ES2589122T3 - Estimulación de la ruta de la Wnt en la reprogramación de células somáticas - Google Patents

Estimulación de la ruta de la Wnt en la reprogramación de células somáticas Download PDF

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Abstract

Un método para la reprogramación de una célula somática de mamífero, que comprende poner en contacto la célula somática de mamífero con: (I) un medio condicionado de Wnt que comprende una concentración de entre 100 ng/ml y 1.000 ng/ml de proteína Wnt3a secretada; un medio no condicionado que comprende al menos un 5 % del medio condicionado en volumen; o un activador de la ruta de la Wnt seleccionado entre el grupo que consiste en: una proteína Wnt exógena soluble biológicamente activa que se une a un receptor de la Wnt y activa la ruta de la Wnt, y un antagonista de molécula pequeña GSK-3 que activa la ruta de la Wnt seleccionado entre el grupo que consiste en: 6-bromoindirrubin-3'-oxima (BIO); N-(4-metoxibencil)-N-(5-nitro-1,3-tiazol-2-il) urea (AR-AO 14418); 3-(2,4- diclorofenil)-4-(1-metil-1H-indol-3-il)-1H-pirrol-2,5-diona (SB 216763); 4-bencil-2-metil-1,2,4-tiadiazolidin-3,5-diona (TDZD-8); CHIR-911 y CHIR-837; y (II) los factores de reprogramación Oct4, Klf4 y Sox2, reprogramando así la célula a un estado pluripotente.

Description

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DESCRIPCION
Estimulacion de la ruta de la Wnt en la reprogramacion de celulas somaticas Financiacion gubernamental
La invencion descrita en el presente documento fue financiada, en su totalidad o en parte, por las subvenciones 5- RO1-HDO45022, 5-R37-CA084198 y 5-R01-CAO87869 a favor de RJ y por parte de la subvencion NIH HG002668 del National Institutes of Health, el gobierno de los Estados Unidos tiene ciertos derechos sobre la invencion.
Referencia cruzada con las solicitudes relacionadas
Esta solicitud reivindica las ventajas de prioridad con la Solicitud de Patente Provisional de EE.UU. 60/967.028, presentada el 31 de agosto de 2007 y la Solicitud de Patente Provisional de EE.UU. 61/188.190, presentada el 6 de agosto de 2008.
Antecedentes de la invencion
Las celulas madre son celulas que son capaces de autorrenovarse y dar lugar a celulas mas diferenciadas. Las celulas madre embrionarias (ES) pueden diferenciarse en los multiples tipos celulares especializados que en conjunto forman el cuerpo. Ademas de presentar un inmenso interes cientffico, la propiedad de pluripotencialidad proporciona a las celulas ES humanas una gran proyeccion clmica para aplicaciones en la medicina regenerativa, tales como las terapias de sustitucion de celulas/tejidos para el tratamiento de enfermedades.
Actualmente se usan varios metodos diferentes para la obtencion de las celulas ES. En un metodo, una lmea celular ES deriva de la masa de celulas internas de un embrion normal en la fase de blastocisto (veanse las Patentes de EE.UU. n° 5.843.780 y 6.200.806, Thompson, J. A. et al. Science, 282: 1145-7, 1998). Un segundo metodo para la creacion de celulas ES pluripotentes utiliza la transferencia de nucleos de celulas somaticas (SCNT). En esta tecnica se extrae el nucleo de un huevo normal, eliminando asf el material genetico. Se introduce directamente el nucleo de una celula diploide donante en el ovocito desnucleado, por ejemplo, mediante una micromanipulacion, o la celula somatica diploide donante se coloca junto al huevo desnucleado y las dos celulas se fusionan. La celula resultante tiene el potencial de desarrollarse en un embrion temprano a partir del cual puede obtenerse la porcion que contiene la masa celular interna productora de la celula madre. En un tercer metodo se trasplanta el nucleo de una celula humana en un ovocito animal desnucleado de una especie diferente a la de la celula donante. Vease, por ejemplo, la Patente Publicada de EE.UU. n° 20010012513. Las celulas quimericas resultantes se usan para la produccion de celulas ES pluripotentes, en particular de celulas ES pluripotentes pseudohumanas. Los inconvenientes de esta tecnica son que estas celulas quimericas pueden contener virus desconocidos y conservan las mitocondrias de la especie animal.
Los metodos tradicionales de aislamiento de celulas ES adolecen de diversas limitaciones cuando se aplican a la generacion de celulas ES humanas. Estas incluyen las controversias eticas relacionadas con la fuente de las celulas, asf como los retos tecnicos. Una limitacion significativa para la utilizacion productiva de las celulas ES en aplicaciones clmicas es la dificultad asociada a la generacion de celulas ES que sean geneticamente compatibles con los pacientes individuales. Existe una necesidad significativa de metodos alternativos para la generacion de celulas pluripotentes.
Sumario de la invencion
La presente invencion proporciona composiciones y metodos para la reprogramacion de celulas somaticas de mairnfero en celulas de tipo celulas madre embrionarias pluripotentes ("celulas de tipo ES").
En un primer aspecto, la invencion proporciona un metodo para la reprogramacion de una celula somatica de marnffero, que comprende poner en contacto la celula somatica de mamnfero con:
(I) un medio condicionado de Wnt que comprende una concentracion de entre 100 ng/ml y 1.000 ng/ml de la protema Wnt3a secretada; un medio no condicionado que comprende al menos un 5 % en volumen del medio condicionado; o un activador de la ruta de la Wnt seleccionado entre el grupo que consiste en: una protema Wnt exogena soluble biologicamente activa que se une a un receptor de la Wnt y activa la ruta de la Wnt, y un antagonista de molecula pequena GSK-3 que activa la ruta de la Wnt seleccionado entre el grupo que consiste en: 6-bromoindirrubin-3'-oxima (BIO); N-(4-metoxibencil)-N'-(5-nitro-1,3-tiazol-2-il) urea (AR-AO 14418); 3-(2,4- diclorofenil)-4-(1-metil-1H-indol-3-il)-1H-pirrol-2,5-diona (Sb 216763); 4-bencil-2-metil-1,2,4-tiadiazolidin-3,5-diona (TDZD-8); CHIR-911 y CHIR-837; y
(II) los factores de reprogramacion Oct4, Klf4 y Sox2, reprogramando asf la celula a un estado pluripotente.
El metodo puede comprender el cultivo de la celula somatica de mamffero en un medio de cultivo que contiene el activador de la ruta de la Wnt, por ejemplo, durante al menos 10 dfas. En una realizacion, el contacto de la celula somatica de mamffero con el activador de la ruta de la Wnt y los factores de reprogramacion aumenta la cantidad de
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celulas somaticas reprogramadas en al menos 5 veces o en al menos 10 veces.
La protema Wnt exogena soluble biologicamente activa puede ser la Wnt3a.
La celula somatica de mairnfero puede ser una celula humana. En algunas realizaciones, la celula somatica de mam^fero es una celula diferenciada a termino, un fibroblasto, una celula madre neural o una celula progenitora neural. La celula somatica de mamffero puede ser modificada para que exprese o contenga al menos un factor de reprogramacion en una cantidad mayor de la que habna presente normalmente en ese tipo de celulas. En algunas realizaciones, la celula somatica de mamffero no ha sido modificada geneticamente. En algunas realizaciones la celula somatica de mamffero no ha sido modificada geneticamente para que exprese el c-Myc en una cantidad mayor de la que hay presente normalmente en una celula de ese tipo celular.
El metodo del primer aspecto de la invencion puede comprender adicionalmente la confirmacion de que la celula reprogramada es pluripotente.
En algunas realizaciones, el metodo comprende adicionalmente la diferenciacion de la celula reprogramada en un tipo celular deseado in vitro despues de la reprogramacion de la celula somatica de mamnfero. En algunas realizaciones, el metodo se lleva a cabo sobre una poblacion de celulas y comprende adicionalmente la identificacion de las celulas somaticas reprogramadas segun los criterios morfologicos para las celulas ES.
En una realizacion, el metodo se lleva a cabo sobre una poblacion de celulas y no comprende la imposicion de una seleccion qmmica para la seleccion de las celulas reprogramadas.
En algunas realizaciones, el metodo se lleva a cabo sobre una poblacion de celulas y comprende adicionalmente la separacion de las celulas que estan reprogramadas a un estado pluripotente con respecto de las celulas que no estan reprogramadas a un estado pluripotente.
En el metodo del primer aspecto de la invencion, el contacto de la celula somatica de marnffero con los factores de reprogramacion puede comprender la modificacion de la celula para que exprese al menos un factor de reprogramacion en una cantidad mayor de la que hay presente normalmente en una celula de ese tipo.
En un segundo aspecto, la invencion proporciona un metodo para la identificacion de un modulador de la ruta de la Wnt util para la modulacion de la reprogramacion de las celulas somaticas de mamffero a un estado de tipo ES que comprende:
(a) el cultivo de una poblacion de celulas somaticas de mamffero en un medio que contiene el modulador de la ruta de la Wnt, en el que las celulas estan modificadas geneticamente o transfectadas temporalmente para que expresen Oct4, Sox2 y Klf4; y
(b) la determinacion, despues de un periodo de tiempo adecuado, de la presencia de las celulas que presentan una o mas de las caractensticas de las celulas ES despues de mantener las celulas y su progenie en un cultivo durante un periodo de tiempo adecuado, en el que el modulador de la ruta de la Wnt es identificado como util para la modulacion de la reprogramacion de las celulas somaticas de mamffero a un estado de tipo ES si las celulas que presentan una o mas de las caractensticas de las celulas ES estan presentes en unas cantidades diferentes a las que se habna esperado si el medio no contuviera el modulador de la ruta de la Wnt.
En un tercer aspecto, la invencion proporciona una composicion que comprende:
(a) un medio de cultivo celular que contiene un activador de la ruta de la Wnt seleccionado entre el grupo que consiste en: una protema Wnt que se une a un receptor de la Wnt y activa la ruta de la Wnt y un antagonista de molecula pequena GSK-3 que activa la ruta de la Wnt seleccionado entre el grupo que consiste en: 6- bromoindirrubin-3'-oxima (BIO); N-(4-metoxibencil)-N'-(5-nitro-1,3-tiazol-2-il) urea (Ar-AO 14418); 3-(2,4- diclorofenil)-4-(1-metil-1H-indol-3-il)-1H-pirrol-2,5-diona (Sb 216763); 4-bencil-2-metil-1,2,4-tiadiazolidin-3,5-diona (TDZD-8); CHIR-911 y CHIR-837; y
(b) una celula somatica de mamnfero, en el que la celula ha sido modificada para que exprese o contenga uno o mas factores de reprogramacion seleccionados entre el grupo que consiste en: Oct4, Nanog, Sox2, Lin28 y Klf4.
En algunas realizaciones, la celula somatica de mamffero ha sido modificada para que exprese o contenga unos factores de reprogramacion seleccionados entre el grupo que consiste en: (i) Oct4; (ii) Oct 4 y Klf4; y (iii) Oct4, Klf4 y Sox2.
En algunas realizaciones, la celula somatica de mamnfero no esta modificada geneticamente.
En ciertas realizaciones, la celula ha sido modificada geneticamente para que contenga una secuencia de acidos nucleicos que codifica para un marcador seleccionable, unido operativamente a un promotor para un gen de pluripotencia endogeno.
El medio de cultivo celular puede comprender un medio condicionado (MC) que comprende una concentracion de entre 100 ng/ml y 1.000 ng/ml de protema Wnt3a secretada.
En un cuarto aspecto, la invencion proporciona una composicion que comprende: una celula madre pluripotente inducida (iPS) y un activador de la ruta de la Wnt seleccionado entre el grupo que consiste en: una protema Wnt
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exogena soluble biologicamente activa que se une a un receptor de la Wnt y activa la ruta de la Wnt, un medio condicionado de Wnt que comprende una concentracion de entre 100 ng/ml y 1.000 ng/ml de protema Wnt3a secretada y un antagonista de molecula pequena GSK-3 que activa la ruta de la Wnt seleccionado entre el grupo que consiste en: 6-bromoindirrubin-3'-oxima (BIO); N-(4-metoxibencil)-N-(5-nitro-1,3-tiazol-2-il) urea (AR-AO 14418); 3-(2,4-diclorofenil)-4-(1 -metil-1H-indol-3-il)-1H-pirrol-2,5-diona (SB 216763); 4-bencil-2-metil-1,2,4-tiadiazolidin-3,5- diona (TDZD8); CHIR-911 y CHIR-837.
Tambien se divulga un metodo para la reprogramacion de una celula somatica de mairnfero que comprende el cultivo de la celula en presencia de una molecula de senalizacion extracelular de forma que la celula quede reprogramada.
El metodo puede comprender el cultivo de la celula en un medio de cultivo celular condicionado de Wnt de forma que la celula quede reprogramada. El metodo puede comprender el cultivo de la celula somatica de forma que la celula sea inducida a transformarse en pluripotente. El medio de cultivo celular condicionado de Wnt puede comprender medio condicionado de Wnt3a (MC de la Wnt3a).
Tambien se divulga un metodo para la reprogramacion de una celula somatica de mamffero que comprende poner en contacto la celula con un agente que aumenta la actividad de una ruta de la Wnt de forma que la celula sea inducida a transformarse en pluripotente. El agente puede ser una protema Wnt soluble biologicamente activa, por ejemplo, una protema Wnt3a. En algunas realizaciones el agente se selecciona entre el grupo que consiste en: (i) moleculas pequenas que simulan el efecto de un medio condicionado de protemas Wnt3a o Wnt solubles biologicamente activas, por ejemplo, mediante la interaccion con el (los) receptor(es) celular(es) de la Wnt; (ii) agentes que modulan la interaccion entre la p-catenina y un miembro de la familia TCF/LEF y/o que modulan la expresion o la actividad de un miembro de la familia TCF/LEF; (iii) agentes que inhiben la expresion o la actividad de un inhibidor endogeno de la ruta de la Wnt.
En el presente documento se divulgan celulas somaticas reprogramadas mediante el uso de los metodos inventivos.
En el presente documento se divulgan medios de cultivo celular que contienen un activador de la Wnt3a y un agente de reprogramacion adicional capaz de sustituir la expresion modificada de Oct4, de Klf4 y/o de Sox2 (o de cualquier combinacion de los mismos). Adicionalmente se divulgan (1) una composicion que comprende: (i) una celula que ha sido modificada para que aumente su expresion de Oct4, de Klf4 y/o de Sox2, o de cualquier subconjunto de estos; y (ii) un modulador de la ruta de la Wnt, por ejemplo, un activador de la ruta de la Wnt; (2) una composicion que comprende: (i) una celula que ha sido modificada para que aumente su expresion o el nivel intracelular de uno o mas factores de reprogramacion, en la que el (los) factor(es) de reprogramacion se selecciona(n) opcionalmente entre Oct4, Klf4 y/o Sox2, o cualquier subconjunto de estos; y (ii) un medio condicionado de Wnt; (3) una composicion que comprende: (i) una celula que ha sido modificada para que aumente su expresion o el nivel intracelular de uno o mas factores de reprogramacion, en la que el (los) factor(es) de reprogramacion se selecciona(n) opcionalmente entre Oct4, Nanog, Lin28 y/o Sox2, o cualquier subconjunto de estos; y (ii) un activador de la ruta de la Wnt; y (4) una composicion que comprende: (i) una celula que ha sido modificada para que aumente su expresion o el nivel intracelular de uno o mas factores de reprogramacion, en la que el (los) factor(es) de reprogramacion se selecciona(n) opcionalmente entre Oct4, Nanog, Lin28 y/o Sox2, o cualquier subconjunto de estos; y (ii) un medio condicionado de Wnt.
Tambien se divulgan metodos para la identificacion de un agente que reprograma celulas somaticas hacia un estado menos diferenciado y/o contribuye a dicha reprogramacion junto con uno o mas de otros agentes. En algunos de los metodos, las celulas somaticas se ponen en contacto con un agente que aumenta la actividad de la ruta de la Wnt y con un agente candidato. Se evaluan las caractensticas de pluripotencia de las celulas. La presencia de al menos un subconjunto de caractensticas de pluripotencia indica que el agente es capaz de reprogramar las celulas somaticas hacia un estado menos diferenciado. Los agentes identificados pueden usarse entonces para la reprogramacion de celulas somaticas poniendo en contacto las celulas somaticas con los agentes.
Tambien se divulgan en el presente documento metodos para el tratamiento de una afeccion en un individuo en necesidad de tratamiento para una afeccion. A partir del individuo pueden obtenerse celulas somaticas y reprogramarse mediante los metodos de la invencion. Las celulas reprogramadas pueden ser expandidas en un cultivo. Las celulas reprogramadas pluripotentes (que se refiere a las celulas originales reprogramadas y/o a su progenie, que conserva la propiedad de pluripotencia) se mantienen en unas condiciones adecuadas para que las celulas se desarrollen en celulas de un tipo celular o de una estirpe celular deseados. Las celulas pueden ser diferenciadas in vitro mediante el uso de protocolos tales como los conocidos en la materia. Las celulas reprogramadas de un tipo celular deseado se introducen en el individuo para el tratamiento de la afeccion. Las celulas somaticas obtenidas a partir del individuo pueden contener una mutacion en uno o mas genes. En estos casos, las celulas somaticas obtenidas a partir del individuo pueden tratarse en primer lugar para reparar o compensar el defecto, por ejemplo, mediante la introduccion de una o mas copias naturales del (los) gen(es) en las celulas de forma que las celulas resultantes expresen la version natural del gen. Despues, las celulas se introducen en el individuo.
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Las celulas somaticas obtenidas a partir del individuo pueden ser modificadas para que expresen uno o mas genes despues de su extraccion del individuo. Las celulas pueden ser modificadas mediante la introduccion de un gen o de un casete de expresion que comprende un gen en las celulas. El gen introducido puede ser uno que sea util para el fin de identificar, seleccionar y/o generar una celular programada. En ciertas realizaciones el (los) gen(es) introducido(s) contribuye(n) a iniciar y/o a mantener el estado reprogramado. El (los) producto(s) de expresion del (los) gen(es) introducido(s) puede(n) contribuir a producir el estado reprogramado pero es (son) dispensable(s) para el mantenimiento del estado reprogramado.
Algunos de los metodos divulgados en el presente documento pueden usarse para el tratamiento de individuos en necesidad de un organo funcional. En los metodos se obtienen celulas somaticas a partir de un individuo en necesidad de un organo funcional y se reprograman mediante los metodos de la invencion para la produccion de celulas somaticas reprogramadas. Dichas celulas somaticas reprogramadas se cultivan despues en unas condiciones adecuadas para el desarrollo de las celulas somaticas reprogramadas en un organo deseado, que despues se introduce en el individuo.
Tambien se divulga un metodo para la reprogramacion de una celula somatica de mairnfero que comprende poner en contacto la celula somatica de mamffero con un agente que modula una ruta de la Wnt de forma que la celula somatica de mamffero queda reprogramada. El metodo puede comprender la reprogramacion de la celula somatica de mamffero a un estado pluripotente. Se divulgan mejoras en los metodos para la generacion de celulas madre pluripotentes inducidas (iPS). Por ejemplo, los metodos mejoran la reprogramacion de celulas somaticas a pluripotencia que no han sido modificadas para que expresen el c-Myc. Los metodos pueden facilitar la generacion de colonias homogeneas de tipo ES y pueden mejorar la formacion de colonias homogeneas de tipo ES sin imponer una etapa de seleccion que requiere la modificacion genetica de las celulas somaticas iniciales.
El metodo puede comprender el cultivo de la celula en un medio condicionado de Wnt, por ejemplo, un medio condicionado de Wnt3a. La celula puede ser una celula humana, una celula de raton o una celula de un primate no humano. La celula somatica de mamffero puede ser una celula diferenciada a termino. La celula puede ser un fibroblasto o una celula del sistema inmunitario (por ejemplo, un linfocito B o T). La celula somatica de mamffero puede no ser una celula diferenciada a termino. Por ejemplo, la celula somatica de mamffero puede ser una celula precursora, por ejemplo, una celula precursora neural o una celula precursora hematopoyetica. El metodo puede llevarse a la practica in vitro. El contacto de la celula puede comprender el cultivo de la celula en un medio de cultivo que contiene el agente. El contacto puede comprender el cultivo de la celula en un medio de cultivo que comprende el agente durante al menos 10 dfas. El contacto puede comprender el cultivo de la celula en medio de cultivo que comprende el agente durante al menos 12 o al menos 15 dfas o al menos 20 dfas. La celula somatica puede estar modificada geneticamente para que contenga una secuencia de acidos nucleicos que codifica para un marcador seleccionable, unido operativamente a un promotor para un gen de pluripotencia endogeno, permitiendo asf la seleccion de las celulas que han sido reprogramadas a una pluripotencia, o la celula somatica pueden no estar modificada geneticamente para que contenga una secuencia de acidos nucleicos que codifica para un marcador seleccionable unido operativamente a un promotor para un gen de pluripotencia endogeno, permitiendo asf la seleccion de las celulas que han sido reprogramadas a una pluripotencia. La celula somatica puede estar modificada para que exprese o contenga al menos un factor de reprogramacion en una cantidad mayor de la que normalmente hay presente en las celulas somaticas de ese tipo. El factor de reprogramacion puede ser Oct4, Sox2, Klf4, Nanog o Lin28. El (los) factor(es) de reprogramacion puede(n) ser Oct4 y Sox2 o Oct4, Sox2 y Klf4. La celula somatica puede no estar modificada geneticamente para que exprese el c-Myc en una cantidad mayor de la que normalmente hay presente en las celulas somaticas de ese tipo celular. La celula tambien puede ponerse en contacto con un segundo agente que modula la ruta de la Wnt. La celula somatica puede ser cultivada en un medio que contiene la protema Wnt exogena soluble biologicamente activa. La protema es la protema Wnt3a. El metodo puede comprender adicionalmente la confirmacion de que la celula reprogramada es pluripotente. El metodo puede llevarse a la practica en una poblacion de celulas y puede comprender la separacion de las celulas que estan reprogramadas a un estado pluripotente de las celulas que no estan reprogramadas a un estado pluripotente. El metodo puede comprender adicionalmente la administracion de la celula reprogramada a un sujeto. El metodo puede comprender la diferenciacion de la celula en un tipo celular deseado in vitro despues de la reprogramacion de la celula. El metodo puede comprender adicionalmente la administracion de la celula diferenciada a un sujeto.
Tambien se divulga un metodo para el tratamiento de un individuo en necesidad del mismo que comprende: (a) la obtencion de celulas somaticas a partir del individuo; (b) la reprogramacion de al menos algunas de las celulas somaticas mediante un metodo que comprende poner en contacto las celulas somaticas de marnffero con un agente que modula la ruta de la Wnt (por ejemplo, un activador de la ruta de la Wnt); y (c) la administracion de al menos algunas de las celulas reprogramadas al individuo, opcionalmente despues de la diferenciacion de las celulas en uno o mas de los tipos celulares deseados. El individuo puede ser un ser humano. El metodo puede llevarse a la practica sobre una poblacion de celulas y puede comprender adicionalmente la separacion de las celulas que estan reprogramadas a un estado pluripotente de las celulas que no estan programadas a un estado pluripotente. El metodo puede comprender adicionalmente la diferenciacion de la celula in vitro y, opcionalmente, la administracion de la celula diferenciada a un individuo en necesidad de tratamiento para una afeccion para la cual es de utilidad la terapia con celulas. Por ejemplo, las celulas pueden estar diferenciadas a lo largo de una estirpe celular deseada, tal como una estirpe neural, una estirpe muscular, etc.
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Tambien se divulga una composicion que comprende (i) una celula somatica de mai^ero que ha sido modificada o tratada de forma que expresa o contiene al menos un factor de reprogramacion en una cantidad mayor de la que sena el caso sin dicha modificacion o tratamiento; y (ii) un agente que aumenta la actividad de una ruta de la Wnt y que contribuye a la reprogramacion de la celula somatica a un estado pluripotente. El agente puede ser una protema Wnt3a o una molecula pequena.
Tambien se divulga un metodo para la identificacion de un agente util para la modulacion de la reprogramacion de celulas somaticas de mairnfero a un estado pluripotente que comprende: (a) el cultivo de una poblacion de celulas somaticas de mamffero en un medio que contiene un agente que modula la actividad de una ruta de la Wnt y un agente candidato; y (b) la determinacion, despues de un periodo de tiempo adecuado, de si estan presentes las celulas que presentan una o mas de las caractensticas de las celulas ES despues de mantener las celulas o su progenie en cultivo durante un periodo de tiempo adecuado, en el que el agente candidato es identificado como util para la modulacion de la reprogramacion de las celulas somaticas de mamffero a un estado pluripotente si las celulas que presentan una o mas de las caractensticas de las celulas ES estan presentes en unas cantidades diferentes a las que se esperana si el medio no hubiera contenido el agente candidato.
Las caractensticas pueden seleccionarse entre: la morfologfa de la colonia, la expresion de un gen endogeno expresado selectivamente por las celulas ES, la expresion de un marcador detectable unido operativamente a secuencias de control de la expresion de un gen expresado selectivamente por las celulas ES, la capacidad para diferenciarse en celulas que tienen las caractensticas del endodermo, del mesodermo y del ectodermo cuando se inyectan en un raton inmunodeprimido y la capacidad para participar en la formacion de quimeras que sobreviven a termino. Las celulas pueden haber sido modificadas para que expresen al menos un factor de reprogramacion. El medio puede ser un medio condicionado de Wnt.
El medio puede ser un medio condicionado de Wnt3a. El agente que modula la actividad de una ruta de la Wnt puede ser una protema Wnt3a o una molecula pequena. El agente candidato puede ser una molecula pequena. El metodo puede comprender la identificacion de un agente util para mejorar la reprogramacion de las celulas somaticas de mamffero, en el que el agente candidato es identificado como util para mejorar la reprogramacion de las celulas somaticas de mamffero a un estado pluripotente si las celulas que presentan una o mas de las caractensticas de las celulas ES estan presentes en una cantidad mayor de la que se habna esperado si el medio no contuviera el agente candidato. La etapa (b) puede comprender la determinacion de si las colonias de celulas que presentan una o mas de las caractensticas de las colonias de celulas ES estan presentes despues de mantener las celulas y su progenie en cultivo durante un periodo de tiempo adecuado, en el que el agente candidato es identificado como util para la modulacion de la reprogramacion de la celulas somaticas de mamffero a un estado pluripotente si las colonias de celulas que presentan una o mas de las caractensticas de las colonias de celulas ES estan presentes en una cantidad diferente a la que se habna esperado si el medio no hubiera contenido el agente candidato. Las celulas pueden expresar al menos un factor de reprogramacion.
Tambien se divulga un metodo para la identificacion de un agente util para la reprogramacion celulas somaticas de mamffero a un estado pluripotente que comprende: (a) poner en contacto una poblacion de celulas somaticas de mamffero con un agente que aumenta la actividad de la ruta de la Wnt y un agente candidato; (b) mantener las celulas en un sistema de cultivo celular durante un periodo de tiempo adecuado; y (c) determinar si las celulas que presentan una o mas de las caractensticas de las celulas ES estan presentes en dicho sistema de cultivo, en el que el agente es identificado como util para la reprogramacion de la celulas somaticas de mamnfero a un estado de tipo ES si las celulas que presentan una o mas de las caractensticas de las celulas ES estan presentes en una cantidad mayor de la que se habfa esperado si las celulas no hubieran estado en contacto con el agente candidato.
Las caractensticas pueden seleccionarse entre: la morfologfa de la colonia, la expresion de un gen endogeno expresado selectivamente por las celulas ES, la expresion de un marcador detectable unido operativamente a secuencias de control de la expresion de un gen expresado selectivamente por las celulas ES, la capacidad para diferenciarse en celulas que tienen las caractensticas del endodermo, del mesodermo y del ectodermo cuando se inyectan en un raton inmunodeprimido y la capacidad para participar en la formacion de quimeras que sobreviven a termino.
El agente que aumenta la actividad de la ruta de la Wnt puede ser una protema Wnt3a. El agente candidato puede ser una molecula pequena. Las celulas pueden expresar al menos un factor de reprogramacion. La etapa (b) puede comprender la determinacion de si las colonias de celulas que presentan una o mas de las caractensticas de las colonias de celulas ES estan presentes despues de mantener las celulas y su progenie en cultivo durante un periodo de tiempo adecuado, en el que el agente candidato es identificado como util para la modulacion de la reprogramacion de las celulas somaticas de mamffero a un estado pluripotente si las colonias de celulas que presentan una o mas de las caractensticas de las colonias de celulas ES estan presentes en una cantidad diferente a la que se habna esperado si el medio no hubiera contenido el agente candidato.
Tambien se divulga un metodo para la reprogramacion de una celula somatica de mamffero que comprende el cultivo de la celula en presencia de una molecula de senalizacion extracelular de forma que la celula quede reprogramada. Dicha molecula de senalizacion extracelular puede ser una molecula cuya union a un dominio
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extracelular de un receptor celular inicia o modifica una ruta de transduccion de senales en el interior de la celula. La ruta de transduccion de senales puede ser la ruta de la Wnt.
Tambien se divulga un metodo para la identificacion de un modulador de la ruta de la Wnt util para la modulacion de la reprogramacion de las celulas somaticas de mamHfero a un estado pluripotente que comprende: (a) el cultivo de una poblacion de celulas somaticas de mairnfero en un medio que contiene el modulador de la ruta de la Wnt; (b) la determinacion, despues de un periodo de tiempo adecuado, de si las celulas que presentan una o mas de las caractensticas de las celulas ES estan presentes despues de mantener las celulas y su progenie en cultivo durante un periodo de tiempo adecuado, en el que el modulador de la ruta de la Wnt es identificado como util para la modulacion de la reprogramacion de las celulas somaticas de marnffero a un estado pluripotente si las celulas que presentan una o mas de las caractensticas de las celulas ES estan presentes en una cantidad diferente a la que se habfa esperado si el medio no hubiera contenido el modulador de la ruta de la Wnt.
El metodo puede comprender (i) el ensayo de al menos 10 moduladores de la ruta de la Wnt; y (ii) la identificacion de uno o mas de los moduladores de la ruta de la Wnt por tener un efecto significativamente mayor sobre la velocidad o la eficacia de reprogramacion con respecto a al menos el 50 % de los otros moduladores de la ruta de la Wnt ensayados. El metodo puede comprender el ensayo de al menos 20, al menos 50 o al menos 100 moduladores de la ruta de la Wnt. El metodo puede comprender la identificacion de uno o mas de los moduladores de la ruta de la Wnt por tener un efecto significativamente mayor sobre la velocidad o la eficacia de la reprogramacion con respecto a al menos el 75 % o al menos el 90 % de los otros moduladores de la ruta de la Wnt ensayados. Los moduladores de la ruta de la Wnt ensayados pueden ser moleculas pequenas y/o pueden estar relacionados estructuralmente. Por ejemplo, pueden ser miembros de un conjunto de compuestos, por ejemplo, una coleccion de compuestos de combinacion, sintetizados en base a una estructura de nucleo comun, o pueden ser derivados obtenidos mediante la modificacion de una estructura de nucleo o de un compuesto de partida, tal como mediante la realizacion de sustituciones o de adiciones en una o mas posiciones. El modulador de la ruta de la Wnt puede ser identificado como util para aumentar la velocidad o la eficacia de la reprogramacion de las celulas a un estado de tipo ES si, despues de un periodo de tiempo adecuado, las celulas que presentan una o mas de las caractensticas de las celulas ES estan presentes en una cantidad mayor de la que se habna esperado si el medio no hubiera contenido el modulador de la ruta de la Wnt. El modulador de la ruta de la Wnt puede ser identificado como util para aumentar la velocidad o la eficacia de la reprogramacion de las celulas a un estado pluripotente si, despues de un periodo de tiempo adecuado, las colonias de celulas que presentan una o mas de las caractensticas de las colonias de celulas ES estan presentes en una cantidad mayor de la que se habfa esperado si el medio no hubiera contenido el modulador de la ruta de la Wnt. Por ejemplo, los metodos pueden dar como resultado un aumento en el porcentaje de colonias que tienen las caractensticas de las colonias de celulas ES y/o las colonias pueden ser mas homogeneas de lo que sena el caso en ausencia del modulador de la ruta de la Wnt.
Tambien se divulga una composicion de cultivo celular que comprende: (a) un medio de cultivo celular que contiene un modulador de la ruta de la Wnt; y (b) una pluralidad de celulas somaticas de mamnfero, en la que (i) las celulas estan modificadas geneticamente o transfectadas temporalmente para que expresen uno o mas factores de reprogramacion; (ii) las celulas estan modificadas geneticamente para que contengan una secuencia de acidos nucleicos que codifica para un marcador seleccionable, unido operativamente a un promotor para un gen de pluripotencia endogeno, permitiendo asf la seleccion de las celulas que han sido reprogramadas a pluripotencia; o (iii) el medio de cultivo celular contiene una o mas moleculas pequenas, acidos nucleicos o polipeptidos que sustituyen a un factor de reprogramacion distinto al c-Myc.
El medio de cultivo celular puede comprender MC de la Wnt-3a. El medio puede contener una molecula pequena que modula la ruta de la Wnt.
El uno o mas factores de reprogramacion puede(n) seleccionarse entre: Oct4, Nanog, Sox2, Lin28 y Klf4. Tambien se divulga una composicion que comprende: una celula iPS y un agente que modula, por ejemplo, que activa, la ruta de la Wnt. El agente que activa la ruta de la Wnt puede ser una protema Wnt3a o una molecula pequena.
Tambien se divulga el uso de un agente que modula una ruta de la Wnt en la preparacion de un medicamento para la reprogramacion de una celula somatica de mamnfero.
Se contempla que todas las realizaciones descritas en el presente documento sean aplicables a los diversos aspectos de la invencion. Tambien se contempla que las diversas realizaciones de la invencion y los elementos de las mismas puedan combinarse con una o mas de otras de dichas realizaciones y/o elementos siempre que sea apropiado.
Breve descripcion de los dibujos
Figura 1. La Wnt3a promueve la reprogramacion epigenetica, a. Representacion esquematica de la lmea temporal experimental. Se infectaron MEF con lentivirus inducibles con DOX, se dividieron en cultivos con y sin un tratamiento con MC de la Wnt3 y despues se indujeron con DOX (dfa 0). La seleccion con G418 se inicio en unos puntos temporales fijos despues de la induccion, y el tratamiento con el MC de la Wnt3a se mantuvo
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durante 7 dfas de seleccion. La DOX y la G418 se mantuvieron hasta que se evaluaron las colonias resistentes, b. Recuentos de las colonias resistentes a la G418 a partir de los MEF que sobreexpresan Oct4/Sox2/KIf4/c-Myc en medio de celulas ES estandar o con un tratamiento con el MC de la Wnt3a. c. Imagenes de fase de las colonias resistentes a la G418 formadas con y sin un tratamiento con el MC de la Wnt3a. d. Recuentos de las colonias resistentes a la G418 a partir de los MEF infectados con una combinacion diferente de factores de reprogramacion en presencia y en ausencia del MC de la Wnt3a. Aparecieron colonias resistentes a la G418 sin una transduccion con c-Myc en presencia de MC de la Wnt3a. e. Imagen de fase de la colonia resistente a la G418 Myc[-] formada con un tratamiento con MC de la Wnt3a. En este experimento no se observaron colonias para las celulas Myc[-] en ausencia de MC de la Wnt3a. f. Recuentos de colonias resistentes a la G418 a partir de los MEF que sobreexpresan Oct4/Sox2/KIf4 (Myc[-]) u Oct4/Sox2/KIf4/c-Myc (Myc[+]) en presencia (barras rojas) y en ausencia (barras grises) de MC de la Wnt3a. La seleccion con G4l8 se inicio el dfa 5 o el dfa 10 posterior a la induccion, segun se indica, y las colonias (en un area de 32 cm2) fueron evaluadas el dfa 20. g. Graficas de dispersion que comparan la intensidad de la GFP a autofluorescencia, mediante el uso de una citometna de flujo, en celulas Oct4-GFP el dfa 20 posterior a la induccion de Oct4/Sox2/KIf4, revelan una poblacion de las celulas que expresa la GFP (indicada con una flecha) unicamente con un tratamiento con el MC de la Wnt3a. h. Imagen de fase de las celulas Myc[-] que expresan la GFP derivadas con un tratamiento con el MC de la Wnt3a y sin ninguna seleccion genetica.
Figura 2. Induccion de pluripotencia en celulas Wnt estimuladas, a-d. La inmunotincion revela la induccion de los marcadores de pluripotencia, Nanog (a-b) y SSEA-1 (c-d) en celulas Myc[-] tratadas con el MC de la Wnt3a, por ejemplo. Las lmeas Myc[-] tratadas con el MC de la Wnt3a formaron teratomas cuando se inyectaron por via subcutanea en ratones SCID. Los teratomas de las lmeas iPS Oct4/Sox2/KIf4/MC de la Wnt3a mostraban signos de celulas diferenciadas de las tres capas germinales similares a los teratomas formados a partir de las inyecciones de V6.5 mES. Las fechas indicaban el tejido neural en (e), cartflago en (f) y celulas endodermicas en (g), h. Las lmeas iPS Oct4/Sox2/KIf4/MC de la Wnt3a derivadas sin seleccion dieron lugar a ratones quimericos (segun se muestra a la izquierda) con un color de pelaje agouti y ojos pigmentados (a diferencia del raton natural Balb/c, a la derecha), proporcionando pruebas de la contribucion a las celulas somaticas. El color del pelaje de la descendencia confirmo que la lmea iPS Oct4/Sox2/KIf4/MC de la Wnt3a aqu generada es germinalmente competente (datos no mostrados).
Figura 3. La estimulacion con Wnt/p-catenina mejora la formacion de colonias iPS en ausencia de retrovirus c- Myc, a. Se muestran los recuentos de las colonias resistentes a la G418 en los MEF que sobreexpresan Oct4/Sox2/KIf4 cultivadas en medio de celulas ES, en medio condicionado de MEF, en medio condicionado que sobreexpresa la Wnt3a y en medio condicionado que sobreexpresa la Wnt3a con ICG001 (4 |jM). La seleccion se inicio el dfa 15 posterior a la induccion y las colonias fueron evaluadas el dfa 28. El tratamiento con el MC de la Wnt3a se mantuvo hasta el dfa 22. Se muestra el numero medio de recuentos a partir de los experimentos por triplicado, indicando las barras de error la D. T. b. Se muestran los recuentos de las colonias resistentes a la G418 (en un area de 32 cm2) en los MEF que sobreexpresan Oct4/Sox2/KIf4/c-Myc cultivadas en medio de celulas ES, en medio condicionado que sobreexpresa la Wnt3a y en medio condicionado que sobreexpresa la Wnt3a con ICG-001 (4 jM). La seleccion se inicio el dfa 10 posterior a la induccion, el Mc de la Wnt3a se mantuvo hasta el dfa 17 y las colonias fueron evaluadas el dfa 20. c. La estimulacion con Wnt promueve la formacion de celulas iPS en ausencia de una transduccion c-Myc. Esto podna ser debido a: i) una regulacion directa por parte de la ruta de la Wnt de los factores de pluripotencia endogenos clave, tales como Oct4, Sox2 y Nanog segun sugieren los estudios canonicos en celulas ES (Cole et al., 2008), ii) una activacion del Myc endogeno inducida por la ruta de la Wnt (He et al., 1998; Cole et al., 2008), o por otros genes de proliferacion celular, acelerando el proceso secuencial de formacion de colonias de iPS.
Figura 4. (a) Lmea temporal de los experimentos iniciales que muestran la capacidad del medio condicionado de Wnt3a para promover la generacion de celulas iPS. La expresion de los factores inductores de pluripotencia se indujo el dfa 2. La expresion de la GFP y la formacion de colonias fueron evaluadas segun se indica (b). La Wnt3a promueve la formacion de celulas iPS en celulas que sobreexpresan Oct4, Sox2, Klf4 y c-Myc; Fig. 4 C. La Wnt3a promueve la formacion de celulas iPS en celulas que sobreexpresan Oct4, Sox2, Klf4 sin ninguna modificacion en la expresion de c-Myc; (c) la Wnt3a promueve la formacion de celulas iPS en celulas que sobreexpresan Oct4, Sox2, Klf4 sin ninguna modificacion en la expresion de c-Myc.
Figura 5. Estructura del ICG-001.
Descripcion detallada de la invencion
Introduccion y definiciones
La presente invencion se refiere a composiciones y a metodos para la reprogramacion de celulas somaticas de mairnfero a pluripotencia in vitro. Tambien se divulgan metodos para la reprogramacion de celulas somaticas de mairnfero a un estado menos diferenciado. Las celulas resultantes se denominan en el presente documento "celulas somaticas reprogramadas" ("RSC") en el presente documento, o celulas madre pluripotentes inducidas (iPS) si se han reprogramado a un estado pluripotente. El termino "celula somatica" se refiere a cualquier celula distinta a una celula germinativa, una celula presente en, u obtenida a partir de, un embrion antes de la implantacion, o una celula resultante de una proliferacion de dicha celula in vitro. En algunas realizaciones la celula somatica es una "celula somatica no embrionaria", por lo que se entiende una celula somatica que no esta presente en, ni se obtiene a partir de, un embrion, y que no es el resultado de una proliferacion de dicha celula in vitro. En algunas realizaciones la
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celula somatica es una "celula somatica adulta", por lo que se entiende una celula que esta presente en, o se obtiene a partir de, un organismo distinto a un embrion o un feto, o es el resultado de la proliferacion de dicha celula in vitro. Salvo que se indique de otro modo, los metodos para la reprogramacion de las celulas a un estado menos diferenciado se llevan a cabo in vitro, es decir, se realizan mediante el uso de celulas somaticas aisladas mantenidas en cultivo.
La invencion engloba el reconocimiento de que las moleculas de senalizacion naturales que modulan la expresion de los factores de transcripcion endogenos de las celulas ES son unos candidatos prometedores como agentes solubles que mejoran la reprogramacion. La invencion tambien incluye el reconocimiento de que la modulacion de las rutas biologicas con las que dichas moleculas de senalizacion naturales interaction es de utilidad para mejorar (por ejemplo, para aumentar la velocidad y/o la eficacia de) la reprogramacion. La invencion tambien incluye el reconocimiento de que los agentes (tanto naturales como sinteticos, por ejemplo, moleculas pequenas) que modulan las rutas biologicas con las que dichas moleculas de senalizacion naturales interaction, son candidatos prometedores como agentes solubles que mejoran la reprogramacion.
Como se describe con mas detalle a continuacion, ciertas realizaciones de la invencion se basan al menos en parte en el reconocimiento de que la modulacion, por ejemplo, la activacion, de la ruta de la Wnt, es de utilidad en la reprogramacion de celulas somaticas. Algunos de los metodos comprenden un aumento de la actividad de la ruta de la Wnt en celulas somaticas de forma que al menos algunas de las celulas queden reprogramadas, por ejemplo, a un estado pluripotente. Algunos de los metodos comprenden el cultivo de celulas somaticas en un medio condicionado de Wnt de forma que al menos algunas de las celulas queden reprogramadas, por ejemplo, a un estado pluripotente.
La reprogramacion, segun se usa en el presente documento, se refiere a un proceso que altera o revierte el estado de diferenciacion de una celula somatica. La celula puede estar diferenciada parcial o terminalmente antes de la reprogramacion. La reprogramacion engloba una reversion completa del estado de diferenciacion de una celula somatica a un estado pluripotente. Como se sabe en la materia, una celula "pluripotente" tiene la capacidad de diferenciarse en, o dar lugar a, celulas derivadas de las tres capas germinales embrionarias (endodermo, mesodermo y ectodermo) y normalmente tiene el potencial de dividirse in vitro durante un largo periodo de tiempo, por ejemplo, mayor de un ano o mayor de 30 pases. Las celulas ES son un ejemplo de celulas pluripotentes. La reprogramacion tambien incluye una reversion parcial del estado de diferenciacion de una celula somatica a un estado multipotente. Una celula "multipotente" es una celula que es capaz de diferenciarse en algunas, pero no en todas, las celulas derivadas de las tres capas germinales. Por lo tanto, una celula multipotente es una celula parcialmente diferenciada. Las celulas madre adultas son celulas multipotentes. Las celulas madre adultas incluyen, por ejemplo, celulas madre hematopoyeticas y celulas madre neurales. La reprogramacion tambien incluye una reversion parcial del estado de diferenciacion de una celula somatica a un estado que hace que las celulas sean mas susceptibles a una reprogramacion completa a un estado pluripotente cuando se someten a manipulaciones adicionales tales como las descritas en el presente documento. Dicho contacto puede dar como resultado la expresion de unos genes en particular por parte de las celulas, expresion que contribuye a la reprogramacion. En el primer aspecto de la invencion, la reprogramacion de una celula somatica de mairnfero provoca que la celula somatica asuma un estado pluripotente, de tipo ES. Las celulas resultantes se denominan en el presente documento celulas somaticas pluripotentes reprogramadas o celulas madre pluripotentes inducidas (iPS).
La reprogramacion implica una alteracion, por ejemplo, una reversion, de al menos algunos de los patrones heredables de la modificacion de un acido nucleico (por ejemplo, una metilacion), condensacion de la cromatina, cambios epigeneticos, sellado genomico, etc., que se producen durante la diferenciacion celular segun se desarrolla el cigoto en un adulto. La reprogramacion es distinta a mantener simplemente el estado no diferenciado ya existente de una celula que ya es pluripotente o a mantener el estado ya existente menor de completamente diferenciado de una celula que ya es una celula multipotente (por ejemplo, una celula madre hematopoyetica). La reprogramacion tambien es distinta a promover la autorrenovacion o la proliferacion de las celulas que ya son pluripotentes o multipotentes, aunque las composiciones y los metodos de la invencion tambien pueden ser de utilidad para dichos fines. Algunas de las composiciones y los metodos divulgados en el presente documento contribuyen al establecimiento del estado pluripotente. Los metodos pueden llevarse a la practica sobre celulas que estan completamente diferenciadas y/o restringirse para dar lugar unicamente a celulas de un tipo en particular, en lugar de a celulas que ya son multipotentes o pluripotentes.
Las celulas somaticas se tratan de cualquiera de una diversidad de formas para provocar una reprogramacion segun los metodos divulgados en el presente documento. El tratamiento puede comprender poner en contacto las celulas con uno o mas agente(s) que contribuye(n) a la reprogramacion ("agente de reprogramacion"). Dicho contacto puede llevarse a cabo manteniendo la celula en un medio de cultivo que comprende el (los) agente(s). En algunas realizaciones las celulas somaticas estan modificadas geneticamente. La celula somatica puede estar modificada geneticamente para que exprese uno o mas agentes de reprogramacion segun se describe adicionalmente a continuacion.
En los metodos de la presente invencion las celulas somaticas pueden cultivarse, en general, en unas condiciones convencionales de temperatura, pH y otras condiciones ambientales, por ejemplo, en forma de celulas adherentes
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en placas de cultivo tisular a 37 °C en una atmosfera que contenga un 5-10 % de CO2. Las celulas y/o el medio de cultivo son modificados apropiadamente para conseguir la reprogramacion segun se describe en el presente documento. En ciertas realizaciones, las celulas somaticas se cultivan en o en presencia de un material que simula uno o mas caractensticas de la matriz extracelular o que comprende uno o mas componentes de la matriz extracelular o de la membrana basal. En algunas realizaciones se usa Matrigel™. Otros materiales incluyen protemas o mezclas de las mismas, tales como gelatina, colageno, fibronectina, etc. En ciertas realizaciones de la invencion las celulas somaticas se cultivan en presencia de una capa de alimentacion de las celulas. Dichas celulas pueden ser, por ejemplo, de origen murino o humano. Pueden ser irradiadas, inactivadas qmmicamente mediante un tratamiento con un inactivador qmmico tal como mitomicina c, o tratadas de otro modo para inhibir su proliferacion si se desea. En otras realizaciones las celulas somaticas se cultivan sin celulas de alimentacion.
La generacion de celulas pluripotentes o multipotentes mediante la reprogramacion de celulas somaticas usando los metodos de la presente invencion tiene diversas ventajas. En primer lugar, los metodos de la presente invencion nos permiten la generacion de celulas pluripotentes autologas, que son las celulas espedficas y geneticamente compatibles con un individuo. Las celulas derivan de celulas somaticas obtenidas a partir del individuo. En general, es menos probable que las celulas autologas se vean sometidas a un rechazo inmunologico que las celulas no autologas. En segundo lugar, los metodos de la presente invencion permiten al artesano la generacion de celulas pluripotentes sin el uso de embriones, ovocitos y/o de la tecnologfa de transferencia nuclear. Los resultados de los Solicitantes demuestran que (i) las celulas somaticas pueden ser reprogramadas a un estado de tipo ES sin la necesidad de modificar las celulas para que expresen un oncogen, tal como c-Myc; y (ii) la reprogramacion de celulas somaticas puede efectuarse al menos en parte mediante un medio distinto a la modificacion de las celulas para que expresen los factores de reprogramacion, es decir, poniendo en contacto las celulas con un agente de reprogramacion distinto a un acido nucleico o a un vector vmco capaz de ser captado y de provocar una modificacion genetica estable en las celulas. En particular, la invencion engloba el reconocimiento de que las moleculas de senalizacion extracelular, por ejemplo, las moleculas que cuando estan presentes se unen extracelularmente a los receptores de la superficie de la celula y activan cascadas de transduccion de senales intracelulares, son de utilidad para la reprogramacion de celulas somaticas. La invencion engloba adicionalmente el reconocimiento de que la activacion de dichas rutas de senalizacion mediante un medio distinto a la aplicacion de unas moleculas de senalizacion extracelular tambien es de utilidad en la reprogramacion de celulas somaticas. Ademas, los metodos de la presente invencion mejoraron la formacion de colonias de celulas de tipo ES que eran detectables basandose en criterios morfologicos, sin la necesidad de emplear un marcador seleccionable. La presente divulgacion refleja por tanto varias ventajas fundamentalmente importantes en el area de la tecnologfa de reprogramacion de celulas somaticas in vitro.
A continuacion se presentan las definiciones de algunos terminos utiles para la comprension de los aspectos de la invencion:
"Agente" segun se usa en el presente documento significa cualquier compuesto o sustancia tal como, pero no se
limitan a, una molecula pequena, un acido nucleico, un polipeptido, un peptido, un farmaco, un ion, etc.
Un "medio de cultivo celular" (denominado tambien en el presente documento "medio de cultivo" o "medio") es un medio para el cultivo de celulas que contiene nutrientes que mantienen la viabilidad celular y apoyan la proliferacion. El medio de cultivo celular puede contener cualquiera de los siguientes en una combinacion apropiada: sal(es), tampon(es), aminoacidos, glucosa u otro(s) azucar(es), antibioticos, suero o un sustituto del suero, y otros componentes tales como factores de crecimiento peptfdicos, etc. El medio de cultivo celular usado habitualmente para los tipos celulares en particular es conocido por los expertos en la materia. En el presente documento se proporcionan algunos ejemplos no limitantes.
"Lmea celular" se refiere a una poblacion de celulas ampliamente o sustancialmente identicas que tipicamente deriva de una unica celula ancestral o de una poblacion definida de celulas ancestrales identicas y/o sustancialmente identicas. La lmea celular puede haber sido o puede ser susceptible de ser mantenida en un cultivo durante un periodo prolongado (por ejemplo, meses, anos, durante un periodo de tiempo ilimitado). Puede haber experimentado un proceso de transformacion espontaneo o inducido que le confiere a las celulas una esperanza de vida en cultivo ilimitada. Las lmeas celulares incluyen todas aquellas lmeas reconocidas en la materia como tales. Se apreciara que las celulas adquieren mutaciones y posiblemente cambios epigeneticos con el tiempo, de forma que al menos algunas de las propiedades de las celulas individuales de una lmea celular pueden diferir entre sf.
El termino "exogena" se refiere a una sustancia presente en una celula o en un organismo distinto a su fuente natural. Por ejemplo, los terminos "acido nucleicos exogeno" o "protema exogena" se refieren a un acido nucleico o a una protema que han sido introducidos mediante un proceso que implica la intervencion humana en un sistema biologico, tal como una celula o un organismo, en el que normalmente no se encuentran o en el que se encuentran en unas cantidades menores. Una sustancia se considerara exogena si es introducida en una celula o en un ancestro de la celula que hereda la sustancia. Por el contrario, el termino "endogena" se refiere a una sustancia que es natural en el sistema biologico.
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"Expresion" se refiere a los procesos celulares implicados en la produccion de ARN y de protemas, y segun sea apropiado, en la secrecion de protemas, incluyendo, cuando sea aplicable, pero no se limita a, por ejemplo, la transcripcion, la traduccion, el plegamiento, la modificacion y el procesado. Los "productos de expresion" incluyen el ARN transcrito a partir de un gen y los polipeptidos obtenidos mediante la traduccion del ARNm transcrito a partir de un gen.
Una celula "modificada geneticamente" o "modificada" segun se usa en el presente documento se refiere a una celula en la que se ha introducido un acido nucleico exogeno mediante un proceso que implica la intervencion humana (o a un descendiente de dicha celula que ha heredado al menos una porcion del acido nucleico). El acido nucleico puede contener, por ejemplo, una secuencia que es exogena a la celula, puede contener secuencias naturales (es decir, secuencias que se encuentran de forma natural en las celulas) pero en una disposicion que no es natural (por ejemplo, una region codificante unida a un promotor de un gen diferente) o versiones alteradas de las secuencias naturales, etc. El proceso de transferir el acido nucleico a la celula puede llevarse a cabo mediante cualquier tecnica adecuada. Algunas tecnicas adecuadas incluyen una transfeccion mediada por fosfato de calcio o por lfpidos, una electroporacion y una transduccion o una infeccion mediante el uso de un vector vmico. En algunas realizaciones, el polinucleotido o una porcion del mismo se integran en el genoma de la celula. El acido nucleico puede haber sido posteriormente eliminado o escindido del genoma, siempre que dicha eliminacion o escision de como resultado una alteracion detectable en la celula con respecto a una celula no modificada pero por lo demas equivalente.
"Identidad" se refiere al grado en el que la secuencia de dos o mas acidos nucleicos o polipeptidos es la misma. El porcentaje de identidad entre una secuencia de interes y una segunda secuencia en una ventana de evaluacion, por ejemplo, a lo largo de la longitud de la secuencia de interes, puede ser calculado mediante la alineacion de las secuencias, determinando el numero de residuos (nucleotidos o aminoacidos) dentro de la ventana de evaluacion que son opuestos a un residuo identico que permite la introduccion de huecos para maximizar la identidad, dividiendo el numero total de residuos de la secuencia de interes o de la segunda secuencia (la que sea mayor) que esta en el interior de la ventana, y multiplicando por 100. Cuando se calcula numero de residuos identicos necesario para conseguir un porcentaje de identidad en particular, las fracciones se redondean al numero entero mas cercano. El porcentaje de identidad puede calcularse mediante el uso de diversos programas informaticos conocidos en la materia. Por ejemplo, los programas informaticos tales como BLAST2, bLaSTN, BLASTP, Gapped BLAST, etc., generan alineaciones y proporcionan un porcentaje de identidad entre las secuencias de interes. El algoritmo de Karlin y Altschul (Karlin y Altschul, Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU. 87: 22264-2268, 1990) modificado segun Karlin y Altschul, Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU.90: 5873-5877, 1993 se incorpora en los programas NBLAST y XBLAST de Altschul et al. (Altschul, et al., J. Mol. Biol. 215: 403-410, 1990). Para la obtencion de alineamientos con huecos con fines comparativos, se utiliza Gapped BLAST segun se describe en Altschul et al. (Altschul, et al. Nucleic Acids Res. 25: 3389-3402, 1997). Cuando se utilizan los programas BLAST y Gapped BLAST, pueden usarse los parametros por defecto de los respectivos programas. Puede usarse una matriz PAM25O o BLOSUM62. El programa informatico para la realizacion de los analisis BLAST esta disponible para el publico a traves del National Center for Biotechnology Information (NCBI). Vease la pagina web con la siguiente direccion URL
www.ncbi.nlm.nih.gov para estos programas. En una realizacion espedfica, el porcentaje de identidad se calcula mediante el uso de BLAST2 con los parametros por defecto proporcionados por el NCBI.
"Aislado" o "parcialmente purificado" segun se usa en el presente documento se refiere, en el caso de un acido nucleico o de un polipeptido, a un acido nucleico o a un polipeptido separado de al menos otro componente (por ejemplo, de un acido nucleico o de un polipeptido) que esta presente con el acido nucleico o con el polipeptido como se encuentra en su fuente natural y/o que estana presente en el acido nucleico o en el polipeptido cuando es expresado por una celula, o secretado en el caso de los polipeptidos secretados. Un acido nucleico o un polipeptido sintetizado qmmicamente o aquel que sea sintetizado mediante el uso de una transcripcion/traduccion in vitro se considera "aislado". Una "celula aislada" es una celula que ha sido extrafda de un organismo en el que se encontraba originalmente o de un descendiente de dicha celula. Opcionalmente, la celula se ha cultivado in vitro, por ejemplo, en presencia de otras celulas. Opcionalmente, la celula es introducida posteriormente en un segundo organismo o reintroducida en el organismo a partir del cual se aislo (o en la celula de la cual desciende).
El termino "gen cuya funcion esta asociada con pluripotencia", segun se usa en el presente documento, se refiere a un gen cuya expresion se produce en condiciones normales (por ejemplo, en ausencia de una modificacion genetica o de otra manipulacion disenada para alterar la expresion genica) y tipicamente esta restringida a las celulas madre pluripotentes, y es crucial para su identidad funcional como tales. Se apreciara que un polipeptido codificado por un gen asociado funcionalmente con pluripotencia puede estar presente como un factor maternal en el ovocito. El gen puede ser expresado por algunos algunas de las celulas del embrion, por ejemplo, a lo largo de al menos una porcion del periodo de preimplantacion y/o en los precursores de las celulas germinativas del adulto.
"Modular" se usa coherentemente con su uso en la materia, es decir, significa causar o facilitar un cambio, una alteracion o una modificacion cualitativa o cuantitativa en un proceso, una ruta o un fenomeno de interes. Sin limitacion, dicho cambio puede ser un aumento, una disminucion o un cambio en la fuerza relativa o en la actividad de los diferentes componentes o ramas del proceso, la ruta o el fenomeno. Un "modulador" es un agente que causa o facilita un cambio, una alteracion o una modificacion cualitativa o cuantitativa en un proceso, una ruta o un
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El termino "factor de pluripotencia" se usa para referirse al producto de la expresion de un gen cuya funcion esta asociada con pluripotencia, por ejemplo, un polipeptido codificado por el gen. Opcionalmente, el factor de pluripotencia es aquel que normalmente no es sustancialmente expresado en los tipos celulares somaticos que constituyen el cuerpo de un animal adulto (con la excepcion de las celulas germinativas o de los precursores de las mismas). Por ejemplo, el factor de pluripotencia puede ser aquel cuyo nivel medio en las celulas ES sea al menos 50 veces o 100 veces mayor que su nivel medio en aquellos tipos celulares diferenciados a termino presentes en el cuerpo de un mairnfero adulto. Opcionalmente, el factor de pluripotencia es aquel que es esencial para el mantenimiento de la viabilidad o del estado pluripotente de las celulas ES in vivo y/o de las celulas ES derivadas mediante el uso de metodos convencionales. Por lo tanto, si el gen que codifica para el factor es inactivado o inhibido (es decir, su expresion se elimina o se reduce sustancialmente), no se forman las celulas ES, mueren o se diferencian. Opcionalmente, la inhibicion de la expresion de un gen cuya funcion esta asociada con pluripotencia en una celula ES (que da como resultado, por ejemplo, una reduccion en el nivel de estado estacionario medio del transcrito del ARN y/o de la protema codificada por el gen en al menos el 50 %, el 60 %, el 70 %, el 80 %, el 90 %, el 95 % o mas) da como resultado una celula que es viable pero que ya no es pluripotente. Opcionalmente, el gen se caracteriza porque su expresion en una celula ES disminuye (dando como resultado, por ejemplo, una reduccion en el nivel de estado estacionario medio del transcrito del ARN y/o de la protema codificada por el gen en al menos el 50 %, el 60 %, el 70 %, el 80 %, el 90 %, el 95 % o mas) cuando la celula se diferencia en una celula diferenciada a termino.
Un "gen inductor de pluripotencia", segun se usa en el presente documento, se refiere a un gen cuya expresion contribuye a la reprogramacion de las celulas somaticas hacia un estado pluripotente. "Factor inductor de pluripotencia" se refiere a un producto de la expresion de un gen inductor de pluripotencia. Un factor inductor de pluripotencia puede ser, pero no necesariamente, un factor de pluripotencia. La expresion de un factor inductor de pluripotencia introducido exogenamente puede ser temporal, es decir, puede ser necesaria durante al menos una porcion del proceso de reprogramacion con objeto de inducir pluripotencia y/o de establecer un estado pluripotente estable, pero despues ya no es necesario para el mantenimiento de la pluripotencia. Por ejemplo, el factor puede inducir la expresion de genes endogenos cuya funcion esta asociada con pluripotencia. Estos genes pueden mantener despues las celulas reprogramadas en un estado pluripotente.
"Polinucleotido" se usa en el presente documento de forma intercambiable con "acido nucleico" para indicar un polfmero de nucleosidos. Tfpicamente, un polinucleotido de esta invencion esta formado por nucleosidos que se encuentran de forma natural en el ADN o en el ARN (por ejemplo, adenosina, timidina, guanosina, citadina, uridina, desoxiadenosina, desoxitimidina, desoxiguanosina y desoxicitidina) unidos por enlaces fosfodiester. Sin embargo, el termino engloba moleculas que comprenden nucleosidos o analogos de nucleosidos que contienen bases modificadas qmmicamente o biologicamente, esqueletos modificados, etc., acidos nucleicos tanto si se encuentran en la naturaleza como si no, y dichas moleculas pueden ser preferidas para ciertas aplicaciones. Cuando esta solicitud se refiere a un polinucleotido se entiende que se proporcionan tanto ADN como ARN, y en cada caso tanto en la forma monocatenaria como bicatenaria (y los complementos de cada molecula monocatenaria). "Secuencia de polinucleotidos" segun se usa en el presente documento puede referirse al propio material del polinucleotido y/o a la informacion de la secuencia (es decir, la sucesion de letras usadas como abreviaturas de las bases) que caracterizan bioqmmicamente a un acido nucleico espedfico. Una secuencia de polinucleotidos presentada en el presente documento se presenta en la direccion 5' a 3' salvo que se indique de otro modo.
"Polipeptido" se refiere a un polfmero de aminoacidos. Los terminos "protema" y "polipeptido" se usan de forma intercambiable en el presente documento. Un peptido es un polipeptido relativamente corto, tfpicamente de entre aproximadamente 2 y 60 aminoacidos de longitud. Los polipeptidos usados en el presente documento contienen tfpicamente aminoacidos tales como los 20 L-aminoacidos que se encuentran mas habitualmente en las protemas. Sin embargo, pueden usarse otros aminoacidos y/o analogos de aminoacidos conocidos en la materia. Uno o mas de los aminoacidos de un polipeptido pueden modificarse, por ejemplo, mediante la adicion de una entidad qrnmica tal como un grupo carbohidrato, un grupo fosfato, un grupo acido graso, un conector para conjugacion, funcionalizacion, etc. Un polipeptido que tiene una fraccion no polipeptfdica asociada covalentemente o no covalentemente con el mismo todavfa se considera un "polipeptido". Algunos ejemplos de modificaciones incluyen una glicosilacion y una palmitoilacion. Los polipeptidos pueden ser purificados a partir de fuentes naturales, producidos mediante el uso de la tecnologfa del aDn recombinante, sintetizados mediante medios qmmicos tales como una smtesis peptfdica en fase solida convencional, etc. El termino "secuencia de polipeptidos" o "secuencia de aminoacidos" segun se usa en el presente documento puede referirse al propio material del polipeptido y/o a la informacion de la secuencia (es decir, la sucesion de letras o de codigos de tres letras usadas como abreviaturas de los nombres de los aminoacidos) que caracterizan bioqmmicamente a un polipeptido. Una secuencia de polipeptidos presentada en el presente documento se presenta en una direccion desde el N-terminal hacia el C-terminal salvo que se indique de otro modo.
"Variante de un polipeptido" se refiere a cualquier polipeptido que difiere de un polipeptido natural mediante insercion(es), delecion(es) y/o sustitucion(es) de aminoacidos. Las variantes pueden ser naturales o crearse mediante el uso de, por ejemplo, tecnicas de ADN recombinante o una smtesis qrnmica. Opcionalmente, las
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"sustituciones" de aminoacidos son el resultado de la sustitucion de un aminoacido por otro aminoacido que tiene unas propiedades estructurales y/o qmmicas similares, es decir, sustituciones conservativas de aminoacidos. Las sustituciones "conservativas" de aminoacidos pueden realizarse sobre la base de la similitud de cualquiera de las diversas propiedades tales como el tamano de la cadena lateral, la polaridad, la carga, la solubilidad, la hidrofobicidad, la hidrofilia y/o anfipaticidad de los residuos implicados. Por ejemplo, los aminoacidos no polares (hidrofobos) incluyen alanina, leucina, isoleucina, valina, glicina, prolina, fenilalanina, triptofano y metionina. Los aminoacidos polares neutros (hidrofilos) incluyen serina, treonina, cistema, tirosina, asparragina y glutamina. Los aminoacidos cargados positivamente (basicos) incluyen arginina, lisina e histidina. Los aminoacidos cargados negativamente (acidos) incluyen acido aspartico y acido glutamico. Las inserciones o las deleciones pueden variar en tamano desde aproximadamente 1 hasta 20 aminoacidos, por ejemplo, desde 1 hasta 10 aminoacidos. En algunos casos pueden eliminarse dominios mayores sin afectar sustancialmente a la funcion. Opcionalmente, la secuencia de una variante puede obtenerse mediante la realizacion de mas de un total de 5, 10, l5 o 20 adiciones, deleciones o sustituciones de aminoacidos en la secuencia de una enzima natural. Opcionalmente, no mas del 1 %, del 5 %, del 10 % o del 20 % de los aminoacidos de un polipeptido son inserciones, deleciones o sustituciones con respecto al polipeptido original. Puede obtenerse una grna sobre la determinacion de que residuos de aminoacidos pueden ser sustituidos, anadidos o delecionados sin eliminar o reducir sustancialmente las actividades de interes mediante la comparacion de la secuencia del polipeptido en particular con la de polipeptidos homologos (por ejemplo, de otros organismos) y minimizando el numero de cambios en la secuencia de aminoacidos realizados en las regiones de alta homologfa (regiones conservadas) o mediante la sustitucion de los aminoacidos por los que se encuentran en las secuencias homologas, ya que es mas probable que los residuos de aminoacidos que estan conservados entre diversas especies sean importantes para la actividad que los aminoacidos que no estan conservados.
"Purificado" o "sustancialmente purificado" segun se usa en el presente documento indica que el acido nucleico o el polipeptido indicado esta presente en una ausencia sustancial de otras macromoleculas biologicas, por ejemplo, polinucleotidos, protemas, y similares. En una realizacion, el polinucleotido o el polipeptido esta purificado, de forma que constituye al menos el 90 % en peso, por ejemplo, al menos el 95 % en peso, por ejemplo, al menos el 99 % en peso, del (los) polinucleotido(s) o del (los) polipeptido(s) presente(s) (pero puede haber presente agua, tampones, iones y otras moleculas pequenas, especialmente moleculas con un peso molecular menor de 1.000 daltons).
"ARN interferente" se usa en el presente documento coherentemente con su significado en la materia para referirse a un fenomeno mediante el cual el ARN bicatenario (ARNbc) desencadena la degradacion espedfica de la secuencia o la represion de la traduccion de un correspondiente ARNm que presenta complementariedad con una hebra del ARNbc. Se apreciara que no es necesario que la complementariedad entre la hebra del ARNbc y el ARNm sea del 100 %, solo necesita ser lo suficiente como para mediar en la inhibicion de la expresion genica (denominada tambien "silenciamiento" o "inactivacion"). Por ejemplo, el grado de complementariedad es tal que la hebra puede (i) guiar la escision del ARNm en el complejo de silenciamiento inducido por ARN (RISC); o (ii) usar una represion de la traduccion del ARNm. En ciertas realizaciones, la porcion bicatenaria del ARN es menor de aproximadamente 30 nucleotidos de longitud, por ejemplo, de entre 17 y 29 nucleotidos de longitud. En las celulas de mairnfero, el ARNi puede conseguirse mediante la introduccion de un acido nucleico bicatenario apropiado en las celulas o mediante la expresion de un acido nucleico en las celulas que a continuacion es procesado intracelularmente para producir en la misma el ARNbc. Los acidos nucleicos capaces de mediar el ARNi se denominan en el presente documento "agentes de ARNi". Algunos ejemplos de acidos nucleicos capaces de mediar el ARNi son un ARN de horquilla corta (ARNhc), un ARN interferente corto (ARNic) y un precursor de un microARN. Todos estos terminos son bien conocidos y se usan en el presente documento coherentemente con su significado en la materia. Los ARNic comprenden tfpicamente dos hebras de acidos nucleicos individuales que hibridan entre sf para formar un duplex. Pueden ser sintetizados in vitro, por ejemplo, mediante el uso de las tecnicas sinteticas habituales de acidos nucleicos. Pueden comprender una amplia variedad de nucleosidos modificados, de analogos de nucleosidos, y pueden comprender bases modificadas qmmica o biologicamente, esqueletos modificados, etc. Puede usarse cualquier modificacion reconocida la materia como util para el ARNi. Algunas modificaciones dan como resultado un aumento en la estabilidad, en la captacion celular, en la potencia, etc. En ciertas realizaciones, el ARNic comprende un duplex de aproximadamente 19 nucleotidos de longitud y uno o dos salientes en 3' de 1-5 nucleotidos de longitud, que pueden estar formados por desoxirribonucleotidos. El ARNhc comprende una unica hebra de acidos nucleicos que contiene dos porciones complementarias separadas por una region predominantemente no
autocomplementaria. Las porciones complementarias hibridan para formar una estructura en duplex y la region no autocomplementaria forma un bucle que conecta el extremo 3' de una hebra del duplex y el extremo 5' de la otra hebra. Los ARNhc experimentan un procesado intracelular para generar los ARNic.
Los microARN (miARN) son pequenos ARN monocatenarios no codificantes de aproximadamente 21-25 nucleotidos (en los sistemas de marnfferos) que inhiben la expresion genica de una forma espedfica de la secuencia. Se generan intracelularmente a partir de precursores que tienen una estructura secundaria caractenstica formada por una horquilla corta (de aproximadamente 70 nucleotidos de longitud) que contiene un duplex que a menudo incluye una o mas regiones de una complementariedad imperfecta. Los miARN naturales son solo parcialmente complementarios con su ARNm objetivo, y tfpicamente actuan a traves de una represion de la traduccion. Los agentes de ARNi modelados sobre precursores de microARN endogenos son de utilidad en la invencion. Opcionalmente puede insertarse una secuencia que codifica para la porcion del tallo de una estructura de tallo-bucle
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o que codifica para un tallo-bucle completo, en un acido nucleico que comprende al menos una porcion de un transcrito primario de un microARN endogeno, por ejemplo, en lugar de la secuencia que codifica para el microARN endogeno o un microARN mmimo (~ 70 nucleotidos) en horquilla.
"Factor de reprogramacion" se refiere a un gen, a un ARN o a una protema que promueve o contribuye a la programacion celular, por ejemplo, in vitro. Opcionalmente, el (los) factor(es) de reprogramacion es (son) de interes para la reprogramacion de celulas somaticas a pluripotencia in vitro. Algunos ejemplos de factores de reprogramacion de interes para la reprogramacion de celulas somaticas a pluripotencia in vitro son Oct4, Nanog, Sox2, Lin28, Klf4, c-Myc, y cualquier gen/protema que pueda sustituir a uno o mas de estos en un metodo de reprogramacion de celulas somaticas in vitro. "Reprogramacion a un estado pluripotente in vitro" o "reprogramacion a pluripotencia in vitro", se usa en el presente documento para referirse a los metodos de reprogramacion in vitro que no requieren, y que tfpicamente no incluyen, una transferencia nuclear o citoplasmatica o una fusion celular, por ejemplo, con ovocitos, embriones, celulas germinativas o celulas pluripotentes. Cualquier realizacion o reivindicacion de la invencion puede excluir espedficamente las composiciones o los metodos relacionados con, o que implican, una transferencia nuclear o citoplasmatica o una fusion celular, por ejemplo, con ovocitos, embriones, celulas germinativas o celulas pluripotentes.
"Marcador seleccionable" se refiere a un gen, a un ARN o a una protema que cuando son expresados, confieren a las celulas un fenotipo seleccionable, tal como una resistencia a un agente citotoxico o citostatico (por ejemplo, una resistencia a un antibiotico), una prototroffa nutricional o la expresion de una protema en particular, que puede usarse como base para distinguir las celulas que expresan la protema de las celulas que no lo hacen. Las protemas cuya expresion puede detectarse facilmente, tales como una protema fluorescente o luminiscente o una enzima que actua sobre un sustrato para producir una sustancia coloreada, fluorescente o luminiscente ("marcadores detectables") constituyen un subconjunto de marcadores seleccionables. La presencia de un marcador seleccionable relacionado con la expresion de los elementos de control naturales de un gen que normalmente se expresa selectivamente o exclusivamente en las celulas pluripotentes hace posible la identificacion y la seleccion de las celulas somaticas que han sido reprogramadas a un estado pluripotente. Pueden usarse diversos genes marcadores seleccionables, tales como el gen de resistencia a la neomicina (neo), el gen de resistencia a la puromicina (puro), la transferasa de fosforribosil guanina (gpt), la reductasa de dihidrofolato (DHFR), la desaminasa de adenosina (ada), la puromicin-N-acetiltransferasa (PAC), el gen de resistencia a la higromicina (hyg), un gen de resistencia multifarmacologica (mdr), la cinasa de timidina (TK), la transferasa de fosforribosil hipoxantina-guanina (HPRT) y el gen de hisD. Algunos marcadores detectables incluyen la protema fluorescente verde (GFP), las protemas fluorescentes azul, zafiro, amarillo, rojo, naranja y cian y las variantes de cualquiera de estas. Las protemas luminiscentes tales como la luciferasa (por ejemplo, luciferasa de luciernaga o de Renilla) tambien son de utilidad. Como sera evidente para el experto en la materia, el termino "marcador seleccionable" segun se usa en el presente documento puede referirse a un gen o al producto de la expresion del gen, por ejemplo, a una protema codificada.
El marcador seleccionable puede conferir una ventaja de proliferacion y/o de supervivencia a las celulas que lo expresan con respecto a las celulas que no lo expresan o que le expresan a unos niveles significativamente inferiores. Dicha ventaja de proliferacion y/o de supervivencia se produce tfpicamente cuando las celulas se mantienen en ciertas condiciones, es decir, en unas "condiciones selectivas". Para asegurar una seleccion eficaz, puede mantenerse una poblacion de celulas en unas condiciones y durante un periodo de tiempo suficiente para que las celulas que no expresan el marcador no proliferen ni/o no sobrevivan y sean eliminadas de la poblacion, o su cantidad se reduzca a solo una fraccion muy pequena de la poblacion. El proceso de seleccion de las celulas que expresan un marcador que confiere una ventaja de proliferacion y/o de supervivencia mediante el mantenimiento de una poblacion de celulas en unas condiciones selectivas de forma que se eliminen ampliamente o completamente las celulas que no expresan el marcador se denomina en el presente documento "seleccion positiva", y se dice que el marcador es "util para una seleccion positiva". La seleccion negativa y los marcadores utiles para la seleccion negativa tambien son de interes en algunos de los metodos descritos en el presente documento. La expresion de dichos marcadores confiere una desventaja de proliferacion y/o de supervivencia a las celulas que expresan el marcador con respecto a las celulas que no expresan el marcador o que lo expresan a unos niveles significativamente inferiores (o, considerado de otra forma, las celulas que no expresan el marcador tienen una ventaja de proliferacion y/o de supervivencia con respecto a las celulas que expresan el marcador). Las celulas que expresan el marcador pueden ser, por lo tanto, ampliamente o completamente eliminadas de una poblacion de celulas cuando se mantienen en unas condiciones selectivas durante un periodo de tiempo suficiente.
Los terminos "tratar", "tratamiento", etc., aplicados a una celula aislada, incluyen someter la celula a cualquier tipo de proceso o condicion, o llevar a cabo cualquier tipo de manipulacion o procedimiento sobre la celula. Aplicados a un sujeto, los terminos se refieren a proporcionar atencion, cuidado o gestion medica o quirurgica a un individuo. El individuo esta habitualmente enfermo o lesionado, o presenta un aumento en el riesgo de caer enfermo con respecto al miembro medio de la poblacion y tiene necesidad de dicha atencion, cuidado o gestion.
El termino "Wnt" o "protema Wnt" segun se usa en el presente documento se refiere a un polipeptido que tiene la secuencia de aminoacidos natural de una protema Wnt o de un fragmento, una variante o un derivado de la misma que conserva al menos en parte la capacidad de la protema natural de unirse al (los) receptor(es) de la Wnt y activar la senalizacion Wnt. Ademas de las variantes alelicas naturales de las secuencias de la Wnt que pueden existir en la
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poblacion, se apreciara que, como es el caso de practicamente todas las protemas, pueden introducirse diversos cambios en las secuencias recogidas con los numeros de registro en la Tabla 1 (denominadas secuencias "naturales") sin alterar sustancialmente la actividad funcional (biologica) de los polipeptidos. Dichas variantes estan incluidas en el ambito de los terminos "Wnt", "protema Wnt", etc.
La variante podna ser, por ejemplo, un polipeptido con una identidad de al menos el 80 %, el 85 %, el 90 %, el 95 %, el 98 % o el 99 % con la Wnt completa. La variante podna ser un fragmento de una Wnt completa. La variante podna ser una variante de corte y empalme natural. La variante podna ser un polipeptido con una identidad de al menos el 80 %, el 85 %, el 90 %, el 95 %, el 98 % o el 99 % con un fragmento de la Wnt, en la que el fragmento es al menos un 50 %, un 60 %, un 70 %, un 80 %, un 85 %, un 90 %, un 95 %, un 98 % o un 99 % tan largo como el polipeptido natural completo o un dominio del mismo que presenta una actividad de interes, tal como la capacidad de unirse a un receptor de la Wnt. En algunas realizaciones el dominio tiene al menos 100, 200, 300 o 400 aminoacidos de longitud, comenzando en cualquier posicion de aminoacido de la secuencia y extendiendose hacia el C-terminal. Preferentemente se evitan las variaciones conocidas en la materia para eliminar o reducir sustancialmente la actividad de la protema Wnt. En algunas realizaciones, la variante carece de una porcion N y/o C-terminal del polipeptido completo, por ejemplo, faltan hasta 10, 20 o 50 aminoacidos de cualquier extremo. En algunas realizaciones el polipeptido tiene la secuencia de un polipeptido Wnt maduro, por el cual se entiende un polipeptido Wnt en el que se han eliminado una o mas porciones tales como un peptido de senalizacion durante el procesado proteolftico intracelular natural normal (por ejemplo, durante un procesado co-traduccional o post-traduccional). En algunas realizaciones en las que la protema Wnt se produce de una forma distinta a la purificacion a partir de las celulas que la expresan de forma natural, la protema es un polipeptido quimerico, por lo cual se entiende que contiene porciones procedentes de dos o mas especies diferentes. En algunas realizaciones en las que la protema Wnt se produce una forma distinta a la purificacion a partir de las celulas que la expresan de forma natural, la protema es un derivado de la Wnt, por lo que se entiende que la protema comprende secuencias adicionales no relacionadas con la Wnt siempre que esas secuencias no reduzcan sustancialmente la actividad biologica de la protema.
El experto en la materia sera consciente, o sera capaz de averiguar facilmente, si una variante, un fragmento o un derivado en particular de la Wnt es funcional mediante el uso de ensayos conocidos en la materia. Por ejemplo, la capacidad de una variante de un polipeptido Wnt de unirse a un receptor de la Wnt puede evaluarse mediante el uso de los ensayos de union de protemas habituales. Algunos ensayos convenientes incluyen la medicion de la capacidad para activar la transcripcion de un constructo indicador que contiene un sitio de union TCF unido operativamente a una secuencia de acidos nucleicos que codifica para un marcador detectable tal como luciferasa. Un ensayo implica la determinacion de si la variante de la Wnt induce la fosforilacion de la p-catenina. El estado de fosforilacion puede determinarse mediante el uso de cualquier metodo adecuado, por ejemplo, inmunotransferencia. Otros ensayos implican el ensayo de la variante del fragmento para comprobar actividades biologicas conocidas de la Wnt. Vease, por ejemplo, Barker, N. y Clevers, FI., Nat Rev Drug Discov. 5 (12): 997-1014, 2006, que describen los ensayos adecuados para la identificacion de agentes que modulan la actividad de la ruta de la Wnt. Dichos ensayos pueden adaptarse facilmente para identificar o confirmar la actividad de los agentes que activan la actividad de la ruta de la Wnt. En ciertas realizaciones de la invencion una variante o un fragmento funcional tiene una actividad de al menos un 50 %, un 60 %, un 70 %, un 80 %, un 90 %, un 95 % o mas de la actividad del polipeptido natural completo.
"Actividad de la ruta de la Wnt" o "senalizacion Wnt" se refiere a la serie de acontecimientos bioqmmicos que resultan despues de la union de un ligando estimulador (por ejemplo, de una protema Wnt) a un receptor para un miembro de la familia Wnt, dando lugar finalmente a cambios en la transicion genica, y si es in vivo, dando lugar a menudo a un efecto biologico caractenstico en un organismo.
Reprogramacion de celulas somaticas mediante la activacion de la ruta de la Wnt
La presente invencion proporciona el reconocimiento de que la activacion de la ruta de la Wnt es de utilidad para la reprogramacion de celulas somaticas. La invencion proporciona el reconocimiento adicional de que la activacion de la ruta de la Wnt aumenta la eficacia de reprogramacion de celulas somaticas, por ejemplo, cuando dichas celulas estan sometidas a un tratamiento que dana como resultado la reprogramacion de al menos algunas de las celulas. "Aumento en la eficacia de la reprogramacion" significa causar un aumento en el porcentaje de celulas que experimentan una reprogramacion cuando se somete una poblacion de celulas a un tratamiento de reprogramacion, que normalmente da como resultado un mayor numero de colonias individuales de celulas reprogramadas despues de un periodo de tiempo dado. La activacion de la ruta de la Wnt segun la invencion puede aumentar el numero de celulas reprogramadas y/o el numero de colonias de celulas reprogramadas y/o el porcentaje de celulas que experimentan una reprogramacion. La invencion tambien proporciona el reconocimiento de que la activacion de la ruta de la Wnt permite la reprogramacion de celulas somaticas que no han sido modificadas geneticamente para aumentar su expresion de un oncogen tal como el c-Myc. La invencion proporciona por lo tanto formas para sustituir la expresion modificada del c-Myc en cualquier metodo de reprogramacion de celulas somaticas que de otro modo implicana la modificacion de las celulas para que expresen el c-Myc. La activacion de la ruta de la Wnt puede ser suficiente para permitir la reprogramacion en unas condiciones en las que de otro modo no se producina la reprogramacion.
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En el presente documento se divulgan los metodos para la generacion de celulas somaticas reprogramadas que comprenden una modulacion, por ejemplo, un aumento en la actividad de la ruta de la Wnt, y las composiciones de utilidad en los metodos. Tambien se divulga un metodo de reprogramacion de una celula somatica que comprende la modulacion, por ejemplo, el aumento de la actividad de la ruta de la Wnt en la celula. Adicionalmente se divulgan metodos mejorados para la reprogramacion de celulas somaticas, metodos que comprenden someter las celulas somaticas a un tratamiento que puede reprogramar al menos algunas de las celulas, en los que la mejora comprende un aumento en la actividad de la ruta de la Wnt en dichas celulas. El tratamiento puede ser cualquier tratamiento conocido en la materia por ser de utilidad en la reprogramacion de celulas somaticas o considerado como de potencial utilidad para este fin. La actividad de la ruta de la Wnt puede aumentarse mediante el uso de activadores de la ruta de la Wnt, tales como moleculas pequenas, protemas Wnt solubles o agentes que median en el ARN interferente y que por lo tanto inhiben los inhibidores endogenos de la ruta de la Wnt. Las celulas somaticas que van a ser reprogramadas pueden cultivarse en un medio condicionado de Wnt. Salvo que se indique de otro modo o sea evidente a partir del contexto, la "reprogramacion" puede referirse a la reprogramacion a un estado pluripotente.
Las Wnt son una familia de protemas secretas importantes para una amplia diversidad de procesos de desarrollo y fisiologicos (Mikels, AJ y Nusse, R., Oncogene, 25: 7461-7468, 2006). Las secuencias de las Wnt estan relacionadas entre sf y fuertemente conservadas en su estructura y funcion a traves de multiples especies. Por lo tanto, puede usarse una protema Wnt que muestre actividad en una especie, en otra especie para activar la ruta de la Wnt en dicha especie, y puede esperarse que muestre una actividad similar. Algunos miembros de la familia Wnt incluyen la Wnt1, la Wnt2, la Wnt2b (denominada tambien Wnt13), la Wnt3, la Wnt3a, la Wnt4, la Wnt5a, la Wnt5b, la Wnt6, la Wnt7a, la Wnt7b, la Wnt7c, la Wnt8, la Wnt8a, la Wnt8b, la Wnt8c, la Wnt10a, la Wnt10b, la Wnt11, la Wnt14, la Wnt15 o la Wnt16. Las secuencias de los genes y de las protemas Wnt son conocidas en la materia. El experto en la materia puede encontrar facilmente la ID del gen, los numeros de registro y la informacion de la secuencia para los miembros de la familia Wnt y para otros genes y protemas de interes del presente documento en bases de datos disponibles publicamente (vease la Tabla 1 para algunos ejemplos).
Tabla 1: protemas, efectores y reguladores de la ruta de la Wnt
Gen
ID del gen Numeros de registro (ARNm / protema)
Wnt3a (de raton)
22416 NM 009522/ NP 033548
Wnt3a (humano)
89780 NM 033131 / NP 149122
p-catenina (de raton)
12387 NM 007614/ NP 031640
p-catenina (humano)
1499 NM 001098209/ NP 001091679 NM 001098210/ NP 001091680 NM 001904/ NP 001895
GSK3a (de raton)
606496 NM 001031667/ NP 001026837
GSK3a (humano)
2931 NM 019884/ NP 063937
GSK3p (de raton)
56637 NM 019827/ NP 062801
GSK3p (humano)
605004 NM 002093/ NP 002084
Sox2 (de raton)
20674 NM 011443/ NP 035573
Sox2 (humano)
6657 NM 003106/ NP 003097
Klf4 (de raton)
16600 NM 010637/ NP 034767
Klf4 (humano)
9314 NM 004235/ NP 004226
Oct4 (de raton
18999 NM 013633/ NP 038661
Oct4 (humano)
5460 NM 203289/ NP 976034
Oct4 (humano)
5460 NM 002701 / NP 002692
Nanog (de raton)
71950 NM 028016.2/ NP 082292.1
Nanog (humano)
79923 NM 024865/ NP 079141
Lin28 (de raton)
83557 NM 145833/ NP 665832
Lin28 (humano)
79727 NM 024674/ NP 078950
La senalizacion Wnt es iniciada por la interaccion de las protemas Wnt con diversos receptores, incluyendo miembros de la familia Frizzled (Fz) de receptores transmembranarios y miembros de la familia de la protema relacionada con el receptor de las lipoprotemas de baja densidad (LRP) (por ejemplo, LRP5/LRP6). La senal de la Wnt extracelular estimula las cascadas intracelulares de transduccion de senales que incluyen la ruta canonica, que regula la expresion genica en el nucleo (revisado por Logan CY y Nusse, R. Annu. Rev. Cell Dev. Biol., 20: 781-810, 2004) y varias otras no canonicas (revisado por Kohn, AD y Moon, RT, Cell Calcium, 38: 439-446, 2005). En resumen, la senalizacion Wnt a traves de la ruta canonica da lugar a la estabilizacion y a la localizacion nuclear de la p-catenina, que se asimila a los miembros de la familia del factor potenciador de los linfocitos T / factor linfoide (TCF/LEF) de factores de transcripcion para formar complejos que generalmente activan la transcripcion. En ausencia de la senalizacion Wnt, la p-catenina es en cambio dirigida para su degradacion mediante la destruccion del complejo de la p-catenina, y los TCF/LEF forman complejos que generalmente reprimen la transcripcion. En ausencia de la senalizacion Wnt, cinasas tales como la cinasa de la sintasa de glicogeno 3 (GSK3) y la cinasa de la casema 1 (CK1) fosforilan la p-catenina, que como consecuencia es ubiquinada y dirigida para su destruccion por el proteosoma. La activacion de la ruta de la Wnt da por lo tanto como resultado una disminucion en la fosforilacion de
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la p-catenina, dando lugar asf a su estabilizacion. Se han identificado varias protemas endogenas como inhibidores de la senalizacion de Wnt, incluyendo Dickkopf (Dkk), la protema de la region de agregacion del punto de ruptura (Bcr), protemas que comprenden un dominio WlF (factor inhibidor de la Wnt) etc.
Los metodos de reprogramacion divulgados en el presente documento pueden comprender poner en contacto una celula con un agente que modula, por ejemplo, que aumenta, la actividad de una ruta de la Wnt. El aumento de la ruta de la Wnt puede inducir a la celula para que se haga pluripotente y presente las caractensticas que son caractensticas de las celulas ES. Los metodos son portanto de utilidad en la generacion de celulas pluripotentes de tipo ES (celulas iPS). Un tratamiento que provoque un aumento en la actividad de una ruta de la Wnt puede ser aquel que de como resultado un aumento en los niveles intracelulares de p-catenina, aquel que de como resultado un aumento en la translocacion nuclear de la p-catenina o aquel capaz de provocar cambios en la expresion genica caractenstica de las celulas expuestas a una fuente de protema Wnt biologicamente activa. La reprogramacion puede modularse mediante el uso de un inhibidor de la ruta de la Wnt.
Se ha conseguido un considerable avance hacia el objetivo de reprogramacion de celulas somaticas a un estado pluripotente in vitro cuando se demostro que podnan producirse lmeas celulares con algunas de las propiedades de las celulas ES mediante la introduccion de los genes que codifican para cuatro factores de transcripcion asociados con pluripotencia, es decir, Oct3/4, Sox2, c-Myc y Klf4, en fibroblastos cutaneos de raton a traves de una infeccion retrovmica, y seleccionando despues las celulas que expresaran un marcador de pluripotencia, Fbx15, en respuesta a estos factores (Takahashi, K. & Yamanaka, S. Cell 126, 663-676, 2006). Sin embargo, las celulas resultantes difenan de las celulas ES en su expresion genica y en sus patrones de metilacion del ADN, y cuando se inyectaban en blastocistos de raton normales, no daban como resultado quimeras vivas (animales portadores de celulas por todo su cuerpo tanto del blastocisto original como de las celulas introducidas). Un trabajo posterior mejoro estos resultados llevando a cabo una seleccion mas rigurosa, dando como resultado una derivacion de las lmeas celulares reprogramadas estables que, basandose en los perfiles de transcripcion notificados, de sellado genomico (expresion de los alelos predeterminada por el progenitor a partir del cual se originan) y de modificacion de la cromatina, que aparedan esencialmente identicas a las celulas ES (Okita, K., et al. 448, 313-317, 2007; Wernig, M. et al. Nature 448, 318-324, 2007; Maherali, N. et al. Cell Stem Cell 1, 55-70, 2007). Las celulas somaticas que han sido reprogramadas a un estado pluripotente in vitro mediante el uso de estos metodos o de otros metodos (por ejemplo, que implican la aplicacion de moleculas pequenas) se denominan en el presente documento, coherentemente con su uso en la materia, celulas "madre pluripotentes inducidas" (iPS). Posteriormente, se demostro que las celulas somaticas humanas tambien pueden ser reprogramadas a pluripotencia mediante el uso de estos factores. Adicionalmente, se demostro que la combinacion de Oct4, Nanog, Sox2 y Lin28 tambien era capaz de reprogramar las celulas somaticas a un estado pluripotente in vitro (Yu J, Science, 318 (5858): 1917-20, 2007). Sin embargo, la generacion de estas celulas tambien implicaba la modificacion de las celulas para que expresaran multiples factores de transcripcion y empleaba una transduccion retrovmica.
Ahora los Solicitantes han demostrado que se produda un aumento en el numero de colonias formadas por celulas de tipo ES cuando se cultivaban celulas somaticas modificadas geneticamente para que expresaran Oct4, Sox2, Klf4 y c-Myc con medio condicionado de Wnt3a con respecto a cuando las celulas se cultivaban en un medio condicionado por celulas de control o en un medio de cultivo celular estandar usado convencionalmente para la propagacion de celulas ES. Los Solicitantes han demostrado adicionalmente que se desarrollaban colonias formadas por celulas de tipo ES cuando se cultivaban las celulas somaticas modificadas para que expresaran Oct4, Sox2 y Klf4, pero no modificadas para que expresaran c-Myc en un medio condicionado de Wnt3a, mientras que no se forman celulas de las colonias de tipo ES en el periodo de tiempo de 20 dfas mostrado en la Figura 1 cuando dichas celulas se cultivaban en un medio no condicionado o en un medio condicionado por celulas de control. En ambos casos, las colonias mostraban unas caractensticas morfologicas caractensticas de las colonias de celulas ES, y la expresion de un marcador detectable indicativo de la expresion de Oct4. Segun todos los criterios ensayados, las celulas paredan ser celulas pluripotentes de tipo ES (celulas iPS). Adicionalmente, el cultivo de las celulas somaticas en medio condicionado de Wnt3a pareda seleccionar las celulas reprogramadas. Las colonias formadas en presencia de medio condicionado de Wnt3a aparedan mas homogeneas que las obtenidas en ausencia de medio condicionado de Wnt3a. Los metodos son por lo tanto de utilidad para facilitar la identificacion de las celulas reprogramadas, y opcionalmente para facilitar la separacion de dichas celulas de las celulas que no han sido reprogramadas, sin la necesidad de una seleccion qrnmica basada en un elemento genetico introducido tal como un gen cuyo producto de expresion confiere una resistencia farmacologica o fluorescencia. Los metodos son por lo tanto de utilidad para la generacion de celulas reprogramadas que no son portadoras de modificaciones geneticas con el fin de seleccionar o detectar las celulas reprogramadas. Adicionalmente, los metodos son de utilidad para aumentar el porcentaje medio de celulas reprogramadas en una colonia que comprende celulas reprogramadas con respecto al porcentaje medio de celulas que estanan reprogramadas en ausencia de un agente que aumenta la actividad de la ruta de la Wnt.
Los Solicitantes y otros han apreciado que pueden formarse algunas celulas de tipo iPS sin infectar las celulas con un virus c-Myc. Sin embargo, este es un acontecimiento de baja eficacia y podna dar como resultado, al menos en parte, una mutagenesis por insercion en la que un acontecimiento de integracion vmica activa directamente el c-Myc o el (los) gen(es) c-Myc objetivo. En los experimentos de los solicitantes, en unos puntos temporales muy tardms, se observaron algunas colonias en las placas que sobreexpresaban Klf4, Sox2 y Oct4 (sin la introduccion del virus c-
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Myc), incluso sin medio condicionado de Wnt. El medio condicionado de Wnt redujo significativamente el tiempo necesario y aumento la eficacia del proceso de reprogramacion. Un aspecto de la invencion es que la mayor rapidez de la reprogramacion conseguida mediante el uso de los metodos de la invencion facilitara el uso de medios de sobreexpresion temporales de factores de induccion de pluripotencia para la formacion de iPS (por ejemplo, una transfeccion temporal) y/o para la reprogramacion mediante el tratamiento de las celulas somaticas con agentes de reprogramacion, tales como protemas, moleculas pequenas, etc., en lugar de una infeccion vmca. Ademas, los Solicitantes proponen que el aumento de la eficacia en la formacion de las iPS mediante el uso de los metodos de la invencion podna ser de particular utilidad en la reprogramacion de celulas humanas, con o sin una sobreexpresion del Myc.
Sin limitacion, los metodos son por tanto de utilidad para aumentar la velocidad de reprogramacion de las celulas somaticas a celulas iPS. En el presente documento se divulga un metodo para aumentar la velocidad de reprogramacion de las celulas somaticas, que comprende cultivar una poblacion de celulas somaticas de mairnfero en un medio de cultivo celular condicionado de Wnt, de forma que al menos parte de las celulas sean inducidas a transformarse en celulas de tipo ES en un periodo de tiempo mas corto del que sena el caso en ausencia de un medio condicionado de Wnt. Tambien se divulga un metodo para aumentar la velocidad de reprogramacion de las celulas somaticas que comprende la activacion de la ruta de la Wnt en una poblacion cultivada de celulas somaticas, de forma que al menos algunas de las celulas sean inducidas a transformarse en celulas de tipo ES en un periodo de tiempo mas corto del que sena el caso si no se activara la ruta de la Wnt. La invencion tambien proporciona un metodo para aumentar la velocidad de reprogramacion de las celulas somaticas que comprende cultivar una poblacion de celulas somaticas de marnffero en presencia de un agente que aumente la actividad de la ruta de la Wnt, de forma que al menos algunas de las celulas sean inducidas a transformarse en celulas de tipo ES en un periodo de tiempo mas corto del que sena el caso en ausencia de dicho agente. El periodo de tiempo puede ser de 7, de 10, de 15 o de 20 dfas. Las celulas pueden ser tratadas (por ejemplo, modificadas geneticamente) para que expresen Sox2, Klf4, Oct4 y c-Myc a unos niveles mayores de lo que sena el caso en ausencia de dicho tratamiento. Las celulas pueden tratarse de forma que sobreexpresen Sox2, Klf4 y Oct4 a unos niveles mayores de lo que sena el caso en ausencia de dicho tratamiento, pero no son modificadas geneticamente para que sobreexpresen el c-Myc. Un metodo de tratamiento es la infeccion de las celulas con virus (por ejemplo, retrovirus, lentivirus) o la transfeccion de las celulas con vectores vmcos (por ejemplo, retrovmcos, lentivmcos) que contienen las secuencias de los factores unidas operativamente a unos elementos de control de la expresion adecuados para dirigir la expresion en las celulas despues de la infeccion o de la transfeccion y, opcionalmente, la integracion en el genoma, como se sabe en la materia.
Tambien se divulga un metodo para la reprogramacion de una celula somatica, que comprende el cultivo de la celula en un medio de cultivo celular condicionado de Wnt de forma que quede reprogramada. El cultivo de la celula en un medio de cultivo celular condicionado de Wnt puede inducir a la celula a transformarse en pluripotente y poseer las caractensticas que son caractensticas de las celulas ES. Los metodos son por lo tanto de utilidad para la generacion de celulas pluripotentes de tipo ES (celulas iPS). El medio de cultivo celular condicionado de Wnt puede comprender medio condicionado de Wnt3a.
El termino "medio condicionado" se refiere a un medio de cultivo celular que se ha usado previamente para el cultivo de celulas. Un medio condicionado se caracteriza porque contiene sustancias solubles, por ejemplo, moleculas de senalizacion, factores de crecimiento, hormonas, etc., que son producidas por las celulas durante su cultivo y liberadas en el medio. Segun se usa en el presente documento, "medio condicionado de Wnt" se refiere a un medio condicionado que se ha usado previamente para el cultivo de celulas que producen y secretan la Wnt. El medio puede describirse adicionalmente mediante referencia a una protema Wnt en particular producida por las celulas. Por ejemplo, "medio condicionado de Wnt3a" se refiere a un medio condicionado que se ha usado previamente para el cultivo de celulas que producen Wnt3a. Las celulas tambien pueden producir otras Wnt ademas de la Wnt en particular mencionada espedficamente. Cualquier realizacion de la invencion que emplee un medio condicionado de Wnt puede emplear un medio condicionado de Wnt3a salvo que se indique de otro modo.
Se apreciara que algunas Wnt tienen unas actividades biologicas similares a la de la Wnt3a y/o sus secuencias estan estrechamente relacionadas con la de la Wnt3a. En ciertas realizaciones de la invencion se usan los medios condicionados preparados mediante el uso de celulas que producen dichas Wnt.
Un medio condicionado puede prepararse mediante metodos conocidos en la materia. Dichos metodos comprenden normalmente el cultivo de una primera poblacion de celulas en un medio de cultivo celular, y recogiendo despues el medio (normalmente sin recoger las celulas). El medio recogido puede ser filtrado para eliminar los desechos celulares, etc. Despues puede usarse un medio condicionado (que contiene los componentes secretados en el medio por las celulas) para apoyar el crecimiento de una segunda poblacion de celulas. Las celulas se cultivan en el medio durante un tiempo suficiente para permitir una concentracion adecuada de factores liberados, tales como la Wnt (y/o el consumo de los componentes del medio) para producir un medio que apoye la reprogramacion de celulas somaticas. En algunas realizaciones, el medio se condiciona mediante un cultivo durante 24 h a 37 °C. Sin embargo, pueden usarse unos periodos de tiempo mas largos o mas cortos, tales como de entre 24 y 72 horas. Las celulas pueden usarse para condicionar multiples lotes de medio a lo largo de periodos de cultivo adicionales, siempre que las celulas conserven su capacidad de condicionar el medio de una forma adecuada para el fin previsto.
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El medio en el que se cultivan las celulas para producir un medio condicionado puede ser cualquier medio de cultivo celular convencional capaz de mantener la viabilidad de las celulas. En algunas realizaciones, el medio esta qmmicamente definido. En algunas realizaciones, el medio es similar o identico en su composicion al medio usado convencionalmente para el cultivo de celulas madre embrionarias de la misma especie que las celulas somaticas que se van a reprogramar mediante el uso del medio condicionado. El medio de base usado para el acondicionamiento puede tener cualquiera de varias composiciones diferentes, dependiendo en parte del tipo de celulas usadas. El medio debe ser capaz de apoyar el cultivo de la lmea celular usada para el acondicionamiento del medio. En algunas realizaciones, el medio tambien apoya el cultivo de las celulas somaticas antes de que sean reprogramadas, y opcionalmente, de las celulas somaticas que han sido reprogramadas. Sin embargo, el medio condicionado puede ser complementado con otros componentes, combinado con otro medio, etc., despues del acondicionamiento, de forma que sea adecuado para el cultivo de las celulas somaticas y de las celulas somaticas reprogramadas.
Un medio de base adecuado puede ser elaborado a partir de los siguientes componentes: medio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM), Invitrogen n° de cat. 11965-092; medio de Eagle modificado por Dulbecco inactivado (Ko DMEM), Invitrogen n° de cat. 10829-018; medio basal de Ham F12 / DMEM al 50 %; L-glutamina 200 mM, Invitrogen n° de cat. 15039-027; solucion de aminoacidos no esenciales, Invitrogen n° de cat. 11140-050; beta- mercaptoetanol; factor de crecimiento de fibroblastos basicos humanos recombinantes (bFGF). Un ejemplo de un medio de ES que contiene suero se elabora con un 80% de DMEM (normalmente KO DMEM), un 20% de suero bovino fetal (FBS) definido no termoinactivado, un 1 % de aminoacidos no esenciales, L-glutamina 1 mM y p- mercaptoetanol 0,1 mM. El medio se filtra y se almacena a 4 °C durante no mas de 2 semanas. Un medio de ES exento de suero puede prepararse con un 80 % de KO DMEM, un 20 % de sustituto de suero, un 1 % de aminoacidos no esenciales, L-glutamina 1 mM y p-mercaptoetanol 0,1 mM, y un sustituto de suero tal como Invitrogen n° de cat. 10828-028. El medio se filtra y se almacena a 4 °C. Antes de combinarlo con las celulas usadas para el acondicionamiento, puede anadirse el bFGF humano a una concentracion final de 4 ng/ml. Es de utilidad StemPro® hESC SFM (Invitrogen n° de cat. A1000701), un medio totalmente definido exento de suero y de alimento (SFM), formulado especialmente para el crecimiento y la expansion de celulas madre embrionarias humanas.
Las celulas usadas para la preparacion del medio condicionado pueden producir de forma natural la Wnt. En algunas realizaciones las celulas usadas para la preparacion del medio estan modificadas geneticamente para aumentar su expresion de la Wnt, por ejemplo, mediante una transfeccion con un ADNc que codifica para la Wnt, en la que la secuencia que codifica para la Wnt esta unida operativamente a secuencias de control de la expresion activas en las celulas. Vease, por ejemplo, Cai, L., et al., Cell Res. 17: 62-72, 2007. En algunas realizaciones, las celulas producen y secretan la Wnt en su medio, dando como resultado un medio que tiene una concentracion de entre 100 ng/ml y 1.000 ng/ml de la protema Wnt. En algunas realizaciones, las celulas producen y secretan la Wnt en su medio, dando como resultado un medio que tiene una concentracion de entre 200 ng/ml y 500 ng/ml de la protema Wnt. Tambien pueden usarse celulas que sobreexpresan la Wnt como celulas de alimento con el fin de reprogramar las celulas somaticas.
El medio condicionado puede combinarse con un medio no condicionado antes de su uso. Por brevedad, el medio resultante todavfa se denomina medio condicionado si comprende al menos un 5 % de medio condicionado en volumen. En algunas realizaciones la cantidad (en volumen) de medio condicionado es de al menos el 10%, por ejemplo, de al menos el 10 %, el 20 %, el 30 %, el 40 %, el 50 %, el 60 %, el 70 %, el 80 %, el 90 % o mas de medio condicionado. En algunas realizaciones, la cantidad de medio condicionado es de entre aproximadamente el 50 % y el 75 % en volumen. El medio no condicionado puede ser un medio de cultivo celular estandar. En algunas realizaciones, el medio no condicionado es un medio usado convencionalmente para la propagacion de celulas ES de la misma especie que las celulas somaticas que se van a reprogramar.
El medio condicionado puede usarse inmediatamente despues de ser recogido de las celulas usadas para su produccion, o puede ser almacenado (por ejemplo, a aproximadamente 4 °C o congelado) antes de su uso. El medio puede almacenarse en unas condiciones y durante un periodo de tiempo coherente para el mantenimiento de la capacidad del medio condicionado de apoyar la reprogramacion en los metodos de la invencion. Sin limitacion, dichas condiciones y tiempo pueden ser coherentes con el mantenimiento de al menos el 20 % de la actividad biologica original de la Wnt secretada presente en el medio, que puede ser evaluada mediante el uso de los metodos indicados anteriormente. El medio condicionado puede concentrarse o procesarse de otro modo, por ejemplo, mediante el uso de los metodos habituales, siempre que dicha concentracion o procesado sea coherente con el mantenimiento de la capacidad del concentrado de apoyar la reprogramacion cuando se anade a un medio no condicionado. Sin limitacion, dicha concentracion o procesado puede ser coherente con el mantenimiento de al menos el 20 % de la actividad biologica original de la Wnt secretada presente en el medio. Como se ha indicado en los Ejemplos, los resultados de los Solicitantes sugieren que los fibroblastos normales (no modificados para que sobreexpresen la Wnt) pueden secretar factores, incluyendo quizas la Wnt3a, que promuevan la reprogramacion, aumentando la posibilidad de que las celulas somaticas que experimentan una reprogramacion in vitro, por ejemplo, las celulas en cultivo que han sido tratadas con un retrovirus o modificadas de otro modo para que expresen Oct4, Sox2, Klf4, y opcionalmente c-Myc, puedan secretar dichos factores y contribuir por lo tanto a su propia reprogramacion. En ciertas realizaciones de la presente invencion, el medio condicionado de Wnt tiene una mayor concentracion de protema Wnt y/o de actividad de activacion de la ruta de la Wnt de lo que sena el caso cuando se
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cultivan celulas somaticas no modificadas, por ejemplo, fibroblastos, que experimentan una reprogramacion, en un medio conocido en la materia por ser util en el cultivo de celulas somaticas que experimentan una reprogramacion. Dicha capacidad de concentracion y/o de activacion de la ruta de la Wnt puede ser al menos 1,5, 2, 5, 10, 20 o mas veces mayor que la presente en un medio en el que se cultivan fibroblastos de control segun se describe en el Ejemplo 5.
Algunos de los metodos divulgados en el presente documento implican poner en contacto una celula somatica in vitro con uno o mas agentes definidos que modulan, por ejemplo, aumentan, la actividad de la ruta de la Wnt. Las celulas pueden mantenerse en un medio de cultivo celular estandar conocido en la materia. El (los) agente(s) puede(n) ser anadido(s) al medio antes del uso del mismo para el cultivo de las celulas, o durante el cultivo celular. El termino "agente definido" en este contexto significa que la estructura, la secuencia o la identidad del agente que modula, por ejemplo, que aumenta, la actividad de la ruta de la Wnt es conocida y/o el agente es sintetizado qmmicamente y/o el agente es (antes de su adicion al medio) aislado o al menos purificado parcialmente. Por ejemplo, el agente puede no ser un componente no caracterizado o no identificado del medio condicionado, un lisado o un extracto de celulas o de tejidos, un citoplasma de celulas o un material nuclear, etc.
Pueden usarse diversos agentes para aumentar la actividad de la ruta de la Wnt. Dichos agentes se denominan en el presente documento "activadores de la ruta de la Wnt" o "agonistas de la Wnt". El activador de la ruta de la Wnt puede actuar directamente mediante la interaccion con un receptor de la Wnt, o indirectamente mediante la interaccion con uno o mas componentes intracelulares de la ruta de senalizacion de la Wnt, tales como la p- catenina, una cinasa o una fosfatasa que actua sobre la p-catenina, un factor de transcripcion que se une a la p- catenina, etc. El activador puede aumentar la expresion de la Wnt o de un componente de la ruta de la Wnt tal como la p-catenina. El activador de la ruta de la Wnt puede aumentar la actividad de la ruta de la Wnt hasta unos niveles suficientes para mejorar la reprogramacion de celulas somaticas. El activador de la ruta de la Wnt puede inhibir la degradacion de la p-catenina, mejorando asf la reprogramacion de celulas somaticas. Puede ser de interes inhibir la ruta de la Wnt en celulas somaticas o en celulas somaticas reprogramadas. Por ejemplo, los inhibidores de la ruta de la Wnt pueden usarse para caracterizar o explorar el mecanismo mediante el cual se produce la reprogramacion y/o para identificar los agentes de reprogramacion (por ejemplo, los agentes que no actuan a traves de la ruta de la Wnt). Adicionalmente, los inhibidores de la ruta de la Wnt (por ejemplo, moleculas pequenas, ARNip, protemas, etc.) pueden ser de utilidad para facilitar la diferenciacion de celulas pluripotentes reprogramadas de un tipo celular deseado, por ejemplo, en protocolos de diferenciacion in vitro.
En ciertas realizaciones de la invencion, el activador o el inhibidor de la ruta de la Wnt es una protema o una molecula pequena que se une a un receptor de la Wnt. Por ejemplo, el activador de la ruta de la Wnt puede ser una protema Wnt soluble biologicamente activa.
En algunas realizaciones la concentracion de la protema Wnt anadida al medio es de entre 10 y 10.000 ng/ml, por ejemplo, de entre 100 y 5.000 ng/ml, por ejemplo, de entre 1.000 y 2.500 ng/ml o de entre 2.500 y 5.000 ng/ml, o de entre 5.000 y 10.000 ng/ml.
Como se ha mencionado anteriormente, algunas Wnt tienen unas actividades biologicas similares a las de la Wnt3a y/o su secuencia esta estrechamente relacionada con la de la Wnt3a. Dichas Wnt y/o los agentes que simulan la actividad de dichas Wnt son de utilidad en ciertas realizaciones de la invencion.
La protema Wnt puede aislarse a partir de fuentes naturales (por ejemplo, de celulas de mairnfero que producen de forma natural la protema), producirse en celulas eucariotas o procariotas mediante el uso de la tecnologfa de expresion recombinante, o sintetizarse qmmicamente. Las protemas Wnt solubles biologicamente activas pueden ser preparadas en una forma purificada mediante el uso de metodos conocidos en la materia. Vease, por ejemplo, la Pub. de Pat. de EE.UU. n° 20040248803 y Willert, K., et al., Nature, 423: 448-52, 2003. En ciertas realizaciones la protema soluble biologicamente activa Wnt es la Wnt3a. En ciertas realizaciones la protema Wnt es modificada junto con, o despues de, la traduccion, como sucede cuando la protema Wnt se produce en una celula hospedadora que expresa de forma natural la protema Wnt. En otras realizaciones la protema Wnt no es modificada junto con, o despues de, la traduccion, como en la naturaleza. En ciertas realizaciones la protema soluble biologicamente activa Wnt es modificada con una fraccion lipfdica tal como palmitato. La fraccion lipfdica puede unirse a una cistema conservada. Por ejemplo, en ciertas realizaciones la protema Wnt es palmitoilada en una cistema conservada, como se sabe en la materia. En ciertas realizaciones la protema Wnt es glicosilada, como sucede cuando la protema Wnt es producida en una celula hospedadora de mamffero que expresa de forma natural la protema Wnt. En otras realizaciones la protema Wnt no esta glicosilada como se encuentra en la naturaleza. La Wnt3a recombinante de raton esta disponible en el mercado (por ejemplo, en Millipore n° de cat. GF145 o en R& D Systems n° de cat. 1324- WN-002).
Una molecula pequena es un compuesto organico que tiene multiples enlaces carbono-carbono y un peso molecular de menos de 1.500 daltons. Normalmente dichos compuestos comprenden uno o mas grupos funcionales que median en las interacciones estructurales con las protemas, por ejemplo, puentes de hidrogeno, y normalmente incluyen al menos un grupo amino, carbonilo, hidroxilo o carboxilo, y pueden incluir al menos dos de los grupos qmmicos funcionales. Los agentes de molecula pequena pueden comprender estructuras de carbono dclicas o
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heterodclicas y/o estructuras aromaticas o poliaromaticas sustituidas con uno o mas grupos funcionales qmmicos y/o heteroatomos.
En ciertas realizaciones de la invencion el activador de la ruta de la Wnt es un agente que inhibe la cinasa sintasa de glicogeno 3 (GSK3) seleccionado entre el grupo indicado a continuacion. Estos agentes "activan" activamente la ruta de la Wnt sin la necesidad de una Wnt extracelular. La GSK3 es una cinasa de serina/treonina, identificada originalmente como un regulador del metabolismo de la glucosa (revisado en Frame y Cohen, Biochem J 359: 1-16, 2001; vease tambien Cohen, Biochem Soc Trans 7: 459-80, 1979; Embi et al., Eur J Biochem 107: 519-27, 1980). "GSK3" segun se usa en el presente documento se refiere a cualquiera o a ambas de las isoformas de la GSK3 (la GSK3a y la GSK3p). Los inhibidores que inhiben cualquiera o ambas de estas isoformas son de utilidad. En ciertas realizaciones el inhibidor de la GSK3 inhibe espedficamente la GSK3 y no inhibe sustancialmente la mayona de las demas cinasas de mairnfero. En algunas realizaciones el inhibidor de la GSK3 no inhibe sustancialmente al menos 10 cinasas de mamffero diversas. En algunas realizaciones el inhibidor de la GSK3 inhibe espedficamente tanto la GSK3p como la GSK3a. En algunas realizaciones el inhibidor de la GSK3 inhibe espedficamente la GSK3p pero no la GSK3a. Por ejemplo, la CI50 para la GSK3a puede ser al menos 10 veces tan alta como para la GSK3p. En algunas realizaciones el inhibidor de la GSK3 inhibe espedficamente la GSK3a pero no la GSK3p. Por ejemplo, la CI50 para la GSK3p puede ser al menos 10 veces tan alta como para la GSK3a. En ciertas realizaciones la CI50 del inhibidor de la GSK3 para la GSK3 es al menos 10 veces menor que su CI50 para la mayona de las demas cinasas de mairnfero. En ciertas realizaciones la CI50 del inhibidor de la GSK3 para la GSK3 es menor de 10 pM. En ciertas realizaciones la CI50 del inhibidor de la GSK3 para la GSK3 es menor de 1 pM. Se entendera que el inhibidor de la GSK3 debena ser capaz de entrar en las celulas en una cantidad suficiente en las condiciones usadas como para inhibir la GSK3 en la misma. En algunas realizaciones la concentracion del inhibidor de la GSK3 usada es al menos igual a la CI50 del compuesto medida in vitro. En algunas realizaciones la concentracion del inhibidor de la GSK3 usada no es mayor de 100 veces la CI50 del compuesto medida in vitro. En algunas realizaciones la concentracion usada vana entre 0,5 y 50 veces la CI50 del agente medida in vitro.
Ahora se han identificado muchos inhibidores potentes y selectivos de la GSK3 de molecula pequena (Wagman AS, Johnson KW, Bussiere DE, Curr Pharm Des., 10 (10): 1105-37, 2004). El inhibidor de la GSk3 que se va a usar en la invencion se selecciona entre el grupo que consiste en: (1) BIO: (2'Z,3'E)-6-bromoindirrubin-3'-oxima. La 6- bromoindirrubin-3'-oxima (BIO) es un potente inhibidor de la GSK-3 reversible y competitivo con el ATP (Polychronopoulos, P. et al. J. Med. Chem. 47, 935-946, 2004). (2) AR- A014418: N-(4-metoxibencil)-N'-(5-nitro-1,3- tiazol-2-il) urea. El AR-A014418 inhibe la GSK3 (CI50 = 104 nM), de una forma competitiva con el aTp (Ki = 38 nM). El AR-A014418 no inhibe significativamente la cdk2 ni la cdk5 (CI50 > 100 pM) ni otras 26 cinasas, lo que demuestra una elevada especificidad para la GSK3 (Bhat, R., et al., J. Biol. Chem. 278, 45937-45945, 2003). (3) SB 216763: 3- (2,4-diclorofenil)-4-(1-metil-1H-indol-3-il)-1H-pirrol-2,5-diona. Vease, por ejemplo, Smith, D. G., et al, Bioorg. Med. Chem. Lett. 11, 635-639 (2001) y Cross, D. A., et al., J. Neurochem. 77, 94-102, (2001), (4) TDZD-8: 4-bencil-2- metil-1,2,4-tiadiazolidin-3,5-diona. Este compuesto es un inhibidor selectivo de la GSK-3, un derivado de una tiadiazolidinona, un inhibidor no competitivo con el ATP de la GSK-3p (CI50 = 2 pM). No inhibe la Cdk-1/ciclina B, la CK-II, la PKA ni la PKC a >100 pM. Se ha propuesto que se une al sitio de la cinasa de la GSK3-3p (Martinez et al., J. Med. Chem. 45, 1292-1299, 2002); CHIR-911 y CHIR-837 (denominados tambien CT-99021 y CT-98023, respectivamente) Chiron Corporation (Emeryville, Calif.) y los compuestos relacionados, son de utilidad. El cloruro de litio, el valproato de sodio y el inhibidor de la GSK3 II (Calbiochem) son otros inhibidores de la GSK3. Otros inhibidores de la GSK3 incluyen SB 415286: 3-[(3-cloro-4-hidroxifenil)amino]-4-(2-nitrofenil)-1H-pirrol-2,5-diona. El SB 415286 se describe en Smith, D. G., et al, Bioorg. Med. Chem. Lett. 11, 635-639, 2001 y en Coughlan, M. P., et al, Chem. Biol. 10, 793-803, 2000, y los descritos en las patentes de EE.UU. n° 6.057.117 y 6.608.063; en las publicaciones de solicitud de patente de EE.UU. 20040092535, 20040209878, 20050054663. Otros inhibidores de la GSK3 se describen en el documento WO/2003/049739, que desvela PYRIMIDINE COMPOUNDS USEFUL AS GSK- 3 INHIBITORS; en el documento WO/2002/085909, que desvela 9-DEAZAGUANINE DERIVATIVES AS INHIBITORS OF GSK-3, en el documento WO/2003/011287, que desvela PYRAZOLON DERIVATIVES AS INHIBITORS OF GSK-3, en el documento WO/2005/039485 y/o en el documento WO/2006/091737.
En el presente documento tambien se divulgan metodos en los que el activador de la ruta de la Wnt es un inhibidor de la cinasa de casema 1 (CK1). Algunos ejemplos incluyen D4476, IC261, y CKI-7 (vease, por ejemplo, Rena, G., et al. EMBO reports 5 (1), 60-65, 2004). Los compuestos que inhiben la CK1 y la GSK3 tambien se divulgan en la Patente de EE.UU. n° 7098204.
En el presente documento tambien se divulgan metodos en los que el activador de la ruta de la Wnt es un activador de una fosfatasa que desfosforila de forma natural la p-catenina en uno mas de los sitios fosforilados por la GSK3 o por la CK1.
La protema de union CREB (CBP) y la estrechamente relacionada protema p300 pueden ensamblarse con la p- catenina y actuar como co-activadores transcripcionales de la union de la p-catenina. Por ejemplo, para generar un complejo transcripcionalmente activo, la p-catenina recluta los coactivadores transcripcionales, la protema de union CREB (CBP) o su estrechamente relacionado homologo p300 (Hecht et al., EMBO J. 19: 1839-50 (2000); Takemaru et al., J. Cell Biol. 149: 249-54 (2000)), asf como otros componentes de la maquinaria de transcripcion basal. Otros coactivadores de la p-catenina incluyen TBP, BRG1, BCL9/PYG, etc. La invencion engloba directa o indirectamente
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la modulacion de las interacciones entre la p-catenina y uno cualquiera o mas de estos coactivadores, de forma que se mejore la reprogramacion de celulas somaticas. Por ejemplo, la participacion relativa de la p-catenina en uno cualquiera o mas de estos complejos puede ser alterada con respecto a su participacion en uno o mas de otros complejos. Pueden usarse agentes tales como moleculas pequenas para desestabilizar selectivamente la interaccion de la p-catenina con un coactivador en particular, produciendo asf potencialmente la transcripcion que inhibina la reprogramacion o favorecena la diferenciacion. La desestabilizacion selectiva puede modificar el balance hacia una interaccion con un coactivador diferente para formar un complejo que mejore la reprogramacion. El agente puede actuar directamente sobre el complejo o indirectamente, por ejemplo, provocando una modificacion post- traduccional tal como una fosforilacion de la p-catenina o de un co-activador. En una realizacion, el agente es un compuesto descrito en la Publicacion de Patente de EE.UU. n° 20070128669 o un analogo o un derivado del mismo, o un agente que tiene el mismo mecanismo de accion. La protema de interaccion con la p-catenina (tambien conocida como ICAT o CTNNBIP1) se une a la p-catenina e inhibe la interaccion entre la p-catenina y los miembros de la familia TCF (Gottardi, et al., Am J Physiol Cell Physiol. 286 (4): C747-56, 2004). La protema codificada es un regulador negativo de la senalizacion de la ruta de la Wnt. La ICAT (termino que tambien incluye cualquier variante de transcripcion o miembros de la familia que inhiben la interaccion de la p-catenina y el TCF) puede ser inhibida con objeto de activar la ruta de la Wnt. El agente que activa una ruta de la Wnt puede hacerlo mediante una inhibicion de la expresion o de la actividad de un inhibidor endogeno o de un regulador negativo de ruta de la Wnt. El agente puede inhibir la expresion mediante un ARN interferente (ARNi). El agente puede inhibir la expresion o la actividad de la GSK3, de la ICAT, de la CK1 o de la CTNNBIP1.
En algunos de los metodos divulgados en el presente documento un inhibidor de utilidad es un agente de ARNi. El experto en la materia sera capaz de identificar un agente de ARNi apropiado para inhibir la expresion de un gen de interes. Vease, por ejemplo, Yu, J-Y., et al., Molecular Therapy, 7 (2): 228-236, 2003. El agente de ARNi puede inhibir la expresion lo suficiente como para reducir el nivel de estado estacionario medio del ARN transcrito a partir del gen (por ejemplo, del ARNm) o su protema codificada en, por ejemplo, al menos el 50 %, el 60 %, el 70 %, el 80 %, el 90 %, el 95 % o mas). El agente de ARNi puede contener una secuencia de entre 17-29 nucleotidos de longitud, por ejemplo, de 19-23 nucleotidos de longitud que es complementaria al 100 % con el ARNm o contiene hasta 1, 2, 3, 4 o 5 nucleotidos, o hasta aproximadamente el 10-30% de los nucleotidos, que no participa en el apareamiento de bases de Watson-Crick cuando se alinea con el ARNm para conseguir el numero maximo de pares de bases complementarios. El agente de ARNi puede contener un duplex de entre 17-29 nucleotidos de longitud en el que todos los nucleotidos participan en el apareamiento de bases de Watson-Crick o en el que hasta aproximadamente el 10-30% de los nucleotidos no participan en el apareamiento de bases de Watson-Crick. El experto en la materia sera consciente de que caractensticas de la secuencia estan asociadas a menudo con una funcionalidad superior del ARNip, y de los algoritmos y normas mediante los cuales pueden disenarse dichos ARNip (vease, por ejemplo, Jagla, B., et al, ARN, 11 (6): 864-72, 2005). Los metodos divulgados en el presente documento pueden emplear, aunque no necesariamente, ARNip que tengan dichas caractensticas. La secuencia de cualquiera o de ambas hebras del agente de ARNi puede elegirse para evitar el silenciamiento de genes que no son objetivo, por ejemplo, la(s) hebra(s) puede(n) tener una complementariedad menor del 70 %, del 80 % o del 90 % con cualquier ARNm distinto al ARNm objetivo. Pueden usarse multiples secuencias diferentes. La Tabla 1 recoge las ID de los genes humanos y de raton que codifican para la GSK3 y los numeros de registro de la secuencia de acidos nucleicos (ARNm) y de la protema. Los agentes de ARNi capaces de silenciar genes de mairnfero estan disponibles en el mercado (por ejemplo, en proveedores tales como Qiagen, Dharmacon, Invitrogen, etc.). Si existen multiples isoformas, se pueden disenar ARNip o ARNhc dirigidos contra una region presente en todas las isoformas expresadas en una celula de interes dada.
Los metodos para el silenciamiento de genes mediante la transfeccion de celulas con un ARNip o con constructos que codifican para un ARNhc son conocidos en la materia. Para expresar un agente de ARNi en celulas somaticas, puede introducirse un constructo de un acido nucleico que comprende una secuencia que codifica para el agente de ARNi, unido operativamente a los elementos de control de la expresion adecuados, por ejemplo, un promotor, en las celulas, como se sabe en la materia. Un constructo de un acido nucleico que comprende una secuencia que codifica para un ARN o un polipeptido de interes, estando la secuencia unida operativamente a elementos de control de la expresion tales como un promotor que dirigen la transcripcion en una celula de interes, se denomina en el presente documento "casete de expresion". El promotor puede ser un promotor de una polimerasa de ARN I, II o III funcional en celulas somaticas de mamffero. La expresion del agente de ARNi puede ser condicional. La expresion puede ser regulada colocando la secuencia que codifica para el agente de ARNi bajo el control de un promotor regulable (por ejemplo, inducible o reprimible).
Las versiones constitutivamente activas de protemas tales como la p-catenina o de otros componentes de la ruta de senalizacion Wnt tambien son de utilidad. Un truncamiento o una delecion N-terminal del potencial sitio de fosforilacion de la GSK-3 en la region N-terminal, o una mutacion sin sentido de los residuos de serina o de treonina en la misma, dan como resultado la acumulacion de una p-catenina truncada o con un tamano normal, y despues a una activacion de la senal mediada por la p-catenina (de La Coste PNAS, 95 (15): 8847-8851, 1998). Las versiones negativas dominantes de las protemas endogenas que inhiben la senalizacion Wnt tambien son de utilidad. Las celulas somaticas pueden ser modificadas para que expresen estas protemas. La protema puede ser anadida al medio de cultivo.
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Pueden tratarse las celulas para mejorar la captacion de un activador de la ruta de la Wnt que actue intracelularmente. Por ejemplo, puede permeabilizarse parcialmente la membrana celular. Un activador de la ruta de la Wnt puede ser modificado para que comprenda una secuencia de aminoacidos que mejore la captacion celular de las moleculas por parte de las celulas (denominado tambien "dominio de transduccion de la protema"). Dichas secuencias de aminoacidos que mejoran la captacion se encuentran, por ejemplo, en la protema TAT del VIH-1, en la protema de union al ADN del virus del herpes simple 1 (HSV-1) VP22, en el factor de transcripcion de Drosophila Antennapedia (Antp), etc. Tambien son de utilidad las secuencias artificiales. Vease, por ejemplo, Fischer et al, Bioconjugate Chem., Vol. 12, n° 6, 2001, y la Patente de EE.UU. n° 6.835.810.
Las composiciones y las metodologfas divulgadas en la Publicacion de Patente de EE.UU. n° 20060147435 son utiles para promover la senalizacion de la Wnt/p-catenina y pueden usarse en los metodos divulgados en el presente documento.
Pueden tratarse celulas somaticas de forma que expresen una protema Wnt a unos niveles mayores de lo que sena el caso sin dicho tratamiento. Las celulas somaticas pueden ser modificadas geneticamente para que expresen de forma estable o temporal una protema Wnt a unos niveles mayores de lo que sena el caso sin dicho tratamiento. Las celulas somaticas pueden ser tratadas de forma que expresen un componente de la ruta de la Wnt, tal como la p- catenina o un TCF/LEF, a unos niveles mayores de lo que sena el caso sin dicho tratamiento. Las celulas somaticas pueden ser modificadas geneticamente para que expresen de forma estable o temporal un componente de la ruta de la Wnt tal como la p-catenina o un TCF/LEF a unos niveles mayores de lo que sena el caso sin dicho tratamiento.
Los metodos de la invencion pueden incluir el tratamiento de las celulas con multiples agentes de reprogramacion tanto simultaneamente (es decir, durante unos periodos de tiempo que se solapan al menos en parte) como secuencialmente y/o repitiendo las etapas de tratamiento de las celulas con un agente. El agente usado en el tratamiento de repeticion puede ser el mismo o distinto al usado durante el primer tratamiento. Las celulas pueden ponerse en contacto con un agente de reprogramacion durante unos periodos de tiempo variables. En algunas realizaciones, las celulas se ponen en contacto con el agente durante un periodo de tiempo de entre 1 hora y 60 dfas, por ejemplo, de entre 10 y 30 dfas, por ejemplo, durante aproximadamente 15-20 dfas. Los agentes de reprogramacion pueden anadirse cada vez que se sustituye el medio de cultivo celular. El (los) agente(s) de reprogramacion puede(n) eliminarse antes de llevar a cabo una seleccion para enriquecer en celulas pluripotentes, o de la evaluacion de las caractensticas de pluripotencia de las celulas.
Los agentes de reprogramacion o los candidatos a agentes de reprogramacion de interes incluyen una diversidad de compuestos. Algunos ejemplos de compuestos incluyen agentes que inhiben la desacetilacion de histonas, por ejemplo, inhibidores de la desacetilasa de histona (HDAc) y agentes que inhiben la metilacion del ADN, por ejemplo, inhibidores de la metiltransferasa de ADN. Sin querer cenirnos a ninguna teona, la desmetilacion del ADN puede regular la expresion genica mediante una "apertura" de la estructura de la cromatina detectable en forma de un aumento de la sensibilidad a la nucleasa. Este remodelado de la estructura de la cromatina permite que los factores de transcripcion se unan a las regiones promotoras, el ensamblaje del complejo de transcripcion y la expresion genica.
Las principales clases de inhibidores de la HDAC incluyen (a) acidos grasos de cadena pequena (por ejemplo, acido valproico); (b) inhibidores del hidroxamato de molecula pequena (por ejemplo, SAHA y PXD101); (c) no inhibidores del hidroxamato de molecula pequena, por ejemplo, MS-275; y (d) peptidos dclicos: por ejemplo, depsipeptido (vease, por ejemplo, Carey N y La Thangue NB, Curr Opin Pharmacol.; 6 (4): 369-75, 2006). Algunos ejemplos de inhibidores de la desacetilasa de histona incluyen Trichostatin A: [R-(E,E)]-7-[4-(dimetilamino)fenil]-N-hidroxi-4,6- dimetil-7-oxo-2,4-heptadienamida, que inhibe la desacetilasa de histona a unas concentraciones nanomolares; la hiperacetilacion de la histona resultante da lugar a una relajacion de la cromatina y a la modulacion de la expresion genica (Yoshida, M., et al., Bioessays 17, 423-430, 1995; Minucci, S., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU. 94, 1129511300, 1997; Brehm, A., et al., 1998; Medina, V., et al., Induction of caspase-3 protease activity and apoptosis by butyrate and trichostatin A (inhibitors of histone deacetilase): dependence on protein synthesis and synergy with a mitochondrial/cytochrome c-dependent pathway. Cancer Res. 57,3697-3707,1997; Kim, M. S., et al., Inhibition of histone deacetilase increases cytotoxicity to anticancer drugs targeting DNA. Cancer Res. 63, 7291-7300, 2003); Apicidin: ciclo[(2S)-2-amino-8-oxodecanoil-1-metoxi-L-triptofil-L-isoleucil-(2R)-2-piperidinxcarbonilo] (Kwon, S. H., et al. J. Biol. Chem. 18, 2073, 2002; Han, J. W., et al. Cancer Res. 60, 6068, 2000; Colletti, S. L., et al. Bioorg. Med. Chem. 11, 107, 2001; Kim, J. S., et al. Biochem. Biophys. Res. Commun. 281, 866, 2001).
En la materia se conocen diversos inhibidores de la metilacion del ADN y son de utilidad en la invencion. Vease, por ejemplo, Lyko, F. y Brown, R., JNCI Journal of the National Cancer Institute, 97 (20) 1498-1506, 2005. Algunos inhibidores de la metilacion del ADN incluyen inhibidores de la metiltransferasa de nucleosidos del ADN tales como decitabina (2'-desoxi-5-azacitidina), 5-azadesoxicitidina y zebularina, inhibidores no nucleosfdicos tales como (-)- epigalocatequin-3-galato de polifenol (EGCG) y la molecula pequena RG108 (acido 2-(1,3-dioxo-1,3-dihidro-2H- isoindol-2-il)-3-(1H-indol-3-il) propanoico), los compuestos descritos en el documento WO2005085196 y ftalamidas, succinimidas y los compuestos relacionados, tales como los descritos en el documento W02007007054. Otras tres clases adicionales de compuestos son: (1) derivados del acido 4-aminobenzoico, tales como el farmaco antiarntmico procainamida y el anestesico local procama; (2) tepsamaplinas, que tambien inhibe la desacetilasa de histona (Pina,
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I. C., J OrgChem., 68 (10): 3866-73, 2003); y (3) oligonucleotidos, incluyendo ARNip, ARNhc y oligonucleotidos antisentido espedficos, tales como MG98. Los inhibidores de la metilacion del aDn pueden actuar mediante diversos mecanismos diferentes. Los inhibidores nucleos^dicos son metabolizados por las rutas celulares antes de ser incorporados en el ADN. Despues de la incorporacion, funcionan como sustratos suicidas para las enzimas DNMT. Se ha propuesto que el inhibidor no nucleosfdico procama, el epigalocatequiin-3-galato (EGCG) y el RG108 inhiben las metiltransferasas de ADN mediante el enmascaramiento de las secuencias objetivo de las DNMT (es decir, la procama) o mediante un bloqueo del sitio activo de la enzima (es decir, el EGCG y el RG108). Pueden usarse combinaciones de inhibidores de la metilacion del ADN. Las concentraciones pueden ser seleccionadas para minimizar los efectos toxicos en las celulas. Pueden no usarse agentes que se incorporan en el ADN (o cuyos productos metabolicos se incorporan en el ADN).
La metiltransferasa de ADN (DNMT1, 3a y/o 3b) y/o uno o mas miembros de la familia HDAC pueden ser inhibidos como alternativa o adicionalmente mediante el uso de agentes de ARNi.
En el presente documento tambien se divulga lo siguiente: 1) uso de un medio condicionado de Wnt, de una Wnt soluble o de moleculas pequenas que modulan la senalizacion de la ruta de la Wnt junto con otras senales temporales, por ejemplo, moleculas pequenas, que pueden sustituir a los retrovirus Oct4, Sox2, Klf4, Nanog y/o Lin28 en la reprogramacion de celulas somaticas a pluripotencia; 2) una composicion que comprende un modulador de la ruta de la Wnt y al menos un compuesto seleccionado entre el grupo que consiste en: inhibidores de la HDAC e inhibidores de la metilacion del ADN; 3) una composicion que comprende un modulador de la ruta de la Wnt, al menos un inhibidor de la HDAC y al menos un inhibidor de la metilacion del ADN; 4) un medio de cultivo celular que contiene cualquiera de las anteriores combinaciones de agentes. El inhibidor de la HDAC puede ser cualquiera de los inhibidores de la HDAC mencionados anteriormente. El inhibidor de la metilacion del aDn puede ser cualquiera de los inhibidores de la HDAC mencionados anteriormente. El modulador de la ruta de la Wnt puede activar la ruta de la Wnt. El medio de cultivo celular puede comprender un medio condicionado de Wnt, por ejemplo, un MC de la Wnt3a, como fuente del modulador de la ruta de la Wnt. El modulador de la ruta de la Wnt puede ser una molecula pequena. La composicion puede comprender celulas somaticas. Las celulas somaticas pueden ser modificadas para que expresen al menos uno de los factores de transcripcion Oct4, Nanog, Sox2, Klf4 y Lin28.
Celulas somaticas y celulas somaticas reprogramadas
Las celulas somaticas de utilidad en la invencion pueden ser celulas primarias (celulas no inmortalizadas), tales como las recien aisladas de un animal, o pueden derivar de una lmea celular capaz de una proliferacion prolongada en cultivo (por ejemplo, durante mas de 3 meses) o de una proliferacion indefinida (celulas inmortalizadas). Las celulas somaticas de adulto pueden obtenerse a partir de individuos, por ejemplo, de sujetos humanos, y cultivarse segun los protocolos de cultivo celular habituales disponibles para los expertos habituales en la materia. Las celulas pueden ser mantenidas en un cultivo celular despues de su aislamiento o a partir de un sujeto. En ciertas realizaciones, las celulas se pasan una vez o mas despues de su aislamiento a partir del individuo (por ejemplo, entre 2-5, 5-10, 10-20, 20-50, 50-100 veces, o mas) antes de su uso en un metodo de la invencion. Pueden ser congeladas y posteriormente descongeladas antes de su uso. En algunas realizaciones, las celulas habran sido pasadas no mas de 1,2,5,10, 20 o 50 veces despues de su aislamiento a partir del individuo antes de su uso en un metodo de la invencion.
Las celulas somaticas de utilidad en la presente invencion incluyen, por ejemplo, celulas humanas, celulas de un primate no humano o celulas de raton. Pueden obtenerse mediante metodos bien conocidos a partir de diversos organos, por ejemplo, la piel, el pulmon, el pancreas, el hugado, el estomago, el intestino, el corazon, los organos reproductores, la vejiga, el rinon, la uretra y otros organos urinarios, etc., generalmente a partir de cualquier organo o tejido que contenga celulas somaticas vivas. Las celulas somaticas de mairnfero utiles en varias realizaciones de la presente invencion incluyen, por ejemplo, fibroblastos, celulas madre adultas, celulas de sertoli, celulas granulosas, neuronas, celulas de los islotes pancreaticos, celulas epidermicas, celulas epiteliales, celulas endoteliales, hepatocitos, celulas del folmulo piloso, queratinocitos, celulas hematopoyeticas, melanocitos, condrocitos, linfocitos (linfocitos B y T), eritrocitos, macrofagos, monocitos, celulas mononucleares, celulas de musculo cardiaco, celulas de musculo esqueletico, etc., generalmente cualquier celula somatica viva.
Las celulas somaticas pueden ser tratadas de forma que se provoque que expresen o contengan uno o mas factores de reprogramacion, factores de pluripotencia y/o factores de induccion del factor de pluripotencia, a unos niveles mayores de lo que sena el caso en ausencia de dicho tratamiento. Por ejemplo, pueden modificarse geneticamente las celulas somaticas para que expresen uno o mas genes que codifican para uno mas de dichos factores y/o pueden tratarse con agentes que aumenten la expresion de uno o mas genes endogenos que codifican para dichos factores y/o que estabilizan dichos factores. El agente podna ser, por ejemplo, una molecula pequena, un acido nucleico, un polipeptido, etc. En algunas realizaciones, se introducen factores tales como factores de pluripotencia en las celulas somaticas, por ejemplo, mediante una microinyeccion o poniendo en contacto las celulas con los factores en unas condiciones en las que los factores son captados por las celulas. En algunas realizaciones, los factores son modificados para que incorporen un dominio de transduccion de una protema. En algunas realizaciones, las celulas son permeabilizadas o tratadas de otro modo para que aumenten su captacion de los factores. A continuacion se analizan algunos ejemplos de factores.
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El factor de transcripcion Oct4 (denominado tambien Pou5fl, Oct-3, Oct3/4) es un ejemplo de un factor de pluripotencia. Se ha demostrado que el Oct4 es necesario para el establecimiento y el mantenimiento del fenotipo indiferenciado de las celulas ES y juega un importante papel en la determinacion de los acontecimientos tempranos en la embriogenesis y en la diferenciacion celular (Nichols et al., 1998, Cell 95: 379-391; Niwa et al., 2000, Nature Genet. 24: 372-376). La expresion del Oct4 esta regulada por disminucion segun se diferencian las celulas madre en celulas mas especializadas. El Nanog es otro ejemplo de un factor de pluripotencia. El Nanog es un factor de transcripcion que contiene una homeocaja con una funcion esencial en el mantenimiento de las celulas pluripotentes de la masa celular interna y en la derivacion de las celulas ES a partir de estas. Adicionalmente, la sobreexpresion de Nanog es capaz de mantener las caractensticas de pluripotencia y de autorrenovacion de las celulas ES bajo lo que normalmente senan unas condiciones de cultivo inductoras de diferenciacion (vease Chambers et al., 2003, Cell 113: 643-655; Mitsui et al., Cell. 2003, 113 (5): 631-42). El Sox2, otro factor de pluripotencia, es un factor de transcripcion que contiene un dominio de HMG conocido por ser esencial para el normal desarrollo y mantenimiento de una celula pluripotente (Avilion, A., et al., Genes Dev. 17, 126-140, 2003). El Klf4 es un factor de transcripcion en dedo de cinc de tipo Kruppel identificado inicialmente como un miembro de la familia Klf expresado en el intestino (Shields, J. M, et al., J. Biol. Chem. 271: 20009-20017, 1996). Se encontro que la sobreexpresion del Klf4 en celulas ES de raton impedfa la diferenciacion en cuerpos embrionarios formados en un cultivo en suspension, lo que sugiere que el Klf4 contribuye a la autorrenovacion de las ES (Li, Y,, et al., Blood 105: 635-637, 2005). El Sox2 es un miembro de la familia de factores de transcripcion SOX (caja Y de la region determinante del sexo) y es importante para el mantenimiento de la autorrenovacion de las celulas ES. El c-Myc es un factor de transcripcion que juega una minada de papeles en el desarrollo y la fisiologfa normales, asf como por ser un oncogen cuya expresion desregulada o mutacion esta implicada en diversos tipos de cancer (revisado en Pelengaris S, Khan M., Arch Biochem Biophys. 416 (2): 129-36, 2003; Cole MD, Nikiforov MA, CurrTop Microbiol Immunol., 302: 33-50, 2006). En algunas realizaciones, dichos factores se seleccionan entre: Oct4, Sox2, Klf4 y combinaciones de los mismos. En algunas realizaciones, un miembro diferente de la familia Klf funcionalmente solapante tal como el Klf2 es sustituido por el Klf4. En algunas realizaciones, los factores incluyen al menos el Oct4. En algunas realizaciones, los factores incluyen al menos el Oct4 y un miembro de la familia Klf, por ejemplo, Klf2. La Lin28 es una protema de union al ARN regulada con el desarrollo. En algunas realizaciones, las celulas somaticas se tratan de forma que expresen o que contengan uno o mas factores de reprogramacion seleccionados entre: Oct4, Sox2, Klf4, Nanog, Lin28 y combinaciones de los mismos. La CCAAT/protema alfa mejoradora de la union (C/EBPalfa) es otra protema que promueve la reprogramacion de al menos en ciertos tipos de celulas, por ejemplo, en celulas linfoides tales como las celulas de la estirpe B, se considera un factor de reprogramacion para dichos tipos de celulas, y es de utilidad en ciertas realizaciones de la invencion, por ejemplo, junto con uno o mas de los genes de pluripotencia y/o moduladores de la ruta de la Wnt descritos en el presente documento.
Otros genes de interes estan implicados en el remodelado de la cromatina y/o se ha demostrado que son importantes para el mantenimiento de la pluripotencia de las celulas ES. Opcionalmente, el gen es aquel que esta regulado por disminucion segun se diferencian las celulas y/o que no es expresado en las celulas somaticas adultas. Otros genes de interes codifican para precursores de microARN que se han asociado con multipotencia o pluripotencia y/o que son expresados de forma natural en las celulas multipotentes o pluripotentes. Otros genes de interes incluyen codifican para agentes de ARNi que inhiben los genes que son objetivos de los microARN endogenos que son expresados de forma natural en las celulas multipotentes o pluripotentes.
En una realizacion, el gen introducido exogenamente puede ser expresado a partir de un locus cromosomico distinto al locus cromosomico de un gen endogeno cuya funcion esta asociada con pluripotencia. Dicho locus cromosomico puede ser un locus con una estructura de cromatina abierta, y contener genes cuya expresion no sea necesaria en las celulas somaticas, por ejemplo, el locus cromosomico contiene genes cuya desestabilizacion no provocara la muerte de las celulas. Algunos ejemplos de loci cromosomicos incluyen, por ejemplo, el locus ROSA 26 de raton y el locus del colageno de tipo II (Col2al) (vease Zambrowicz et al., 1997).
Los metodos para la expresion de genes en celulas son conocidos en la materia. Generalmente, se une operativamente una secuencia que codifica para un polipeptido o un ARN funcional, tal como un agente de ARNi, a las secuencias reguladoras apropiadas. El termino secuencia reguladora incluye promotores, potenciadores y otros elementos de control de la expresion. Algunos ejemplos de secuencias reguladoras se describen en Goeddel; Gene Expression Technology: Methods in Enzymology, Academic Press, San Diego, CA (1990). Por ejemplo, puede usarse cualquiera de una gran diversidad de secuencias de control de la expresion que controlen la expresion de una secuencia de ADN cuando estan unidas operativamente a la misma en estos vectores para la expresion de ADNc.
El gen introducido exogenamente puede ser expresado a partir de una secuencia reguladora inducible o reprimible de forma que puede regularse su expresion. El termino "secuencia reguladora inducible", segun se usa en el presente documento, se refiere a una secuencia reguladora que, en ausencia de un inductor (tal como un agente qmmico y/o biologico) o de una combinacion de inductores, no dirige la expresion o la dirige a unos niveles de expresion bajos de una secuencia de acidos nucleicos unida operativamente tal como un ADNc, y, en respuesta a un inductor, se mejora su capacidad para dirigir la expresion. Algunos ejemplos de promotores inducibles incluyen, por ejemplo, los promotores que responden a metales pesados (CRC Boca Raton, Fla. (1991), 167-220; Brinster et al. Nature (1982), 296, 39-42), a choques termicos, a hormonas (Lee et al. P.N.A.S. EE.UU. (1988), 85, 1204-1208;
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(1981), 294, 228-232; Klock et al. Nature (1987), 329, 734-736; Israel y Kaufman, Nucleic Acids Res. (1989), 17, 2589-2604), promotores que responden a agentes qmmicos, tales como glucosa, lactosa, galactosa o un antibiotico. Una "secuencia reguladora reprimible" es aquella que dirige la expresion de una secuencia de acidos nucleicos unida operativamente en ausencia de un agente espedfico o de una combinacion de agentes que inhiben la expresion.
Un promotor inducible por tetraciclina es un ejemplo de un promotor inducible que responde a un antibiotico. Vease Gossen, M. y Bujard, H., Annu Rev Genet. Vol. 36: 153-173 2002 y las referencias del mismo. Un promotor inducible por tetraciclina comprende un promotor mmimo unido operativamente a uno o mas operadores de tetraciclina. La presencia de tetraciclina o de uno de sus analogos da lugar a la union de un activador de la transcripcion a las secuencias operadoras de la tetraciclina, que activa el promotor mmimo y por lo tanto la transcripcion del ADNc asociado. El analogo de la tetraciclina incluye cualquier compuesto que muestre una similitud estructural con la tetraciclina y sea capaz de activar un promotor inducible por tetraciclina. Algunos ejemplos de analogos de tetraciclina incluyen, por ejemplo, doxiciclina, clorotetraciclina y anhidrotetraciclina.
La expresion de un gen introducido, por ejemplo, de un gen que codifica para un factor de reprogramacion o un agente de ARNi, puede ser temporal. La expresion temporal puede conseguirse mediante una transfeccion temporal o mediante la expresion a partir de un promotor regulable. Opcionalmente, la expresion puede ser regulada por, o dependiente de, la expresion de una recombinasa espedfica de sitio. Algunos sistemas de recombinasa incluyen los sistemas Cre-Lox y Flp-Frt, entre otros (Gossen, M. y Bujard, H., 2002). Opcionalmente, se usa una recombinasa para activar la expresion mediante la eliminacion de una secuencia de detencion que de otro modo separana la secuencia codificante de las secuencias de control de la expresion. Puede usarse una recombinasa para escindir al menos una porcion de un gen despues de que se haya inducido la pluripotencia. Opcionalmente, la recombinasa es expresada temporalmente, por ejemplo, se vuelve indetectable despues de aproximadamente 1-2 dfas, 2-7 dfas, 1-2 semanas, etc. Opcionalmente, la recombinasa es introducida desde fuentes externas. Opcionalmente, la recombinasa es un dominio de transduccion de una protema.
Pueden evaluarse una o mas caractensticas de pluripotencia de las celulas somaticas reprogramadas. La presencia de las caractensticas de pluripotencia indica que las celulas somaticas han sido reprogramadas a un estado pluripotente. El termino "caractensticas de pluripotencia", segun se usa en el presente documento, se refiere a las caractensticas asociadas con, e indicativas de, pluripotencia, incluyendo, por ejemplo, la capacidad para diferenciarse en celulas derivadas de las tres capas germinales embrionarias, todos los tipos y patrones de expresion genica caractensticos de una celula pluripotente, incluyendo la expresion de factores de pluripotencia y la expresion de otros marcadores de las celulas ES.
Para evaluar las caractensticas de pluripotencia de las celulas somaticas potencialmente reprogramadas, se pueden analizar las caractensticas de crecimiento en particular de dichas celulas y la morfologfa de tipo celula Es. Las celulas pueden inyectarse subcutaneamente en ratones SCID inmunodeprimidos para determinar si inducen teratomas (un ensayo estandar para las celulas ES). Las celulas de tipo ES pueden ser diferenciadas en cuerpos embrionarios (otra caractenstica espedfica de las ES). Ademas, las celulas de tipo ES pueden ser diferenciadas in vitro mediante la adicion de algunos factores de crecimiento que se sabe que grnan la diferenciacion en unos tipos celulares espedficos. La capacidad de autorrenovacion, apreciable por la induccion de la actividad de la telomerasa, es otra caractenstica de pluripotencia que puede ser controlada. Se pueden llevar a cabo ensayos funcionales con las celulas somaticas reprogramadas introduciendolas en blastocistos y determinando si las celulas son capaces de dar lugar a todos los tipos celulares. Vease Hogan et al., 2003. Si las celulas reprogramadas son capaces de formar unos pocos tipos celulares del cuerpo, son multipotentes; si las celulas reprogramadas son capaces de formar todos los tipos celulares del cuerpo, incluyendo las celulas germinativas, son pluripotentes.
Tambien se puede analizar la expresion de un factor de pluripotencia individual en las celulas somaticas reprogramadas para evaluar sus caractensticas de pluripotencia. Adicionalmente o alternativamente, se puede evaluar la expresion de otros marcadores de las celulas ES. Los antfgenos embrionarios espedficos de etapa 1 5 1, 3 y 4 (SSEA-1, SSEA-3, SSEA-4) son glicoprotemas que se expresan espedficamente en el desarrollo embrionario temprano, y son marcadores de las celulas ES (Solter y Knowles, 1978, Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU. 75: 55655569; Kannagi et al., 1983, EMBO J 2: 2355-2361). Una elevada expresion de la enzima fosfatasa alcalina (FA) es otro marcador asociado con las celulas madre embrionarias indiferenciadas (Wobus et al., 1984, Exp. Cell 152: 212219; Pease et al., 1990, Dev. Biol. 141: 322-352). Algunos marcadores adicionales de las celulas ES se describen en Ginis, I., et al., Dev. Biol., 269: 369-380, 2004 y en The International Stem Cell Initiative, Adewumi O, et al., Nat Biotechnol., 25 (7): 803-16, 2007 y en las referencias de los mismos. Por ejemplo, son de utilidad los TRA-1-60, TRA-1-81, GCTM2 y GCT343, y los antfgenos proteicos CD9, Thyl (tambien conocido como CD9O), el HLA de clase 1, NANOG, TDGF1, DNMT3B, GABRB3 y GDF3, REX-1, TERT, UTF-1, TRF-1, TRF-2, conexina 43, conexina 45, Foxd3, FGFR-4, ABCG-2 y Glut-1.
Se puede llevar a cabo una caracterizacion de la expresion de las celulas somaticas reprogramadas para evaluar sus caractensticas de pluripotencia. Se sabe que las celulas pluripotentes, tales como las celulas madre embrionarias, y las celulas multipotentes, tales como las celulas madre adultas, tienen un patron distinto de expresion genica global. Vease, por ejemplo, Ramalho-Santos et al., Science 298: 597-600, 2002; Ivanova et al.,
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Science 298: 601-604, 2002; Boyer, LA, et al. Nature 441, 349, 2006, y Bernstein, BE, et al., Cell 125 (2), 315, 2006. Se puede evaluar la metilacion del ADN, la expresion genica y/o el estado epigenetico del ADN celular y/o el potencial de desarrollo de las celulas, por ejemplo, segun se describe en Wernig, M., et al., Nature, 448: 318-24, 2007. Las celulas que son capaces de formar teratomas que contienen celulas que tienen las caractensticas del endodermo, del mesodermo y del ectodermo cuando se inyectan en ratones SCID y/o que poseen la capacidad de participar (despues de una inyeccion en blastocistos murinos) en la formacion de quimeras que sobreviven a termino, se consideran pluripotentes. Otro metodo de utilidad para la evaluacion de la pluripotencia es la determinacion de si las celulas han reactivado un cromosoma X silente.
Las celulas somaticas pueden ser reprogramadas para que ganen un conjunto completo de caractensticas de pluripotencia. Alternativamente, las celulas somaticas pueden ser reprogramadas para que ganen unicamente un subconjunto de las caractensticas de pluripotencia.
Algunos de los metodos divulgados en el presente documento incluyen una etapa de seleccion de las celulas que expresan un marcador que es expresado por las celulas multipotentes o pluripotentes. El marcador puede ser expresado espedficamente en dichas celulas. Pueden usarse los metodos de separacion de celulas habituales, por ejemplo, una citometna de flujo, una separacion por afinidad, etc. Alternativamente o adicionalmente, se podnan seleccionar las celulas que no expresan los marcadores caractensticos de las celulas somaticas de las cuales derivan las celulas potencialmente reprogramadas y que no son expresados en las celulas ES generadas mediante el uso de metodos convencionales. Otros metodos de separacion de celulas pueden utilizar las diferencias en el tamano medio o en la densidad de la celula que puedan existir entre las celulas pluripotentes y las celulas somaticas. Por ejemplo, las celulas pueden filtrarse a traves de materiales que tengan unos poros que solo permitan el paso a su traves de ciertas celulas.
Las celulas somaticas pueden contener un acido nucleico que comprenda secuencias reguladoras de un gen que codifica para un factor de pluripotencia unido operativamente a un marcador seleccionable o detectable (por ejemplo, GFP o neo). La secuencia de acidos nucleicos que codifica para el marcador puede ser integrada en el locus endogeno del gen que codifica para el factor de pluripotencia (por ejemplo, Oct4), o el constructo puede comprender secuencias reguladoras unidas operativamente al marcador. Puede usarse la expresion del marcador para seleccionar, identificar y/o cuantificar las celulas reprogramadas.
Las celulas somaticas reprogramadas son generadas, seleccionadas o identificadas entre las celulas obtenidas o las descendientes de las celulas obtenidas. Opcionalmente, la(s) celula(s) es (son) expandida(s) en un cultivo antes de la generacion, la seleccion o la identificacion de la(s) celulas somatica(s) reprogramada(s) emparejada(s) geneticamente con el donante.
Las colonias pueden subclonarse y/o pasarse una o mas veces con objeto de obtener una poblacion de celulas enriquecida en las celulas de tipo ES. La poblacion enriquecida puede contener al menos un 95 %, un 96 %, un 97 %, un 98 %, un 99 % o mas, por ejemplo, un 100 % de celulas de tipo ES. En el presente documento se divulgan las lmeas celulares de las celulas somaticas que han sido reprogramadas de forma estable y heredable a un estado de tipo ES.
En algunas realizaciones, los metodos se llevan a la practica mediante el uso de celulas somaticas que no estan modificadas geneticamente con el fin de identificar o de seleccionar las celulas reprogramadas. Las celulas somaticas reprogramadas resultantes no contienen material genetico exogeno que ha sido introducido en dichas celulas (o en los ancestros de dichas celulas) mediante la intervencion humana, por ejemplo, con el fin de identificar o de seleccionar las celulas reprogramadas. En algunas realizaciones, las celulas somaticas y las celulas somaticas reprogramadas derivadas de las mismas no contienen material genetico exogeno en su genoma, pero dicho material genetico es introducido con el fin de corregir un defecto genetico en dichas celulas o para permitir que dichas celulas sinteticen una protema deseada con fines terapeuticos, y no se usa para la identificacion ni para la seleccion de las celulas reprogramadas.
En algunas realizaciones, los metodos emplean unos criterios morfologicos para la identificacion de las celulas somaticas reprogramadas entre una poblacion de celulas somaticas que no estan reprogramadas. En algunas realizaciones, los metodos emplean unos criterios morfologicos para la identificacion de las celulas somaticas que han sido reprogramadas a un estado de tipo ES entre una poblacion de celulas que no estan reprogramadas o que solo estan parcialmente reprogramadas a un estado de tipo ES. "Criterios morfologicos" se usa en un sentido amplio para referirse a cualquier caractenstica detectable visualmente de las celulas o de las colonias. Algunos criterios morfologicos incluyen, por ejemplo, la forma de las colonias, la definicion de los lfmites de la colonia, la densidad, un tamano pequeno y la forma redondeada de las celulas con respecto a las celulas no reprogramadas, etc. La Figura 1 muestra colonias de celulas que muestran unos criterios morfologicos indicativos de las celulas que han sido reprogramadas a un estado de tipo ES. Notense las densas colonias formadas por pequenas celulas redondeadas, y los definidos lfmites de las colonias. Las colonias (o las celulas de las colonias) pueden ser identificadas, y opcionalmente aisladas cuando las colonias muestran una o mas de dichas caractensticas. Las celulas somaticas reprogramadas pueden ser identificadas como colonias que crecen en una primera placa de cultivo celular (termino que se refiere a cualquier recipiente, placa, plato, receptaculo, envase, etc., en el que puedan mantenerse celulas
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vivas in vitro) y las colonias, o las porciones de las mismas, transferidas a una segunda placa de cultivo celular, aislando as^ las celulas somaticas reprogramadas. Las celulas pueden ser despues expandidas adicionalmente.
Metodos de cribado de un agente que reprograma o que contribuye a la reprogramacion de celulas somaticas
En el presente documento se divulgan metodos para la identificacion de un agente que, solo o junto con uno o mas de otros agentes, reprograman las celulas somaticas a un estado menos diferenciado, y los agentes identificados segun los metodos. Los metodos pueden comprender poner en contacto las celulas somaticas con un activador de la ruta de la Wnt y un agente candidato, y la determinacion de si la presencia del agente candidato da como resultado una mejora en la reprogramacion (por ejemplo, un aumento en la velocidad y/o en la eficacia de reprogramacion) con respecto a lo que se producina si las celulas no hubieran entrado en contacto con el agente candidato. El activador de la Wnt y el agente candidato pueden estar presentes juntos en el medio de cultivo celular, o el activador de la Wnt y el agente candidato puede no estar presentes juntos (por ejemplo, las celulas son expuestas a los agentes secuencialmente). Las celulas pueden mantenerse en cultivo durante, por ejemplo, al menos 3 dfas, al menos 5 dfas, hasta 10 dfas, hasta 15 dfas, hasta 30 dfas, etc., tiempo durante el cual estan en contacto con el activador de la Wnt y el agente candidato durante todo o parte del tiempo. El agente puede ser identificado como un agente que reprograma las celulas si hay al menos 2, 5 o 10 veces tantas celulas reprogramadas o colonias que comprenden celulas predominantemente reprogramadas despues de dicho periodo de tiempo que si las celulas no hubieran estado en contacto con el agente.
Un agente candidato puede ser cualquier molecula o complejo supramolecular, por ejemplo, un polipeptido, un peptido (que se usa en el presente documento para referirse a un polipeptido que contiene 60 aminoacidos o menos), una molecula pequena organica o inorganica (es decir, moleculas que tienen un peso molecular menor de 1.500 Da, de 1.000 Da o de 500 Da), un polisacarido, un polinucleotido, etc. cuya capacidad para reprogramar las celulas se va a ensayar. Los agentes candidatos pueden ser moleculas organicas, particularmente moleculas organicas pequenas, que comprenden grupos funcionales que median en las interacciones estructurales con las protemas, por ejemplo, puentes de hidrogeno, y normalmente incluyen al menos un grupo amino, carbonilo, hidroxilo o carboxilo, y en algunas realizaciones, al menos dos de los grupos funcionales qmmicos. Los agentes candidatos pueden comprender estructuras de carbono dclicas o heterodclicas y/o estructuras aromaticas o poliaromaticas sustituidas con uno o mas grupos funcionales qmmicos y/o heteroatomos.
Los agentes candidatos se obtienen a partir de una gran diversidad de fuentes, como apreciaran los expertos en la materia, incluyendo colecciones de compuestos sinteticos o naturales. Los agentes candidatos pueden ser compuestos sinteticos. Hay disponibles numerosas tecnicas para la smtesis aleatoria y dirigida de una gran diversidad de compuestos y biomoleculas organicas. Los moduladores candidatos pueden proporcionarse en forma de compuestos naturales en forma de extractos bacterianos, fungicos, vegetales y animales, caldos de fermentacion, medios condicionados, etc., que estan disponibles o pueden ser facilmente producidos.
Puede cribarse una coleccion de compuestos. Una coleccion es normalmente un conjunto de compuestos que puede presentarse de forma que los compuestos pueden ser identificados en un ensayo de cribado. Los compuestos de la coleccion pueden estar alojados en pocillos individuales (por ejemplo, de placas de microtitulacion), en recipientes, en tubos, etc., para facilitar la conveniente transferencia a los pocillos o a los recipientes individuales para ponerlos en contacto con las celulas, para la realizacion de ensayos exentos de celulas, etc. La coleccion puede estar formada por moleculas que tienen unas caractensticas estructurales comunes que difieren en el numero o en el tipo de grupo unido a la estructura principal, o pueden ser completamente aleatorias. Algunas colecciones incluyen, pero no se limitan a, por ejemplo, colecciones de expresion en fago, colecciones de peptidos, colecciones de polisomas, colecciones de aptameros, colecciones de pequenas moleculas sinteticas, colecciones de compuestos naturales y colecciones de compuestos qmmicos. Los metodos para la preparacion de colecciones de moleculas son bien conocidos en la materia, y hay disponibles muchas colecciones en fuentes comerciales o no comerciales. Algunas colecciones de interes incluyen colecciones sinteticas organicas combinatorias. Algunas colecciones, tales como las colecciones de pequenas moleculas sinteticas y las colecciones de compuestos qmmicos, pueden comprender un conjunto estructuralmente diverso de moleculas qmmicas. Algunas moleculas pequenas incluyen moleculas organicas que a menudo tienen multiples enlaces carbono-carbono. Las colecciones pueden comprender estructuras de carbono dclicas o heterodclicas y/o estructuras aromaticas o poliaromaticas sustituidas con uno o mas grupos funcionales. La molecula pequena puede tener entre 5 y 50 atomos de carbono, por ejemplo, entre 7 y 30 carbonos. Los compuestos pueden ser macrodclicos. Algunas colecciones de interes tambien incluyen colecciones de peptidos, colecciones aleatorias de oligonucleotidos, y similares. Las colecciones pueden ser sintetizadas con peptoides y con fracciones sinteticas no peptfdicas. Dichas colecciones pueden ser sintetizadas adicionalmente para que contengan unas fracciones sinteticas no peptfdicas que son menos susceptibles a una degradacion enzimatica en comparacion con sus homologos naturales. Tambien pueden generarse colecciones combinatorias de moleculas pequenas. Una coleccion combinatoria de compuestos organicos pequenos puede comprender un conjunto de analogos estrechamente relacionados que difieren entre sf en uno o mas puntos de diversidad y que son sintetizados mediante tecnicas organicas mediante el uso de procesos multietapa. Las colecciones combinatorias pueden incluir una amplia cantidad de compuestos organicos pequenos. Una "matriz de compuestos" segun se usa en el presente documento es un conjunto de compuestos identificable por sus direcciones espaciales en coordenadas cartesianas y dispuesto de tal forma que cada compuesto tiene un
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nucleo molecular comun y uno o mas elementos de diversidad estructural variables. Los compuestos de dicha matriz de compuestos se producen en paralelo en recipientes de reaccion individuales, identificandose cada compuesto y siendo ubicado por su direccion espacial. Algunos ejemplos de mezclas de smtesis paralelas y de metodos de smtesis en paralelo se proporcionan en la Patente de Ee.UU. n° 5.712.171. Pueden cribarse mezclas que contengan dos o mas compuestos, extractos u otras preparaciones obtenidas a partir de fuentes naturales (que pueden comprender docenas de compuestos o mas), y/o compuestos inorganicos, etc.
Los metodos pueden usarse para el cribado de "farmacos aprobados". Un "farmaco probado" es cualquier compuesto (termino que incluye moleculas biologicas tales como protemas y acidos nucleicos) que ha sido aprobado para su uso en seres humanos por la FDA o estadounidense o una agencia gubernamental similar en otro pafs, para cualquier fin. Esta puede ser una clase particularmente util de compuestos para cribar debido a que representa un conjunto de compuestos que se cree que son seguros y, al menos en el caso de los farmacos aprobados por la FDA, son terapeuticos para al menos un fin. Por lo tanto, existe una elevada probabilidad de que estos farmacos sean al menos seguros para otros fines.
Algunos ejemplos representativos de colecciones que podnan cribarse incluyen DIVERSet™, disponible en ChemBridge Corporation, 16981 Via Tazon, San Diego, Calif. 92127. DIVERSet contiene entre 10.000 y 50.000 moleculas pequenas similares a farmacos sintetizadas manualmente. Los compuestos son preseleccionados para formar una coleccion "universal" que cubre la maxima diversidad de farmacoforos con el mmimo numero de compuestos, y es adecuada para un cribado tanto de alto rendimiento como de bajo rendimiento. Para las descripciones de colecciones adicionales, vease, por ejemplo, Tan, et al., Am. Chem Soc. 120, 8565-8566, 1998; Floyd C D, Leblanc C, Whittaker M, Prog Med Chem 36: 91-168, 1999. En el mercado hay disponibles numerosas colecciones, por ejemplo, en AnalytiCon EE.UU. Inc., P.O. Box 5926, Kingwood, Tex. 77325; en 3-Dimensional Pharmaceuticals, Inc., 665 Stockton Drive, Suite 104, Exton, Pa. 19341-1151; en Tripos, Inc., 1699 Hanley Rd., St. Louis, Mo., 63144-2913, etc. Por ejemplo, en el mercado estan disponibles colecciones basadas en acido qumico y acido shikfmico, hidroxiprolina, santonina, dianhidro-D-glucitol, acido hidroxipipecolmico, andrografolida, una coleccion basada en el acido piperazin-2-carboxflico, citosina, etc.
Los agentes candidatos pueden ser ADNc de una genoteca de expresion de ADNc preparada a partir de celulas, por ejemplo, de celulas pluripotentes. Dichas celulas pueden ser celulas madre embrionarias, ovocitos, blastomeros, teratocarcinomas, celulas germinales embrionarias, celulas de la masa celular interna, etc.
Se apreciara que el agente candidato de reprogramacion que se va a ensayar normalmente es aquel que no esta presente en un medio de cultivo habitual, o que si esta presente, esta presente en unas cantidades menores de las que se usan en los metodos divulgados en el presente documento.
Tambien se apreciara que no es necesario que un agente de reprogramacion util u otra forma de tratamiento de reprogramacion sea capaz de reprogramar todos los tipos de celulas somaticas, ni que sea capaz de reprogramar todas las celulas somaticas de un tipo celular dado. Sin limitacion, es de utilidad un agente candidato que de como resultado una poblacion que esta enriquecida en celulas reprogramadas en un factor de 2, de 5, de 10, de 50, de 100 o mas (es decir, la fraccion de celulas reprogramadas en la poblacion es 2, 5, 10, 50 o 100 veces mas que la presente en una poblacion de celulas de partida tratada de la misma forma pero que no haya entrado en contacto con el agente candidato).
El metodo de cribado puede usarse para la identificacion de un agente o de una combinacion de agentes que sustituye al Klf4 en la reprogramacion de las celulas a un estado de tipo ES. El metodo puede llevarse a la practica mediante el uso de celulas somaticas modificadas para que expresen Sox2 y Oct4 y poniendolas en contacto con un activador de la ruta de la Wnt. El metodo puede usarse para la identificacion de un agente que sustituye al Sox2 en la reprogramacion de las celulas a un estado de tipo ES. El metodo puede llevarse a la practica mediante el uso de celulas somaticas modificadas para que expresen Klf4 y Oct4 y poniendolas en contacto con un activador de la ruta de la Wnt. El metodo puede usarse para la identificacion de un agente que sustituye al Oct4 en la reprogramacion de las celulas a un estado de tipo ES. El metodo puede llevarse a la practica mediante el uso de celulas somaticas modificadas para que expresen Sox2 y Klf4 y poniendolas en contacto con un activador de la ruta de la Wnt. Se contempla que la expresion modificada de Klf4, de Sox2, de Oct4 y de c-Myc se sustituya mediante el tratamiento de las celulas somaticas con una combinacion de moleculas pequenas y/o de polipeptidos o de otros agentes que no impliquen una modificacion del genoma. Los metodos pueden llevarse a la practica mediante el uso de celulas humanas, de celulas de raton o de celulas de un primate no humano.
Algunos de los metodos divulgados en el presente documento engloban el ensayo de moduladores de la ruta de la Wnt, por ejemplo, colecciones de moleculas pequenas de las que se sabe o se sospecha que modulan la ruta de la Wnt, para identificar aquellas que son eficaces en la mejora de la reprogramacion y/o que tienen una capacidad superior para mejorar la reprogramacion de celulas somaticas a pluripotencia, por ejemplo, con respecto a otros compuestos ensayados. En algunas realizaciones, se ensayan al menos 10, al menos 20, al menos 50, al menos 100 o al menos 1.000 moleculas pequenas, por ejemplo, moleculas relacionadas estructuralmente, al menos algunas de las cuales se sabe o se cree que modulan la actividad de la ruta de la Wnt. Un inhibidor de la Wnt puede usarse para confirmar que un compuesto que mejora la reprogramacion y que es sospechoso de hacerlo mediante la
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modulacion de la actividad de la ruta de la Wnt actua de hecho a traves de la ruta de la Wnt. Por ejemplo, si el inhibidor de la ruta de la Wnt bloquea el efecto de un compuesto de ensayo sobre la reprogramacion, puede concluirse que el compuesto de ensayo actua traves de la ruta de la Wnt.
Los metodos y las composiciones de la presente invencion relacionados con la modulacion de la ruta de la Wnt puede ser aplicados o usarse junto con otros diversos metodos y composiciones utiles para la reprogramacion de celulas somaticas y/o para la identificacion de agentes de reprogramacion para su uso en la reprogramacion de celulas somaticas. Por ejemplo, algunas realizaciones de la invencion emplean unos tipos de celulas (por ejemplo, celulas madre neurales o celulas progenitoras) que expresan de forma natural uno o mas factores de reprogramacion a unos niveles mayores de los que dichos factores son expresados en otros muchos tipos de celulas (vease, por ejemplo, Eminli, et al., Reprogramming of Neural Progenitor Cells in iPS Cells in the Absence of Exogenous Sox2 Expression, Stem Cells. 17 de julio de 2008, publicacion electronica antes de impresion).
Los metodos y las composiciones pueden usarse junto con los metodos y las composiciones divulgados en el documento PCT/US2008/004516:
se han derivado celulas somaticas "secundarias" geneticamente homogeneas que portan factores de reprogramacion en forma de transgenes definidos inducibles por doxiciclina (dox) Wernig, et al., A novel drug- inducible transgenic system for direct reprogramming of multiple somatic cell types. Nature Biotechnology; publicacion electronica del 1 de julio de 2008; doi:10.1038/nbt1483). Estas celulas se produjeron mediante la infeccion de fibroblastos con lentivirus inducibles por dox, una reprogramacion mediante la adicion de dox, seleccionando las celulas madre pluripotentes inducidas y produciendo ratones quimericos. Las celulas derivadas de estas quimeras se reprograman tras la exposicion a dox sin la necesidad de una infeccion vmca, con unas eficacias 25 y 50 veces mayores que las observadas mediante el uso de una infeccion directa y una seleccion farmacologica para la reactivacion del marcador de pluripotencia. En algunas realizaciones de la invencion, dichas celulas somaticas secundarias se usan en realizaciones de la presente invencion y/o se generan celulas somaticas secundarias sin el uso de un virus c-Myc mediante el empleo de una estimulacion de la ruta de la Wnt segun se describe en el presente documento. La presente invencion contempla el uso de la modulacion de la ruta de la Wnt en composiciones y metodos relacionados con celulas somaticas secundarias.
En algunas realizaciones de la invencion, las celulas somaticas contienen una secuencia de acidos nucleicos que codifica para un marcador seleccionable, unido operativamente a un promotor de un gen de pluripotencia endogeno, por ejemplo, Oct4 o Nanog. La secuencia que codifica para el marcador puede ser integrada en el genoma en un locus endogeno. El marcador seleccionable puede ser, por ejemplo, una protema facilmente detectable, tal como una protema fluorescente, por ejemplo, la GFP o un derivado de la misma. La expresion del marcador es indicativa de reprogramacion, y por lo tanto puede usarse para la identificacion o la seleccion de las celulas reprogramadas, para la cuantificacion de la eficacia de reprogramacion y/o para la identificacion, la caracterizacion o el uso de agentes que mejoran la reprogramacion y/o cuya capacidad para mejorar la reprogramacion se esta ensayando.
Celulas somaticas reprogramadas y usos de las mismas
En el presente documento se divulgan celulas somaticas reprogramadas (RSC), que incluyen celulas madre pluripotentes inducidas (celulas iPS), producidas mediante los metodos de la invencion u otros metodos divulgados en el presente documento. Estas celulas tienen numerosas aplicaciones en medicina, agricultura y otras areas de interes, algunas de las cuales se describen aqrn.
Tambien se divulgan metodos para el tratamiento o la prevencion de una afeccion en un mairnfero. Los metodos pueden implicar la obtencion de celulas somaticas a partir del individuo, la reprogramacion de las celulas somaticas asf obtenidas mediante los metodos de la presente invencion para obtener RSC, por ejemplo, celulas iPS. Las RSC se cultivan despues en unas condiciones adecuadas para su desarrollo en celulas de un tipo celular deseado. Las celulas desarrolladas del tipo celular deseado se introducen en el individuo para el tratamiento de la afeccion. Alternativamente, los metodos pueden comenzar con la obtencion de celulas somaticas a partir del individuo, la reprogramacion de las celulas somaticas asf obtenidas mediante los metodos de la presente invencion. Despues, las RPC se cultivan en unas condiciones adecuadas para que las RPC se desarrollen en un organo deseado, que es recogido e introducido en el individuo para el tratamiento de la afeccion. La afeccion puede ser cualquier afeccion en la que una celula o un organo tiene un funcionamiento normal y/o unos niveles reducidos por debajo de lo normal. Por lo tanto, en el presente documento se divulgan las etapas de obtencion de las celulas somaticas a partir de un individuo en necesidad de una terapia celular, la reprogramacion de las celulas mediante un proceso que comprende la activacion de una ruta de la Wnt y/o el cultivo de las celulas en medio condicionado de Wnt, opcionalmente la diferenciacion de las celulas somaticas reprogramadas para generar celulas de uno o mas tipos celulares deseados, y la introduccion de las celulas en el individuo. Un individuo en necesidad de terapia celular puede padecer cualquier afeccion, en la que la afeccion o uno o mas smtomas de la afeccion pueden ser aliviados mediante la administracion de las celulas al donante y/o en la que la progresion de la afeccion puede ser ralentizada mediante la administracion de las celulas al individuo. El metodo puede incluir una etapa de identificacion o de seleccion de las celulas somaticas reprogramadas y de su separacion de las celulas que no estan reprogramadas.
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Las RSC pueden ser celulas de tipo ES, denominadas tambien celulas iPS, y por lo tanto pueden ser inducidas para que se diferencien para obtener los tipos celulares deseados segun los metodos conocidos para la diferenciacion de celulas ES. Por ejemplo, las celulas iPS pueden ser inducidas para que se diferencien en celulas madre hematopoyeticas, en celulas musculares, en celulas musculares cardiacas, en celulas hepaticas, en celulas pancreaticas, en celulas de cartflago, en celulas epiteliales, en celulas del tracto urinario, en celulas del sistema nervioso (por ejemplo, en neuronas) etc., mediante el cultivo de dichas celulas en un medio de diferenciacion y en unas condiciones que proporcionen la diferenciacion celular. El medio y los metodos que dan como resultado la diferenciacion de celulas madre embrionarias obtenidas mediante el uso de los metodos tradicionales son conocidos en la materia, al igual que las condiciones de cultivo adecuadas. Dichos metodos y condiciones de cultivo pueden aplicarse a las celulas iPS obtenidas segun la presente invencion. Vease, por ejemplo, Trounson, A., The production and directed differentiation of human embryonic stem cells, Endocr Rev. 27 (2): 208-19, 2006 y las referencias del mismo, para algunos ejemplos. Vease tambien Yao, S., et al, Long-term self-renewal and directed differentiation of human embryonic stem cells in chemically defined conditions, Proc Natl Acad Sci EE.UU., 103 (18): 6907-6912, 2006 y las referencias del mismo.
Por lo tanto, mediante el uso de los metodos y los medios de cultivo conocidos, el experto en la materia puede cultivar las celulas pluripotentes reprogramadas para obtener los deseados tipos celulares diferenciados, por ejemplo, celulas neurales, celulas musculares, celulas hematopoyeticas, etc. Las celulas en cuestion pueden usarse para obtener cualquier tipo celular diferenciado deseado. Dichas celulas humanas diferenciadas proporcionan una multitud de oportunidades terapeuticas. Por ejemplo, las celulas madre hematopoyeticas humanas derivadas de las celulas reprogramadas segun la presente invencion pueden usarse en tratamientos medicos que requieren un trasplante de medula osea. Dichos procedimientos se usan para el tratamiento de muchas enfermedades, por ejemplo, de canceres en fase terminal y de neoplasias tales como la leucemia. Dichas celulas tambien son de utilidad para el tratamiento de la anemia, de enfermedades que comprometen el sistema inmunitario, tales como el SIDA, etc. Los metodos divulgados en el presente documento tambien pueden usarse para el tratamiento, la prevencion o la estabilizacion de una enfermedad neurologica tal como la enfermedad de Alzheimer, la enfermedad de Parkinson, la enfermedad de Huntington o la ELA, de enfermedades de almacenamiento lisosomico, de la esclerosis multiple o de una lesion de la medula espinal. Por ejemplo, pueden obtenerse celulas somaticas a partir del individuo que necesita el tratamiento, y reprogramarse para que consigan una pluripotencia, y cultivarse para que deriven en celulas del neurectodermo que pueden usarse para sustituir o ayudar al normal funcionamiento del tejido enfermo o danado.
Las celulas reprogramadas que producen un factor de crecimiento o una hormona, tal como insulina, etc., pueden ser administradas a un marnffero para el tratamiento o la prevencion de trastornos endocrinos. Las celulas epiteliales reprogramadas pueden ser administradas para reparar danos en el revestimiento de una cavidad corporal o de un organo, tal como un pulmon, el intestino, una glandula exocrina o el tracto urogenital. Tambien se contempla que las celulas reprogramadas puedan ser administradas a un mairnfero para el tratamiento de una lesion o de una deficiencia en las celulas de un organo tal como la vejiga, el cerebro, el esofago, una trompa de Falopio, el corazon, el intestino, la vesfcula biliar, el rinon, el tugado, el pulmon, los ovarios, el pancreas y, la prostata, la medula espinal, el bazo, al estomago, los testfculos, el timo, la tiroides, la traquea, un ureter, la uretra o el utero.
La presente invencion tiene el potencial de proporcionar un suministro esencialmente ilimitado de celulas geneticamente compatibles adecuadas para su trasplante. Dicho suministro abordana el significativo problema relacionado con los actuales metodos de trasplante, es decir, el rechazo del tejido trasplantado que puede producirse debido a un rechazo del hospedador frente al injerto o del injerto frente al hospedador. Las RSC tambien pueden combinarse con una matriz para formar un tejido o un organo in vitro o in vivo que puede usarse para reparar o sustituir un tejido o un organo en un receptor marnffero. Por ejemplo, pueden cultivarse las RSC in vitro en presencia de una matriz para producir un tejido o un organo del sistema urogenital, cardiovascular o musculoesqueletico. Alternativamente, puede administrarse una mezcla de las celulas y una matriz a un marnffero para la formacion del tejido deseado in vivo. Las RSC producidas segun la invencion pueden usarse para producir celulas diferenciadas modificadas geneticamente o transgenicas, por ejemplo, mediante la introduccion de un gen o genes deseados, o mediante la eliminacion de todos o de parte de un gen o genes endogenos de las RSC producidas segun la invencion, y permitiendo que dichas celulas se diferencien en el tipo celular deseado. Un metodo para conseguir dicha modificacion es mediante una recombinacion homologa, tecnica que puede usarse para insertar, delecionar o modificar un gen o genes en un sitio o sitios espedficos del genoma.
Esta metodologfa puede usarse para sustituir genes defectuosos o para introducir genes que dan como resultado la expresion de protemas terapeuticamente beneficiosas tales como factores de crecimiento, hormonas, linfocinas, citocinas, enzimas, etc. Por ejemplo, puede introducirse el gen que codifica para el factor de crecimiento cerebral en celulas embrionarias o de tipo madre humanas, diferenciarse las celulas en celulas neurales y trasplantarse las celulas un paciente con Parkinson para retrasar la perdida de las celulas neurales durante dicha enfermedad. Mediante la utilizacion de metodos conocidos para la introduccion de los genes/mutaciones deseados en las celulas ES, las RSC puede ser modificadas geneticamente, y las celulas modificadas resultantes diferenciarse en los tipos celulares deseados, por ejemplo, en celulas hematopoyeticas, en celulas neurales, en celulas pancreaticas, en celulas de cartflago, etc. Algunos genes que pueden ser introducidos en las RSC incluyen, por ejemplo, factor de crecimiento epidermico, factor de crecimiento basico de fibroblastos, factor de crecimiento neurotrofico derivado de
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la glfa, factor de crecimiento insulinoide (I y II), neurotrofina 3, neurotrofina 4/5, factor neurotrofico ciliar, AFT-1, genes de citocinas (interleucinas, interferones, factores estimulantes de colonias, factores de necrosis tumoral (alfa y beta), etc.), genes que codifican para enzimas terapeuticas, colageno, albumina serica humana, etc.
Si se desea pueden usarse los sistemas de seleccion negativa conocidos en la materia para la eliminacion de las celulas terapeuticas de un paciente. Por ejemplo, las celulas transportadas con el gen de la cinasa de timidina (TK) daran lugar a la produccion de celulas embrionarias (por ejemplo, de tipo ES) que contienen el gen de la TK. La diferenciacion de estas celulas dara lugar al aislamiento de las celulas terapeuticas de interes que tambien expresan el gen de la TK. Dichas celulas pueden ser eliminadas selectivamente en cualquier momento de un paciente tras la administracion de ganciclovir. Dicho sistema de seleccion negativa se describe en la Patente de EE.UU. n° 5.698.446. Las celulas pueden ser modificadas para que contengan un gen que codifica para un producto toxico cuya expresion esta bajo el control de un promotor inducible. La administracion del inductor provoca la produccion del producto toxico, dando lugar a la muerte las celulas. Por lo tanto, cualquiera de las celulas somaticas divulgadas en el presente documento puede comprender un gen suicida, contenido opcionalmente en un casete de expresion, que puede estar integrado en el genoma. El gen suicida es aquel cuya expresion sena letal para las celulas. Algunos ejemplos incluyen genes que codifican para la toxina difterica, la toxina colerica, ricino, etc. El gen suicida puede estar bajo el control de elementos de control de la expresion que dirigen la expresion en circunstancias normales en ausencia de un agente o estimulo inductor espedfico. Sin embargo, la expresion puede ser inducida en unas condiciones apropiadas, por ejemplo, (i) mediante la administracion de un agente de induccion apropiado a una celula o un organismo o (ii) si un gen en particular (por ejemplo, un oncogen, un gen implicado en el ciclo de division celular o un gen indicativo de desdiferenciacion o de perdida de diferenciacion) es expresado en las celulas, o (iii) si se pierde la expresion de un gen, tal como un gen de control del ciclo celular o de un gen indicativo de diferenciacion. Vease, por ejemplo, la Patente de EE.UU. n° 6.761.884. El gen puede ser expresado unicamente despues de un acontecimiento de recombinacion mediado por una recombinasa espedfica de sitio. Dicho acontecimiento puede poner la secuencia codificante en una asociacion operativa con elementos de control de la expresion, tales como un promotor. Puede inducirse la expresion del gen suicida si se desea eliminar las celulas (o su progenie) del cuerpo de un sujeto despues de que se hayan administrado las celulas (o sus ancestros) al sujeto. Por ejemplo, si una celula somatica reprogramada da lugar a un tumor, el tumor puede ser eliminado mediante la induccion de la expresion del gen suicida. La formacion de tumores puede estar inhibida debido a que las celulas son eliminadas automaticamente tras su desdiferenciacion o porque pierden el apropiado control del ciclo celular.
Algunos ejemplos de enfermedades, trastornos o afecciones que pueden tratarse o prevenirse incluyen enfermedades, trastornos o afecciones neurologicos, endocrinos, estructurales, esqueleticos, vasculares, urinarios, digestivos, integumentarios, sangumeos, inmunitarios, autoinmunes, inflamatorios, endocrinos, renales, vesiculares, cardiovasculares, cancerosos, circulatorios, digestivos, hematopoyeticos y musculares. Ademas, las celulas reprogramadas pueden usarse para aplicaciones de reconstruccion, tales como la reparacion o la sustitucion de tejidos o de organos. Puede ser ventajosa la inclusion de factores de crecimiento y de protemas o de otros agentes que promuevan la angiogenesis. Alternativamente, la formacion de los tejidos puede efectuarse totalmente in vitro, con los apropiados medios y condiciones de cultivo, factores de crecimiento y matrices polimericas biodegradables.
Con respecto a los metodos terapeuticos divulgados en el presente documento, la administracion de las RSC a un mairnfero no se limita a un modo de administracion, dosis o frecuencia de dosificacion en particular; la presente invencion contempla todos los modos de administracion, incluyendo intramuscular, intravenoso, intraarticular, intralesional, subcutaneo, o cualquier otra via suficiente para proporcionar una dosis adecuada para la prevencion o el tratamiento de una enfermedad. Las RSC pueden ser administradas al mai^ero en una unica dosis o en dosis multiples. Cuando se administran multiples dosis, las dosis pueden estar separadas entre sf por, por ejemplo, una semana, un mes, un ano o diez anos. Tambien pueden administrarse uno o mas factores de crecimiento, hormonas, interleucinas, citocinas u otras celulas antes, durante o despues de la administracion de las celulas para predisponerlas adicionalmente hacia un tipo celular en particular.
Las RSC divulgadas en el presente documento pueden usarse como un modelo de diferenciacion in vitro, en particular para el estudio de los genes que estan implicados en la regulacion del desarrollo temprano. Las celulas de los tejidos y organos diferenciadas generadas mediante el uso de las celulas reprogramadas pueden usarse para estudiar los efectos de farmacos y/o para la identificacion de agentes farmacologicos potencialmente utiles.
Aplicaciones adicionales de los metodos de reprogramacion de celulas somaticas y de las celulas reprogramadas
Los metodos de reprogramacion divulgados en el presente documento pueden usarse para generar RSC, por ejemplo, celulas iPS, para una diversidad de especies animales. Las RSC generadas puede ser utiles para producir los animales deseados. Algunos animales incluyen, por ejemplo, aves y mamnferos, asf como cualquier animal que pertenezca a una especie en peligro. Algunos ejemplos de pajaros incluyen pajaros domesticados (por ejemplo, codornices, pollos, patos, gansos, pavos y gallinas). Algunos ejemplos de marnfferos incluyen murino, caprino, ovino, bovino, porcino, canino, felino y primates no humanos. De estos, algunos miembros preferidos incluyen animales domesticados, que incluyen, por ejemplo, ganado, cerdos, caballos, vacas, conejos, cobayas, ovejas y cabras.
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Metodos para la identificacion de genes
En el presente documento se divulgan metodos para la identificacion de un gen cuya expresion inhibe la generacion de celulas reprogramadas. Un metodo comprende: (i) la activacion de la ruta de la Wnt en celulas somaticas; (ii) la reduccion de la expresion de un gen candidato por parte de un ARNi; (iii) la determinacion de si la reduccion de la expresion del gen candidato da como resultado un aumento en la eficacia de reprogramacion, y si lo hace, la identificacion del gen candidato como aquel cuya expresion inhibe la reprogramacion de celulas somaticas. Un metodo comprende: (i) cultivar las celulas somaticas en medio condicionado de Wnt; (ii) reducir la expresion de un gen candidato mediante un ARNi; (iii) determinar si la reduccion en la expresion del gen candidato da como resultado un aumento en la eficacia de reprogramacion, y si es asf, identificar el gen candidato como aquel cuya expresion inhibe la reprogramacion de celulas somaticas. Opcionalmente las celulas somaticas son modificadas para que expresen al menos un gen seleccionado entre: Oct4, Sox2, Nanog, Lin28 y Klf4. Opcionalmente las celulas se ponen en contacto con un modulador de la ruta de la Wnt. Las colecciones de ARNhc o de ARNip de utilidad en el metodo estan disponibles en el mercado. El gen identificado es un objetivo de inhibicion con objeto de mejorar la reprogramacion celular. Los agentes que inhiben el gen (tanto agentes de ARNi como otros agentes, tales como moleculas pequenas) son de utilidad en la reprogramacion de celulas somaticas, por ejemplo, junto con un activador de la Wnt.
Demostracion
Habiendose descrito ahora la invencion de forma general, sera mas facilmente comprensible mediante referencia a los siguientes ejemplos, que se incluyen con fines meramente ilustrativos de ciertos aspectos y realizaciones de la presente invencion, y no pretenden limitar la invencion.
Materiales y metodos para el Ejemplo 1
Cultivo celular, infecciones vmcas, induccion de la expresion genica. Las celulas se cultivaron en un 15 % de FBS, DMEM-KO, Pen/Estep, glutamina, aminoacidos no esenciales, p-ME y LIF. Se infectaron fibroblastos embrionarios de raton (MEF) con un constructo Oct4-IRES-eGFP (Meissner, A., et al., Nature Biotechnology, Direct reprogramming of genetically unmodified fibroblasts in pluripotent stem cells. Publicado electronicamente: 27 de agosto de 2007 | doi:10.1038/nbt1335) insertado en el locus endogeno Oct4 con vectores lentivmcos que grnan la expresion inducible por doxiciclina de Oct4, Sox2, Klf4 y c-Myc o unicamente de Oct4, Sox2 y Klf4. Los vectores se basaban en el esqueleto del vector lentivmco FUGW (Lois C, et al., Science 2002; 295: 868-872.), modificado para que incluyera un promotor inducible por tet. Dos dfas despues de la infeccion las celulas se dividieron y se indujeron con doxiciclina en presencia o en ausencia de medio condicionado de Wnt3a (usado a una dilucion de 1:1 con medio de ES con 2x de LIF normal). Se controlo la expresion de la GFP de estas celulas mediante una citometna de flujo el dfa 13 y de nuevo el dfa 20. Paralelamente se infectaron MEF con Oct4 inducible por doxiciclina expresado a partir del locus del colageno y Oct4-IRES (resistencia a la neo) insertado en el locus endogeno Oct4 con lentivirus que grnan la sobreexpresion de Sox2, Klf4 y c-Myc o de Sox2 y Klf4. De nuevo, dos dfas despues de la infeccion las celulas se dividieron y se indujeron con doxiciclina en presencia o en ausencia de medio condicionado de Wnt3a. Se seleccionaron placas individuales de estas celulas con G418 el dfa 7 y el dfa 13, respectivamente. Despues de al menos una semana de seleccion con G418, se analizaron y se contaron las colonias resistentes.
Medio condicionado. Se recogio medio condicionado de Wnt 3a (MC) a partir de celulas L de raton que habfan sido transfectadas con ADNc de Wnt3a (Shibamoto et al. 1998). Estas celulas son susceptibles, a traves de ATCC (CRL- 2647) junto con la lmea celular parental no transfectada (CRL-2648), de ser utilizadas para el medio condicionado de control. Las celulas transfectadas con la Wnt3a secretan Wnt, alcanzando unos niveles de hasta 400 ng/ml de la protema Wnt3a en su medio de crecimiento. El medio basal consistfa en DMEM, un 15% de FBS, Pen/Estep, glutamina y aminoacidos no esenciales, preparado segun el protocolo de Singla et al. (Singla, et al., Biochem Biophys Res Commun., 345 (2): 789-95, 2006). El medio recogido de los fibroblastos secretores se filtro y se diluyo a 1:1 con medio regular de celulas ES (15 % de FBS, DMEM-KO, Pen/Estep, glutamina, aminoacidos no esenciales, p-ME y LIF). Despues se uso este medio para tratar las celulas ES. Los Solicitantes y otros han demostrado que el medio condicionado de Wnt3a activa la ruta de senalizacion de la Wnt en celulas ES, segun se demuestra mediante las inmunotransferencias que analizan la fosforilacion de la beta-catenina.
Ejemplo 1: generacion de celulas de tipo ES mediante el uso de medio condicionado de Wnt3a
Formulamos la hipotesis de que la estimulacion de la estimulacion de la ruta de la Wnt mediante el uso de factores solubles podna modular la eficacia de la induccion de pluripotencia en celulas somaticas. Este Ejemplo describe los experimentos iniciales que se llevaron a cabo para determinar el efecto de la estimulacion de la ruta de la Wnt sobre la reprogramacion. Las celulas que contienen un constructo Oct4-IRES-eGFP u Oct4-IRES-neo se infectaron con vectores lentivmcos que codifican para tres o para cuatro factores, como se ha descrito anteriormente. La expresion de los factores de pluripotencia se indujo el dfa 2. En algunos experimentos las celulas se cultivaron en medio condicionado de Wnt3a o en medio no condicionado, segun se muestra en la Figura 4A (parte superior) desde los dfas 2-13. La expresion de la GFP se analizo mediante un FACS los dfas 13 y 20. En otros experimentos, las celulas se cultivaron en medio condicionado de Wnt3a o en medio no condicionado, segun se muestra en la Figura 4A
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(parte inferior) desde los dfas 2-13 o 2-20. La seleccion con G418 se impuso el dfa 7 o 13. Las colonias supervivientes se contaron el dfa 20.
Los resultados demostraron que el medio condicionado de Wnt 3a aumenta la tasa de formacion de iPS en fibroblastos transducidos con los cuatro factores de transcripcion de reprogramacion. Segun se muestra en la Figura 4B, la Wnt3a promueve la formacion de celulas iPS en celulas que sobreexpresan Oct4, Sox2, Klf4 y c-Myc. Las celulas seleccionables que sobreexpresan Oct4, Sox2, Klf4 y c-Myc formaron robustas colonias resistentes a la G418 mas tempranamente en presencia de medio condicionado de Wnt3a que en ausencia de este medio. Cuando se seleccionaron el dfa 7, solo se formaron pequenas colonias en ausencia de Wnt, ninguna de las cuales pudo ser propagada en cultivo. Las colonias formadas en presencia de medio condicionado de Wnt en este punto eran mayores y podfan ser pasadas en forma de clones. Cuando la seleccion comenzaba el dfa 13, se observaban colonias en ausencia de medio condicionado de Wnt3a que pudieron ser propagadas. Aunque habfa menos colonias en este punto temporal en presencia de medio condicionado de Wnt que en ausencia de medio condicionado de Wnt, las colonias que se formaron eran grandes, relativamente homogeneas de aspecto y de nuevo podfan ser mantenidas en cultivo. Este resultado sugiere que el medio condicionado de Wnt3a no solo aumentaba la tasa de reprogramacion, sino que tambien seleccionaba las colonias de celulas reprogramadas.
El medio condicionado de Wnt3a tambien permite que se formen las celulas iPS sin la adicion del factor de transcripcion oncogenico c-Myc. Mientras que en nuestro experimento inicial no se formaron celulas iPS cuando los fibroblastos fueron transducidos con Oct4, Sox2 y Klf4, sf que observamos colonias iPS con estos tres factores cuando las celulas se cultivaban en medio condicionado de Wnt3a. Estas colonias paredan ser verdaderas celulas iPS basandose en la morfologfa y en la activacion del locus endogeno Oct4, un acontecimiento restringido normalmente a las celulas pluripotentes. Segun se muestra en la Figura 4C, en presencia de medio condicionado de Wnt3a se observaron robustas colonias resistentes a neo en las celulas que sobreexpresan Oct4, Sox2, Klf4 seleccionadas tanto el dfa 7 como el dfa 13. En ausencia de medio condicionado de Wnt, se encontro que ninguna celula no infectada con el virus c-Myc era resistente a la neo en ningun punto temporal. Sin seleccion, se encontro que las celulas Oct4-IRES-eGFP infectadas con los lentivirus Sox2 y Klf4 expresaban la GFP (indicativo de la activacion del locus endogeno Oct4) alrededor del dfa 20 unicamente en presencia de medio condicionado de Wnt.
Analisis
Los hallazgos descritos anteriormente son significativos por al menos dos razones principales. En primer lugar, existe un gran interes en la creacion de celulas iPS que no tengan interacciones vmcas del factor de transcripcion oncogenico c-Myc. Los ratones quimericos con celulas iPS creados con Myc muestran unas elevadas tasas de cancer asociado con la reactivacion somatica del virus c-Myc. Incluso in vitro apreciamos que las lmeas celulares iPS generadas con el virus c-Myc contienen una poblacion mixta, teniendo algunas celulas un aspecto morfologicamente mucho mas parecido a las celulas ES y creciendo otras mas como celulas transformadas cancerosas. Nuestros resultados obtenidos hasta ahora indican que las lmeas iPS creadas sin c-Myc en medio condicionado de Wnt3a parecen ser mas homogeneamente de tipo ES en su morfologfa. En segundo lugar, el medio condicionado de Wnt3a parece ejercer un efecto selectivo que favorece la formacion de grandes colonias homogeneas. El uso de medio condicionado de Wnt3a o de activadores de la ruta de la Wnt3a podna usarse por lo tanto como un proceso de seleccion alternativo en lugar de imponer una etapa de seleccion que requiere una modificacion genetica de las celulas somaticas iniciales. El uso de medio condicionado de Wnt3a o de activadores de la ruta de la Wnt3a durante la reprogramacion nos proporcionana por tanto una mejora valiosa para cualquier metodo de reprogramacion de celulas somaticas conocido actualmente en la materia o desarrollado en el futuro.
Materiales y metodos para los Ejemplos 2-8
Cultivo celular.
Se cultivaron celulas murinas V6.5 (C57BL/6-129) ES y celulas iPS en las condiciones tfpicas de ES en fibroblastos embrionarios de raton irradiados (MEF). Los MEF transgenicos usados en las infecciones con lentivirus inducibles con DOX (T. Brambrink, R. Foreman, Cell Stem Cell 2, 151-159 (2008)) se recogieron en 13.5dpc y se seleccionaron con 2 |jg/ml de puromicina a partir de los embriones despues de la inyeccion de celulas ES inducibles con Oct4- IRES-GFPneo/Oct4 (M. Wernig, A. Meissner, Nature 448, 318-324 (2007).) o se recogieron a partir de cruces de F1 entre ratones R26-M2rtTA (C. Beard, K. Hochedlinger, Genesis 44, 23-28 (2006)) y ratones Oct4-GFP (A. Meissner, M. Wernig, Nat Biotechnol 25, 1177-1181 (2007). Se genero medio condicionado de Wnt3a y medio condicionado de control segun los protocolos habituales (ATcC) (K. Willert, J. D. Brown, Nature 423, 448-452 (2003), descrito tambien anteriormente) y se uso en una proporcion de 1:1 con medio estandar de celulas ES). Se disolvio el inhibidor de la Wnt ICG-001 en DMSO hasta una concentracion madre de 0,1 M. La concentracion final de trabajo del inhibidor de la Wnt era de 4 jM.
Transduccion vmca.
Se usaron constructos lentivmcos inducibles por tetraciclina que expresan los ADNc de Oct4, K1f-4, Sox2 y c-Myc como se ha descrito previamente (Brambrink, supra). El virus se preparo mediante la transfeccion de celulas
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FIEK293T con una mezcla del plasmido vmco y de constructos empaquetados que expresaban las funciones de empaquetado vmcas y la protema VSV-G (Fugene, Roche). El medio se sustituyo 24 horas despues de la transfeccion y los sobrenadantes vmcos se recogieron a las 48 horas y a las 72 horas. Despues de la filtracion, los sobrenadantes se agruparon y se cultivaron 2,5 x 105 MEF con los sobrenadantes vmcos y medio reciente a una proporcion de 1:1 durante 24 horas. Despues, las celulas infectadas se dividieron en unas proporciones de entre 1:5 y 1:12 en placas de 10 cm recubiertas con gelatina. Un dfa despues de la division, el medio de ES se complemento con 2 |jg/ml de DOX y, en las placas apropiadas, con medio condicionado y/o con un inhibidor qmmico.
Inmunotincion y celulas de anticuerpos se tineron segun se ha descrito previamente (Wernig, supra). Se usaron anticuerpos contra Nanog (Betil) y SSEA1 (R&D systems, Minneapolis, MN) segun las recomendaciones del proveedor.
Formacion de teratomas
Se ensayo la formacion de teratomas como se ha descrito previamente. En resumen, las celulas se tripsinizaron y se inyectaron 5 x 105 celulas subcutaneamente en ratones sClD. Despues de 14-21 dfas, se extrajeron los teratomas, se fijaron en formalina al 10 % tamponada con fosfato durante una noche y posteriormente se incluyeron en cera de parafina mediante el uso de una maquina de inclusion Tissue-Tek VIP (Miles Scientific, Naperville, IL) y un Thermo Shandon Histocenter 2 (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA). Las secciones se cortaron con un espesor de 2 jm mediante el uso de un Leica RM2065 (Leica, Wetzlar, Alemania) y se tineron con hematoxilina y eosina (K. Hochedlinger, Y. Yamada, Cell 121, 465-477 (2005).
Inyeccion en los blastocistos. Las inyecciones de las celulas iPS en blastocistos de hospedadores Balb/c se llevaron a cabo como se ha descrito anteriormente (Beard, supra).
Ejemplo 2: experimentos adicionales relacionados con la generacion de celulas de tipo ES mediante el uso de medio condicionado de Wnt3a
Para definir adicionalmente el efecto de la Wnt3a sobre la reprogramacion, infectamos MEF que portan un ADNc de Oct4 inducible con doxicilina (DOX) (Hochedlinger, 2005) con vectores lentivmcos inducibles con DOX que codifican para Sox2, Klf4 y c-Myc (Brambrink, et al., 2008). Estas celulas tambien conteman un casete de resistencia a la G418 en el locus endogeno Oct4 que permite la seleccion farmacologica de las celulas iPS (Meissner et al., 2007).
Se indujo la expresion de cuatro factores mediante la adicion de DOX en celulas cultivadas en presencia o en ausencia de medio condicionado de Wnt3a (MC de la Wnt3a), la seleccion con G418 se inicio despues de 5 dfas y el numero de colonias resistentes al farmaco se determino 24 dfas despues de la induccion (Figura 1 a). La Figura 1 b muestra que el numero total de colonias resistentes al farmaco aumento mas de 7 veces cuando las celulas eran cultivadas en el MC de la Wnt3a. Tambien apreciamos que las colonias resistentes al farmaco eran mas grandes y mas de tipo ES en su morfologfa cuando se cultivaban en el MC de la Wnt3a con respecto a un medio de celulas ES (Figura 1 c). Adicionalmente, las colonias que aparedan en el MC de la Wnt3a con la seleccion con G418 iniciada el dfa 5 podfan ser propagadas adicionalmente, al contrario que las pequenas colonias derivadas en medio de celulas ES estandar.
Dado que el MC de la Wnt3a tema un efecto positivo sobre la reprogramacion en concierto con los cuatro factores de transcripcion, a continuacion analizamos si el MC de la Wnt3a podna ser sustituido por cualquiera de los factores nucleares. En experimentos paralelos transdujimos fibroblastos con subconjuntos de factores de transcripcion, y los observamos en presencia y en ausencia de MC de la Wnt3a (Figuras 1 d y 1 e). No se formaron colonias resistentes en ausencia de una infeccion por Oct4 o Klf4. Se observo una colonia en ausencia del retrovirus Sox2, pero esta colonia no pudo ser propagada adicionalmente en las condiciones de cultivo de las celulas ES. Por el contrario, en presencia del MC de la Wnt3a, se formaron multiples y robustas colonias resistentes a la G418 en ausencia de c- Myc en las celulas que sobreexpresan Oct4, Sox2 y Klf4 (Figuras 1 d y 1 e). De forma similar a las colonias de MEF transducidas con los cuatro factores, estas lmeas iPS pudieron ser propagadas en medio de celulas ES estandar sin ninguna seleccion adicional y conservaron la morfologfa de las celulas ES. En experimentos repetidos se formaron ocasionalmente colonias resistentes a la G418 sin ninguna transduccion con c-Myc en ausencia del MC de la Wnt3a. Sin embargo, de forma coherente con los informes publicados (8, 9), estas colonias eran raras. En lo sucesivo, las celulas iPS generadas unicamente con tres factores y sin c-Myc se denominaron celulas Myc['] iPS.
Para analizar mas estrechamente los efectos del tratamiento con el MC de la Wnt3a sobre el proceso de reprogramacion, se cultivaron MEF que sobreexpresan Oct4/Sox2/KIf4 y Oct4/Sox2/KIf4/c-Myc con y sin el MC de la Wnt3a, y la seleccion con G418 se inicio en diferentes momentos despues de la adicion de la DOX. La Figura If muestra que cuando se cultivaron celulas que sobreexpresan tres factores en el medio MC de la Wnt3a, aparedan aproximadamente 3 veces mas colonias Myc['] iPS cuando se anadio G418 el dfa 5 y aproximadamente 20 veces mas colonias que cuando se anadio G418 el dfa 10 despues de la induccion en comparacion con el cultivo en medio de celulas ES (Figura If, panel izquierdo). El medio MC de la Wnt3a tambien aumento el numero de colonias resistentes al farmaco tras la induccion de los cuatro factores, a pesar de que el aumento era menos pronunciado que en las celulas inducidas con tres factores (Figura If, panel derecho). Estos resultados indican que el MC de la
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Wnt3a aumento el numero de colonias resistentes a farmacos en las celulas inducidas tanto con los tres factores como con los cuatro factores, con el efecto mas pronunciado en las celulas que sobreexpresan los tres factores con la seleccion aplicada en el ultimo punto temporal.
Ejemplo 3: generacion de clones de Myc[-] iPS sin seleccion genetica.
Recientemente se han generado celulas iPS sin el retrovirus c-Myc (Myc[-]), pero en ausencia de un c-Myc exogeno la eficacia y la cinetica de la reprogramacion se reducen significativamente (Nakagawa et al., 2008; Wernig et al., 2008). Ensayamos si el MC de la Wnt3a tambien podna ayudar en la generacion de celulas iPS en ausencia de una seleccion para la reactivacion de Oct4. Para esto se utilizaron celulas con una GFP guiada por el promotor endogeno Oct4 (Meissner, et al., 2008). Se analizo la expresion de la GFP en las celulas infectadas Oct4/Sox2/KIf4 con y sin un tratamiento con el MC de la Wnt3a mediante una citometna de flujo los dfas 10, 15 y 20 despues de la induccion con DOX. No habfa presentes celulas positivas para la GFP con o sin un tratamiento con el MC de la Wnt3a el dfa 10 ni el dfa 15. Alrededor del dfa 20 se detecto una pequena poblacion de celulas que expresan la GFP en las celulas cultivadas en el MC de la Wnt3a, pero no en el medio de ES estandar (Figura 1 g). Los cultivos expuestos al MC de la Wnt3a formaron colonias que expresaban la GFP con una morfologfa tfpica de las celulas ES o iPS (Figura 1 h). Sin embargo, al contrario que las celulas transducidas con los cuatro factores, que habitualmente forman una poblacion muy heterogenea de celulas cuando se propagan sin seleccion, las colonias de Oct4/Sox2/KIf4/MC en Wnt3a paredan homogeneamente de tipo ES similares a los clones de Myc[-] iPS notificados previamente (Nakagawa, et al., 2008.
Ejemplo 4: potencial de desarrollo de las celulas Myc[-] iPS derivadas con MC de la Wnt3a
Se llevaron a cabo varios ensayos para caracterizar el potencial de desarrollo de las celulas Myc[-] iPS derivadas con un tratamiento con el MC de la Wnt3a. La inmunocitoqmmica confirmo la expresion de los marcadores de pluripotencia, incluyendo el factor nuclear Nanog (Figuras 2 a y 2 b) y la glicoprotema de superficie SSEA1 (Figuras 2 c y 2 d). Los ensayos funcionales confirmaron que, al igual que las celulas ES, estas celulas iPS eran pluripotentes. Cuando se inyectaron subcutaneamente en ratones SCID, las celulas Myc[-] iPS dieron lugar a teratomas con pruebas histologicas de celulas diferenciandose en las tres capas germinales (Figuras 2 e, 2 f y 2 g). Lo mas importante, las celulas Myc[-] iPS derivadas con un tratamiento con el MC de la Wnt3a contribuyeron a la formacion de tejidos diferenciados en ratones quimericos (Figura 2 h). Estos resultados indican que los clones Myc[-] tratados con el MC de la Wnt3a son celulas pluripotentes que son morfologica y funcionalmente indistinguibles de las celulas ES.
Ejemplo 5: efecto de un inhibidor de molecula pequena de la ruta de la Wnt sobre la generacion de celulas iPS Myc[-] e iPS en presencia de MC de la Wnt3a
Para cuantificar los efectos del MC de la Wnt3a, se llevaron a cabo experimentos por triplicado con MEF inducibles con Oct4/Sox2/KIf4 seleccionables con G418 (Figura 3 a). Se anadio G418 a los cultivos 15 dfas despues de la inyeccion para seleccionar las celulas que teman reactivado el locus Oct4. Cuando se puntuaron el dfa 28 despues de la inyeccion, solo se detectaron unas pocas colonias Myc[-] resistentes a la G418 (formandose entre 0-3 colonias sobre cada placa de diez centimetros) en unas condiciones de cultivo de celulas ES estandar. Por el contrario, se formaron ~ 20 veces mas colonias resistentes al farmaco cuando la seleccion con la G418 se inicio en las celulas tratadas con el MC de la Wnt3a, de forma coherente con la conclusion de que la activacion de la ruta de la Wnt mejora la reprogramacion. Debena apreciarse que el medio condicionado de los fibroblastos de control, que carece de una sobreexpresion de la Wnt3a, tambien provoco un aumento moderado en el numero de colonias resistentes a la G418 con respecto al medio de ES estandar, lo que sugiere que los fibroblastos normales pueden secretar factores, que quizas incluyen la Wnt3a, que promueven la reprogramacion.
Para evaluar de forma independiente el efecto de la Wnt3a sobre la reprogramacion, cultivamos celulas en presencia de ICG-001 (Teo et al., 2005; McMillan y Kahn, 2005; vease la Figura 5), un inhibidor de la ruta de la Wnt/p-catenina. La Figura 3 a (columnas de la derecha) muestra que el ICG-001 a 4 pM inhibio fuertemente el efecto del MC de la Wnt3a sobre la formacion de las Myc[-] iPS. Tambien se analizaron los efectos del MC de la Wnt3a y del ICG-001 en MEF que sobreexpresan los cuatro factores de reprogramacion, incluyendo el c-Myc (Figura 3 b). Se observaron grandes cantidades de colonias resistentes a la G418 tanto en el medio de celulas ES estandar como en el MC de la Wnt3a en las celulas reprogramadas con los cuatro factores, con unicamente un sutil aumento en el numero de las colonias con el MC de la Wnt3a. Al contrario que el drastico efecto del ICG-001 sobre las celulas Myc[-], a la misma dosis, el compuesto solo tuvo un sutil efecto sobre el numero de colonias G418 en las celulas transducidas con c- Myc, y se observo un numero relativamente mayor de colonias resistentes en estas condiciones. A unas dosis mayores de ICG-001, se redujo adicionalmente la cantidad de colonias iPS, pero incluso a 25 pM se observaron multiples colonias de iPS Oct4/Sox2/KIf4/c-Myc (datos no mostrados). Estos resultados son coherentes con la nocion de que la Wnt3a puede sustituir, al menos en parte, el papel del c-Myc en la reprogramacion.
Se ha demostrado que la ruta de senalizacion de la Wnt se conecta directamente con el nucleo del circuito regulador de la transcripcion de las celulas ES, lo que sugiere un mecanismo mediante el cual esta ruta podna promover directamente la induccion de pluripotencia en ausencia de una transduccion con c-Myc (Figura 3 c). Se ha
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demostrado que la ruta de senalizacion de la Wnt ruta se conecta directamente con el nucleo del circuito regulador de la transcripcion de las celulas ES, lo que sugiere un mecanismo mediante el cual esta ruta podna promover directamente la induccion de pluripotencia en ausencia de una transduccion con c-Myc (Figura 2 c). En las celulas ES, el Tcf3 ocupa y regula los promotores de Oct4, Sox2 y Nanog (Cole et al., 2008; Tam et al., 2008; Yi et al., 2008). En los MEF, estos factores de transcripcion endogenos de pluripotencia estan silenciados. Durante la reprogramacion, como los Oct4, Sox2 y Klf4 exogenos contribuyen a la reactivacion de los factores de pluripotencia endogenos (Jaenisch y Young, 2008), la senalizacion de la Wnt podna potenciar directamente el efecto de estos factores de transcripcion, como lo hace en las celulas ES (Cole et al., 2008). Adicionalmente o alternativamente, la Wnt podna servir para activar directamente el c-Myc endogeno, sustituyendo asf el c-Myc exogeno. De hecho, el c- Myc es un objetivo bien establecido de la ruta de la Wnt en celulas de cancer colorrectal (He et al., 1998). En las celulas ES, el Tcf3 ocupa el promotor c-Myc, y la Wnt3a contribuye positivamente a la expresion del gen (Cole et al., 2008). El hecho de que la sobreexpresion forzada de c-Myc contrarreste el efecto negativo del inhibidor de la Wnt ICG-001 en el proceso de reprogramacion, sugiere que la estimulacion de la Wnt podna estar actuando cascada arriba del Myc endogeno. Los efectos inducidos por la Wnt sobre la proliferacion celular, mediada por el c-Myc o por otros factores de proliferacion endogenos, podnan ayudar a acelerar la secuencia de acontecimientos que da lugar a la generacion de las colonias de Myc['] iPS.
Una meta importante de la investigacion actual es la identificacion de senales temporales que puedan reprogramar las celulas somaticas, eliminando la necesidad de retrovirus. Los estudios aqu descritos establecen que puede usarse la estimulacion de la Wnt para mejorar la eficacia de reprogramacion junto con factores nucleares, Oct4, Sox2 y Klf4. Al mejorar la eficacia de reprogramacion en ausencia de retrovirus c-Myc, es probable que la Wnt soluble o pequenas moleculas que modulan la ruta de senalizacion de la Wnt resulten utiles junto con otras senales temporales que puedan sustituir al resto de retrovirus.
Ejemplo 6: identificacion de agentes de reprogramacion adicionales
El Ejemplo 3 se ha modificado porque el medio contiene adicionalmente, ademas del MC de Wnt3a, un agente de reprogramacion candidato que se va a ensayar para evaluar su potencial para mejorar o inhibir la reprogramacion. En algunas realizaciones las celulas son infectadas de forma que expresen unicamente 2 de los 3 siguientes factores de reprogramacion: Oct4, Klf4 y Sox2. Se identifican los agentes que mejoran la generacion de celulas reprogramadas (por ejemplo, que aumentan la velocidad con la eficacia de la reprogramacion). El proceso se repite para identificar los agentes capaces de sustituir la expresion modificada de Oct4, Klf4, y/o Sox2 en la reprogramacion de celulas somaticas.
Ejemplo 7: identificacion de agentes de reprogramacion adicionales
El Ejemplo 3 se ha modificado porque el medio MC de Wnt3a contiene adicionalmente un agente de reprogramacion candidato. En algunas realizaciones, las celulas son infectadas de forma que expresen unicamente 1 o 2 de los siguientes factores de reprogramacion: Oct4, Lin28, Sox2 y Nanog (por ejemplo, unicamente Oct4, Oct-4 y Sox2). Se identifican los agentes que mejoran la generacion de celulas reprogramadas. El proceso se repite para identificar los agentes capaces de sustituir la expresion modificada de Oct4, Lin28, Sox2, y/o Nanog en la reprogramacion de celulas somaticas.
Ejemplo 8: uso de un modulador de molecula pequena de la ruta de la Wnt en la reprogramacion
El Ejemplo 3 se repite excepto porque en lugar de usar el MC de la Wnt3a, se usa medio de celulas ES que contienen un activador de molecula pequena de la ruta de la Wnt.
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La practica de la presente invencion empleara, salvo que se indique de otro modo, las tecnicas de genetica con ratones convencionales, biologfa del desarrollo, biolog^a celular, cultivo celular, biologfa molecular, biolog^a transgenica, microbiolog^a, ADN recombinante e inmunolog^a, que estan en la pericia de la tecnica. Dichas tecnicas se describen en la bibliograffa. Vease, por ejemplo, Current Protocols in Cell Biology, ed. by Bonifacino, Dasso, Lippincott-Schwartz, Harford y Yamada, John Wiley and Sons, Inc., Nueva York, 1999; Manipulating the Mouse Embryos, A Laboratory Manual, 3a Ed., de Hogan et al., Cold Spring Contain Laboratory Press, Cold Spring Contain, Nueva York, 2003; Gene Targeting: A Practical Approach, IRL Press at Oxford University Press, Oxford, 1993; y Gene Targeting Protocols, Human Press, Totowa, Nueva Jersey, 2000.
El experto en la materia apreciara facilmente que la presente invencion esta bien adaptada para llevar a cabo los objetos y obtener los resultados y ventajas mencionadas, asf como los inherentes a la misma. Los metodos, los sistemas y los kits son representativos de ciertas realizaciones, son ejemplares y no pretenden ser limitaciones del ambito de la invencion. A los expertos en la materia se les ocurriran modificaciones de la misma y otros usos.
Debena entenderse que los artfculos "un" y "uno/a" segun se usan en el presente documento en la memoria descriptiva y en las reivindicaciones, salvo que claramente se indique lo contrario, incluyen los referentes en plural. Las reivindicaciones o las descripciones que incluyan "o" entre uno o mas miembros de un grupo se consideran satisfechas si uno, mas de uno o todos los miembros del grupo estan presentes en, se emplean en, o estan de otro modo relacionados con, un producto o proceso dado, salvo que se indique lo contrario o sea por lo demas evidente a partir del contexto. La invencion incluye realizaciones en las que exactamente un miembro del grupo esta presente en, se emplea en o esta relacionado de otro modo con, un producto o proceso dado. La invencion tambien incluye realizaciones en las que mas de uno o todos los miembros del grupo estan presentes en, se emplean en, o estan relacionados de otro modo con, un proceso producto dado. Adicionalmente, debe entenderse que la invencion engloba todas las variaciones, combinaciones y permutaciones en las que se introduzcan una o mas limitaciones, elementos, estipulaciones, terminos descriptivos, etc., de una o mas de las reivindicaciones indicadas en otra reivindicacion dependiente de la misma reivindicacion de base (o, segun sea relevante, de cualquier otra reivindicacion) salvo que se indique de otro modo o salvo que fuera evidente para el experto habitual en la materia si pudiera surgir una contradiccion o una incoherencia. Cuando los elementos se presentan en forma de listas, por ejemplo, en grupos de Markush o en un formato similar, debe entenderse que cada subgrupo de elementos tambien esta divulgado, y que cualquier elemento puede ser eliminado del grupo. Debena entenderse que, en general, cuando se indica que la invencion, o los aspectos de la invencion, comprenden elementos, caractensticas, etc., particulares, ciertas realizaciones de la invencion o aspectos de la invencion consisten, o consisten esencialmente en, dichos elementos, caractensticas, etc. Con el fin de simplificar, esas realizaciones no se han establecido espedficamente en cada caso en el presente documento. Debena entenderse que cualquier realizacion de la invencion puede ser explfcitamente excluida de las reivindicaciones, independientemente de si la exclusion espedfica esta mencionada en la memoria descriptiva. Por ejemplo, puede excluirse cualquier modulador de la Wnt, por ejemplo, cualquier agente activador de la ruta de la Wnt, cualquier tipo de celula somatica, cualquier agente de reprogramacion, etc.
Cuando en el presente documento se proporcionan intervalos en el presente documento, la invencion incluye las realizaciones en las que estan incluidos los puntos terminales, las realizaciones en las que ambos puntos terminales estan excluidos y las realizaciones en las que se incluye un punto terminal y el otro se excluye. Debena asumirse que ambos puntos terminales estan incluidos salvo que se indique de otro modo. Adicionalmente, debe entenderse que, salvo que se indique de otro modo o sea por lo demas evidente a partir del contexto y segun la comprension del experto habitual en la materia, los valores que estan expresados en forma de intervalos pueden asumir cualquier valor o subintervalo espedfico de los intervalos establecidos en las diferentes realizaciones de la invencion, hasta un decimo de la unidad del lfmite inferior del intervalo, salvo que el contexto lo indique claramente de otro modo. Tambien debe entenderse que cuando se establece una serie de valores numericos en el presente documento, la invencion incluye las realizaciones que se refieren de forma analoga a cualquier valor o intervalo interviniente definido por dos valores cualesquiera de la serie, y que el valor mas bajo puede tomarse como un mmimo y el valor mas alto puede tomarse como un maximo. Los valores numericos, segun se usa en el presente documento, incluyen los valores expresados en forma de porcentajes. Para cualquier realizacion de la invencion en la que un valor numerico esta precedido por "aproximadamente", la invencion incluye una realizacion en la que se indica el valor exacto. Para cualquier realizacion de la invencion en la que un valor numerico no esta precedido por "aproximadamente", la invencion incluye una realizacion en la que el valor esta precedido por "aproximadamente". "Aproximadamente" pretende incluir las cifras que estan en un intervalo de ± 10% de una cifra, en algunas realizaciones en el ± 5 % de una cifra, en algunas realizaciones en el ±1 %, de una cifra, en algunas realizaciones en el ± 0,5 % de una cifra, en algunas realizaciones en el ±0,1 % de una cifra salvo que se indique de otro modo o sea por lo demas evidente a partir del contexto (excepto cuando dicha cifra exceda de forma no permisible el 100 % de un posible valor).
Algunas de las reivindicaciones se presentan en una forma dependiente por conveniencia, pero el Solicitante se reserva el derecho de volver a redactar cualquier reivindicacion dependiente de una forma independiente para que incluya las limitaciones de la reivindicacion independiente y cualquier otra reivindicacion de la cual dependa dicha reivindicacion, y dicha reivindicacion vuelta a redactar debe considerarse equivalente en todos los aspectos a la reivindicacion dependiente en cualquiera que sea su forma (tanto modificada como no modificada) antes de ser
redactada de nuevo en un formato independiente. Tambien debena entenderse que, salvo que se indique claramente lo contrario, en cualquiera de los metodos reivindicados en el presente documento que incluya mas de un acto, el orden de los actos del metodo no se limita necesariamente al orden en el que se indica el acto del metodo, sino que la invencion incluye realizaciones en las que el orden esta asf limitado.
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    REIVINDICACIONES
    1. Un metodo para la reprogramacion de una celula somatica de mamHfero, que comprende poner en contacto la celula somatica de mamnfero con:
    (I) un medio condicionado de Wnt que comprende una concentracion de entre 100 ng/ml y 1.000 ng/ml de protema Wnt3a secretada; un medio no condicionado que comprende al menos un 5 % del medio condicionado en volumen; o un activador de la ruta de la Wnt seleccionado entre el grupo que consiste en: una protema Wnt exogena soluble biologicamente activa que se une a un receptor de la Wnt y activa la ruta de la Wnt, y un antagonista de molecula pequena GSK-3 que activa la ruta de la Wnt seleccionado entre el grupo que consiste en: 6-bromoindirrubin-3'-oxima (BIO); N-(4-metoxibencil)-N-(5-nitro-1,3-tiazol-2-il) urea (AR-AO 14418); 3-(2,4- diclorofenil)-4-(1-metil-1H-indol-3-il)-1H-pirrol-2,5-diona (Sb 216763); 4-bencil-2-metil-1,2,4-tiadiazolidin-3,5-diona (TDZD-8); CHIR-911 y CHIR-837; y
    (II) los factores de reprogramacion Oct4, Klf4 y Sox2, reprogramando asf la celula a un estado pluripotente.
  2. 2. El metodo de la reivindicacion 1, en el que
    (a) el metodo comprende el cultivo de la celula somatica de mairnfero en un medio de cultivo que contiene el activador de la ruta de la Wnt, o
    (b) el metodo comprende el cultivo de la celula somatica de mamffero en un medio de cultivo que comprende el activador de la ruta de la Wnt durante al menos 10 dfas, o
    (c) al poner en contacto la celula somatica de mamffero con el activador de la ruta de la Wnt y los factores de reprogramacion, mejora el numero de celulas somaticas reprogramadas en al menos 5 veces, o
    (d) al poner en contacto la celula somatica de mamffero con el activador de la ruta de la Wnt y los factores de reprogramacion, mejora el numero de celulas somaticas reprogramadas en al menos 10 veces.
  3. 3. El metodo de la reivindicacion 1, en el que la protema Wnt exogena soluble biologicamente activa es la Wnt3a.
  4. 4. El metodo de la reivindicacion 1, en el que la celula somatica de mamnfero
    (a) es una celula humana,
    (b) es una celula humana diferenciada a termino,
    (c) es un fibroblasto,
    (d) esta modificada para que exprese o contenga al menos un factor de reprogramacion en una cantidad mayor de la que habna normalmente presente en las celulas de ese tipo,
    (e) no esta modificada geneticamente,
    (f) no esta modificada geneticamente para que exprese el c-Myc en una cantidad mayor de la que habna normalmente presente en una celula de ese tipo celular, o
    (g) es una celula madre neural o una celula progenitora neural.
  5. 5. El metodo de la reivindicacion 1, que comprende adicionalmente la confirmacion de que la celula reprogramada es pluripotente.
  6. 6. El metodo de la reivindicacion 1, que comprende adicionalmente la diferenciacion de la celula reprogramada a un tipo celular deseado in vitro despues de la reprogramacion de la celula somatica de mamnfero.
  7. 7. El metodo de la reivindicacion 1, en el que el metodo se lleva a la practica sobre
    (a) una poblacion de celulas y el metodo comprende adicionalmente la identificacion de las celulas somaticas reprogramadas mediante criterios morfologicos para las celulas ES, o
    (b) una poblacion de celulas y el metodo no comprende la imposicion de una seleccion qmmica para la seleccion de las celulas reprogramadas, o
    (c) una poblacion de celulas y el metodo comprende adicionalmente la separacion de las celulas que estan reprogramadas a un estado pluripotente a partir de las celulas que no estan reprogramadas a un estado pluripotente.
  8. 8. Un metodo para la identificacion de un modulador de la ruta de la Wnt util para la modulacion de la reprogramacion de celulas somaticas de mamnfero a un estado de tipo ES que comprende:
    (a) el cultivo de una poblacion de celulas somaticas de marnffero en un medio que contiene el modulador de la ruta de la Wnt, en el que las celulas estan modificadas geneticamente o transfectadas temporalmente para que expresen Oct4, Sox2 y Klf4; y
    (b) la determinacion, despues de un periodo de tiempo adecuado, de si estan presentes las celulas que tienen una o mas caractensticas de las celulas ES despues de mantener las celulas y su progenie en cultivo durante un periodo de tiempo adecuado, en el que el modulador de la ruta de la Wnt es identificado como util para la
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    modulacion de la reprogramacion de celulas somaticas de mairnfero a un estado de tipo ES si las celulas que tienen una o mas caractensticas de las celulas ES estan presentes en unas cantidades diferentes de lo que se esperana si el medio no contuviera el modulador de la ruta de la Wnt.
  9. 9. Una composicion que comprende:
    (a) un medio de cultivo celular que contiene un activador de la ruta de la Wnt seleccionado entre el grupo que consiste en: una protema Wnt que se une a un receptor de la Wnt y activa la ruta de la Wnt, y un antagonista de molecula pequena GSK-3 que activa la ruta de la Wnt seleccionado entre el grupo que consiste en: 6- bromoindirrubin-3'-oxima (BIO); N-(4-metoxibencil)-N'-(5-nitro-1,3-tiazol-2-il) urea (Ar-AO 14418); 3-(2,4- diclorofenil)-4-(1-metil-1H-indol-3-il)-H-pirrol-2,5-diona (SB 216763); 4-bencil-2-metil-1,2,4-tiadiazolidin-3,5-diona (TDZD-8); CHIR-911 y CHIR-837; y
    (b) una celula somatica de mai^ero, en la que la celula ha sido modificada para que exprese o contenga uno o mas factores de reprogramacion seleccionados entre el grupo que consiste en: Oct4, Nanog, Sox2, Lin28 y Klf4.
  10. 10. La composicion de la reivindicacion 9, en la que la celula somatica de marnffero se ha modificado para que exprese o contenga los factores de reprogramacion seleccionados entre el grupo que consiste en: (i) Oct4; (ii) Oct4 y Klf4; y (iii) Oct4, Klf4 y Sox2.
  11. 11. La composicion de la reivindicacion 9 o 10, en la que la celula somatica de mamffero no esta modificada geneticamente.
  12. 12. La composicion de la reivindicacion 9, en la que la celula se ha modificado geneticamente para que contenga una secuencia de acidos nucleicos que codifica para un marcador seleccionable unido operativamente a un promotor para un gen de pluripotencia endogeno.
  13. 13. La composicion de cualquiera de las reivindicaciones 9-12, en la que el medio de cultivo celular comprende medio condicionado (MC) que comprende una concentracion de entre 100 ng/ml y 1.000 ng/ml de protema Wnt3a secretada.
  14. 14. Una composicion que comprende: una celula madre pluripotente inducida (iPS) y un activador de la ruta de la Wnt seleccionado entre el grupo que consiste en: una protema Wnt exogena soluble biologicamente activa que se une a un receptor de la Wnt y activa la ruta de la Wnt, un medio condicionado de Wnt que comprende una concentracion de entre 100 ng/ml y 1.000 ng/ml de protema Wnt3a secretada, y un antagonista de molecula pequena GSK-3 que activa la ruta de la Wnt seleccionado entre el grupo que consiste en: 6-bromoindirrubin-3'-oxima (BlO); N-(4-metoxibencil)-N'-(5-nitro-1,3-tiazol-2-il) urea (AR-AO 14418); 3-(2,4-diclorofenil)-4-(1-metil-1H-indol-3-il)- 1H-pirrol-2,5-diona (SB 216763); 4-bencil-2-metil-1,2,4-tiadiazolidin-3,5-diona (TDZD-8); CHIR-911 y CHIR-837.
  15. 15. El metodo de la reivindicacion 1, en el que poner en contacto la celula somatica de mamffero con los factores de reprogramacion comprende la modificacion de la celula para que exprese al menos un factor de reprogramacion en unas cantidades mayores de las que habna presentes normalmente en una celula de ese tipo.
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