RU2477314C1 - РЕКОМБИНАНТНАЯ ПЛАЗМИДА pSM-ZsGreen, КОДИРУЮЩАЯ БЕЛКИ SOX2 И С-MYC ЧЕЛОВЕКА И ФЛУОРЕСЦЕНТНЫЙ БЕЛОК ZsGreen, ПРЕДНАЗНАЧЕННАЯ ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ ИНДУЦИРОВАННЫХ ПЛЮРИПОТЕНТНЫХ СТВОЛОВЫХ КЛЕТОК ЧЕЛОВЕКА - Google Patents
РЕКОМБИНАНТНАЯ ПЛАЗМИДА pSM-ZsGreen, КОДИРУЮЩАЯ БЕЛКИ SOX2 И С-MYC ЧЕЛОВЕКА И ФЛУОРЕСЦЕНТНЫЙ БЕЛОК ZsGreen, ПРЕДНАЗНАЧЕННАЯ ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ ИНДУЦИРОВАННЫХ ПЛЮРИПОТЕНТНЫХ СТВОЛОВЫХ КЛЕТОК ЧЕЛОВЕКА Download PDFInfo
- Publication number
- RU2477314C1 RU2477314C1 RU2011149846/10A RU2011149846A RU2477314C1 RU 2477314 C1 RU2477314 C1 RU 2477314C1 RU 2011149846/10 A RU2011149846/10 A RU 2011149846/10A RU 2011149846 A RU2011149846 A RU 2011149846A RU 2477314 C1 RU2477314 C1 RU 2477314C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- zsgreen
- myc
- sox2
- plasmid
- human
- Prior art date
Links
Abstract
Изобретение относится к области генной инженерии, молекулярной и клеточной биологии и биотехнологии. Предложена рекомбинантная плазмида pSM-ZsGreen, кодирующая белки SOX2 и C-MYC человека и флуоресцентный белок ZsGreen, предназначенная для временной или постоянной экспрессии генов SOX2, C-MYC и ZsGreen в культивируемых клетках человека и обеспечивающая стабильную экспрессию введенного гена. Рекомбинантная плазмида может использоваться в качестве вектора для получения индуцированных плюрипотентных стволовых клеток человека. 1 ил., 1 табл.
Description
Изобретение относится к области генной инженерии, молекулярной и клеточной биологии, биотехнологии и может быть использовано для получения индуцированных плюрипотентных стволовых клеток человека.
Индуцированные плюрипотентные стволовые клетки (ИПСК) - это тип стволовых клеток, которые могут быть получены из соматических клеток животных и человека в результате повышенной экспрессии набора определенных генов [1-3]. Для получения ИПСК человека и животных успешно используется сверхэкспрессия таких генов как OCT4, SOX2, KLF4 и c-MYC [2].
Известно, что для получения большинства новых линий ИПСК в настоящий момент используют генетические конструкции, полученные на основе ретро- и лентивирусных векторов. Этот метод характеризуется тем, что происходит случайное встраивание ДНК-копий геномов ретро- или лентивирусов в геномы клеток, что в свою очередь может приводить к нарушению функционирования генов [4].
Для полномасштабного применения индуцированных плюрипотентных стволовых клеток в фундаментальных и прикладных исследованиях, таких как скрининг новых лекарственных веществ, исследования в области токсикологии и регенеративной медицины, необходимо решение ряда проблем. Во-первых, необходима разработка методов получения ИПСК без генетической модификации их геномов. Во-вторых, способ получения ИПСК должен быть достаточно эффективным.
Известно, что плазмидные векторы (плазмиды) могут временно существовать в ядрах клеток, обеспечивая стабильную транскрипцию нуклеотидных последовательностей, находящихся под контролем конститутивных промоторов. Кроме того, известен метод, основанный на использовании специфических последовательностей - 2А-пептидов, позволяющий получать генетические конструкции, обеспечивающие трансляцию нескольких полипептидов (белков) с одной молекулы матричной РНК [5].
Задачей данного изобретения является конструирование полицистронной неинтегрирующейся плазмидной конструкции, кодирующей белки SOX2 и C-MYC человека и флуоресцентный белок ZsGreen, обеспечивающей одновременную трансляцию данных белков и являющейся вектором при получении индуцированных плюрипотентных стволовых клеток. Белки SOX2 и C-MYC необходимы для запуска репрограммирования клеток, а флуоресцентный белок ZsGreen служит маркером трансфекции клеток и последующей элиминации плазмидной ДНК.
Реализация изобретения осуществляется следующим образом.
Конструирование рекомбинантной плазмидной ДНК выполняют на основе плазмиды pIRES (Clontech) и включает следующие стадии:
1. Выделяют РНК из клеток известной линии эмбриональных стволовых клеток человека HUES9 [6], и производят синтез кДНК с помощью олиго-(dT) праймеров. Полученную кДНК используют в качестве матрицы для синтеза фрагментов, кодирующих белки;
2. Синтез фрагмента кДНК гена SOX2 -позиции в мРНК 428-1379- (Homo sapiens SRY (sex determining region Y)-box 2) человека, (регистрационный номер в GeneBank NM_003106.2), размером 1023 пар нуклеотидов, содержащего на 3'-конце последовательность P2A-пептида (SOX2-P2A). Синтез проводят с помощью полимеразной цепной реакции с праймерами: hSOX2 5' XbaI 5'-TTTAGTGTCTAGAATGTACAACATGATGGAGACGGAGCTG-3' (прямой праймер, содержит искусственно введенный сайт эндонуклеазы рестрикции Xba I) и hSOX2 P2A 3'5'-TTCTCTTCGACATCCCCTGCTTGTTTCAACAGGGAGAAGTTAGTGGCTCCGCTTCCGGACATGTGTGAGAGGGGCAGTGTGCCGTTAATG-3' (обратный праймер, содержащий нуклеотидную последовательность кодирующую пептид P2A);
3. Синтез фрагмента кДНК гена c-MYC -позиции в мРНК 571-1891- (Homo sapiens v-myc myelocytomatosis viral oncogene homolog (avian)) (регистрационный номер в GeneBank NM_002467.4) размером 1397 пар нуклеотидов, содержащего на 5'-конце последовательность P2A-пептида (P2A-c-MYC). Синтез проводят с помощью полимеразной цепной реакции с праймерами: hcMYC P2A 5' 5'- GCCACTAACTTCTCCCTGTTGAAACAAGCAGGGGATGTCGAAGAGAATCCCGGGCCAATGCCCCTCAACGTTAGCTTCACCAACAGGAAC-3' (прямой праймер, содержащий нуклеотидную последовательность кодирующую пептид P2A) и hcMYC 3' SalI 5'- TTTAGCAGTGGTACGTCGACTTACGCACAAGAGTTCCGTAGCTGTTC-3' (прямой праймер, содержит искусственно введенный сайт эндонуклеазы рестрикции Sal I);
4. Объединение фрагментов SOX2-P2A и P2A-c-MYC осуществляют методом полимеразной цепной реакции с использованием в качестве матриц перекрывающихся фрагментов SOX2-P2A и P2A-c-MYC, а также праймеров hSOX2 5'XbaI и hcMYC 3' SalI. В результате получают фрагмент SOX2-P2A-c-MYC, размером 2373 пар нуклеотидов;
5. Фрагмент ДНК, кодирующий белок ZsGreen, вырезают из плазмиды pZsGreen (Clontech) эндонуклеазой рестрикции Xba I и клонируют в сайт Xba I, находящийся в полилинкере B плазмиды pIRES (Clontech). В результате получена плазмида pIRES-ZsGreen.
6.Фрагмент ДНК SOX2-P2A-c-MYC клонируют с помощью набора реагентов pGEM-T Easy Vector Systems (Promega) и штамма E.coli XL-10 Gold;
7. Клоны плазмиды pGEM-T Easy со встройками pGEM-SOX2-P2A-c-MYC последовательности выделяют стандартным методом щелочного лизиса (Maniatis, Т., Fritsch, E.F. and Sambrook, J. (1982) Molecular Cloning: a Laboratory Manual, Cold Sping Harbor Laboratory Press);
8. Фрагмент SOX2-P2A-c-MYC вырезают из плазмиды pGEM-SOX2-P2A-c-MYC с помощью эндонуклеаз рестрикции Spe I и EcoR I и лигируют с плазмидой pIRES-ZsGreen, гидролизованной эндонуклеазами рестрикции Nhe I и EcoR I, сайты которых расположены в полилинкере А - эндонуклеазы рестрикции Spe I и Nhe I имеют совместимые липкие концы.
В результате получена плазмида pSM-ZsGreen размером 9204 п.н. (SM= SOX2, c-MYC).
На чертеже изображена карта плазмидной генетической конструкции pSM-ZsGreen. Фрагмент ДНК, кодирующий белки SOX2 и C-MYC, встроен между сайтами Nhe I и EcoR I в полилинкер А плазмиды pIRES, а ДНК, кодирующая ZsGreen, встроена в сайт Xba I полилинкера В плазмиды pIRES.
Описание и позиции в нуклеотидной последовательности (п.н., пара нуклеотидов) функциональных элементов генетической плазмидной конструкции pSM-ZsGreen представлены в таблице 1.
Таблица 1 | |
Элемент плазмидной генетической конструкции | Позиции в последовательности конструкции, п.н. |
p CMV IE - энхансер/промотор цитомегаловируса | 1-750 |
IVS - интрон | 890-1022 |
Промотор РНК-полимеразы T7 | 1067-1085 |
Фрагмент ДНК SOX2-P2A-c-MYC | 1085-3445 |
IRES - внутренний сайт посадки рибосом | 3474-4055 |
ZsGreen - кДНК гена ZsGreen | 4078-4822 |
Промотор РНК-полимеразы T3 | 4968-4890 |
SV40 poly A - фрагмент, содержащий сигнал полиаденилирования мРНК вируса SV40 | 4967-5189 |
Ориджин репликации f1 | 5285-5741 |
p SV40 - энхансер/ранний промотор вируса SV40 | 5806-6224 |
SV40 ori - ориджин репликации вируса SV40 | 6122-6188 |
Neo-r - ген устойчивости к неомицину | 6269-7064 |
Синтетический сигнал полиаденилирования | 7129-7178 |
Amp-r - ген устойчивости к ампициллину | 7590-8451 |
Полученная плазмидная генетическая конструкция pSM-ZsGreen построена на основе плазмидного вектора pIRES (Clontech), в который помещены фрагменты кДНК генов SOX2 и c-MYC человека, соединенные нуклеотидной последовательностью, кодирующей P2A-пептид и кДНК гена, кодирующего флуоресцентный белок ZsGreen.
Транскрипция единой мРНК SOX2-P2A-c-MYC-IRES-ZsGreen осуществляется с конститутивного промотора p CMV IE, обеспечивающего высокий уровень наработки мРНК. Наличие последовательностей P2A и IRES позволяет одновременно транслировать белки SOX2, C-MYC и ZsGreen с одной молекулы мРНК.
Фрагмент ДНК, кодирующий флуоресцентный белок ZsGreen, является маркером трансфекции клеток и последующей элиминации плазмидной ДНК.
Плазмидная генетическая конструкция pSM-ZsGreen предназначена для временной или постоянной экспрессии генов SOX2, C-MYC и ZsGreen в культивируемых клетках человека и обеспечивает стабильную экспрессию введенного гена.
Рекомбинантная плазмида pSM-ZsGreen может использоваться в качестве вектора для получения индуцированных плюрипотентных стволовых клеток человека.
Список использованной литературы
1. Takahashi, K. and S. Yamanaka, Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic
and adult fibroblast cultures by defined factors. Cell, 2006. 126(4): p. 663-76.
2. Takahashi, K., et al., Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by
defined factors. Cell, 2007. 131(5): p. 861-72.
3. Yu, J., et al., Induced pluripotent stem cell lines derived from human somatic cells. Science, 2007. 318(5858): p. 1917-20.
4. Okita, K., et al., Generation of mouse induced pluripotent stem cells without viral vectors.
Science, 2008. 322(5903): p. 949-53.
5. Szymczak, A.L. and Vignali, D.A., Development of 2A peptide-based strategies in the design of multicistronic vectors. Expert Opin Biol Ther, 2005. 5(5): p. 627-38.
6. Cowan, C.A., et al., Derivation of embryonic stem-cell lines from human blastocysts. N Engl J Med, 2004. 350(13): p. 1353-6.
Claims (3)
1. Рекомбинантная плазмида pSM-ZsGreen, кодирующая белки SOX2 и С-MYC человека и флуоресцентный белок ZsGreen, предназначенная для получения индуцированных плюрипотентных стволовых клеток человека, представляющая собой генетическую конструкцию на основе плазмиды pIRES, содержащая следующие конструктивные элементы: фрагмент ДНК, кодирующий белки SOX2 и C-MYC человека, включающий последовательность, кодирующую Р2А, расположенную между последовательностями SOX2 и C-MYC, встроен между сайтами рестрикции NheI и EcoRI в полилинкер А плазмиды pIRES, размер встройки 2360 пар нуклеотидов, и фрагмент ДНК, кодирующий флуоресцентный белок ZsGreen, встроенный в сайт Xba I полилинкера В плазмиды pIRES; транскрипция полицистронной мРНК SOX2-P2A-C-MYC-IRES- ZsGreen осуществляется с конструктивного промотора pCMV IE.
2. Рекомбинантная плазмида pSM-ZsGreen по п.1, где разделение последовательностей элементами Р2А и IRES позволяет экспрессировать три белка с одной плазмиды одновременно.
3. Рекомбинантная плазмида pSM-ZsGreen по п.1, где фрагмент ДНК, кодирующий белки SOX2 и C-MYC человека, запускает репрограммирование клеток для получения индуцированных плюрипотентных стволовых клеток человека, а фрагмент ДНК, кодирующий флуоресцентный белок ZsGreen, является маркером трансфекции клеток и последующей элиминации плазмидной ДНК.
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
RU2011149846/10A RU2477314C1 (ru) | 2011-12-07 | 2011-12-07 | РЕКОМБИНАНТНАЯ ПЛАЗМИДА pSM-ZsGreen, КОДИРУЮЩАЯ БЕЛКИ SOX2 И С-MYC ЧЕЛОВЕКА И ФЛУОРЕСЦЕНТНЫЙ БЕЛОК ZsGreen, ПРЕДНАЗНАЧЕННАЯ ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ ИНДУЦИРОВАННЫХ ПЛЮРИПОТЕНТНЫХ СТВОЛОВЫХ КЛЕТОК ЧЕЛОВЕКА |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
RU2011149846/10A RU2477314C1 (ru) | 2011-12-07 | 2011-12-07 | РЕКОМБИНАНТНАЯ ПЛАЗМИДА pSM-ZsGreen, КОДИРУЮЩАЯ БЕЛКИ SOX2 И С-MYC ЧЕЛОВЕКА И ФЛУОРЕСЦЕНТНЫЙ БЕЛОК ZsGreen, ПРЕДНАЗНАЧЕННАЯ ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ ИНДУЦИРОВАННЫХ ПЛЮРИПОТЕНТНЫХ СТВОЛОВЫХ КЛЕТОК ЧЕЛОВЕКА |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
RU2477314C1 true RU2477314C1 (ru) | 2013-03-10 |
Family
ID=49124208
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
RU2011149846/10A RU2477314C1 (ru) | 2011-12-07 | 2011-12-07 | РЕКОМБИНАНТНАЯ ПЛАЗМИДА pSM-ZsGreen, КОДИРУЮЩАЯ БЕЛКИ SOX2 И С-MYC ЧЕЛОВЕКА И ФЛУОРЕСЦЕНТНЫЙ БЕЛОК ZsGreen, ПРЕДНАЗНАЧЕННАЯ ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ ИНДУЦИРОВАННЫХ ПЛЮРИПОТЕНТНЫХ СТВОЛОВЫХ КЛЕТОК ЧЕЛОВЕКА |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
RU (1) | RU2477314C1 (ru) |
Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US20100169986A1 (en) * | 2008-03-05 | 2010-07-01 | Suzanne Porszasz-Reisz | Conditional Mst Overexpressing Construct and Conditional Myostatin Overexpressing Transgenic Mouse |
RU2010112393A (ru) * | 2007-08-31 | 2011-10-10 | Уайтхэд Инститьют Фор Байомедикал Рисерч (Us) | СТИМУЛЯЦИЯ ПУТИ Wnt ПРИ ПЕРЕПРОГРАММИРОВАНИИ СОМАТИЧЕСКИХ КЛЕТОК |
-
2011
- 2011-12-07 RU RU2011149846/10A patent/RU2477314C1/ru not_active IP Right Cessation
Patent Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
RU2010112393A (ru) * | 2007-08-31 | 2011-10-10 | Уайтхэд Инститьют Фор Байомедикал Рисерч (Us) | СТИМУЛЯЦИЯ ПУТИ Wnt ПРИ ПЕРЕПРОГРАММИРОВАНИИ СОМАТИЧЕСКИХ КЛЕТОК |
US20100169986A1 (en) * | 2008-03-05 | 2010-07-01 | Suzanne Porszasz-Reisz | Conditional Mst Overexpressing Construct and Conditional Myostatin Overexpressing Transgenic Mouse |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
US10729784B2 (en) | Method for cellular RNA expression | |
US11634727B2 (en) | Recombinant nucleic acid molecule of transcriptional circular RNA and its application in protein expression | |
KR101871192B1 (ko) | 비-바이러스 접근법을 사용한 iPS 세포의 생산 방법 | |
Quabius et al. | Synthetic mRNAs for manipulating cellular phenotypes: an overview | |
CN109072257B (zh) | 增强的睡美人转座子、试剂盒和转座方法 | |
US11767530B2 (en) | Splice inhibiting oligonucleotides | |
JP2014128289A (ja) | iPS細胞を生成するための方法 | |
CA2873814A1 (en) | Method for expression of heterologous proteins using a recombinant negative-strand rna virus vector | |
KR20180105670A (ko) | 벡터-프리 유도만능 줄기세포를 생성시키기 위한 방법 및 벡터 | |
Rohani et al. | Generation of human induced pluripotent stem cells using non-synthetic mRNA | |
CA2973943A1 (en) | Gene expression system using stealthy rna, and gene introduction/expression vector including said rna | |
Kulcenty et al. | Review Molecular mechanisms of induced pluripotency | |
WO2018214534A1 (en) | Artificial pou protein, method for preparing the same and use thereof | |
EP2917350B1 (en) | Method for cellular rna expression | |
RU2017121232A (ru) | Плазмиды и способ получения вирусных частиц | |
RU2477314C1 (ru) | РЕКОМБИНАНТНАЯ ПЛАЗМИДА pSM-ZsGreen, КОДИРУЮЩАЯ БЕЛКИ SOX2 И С-MYC ЧЕЛОВЕКА И ФЛУОРЕСЦЕНТНЫЙ БЕЛОК ZsGreen, ПРЕДНАЗНАЧЕННАЯ ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ ИНДУЦИРОВАННЫХ ПЛЮРИПОТЕНТНЫХ СТВОЛОВЫХ КЛЕТОК ЧЕЛОВЕКА | |
RU2495124C2 (ru) | РЕКОМБИНАНТНАЯ ПЛАЗМИДА pSN-ZsGreen, КОДИРУЮЩАЯ БЕЛКИ SOX2 И NANOG ЧЕЛОВЕКА И ФЛУОРЕСЦЕНТНЫЙ БЕЛОК ZsGreen, ПРЕДНАЗНАЧЕННАЯ ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ ИНДУЦИРОВАННЫХ ПЛЮРИПОТЕНТНЫХ СТВОЛОВЫХ КЛЕТОК ЧЕЛОВЕКА | |
RU2495125C2 (ru) | РЕКОМБИНАНТНАЯ ПЛАЗМИДА pOK-DsRed2, КОДИРУЮЩАЯ БЕЛКИ ОСТ4 И KLF4 ЧЕЛОВЕКА И ФЛУОРЕСЦЕНТНЫЙ БЕЛОК DsRed2, ПРЕДНАЗНАЧЕНАЯ ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ ИНДУЦИРОВАННЫХ ПЛЮРИПОТЕНТНЫХ СТВОЛОВЫХ КЛЕТОК ЧЕЛОВЕКА | |
RU2495126C2 (ru) | РЕКОМБИНАНТНАЯ ПЛАЗМИДА pOL-DsRed2, КОДИРУЮЩАЯ БЕЛКИ OCT4 И LIN28 ЧЕЛОВЕКА И ФЛУОРЕСЦЕНТНЫЙ БЕЛОК DsRed2, ПРЕДНАЗНАЧЕННАЯ ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ ИНДУЦИРОВАННЫХ ПЛЮРИПОТЕНТНЫХ СТВОЛОВЫХ КЛЕТОК ЧЕЛОВЕКА | |
CA2752947A1 (en) | Foxp1 splice variants and methods and uses thereof | |
RU2495127C2 (ru) | РЕКОМБИНАНТНАЯ ПЛАЗМИДА pAd-SM, КОДИРУЮЩАЯ БЕЛКИ SOX2 И C-MYC ЧЕЛОВЕКА, ЯВЛЯЮЩАЯСЯ ОСНОВОЙ ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ ВИРУЛЕНТНЫХ АДЕНОВИРУСОВ, ПРЕДНАЗНАЧЕННЫХ ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ ИНДУЦИРОВАННЫХ ПЛЮРИПОТЕНТНЫХ КЛЕТОК ЧЕЛОВЕКА | |
CN113652428B (zh) | 核膜蛋白敲降在干细胞移植方面的应用 | |
US9890392B2 (en) | Method for preparing specific cells of human-derived cells | |
KR20240022421A (ko) | 전자기파에 반응하는 유전자 프로모터 및 이의 활용 | |
JP2009072186A (ja) | 幹細胞における未分化状態の制御方法 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
MM4A | The patent is invalid due to non-payment of fees |
Effective date: 20191208 |