposición y/o el grado de fuerza aplicada, puede obtenerse una composición que comprende solo células lisadas o una composición que comprende una mezcla de restos celulares y células intactas. El término “biomasa que contiene lípidos lisada” se refiere en este sentido a una suspensión que contiene agua, restos celulares y aceite liberado por las células de la biomasa, pero más allá de esto también puede comprender componentes adicionales, en particular sales, células intactas, contenidos adicionales de las células lisadas, así como componentes de un medio de fermentación, en particular nutrientes. En una realización preferida de la invención, solo están presentes pequeñas cantidades de células intactas, en particular menos del 20%, preferiblemente menos del 10%, más preferiblemente menos del 5% (en relación con el número total de células intactas presentes antes de lisar las células de la biomasa) en la biomasa lisada después de la etapa de lisado de las células.

El lisado de las células puede realizarse, por ejemplo, utilizando una prensa celular French, un sonicador, un homogeneizador, un microfluidizador, un molino de bolas, un molino de barras, un molino de guijarros, un molino de perlas, un rodillo de trituración de alta presión, un impactador de árbol vertical, un combinador industrial, un mezclador de alta cizalladura, un mezclador de paletas y/o un homogeneizador Polytron.

En una realización preferida de la invención, el lisado de las células comprende un tratamiento enzimático de las células aplicando una enzima que degrada la pared celular.

Según la invención, la enzima que degrada la pared celular se selecciona preferiblemente de proteasas, celulasas (por ejemplo, Cellustar CL (Dyadic), Fibrezyme G2000 (Dyadic), Celluclast (Novozymes), Fungamyl (Novozymes), Viscozyme L (Novozymes)), hemicelulasas, quitinasas, pectinasas (por ejemplo, Pectinex (Novozymes)), sucrasas, maltasas, lactasas, alfa-glucosidasas, beta-glucosidasas, amilasas (por ejemplo, Alphastar Plus (Dyadic); Termamyl (Novozymes)), lisozimas, neuraminidasas, galactosidasas, alfa-manosidasas, glucuronidasas, hialuronidasas, pululanasas, glucocerebrosidasas, galactosilceramidasas, acetilgalactosaminidasas, fucosidasas, hexosaminidasas, iduronidasas, maltasas-glucoamilasas, xilanasas (por ejemplo, Xylanase Plus (Dyadic), Pentopan (Novozymes)), betaglucanasas (por ejemplo, Vinoflow Max (Novozymes), Brewzyme LP (Dyadic)), mananasas, y combinaciones de las mismas. La proteasa puede seleccionarse de serina proteasas, treonina proteasas, cisteína proteasas, aspartato proteasas, metaloproteasas, ácido glutámico proteasas, alcalasas (subtilisinas), y combinaciones de las mismas. La quitinasa puede ser una quitotriosidasa. La pectinasa puede seleccionarse de pectoliasas, pectozimas, poligalacturonasas, y combinaciones de las mismas.

El pH adecuado para utilizar la enzima depende del óptimo de pH de la enzima.

En una realización preferida de la invención, se usa una enzima con un óptimo de pH de entre 7,0 y 8,0, en particular de aproximadamente 7,5, de modo que el pH aplicado en esta etapa es de desde 7,0 hasta 8,0, preferiblemente desde 7,3 hasta 7,7. Una enzima preferida que puede usarse en este intervalo de pH es una alcalasa.

La enzima se añade preferiblemente como disolución de enzima concentrada, preferiblemente en una cantidad del 0,01 al 1,5% en peso, más preferiblemente en una cantidad del 0,03 al 1,0% en peso, sobre todo en una cantidad del 0,05 al 0,5% en peso, en relación con la cantidad de disolución de enzima concentrada añadida en relación con la cantidad total de la suspensión tras la adición de la disolución de enzima concentrada.

En una realización muy preferida de la invención, el lisado de las células se lleva a cabo tal como sigue:

i) calentando la suspensión de (a) hasta una temperatura de entre 50°C y 70°C, preferiblemente hasta una temperatura de entre 55°C y 65°C, y añadiendo una enzima que degrada la pared celular a la suspensión, en particular caldo de fermentación, y ajustando un valor de pH adecuado, si es necesario, al que la enzima trabaja apropiadamente;

ii) manteniendo la temperatura y el pH en los intervalos descritos en (ii) durante al menos una hora, preferiblemente durante al menos dos horas, más preferiblemente durante de dos a cuatro horas.

En la etapa (i), la enzima puede añadirse antes o después de calentar la suspensión y/o antes o después de ajustar el pH. Del mismo modo, el calentamiento de la suspensión puede llevarse a cabo antes o después de ajustar el pH. -Pero en una realización preferida, la enzima se añade después del calentamiento de la suspensión y después de ajustar el pH, si el ajuste del pH es necesario, si acaso. - En una realización muy preferida, todas las medidas se llevan a cabo más o menos simultáneamente.

Preferiblemente, en las etapas (i) y (ii) la suspensión se mezcla de manera continua usando un mezclador y/o un agitador.

Según la invención, la desemulsificación se lleva a cabo con una suspensión que tiene un contenido de materia seca del 20 al 60% en peso, preferiblemente del 25 al 60% en peso, en particular del 30 al 55% en peso o del 30 al 45% en peso. Esto puede realizarse o bien proporcionando una suspensión con una biomasa apropiadamente alta en la etapa (a) o bien concentrando la suspensión, en particular tras el lisado las células de la biomasa. Por tanto, en una realización preferida de la invención, tras el lisado opcional de las células de la biomasa y antes de la etapa de desemulsificación, la suspensión se concentra hasta un contenido de materia seca total del 20 al 60% en peso, más preferiblemente del 25 al 60% en peso, en particular del 30 al 55% en peso, sobre todo del 30 al 50% en peso o del 30 al 45% en peso.

La concentración de la suspensión se lleva a cabo preferiblemente mediante evaporación de agua a una temperatura no mayor de 100°C, preferiblemente de 70°C a Í002C, más preferiblemente de 80°C a 90°C, hasta alcanzar un contenido de materia seca total del 20 al 60% en peso, más preferiblemente del 25 al 60% en peso, en particular del 30 al 55% en peso o del 30 al 45% en peso.

La concentración de la suspensión se lleva a cabo preferiblemente en un evaporador de circulación forzada (por ejemplo, disponible de GEA, Alemania) para permitir la eliminación rápida del agua. Alternativamente o además, la concentración puede llevarse a cabo mediante evaporación en película descendente, evaporación en película delgada y/o evaporación rotatoria.

En general, el ajuste del valor de pH puede llevarse a cabo según la invención usando o bien bases o bien ácidos conocidos por los expertos en la técnica. La disminución del pH puede llevarse a cabo en particular usando ácidos orgánicos o inorgánicos como ácido sulfúrico, ácido nítrico, ácido fosfórico, ácido bórico, ácido clorhídrico, ácido bromhídrico, ácido perclórico, ácido hipocloroso, ácido cloroso, ácido fluorosulfúrico, ácido hexafluorofosfórico, ácido acético, ácido cítrico, ácido fórmico, o combinaciones de los mismos. Como de manera deseable se evita un alto contenido de cloruro, en una realización preferida de la invención no se usan o solo se usan pequeñas cantidades de ácido clorhídrico en el proceso de la presente invención. Según la invención, el ácido sulfúrico es la sustancia preferida para disminuir el valor de pH. - El aumento del pH puede llevarse a cabo en particular usando bases orgánicas o inorgánicas como hidróxidos, en particular hidróxido de sodio, hidróxido de litio, hidróxido de potasio y/o hidróxido de calcio, carbonatos, en particular carbonato de sodio, carbonato de potasio o carbonato de magnesio, y/o bicarbonatos, en particular bicarbonato de litio, bicarbonato de sodio y/o bicarbonato de potasio. - Debido a facilidad de manipulación, los ácidos y las bases se usan preferiblemente en forma líquida, en particular como disoluciones concentradas, en las que la concentración de ácido o base en la disolución está preferiblemente en el intervalo del 10 al 55% en peso, en particular en el intervalo del 20 al 50% en peso. En particular, el ácido sulfúrico se usa preferiblemente también en forma concentrada.

El método según la invención comprende preferiblemente como etapa adicional la recogida del lípido que contiene PUFA a partir de la composición desemulsificada obtenida en la etapa (e).

La recogida del lípido que contiene PUFA comprende preferiblemente la neutralización de la suspensión desemulsificada y la separación posterior de la fase ligera que contiene aceite así obtenida de la fase pesada que contiene agua, sales, restos celulares y aceite residual.

La neutralización de la composición desemulsificada se realiza preferiblemente añadiendo un ácido, preferiblemente ácido sulfúrico, para ajustar un valor de pH de 5,5 a 8,5, en particular de 6,5 a 8,5, preferiblemente de 6,5 a 7,5 o de 7,0 a 8,0. Antes de empezar la separación de la fase ligera de la fase pesada, la composición neutralizada puede agitarse a este pH neutralizado desde varios minutos hasta varias horas. - La neutralización de la composición desemulsificada solo es necesaria en esta realización con certeza, si la composición desemulsificada obtenida según la etapa (e) de los métodos de la invención tiene un valor de pH fuera de este intervalo.

La separación de la fase ligera que contiene aceite de la fase pesada que contiene agua, sales y restos celulares se realiza preferiblemente mediante medios mecánicos y preferiblemente a una temperatura de 60-90°C, más preferiblemente de 70-80°C, y preferiblemente a un valor de pH de 6-9, más preferiblemente de 7-8,5. “Medios mecánicos” se refiere en particular a métodos de filtración y de centrifugación conocidos por los expertos en la técnica.

Después de la separación de la fase ligera que contiene aceite, el aceite que contiene PUFA así obtenido puede procesarse adicionalmente aplicando métodos conocidos por los expertos en la técnica, en particular refinado, blanqueado, desodorización y/o preparación para el invierno.

Una ventaja particular del método de la presente invención es que puede llevarse a cabo sin el uso de ningún disolvente orgánico, en particular sin el uso de ningún disolvente orgánico polar o no polar. Por tanto, en una realización preferida de la invención, no se usan o solo se usan cantidades pequeñas de disolventes orgánicos, en particular de disolventes orgánicos polares o no polares, para aislar el aceite que contiene PUFA de la biomasa. Disolventes orgánicos típicos son hexano y etanol.

En una realización preferida de la invención se usa menos del 2% en peso de disolventes orgánicos no polares, más preferiblemente menos del 1, del 0,5 o del 0,1% en peso. En una realización particularmente preferida de la invención no se usa ningún disolvente orgánico no polar en absoluto. En una realización muy preferida de la invención se usa menos del 2% en peso de disolventes orgánicos, en general, de manera particularmente preferida menos del 1, del 0,5 o del 0,1% en peso. En una realización particularmente muy preferida de la invención no se usa ningún disolvente orgánico en absoluto.

Una ventaja adicional del método de la presente invención es que puede realizarse una separación muy eficiente del aceite de la biomasa restante sin la adición de cloruro de sodio, que se usa normalmente para precipitar por sales el aceite de la biomasa. Preferiblemente el método puede llevarse a cabo sin la adición de sales de cloruro en absoluto, sobre todo sin la adición de ninguna sal para precipitar por sales el aceite. Pero pueden estar presentes pequeñas cantidades de sales de cloruro, en particular cloruro de sodio, en la suspensión debido al medio de fermentación usado para hacer crecer la biomasa.

Por tanto, en una realización preferida de la presente invención, no se usa o solo se usan cantidades pequeñas de cloruro de sodio para mejorar el aislamiento de aceite. En una realización preferida de la invención se usa menos del 1% en peso de cloruro de sodio, más preferiblemente menos del 0,5 o del 0,2% en peso de cloruro de sodio para aislar el aceite de la biomasa, sobre todo menos del 0,1 o del 0,05% en peso, haciendo referencia el % en peso al peso total de la composición tras la adición del cloruro de sodio.

En una realización particularmente preferida de la invención no se usan o solo se usan cantidades pequeñas de sales de cloruro para mejorar el aislamiento de aceite, si acaso. En esta realización se usa preferiblemente menos del 1% en peso de sales de cloruro, más preferiblemente menos del 0,5 o del 0,2% en peso de sales de cloruro para aislar el aceite de la biomasa, sobre todo menos del 0,1 o del 0,05% en peso, haciendo referencia el % en peso al peso total de la composición tras la adición de las sales de cloruro.

En una realización muy preferida de la invención no se usan o solo se usan cantidades pequeñas de sales para mejorar el aislamiento de aceite, en general. En esta realización se usa preferiblemente menos del 1% en peso de sales, más preferiblemente menos del 0,5 o del 0,2% en peso de sales para aislar el aceite de la biomasa, sobre todo menos del 0,1 o del 0,05% en peso, haciendo referencia el % en peso al peso total de la composición tras la adición de las sales.

Los métodos de la presente invención permiten una separación muy eficiente del aceite contenido en la biomasa de los restos celulares y otras sustancias contenidas en la suspensión, en particular caldo de fermentación. Usando los métodos de la presente invención puede separarse preferiblemente más del 80% en peso, en particular más del 90% en peso del aceite contenido en la biomasa de la biomasa y aislarse aplicando condiciones muy económicas y sostenibles.

“Cloruro” según la invención se refiere a la cantidad de cloro detectable. La cantidad de cloro presente puede determinarse, por ejemplo, mediante análisis elemental según la norma DIN EN ISO 11885. El cloro está presente en forma de sales que se denominan “cloruros”. El contenido de cloruro mencionado según la invención - también denominado “iones cloruro” - solo se refiere a la cantidad de cloro detectable, no a la cantidad de la sal de cloruro completa, que comprende, además del ion cloruro, también un contraión catiónico.

El contenido de materia seca total (TDM) se determina preferiblemente mediante análisis gravimétrico. Para hacer esto, se pesa una muestra de la suspensión homogénea con un volumen específico antes y después de la liofilización. El peso restante de la muestra secada corresponde a la materia seca total contenida en ese volumen específico de la suspensión.

El rendimiento de aceite liberado se determina preferiblemente mediante el análisis de ésteres metílicos de ácidos grasos (FAME, fatty acid methyl ester analysis). Para hacer esto, los lípidos en la muestra se saponifican en primer lugar con KOH. Después de esto, los ácidos grasos libres se metilan con MeOH. Los ácidos grasos metilados pueden entonces determinarse y cuantificarse mediante cromatografía de gases usando un patrón interno.

En una realización particularmente preferida de la presente invención, la fase acuosa que contiene agua, sales, aceite residual y restos celulares, que se obtiene como subproducto en la etapa de recogida de aceite descrita anteriormente, se convierte en una biomasa secada secando la biomasa hasta un contenido de materia seca total de más del 90% en peso.

La conversión de la fase pesada que contiene agua, sales, aceite restante y restos celulares, que se obtiene como subproducto en la etapa de recogida de aceite, en una biomasa secada secando la biomasa hasta un contenido de materia seca total de más del 90% en peso, puede llevarse a cabo de diferentes modos.

En un modo muy preferido, la transformación se lleva a cabo mediante la concentración de la fase pesada hasta un contenido de materia seca del 30-50% en peso, preferiblemente del 35-45% en peso, y la posterior granulación por pulverización de la biomasa por medio de granulación en lecho fluidizado. Haciendo esto, de un modo muy eficiente, puede obtenerse una biomasa con características ventajosas. La granulación por pulverización por medio de granulación en lecho fluidizado se da a conocer más detalladamente en el documento EP2826384.

La concentración de la fase pesada hasta un contenido de materia seca del 30-50% en peso se lleva a cabo preferiblemente mediante evaporación con disolventes, en particular evaporación a vacío, y/o usando un evaporador rotatorio, un evaporador de película delgada o un evaporador de película descendente. Una alternativa útil a la evaporación con disolventes es la ósmosis inversa.

Como alternativa a la granulación por pulverización, otros métodos de secado, en particular otros métodos de secado convectivos, como secado en túnel o secado por pulverización, en particular secado por pulverización con boquilla, o métodos de secado por contacto, como secado en tambor, o métodos de secado por radiación, como secado por infrarrojos, de la fase pesada concentrada serían alternativas aplicables, obteniéndose usando estos métodos normalmente partículas con un diámetro menor o mayor.

Según la invención, durante el proceso de secado, puede añadirse opcionalmente un agente antiaglomerante, en particular sílice, preferiblemente una sílice hidrófoba o hidrófila, a la biomasa para impedir la aglomeración. Para este propósito, la suspensión, en particular caldo de fermentación, que comprende biomasa, así como la sílice se pulverizan preferiblemente en la zona de secado particular. Alternativa o adicionalmente, la biomasa puede mezclarse con el agente antiaglomerante tras el proceso de secado.

La conversión de un polvo de grano fino en un producto libre de polvo de grano grueso puede realizarse mediante procesos de granulación. Soportes o productos auxiliares orgánicos o inorgánicos convencionales tales como almidón, gelatina, derivados de celulosa o sustancias similares, que se usan normalmente en el procesamiento de alimentos o el procesamiento de piensos como agentes aglutinantes, agentes gelificantes o espesantes, pueden usarse opcionalmente en este proceso de granulación posterior. Productos auxiliares adicionales que se usan preferiblemente según la invención se dan a conocer en el documento WO 2016/050560, siendo la carboximetilcelulosa un agente aglutinante particularmente preferido. Después de secar y opcionalmente granular y/o tamizar la biomasa, la biomasa secada preferiblemente se almacena o se envasa.

La biomasa particulada de la invención, así como las suspensiones acuosas de la invención pueden usarse de diferentes modos. Por ejemplo, pueden usarse con el fin de producir un producto alimenticio o un producto de pienso. Alternativamente pueden usarse directamente como producto alimenticio o producto de pienso.

Una materia adicional de la presente invención es por tanto igualmente un método para producir un producto de pienso o producto alimenticio, en el que se usa una biomasa particulada y/o una suspensión acuosa según la invención, y se mezcla preferiblemente con ingredientes de producto de pienso o de producto alimenticio adicionales.

Las células que contienen PUFA de la biomasa son preferiblemente células microbianas o células vegetales. Preferiblemente, las células son capaces de producir los PUFA debido a un sistema policétido sintasa. El sistema policétido sintasa puede ser uno endógeno o, debido a ingeniería genética, uno exógeno.

Las células vegetales pueden seleccionarse en particular de células de las familias Brassicaceae, Elaeagnaceae y Fabaceae. Las células de la familia Brassicaceae pueden seleccionarse del género Brassica, en particular de colza, nabina y mostaza india; las células de la familia Elaeagnaceae pueden seleccionarse del género Elaeagnus, en particular de la especie Oleae europaea; las células de la familia Fabaceae pueden seleccionarse del género Glycine, en particular de la especie Glycine max.

Los organismos microbianos que contienen un lípido que contiene PUFA se describen de manera extensa en la técnica anterior. Las células usadas pueden, en este contexto, en particular ser células que ya producen de manera natural PUFA (ácidos grasos poliinsaturados); sin embargo, también pueden ser células que, como resultado de métodos de ingeniería genética adecuados o debido a mutagénesis aleatoria, muestran una producción mejorada de PUFA o se les ha hecho capaces de producir PUFA, si acaso. La producción de los PUFA puede ser auxotrófica, mixotrófica o heterotrófica.

La biomasa comprende preferiblemente células que producen PUFA de manera heterotrófica. Las células según la invención se seleccionan preferiblemente de algas, hongos, particularmente levaduras, bacterias o protistas. Las células son más preferiblemente algas microbianas u hongos.

Células adecuadas de levaduras que producen aceite son, en particular, cepas de Yarrowia, Candida, Rhodotorula, Rhodosporidium, Cryptococcus, Trichosporon y Lipomyces.

Células adecuadas de microalgas y microorganismos similares a algas que producen aceite son, en particular, microorganismos seleccionados del filo Stramenopiles (también denominado Heterokonta). Los microorganismos del filo Stramenopiles pueden seleccionarse en particular de los siguientes grupos de microorganismos: Hamatores, Proteromonads, Opalines, Developayella, Diplophrys, labirintúlidos, traustoquítridos, Biosecids, Oomycetes, Hypochytridiomycetes, Commation, Reticulosphaera, Pelagomonas, Pelagococcus, Ollicola, Aureococcus, Parmales, diatomeas, Xanthophytes, Phaeophytes (algas pardas), Eustigmatophytes, Raphidophytes, Synurids, Axodines (incluyendo Rhizochromulinales, Pedinellales, Dictyochales), Chrysomeridales, Sarcinochrysidales, Hydrurales, Hibberdiales y Chromulinales. Otros grupos preferidos de microalgas incluyen los miembros de las algas verdes y los dinoflagelados, incluyendo los miembros del género Crypthecodiurn.

La biomasa según la invención comprende preferiblemente células, y preferiblemente consiste esencialmente en tales células, del taxón Labyrinthulomycetes (Labyrinthulea, hongos mucilaginosos reticulares, redes mucilaginosas), en particular aquellos de la familia de Thraustochytriaceae. La familia de Thraustochytriaceae (traustoquítridos) incluye los géneros Althomia, Aplanochytrium, Aurantiochytrium, Botryochytrium, Elnia, Japonochytrium, Oblongichytrium, Parietichytrium, Schizochytrium, Sicyoidochytrium, Thraustochytrium y Ulkenia. La biomasa particularmente comprende preferiblemente células de los géneros Aurantiochytrium , Oblongichytrium , Schizochytrium o Thraustochytrium , sobre todo del género Schizochytrium .

Según la invención, el ácido graso poliinsaturado (PUFA) es preferiblemente un ácido graso altamente insaturado (HUFA).

Las células presentes en la biomasa se distinguen preferiblemente por el hecho de que contienen al menos el 20% en peso, preferiblemente al menos el 30% en peso, en particular al menos el 35% en peso, de PUFA, en cada caso basado en la materia seca celular.

Según la presente invención, el término “lípido” incluye fosfolípidos; ácidos grasos libres; ésteres de ácidos grasos; triacilgliceroles; esteroles y ésteres de esterol; carotenoides; xantofilas (por ejemplo, oxicarotenoides); hidrocarburos; compuestos derivados de isoprenoide y otros lípidos conocidos por un experto habitual en la técnica. - Los términos “lípido” y “aceite” se usan de manera intercambiable según la invención.

En una realización preferida, la mayoría de los lípidos en este caso están presentes en forma de triglicéridos, estando preferiblemente al menos el 50% en peso, en particular al menos el 75% en peso y, en una realización especialmente preferida, al menos el 90% en peso de los lípidos presentes en la célula presentes en forma de triglicéridos.

Según la invención, se entiende que ácidos grasos poliinsaturados (PUFA) significa ácidos grasos que tienen al menos dos, particularmente al menos tres, dobles enlaces C-C. Según la invención, se prefieren los ácidos grasos altamente insaturados (HUFA) entre los PUFA. Según la invención, se entiende que HUFA significa ácidos grasos que tienen al menos cuatro dobles enlaces C-C.

Los PUFA pueden estar presentes en la célula en forma libre o en forma unida. Ejemplos de la presencia en forma unida son fosfolípidos y ésteres de los PUFA, en particular monoacil-, diacil- y triacilglicéridos. En una realización preferida, la mayoría de los PUFA están presentes en forma de triglicéridos, estando preferiblemente al menos el 50% en peso, en particular al menos el 75% en peso y, en una realización especialmente preferida, al menos el 90% en peso de los PUFA presentes en la célula presentes en forma de triglicéridos.

PUFA preferidos son ácidos grasos omega-3 y ácidos grasos omega-6, prefiriéndose especialmente los ácidos grasos omega-3. En este caso, ácidos grasos omega-3 preferidos son el ácido eicosapentaenoico (EPA, 20:5w-3), particularmente el ácido (5Z,8Z,11Z,14Z,17Z)-eicosa-5,8,11,14,17-pentaenoico, y el ácido docosahexaenoico (DHA, 22:6w-3), particularmente el ácido (4Z,7Z,10Z,13Z,16Z,19Z)-docosa-4,7,10,13,16,19-hexaenoico.

En una realización muy preferida de la presente invención, se emplean células, en particular una cepa de Schizochytrium, que produce una cantidad significativa de EPA y DHA, simultáneamente, produciéndose DHA preferiblemente en una cantidad de al menos el 20% en peso, preferiblemente en una cantidad de al menos el 30% en peso, en particular en una cantidad del 30 al 50% en peso, y produciéndose EPA en una cantidad de al menos el 5% en peso, preferiblemente en una cantidad de al menos el 10% en peso, en particular en una cantidad del 10 al 20% en peso (en relación con la cantidad total de lípido contenido en las células, respectivamente). Cepas de Schizochytrium que producen DHA y EPA pueden obtenerse mediante mutagénesis consecutiva seguida de la selección adecuada de cepas mutantes que demuestran una producción de EPA y DHA superior y una relación EPA:DHA específica. Cualquier agente químico o no químico (por ejemplo, radiación ultravioleta (UV)) capaz de inducir un cambio genético en la célula de levadura puede usarse como mutágeno. Estos agentes pueden usarse solos o en combinación entre sí, y los agentes químicos pueden usarse puros o con un disolvente.

Especies preferidas de microorganismos del género Schizochytrium, que producen EPA y DHA simultáneamente en cantidades significativas, tal como se mencionó anteriormente, están depositadas con los n.os de registro ATCC PTA-10208, PTA-10209, PTA-10210, o PTA-10211, PTA-10212, PTA-10213, PTA-10214, PTA-10215.

La suspensión de biomasa según la presente invención tiene preferiblemente una densidad de biomasa de al menos 80 o 100 g/l, en particular una densidad de biomasa de 80 a 250 g/l, en particular de 80 a 200 g/l, más preferiblemente una densidad de biomasa de al menos 120 o 140 g/l, en particular al menos 160 o 180 g/l (calculada como contenido de materia seca) y es preferiblemente un caldo de fermentación. Por tanto, la suspensión puede obtenerse cultivando y haciendo crecer células adecuadas en un medio de fermentación en condiciones mediante las cuales los PUFA se producen por el microorganismo.

Métodos para producir la biomasa, en particular una biomasa que comprende células que contienen lípidos, en particular PUFA, particularmente del orden Thraustochytriales, se describen en detalle en la técnica anterior (véanse, por ejemplo, los documentos WO91/07498, WO94/08467, WO97/37032, WO97/36996, WO01/54510). Como regla, la producción tiene lugar al cultivarse células en un fermentador en presencia de una fuente de carbono y de una fuente de nitrógeno, junto con un número de sustancias adicionales como minerales que permiten el crecimiento de los microorganismos y la producción de los PUFA. En este contexto, pueden alcanzarse densidades de biomasa de más de 100 gramos por litro y tasas de producción de más de 0,5 gramos de lípido por litro por hora. El proceso se lleva a cabo preferiblemente en lo que se conoce como proceso de alimentación por lotes, es decir las fuentes de carbono y de nitrógeno se alimentan de manera incremental durante la fermentación. Cuando se ha obtenido la biomasa deseada, puede inducirse la producción de lípidos mediante diversas medidas, por ejemplo, limitando la fuente de nitrógeno, la fuente de carbono o el contenido de oxígeno o combinaciones de estos. El documento EP 1178 118 A1 da a conocer un método de extracción de un aceite microbiano o unicelular, que comprende ácidos grasos poliinsaturados, directamente de células microbianas que evita la necesidad de disolventes. La pared celular se rompe y el aceite se separa de los restos de pared celular mediante centrifugación.

En una realización preferida de la presente invención, las células se hacen crecer hasta que alcanzan una densidad de biomasa de al menos 80 o 100 g/l, más preferiblemente al menos 120 o 140 g/l, en particular al menos 160 o 180 g/l (calculada como contenido de materia seca total). Tales procesos se dan a conocer, por ejemplo, en el documento US 7.732.170.

Preferiblemente, las células se fermentan en un medio con baja salinidad, en particular para evitar la corrosión. Esto puede conseguirse usando sales de sodio libres de cloro como fuente de sodio en lugar de cloruro de sodio, tal como, por ejemplo, sulfato de sodio, carbonato de sodio, hidrogenocarbonato de sodio o ceniza de soda. Preferiblemente, se usa cloruro en la fermentación en cantidades de menos de 3 g/l, en particular menos de 500 mg/l, de manera especialmente preferible menos de 100 mg/l.

Fuentes de carbono adecuadas son fuentes de carbono tanto alcohólicas como no alcohólicas. Ejemplos de fuentes de carbono alcohólicas son metanol, etanol e isopropanol. Ejemplos de fuentes de carbono no alcohólicas son fructosa, glucosa, sacarosa, melaza, almidón y jarabe de maíz.

Fuentes de nitrógeno adecuadas son fuentes de nitrógeno tanto inorgánicas como orgánicas. Ejemplos de fuentes de nitrógeno inorgánicas son nitratos y sales de amonio, en particular sulfato de amonio e hidróxido de amonio. Ejemplos de fuentes de nitrógeno orgánicas son aminoácidos, en particular glutamato, y urea.

Además, también pueden añadirse compuestos de fósforo inorgánicos u orgánicos y/o sustancias que estimulan el crecimiento conocidas tales como, por ejemplo, extracto de levadura o licor de maceración de maíz, para tener un efecto positivo sobre la fermentación.

Las células se fermentan preferiblemente a un pH de 3 a 11, en particular de 4 a 10, y preferiblemente a una temperatura de al menos 20°C, en particular de 20 a 40°C, de manera especialmente preferible al menos 30°C. Un proceso de fermentación típico dura hasta aproximadamente 100 horas.

Después de haber terminado la fermentación, las células pueden pasteurizarse con el fin de matar las células y desactivar las enzimas que puedan promover la degradación de lípidos. La pasteurización se efectúa preferiblemente calentando la biomasa hasta una temperatura de 50 a 121 °C, preferiblemente de 50 a 70°C, durante un periodo de 5 a 150 minutos, en particular de 20 a 100 minutos.

Igualmente, después de haber terminado la fermentación, pueden añadirse antioxidantes con el fin de proteger los PUFA presentes en la biomasa frente a la degradación oxidativa. Antioxidantes preferidos en este contexto son BHT, BHA, TBHA, etoxiquina, beta-caroteno, vitamina E, en particular tocoferol, y vitamina C. El antioxidante, si se usa, se añade preferiblemente en una cantidad del 0,001 al 0,1% en peso, preferiblemente en una cantidad del 0,002 al 0,05% en peso, en relación con la cantidad total del caldo de fermentación tras la adición del antioxidante.

Ejemplos de trabajo

Ejemplo 1: Preparación de la suspensión para su uso en las pruebas de desemulsificación

Un caldo celular sin lavar que contenía células microbianas (Schizochytrium sp.) a una densidad de biomasa de más de 100 g/l se calentó hasta 60°C en un recipiente agitado. Después de calentar la suspensión, el pH se ajustó a 7,5 usando sosa cáustica (disolución de NaOH al 50% en peso), antes de añadir una alcalasa (Alcalase® 2,4 FG (Novozymes)) en forma líquida en una cantidad del 0,5% en peso (en peso de caldo). Se continuó con la agitación durante 3 horas a 60°C. Después de esto, la mezcla de células lisadas se transfirió al interior de un evaporador de circulación forzada (obtenido de GEA, Alemania) y se calentó hasta una temperatura de 85°C. La mezcla se concentró en el evaporador de circulación forzada, hasta que se alcanzó un contenido de materia seca total de aproximadamente el 30% en peso.

Ejemplo 2: Influencia de la cantidad de equivalentes de base añadidos sobre la liberación del aceite

Para someter a prueba la significancia de la cantidad de equivalentes de base añadidos sobre la eficiencia de la liberación de aceite a partir de la biomasa, se sometió a prueba el efecto de la adición de diferentes cantidades de sosa cáustica a la biomasa con respecto a la liberación de aceite. La relación de equivalentes de base añadidos a la materia seca total se representa en la tabla 1 así como la cantidad de aceite liberado mediante la adición de la sosa cáustica. Todos los experimentos se llevaron a cabo con un litro de caldo de fermentación tratado enzimáticamente y concentrado posteriormente usando un recipiente con agitación BIOSTAT® B-DCU-Quad 2L (Sartorius, Alemania). La materia seca total de las muestras era del 30% en peso. La desemulsificación se llevó a cabo durante 24 horas a una temperatura de 80°C. La suspensión se agitó con 300 rpm. Se añadió sosa cáustica al principio de una sola vez. Después de 24 horas, las composiciones desemulsificadas se neutralizaron hasta pH 7,5. Después de la neutralización, se tomó una muestra de 50 g de la suspensión homogeneizada y la separación de los restos celulares se llevó a cabo mediante centrifugación a 13500 g. Posteriormente se determinó la cantidad de EPA y DHA en el sobrenadante.

Tabla 1: Influencia de la cantidad de NaOH añadido sobre la cantidad de aceite liberado

Los resultados muestran que incluso con cantidades bastante bajas de equivalentes de base añadidos ya pueden realizarse rendimientos muy buenos de aceite liberado sin la adición de disolventes orgánicos o sales como cloruro de sodio. Además, queda claro que hay una relación de equivalente de base añadido con respecto a materia seca total, en la que puede realizarse un rendimiento maximizado. Aumentar adicionalmente la cantidad de equivalentes de base más allá de esa relación no aumenta el rendimiento, sino que conduce a resultados incluso peores en comparación con cantidades menores de equivalentes de base añadidos. Los mejores resultados se obtuvieron con una cantidad de 12,5 y 15 moles de NaOH por 10 kg de TDM.

Ejemplo 3: Influencia de la cantidad de equivalentes de base añadidos sobre la liberación del aceite

Para someter a prueba adicionalmente la significancia de la cantidad de equivalentes de base añadidos sobre la eficiencia de la liberación de aceite a partir de la biomasa, se sometió a prueba el efecto de la adición de diferentes cantidades de sosa cáustica a la biomasa con respecto a la liberación de aceite. La relación de equivalentes de base añadidos a la materia seca total se representa en la tabla 2 así como la cantidad de aceite liberado mediante la adición de la sosa cáustica. Todos los experimentos se llevaron a cabo con un litro de caldo de fermentación tratado enzimáticamente y concentrado posteriormente usando un recipiente con agitación BIOSTAT® B-DCU-Quad 2L (Sartorius, Alemania). La materia seca total de las muestras era del 30,5% en peso. La desemulsificación se llevó a cabo durante 24 horas a una temperatura de 80°C. La suspensión se agitó con 300 rpm. Se añadió sosa cáustica paso a paso en tres veces para mantener el pH bajo. Después de 24 horas, las composiciones desemulsificadas se neutralizaron hasta pH 7,5. Después de la neutralización, se tomó una muestra de 50 g de la suspensión homogeneizada y la separación de los restos celulares se llevó a cabo mediante centrifugación a 13500 g. Posteriormente se determinó la cantidad de EPA y DHA en el sobrenadante.

Tabla 2: Influencia de la cantidad de NaOH añadido sobre la cantidad de aceite liberado

Los resultados muestran que incluso con cantidades bastante bajas de equivalentes de base añadidos ya pueden realizarse rendimientos muy buenos de aceite liberado sin la adición de disolventes orgánicos o sales como cloruro de sodio. Además, queda claro que hay una relación de equivalente de base añadido con respecto a materia seca total, en la que puede realizarse un rendimiento maximizado. Aumentar adicionalmente la cantidad de equivalentes de base más allá de esa relación no aumenta el rendimiento, sino que conduce a resultados incluso peores en comparación con cantidades menores de equivalentes de base añadidos. Los mejores resultados se obtuvieron con una cantidad de 12,5 a 20 moles de NaOH por 10 kg de TDM.

Ejemplo 4: Influencia de la cantidad de equivalentes de base añadidos sobre la liberación del aceite

Para someter a prueba la significancia de la cantidad de equivalentes de base añadidos sobre la eficiencia de la liberación de aceite a partir de la biomasa, se sometió a prueba el efecto de la adición de diferentes cantidades de sosa cáustica a la biomasa con respecto a la liberación de aceite. La relación de equivalentes de base añadidos a la materia seca total se representa en la tabla 3 así como la cantidad de aceite liberado mediante la adición de la sosa cáustica. Todos los experimentos se llevaron a cabo con un litro de caldo de fermentación tratado enzimáticamente y concentrado posteriormente usando un recipiente con agitación BIOSTAT® B-DCU-Quad 2L (Sartorius, Alemania). La materia seca total de las muestras era del 30% en peso. La desemulsificación se llevó a cabo durante 24 horas a una temperatura de 80°C. La suspensión se agitó con 300 rpm. Se añadió sosa cáustica de manera continua para evitar valores de pH altos. Después de 24 horas, las composiciones desemulsificadas se neutralizaron hasta pH 7,5. Después de la neutralización, se tomó una muestra de 50 g de la suspensión homogeneizada y la separación de los restos celulares se llevó a cabo mediante centrifugación a 13500 g. Posteriormente se determinó la cantidad de EPA y DHA en el sobrenadante.

Tabla 3: Influencia de la cantidad de NaOH añadido sobre la cantidad de aceite liberado

Los resultados muestran que incluso con cantidades bastante bajas de equivalentes de base añadidos ya pueden realizarse rendimientos muy buenos de aceite liberado sin la adición de disolventes orgánicos o sales como cloruro de sodio. Además, queda claro que hay una relación de equivalente de base añadido con respecto a materia seca total, en la que puede realizarse un rendimiento maximizado. Aumentar adicionalmente la cantidad de equivalentes de base más allá de esa relación no aumenta el rendimiento, sino que conduce a resultados incluso peores en comparación con cantidades menores de equivalentes de base añadidos. Los mejores resultados se obtuvieron con una cantidad de 12,5 a 17,5 moles de NaOH por 10 kg de TDM.

Ejemplo 5: Influencia de la cantidad de equivalentes de base añadidos sobre la liberación del aceite

Para someter a prueba la significancia de la cantidad de equivalentes de base añadidos sobre la eficiencia de la liberación de aceite a partir de la biomasa, se sometió a prueba el efecto de la adición de diferentes cantidades de sosa cáustica a la biomasa con respecto a la liberación de aceite. La relación de equivalentes de base añadidos a la materia seca total se representa en la tabla 4 así como la cantidad de aceite liberado mediante la adición de la sosa cáustica. Todos los experimentos se llevaron a cabo con un litro de caldo de fermentación tratado enzimáticamente y concentrado posteriormente usando un recipiente con agitación BIOSTAT® B-DCU-Quad 2L (Sartorius, Alemania). La materia seca total de las muestras era del 35,5% en peso. La desemulsificación se llevó a cabo durante 24 horas a una temperatura de 80°C. La suspensión se agitó con 300 rpm. Se añadió sosa cáustica de manera continua para evitar valores de pH altos. Después de 24 horas, las composiciones desemulsificadas se neutralizaron hasta pH 7,5. Después de la neutralización, se tomó una muestra de 50 g de la suspensión homogeneizada y la separación de los restos celulares se llevó a cabo mediante centrifugación a 13500 g. Posteriormente se determinó la cantidad de EPA y DHA en el sobrenadante.

Tabla 4: Influencia de la cantidad de NaOH añadido sobre la cantidad de aceite liberado

Los resultados muestran que incluso con cantidades bastante bajas de equivalentes de base añadidos ya pueden realizarse rendimientos muy buenos de aceite liberado sin la adición de disolventes orgánicos o sales como cloruro de sodio. Además, queda claro que hay una relación de equivalente de base añadido con respecto a materia seca total, en la que puede realizarse un rendimiento maximizado. Aumentar adicionalmente la cantidad de equivalentes de base más allá de esa relación no aumenta el rendimiento, sino que conduce a resultados incluso peores en comparación con cantidades menores de equivalentes de base añadidos. Los mejores resultados se obtuvieron con una cantidad de 12,5 a 15 moles de NaOH por 10 kg de TDM.

Ejemplo 6: Influencia de la temperatura, la materia seca total, la cantidad de cáustica y la velocidad de agitación sobre la liberación del aceite

Para someter a prueba la influencia y la interdependencia de la temperatura, el contenido de materia seca total (TDM), la cantidad de equivalentes de base y la velocidad de agitación sobre la liberación del aceite, se llevaron a cabo pruebas con caldos de fermentación tratados enzimáticamente que se concentraron mediante evaporación con circulación forzada hasta un contenido de materia seca total de o bien el 25, el 30 o bien el 35% en peso. Las pruebas se llevaron a cabo en un recipiente con agitación BIOSTAT® B-DCU-Quad 2L (Sartorius, Alemania). El volumen de las suspensiones concentradas usadas en las pruebas era de 1 l para cada muestra. En las pruebas, la cantidad total de equivalente de base añadido se varió desde el 5 hasta el 7% en peso, mientras que la desemulsificación se llevó a cabo o bien a 70, a 80 o bien a 90°C. Como equivalente de base se añadió NaOH en forma líquida (disolución de NaOH al 20% en peso) de una vez al principio de la etapa de desemulsificación. La desemulsificación tuvo lugar a una velocidad de mezclador de o bien 100, 550 o bien 1000 rpm durante 24 horas. Después de 24 horas, las composiciones resultantes se neutralizaron añadiendo ácido sulfúrico. Después de la neutralización, se tomó una muestra de 50 g de la suspensión homogeneizada y la separación de los restos celulares se llevó a cabo mediante centrifugación a 13500 g. Posteriormente se determinó la cantidad de EPA y DHA en el sobrenadante.

Tabla 5: Influencia de la temperatura, la TDM y la velocidad de agitación sobre el rendimiento de aceite liberado

Como puede verse, con una TDM del 35% en peso siempre pueden realizarse resultados muy buenos, es decir un rendimiento de aceite de al menos el 90% en peso, incluso a una cantidad bastante alta de equivalentes de base y una temperatura bastante baja. Por el contrario, a una TDM de solo el 25% en peso, los resultados pueden empeorar significativamente, cuando la cantidad de equivalente de base es bastante alta, en particular cuando la temperatura es bastante baja.

Ejemplo 7: Influencia de la temperatura sobre la liberación del aceite

Para someter a prueba la significancia de la temperatura sobre la liberación del aceite, se llevaron a cabo pruebas con caldos de fermentación tratados enzimáticamente que se concentraron mediante evaporación con circulación forzada hasta un contenido de materia seca total del 33% en peso. Las pruebas se llevaron a cabo en un recipiente con agitación BIOSTAT® B-DCU-Quad 2L (Sartorius, Alemania). El volumen de las suspensiones concentradas usadas en las pruebas era de 1 l para cada muestra. En cada prueba se añadió la misma cantidad total de equivalente de base (NaOH al 6% en peso por TDM, es decir 15 moles de NaOH por 10 kg de TDM), mientras que la desemulsificación se llevó a cabo o bien a 40, a 50 o bien a 90°C. El equivalente de base se añadió en forma líquida (disolución de NaOH al 20% en peso) de una vez al principio de la etapa de desemulsificación. La desemulsificación tuvo lugar a una velocidad de mezclador de 300 rpm durante 24 horas. Después de 24 horas, la composición resultante se neutralizó añadiendo ácido sulfúrico. Después de la neutralización, se tomó una muestra de 50 g de la suspensión homogeneizada y la separación de los restos celulares se llevó a cabo mediante centrifugación a 13500 g. Posteriormente se determinó la cantidad de EPA y DHA en el sobrenadante.

Tabla 6: Influencia de la temperatura sobre el rendimiento de aceite liberado

Resultó que incluso a bajas temperaturas como 40°C o 50°C puede realizarse una liberación muy eficiente de aceite, cuando se añade la cantidad apropiada de equivalentes de base.

Ejemplo 8: Desemulsificación a temperaturas muy bajas

Para someter a prueba adicionalmente la significancia de la temperatura sobre la liberación del aceite, se llevaron a cabo pruebas con caldos de fermentación tratados enzimáticamente que se concentraron mediante evaporación con circulación forzada hasta un contenido de materia seca total del 33,5% en peso. Las pruebas se llevaron a cabo en un recipiente con agitación BIOSTAT® B-DCU-Quad 2L (Sartorius, Alemania). El volumen de las suspensiones concentradas usadas era de 1 l para cada muestra. En cada prueba se añadió la misma cantidad total de equivalente de base (NaOH al 6% en peso por TDM, es decir 15 moles de NaOH por 10 kg de TDM), mientras que la desemulsificación se llevó a cabo o bien a 30°C o bien a 40°C. El equivalente de base se añadió en forma líquida (disolución de NaOH al 20% en peso) de una vez al principio de la etapa de desemulsificación. La desemulsificación tuvo lugar a una velocidad de mezclador de 300 rpm durante 24 horas. Después de 24 horas, la composición resultante se neutralizó añadiendo ácido sulfúrico. Después de la neutralización, se tomó una muestra de 50 g de la suspensión homogeneizada y la separación de los restos celulares se llevó a cabo mediante centrifugación a 13500 g. Posteriormente se determinó la cantidad de EPA y DHA en el sobrenadante.

Tabla 7: Influencia de la temperatura sobre el rendimiento de aceite liberado

Resultó que incluso a temperaturas de tan solo 30°C puede realizarse una liberación eficiente de aceite, cuando se añade la cantidad apropiada de equivalentes de base.

Ejemplo 9: Influencia del tiempo de desemulsificación sobre la liberación de aceite

Para someter a prueba la significancia del tiempo de exposición sobre la liberación del aceite, se llevaron a cabo pruebas con caldos de fermentación tratados enzimáticamente que se concentraron mediante evaporación con circulación forzada hasta un contenido de materia seca total del 36,2% en peso. Las pruebas se llevaron a cabo en un recipiente con agitación. El volumen de las suspensiones concentradas usadas era de 300 l para cada muestra. En cada prueba se añadió la misma cantidad total de equivalente de base (NaOH al 6% en peso por TDM, es decir 15 moles de NaOH por 10 kg de TDM) y la temperatura se mantuvo a 80°C. El equivalente de base se añadió paso a paso en forma líquida (disolución de NaOH al 20% en peso) en el transcurso de la exposición, de modo que el pH de la suspensión nunca superó pH 9,5. Los tiempos de exposición se variaron desde 4 hasta 23 horas. Después de la incubación, la composición resultante se neutralizó añadiendo ácido sulfúrico. Después de la neutralización, se tomó una muestra de 50 g de la suspensión homogeneizada y la separación de los restos celulares se llevó a cabo mediante centrifugación a 13500 g. Posteriormente se determinó la cantidad de EPA y DHA en el sobrenadante.

Tabla 8: Influencia del tiempo de desemulsificación sobre el rendimiento de aceite liberado

Resultó que sorprendentemente casi la misma cantidad de aceite podía aislarse a tiempos de exposición que variaban desde 4 hasta 23 horas. Esto significa que tiempos de exposición bastante cortos conducen ya a rendimientos muy buenos, de modo que pueden evitarse tiempos de incubación más prolongados, que consumen tiempo y energía.

Ejemplo 10: Uso de Ca(OH)² como base en la desemulsificación

Se concentraron caldos de fermentación tratados enzimáticamente mediante evaporación con circulación forzada hasta un contenido de materia seca total del 34% en peso. Las pruebas se llevaron a cabo en un recipiente con agitación BIOSTAT® B-DCU-Quad 2L (Sartorius, Alemania). El volumen de las suspensiones concentradas usadas era de un litro para cada muestra. La desemulsificación se llevó a cabo a una temperatura de 80°C y a un tiempo de exposición de 24 horas. Las suspensiones se agitaron con 300 rpm. O bien 10,6 moles de equivalentes de base o bien 14,0 moles de equivalentes de base de Ca(OH⁾² por 10 kg de materia seca total se añadieron a la suspensión. Se añadió Ca(OH⁾² paso a paso en forma suspendida (Ca(OH⁾² al 20% en peso en agua) en el transcurso de la exposición, de modo que el valor de pH de la suspensión nunca superó pH 9,5. Después de la incubación, la composición resultante se neutralizó añadiendo ácido sulfúrico. Después de la neutralización, se tomó una muestra de 50 g de la suspensión homogeneizada y la separación de los restos celulares se llevó a cabo mediante centrifugación a 13500 g. Posteriormente se determinó la cantidad de EPA y DHA en el sobrenadante.

Tabla 9: Influencia de la cantidad de Ca(OH⁾² añadido sobre la cantidad de aceite liberado

Como puede verse, aumentar la cantidad de Ca(OH⁾² desde 10,6 hasta 14,0 moles por 10 kg de materia seca total no tiene influencia sobre el rendimiento de aceite liberado. La adición de la misma cantidad de equivalentes de base conduce a resultados buenos similares como en el caso de NaOH.

Ejemplo 11: Desemulsificación sin tratamiento enzimático de las células

Para someter a prueba la significancia del tratamiento enzimático de las células sobre la liberación del aceite, se llevaron a cabo pruebas con caldos de fermentación que tras la pasteurización no se trataron enzimáticamente, sino que se concentraron directamente mediante evaporación con circulación forzada hasta un contenido de materia seca total del 32,8% en peso. Las pruebas se llevaron a cabo en un recipiente con agitación BIOSTAT® B-DCU-Quad 2L (Sartorius, Alemania). El volumen de las suspensiones concentradas usadas era de 1 l para cada muestra. En cada prueba se añadió la misma cantidad total de equivalente de base (NaOH al 6% en peso por TDM, es decir 15 moles de NaOH por 10 kg de TDM), y la desemulsificación se llevó a cabo a 90°C durante 24 horas a una velocidad de mezclador de 300 rpm. El equivalente de base se añadió en forma líquida (disolución de NaOH al 20% en peso) de una vez al principio de la etapa de desemulsificación. Después de 24 horas, la composición resultante se neutralizó añadiendo ácido sulfúrico. Después de la neutralización, se tomó una muestra de 50 g de la suspensión homogeneizada y la separación de los restos celulares se llevó a cabo mediante centrifugación a 13500 g. Posteriormente se determinó la cantidad de EPA y DHA en el sobrenadante.

Resultó que sorprendentemente incluso sin tratamiento enzimático previo de las células podían realizarse rendimientos de aceite bastante buenos de aproximadamente el 80%, cuando se proporciona una cantidad apropiada de materia seca total y se aplica una cantidad apropiada de equivalentes de base durante la desemulsificación.

Claims (15)

1. REIVINDICACIONES

   1 Un método de aislamiento de un lípido que contiene ácidos grasos poliinsaturados (PUFA) a partir de una biomasa, que comprende las siguientes etapas:

   a) proporcionar una suspensión de una biomasa que comprende células que contienen un lípido que contiene PUFA;

   b) opcionalmente lisar las células de la biomasa;

   c) concentrar la suspensión hasta un contenido de materia seca total (TDM) del 20 al 60% en peso, si la suspensión tiene un contenido de TDM menor;

   d) ajustar en la suspensión una temperatura de 20°C a 100°C, preferiblemente de 25, 30, 40, 50 o 60°C a 100°C, más preferiblemente de 65°C a 95°C, en particular de 70 a 90°C;

   e) mantener la temperatura en el intervalo descrito en (d) durante al menos 1 hora, preferiblemente durante al menos 2, 3, 4, 5, 6, 7 u 8 horas, más preferiblemente durante de 1 a 36 horas, en particular durante de 2, 3, 4, 5, 6, 7 u 8 horas a 36 horas, más preferiblemente de 10 a 24 horas, al tiempo que se añaden en total de 7,5 a 25 moles, preferiblemente de 8,5 a 22 moles, en particular de 10 a 20, más preferiblemente de 11 a 18, sobre todo de 12 a 17 moles, de equivalente de base a 10 kg de materia seca total contenida en la suspensión.
2. 2. - El método según la reivindicación 1, que comprende las siguientes etapas:

   a) proporcionar una suspensión de una biomasa que comprende células que contienen un lípido que contiene PUFA;

   b) opcionalmente lisar las células de la biomasa;

   c) concentrar la suspensión hasta un contenido de materia seca total (TDM) del 20 al 60% en peso, si la suspensión tiene un contenido de TDM menor;

   d) ajustar en la suspensión una temperatura de 20°C a por debajo de 80°C, preferiblemente una temperatura de 25°C a por debajo de 60°C, más preferiblemente de 25°C a 58°C, en particular de 30°C a 55°C, sobre todo una temperatura de 30°C a 50°C;

   e) mantener la temperatura en los intervalos descritos en (d) durante al menos 1 hora, preferiblemente durante al menos 2, 3, 4, 5, 6, 7 u 8 horas, más preferiblemente durante de 1 a 36 horas, en particular durante de 2, 3, 4, 5, 6, 7 u 8 horas a 36 horas, más preferiblemente de 10 a 24 horas, al tiempo que se añaden en total de 7,5 a 25 moles, preferiblemente de 8,5 a 22 moles, en particular de 10 a 20, más preferiblemente de 11 a 18, sobre todo de 12 a 17 moles, de equivalente de base a 10 kg de materia seca total contenida en la suspensión.
3. 3. - El método según la reivindicación 1, que comprende las siguientes etapas:

   a) proporcionar una suspensión de una biomasa que comprende células que contienen un lípido que contiene PUFA;

   b) opcionalmente lisar las células de la biomasa;

   c) concentrar la suspensión hasta un contenido de materia seca total (TDM) del 20 al 60% en peso, si la suspensión tiene un contenido de TDM menor;

   d) ajustar en la suspensión una temperatura de 20°C a 100°C, preferiblemente de 25, 30, 40 o 50°C a 100°C, más preferiblemente de 60°C a 95°C, en particular de 70 a 90°C;

   e) mantener la temperatura en los intervalos descritos en (d) durante de 1 a menos de 10 horas, preferiblemente de 1 o 2 a 8 horas, más preferiblemente de 1, 2 o 3 a 6 horas, al tiempo que se añaden en total de 7,5 a 25 moles, preferiblemente de 8,5 a 22 moles, en particular de 10 a 20, más preferiblemente de 11 a 18, sobre todo de 12 a 17 moles, de equivalente de base a 10 kg de materia seca total contenida en la suspensión.
4. 4. - El método según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el pH se mantiene en la etapa (e) por debajo de 11,5, preferiblemente por debajo de 11, más preferiblemente por debajo de 10,5, en particular en el intervalo de 7,5 a 11,5, preferiblemente en el intervalo de 8 a 11, más preferiblemente en el intervalo de 8 a 10,5, en particular en el intervalo de 8,0 a 10,0.
5. 5. - El método según la reivindicación 1, que comprende las siguientes etapas:

   a) proporcionar una suspensión de una biomasa que comprende células que contienen un lípido que contiene PUFA;

   b) opcionalmente lisar las células de la biomasa;

   c) concentrar la suspensión hasta un contenido de materia seca total (TDM) del 20 al 60% en peso, preferiblemente del 25 al 60% en peso, en particular del 30 al 60% en peso, si la suspensión tiene un contenido de TDM menor;

   d) ajustar en la suspensión una temperatura de 25°C a 100°C, preferiblemente de 30, 40 o 50°C a 100°C, más preferiblemente de 60°C a 95°C, en particular de 70 a 90°C;

   e) mantener la temperatura en los intervalos descritos en (d) durante al menos 1 hora, preferiblemente durante al menos 2, 3, 4, 5, 6, 7 u 8 horas, más preferiblemente durante de 1 a 36 horas, en particular durante de 2, 3, 4, 5, 6, 7 u 8 horas a 36 horas, más preferiblemente de 10 a 24 horas, al tiempo que se añaden en total de 7,5 a 25 moles, preferiblemente de 8,5 a 18,5 moles, en particular de 10 a 17, más preferiblemente de 11 a 16, sobre todo de 12 a 15 moles, de equivalente de base a 10 kg de materia seca total contenida en la suspensión, al tiempo que el pH de la composición se mantiene siempre por debajo de 9,0, preferiblemente por debajo de 8,5, en particular se mantiene en el intervalo de 8,0 a 8,9, más preferiblemente en el intervalo de 8,0 a 8,5.
6. 6. - El método según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que la base se selecciona de hidróxidos, en particular hidróxido de sodio, hidróxido de litio, hidróxido de potasio y/o hidróxido de calcio, y/o carbonatos, en particular carbonato de sodio, carbonato de potasio y/o carbonato de magnesio, y/o bicarbonatos, en particular bicarbonato de litio, bicarbonato de sodio y/o bicarbonato de potasio, en el que se prefiere el hidróxido de sodio.
7. 7. - El método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 o 5, en el que la concentración de la suspensión en la etapa (b) se lleva a cabo mediante evaporación de agua a una temperatura no mayor de 100°C, preferiblemente de 70°C a 100°C, más preferiblemente de 80°C a 90°C.
8. 8. - El método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en el que la suspensión proporcionada en la etapa (a) tiene ya un contenido de materia seca total del 20 al 60% en peso, preferiblemente del 25 al 60% en peso, más preferiblemente del 30 al 55% en peso.
9. 9. - El método según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que para lisar las células no se usan o solo se usan pequeñas cantidades de sales, en el que “pequeñas cantidades” significa preferiblemente que las sales se añaden en una cantidad de menos de 0,1 g/l de caldo de fermentación.
10. 10. - El método según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que para lisar las células no se usan o solo se usan pequeñas cantidades de disolventes orgánicos, en el que “pequeñas cantidades” significa preferiblemente que los disolventes orgánicos se añaden en una cantidad de menos de 0,1 g/l de caldo de fermentación.
11. 11. - El método según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el lisado de las células de la biomasa se lleva a cabo enzimática, mecánica, química y/o físicamente.
12. 12. - El método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en el que las etapas (d) y (e) se llevan a cabo sin lisado previo las células de la biomasa.
13. 13. - El método según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que comprende como etapa adicional la recogida del aceite que contiene PUFA, en el que la recogida del aceite que contiene PUFA comprende preferiblemente la neutralización de la suspensión desemulsificada y la separación posterior de la fase ligera que contiene aceite así obtenida de la fase pesada que contiene agua, sales, aceite residual y restos celulares.
14. 14. - El método según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que la suspensión se proporciona como caldo de fermentación con una densidad de biomasa de preferiblemente al menos 80, 100, 120 o 140 g/l.
15. 15. - El método según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que las células que contienen un lípido que contiene PUFA se seleccionan de algas, hongos, protistas, bacterias, microalgas, células vegetales y mezclas de los mismos, en el que las microalgas se seleccionan preferiblemente del filo Stramanopiles, en particular de la familia de los traustoquítridos, preferiblemente del género Schizochytrium.