WO2014136581A1 - 多能性幹細胞の培養システム及び多能性幹細胞の継代方法 - Google Patents

多能性幹細胞の培養システム及び多能性幹細胞の継代方法 Download PDF

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WO2014136581A1
WO2014136581A1 PCT/JP2014/054066 JP2014054066W WO2014136581A1 WO 2014136581 A1 WO2014136581 A1 WO 2014136581A1 JP 2014054066 W JP2014054066 W JP 2014054066W WO 2014136581 A1 WO2014136581 A1 WO 2014136581A1
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WO
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pluripotent stem
culture
medium
stem cells
container
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PCT/JP2014/054066
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憲夫 中辻
吉川　義洋
竹内　誠亮
大揮 舘山
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国立大学法人京都大学
ニプロ株式会社
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    • C12M23/00—Constructional details, e.g. recesses, hinges
    • C12M23/58—Reaction vessels connected in series or in parallel
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C12M41/00—Means for regulation, monitoring, measurement or control, e.g. flow regulation

Definitions

  • the present invention relates to a system for culturing pluripotent stem cells and a method for subculturing pluripotent stem cells.
  • Multipotent stem cells that can proliferate indefinitely without causing canceration and have pluripotency are expected to be applied to cell transplantation therapy and drug discovery screening.
  • Patent Documents 1 to 5 suspension culture methods that do not require an adhesion substrate have been reported. According to the suspension culture method, three-dimensional culture is possible, so that a large amount of pluripotent stem cells can be cultured in a smaller space.
  • Patent Document 6 a method of dividing a cell cluster of pluripotent stem cells through a microgrid has been devised.
  • the present invention has been made in view of the above-described problems, and an object thereof is to provide a system suitable for culturing a large amount of pluripotent stem cells.
  • Another object of the present invention is to provide a method suitable for passage of a large amount of pluripotent stem cells.
  • the pluripotent stem cell culture system is connected to the culture container through a culture vessel for suspension culture of pluripotent stem cells in a medium and a flow path through which a liquid can flow.
  • a waste liquid container for storing a used medium that has flowed out of the culture container; a fresh medium container that is connected to the culture container by a flow path capable of circulating liquid; and stores a fresh medium to be supplied to the culture container;
  • a first switching unit for switching a flow path from the culture container to the waste liquid container or the fresh medium container, and a flow path on the culture container side from the first switching unit,
  • a trap section for trapping pluripotent stem cells in the medium in the flow; and a flow path provided in parallel with the flow path connecting the trap section and the culture container between the trap section and the culture container.
  • Setting A passage filter part having a mesh capable of dividing a cell cluster of pluripotent stem cells, and a second switching part for switching a flow path from the trap part to the culture vessel or the passage filter part.
  • the medium flows out from the culture container to the waste container.
  • pluripotent stem cells flow out of the culture container together with the culture medium, the pluripotent stem cells are trapped by the trap part and do not flow into the waste liquid container.
  • the fresh medium is discharged from the fresh medium container to the culture container.
  • the pluripotent stem cells trapped in the trap part flow into the culture container together with the fresh medium.
  • the second switching unit is switched to the flow path that flows from the trap unit to the culture vessel without passing through the passage filter unit. Thereby, the culture medium of a culture container is replaced
  • the medium flows out from the culture container to the waste liquid container, and the pluripotent stem cells are trapped in the trap part.
  • the second switching unit is switched to a flow path that flows from the trap unit to the culture container through the passage filter unit.
  • the cell mass of pluripotent stem cells that has reached the passage filter part from the trap part together with the fresh medium is divided when passing through the mesh.
  • the cell mass of pluripotent stem cells that have been divided and have a size suitable for passage is poured into a culture vessel together with a fresh medium. Thereby, pluripotent stem cells are passaged.
  • the pluripotent stem cell culture system according to the present invention is provided in a flow path connecting the culture vessel and the passage filter unit so that liquid can be circulated, and is supplied to the passage filter unit. You may further comprise the container for backwashing which stores the washing
  • the cell mass of pluripotent stem cells that has reached the passage filter part from the trap part together with fresh medium is divided when passing through the mesh, but the cell mass that is not divided but clogs the mesh Exists.
  • the backwash medium is circulated from the backwash container to the mesh, the clogged cell mass flows into the backwash medium and leaves the mesh. Thereby, clogging of the mesh can be eliminated.
  • the pluripotent stem cell culture system according to the present invention further includes a control unit for controlling the flow rate of the liquid in each of the channels, and the control unit is a mesh of the passage filter unit.
  • the flow rate per unit square centimeter of the liquid passing through may be 95 mL / min or more.
  • the recovery rate of pluripotent stem cells is improved by setting the flow rate per unit square centimeter of the mesh of the passage filter section to 95 mL or more per minute.
  • the pluripotent stem cell culture system further includes a pump for circulating a liquid in each of the flow paths, and a control unit for controlling the driving of the pump.
  • the pump may be driven at a constant flow rate of 90 mL / min or more in at least the flow from the trap section to the passage filter section.
  • the recovery rate of pluripotent stem cells is improved by circulating the medium through the passage filter section at a constant flow rate of 90 mL / min or more.
  • pluripotent stem cells examples include ES cells and iPS cells.
  • pluripotent stem cells examples include those derived from humans.
  • the pluripotent stem cell passage method comprises a culture step of culturing a cell mass of pluripotent stem cells in suspension, and a flow in which the culture medium can flow through the cultured pluripotent stem cell mass.
  • the removed cell mass is circulated in one direction together with the culture medium.
  • the cell mass clogged in the mesh in the first division step can be separated from the mesh in the backwashing step to eliminate clogging, and the cell mass separated by the mesh in the second division step can be divided.
  • the recovery rate of pluripotent stem cells during passage is improved.
  • Examples of the pluripotent stem cells include ES cells and iPS cells.
  • pluripotent stem cells examples include those derived from humans.
  • the culture system for pluripotent stem cells According to the culture system for pluripotent stem cells according to the present invention, a large amount of pluripotent stem cells can be cultured, and an automated system can be realized.
  • the method for subculturing pluripotent stem cells according to the present invention it is possible to suppress the clogging of the mesh and realize passage of a large amount of pluripotent stem cells.
  • FIG. 4 is a cross-sectional view showing an internal structure of a trap unit 14.
  • FIG. 6 is a cross-sectional view showing the internal structure of the passage filter unit 15. It is a figure which shows the collection
  • FIG. It is a figure which shows the collection
  • the pluripotent stem cell culture system 10 includes a culture bag 11, a waste liquid container 12, a fresh medium container 13, a trap part 14, a passage filter part 15, a pump 16,
  • the backwash containers 17 and 18 are connected by a flow path.
  • the culture bag 11 is a resin bag capable of suspension culture of pluripotent stem cells in a medium, and can enclose a liquid in the internal space. Moreover, the resin sheet which comprises the outer wall of the culture bag 11 has a high gas permeability, such as a carbon dioxide.
  • the culture bag 11 is appropriately provided with a port that allows a fluid such as a culture medium to flow into and out of the internal space.
  • the culture bag 11 has a rectangular outer shape in plan view, but the shape is not particularly limited, and the shape and the volume are set in consideration of the capacity of the medium to be filled, operability, and the like.
  • the culture bag 11 is stored in an incubator or the like so that the surrounding environment has a temperature and humidity suitable for culture. Further, in order to prevent the aggregation of pluripotent stem cell clumps, a mechanism for changing the posture of the culture bag 11 may be provided as necessary.
  • the waste liquid container 12 is a container capable of storing a used medium that has flowed out of the culture bag 11 for medium replacement.
  • the shape and capacity of the waste liquid container 12 are appropriately set according to the capacity of the culture bag 11 and the number of days for storing the used culture medium.
  • the fresh medium container 13 is a container capable of storing a fresh medium to be supplied to the culture bag 11 in medium exchange.
  • the shape and capacity of the fresh medium container 13 are appropriately set according to the capacity of the culture bag 11 and the frequency of medium replacement.
  • the trap unit 14 traps the cell mass of pluripotent stem cells that flowed together with the medium, and causes only the medium to flow out.
  • an inflow port 21 is formed on the lower side of the substantially cylindrical main body 20
  • an outflow port 22 is formed on the upper side of the main body 20.
  • the inflow port 21 communicates with the internal space of the main body 20.
  • a cell mass of pluripotent stem cells can flow into the internal space of the main body 20 through the inflow port 21 together with the culture medium.
  • the outlet 22 communicates with the internal space of the main body 20, and a mesh 23 is provided at the outlet to the internal space of the main body 20.
  • the mesh 23 is in the form of a thin film in which a large number of pores having a size through which the cell mass of pluripotent stem cells cannot pass.
  • the cell mass of pluripotent stem cells that has flowed together with the culture medium from the inlet 21 into the internal space of the main body 20 stays below the internal space of the main body 20 by its own weight.
  • the cell mass of pluripotent stem cells reaching the upper side in the internal space of the main body 20 is blocked by the mesh 23 and does not flow out from the outflow port 22.
  • the trap portion 14 may elastically deform the main body 20 as necessary in order to prevent aggregation of cell clusters of pluripotent stem cells and clogging of the mesh 23.
  • a mechanism for applying vibration to the mesh 23 may be provided.
  • the passage filter unit 15 divides the cell mass of the pluripotent stem cells that flowed together with the medium.
  • the passage filter unit 15 includes a main body 30 that houses the mesh 31.
  • the main body 30 has an inlet 32 and an outlet 33.
  • the inflow port 32 and the outflow port 33 communicate with the internal space of the main body 30.
  • a mesh 31 is provided in the internal space of the main body 30 so as to separate a flow path leading from the inlet 32 to the outlet 33.
  • the material of the mesh 31 is not particularly limited as long as it can be sterilized.
  • a synthetic resin such as nylon or polyethylene terephthalate, or a metal such as stainless steel can be adopted.
  • the stainless steel mesh 31 is preferable because the thickness of the fibers constituting the mesh 31 can be reduced to increase the opening ratio (the ratio occupied by openings (holes) per unit area of the mesh 31). As the opening ratio of the mesh 31 is larger, the recovery rate of pluripotent stem cells recovered in the culture bag 11 tends to be improved.
  • the pore diameter of the mesh 31 may be such that the average diameter of the divided cell mass is about 80 to 120 ⁇ m, preferably about 80 ⁇ m.
  • the pore diameter is about 40 to 100 ⁇ m.
  • “about” is used to mean ⁇ 10%.
  • the shape and the like of the mesh 31 are not particularly limited, but it is preferably a thickness and shape that do not damage the cells as much as possible.
  • it is preferable that the area of a region through which the cell mass can pass in the mesh 31 is larger because clogging is less likely to occur even if the number of cell masses is increased.
  • the pump 16 is for circulating a medium and the like in each flow path, and a typical example is a peristaltic pump. Although not shown in each figure, the pump 16 includes an arithmetic unit as a control unit, and the pump 16 operates to circulate the medium and the like at a constant flow rate according to the input flow rate.
  • the pump 16 is used as a drive source for circulating the medium and the like in each flow path.
  • the culture bag 11 or the like is compressed and deformed, or the air in the waste liquid container 12 or the like.
  • the medium pressure may be changed to cause the culture medium to flow out from the culture bag 11 or the like, or the culture medium may flow into the waste liquid container 12 or the like.
  • the relative height relationship between the culture bag 11, the waste liquid container 12 and the fresh medium container 13 is changed, so that the culture bag 11, the waste liquid container 12 and the fresh medium container 13 are It is good also as distribute
  • Each flow path is formed of, for example, a resin tube, and an inner diameter, a length, and the like are appropriately selected according to a flow rate, a flow rate, and the like. Moreover, even if the tube which comprises each flow path is comprised by one, the multiple tubes may be comprised by connecting with the joint etc.
  • the culture bag 11 is connected to the trap part 14 by the first flow path 41.
  • the first flow path 41 connects the port of the culture bag 11 and the inlet 21 of the trap unit 14.
  • the trap unit 14 is connected to the waste liquid container 12 by the second flow path 42.
  • the second flow path 42 connects the outlet 22 of the trap unit 14 and the waste liquid container 12.
  • the pump 16 is provided in the second flow path 42. The pump 16 sends the liquid in one direction in the second flow path 42 by selectively pulsating a tube constituting a part of the second flow path 42 toward the trap portion 14 side or the waste liquid container 12 side.
  • a three-way stopcock 51 is provided between the waste liquid container 12 and the pump 16 in the second flow path 42.
  • the three-way stopcock 51 is connected to the fresh medium container 13 by the third flow path 43.
  • the trap unit 14 is selectively connected to the waste liquid container 12 or the fresh medium container 13.
  • the first flow path 41 is provided with two three-way stopcocks 52 and 53.
  • the three-way stopcock 52 is connected to the passage filter unit 15 by the fourth flow path 44.
  • the fourth flow path 44 connects the three-way cock 52 and the inlet 32 of the passage filter unit 15.
  • the three-way stopcock 53 is connected to the passage filter unit 15 by a fifth flow path.
  • the fifth flow path 45 connects the three-way cock 53 and the outlet 33 of the passage filter unit 15.
  • a three-way cock 54 is provided between the trap section 14 and the pump 16 in the second flow path 42.
  • the three-way stopcock 54 is connected to the backwash container 17 by the sixth flow path 46. By switching the three-way stopcock 54, the pump 16 is selectively connected to the trap unit 14 or the backwash container 17.
  • a three-way stopcock 55 is provided between the culture bag 11 and the passage filter unit 15 in the fifth flow path 45.
  • the three-way stopcock 55 is connected to the backwash container 18 by the seventh flow path 47.
  • the passage filter unit 15 is selectively connected to the culture bag 11 or the backwash container 18.
  • the three-way stopcocks 51 to 55 may be configured to be switchable by being transmitted from a driving source such as a motor. Moreover, switching of each flow path may be realized by a valve other than the three-way cock.
  • the three-way stopcocks 51 and 54 correspond to the first switching unit, and the three-way stopcocks 52 to 55 correspond to the second switching unit.
  • the culture system 10 can be used for culturing pluripotent stem cells.
  • the pluripotent stem cell that can be cultured by the culture system 10 is an undifferentiated cell having “self-renewal ability” capable of proliferating while maintaining an undifferentiated state and “differentiation pluripotency” capable of differentiating into all three germ layers.
  • pluripotent stem cells include ES cells, induced pluripotent stem cells (iPS cells), mutipotent germline stem (mGS) cells derived from primordial germ cells, and multipotent adult progenitor cells ( MAPC).
  • the ES cell may be an ES cell produced by nuclear reprogramming from a somatic cell.
  • ES cells or iPS cells are preferable.
  • the culture by the culture system 10 can be applied in any mammal in which pluripotent stem cells are established or can be established. Examples of such mammals include humans, mice, monkeys, pigs, rats, dogs, etc., preferably humans or mice, and particularly preferably humans.
  • ES cells can be established by removing an inner cell mass from a blastocyst of a fertilized egg of a target animal and culturing the inner cell mass on a fibroblast feeder. In addition, maintenance of cells by subculture is performed using a culture solution supplemented with substances such as leukemia inhibitory factor (LIF) and basic fibroblast growth factor (bFGF). It can be carried out.
  • LIF leukemia inhibitory factor
  • bFGF basic fibroblast growth factor
  • a culture solution for preparing ES cells for example, a DMEM / F-12 culture solution supplemented with 0.1 mM 2-mercaptoethanol, 0.1 mM essential amino acid, 2 mM L-glutamic acid, 20% KSR and 4 ng / mL bFGF (Alternatively, human ES cells can be maintained in a humidified atmosphere of 37 ° C., 2% CO 2 /98% air using a synthetic medium (mTeSR, Stem Pro, etc.) (O. Fumitake et al. (2008) , Nat. Biotechnol., 26: 215-224).
  • ES cells need to be passaged every 3-4 days, where passage is for example 0.25% trypsin and 0.1 mg / ml in PBS containing 1 mM CaCl 2 and 20% KSR. It can be performed using mL collagenase IV.
  • ES cells can be generally selected by Real-Time PCR method using the expression of gene markers such as alkaline phosphatase, Oct-3 / 4, Nanog as an index.
  • gene markers such as alkaline phosphatase, Oct-3 / 4, Nanog
  • ECAD E. Kroon et al. (2008), Nat. Biotechnol., 26: 443). -452).
  • sperm stem cells are testis-derived pluripotent stem cells that are the origin of sperm formation. Like ES cells, these cells can be induced to differentiate into various types of cells, and have characteristics such as the ability to create chimeric mice when transplanted into mouse blastocysts (M. Kanatsu-Shinohara et al. ( 2003) Biol. Reprod., 69: 612-616; K. Shinohara et al. (2004), Cell, 119: 1001-1012). It is capable of self-replication in a culture medium containing glial cell line-derived neurotrophic factor (GDNF), and by repeated passage under the same culture conditions as ES cells, Sperm stem cells can be obtained (Takebayashi Masanori et al. (2008), Experimental Medicine, Vol. 26, No. 5 (extra number), pages 41-46, Yodosha (Tokyo, Japan)).
  • GDNF glial cell line-derived neurotrophic factor
  • Embryonic germ cells are cells that are established from embryonic primordial germ cells and have the same pluripotency as ES cells. They are primitive in the presence of substances such as LIF, bFGF, and stem cell factor. It can be established by culturing germ cells (Y. Matsui et al. (1992), Cell, 70: 841-847; JL Resnick et al. (1992), Nature, 359: 550-551).
  • iPS cells can be produced by introducing a specific reprogramming factor into a somatic cell in the form of DNA or protein, such as almost the same characteristics as ES cells, such as differentiation pluripotency And an artificial stem cell derived from a somatic cell having proliferation ability by self-replication (K. Takahashi and S. Yamanaka (2006) Cell, 126: 663-676; K. Tkahashi et al. (2007), Cell, 131) : 861-872; J. Yu et al. (2007), Science, 318: 1917-1920; Nakagawa, M. et al. Nat. Biotechnol. 26: 101-106 (2008); International Publication No. 2007-069666 ).
  • the reprogramming factor is a gene specifically expressed in ES cells, its gene product or non-cording RNA, a gene that plays an important role in maintaining undifferentiation of ES cells, its gene product or non-cording RNA, or You may be comprised with the low molecular compound.
  • genes included in the reprogramming factor include Oct3 / 4, Sox2, Sox1, Sox3, Sox15, Sox17, Klf4, Klf2, c-Myc, N-Myc, L-Myc, Nanog, Lin28, Fbx15, ERas, ECAT15 -2, Tcl1, beta-catenin, Lin28b, Sall1, Salll4, Esrrb, Nr5a2, Tbx3 or Glisl.
  • initialization factors may be used alone or in combination.
  • HDAC histone deacetylase
  • VPA valproic acid
  • trichostatin A sodium butyrate
  • MC1293, M344 and other small molecule inhibitors
  • siRNA and shRNA against HDAC eg, Nucleic acid expression inhibitors such as HDAC1poolsi RNA ⁇ Smartpool (registered trademark), millipore), HuSH 29mer shRNA Constructs against HDAC1 (OriGene) etc.
  • MEK inhibitors for example, PD184352, PD98059, U0126, SL327, PD0325901
  • Glycogen synthase kinase-3 inhibitor for example, Bio, CHIR99021
  • DNA methyltransferase inhibitor for example, 5-azacytidine
  • histone methyltransferase inhibitor for example, small molecule inhibitor such as BIX-01294, Suv39HL, Suv39h2, Nucleic acid expression inhibitors such as siRNA
  • the reprogramming factor may be introduced into a somatic cell by a technique such as lipofection, fusion with a cell membrane permeable peptide (for example, TAT and polyarginine derived from HIV), or microinjection.
  • a cell membrane permeable peptide for example, TAT and polyarginine derived from HIV
  • Virus vectors include retrovirus vectors, lentivirus vectors (cells, 126, pp.663-676, 2006; Cell, 131, pp.861-872, 2007; Science, 318, pp.1917-1920, 2007 ), Adenovirus vectors (Science, 322, 945-949, 2008), adeno-associated virus vectors, Sendai virus vectors (International Publication No. 2010/008054), and the like.
  • the artificial chromosome vector examples include human artificial chromosome (HAC), yeast artificial chromosome (YAC), bacterial artificial chromosome (BAC, PAC) and the like.
  • a plasmid a plasmid for mammalian cells can be used (Science, 322: 949-953, 2008).
  • the vector can contain regulatory sequences such as a promoter, an enhancer, a ribosome binding sequence, a terminator, and a polyadenylation side so that a nuclear reprogramming substance can be expressed.
  • a drug resistance gene For example, selectable marker sequences such as kanamycin resistance gene, ampicillin resistance gene, puromycin resistance gene, thymidine kinase gene, diphtheria toxin gene, reporter gene sequences such as green fluorescent protein (GFP), ⁇ -glucuronidase (GUS), FLAG, etc. Can be included.
  • the above vector has a LoxP sequence before and after the gene to encode the reprogramming factor or the promoter and the gene encoding the reprogramming factor that binds to it after introduction into the somatic cell. May be.
  • RNA form for example, it may be introduced into somatic cells by techniques such as lipofection and microinjection, and in order to suppress degradation, RNA incorporating 5-methylcytidine and pseudouridine® (TriLink® Biotechnologies) is used. (Warren L, (2010) Cell Stem Cell. 7: 618-630).
  • Culture solutions for iPS cell induction may further contain LIF, penicillin / streptomycin, puromycin, L-glutamine, non-essential amino acids, ⁇ -mercaptoethanol, etc.) or commercially available.
  • Culture medium eg, mouse ES cell culture medium (TX-WES culture medium, Thrombo X)
  • primate ES cell culture medium primate ES / iPS cell culture medium, Reprocell
  • serum-free medium MTeSR, Stemcell Technology
  • a somatic cell and a reprogramming factor are brought into contact with each other on DMEM or DMEM / F12 containing 10% FBS in the presence of 5% CO 2 at 37 ° C. for about 4 to 7 days.
  • the cells are then cultured on feeder cells (eg, mitomycin C-treated STO cells, SNL cells, etc.), and bFGF-containing primate ES cell culture medium is cultured about 10 days after contact between the somatic cells and the reprogramming factor.
  • feeder cells eg, mitomycin C-treated STO cells, SNL cells, etc.
  • bFGF-containing primate ES cell culture medium is cultured about 10 days after contact between the somatic cells and the reprogramming factor.
  • IPS-like colonies can be generated about 30-45 days or more after contact.
  • a DMEM culture solution containing 10% FBS on feeder cells for example, mitomycin C-treated STO cells, SNL cells, etc.
  • feeder cells for example, mitomycin C-treated STO cells, SNL cells, etc.
  • these culture media are further used as LIF, penicillin / streptomycin, puromycin, L-glutamine, non-essential amino acids, ⁇ -mercaptoethanol, etc. may be included as appropriate.
  • ES-like colonies may be formed. it can.
  • the somatic cell itself to be initialized is used instead of the feeder cell (Takahashi K et al. (2009), PLoS One. 4: e8067, or WO 2010/137746), or the extracellular matrix. Examples thereof include a method using (for example, Laminin (International Publication No. 2009/123349), Matrigel (BD)).
  • iPS cells may be established under the bottom oxygen condition (oxygen concentration of 0.1% or more and 15% or less) (Yoshida Y et al. (2009), Cell Stem Cell. 5: 237-241, International Publication No. 2010/013845).
  • the culture medium is exchanged with a fresh culture medium once a day from the second day after the start of the culture.
  • the number of somatic cells used for nuclear reprogramming is not limited, but ranges from about 5 ⁇ 10 3 to 5 ⁇ 10 6 cells per 100 cm 2 of culture dish.
  • IPS cells can be selected according to the shape of the formed colonies.
  • a drug resistance gene that is expressed in conjunction with a gene that is expressed when somatic cells are initialized for example, Oct3 / 4, Nanog
  • a culture solution containing the corresponding drug selection The established iPS cells can be selected by culturing with the culture medium. If the marker gene is a fluorescent protein gene, iPS cells established by observing with a fluorescence microscope can be selected. If the marker gene is a luminescent enzyme gene, iPS cells established by adding a luminescent substrate are selected. In the case of a chromogenic enzyme gene, iPS cells established by adding a chromogenic substrate can be selected.
  • the pluripotent stem cells prepared as described above are subjected to suspension culture in the culture system 10. Specifically, the culture bag 11 is filled with pluripotent stem cells together with a medium, and suspension culture is performed until the average diameter of the cell mass of the pluripotent stem cells becomes about 200 to 300 ⁇ m. Here, “about” is used to mean ⁇ 10%. If the diameter of the cell mass exceeds 300 ⁇ m, a microenvironment is formed due to the influence of cytokines secreted by the cells and differentiation is induced. In addition, necrosis occurs in the center of the cell mass, which causes a problem that the recovery rate of living cells is deteriorated.
  • the lower limit of the average diameter of the cell mass is not particularly limited as long as it is larger than the average diameter of the cell mass at the start of suspension culture (at the time of passage in suspension culture after passage). Considering the yield, it is preferable to continue the culture to about 200 ⁇ m or more.
  • the culture medium for suspension culture a medium having the same composition as the above-described culture medium for adhesion culture can be used.
  • the medium is appropriately used to prevent the movement of the cell mass and the adhesion between the cell masses. It is desirable to give a proper viscosity.
  • the moderate viscosity means a viscosity that does not interfere with the medium exchange and does not cause adhesion between cell masses.
  • the means for imparting viscosity to the medium is not particularly limited.
  • it can be carried out by adding a water-soluble polymer to the medium at an appropriate concentration.
  • a water-soluble polymer any water-soluble polymer can be used as long as it can impart an appropriate viscosity to the medium and does not adversely affect cells (has no cytotoxicity) within the concentration range where viscosity can be imparted.
  • Polymers can also be used.
  • polysaccharides such as cellulose and agarose, methylcellulose, ethylcellulose, hydroxyethylcellulose, hydroxypropylcellulose, hydroxyethylmethylcellulose, hydroxypropylmethylcellulose, hydroxyethylethylcellulose, hydroxypropylethylcellulose, ethylhydroxyethylcellulose, dihydroxypropylcellulose, hydroxyethylhydroxypropylcellulose, etc.
  • Synthetic polymers such as polysaccharide ether, polyacrylamide, polyethylene oxide, polyvinyl pyrrolidone, ethylene glycol / propylene glycol copolymer, polyethyleneimine polyvinyl methyl ether, polyvinyl alcohol, polyacrylic acid, maleic acid copolymer, collagen, gelatin ,
  • Ron acid, dextran, alginate, carrageenan biopolymers such as starch or artificial polymer (for example, elastin-like peptide) that mimics thereof.
  • These water-soluble polymers may be used alone or as a mixture of several types of water-soluble polymers. Moreover, you may use the copolymer of these water-soluble polymers.
  • it is methylcellulose, polyethylene glycol, polyvinylpyrrolidone, carboxymethylcellulose, or a mixture thereof, more preferably methylcellulose.
  • the concentration of methylcellulose is preferably higher than 0.25 w / v% and lower than 0.5 w / v%.
  • the concentration of methylcellulose is 0.25 w / v% or less, the viscosity is too low to obtain a desired effect, and when it is 0.5 w / v% or more, it is difficult to pass through the trap part 14 and the passage filter part 15.
  • the concentration of methylcellulose is 0.26 to 0.3 w / v%, particularly preferably 0.28 w / v%. Even when other water-soluble polymers are used, those skilled in the art can appropriately select the concentration of the other water-soluble polymers in order to obtain the above-described appropriate viscosity.
  • a temperature rising type temperature sensitive hydrogel can be used as the water-soluble polymer.
  • “Temperature-enhanced temperature-sensitive hydrogel” means a hydrogel that exhibits a reversible sol-gel phase transition that is liquid at low temperatures, but gels with an increase in temperature and resols when cooled to room temperature.
  • Examples of the temperature-rising temperature-sensitive hydrogel include, but are not limited to, the trade name “Mebiol ⁇ gel ”series (Meviol Co., Ltd.), which shows a gel transition temperature of 27 to 32 ° C.
  • the hydrogel When using a temperature-enhanced temperature-sensitive hydrogel, add the hydrogel at a concentration that can provide sufficient viscosity to prevent the movement of floating cell masses and adhesion between the cell masses. After growing by suspension culture, the cells can be easily recovered by cooling to a temperature below the gelation transition temperature to sol the culture solution and passing through the trap part 14 or the passage filter part 15.
  • pluripotent stem cells that have been attached and cultured are dissociated by an enzyme treatment, and, for example, about 0.5 to 50 ⁇ 10 4 cells / cm 2 , preferably about 1 to 10 ⁇ 10 4 cells in the culture bag 11.
  • / cm 2 of seeded so that the cell density, in a CO 2 environment in the culture system 10, about 1 to 10%, preferably under an atmosphere of about 2 ⁇ 5% CO 2 concentration, about 30 ⁇ 40 ° C., preferably Is carried out at about 37 degrees for 1 to 7 days, preferably 3 to 6 days, more preferably 4, 5 days.
  • the medium in the culture bag 11 is preferably replaced with a fresh medium every 1 or 2 days.
  • the medium flows out from the culture bag 11 to the waste liquid container 12 (arrow 101).
  • the flow path from the culture bag 11 to the waste liquid container 12 via the trap unit 14 is opened.
  • the pump 16 By operating the pump 16, the culture medium flows from the culture bag 11 to the waste liquid container 12 through the first channel 41 and the second channel 42 at a constant flow rate.
  • the flow rate is preferably a constant flow rate in the range of about 5 to 50 mL per minute, more preferably a constant flow rate in the range of about 8 to 10 mL per minute.
  • the cell mass of pluripotent stem cells flows out from the culture bag 11 together with the medium, but the cell mass is trapped by the trap part 14 and therefore does not flow into the waste liquid container 12.
  • a cell mass of pluripotent stem cells flows into the internal space of the main body 20 from the lower inlet 21 of the main body 20 together with the culture medium.
  • the cell mass stays below the internal space of the main body 20 due to its own weight.
  • the medium flows out from the inner space of the main body 20 through the outlet 22.
  • the cell mass that has reached the upper side in the internal space of the main body 20 is not blocked by the mesh 23 and flows out from the outlet 22.
  • the three-way stopcock 51 is switched, and the culture bag 11 and the fresh medium container 13 are connected via the trap part 14.
  • a fresh medium flows from the fresh medium container 13 to the culture bag 11 through the first flow path 41, the second flow path 42, and the third flow path 43 at a constant flow rate (arrow 102).
  • the flow rate is preferably a constant flow rate in the range of about 50 to 150 mL per minute, more preferably a constant flow rate in the range of about 80 to 100 mL per minute.
  • the fresh medium that has flowed out of the fresh medium container 13 flows into the internal space of the main body 20 from the outlet 22 of the trap unit 14. Then, together with the cell mass of pluripotent stem cells staying below the internal space of the main body 20, it flows out from the inlet 21 and flows into the culture bag 11 through the first channel 41 (arrow 103). Thereby, the cell mass of the pluripotent stem cell trapped by the trap part 14 flows into the culture bag 11 with a fresh culture medium.
  • the backwashing medium is allowed to flow into the trap part 14 from the backwash container 17. Also good.
  • the medium for backwashing is preferably, for example, a medium used for the above-described suspension culture, to which a water-soluble polymer is not added.
  • a medium used for the above-described suspension culture to which a water-soluble polymer is not added.
  • the operation of the pump 16 is temporarily stopped, the three-way stopcock 54 is switched, and the backwash container 17 and the pump 16 is connected through the sixth flow path 46.
  • the backwash medium flows from the backwash container 17 through the sixth flow path 46 toward the fresh medium container 13 (arrow 104).
  • the operation of the pump 16 is temporarily stopped, the three-way stopcock 54 is switched, and the culture bag 11 and the fresh medium container 13 are trapped. 14 for connection.
  • the pump 16 is operated in the reverse direction (the direction of the arrow 102), that is, from the fresh medium container 13 toward the trap unit 14, so that the backwash medium flowing into the second flow path 42 is retained in the trap unit 14. It flows into the internal space of the main body 20 through the outlet 22. At this time, the cell mass clogged in the mesh 23 of the trap portion 14 is peeled off by the backwash medium. Thereafter, the direction of the pump 16 is switched, and the culture medium flows out from the culture bag 11 to the waste liquid container 12 in the same manner as described above.
  • the medium in the culture bag 11 is replaced with a fresh medium every 1 or 2 days.
  • the average diameter of the cell mass of pluripotent stem cells at the start of suspension culture is about 80 ⁇ m and this is expanded to about 250 ⁇ m
  • human ES cells divide once every about 24 hours, it is considered that if ES cells are cultured for 4 or 5 days, they grow to a desired size.
  • the three-way stopcocks 51 to 54 are operated, whereby the waste liquid container 12 is passed from the culture bag 11 through the trap portion 14.
  • the flow path to is opened.
  • the flow rate is preferably a constant flow rate in the range of about 5 to 50 mL per minute, more preferably a constant flow rate in the range of about 8 to 10 mL per minute.
  • the cell mass of pluripotent stem cells flows out from the culture bag 11 together with the culture medium. However, as described above, the cell mass is trapped by the trap part 14 and does not flow into the waste liquid container 12.
  • the three-way stopcocks 51, 52, 53 are switched, and the culture bag 11 and the fresh culture medium container 13 are connected via the trap part 14 and the passage filter part 15.
  • the fresh medium container 13 is freshly fed from the fresh medium container 13 toward the culture bag 11 through the second flow path 42, the third flow path 43, the fourth flow path 44, and the fifth flow path 45 at a constant flow rate.
  • the medium flows (arrow 102).
  • the fresh medium that has flowed out of the fresh medium container 13 flows into the internal space of the main body 20 from the outlet 22 of the trap section 14 and stays below the internal space of the main body 20 as described above. It flows out from the inflow port 21 together with the cell mass. Thereby, the cell mass of the pluripotent stem cell trapped by the trap part 14 flows into the subculture filter part 15 with the fresh culture medium (arrow 105).
  • a cell mass of pluripotent stem cells that has reached the passage filter unit 15 from the trap unit 14 together with a fresh medium is divided when passing through the mesh 31.
  • the flow rate when the cell mass of pluripotent stem cells is passed through the mesh 31 is preferably a constant flow rate in the range of about 90 to 300 mL / min.
  • “about” is used to mean ⁇ 10%.
  • the flow velocity is a flow velocity in the second flow path 42 or the fourth flow path 44 due to the driving force of the pump 16.
  • the upper limit of the flow rate is not particularly limited, but if the flow rate is faster than about 300 mL / min, the average diameter of the cell mass that has passed through the mesh 31 tends to be small.
  • the cross-sectional area of the space where the mesh 31 in the main body 30 exists is larger than the cross-sectional area of the fourth flow path 44.
  • the flow rate of the cell mass (medium) passing through the region tends to be slow, particularly as the periphery of the mesh 31 becomes larger. Therefore, if the effective area of the mesh 31 changes, the area of the cell mass passing through the mesh 31 can also change. Therefore, the flow rate when passing the cell mass of other femoral sensory cells through the mesh 31 is per unit square centimeter of the mesh 31. It may be grasped as the flow velocity of For example, if the effective diameter of the disk-shaped mesh 31 is 11 mm, the flow rate per unit square centimeter of the mesh 31 is preferably in the range of about 95 to 315 mL / min.
  • the step of dividing the cell mass of pluripotent stem cells together with the fresh medium through the mesh 31 corresponds to the first dividing step.
  • the backwash medium is removed from the backwash container 18 in order to remove the clogged cell mass. May be allowed to flow into. Specifically, the operation of the pump 16 is temporarily stopped, the three-way stopcock 55 is switched, and the backwash container 18 and the passage filter unit 15 are connected through the seventh flow path 47.
  • the pump 16 is operated in the reverse direction (rightward in the passage filter unit 15 in FIG. 1), the backwash medium is transferred from the backwash container 18 to the inlet 32 from the outlet 33 of the passage filter unit 15.
  • the mesh 31 flows backward (arrow 106).
  • the medium for backwashing is preferably, for example, a medium used for the above-described suspension culture, to which a water-soluble polymer is not added.
  • a medium used for the above-described suspension culture to which a water-soluble polymer is not added.
  • the step of once removing the cell mass of the pluripotent stem cells together with the backwash medium from the mesh 31 and passing the mesh 31 again to divide it corresponds to the second dividing step.
  • the cell mass of pluripotent stem cells thus divided and having a size suitable for passage passes into the culture bag 11 together with a fresh medium. Thereby, pluripotent stem cells are passaged.
  • the pluripotent stem cell culture system 10 According to the pluripotent stem cell culture system 10 according to the present embodiment, a large amount of pluripotent stem cells can be cultured, and an automated system can be realized.
  • the backwash container 18 is reversed.
  • the washing medium is distributed to the mesh 31
  • the clogged cell mass is flowed to the backwashing medium and leaves the mesh 31.
  • the recovery rate of pluripotent stem cells is improved by circulating the medium through the passage filter unit 15 at a constant flow rate of 90 mL / min or more.
  • the cell recovery rate was measured when the flow rate of the medium passing through the passage filter unit 15 was 10 mL, 50 mL, 90 mL, 150 mL, and 300 mL per minute. Since the effective diameter of the mesh 31 is 11 mm, it becomes 10.5 mL, 52.6 mL, 94.7 mL, 157.9 mL, and 315.8 mL per minute when converted to the flow rate per unit square centimeter of the mesh 31.
  • methylcellulose solution 50 mL was added to 450 mL of DMEM / F12 medium (Life Technologies) and stirred well to obtain a backwash medium.
  • the culture medium was allowed to flow out from the culture bag 11 to the trap portion 14 together with the cell mass of pluripotent stem cells.
  • the cell mass was captured in the trap part 14 and only the medium was allowed to flow out to the waste liquid container 12 side.
  • the medium for backwashing was appropriately flowed back from the backwashing container 17 to the trap unit 14, and the medium was allowed to flow out while eliminating clogging of the mesh 23.
  • the fresh medium was caused to flow out from the fresh medium container 13 to the culture bag 11 through the trap part 14 and the passage filter part 15.
  • the cell mass trapped in the trap part 14 was passed through the mesh 31 (stainless steel, pore diameter 50 ⁇ m, aperture ratio 64%) of the passage filter part 15 and subcultured.
  • the backwashing medium 18 is appropriately returned to the passaging filter unit 15 to eliminate clogging of the mesh 31, and the clogged cell mass is also passed through the mesh 31 again. Divided.
  • the mesh 31 of the passage filter section 15 has an opening ratio of 72% (made of stainless steel, hole diameter 46 ⁇ m), 71% (made of stainless steel, hole diameter 55 ⁇ m), 64% (made of stainless steel, hole diameter 50 ⁇ m), 58% (made of PET, hole diameter) 98 ⁇ m), and the passage operation described above was performed for each.
  • the flow rate of the medium passing through the passage filter unit 15 was 90 mL per minute.
  • FIG. 6 shows the result of calculating the collection rate for each mesh 31 having an opening ratio. As is clear from FIG. 6, when the material of the mesh 31 is the same (made of stainless steel), it has been confirmed that the recovery rate is improved as the redness of the tree is higher.

Abstract

【課題】大量の多能性幹細胞を培養するに適したシステムを提供する。 【解決手段】培養システム１０は、培地中において多能性幹細胞を浮遊培養するための培養バッグ１１と、培養バッグ１１と接続されており、使用済みの培地を貯留する廃液容器１２と、培養バッグ１１と接続されており、新鮮な培地を貯留する新鮮培地容器１３と、培養バッグ１１から廃液容器１２又は新鮮培地容器１３などへの流路を切り換える三方活栓５１～５５と、廃液容器１２側への流れにおいて培地中の多能性幹細胞をトラップするトラップ部１４と、トラップ部１４と培養バッグ１１とを接続する第１流路４１と平行に設けられた第４流路及び第５流路４５に設けられており、多能性幹細胞の細胞塊を分割可能なメッシュ３１を有する継代用フィルタ部１５と、各流路において液体を流通させるためのポンプ１６と、を具備する。

Description

多能性幹細胞の培養システム及び多能性幹細胞の継代方法
　本発明は、多能性幹細胞を培養するシステム、及び多能性幹細胞を継代する方法に関する。
　癌化などを起こすことなく無制限に増殖可能で多分化能をもつ多能性幹細胞は、細胞移植治療や創薬スクリーニングなどへの応用が期待されている。
　従来、ヒト多能性幹細胞株は、フィーダー細胞又は各種高分子などに接着させる平面培養によって増殖維持されてきた。しかしながら、高品質のヒト多能性幹細胞を、安定して大量に培養する技術は未だ確立されていない。特に、実用化に必要となる大量の多能性幹細胞を調製するには、従来法である培養容器に接着させて継代により増殖させる方法では限界がある。例えば、ヒト多能性幹細胞用の接着基質材料として、品質面とコスト面で最適なものは開発されていない。また、継代には複雑な多段階の操作が必要であり、酵素処理など、安全面及びコスト面で不利なステップが含まれている。
　最近、接着基質が不要な浮遊培養法が報告されている（特許文献１～５）。浮遊培養法によれば、三次元的な培養が可能なので、より小さなスペースで大量の多能性幹細胞を培養することができる。
　また、継代のときの酵素処理に代替する方法として、多能性幹細胞の細胞塊をマイクログリッドに通過させて分割する方法が考案されている（特許文献６）。
国際公開第２０１１／０５８５５８号 国際公開第２００９／１１６９５１号 国際公開第２００８／１２０２１８号 国際公開第２００８／０１５６８２号 国際公開第２００７／００２０８６号 特表２０１０－５２６５３０号公報
　しかしながら、実用化に必要となる大量の多能性幹細胞を培養するシステムとして、自動化可能のものは未だ開発されていない。また、多能性幹細胞の細胞塊をマイクログリッドに通過させて分割する方法を、大量の多能性幹細胞の培養に採用すると、マイクログリッドの目詰まりが生じて、適切かつ効率的な継代が実現されないという問題が生じ得る。
　本発明は前述された問題に鑑みてなされたものであり、その目的は、大量の多能性幹細胞を培養するに適したシステムを提供することにある。
　また、本発明の他の目的は、大量の多能性幹細胞の継代に適した方法を提供することにある。
　(1)　本発明に係る多能性幹細胞の培養システムは、培地中において多能性幹細胞を浮遊培養するための培養容器と、液体を流通可能な流路により上記培養容器と接続されており、上記培養容器から流出した使用済みの培地を貯留する廃液容器と、液体を流通可能な流路により上記培養容器と接続されており、上記培養容器へ供給する新鮮な培地を貯留する新鮮培地容器と、上記培養容器から上記廃液容器又は上記新鮮培地容器への流路を切り換える第１切替部と、上記第１切替部より上記培養容器側の流路に設けられており、上記廃液容器側への流れにおいて培地中の多能性幹細胞をトラップするトラップ部と、上記トラップ部と上記培養容器との間において、上記トラップ部と上記培養容器とを接続する流路と平行に設けられた流路に設けられており、多能性幹細胞の細胞塊を分割可能なメッシュを有する継代用フィルタ部と、上記トラップ部から上記培養容器又は上記継代用フィルタ部への流路を切り換える第２切替部と、を具備する。
　多能性幹細胞の培養における培地の交換に際しては、培養容器から廃液容器へ培地が流出される。培養容器から培地とともに多能性幹細胞が流出するが、多能性幹細胞はトラップ部によってトラップされるので、廃液容器へは流入しない。第１切替部が切り換えられた後、新鮮培地容器から新鮮な培地が培養容器へ流出される。新鮮な培地がトラップ部を培養容器へ向かって通過することにより、トラップ部にトラップされていた多能性幹細胞は、新鮮な培地とともに培養容器へ流れ込む。このとき、第２切替部は、トラップ部から継代用フィルタ部を介さずに培養容器へ流れる流路に切り換えられている。これにより、培養容器の培地が交換され、新鮮な培地中で多能性幹細胞が培養される。
　継代に際しては、前述と同様にして、培養容器から廃液容器へ培地が流出され、多能性幹細胞はトラップ部にトラップされる。新鮮培地容器から新鮮な培地が培養容器へ流出される前に、第２切替部は、トラップ部から継代用フィルタ部を介して培養容器へ流れる流路に切り換えられる。新鮮な培地とともにトラップ部から継代用フィルタ部へ到達した多能性幹細胞の細胞塊は、メッシュを通過するときに分割される。分割されて継代に適した大きさとなった多能性幹細胞の細胞塊は、新鮮な培地とともに培養容器へ流れ込む。これにより、多能性幹細胞が継代される。
　(2)　本発明に係る多能性幹細胞の培養システムは、上記培養容器と上記継代用フィルタ部とを接続する流路に液体を流通可能に設けられており、継代用フィルタ部へ供給する逆洗用培地を貯留する逆洗用容器を、更に具備するものであってもよい。
　継代に際して、新鮮な培地とともにトラップ部から継代用フィルタ部へ到達した多能性幹細胞の細胞塊は、メッシュを通過するときに分割されるが、分割されずにメッシュに目詰まりする細胞塊が存在する。逆洗用容器から逆洗用培地がメッシュへ流通されることにより、目詰まりした細胞塊が逆洗用培地に流されてメッシュから離れる。これにより、メッシュの目詰まりを解消することができる。
　(3)　本発明に係る多能性幹細胞の培養システムは、上記各流路における液体の流速を制御するための制御部を更に具備しており、当該制御部は、上記継代用フィルタ部のメッシュを通過する液体の単位平方センチメートル当たりの流速を毎分９５ｍＬ以上とするものであってもよい。
　継代に際して、継代用フィルタ部のメッシュの単位平方センチメートル当たりの流速を毎分９５ｍＬ以上とすることにより、多能性幹細胞の回収率が向上する。
　(4)　本発明に係る多能性幹細胞の培養システムは、上記各流路において液体を流通させるためのポンプと、当該ポンプの駆動を制御する制御部を更に具備しており、当該制御部は、少なくとも上記トラップ部から上記継代用フィルタ部への流れにおいて、上記ポンプを毎分９０ｍＬ以上の一定の流速で駆動するものであってもよい。
　継代に際して、毎分９０ｍＬ以上の一定の流速で培地を継代用フィルタ部へ流通させることにより、多能性幹細胞の回収率が向上する。
　(5)　上記多能性幹細胞として、ＥＳ細胞又はｉＰＳ細胞が挙げられる。
　(6)　上記多能性幹細胞として、ヒト由来のものが挙げられる。
　(7)　本発明に係る多能性幹細胞の継代方法は、多能性幹細胞の細胞塊を浮遊培養する培養工程と、培養された多能性幹細胞の細胞塊を、培地が流通可能な流路に設けられたメッシュに培地ともに一方向へ流通させることにより分割して培養容器へ収容する第１分割工程と、上記培養容器への流路を閉鎖した後、上記メッシュへ上記分割工程と逆方向へ培地を流通させて、メッシュに目詰まりした細胞塊を除去する逆洗工程と、上記培養容器への流路を開放した後、除去された細胞塊を培地とともに一方向へ流通させることにより分割して培養容器へ収容する第２分割工程と、を含む。
　これにより、第１分割工程においてメッシュに目詰まりした細胞塊を、逆洗工程においてメッシュから離れさせて目詰まりを解消し、第２分割工程においてメッシュにより離れた細胞塊を分割することができるので、継代の際の多能性幹細胞の回収率が向上する。
　(8)　上記多能性幹細胞として、ＥＳ細胞又はｉＰＳ細胞が挙げられる。
　(9)　上記多能性幹細胞として、ヒト由来のものが挙げられる。
　本発明に係る多能性幹細胞の培養システムによれば、大量の多能性幹細胞を培養することができ、自動化されたシステムが実現可能である。
　また、本発明に係る多能性幹細胞の継代方法によれば、メッシュの目詰まりを抑制して、大量の多能性幹細胞の継代が実現できる。
本発明の実施形態に係る培養システム１０の概要を示す概略図である。 トラップ部１４の内部構造を示す断面図である。 継代用フィルタ部１５の内部構造を示す断面図である。 メッシュ３１を通過する培地の流速に対する細胞の回収率を示す図である。 メッシュ３１を通過した細胞塊の大きさの分布を示す図である。 メッシュ３１の開口率に対する細胞の回収率を示す図である。
　以下、図面が参照されつつ本発明の実施形態が説明される。なお、本実施形態は、本発明の一例にすぎず、本発明の要旨が変更されない範囲において、本実施形態が適宜変更されてもよいことは言うまでもない。
［培養システム１０］
　図１に示されるように、多能性幹細胞の培養システム１０は、培養バッグ１１と、廃液容器１２と、新鮮培地容器１３と、トラップ部１４と、継代用フィルタ部１５と、ポンプ１６と、逆洗用容器１７，１８と、が流路により接続されたものである。
　培養バッグ１１は、培地中において多能性幹細胞を浮遊培養可能な樹脂製のバッグであり、内部空間に液体を封入可能である。また、培養バッグ１１の外壁を構成する樹脂シートは、二酸化炭素などのガス透過性の高いものが好適である。培養バッグ１１には、その内部空間に培地などの流動体を流出入可能とするポートが適宜設けられている。培養バッグ１１は、平面視において矩形の外形であるが、形状は特に限定されるものではなく、充填される培地の容量、操作性などを考慮して、形状及び容量が設定される。
　なお、図１には示されていないが、培養バッグ１１は、その周囲の環境が培養に適した温度及び湿度となるように、インキュベータ等に収納されている。また、多能性幹細胞の細胞塊が凝集することを防ぐために、必要に応じて培養バッグ１１を姿勢変化させる機構が設けられていてもよい。
　廃液容器１２は、培養バッグ１１から培地交換のために流出された使用済みの培地などを貯留可能な容器である。廃液容器１２の形状及び容量は、培養バッグ１１の容量や使用済み培地を貯留する日数などに応じて適宜設定される。
　新鮮培地容器１３は、培地交換において培養バッグ１１へ供給する新鮮な培地を貯留可能な容器である。新鮮培地容器１３の形状及び容量は、培養バッグ１１の容量や培地交換の頻度などに応じて適宜設定される。
　図２に示されるように、トラップ部１４は、培地とともに流入した多能性幹細胞の細胞塊をトラップして、培地のみを流出させるものである。トラップ部１４は、概ね筒形状の本体２０の下側に流入口２１が形成されており、本体２０の上側に流出口２２が形成されている。流入口２１は、本体２０の内部空間へ通じている。流入口２１を通じて本体２０の内部空間へ培地とともに多能性幹細胞の細胞塊が流入可能である。
　流出口２２は、本体２０の内部空間へ通じており、本体２０の内部空間への出口にメッシュ２３が設けられている。メッシュ２３は、多能性幹細胞の細胞塊が通過できない大きさの孔が多数形成された薄膜形状である。流入口２１から本体２０の内部空間へ培地とともに流入した多能性幹細胞の細胞塊は、自重によって本体２０の内部空間の下側に滞留する。本体２０の内部空間において上側まで到達した多能性幹細胞の細胞塊は、メッシュ２３に阻まれて、流出口２２から流出することがない。
　なお、各図には示されていないが、トラップ部１４は、多能性幹細胞の細胞塊の凝集や、メッシュ２３の目詰まりを防ぐために、必要に応じて本体２０を弾性的に変形させたり、メッシュ２３に振動を与えたりする機構が設けられていてもよい。
　図３に示されるように、継代用フィルタ部１５は、培地とともに流入した多能性幹細胞の細胞塊を分割するものである。継代用フィルタ部１５は、メッシュ３１を収容する本体３０を有する。本体３０は、流入口３２及び流出口３３を有する。流入口３２及び流出口３３は、本体３０の内部空間へ通じている。本体３０の内部空間には、流入口３２から流出口３３へ通じる流路を隔てるようにメッシュ３１が設けられている。
　メッシュ３１の素材は、滅菌可能なものであれば特に制限されず、例えば、ナイロンやポリエチレンテレフタレートなどの合成樹脂や、ステンレスなどの金属が採用され得る。ステンレス製のメッシュ３１は、メッシュ３１を構成する繊維の太さを細くして、開口率（メッシュ３１の単位面積当たりに開口（孔）が占める率）を大きくできるので好ましい。メッシュ３１の開口率が大きいほど、培養バッグ１１に回収される多能性幹細胞の回収率がよくなる傾向にある。
　メッシュ３１の孔径は、分割後の細胞塊の平均直径が約８０～１２０μｍ、好ましくは約８０μｍとなるような孔径であればよく、例えば、ステンレス製のメッシュであれば、孔径が約４０～１００μｍ、好ましくは約５０～７０μｍ、より好ましくは約５０μｍが挙げられる。ここで「約」とは、±１０％を許容する意味で用いられる。メッシュ３１の形状等の特に限定されないが、細胞にできるだけダメージを与えないような太さと形状であることが好ましい。また、メッシュ３１において細胞塊が通過しうる領域の面積が広いほど、細胞塊の数が増えても目詰まりが生じ難くなるので好ましい。
　ポンプ１６は、各流路において培地等を流通させるためのものであり、典型例としてペリスタポンプが挙げられる。各図には示されていないが、ポンプ１６は演算装置を制御部として備えており、入力された流速に応じて、ポンプ１６が一定の流速で培地等を流通させるように動作する。
　なお、本実施形態では、各流路において培地等を流通させる駆動源としてポンプ１６が用いられるが、ポンプ１６に代えて、例えば、培養バッグ１１等を圧縮変形させたり、廃液容器１２等の空気層の圧力を変動させたりして、培養バッグ１１等から培地を流出させたり、廃液容器１２等へ培地が流入したりするようにしてもよい。また、例えば、重力を利用して、培養バッグ１１と、廃液容器１２及び新鮮培地容器１３との相対的な高さ関係を変化させて、培養バッグ１１と、廃液容器１２及び新鮮培地容器１３との間で培地等を流通させることとしてもよい。
　以下、培養バッグ１１、廃液容器１２、新鮮培地容器１３、トラップ部１４、継代用フィルタ部１５、ポンプ１６、及び逆洗用容器１７，１８をそれぞれ接続する流路が説明される。各流路は、例えば樹脂製のチューブにより構成され、流量や流速などに応じて内径や長さなどが適宜選択される。また、各流路を構成するチューブは１本で構成されていても、複数本のチューブがジョイントなどにより接続されて構成されていてもよい。
　培養バッグ１１は、第１流路４１によってトラップ部１４と接続されている。第１流路４１は、培養バッグ１１のポートとトラップ部１４の流入口２１とを接続する。トラップ部１４は、第２流路４２によって廃液容器１２と接続されている。第２流路４２は、トラップ部１４の流出口２２と廃液容器１２とを接続する。第２流路４２に、ポンプ１６が設けられている。ポンプ１６は、第２流路４２の一部を構成するチューブをトラップ部１４側又は廃液容器１２側へ選択的に脈動させることにより、第２流路４２において一方向へ送液する。
　第２流路４２における廃液容器１２とポンプ１６との間に三方活栓５１が設けられている。三方活栓５１は、第３流路４３によって新鮮培地容器１３と接続されている。三方活栓５１が切り替えられることによって、トラップ部１４が廃液容器１２又は新鮮培地容器１３と選択的に接続される。
　第１流路４１には２つの三方活栓５２，５３が設けられている。三方活栓５２は、第４流路４４によって継代用フィルタ部１５と接続されている。第４流路４４は、三方活栓５２と継代用フィルタ部１５の流入口３２とを接続する。三方活栓５２が切り替えられることによって、トラップ部１４が培養バッグ１１又は継代用フィルタ部１５と選択的に接続される。
　三方活栓５３は、第５流路によって継代用フィルタ部１５と接続されている。第５流路４５は、三方活栓５３と継代用フィルタ部１５の流出口３３とを接続する。三方活栓５３が切り替えられることによって、培養バッグ１１がトラップ部１４又は継代用フィルタ部１５と選択的に接続される。
　第２流路４２におけるトラップ部１４とポンプ１６との間に三方活栓５４が設けられている。三方活栓５４は、第６流路４６によって逆洗用容器１７と接続されている。三方活栓５４が切り替えられることによって、ポンプ１６が、トラップ部１４又は逆洗用容器１７と選択的に接続される。
　第５流路４５における培養バッグ１１と継代用フィルタ部１５との間に三方活栓５５が設けられている。三方活栓５５は、第７流路４７によって逆洗用容器１８と接続されている。三方活栓５５が切り替えられることによって、継代用フィルタ部１５が培養バッグ１１又は逆洗用容器１８と選択的に接続される。
　なお、各図には示されていないが、各三方活栓５１～５５は、モータなどの駆動源から駆動伝達されることによって切り替え可能に構成されていてもよい。また、各流路の切り替えは、三方活栓以外の弁などによって実現されていてもよい。三方活栓５１，５４が第１切替部に相当し、三方活栓５２～５５が第２切替部に相当する。
［多能性幹細胞の培養］
　培養システム１０は、多能性幹細胞の培養に用いることができる。培養システム１０によって培養可能な多能性幹細胞は、未分化状態を保持したまま増殖できる「自己再生能」と、三胚葉系列すべてに分化できる「分化多能性」とを有する未分化細胞であれば特に制限されない。このような多能性幹細胞として、例えば、ＥＳ細胞、人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）の他、始原生殖細胞に由来するmutipotent germline stem (mGS)細胞、骨髄から単離されるmultipotent adult progenitor cell (MAPC)などが挙げられる。ＥＳ細胞は、体細胞から核初期化されて生じたＥＳ細胞であってもよい。これらのうち好ましいものとして、ＥＳ細胞又はｉＰＳ細胞が挙げられる。培養システム１０による培養は、多能性幹細胞が樹立されているか又は樹立可能である、任意の哺乳動物において適用することができる。このような哺乳動物として、例えば、ヒト、マウス、サル、ブタ、ラット、イヌなどが挙げられ、好ましくはヒト又はマウスであり、特に好ましくはヒトである。
　ＥＳ細胞は、対象動物の受精卵の胚盤胞から内部細胞塊を取り出し、内部細胞塊を繊維芽細胞のフィーダー上で培養することによって樹立することができる。また、継代培養による細胞の維持は、白血病抑制因子（leukemia inhibitory factor (LIF)）、塩基性繊維芽細胞成長因子（basic fibroblast growth factor (bFGF)）などの物質を添加した培養液を用いて行うことができる。ヒト及びサルのＥＳ細胞の樹立と維持の方法については、例えば、USP5,843,780; Thomson JA, et al. (1995), Proc Natl. Acad. Sci. USA. 92: 7844-7848; Tomson JA, et al. (1998), Science. 282: 1145-1147; H. Suemori et al. (2006), Biochem. Biophys. Res. Commun., 345: 926-932; M. Ueno et al. (2006), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 103: 9554-9559; H. Suemori et al. (2001), Dev. Dyn., 222: 273-279; H. Kawasaki et al. (2002), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 99: 1580-1585; Klimanskaya I, et al. (2006), Nature. 444: 481-485などに記載されている。
　ＥＳ細胞作成のための培養液として、例えば、０．１ｍＭ　２－メルカプトエタノール、０．１ｍＭ　必須アミノ酸、２ｍＭ　Ｌ－グルタミン酸、２０％　ＫＳＲ及び４ｎｇ／ｍＬ　ｂＦＧＦを補充したＤＭＥＭ／Ｆ－１２　培養液（又は、合成培地：mTeSR、Stem Proなど）を使用し、３７℃、２％ＣＯ２／９８％空気の湿潤雰囲気下でヒトＥＳ細胞を維持することができる（O. Fumitake et al. (2008）, Nat. Biotechnol., 26: 215-224）。また、ＥＳ細胞は、３～４日おきに継代する必要があり、このとき、継代は、例えば１ｍＭ　ＣａＣｌ２及び２０％　ＫＳＲを含有するＰＢＳ中の０．２５％　トリプシン及び０．１ｍｇ／ｍＬ　コラゲナーゼＩＶを用いて行うことができる。
　ＥＳ細胞の選択は、一般に、アルカリホスファターゼ、Oct-3/4、Nanogなどの遺伝子マーカーの発現を指標にしてReal-Time PCR法により行うことができる。特に、ヒトＥＳ細胞の選択では、Oct-3/4、Nanog、ECADなどの遺伝子マーカーの発現を指標とすることができる（E. Kroon et al. (2008）, Nat. Biotechnol., 26: 443-452）。
　ヒトＥＳ細胞株は、例えばWA01(H1)及びWA09(H9)は、WiCell Research Instituteから入手可能であり、また、KhES-1、KhES-2及びKhES-3は、京都大学再生医科学研究所（京都、日本）から入手可能である。
　***幹細胞は、精巣由来の多能性幹細胞であり、***形成のための起源となる細胞である。この細胞は、ＥＳ細胞と同様に、種々の系列の細胞に分化誘導可能であり、例えばマウス胚盤胞に移植するとキメラマウスを作出できるなどの性質をもつ（M. Kanatsu－Shinohara et al. (2003） Biol. Reprod., 69: 612-616; K. Shinohara et al. (2004), Cell, 119: 1001-1012）。神経膠細胞系由来神経栄養因子（glial cell line-derived neurotrophic factor (GDNF)）を含む培養液で自己複製可能であるし、また、ＥＳ細胞と同様の培養条件下で継代を繰り返すことによって、***幹細胞を得ることができる（竹林正則ら（２００８）、実験医学、２６巻、５号（増刊）、４１～４６頁、羊土社（東京、日本））。
　胚性生殖細胞は、胎生期の始原生殖細胞から樹立される、ＥＳ細胞と同様な多能性をもつ細胞であり、LIF、bFGF、幹細胞因子（stem cell factor）などの物質の存在下で始原生殖細胞を培養することによって樹立しうる（Y. Matsui et al. (1992）, Cell, 70: 841-847; J.L. Resnick et al. (1992), Nature, 359: 550-551）。
　人工多能性幹（ｉＰＳ）細胞は、特定の初期化因子を、ＤＮＡ又はタンパク質の形態で体細胞に導入することによって作製することができる、ＥＳ細胞とほぼ同等の特性、例えば分化多能性と自己複製による増殖能、を有する体細胞由来の人工の幹細胞である（K. Takahashi and S. Yamanaka (2006) Cell, 126: 663-676; K. Tkahashi et al. (2007）, Cell, 131: 861-872; J. Yu et al. (2007), Science, 318: 1917-1920; Nakagawa, M. et al. Nat. Biotechnol. 26: 101-106 (2008); 国際公開第２００７－０６９６６６号）。初期化因子は、ＥＳ細胞に特異的に発現している遺伝子、その遺伝子産物若しくはnon-cording RNA又はＥＳ細胞の未分化維持に重要な役割を果たす遺伝子、その遺伝子産物若しくはnon-cording RNA、或いは低分子化合物によって構成されていてもよい。初期化因子に含まれる遺伝子として、例えば、Oct3/4、Sox2、Sox1、Sox3、Sox15、Sox17、Klf4、Klf2、c-Myc、N-Myc、L-Myc、Nanog、Lin28、Fbx15、ERas、ECAT15-2、Tcl1、beta-catenin、Lin28b、Sall1、Salll4、Esrrb、Nr5a2、Tbx3又はGlislなどが例示される。これらの初期化因子は、単独で用いてもよく、組み合わせて用いてもよい。初期化因子の組み合わせとしては、国際公開第２００７／０６９６６６号、国際公開第２００８／１１８８２０号、国際公開第２００９／００７８５２号、国際公開第２００９／０３２１９４号、国際公開第２００９／０５８４１３号、国際公開第２００９／０５７８３１号、国際公開第２００９／０７５１１９号、国際公開第２００９／０７９００７号、国際公開第２００９／０７９００７号、国際公開第２００９／０９１６５９号、国際公開第２００９／１０１０８４号、国際公開第２００９／１０１４０７号、国際公開第２００９／１０２９８３号、国際公開第２００９／１１４９４９号、国際公開第２００９／１１７４３９号、国際公開第２００９／１２６２５０号、国際公開第２００９／１２６２５１号、国際公開第２００９／１２６６５５号、国際公開第２００９／１５７５９３号、国際公開第２０１０／００９０１５号、国際公開第２０１０／０３３９０６号、国際公開第２０１０／０３３９２０号、国際公開第２０１０／０４２８００号、国際公開第２０１０／０５０６２６号、国際公開第２０１０／０５６８３１号、国際公開第２０１０／０６８９５５号、国際公開第２０１０／０９８４１９号、国際公開第２０１０／１０２２６７号、国際公開第２０１０／１１１４０９号、国際公開第２０１０／１１１４２２号、国際公開第２０１０／１１５０５０号、国際公開第２０１０／１２４２９０号、国際公開第２０１０／１４７３９５号、国際公開第２０１０／１４７６１２号、Huangfu D, et al. (2008), Nat. Biotechnol., 26: 795-797; Shi Y et al. (2008), Cell Stem Cell, 2: 525-528; Eminli S et al. (2008), Stem Cells. 26: 2467-2474; Huangfu D et al. (2008), Nat. Biotecnol. 26: 1269-1275; Shi Y et al. (2008), Cell Stem Cell, 3: 568-574; Zhao Y et al. (2008), Cell Stem Cell, 3: 475-479; Marson A, (2008), Cell Stem Cell, 3: 132-135; Feng B et al. (2009), Nat Cell Biol. 11: 197-203; R.L.Judson et al. (2009), Nat. Biotech., 27: 459-461; Lyssiotis CA et al. (2009), Proc. Natl. Acad Sci. USA. 106: 8912-8917; Kim JB et al. (2009), Nature. 461: 643-649; Ichida JK et al. (2009), Cell Stem Cell. 5: 491-503; Heng JC et al. (2010), Cell Stem Cell. 6: 167-174; Han J et al. (2010), Nature. 463: 1096-1100; Mali P et al. (2010), Stem Cells. 28: 713-720; Maekawa M et al. (2011), Nature. 474: 225-229に記載の組み合わせが例示される。
　上記初期化因子には、ヒストンデアセチラーゼ（HDAC）阻害剤（例えば、バルプロ酸（VPA）、トリコスタチンＡ、酪酸ナトリウム、MC1293, M344等の低分子阻害剤、HDACに対するsiRNA及びshRNA（例：HDAC1 si RNA Smartpool（登録商標）、millipore）、HuSH 29mer shRNA Constructs against HDAC1 (OriGene)等）等の核酸性発現阻害剤など）、MEK阻害剤（例えば、PD184352, PD98059, U0126, SL327, PD0325901）、Glycogen synthase kinase-3阻害剤（例えば、Bio, CHIR99021）、DNAメチルトランスフェラーゼ阻害剤（例えば、5-azacytidine）、ヒストンメチルトランスフェラーゼ阻害剤（例えば、BIX-01294等の低分子阻害剤、Suv39HL, Suv39h2, SetDB1,G9aに対するsiRNA及びshRNA等の核酸性発現阻害剤など）、L-channel calcium agonist（例えば、Bayk8644）、酪酸、TGFβ阻害剤又はALK5阻害剤（例えば、LY364947, SB431542, 616453, A-83-01）、p53阻害剤（例えば、p53に対するsiRNA及びshRNA）、ARID3A阻害剤（例えば、ARID3Aに対するsiRNA及びshRNA）、miR-291-3p, miR-294, miR-295, miR-302などのmiRNA）、Wnt Signaling（例えば、soulble Wnt3a）、神経ペプチドY、プロスタグランジン類（例えば、プロスタグランジンE2及びプロスタグランジンJ2）、hTERT, SV40LT, UTF1, IRX6, GLIS1, PITX2, DMRTB1等の樹立効率を高めることを目的として用いられる因子も含まれており、本明細書においては、これらの樹立効率の改善目的にて用いられた因子についても初期化因子と別段の区別をしないものとする。
　初期化因子は、タンパク質の形態の場合、例えば、リポフェクション、細胞膜透過性ペプチド（例えば、HIV由来のTAT及びポリアルギニン）との融合、マイクロインジェクションなどの手法によって体細胞内に導入してもよい。
　一方、DNA形態の場合、例えば、ウイルス、プラスミド、人工染色体などのベクター、リポフェクション、リポソーム、マイクロインジェクションなどの手法によって体細胞内に導入することができる。ウイルスベクターとしては、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター（以上、Cell, 126, pp.663-676, 2006; Cell, 131, pp.861-872, 2007; Science, 318, pp.1917-1920, 2007）、アデノウイルスベクター（Science, 322, 945-949, 2008）、アデノ随伴ウイルスベクター、センダイウイルスベクター（国際公開第２０１０／００８０５４号）などが例示される。また、人工染色体ベクターとしては、例えば、ヒト人工染色体（HAC）、酵母人工染色体（YAC）、細菌人工染色体（BAC, PAC）などが含まれる。プラスミドとしては、哺乳動物細胞用プラスミドを使用しうる（Science, 322: 949-953, 2008）。ベクターには、核初期化物質が発現可能なように、プロモーター、エンハンサー、リボゾーム結合配列、ターミネーター、ポリアデニル化サイドなどの制御配列を含むことができるし、さらに、必要に応じて、薬剤耐性遺伝子（例えば、カナマイシン耐性遺伝子、アンピシリン耐性遺伝子、ピューロマイシン耐性遺伝子など）、チミジンキナーゼ遺伝子、ジフテリアトキシン遺伝子などの選択マーカー配列、緑色蛍光タンパク質（GFP）、βグルクロニダーゼ（GUS）、FLAGなどのレポーター遺伝子配列などを含むことができる。また、上記ベクターには、体細胞への導入後、初期化因子をコードする遺伝子又はプロモーターとそれに結合する初期化因子をコードする遺伝子をともに切除するために、それらの前後にLoxP配列を有してもよい。
　また、RNA形態の場合、例えば、リポフェクション、マイクロインジェクションなどの手法によって体細胞内に導入してもよく、分解を抑制するために、５－メチルシチジン及びpseudouridine (TriLink Biotechnologies)を取り込ませたRNAを用いてもよい（Warren L, (2010） Cell Stem Cell. 7: 618-630）。
　iPS細胞誘導のための培養液（これらの培養液は、さらに、LIF, penicillin/streptomycin, puromycin, Ｌ－グルタミン、非必須アミノ酸類、β－メルカプトエタノールなどを適宜含むことができる。）又は市販の培養液（例えば、マウスES細胞培養用培養液（TX-WES培養液、トロンボＸ社）、霊長類ES細胞培養用培養液（霊長類ES/iPS細胞用培養液、リプロセル社）、無血清培地（mTeSR, Stemcell Technology社）などが含まれる。
　培養法の例としては、例えば、３７℃、５％ＣＯ２存在下にて、１０％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ又はＤＭＥＭ／Ｆ１２培養液上で体細胞と初期化因子とを接触させ、約４～７日間培養し、その後、細胞をフィーダー細胞（例えば、マイトマイシンＣ処理ＳＴＯ細胞、ＳＮＬ細胞等）上にまきなおし、体細胞と初期化因子の接触から約１０日後からｂＦＧＦ含有霊長類ＥＳ細胞培養用培養液で培養し、接触から約３０～４５日又はそれ以上の後に、ｉＰＳ様コロニーを生じさせることができる。
　あるいは、３７℃、５％ＣＯ２存在下にて、フィーダー細胞（例えば、マイトマイシンＣ処理ＳＴＯ細胞、ＳＮＬ細胞等）上で１０％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ培養液（これらの培養液は、さらに、LIF, penicillin/streptomycin, puromycin, Ｌ－グルタミン、非必須アミノ酸類、β－メルカプトエタノールなどを適宜含むことができる。）で培養し、約２５～３０日又はそれ以上の後に、ＥＳ様コロニーを生じさせることができる。望ましくは、フィーダー細胞の代わりに、初期化される体細胞そのものを用いる（Takahashi K et al. (2009）, PLoS One. 4: e8067、又は国際公開第２０１０／１３７７４６号）、もしくは、細胞外基質（例えば、Laminin（国際公開第２００９／１２３３４９号）、マトリゲル（ＢＤ社））を用いる方法が例示される。
　この他にも、血清を含有しない培地を用いて培養する方法も例示される（Sun N et al. (2009）, Proc Natl Acad Sci USA. 106: 15720-15725）。さらに、樹立効率を上げるため、底酸素条件（０．１％以上、１５％以下の酸素濃度）によりiPS細胞を樹立してもよい（Yoshida Y et al. (2009）, Cell Stem Cell. 5: 237-241、国際公開第２０１０／０１３８４５号）。
　上記培養の間には、培養開始２日目以降から毎日１回新鮮な培養液と培養液交換を行う。また、核初期化に使用する体細胞の細胞数は、限定されないが、培養ディッシュ１００ｃｍ２当たり約５×１０３～５×１０６細胞の範囲である。
　iPS細胞は、形成したコロニーの形状により選択することが可能である。一方、体細胞が初期化された場合に発現する遺伝子（例えば、Oct3/4, Nanog）と連動して発現する薬剤耐性遺伝子をマーカー遺伝子として導入した場合は、対応する薬剤を含む培養液（選択培養液）で培養を行うことにより樹立したiPS細胞を選択することができる。また、マーカー遺伝子が蛍光タンパク質遺伝子の場合は、蛍光顕微鏡で観察することにより樹立したiPS細胞を選択することができ、発光酵素遺伝子の場合は、発光基質を加えることにより樹立したiPS細胞を選択することができ、発色酵素遺伝子の場合は、発色基質を加えることにより樹立したiPS細胞を選択することができる。
［多能性幹細胞の浮遊培養（培養工程）］
　前述されたようにして調製された多能性幹細胞を、培養システム１０にて浮遊培養する。具体的には、培養バッグ１１に、多能性幹細胞を培地とともに充填して、多能性幹細胞の細胞塊の平均直径が約２００～３００μｍとなるまで浮遊培養する。ここで、「約」とは、±１０％を許容する意味で用いられる。細胞塊の直径が３００μｍを超えると、細胞が分泌するサイトカイン等の影響で微小環境が形成され、分化が誘導されてしまう。また、細胞塊の中心部で壊死が起こるため、生細胞の回収率が悪くなるという問題がある。一方、細胞塊の平均直径の下限は、浮遊培養開始時（継代後の浮遊培養では継代時）の細胞塊の平均直径より大きいサイズであれば特に制限はないが、多能性幹細胞の収率を考慮すれば約２００μｍ以上まで培養を続けることが好ましい。
　浮遊培養用の培地としては、前述された付着培養用の培地と同様の組成のものを使用することができるが、好ましくは、細胞塊の移動と細胞塊同士の密着を防ぐため、培地に適度な粘性を付与することが望ましい。ここで、適度な粘性とは、培地交換を妨げないで細胞塊同士の接着が起こらない程度の粘性を意味する。
　培地に粘性を付与する手段は特に限定されないが、例えば、水溶性高分子を適当な濃度で培地に添加することにより実施されうる。水溶性高分子としては、培地に適度な粘性を付与しうるものであって、粘性を付与しうる濃度範囲において、細胞に悪影響を及ぼさない（細胞毒性がない）ものであれば、如何なる水溶性高分子も使用することができる。例えば、セルロース、アガロースなどの多糖、メチルセルロース、エチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシエチルメチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ヒドロキシエチルエチルセルロース、ヒドロキシプロピルエチルセルロース、エチルヒドロキシエチルセルロース、ジヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシエチルヒドロキシプロピルセルロースなどの多糖のエーテル、ポリアクリルアミド、ポリエチレンオキシド、ポリビニルピロリドン、エチレングリコール／プロピレングリコール共重合体、ポリエチレンイミンポリビニルメチルエーテル、ポリビニルアルコール、ポリアクリル酸、マレイン酸共重合体などの合成高分子、コラーゲン、ゼラチン、ヒアルロン酸、デキストラン、アルギン酸、カラゲーナン、デンプンなどの生体高分子、あるいはそれらを模倣した人工高分子（例えば、エラスチン様ペプチドなど）が挙げられる。これら水溶性高分子は単独で用いてもよいし、何種類かの水溶性高分子の混合物として用いることもできる。また、これら水溶性高分子の共重合体を用いてもよい。好ましくは、メチルセルロース、ポリエチレングリコール、ポリビニルピロリドン、カルボキシメチルセルロース、又はそれらの混合物である、より好ましくはメチルセルロースである。
　例えば、粘性を付与するためにメチルセルロースを培地に添加する場合、メチルセルロースの濃度としては、０．２５ｗ／ｖ％より高く、０．５ｗ／ｖ％より低い濃度が好ましい。メチルセルロースの濃度が０．２５ｗ／ｖ％以下では粘性が低すぎて所望の効果が得られず、また、０．５ｗ／ｖ％以上ではトラップ部１４や継代用フィルタ部１５を通過し難くなる。好ましくは、メチルセルロースの濃度は、０．２６～０．３ｗ／ｖ％であり、特に好ましくは、０．２８ｗ／ｖ％である。他の水溶性高分子を用いる場合でも、当業者は前述された適度な粘性を得るために、他の水溶性高分子も濃度を適宜選択することができる。
　また、別の好ましい態様においては、水溶性高分子として、昇温型温度感受性ハイドロゲルを用いることができる。「昇温型温度感受性ハイドロゲル」とは、低温では液体であるが、昇温によりゲル化し、室温に冷却すると再ゾル化する可逆的なゾル－ゲル相転移を示すハイドロゲルを意味する。昇温型温度感受性ハイドロゲルの例として、２７～３２℃のゲル化転移温度を示す商品名「Mebiol gel」シリーズ（メビオール株式会社）等が挙げられるが、これに限定されない。昇温型温度感受性ハイドロゲルを用いる場合は、浮遊細胞塊の移動及び細胞塊同士の密着を阻止するのに十分な粘性を付与しうる濃度でハイドロゲルを添加し、継代に適したサイズまで浮遊培養により増殖させた後、ゲル化転移温度以下にまで冷却して培養液をゾル化し、トラップ部１４又は継代用フィルタ部１５を通過させることにより容易に細胞を回収することができる。
　培養は、付着培養した多能性幹細胞を酵素処理により解離し、培養バッグ１１中に、例えば、約０．５～５０×１０４細胞／ｃｍ２、好ましくは、約１～１０×１０４細胞／ｃｍ２の細胞密度となるように播種し、培養システム１０におけるＣＯ２環境の中、約１～１０％、好ましくは約２～５％ＣＯ２濃度の雰囲気下、約３０～４０℃、好ましくは約３７度で、１～７日間、好ましくは３～６日間、より好ましくは４，５日間行われる。
　前述された培養の間に、好ましくは１，２日毎に培養バッグ１１中の培地が新鮮な培地と交換される。培地の交換に際しては、培養バッグ１１から廃液容器１２へ培地が流出される（矢印１０１）。三方活栓５１～５４が操作されることによって、培養バッグ１１からトラップ部１４を介して廃液容器１２への流路が開かれる。ポンプ１６が動作されることによって、一定の流速で培養バッグ１１から第１流路４１及び第２流路４２を通じて廃液容器１２へ培地が流れる。流速は、毎分約５～５０ｍＬの範囲の一定の流速であることが好ましく、より好ましくは、毎分約８～１０ｍＬの範囲の一定の流速である。
　培養バッグ１１から培地とともに多能性幹細胞の細胞塊が流出するが、細胞塊はトラップ部１４によってトラップされるので、廃液容器１２へは流入しない。具体的には、本体２０の下側の流入口２１から本体２０の内部空間へ培地とともに多能性幹細胞の細胞塊が流入する。本体２０の内部空間において細胞塊は、自重によって本体２０の内部空間の下側に滞留する。一方、培地は、流出口２２を本体２０の内部空間から流出する。また、本体２０の内部空間において上側まで到達した細胞塊は、メッシュ２３に阻まれて流出口２２から流出することがない。
　培養バッグ１１中の培地がすべて流出されると、三方活栓５１が切り替えられて、培養バッグ１１と新鮮培地容器１３とがトラップ部１４を介して接続される。ポンプ１６が動作されることによって、一定の流速で新鮮培地容器１３から第１流路４１、第２流路４２及び第３流路４３を通じて培養バッグ１１へ新鮮な培地が流れる（矢印１０２）。流速は、毎分約５０～１５０ｍＬの範囲の一定の流速であることが好ましく、より好ましくは、毎分約８０～１００ｍＬの範囲の一定の流速である。
　新鮮培地容器１３から流出した新鮮な培地は、トラップ部１４の流出口２２から本体２０の内部空間へ流入する。そして、本体２０の内部空間の下側に滞留した多能性幹細胞の細胞塊とともに、流入口２１から流出し、第１流路４１を通じて培養バッグ１１へ流れる（矢印１０３）。これにより、トラップ部１４にトラップされていた多能性幹細胞の細胞塊は、新鮮な培地とともに培養バッグ１１へ流れ込む。
　なお、トラップ部１４のメッシュ２３に細胞塊が目詰まりしている場合には、目詰まりした細胞塊を除去するために、逆洗用容器１７から逆洗用培地をトラップ部１４へ流入させてもよい。
　逆洗用培地は、例えば、前述された浮遊培養に用いられる培地であって、水溶性高分子が添加されてないものが好ましい。粘性の低い逆洗用培地がトラップ部１４のメッシュ２３を通過することによって、メッシュ２３に目詰まりした細胞塊がメッシュ２３から剥がれやすくなる。逆洗用培地の流量や流速は、メッシュ２３の目詰まりの程度に応じて適宜選択される。
　具体的には、培養バッグ１１からトラップ部１４を通じて廃液容器１２へ培地が流出されているときに、ポンプ１６の動作が一時停止され、三方活栓５４が切り替えられて、逆洗用容器１７とポンプ１６とが第６流路４６を通じて接続される。そして、ポンプ１６が再び動作されると、逆洗用容器１７から逆洗用培地が第６流路４６を通じて第２流路４２を新鮮培地容器１３へ向かって流れる（矢印１０４）。第２流路４２内に逆洗用培地が予め定められた量だけ流れ込むと、ポンプ１６の動作が一時停止され、三方活栓５４が切り替えられて、培養バッグ１１と新鮮培地容器１３とがトラップ部１４を介して接続される。そして、ポンプ１６が逆向き（矢印１０２の向き）、つまり新鮮培地容器１３からトラップ部１４へ向かって動作されることによって、第２流路４２内に流入した逆洗用培地がトラップ部１４の流出口２２を通じて本体２０の内部空間へ流入する。このとき、逆洗用培地によって、トラップ部１４のメッシュ２３に目詰まりした細胞塊が剥がれる。その後、ポンプ１６の向きが切り替えられて、前述と同様にして、培養バッグ１１から廃液容器１２側へ培地が流出される。
　前述されたようにして、浮遊培養において、１，２日毎に培養バッグ１１中の培地が新鮮な培地と交換される。
　例えば、浮遊培養開始時の多能性幹細胞の細胞塊の平均直径が約８０μｍであり、これを約２５０μｍまで増殖されるとすると、細胞塊の細胞数を約３３＝２７倍に増幅させる必要がある。例えば、ヒトＥＳ細胞は、約２４時間に１回***するので、計算上も４，５日培養すれば、所望のサイズにまで増殖すると考えられる。
［多能性幹細胞の継代］
　多能性幹細胞の細胞塊の平均直径が約２００～３００μｍである均一なサイズの多能性幹細胞の細胞塊は、次いで、平均直径が約８０～１２０μｍである略均一な小細胞塊に分割され、継代される。ここで「約」とは、±２０％を許容する意味で用いられる。細胞塊の平均直径が５０μｍ以下となるように分割すると、細胞がアポトーシス等の細胞死を起こしやすくなるので好ましくない。分割後の平均直径の上限は特に制限されないが、サイズが大きくなるほど次回の継代後の浮遊培養による増幅の効率が悪くなるので、約１２０μｍ以下であることが好ましく、約４０～８０μｍとすることが特に好ましい。
　培養バッグ１１において、多能性幹細胞の細胞塊が平均直径が約２００～３００μｍまで増殖した後、三方活栓５１～５４が操作されることによって、培養バッグ１１からトラップ部１４を介して廃液容器１２への流路が開かれる。ポンプ１６が動作されることによって、一定の流速で培養バッグ１１から第１流路４１及び第２流路４２を通じて廃液容器１２へ培地が流れる（矢印１０１）。流速は、毎分約５～５０ｍＬの範囲の一定の流速であることが好ましく、より好ましくは、毎分約８～１０ｍＬの範囲の一定の流速である。
　培養バッグ１１から培地とともに多能性幹細胞の細胞塊が流出するが、前述されたように、細胞塊はトラップ部１４によってトラップされるので、廃液容器１２へは流入しない。培養バッグ１１中の培地がすべて流出されると、三方活栓５１，５２，５３が切り替えられて、培養バッグ１１と新鮮培地容器１３とが、トラップ部１４及び継代用フィルタ部１５を介して接続される。
　ポンプ１６が動作されることによって、一定の流速で新鮮培地容器１３から第２流路４２、第３流路４３、第４流路４４及び第５流路４５を通じて培養バッグ１１へ向かって新鮮な培地が流れる（矢印１０２）。新鮮培地容器１３から流出した新鮮な培地は、トラップ部１４の流出口２２から本体２０の内部空間へ流入して、前述と同様に、本体２０の内部空間の下側に滞留した多能性幹細胞の細胞塊とともに、流入口２１から流出する。これにより、トラップ部１４にトラップされていた多能性幹細胞の細胞塊は、新鮮な培地とともに継代用フィルタ部１５へ流れ込む（矢印１０５）。
　新鮮な培地とともにトラップ部１４から継代用フィルタ部１５へ到達した多能性幹細胞の細胞塊は、メッシュ３１を通過するときに分割される。多能性幹細胞の細胞塊をメッシュ３１に通すときの流速は、約９０～３００ｍＬ／ｍｉｎの範囲の一定の流速であることが好ましい。ここで「約」とは、±１０％を許容する意味で用いられる。また、流速は、ポンプ１６の駆動力による第２流路４２又は第４流路４４内の流速である。流速が約９０ｍＬ／ｍｉｎより遅いと、メッシュ３１を通過できない細胞塊が多くなり、培養バッグ１１に回収される多能性幹細胞の回収率が悪くなる。流速の上限は特に制限されないが、流速が約３００ｍＬ／ｍｉｎより速いと、メッシュ３１を通過した細胞塊の平均直径が小さくなる傾向がある。
　なお、メッシュ３１において多能性幹細胞の細胞塊が通過し得る面積（有効面積）を大きくすると、第４流路４４の断面積に対して、本体３０におけるメッシュ３１が存在する空間の断面積が大きくなり、その結果、特にメッシュ３１の周縁となるほど、その領域を通過する細胞塊（培地）の流速が遅くなる傾向がある。したがって、メッシュ３１の有効面積が変化すると、メッシュ３１を通過する細胞塊の面積も変化し得るので、他の婦性感細胞の細胞塊をメッシュ３１に通すときの流速は、メッシュ３１の単位平方センチメートル当たりの流速として把握されてもよい。例えば、円盤形状のメッシュ３１の有効径が１１ｍｍであれば、メッシュ３１の単位平方センチメートル当たりの流速は、約９５～３１５ｍＬ／ｍｉｎの範囲であることが好ましい。
　前述されたようにして、新鮮培地とともに多能性幹細胞の細胞塊をメッシュ３１を通過させて分割する工程が、第１分割工程に相当する。
　なお、継代用フィルタ部１５のメッシュ３１に細胞塊が目詰まりしている場合には、目詰まりした細胞塊を除去するために、逆洗用容器１８から逆洗用培地を継代用フィルタ部１５へ流入させてもよい。具体的には、ポンプ１６の動作が一時停止され、三方活栓５５が切り替えられて、逆洗用容器１８と継代用フィルタ部１５とが第７流路４７を通じて接続される。そして、ポンプ１６が逆向き（図１の継代用フィルタ部１５における右向き）に動作されると、逆洗用容器１８から逆洗用培地が継代用フィルタ部１５の流出口３３から流入口３２へ向かってメッシュ３１を逆流する（矢印１０６）。
　逆洗用培地は、例えば、前述された浮遊培養に用いられる培地であって、水溶性高分子が添加されてないものが好ましい。粘性の低い逆洗用培地が継代用フィルタ部１５のメッシュ３１を通過することによって、メッシュ３１に目詰まりした細胞塊がメッシュ３１から剥がれやすくなる。逆洗用培地の流量や流速は、メッシュ３１の目詰まりの程度に応じて適宜選択される。
　逆洗が終了すると、ポンプ１６の動作が一時停止され、三方活栓５５が切り替えられて、培養バッグ１１と継代用フィルタ部１５とが接続される。そして、ポンプ１６が再び正向き（図１の継代用フィルタ部１５における左向き）動作されることによって、前述と同様にして、新鮮培地容器１３から新鮮な培地が培養バッグ１１へ流出される（矢印１０５）。
　前述されたようにして、逆洗用培地とともに多能性幹細胞の細胞塊をメッシュ３１から一旦除去して、再びメッシュ３１を通過させて分割する工程が、第２分割工程に相当する。
　このように分割されて継代に適した大きさとなった多能性幹細胞の細胞塊は、新鮮な培地とともに培養バッグ１１へ流れ込む。これにより、多能性幹細胞が継代される。
［本実施形態の作用効果］
　本実施形態に係る多能性幹細胞の培養システム１０によれば、大量の多能性幹細胞を培養することができ、自動化されたシステムが実現可能である。
　また、継代に際して、新鮮な培地とともにトラップ部１４から継代用フィルタ部１５へ到達した多能性幹細胞の細胞塊が分割されずにメッシュ３１に目詰まりしても、逆洗用容器１８から逆洗用培地がメッシュ３１へ流通されることにより、目詰まりした細胞塊が逆洗用培地に流されてメッシュ３１から離れる。これにより、継代用フィルタ部１５のメッシュ３１の目詰まりを解消することができる。
　また、継代に際して、毎分９０ｍＬ以上の一定の流速で培地を継代用フィルタ部１５へ流通させることにより、多能性幹細胞の回収率が向上する。
［継代用フィルタ部１５を通過する培地の流速］
　継代フィルタ部１５を通過する培地の流速を、毎分１０ｍＬ，５０ｍＬ，９０ｍＬ，１５０ｍＬ，３００ｍＬにしたときの細胞の回収率を測定した。メッシュ３１の有効径が１１ｍｍなので、メッシュ３１の単位平方センチメートル当たりの流速に換算すると、毎分１０．５ｍＬ，５２．６ｍＬ，９４．７ｍＬ，１５７．９ｍＬ，３１５．８ｍＬとなる。
（試薬の調製）
　基礎培地（ベリタス、ST-05850）３５０ｍＬに対してサプリメント（ベリタス、ST-05850）１００ｍＬを添加して、よく撹拌した。さらに、Y-27632溶液（SIGMA、Y0503-5MG）５００ｍＬを、終濃度が１０μＭとなるように加えた。さらに、メチルセルロース液（R&D、HSC001）５０ｍＬを加えて、よく撹拌して、継代用培地を調製した。
　DMEM/F12培地（Life Technologies）４５０ｍＬに対してメチルセルロース液５０ｍＬを加えて、よく撹拌して、逆洗用培地とした。
（継代操作）
　培養バッグ１１から、トラップ部１４へ多能性幹細胞の細胞塊と共に培地を流出させた。トラップ部１４において細胞塊を捕捉して、培地のみを廃液容器１２側へ流出させた。この操作において、逆洗用容器１７から逆洗用培地を適宜トラップ部１４へ逆流させて、メッシュ２３の目詰まりを解消しながら、培地を流出させた。続いて、新鮮培地容器１３からトラップ部１４、継代用フィルタ部１５を通じて培養バッグ１１へ新鮮培地を流出させた。これにより、トラップ部１４にトラップされていた細胞塊を、継代用フィルタ部１５のメッシュ３１（ステンレス製、孔径５０μｍ、開口率６４％）を通過させ、分割することにより、継代を行った。継代において、逆洗用容器１８から逆洗用培地を適宜継代用フィルタ部１５へ逆流させて、メッシュ３１の目詰まりを解消し、再びメッシュ３１を通過させることによって、目詰まりした細胞塊も分割させた。
（回収率の算定）
　継代後に培養バッグ１１に回収された多能性幹細胞の回収率を算定した。回収率は、以下の式により求めた。
　（回収率）＝（継代後の総細胞数）／（継代前の総細胞数）
　その結果が図４に示される。図４から明らかなように、継代用フィルタ部１５を培地が通過するときの流速が速くなるにつれて回収率が向上し、毎分９０ｍＬ以上の流速では回収率が一定になる傾向が確認された。
（継代後の細胞塊の大きさ）
　継代後に培養バッグ１１に回収された多能性幹細胞の細胞塊の大きさ及び分布を測定した。その結果が図５に示される。図５から明らかなように、流速が遅いとメッシュ３１の孔径より大きな細胞塊の分布が多くなる傾向にあり、細胞塊の大きさの分布が全体として拡がる傾向にあった。流速が速いとメッシュ３１の孔径に近い細胞塊の分布が多くなる傾向にあり、細胞塊の大きさの分布が全体として狭まる傾向にあった。
［継代用フィルタ部１５のメッシュ３１の開口率］
　継代用フィルタ部１５のメッシュ３１を、開口率が７２％（ステンレス製、孔径４６μｍ）、７１％（ステンレス製、孔径５５μｍ）、６４％（ステンレス製、孔径５０μｍ）、５８％（ＰＥＴ製、孔径９８μｍ）のものを用いて、それぞれについて前述した継代操作を行った。継代用フィルタ部１５を通過する培地の流速は、毎分９０ｍＬとした。
　それぞれの開口率のメッシュ３１について回収率を算定した結果が図６に示される。図６から明らかなように、メッシュ３１の素材が同一（ステンレス製）であれば、樹赤穂率が高いほど、回収率が向上する傾向が確認された。
１０　培養システム
１１　培養バッグ
１２　廃液容器
１３　新生培地容器
１４　トラップ部
１５　継代用フィルタ部
１６　ポンプ
１７，１８　逆洗用容器
３１　メッシュ
　

Claims (9)

  1. 　培地中において多能性幹細胞を浮遊培養するための培養容器と、
    　液体を流通可能な流路により上記培養容器と接続されており、上記培養容器から流出した使用済みの培地を貯留する廃液容器と、
    　液体を流通可能な流路により上記培養容器と接続されており、上記培養容器へ供給する新鮮な培地を貯留する新鮮培地容器と、
    　上記培養容器から上記廃液容器又は上記新鮮培地容器への流路を切り換える第１切替部と、
    　上記第１切替部より上記培養容器側の流路に設けられており、上記廃液容器側への流れにおいて培地中の多能性幹細胞をトラップするトラップ部と、
    　上記トラップ部と上記培養容器との間において、上記トラップ部と上記培養容器とを接続する流路と平行に設けられた流路に設けられており、多能性幹細胞の細胞塊を分割可能なメッシュを有する継代用フィルタ部と、
    　上記トラップ部から上記培養容器又は上記継代用フィルタ部への流路を切り換える第２切替部と、を具備する多能性幹細胞の培養システム。
  2. 　上記培養容器と上記継代用フィルタ部とを接続する流路に液体を流通可能に設けられており、継代用フィルタ部へ供給する逆洗用培地を貯留する逆洗用容器を、更に具備する請求項１に記載の多能性幹細胞の培養システム。
  3. 　上記各流路における液体の流速を制御するための制御部を更に具備しており、当該制御部は、上記継代用フィルタ部のメッシュを通過する液体の単位平方センチメートル当たりの流速を毎分９５ｍＬ以上とするものである請求項１又は２に記載の多能性幹細胞の培養システム。
  4. 　上記各流路において液体を流通させるためのポンプと、当該ポンプの駆動を制御する制御部を更に具備しており、当該制御部は、少なくとも上記トラップ部から上記継代用フィルタ部への流れにおいて、上記ポンプを毎分９０ｍＬ以上の一定の流速で駆動するものである請求項１又は２に記載の多能性幹細胞の培養システム。
  5. 　上記多能性幹細胞が、ＥＳ細胞又はｉＰＳ細胞である請求項１から４のいずれかに記載の多能性幹細胞の培養システム。
  6. 　上記多能性幹細胞が、ヒト由来のものである請求項１から５のいずれかに記載の多能性幹細胞の培養システム。
  7. 　多能性幹細胞の細胞塊を浮遊培養する培養工程と、
    　培養された多能性幹細胞の細胞塊を、培地が流通可能な流路に設けられたメッシュに培地ともに一方向へ流通させることにより分割して培養容器へ収容する第１分割工程と、
    　上記培養容器への流路を閉鎖した後、上記メッシュへ上記分割工程と逆方向へ培地を流通させて、メッシュに目詰まりした細胞塊を除去する逆洗工程と、
    　上記培養容器への流路を開放した後、除去された細胞塊を培地とともに一方向へ流通させることにより分割して培養容器へ収容する第２分割工程と、を含む多能性幹細胞の継代方法。
  8. 　上記多能性幹細胞が、ＥＳ細胞又はｉＰＳ細胞である請求項７に記載の多能性幹細胞の継代方法。
  9. 　上記多能性幹細胞が、ヒト由来のものである請求項７又は８に記載の多能性幹細胞の継代方法。
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