CN101855338A - 在程序重排体细胞中的wnt途径刺激 - Google Patents

Abstract

本发明提供了可用于程序重排体细胞的组合物及方法。本发明的组合物和方法对于例如产生或调节(例如增强)通过程序重排体细胞诱导的多能干细胞的产生有用。程序重排的体细胞能够用于许多目的，包括在个体中治疗或防止医学状况。本发明进一步提供了用于鉴定程序重排体细胞为多能状态和/或增强程序重排的速度和/或效率的试剂的方法。某些组合物和方法涉及调节Wnt途径。

Description

在程序重排体细胞中的WNT途径刺激

政府基金

本文描述的发明完全或部分地由对RJ的拨款5-RO1-HDO45022、5-R37-CA084198和5-RO1-CA087869以及来自国立卫生研究院的NIH拨款HG002668支持。在本发明中美国政府具有某些权利。

对相关申请的交叉引用

本申请要求2007年8月31日提交的美国临时专利申请60/967,028和2008年8月6日提交的美国临时专利申请61/188,190的优先权利益，两者都通过引用在此并入。

发明背景

干细胞是能够自我更新并产生更多分化细胞的细胞。胚胎干(ES)细胞可以分化为共同构成身体的多种特化细胞类型。除巨大的科学兴趣之外，多能性的性质赋予人类ES细胞在再生医学(例如对于疾病的细胞/组织替换治疗)应用上巨大的临床希望。

当前若干不同的方法用于获得ES细胞。在一种方法中，ES细胞系源自于胚泡时期的正常胚胎内细胞团(参见美国专利号5,843,780和6,200,806，Thompson，J.A.et al.Science，282：1145-7，1998)。第二种产生多能ES细胞的方法使用体细胞核转移(SCNT)。在该技术中，从正常卵移走细胞核，从而除去遗传物质。例如通过显微操作把供体二倍体体细胞的细胞核直接引入去核的***，或者把供体二倍体体细胞紧挨着去核的卵放置然后融合两种细胞。产生的细胞有发育成早期胚胎的潜能，从该早期胚胎中可以获得包含产生内细胞团的干细胞的部分。在第三种方法中，把人类细胞的细胞核移植进入不同于供体细胞的物种的去核动物***。参见，例如美国专利公开号20010012513。产物嵌合细胞用于生产多能ES细胞，尤其是人类样多能ES细胞。该技术的缺点是这些嵌合细胞可能包含未知的病毒以及保留动物物种的线粒体。

当用于产生人类ES细胞时传统的ES细胞分离方法受到若干限制。这包括与细胞来源相关的伦理争议以及技术挑战。用于临床应用的ES细胞的生产性利用的一个显著限制是与产生与单个病人遗传匹配的ES细胞相关的困难。存在对产生多能细胞的可选方法的重大需要。

发明概述

本发明提供了用于程序重排体细胞为较少分化状态的组合物和方法。在某些实施方案中组合物和方法允许体细胞程序重排为多能的胚胎干细胞样细胞(“ES样细胞”)。

在一个方面，本发明提供了程序重排哺乳动物体细胞的方法，包括在有胞外信号分子的情况下培养细胞以便细胞变得程序重排。

在一个方面本发明提供了程序重排哺乳动物体细胞的方法，包括在Wnt条件细胞培养基中培养细胞以便细胞变得程序重排。在某些实施方案中该方法包括培养体细胞以便诱导细胞变成多能的。在某些实施方案中Wnt条件细胞培养基包括Wnt3a条件培养基(Wnt3a-CM)。

在另一个方面本发明提供了程序重排哺乳动物体细胞的方法，包括使细胞与增加Wnt途径活性的试剂接触以便诱导细胞变成多能的。在一些实施方案中该试剂是可溶的、生物活性的Wnt蛋白质，例如Wnt3a蛋白质。在一些实施方案中该试剂选自：(i)例如通过与Wnt的细胞受体相互作用，模拟Wnt3a条件培养基或可溶的、生物活性的Wnt蛋白质效果的小分子；(ii)调节β连环蛋白和TCF/LEF家族成员之间的相互作用和/或调节TCF/LEF家族成员的表达或活性的试剂；(iii)抑制Wnt途径的内源抑制剂的表达或活性的试剂。

本发明提供了使用本发明的方法程序重排的体细胞。

包含Wnt3a激活剂和能够替代Oct4、Klf4和/或Sox2(或其任何组合)的改造的表达的另外的程序重排试剂的细胞培养基是本发明另外的方面。本发明进一步的方面是(1)组合物，包括：(i)已经修饰以增加其Oct4、Klf4和/或Sox2，或这些的任何亚组表达的细胞；和(ii)Wnt途径调节剂，例如Wnt途径激活剂；(2)组合物，包括：(i)已经修饰以增加其一种或更多种程序重排因子表达或胞内水平的细胞，其中该程序重排因子任选地选自Oct4、Klf4、和/或Sox2，或这些的任何亚组；和(ii)Wnt条件培养基；(3)组合物，包括：(i)已经修饰以增加其一种或更多种程序重排因子表达或胞内水平的细胞，其中该程序重排因子任选地选自Oct4、Nanog、Lin28和/或Sox2，或这些的任何亚组；和(ii)Wnt途径激活剂；和(4)组合物，包括：(i)已经修饰以增加其一种或更多种程序重排因子表达或胞内水平的细胞，其中该程序重排因子任选地选自Oct4、Nanog、Lin28和/或Sox2，或这些的任何亚组；和(ii)Wnt条件培养基。

本发明还提供了用于鉴定与一种或更多种其它试剂联合程序重排体细胞为较少分化状态和/或促进这样的程序重排的试剂的方法。在某些方法中，把体细胞与增加Wnt途径活性的试剂以及候选试剂接触。评价细胞的多能性特征。至少一种亚组的多能性特征的存在表明该试剂能够程序重排体细胞为较少分化状态。通过本发明鉴定的试剂然后可以通过把体细胞与该试剂接触用来程序重排体细胞。

本发明进一步提供了用于在需要治疗状况的个体中治疗状况的方法。在某些实施方案中，从个体获得体细胞并通过本发明的方法程序重排。在培养中程序重排的细胞可以扩增。在适于该细胞发育成需要的细胞类型或细胞谱系的细胞的条件下维持多能的程序重排细胞(其指的是原始的程序重排细胞和/或它们保留多能性性质的后代)。在一些实施方案中，使用流程，例如本领域已知的那些在体外分化细胞。把需要的细胞类型的程序重排细胞引入个体以治疗该状况。在某些实施方案中，从个体获得的体细胞包含一种或更多种基因中的突变。在这些情况下，在某些实施方案中首先例如通过引入一种或更多种野生型拷贝的基因进该细胞以便产生的细胞表达该基因的野生型形式，处理从个体获得的体细胞以修复或补偿该缺损。然后把该细胞引入该个体。

在某些实施方案中，在它们从个体分离之后改造从个体获得的体细胞以表达一种或更多种基因。可以通过引入基因或包括基因的表达盒进细胞来改造该细胞。引入的基因可以是可用于鉴定、选择和/或产生程序重排细胞目的的基因。在某些实施方案中该引入的基因有助于启动和/或维持程序重排状态。在某些实施方案中该引入的基因的表达产物有助于产生程序重排状态但是对维持该程序重排状态不是必要的。

在某些其它实施方案中，本发明的方法可用于治疗需要功能性器官的个体。在该方法中，从需要功能性器官的个体获得体细胞，并通过本发明的方法程序重排以产生程序重排的体细胞。然后在适于该程序重排的体细胞发育成为需要的器官的条件下培养上述程序重排的体细胞，然后把该需要的器官引入该个体。

在进一步的概述中，本发明提供了程序重排哺乳动物体细胞的方法，包括使哺乳动物体细胞与调节Wnt途径的试剂接触以便该哺乳动物体细胞变成程序重排的。在本发明的某些实施方案中该方法包括程序重排哺乳动物体细胞为多能状态。在某些方面，本发明提供了产生诱导的多能干(iPS)细胞的方法的改进。例如，在某些方面本发明增强程序重排体细胞为多能性，所述体细胞没有被改造以表达c-Myc。在某些方面，本发明的方法易于产生同质的ES样集落。在一些实施方案中，本发明的方法增强同质的ES样集落的形成，而没有利用需要初始体细胞遗传修饰的选择步骤。

在本发明的某些实施方案中，该方法包括在Wnt条件培养基中培养细胞。在某些实施方案中，该方法包括在Wnt3a条件培养基中培养细胞。在某些实施方式中，该细胞是人类细胞。在某些实施方式中，该细胞是小鼠细胞。在某些实施方式中，该细胞是非人灵长类细胞。在某些实施方式中，该哺乳动物体细胞是终末分化的细胞。在某些实施方案中该细胞是成纤维细胞或免疫***细胞(例如B或T细胞)。在某些实施方式中，该哺乳动物体细胞不是终末分化的细胞。例如，该哺乳动物体细胞可以是前体细胞，例如神经前体或造血前体细胞。在某些实施方案中，该方法在体外实施。在某些实施方案中，接触细胞包括在包含试剂的培养基中培养细胞。在某些实施方案中，接触包括在包含试剂的培养基中培养细胞至少10天。在某些实施方案中，接触包括在包含试剂的培养基中培养细胞至少12或至少15天或至少20天。在某些实施方案中，遗传修饰该体细胞以包含编码可选择标记的核酸序列，其与内源多能性基因启动子可操作地连接从而允许已经程序重排为多能性的细胞的选择，而在其它实施方案中不遗传修饰该体细胞以包含与内源多能性基因启动子可操作地连接从而允许已经程序重排为多能性的细胞的选择的编码可选择标记的核酸序列。在某些实施方案中，修饰体细胞以在高于通常存在于该类型的体细胞中的水平表达或包含至少一种程序重排因子。在一些实施方案中，该程序重排因子是Oct4。在一些实施方案中，该程序重排因子是Sox2。在一些实施方案中，该程序重排因子是Klf4。在一些实施方案中该程序重排因子是Nanog。在一些实施方案中该程序重排因子是Lin28。在一些实施方案中该程序重排因子是Oct4和Sox2。在一些实施方案中该程序重排因子是Oct4、Sox2和Klf4。在某些实施方案中，不遗传修饰体细胞以在高于通常存在于该细胞类型的体细胞中的水平表达c-Myc。在某些实施方案中，还把细胞与调节Wnt途径的第二种试剂接触。在某些实施方案中，在包含外源可溶的、生物活性的Wnt蛋白质的培养基中培养体细胞。在某些实施方案中，该Wnt蛋白质是Wnt3a蛋白质。在某些实施方案中，该方法进一步包括确认该程序重排的细胞是多能的。在某些实施方案中，在细胞群上实施该方法并且该方法进一步包括从未程序重排为多能状态的细胞中分离程序重排为多能状态的细胞。在某些实施方案中，该方法进一步包括给药程序重排的细胞至受试者。在某些实施方案中，在程序重排该细胞之后该方法进一步包括体外分化该细胞至需要的细胞类型。在某些实施方案中，该方法进一步包括给药该分化的细胞至受试者。

本发明还提供了治疗需要其的个体的方法，其包括：(a)自个体获得体细胞；(b)通过包括把哺乳动物体细胞与调节Wnt途径的试剂(例如Wnt途径激活剂)接触的方法程序重排至少一些体细胞；和(c)给药至少一些程序重排的细胞至该个体，任选地在分化该细胞成为一种或更多种需要的细胞类型之后。在一些实施方案中，该个体是人类。在一些实施方案中中，该方法在细胞群上实施并且进一步包括从未程序重排为多能状态的细胞中分离程序重排为多能状态的细胞。在一些实施方案中，该方法进一步包括体外分化该细胞和，任选地，给药该分化的细胞至需要针对细胞治疗有用的状况治疗的个体。例如，可以沿着需要的细胞谱系分化细胞，例如神经谱系、肌肉谱系等。

本发明进一步提供了组合物，其包括(i)已经修饰或处理以便在高于没有上述修饰或处理的情况的水平上表达或包含至少一种程序重排因子的哺乳动物体细胞；和(ii)增加Wnt途径活性并且有助于程序重排体细胞至多能状态的试剂。在某些实施方案中，该试剂是Wnt3a蛋白质。在某些实施方案中，该试剂是小分子。

本发明进一步提供了鉴定能够用于调节程序重排哺乳动物体细胞至多能状态的试剂的方法，包括：(a)在包含调节Wnt途径活性的试剂和候选试剂的培养基中培养哺乳动物体细胞群；和(b)在适当的时期之后，确定在培养中维持细胞和它们的后代适当的时期后具有一种或更多种ES细胞特性的细胞是否存在，其中如果具有一种或更多种ES细胞特性的细胞以不同于不包含该候选试剂的培养基预期具有的水平存在，该候选试剂被鉴定为能够用于调节哺乳动物体细胞程序重排为多能状态。

在某些实施方案中，该特性选自：集落形态，ES细胞选择性表达的内源基因的表达，与ES细胞选择性表达的基因的表达控制序列可操作地连接的可检测标记的表达，当注入到免疫妥协小鼠时分化成为具有内胚层、中胚层和外胚层特性的细胞的能力，和参与形成存活至足孕的嵌合体的能力。在某些实施方案中，已经修饰该细胞以表达至少一种程序重排因子。在某些实施方案中，该培养基是Wnt条件培养基。

在某些实施方案中，该培养基是Wnt3a条件培养基。在某些实施方案中，调节Wnt途径活性的试剂是Wnt3a蛋白质。在某些实施方案中，调节Wnt途径活性的试剂是小分子。在某些实施方案中，候选试剂是小分子。在某些实施方案中，方法包括鉴定能够用于增强哺乳动物体细胞程序重排的试剂，其中如果具有一种或更多种ES细胞特性的细胞以高于不包含该候选试剂的培养基预期具有的水平存在，该候选试剂被鉴定为能够用于增强哺乳动物体细胞程序重排为多能状态。在某些实施方案中，步骤(b)包括确定在培养中维持细胞和它们的后代适当的时期后具有一种或更多种ES细胞集落特性的细胞集落是否存在，其中如果具有一种或更多种ES细胞集落特性的细胞集落以不同于不包含该候选试剂的培养基预期具有的水平存在，该候选试剂被鉴定为能够用于调节哺乳动物体细胞程序重排为多能状态。在某些实施方案中，该细胞表达至少一种程序重排因子。

本发明还提供了鉴定能够用于程序重排哺乳动物体细胞为多能状态的试剂的方法，包括：(a)把哺乳动物体细胞群与增加Wnt途径活性的试剂和候选试剂接触；(b)在细胞培养***中维持该细胞适当的时期；和(c)确定具有一种或更多种ES细胞特性的细胞是否存在于所述培养***中，其中如果具有一种或更多种ES细胞特性的细胞以高于不与该候选试剂接触的细胞预期具有的水平存在，该试剂被鉴定为能够用于程序重排哺乳动物体细胞为ES样状态。

在本发明的某些实施方案中，该特性选自：集落形态，ES细胞选择性表达的内源基因的表达，与ES细胞选择性表达的基因的表达控制序列可操作地连接的可检测标记的表达，当注入到免疫妥协小鼠时分化成为具有内胚层、中胚层和外胚层特性的细胞的能力，和参与形成存活至足孕的嵌合体的能力。

在某些实施方案中，增加Wnt途径活性的试剂是Wnt3a蛋白质。在某些实施方案中，候选试剂是小分子。在某些实施方案中，该细胞表达至少一种程序重排因子。在某些实施方案中，步骤(b)包括确定在培养中维持细胞和它们的后代适当的时期后具有一种或更多种ES细胞集落特性的细胞集落是否存在，其中如果具有一种或更多种ES细胞集落特性的细胞集落以不同于不包含该候选试剂的培养基预期具有的水平存在，该候选试剂被鉴定为能够用于调节哺乳动物体细胞程序重排为多能状态。

本发明还提供了程序重排哺乳动物体细胞的方法，包括在有胞外信号分子的情况下培养细胞以便细胞变成程序重排的。在某些实施方案中，所述胞外信号分子是其与细胞受体的胞外域的结合启动或修饰该细胞中的信号转导途径的分子。在某些实施方案中，该信号转导途径是Wnt途径。

本发明还提供了鉴定能够用于调节哺乳动物体细胞程序重排为多能状态的Wnt途径调节剂的方法，包括：(a)在包含该Wnt途径调节剂的培养基中培养哺乳动物体细胞群；(b)在适当的时期之后，确定在培养中维持细胞和它们的后代适当的时期后具有一种或更多种ES细胞特性的细胞是否存在，其中如果具有一种或更多种ES细胞特性的细胞以不同于不包含该Wnt途径调节剂的培养基预期具有的水平存在，该Wnt途径调节剂被鉴定为能够用于调节哺乳动物体细胞程序重排为多能状态。

在某些实施方案中，该方法包括(i)测试至少10种Wnt途径调节剂；和(ii)鉴定一种或更多种Wnt途径调节剂为对程序重排速度或效率比测试的至少50％的其它Wnt途径调节剂具有显著更大的影响。在某些实施方案中，该方法包括测试至少20种，至少50种，或至少100种Wnt途径调节剂。在一些实施方案中，该方法包括鉴定一种或更多种Wnt途径调节剂为对程序重排速度或效率比测试的至少75％，或至少90％的其它Wnt途径调节剂具有显著更大的影响。在某些实施方案中，测试的Wnt途径调节剂是小分子。在某些实施方案中，测试的Wnt途径调节剂在结构上相关。例如，它们可以是一组化合物，例如基于共同的核心结构合成的组合的化合物文库的成员，或者它们可以是例如通过在一个或更多个位点产生取代或添加修饰核心结构或先导化合物获得的衍生物。在某些实施方案中，如果在适当的时期之后，具有一种或更多种ES细胞特性的细胞以大于不包含该Wnt途径调节剂的培养基预期具有的数量存在，该Wnt途径调节剂被鉴定为能够用于增加程序重排细胞为ES样状态的速度或效率。在某些实施方案中，如果在适当的时期之后，具有一种或更多种ES细胞集落特性的细胞集落以大于不包含该Wnt途径调节剂的培养基预期具有的数量存在，该Wnt途径调节剂被鉴定为能够用于增加程序重排细胞为多能状态的速度或效率。例如，该方法可以产生增加的百分数的具有ES细胞集落特征的集落和/或该集落比在没有该Wnt途径调节剂的情况下更同质。

本发明进一步提供了细胞培养组合物，其包括：(a)包含Wnt途径调节剂的细胞培养基；和(b)复数的哺乳动物体细胞，其中(i)该细胞被遗传修饰或瞬时转染以表达一种或更多种程序重排因子；(ii)该细胞被遗传修饰以包含与内源多能性基因启动子可操作地连接的编码可选择标记的核酸序列，从而允许已经程序重排为多能性的细胞的选择；或(iii)该细胞培养基包含一种或更多种替代除c-Myc以外的程序重排因子的小分子、核酸或多肽。

在某些实施方案中，细胞培养基包括Wnt-3a CM。在某些实施方案中，该培养基包含调节Wnt途径的小分子。

在某些实施方案中，该一种或更多种程序重排因子选自：Oct4、Nanog、Sox2、Lin28和Klf4。本发明进一步提供了组合物，其包括：iPS细胞和调节，例如活化，Wnt途径的试剂。在某些实施方案中，活化Wnt途径的试剂是Wnt3a蛋白质。在某些实施方案中活化Wnt途径的试剂是小分子。

在某些实施方案中，本发明提供了调节Wnt途径的试剂在制造用于程序重排哺乳动物体细胞的药剂中的用途。

预期本文描述的所有实施方案都适用于本发明的多个方面。还预期当适当的时候本发明的多个实施方案及其要素可以与一种或更多种其它这样的实施方案和/或要素组合。

附图简述

图1.Wnt3a促进后生的程序重排。a.实验时间线的示意图。用DOX可诱导的慢病毒感染MEF，分为有和没有Wnt3-CM处理的培养物，然后用DOX诱导(第0天)。诱导后在固定时间结点启动G418选择，并且维持Wnt3a-CM处理7天的选择。维持DOX和G418直到评价抗性集落。b.来自在标准ES细胞培养基中过表达Oct4/Sox2/Klf4/c-Myc或用Wnt3a-CM处理的MEF中G418抗性集落计数。c.有和没有Wnt3a-CM处理形成的G418抗性集落的相位图象。d.来自用存在和不存在Wnt3a-CM的不同程序重排因子组合感染的MEF的G418抗性集落计数。在有Wnt3a-CM而没有c-Myc转导的情况下G418抗性集落出现。e.用Wnt3a-CM处理形成的Myc[-]G418抗性集落的相位图象。在该实验中，在没有Wnt3a-CM的情况下没有观察到Myc[-]细胞集落。f.来自在存在(红色条带)和不存在(灰色条带)Wnt3a-CM的情况下过表达Oct4/Sox2/Klf4(Myc[-])或Oct4/Sox2/Klf4/c-Myc(Myc[+])的MEF中G418抗性集落计数。按照指示在诱导后第5天或第10天时启动G418选择并且在第20天时评价集落(在32cm²的区域)g.在Oct4/Sox2/Klf4诱导后20天时在Oct4-GFP细胞中使用流式细胞术比较GFP强度与自发荧光的散布图，显示GFP表达细胞群(用箭头指示)仅仅是用Wnt3a-CM处理的。h.用Wnt3a-CM处理而没有任何遗传选择衍生的GFP表达Myc[-]细胞的相位图象。

图2.在Wnt刺激的细胞中多能性的诱导。a-d.免疫染色显示在Wnt3a-CM处理的Myc[-]细胞中多能性标记Nanog(a-b)和SSEA-1(c-d)的诱导。e-g.当皮下注射入SCID小鼠时Wnt3a-CM处理的Myc[-]系形成畸胎瘤。来自Oct4/Sox2/Klf4/Wnt3aCM iPS系的畸胎瘤表明三种胚层的分化的细胞与由V6.5mES注射形成的畸胎瘤相似。箭头指示(e)中的神经组织，(f)中的软骨，和(g)中的内胚层细胞，h.未选择衍生的Oct4/Sox2/Klf4/Wnt3aCM iPS系产生具有野灰色毛色和着色的眼睛的嵌合小鼠(如左边所示)(与野生型Balb/c小鼠对比，右边)，提供了对体细胞的贡献的证据。后代的毛色确认这里产生的Oct4/Sox2/Klf4/Wnt3aCM iPS系是有种系能力的(数据未显示)。

图3.无c-Myc逆转录病毒时Wnt/β连环蛋白刺激增强iPS集落形成。a.显示在ES细胞培养基、MEF条件培养基、Wnt3a过表达条件培养基和具有ICG001(4μM)的Wnt3a过表达条件培养基中培养的Oct4/Sox2/Klf4过表达MEF中的G418抗性集落的计数。在诱导后第15天时开始选择，而在第28天时评价集落。维持Wnt3a-CM处理直到第22天。来自三次重复实验的计数的平均数用指示S.D.的误差线显示。b.显示在ES细胞培养基、Wnt3a过表达条件培养基和具有ICG-001(4μM)的Wnt3a过表达条件培养基中培养的Oct4/Sox2/Klf4/c-Myc过表达MEF中G418抗性集落(在32cm²区域)的计数。在诱导后第10天时开始选择，维持Wnt3a-CM直到第17天，并在第20天时评价集落。c.无c-Myc转导时Wnt刺激促进iPS细胞的形成。这可以归因于：i)由关键内源多能性因子，例如Oct4、Sox2和Nanog的Wnt途径的直接调控，如ES细胞中的基因组研究暗示的(Cole et al.，2008)，ii)Wnt途径诱导的内源Myc(He et al.，1998；Coleet al.，2008)，或其它细胞增殖基因活化，加速形成iPS集落的顺序进程。

图4.(a)原始实验的时间线显示Wnt3a条件培养基促进iPS细胞产生的能力。在第2天时诱导多能性诱导因子的表达。按照指示评价GFP表达和集落形成。(b).Wnt3a促进过表达Oct4、Sox2、Klf4和c-Myc的细胞中的iPS细胞形成；图4C.Wnt3a促进过表达Oct4、Sox2、Klf4而没有c-Myc的改造的表达的细胞中的iPS细胞形成；(c)Wnt3a促进过表达Oct4、Sox2、Klf4而没有c-Myc的改造的表达的细胞中的iPS细胞形成。

图5.ICG-001的结构。

发明详述

介绍和定义

本发明涉及用于程序重排体细胞，例如体外程序重排体细胞为多能性的组合物和方法。本发明提供了用于程序重排体细胞为较少分化状态的方法。在此产生的细胞被称为“程序重排的体细胞”(“RSC”)，或者在一些实施方案中如果程序重排为多能状态则为诱导的多能干(iPS)细胞。术语“体细胞”指的是除生殖细胞、存在于或从植入前胚胎中获得的细胞、或者在体外由上述细胞增殖产生的细胞以外的任何细胞。在一些实施方案中体细胞是“非胚胎的体细胞”，其表示不存在于胚胎或从胚胎中获得并且不由上述细胞在体外增殖产生的体细胞。在一些实施方案中体细胞是“成体体细胞”，其表示存在于除胚胎或胎儿以外的生物体或从其中获得或由上述细胞在体外增殖产生的细胞。除非另有陈述用于程序重排细胞为较少分化状态的方法在体外实施，即，它们使用培养中维持的分离的体细胞操作。

本发明包括调节内源ES细胞转录因子表达的天然存在的信号分子为增强程序重排的可溶试剂的有希望的候选者的认识。本发明还包括调节所述天然存在的信号分子相互作用的生物学途径对增强程序重排(例如增加其速度和/或效率)有用的认识。本发明还包括调节所述天然存在的信号分子相互作用的生物学途径的试剂(无论天然存在或合成的，例如小分子)是增强程序重排的可溶试剂的有希望的候选者的认识。

如以下更详细描述的，本发明的某些实施方案至少部分地基于调节，例如激活Wnt途径在程序重排体细胞中有用的认识上。某些方法包括在体细胞中增加Wnt途径的活性以便至少一些细胞变成程序重排的，例如为多能状态。某些方法包括在Wnt条件培养基中培养体细胞以便至少一些细胞变成程序重排的，例如为多能状态。

本文使用的，程序重排指的是改变或逆转体细胞分化状态的过程。在程序重排前细胞可以是部分或终末分化的。程序重排包括体细胞的分化状态完全回复为多能状态。如本领域已知的，“多能(pluripotent)”细胞具有分化成为或产生来源于全部三种胚胎胚层(内胚层、中胚层和外胚层)的细胞的能力并且一般具有在体外长期***的潜能，例如大于一年或超过30次传代。ES细胞是多能细胞的例子。程序重排还包括体细胞分化状态部分回复为专能状态。“专能(multipotent)”细胞是能够分化成为一些而不是所有来源于全部三种胚层的细胞的细胞。因此，专能细胞是部分分化的细胞。成体干细胞是专能细胞。成体干细胞包括，例如造血干细胞和神经干细胞。程序重排还包括体细胞分化状态部分回复为使得当经受另外的操作(例如在此描述的那些)时细胞对完全程序重排为多能状态更敏感的状态。这样的接触可能引起细胞特定基因的表达，其表达有助于程序重排。在本发明的某些实施方案中，体细胞的程序重排导致体细胞呈多能的、ES样状态。在此产生的细胞被提及为程序重排的多能体细胞或诱导的多能干(iPS)细胞。

程序重排包括核酸修饰(例如甲基化)、染色质凝聚、后生变化、基因组印记等可遗传模式至少一些的改变，例如反转，其发生于受精卵发育为成体的细胞分化期间。程序重排不同于简单地维持存在的已经是多能的细胞未分化状态或维持存在的已经是专能细胞(例如造血干细胞)的细胞不到完全分化的状态。程序重排也不同于促进已经是多能或专能的细胞的自我更新或增殖，虽然本发明的组合物和方法也可以用于这样的目的。本发明的某些组合物和方法有助于建立多能状态。该方法可以在完全分化和/或限制为仅仅产生特定类型细胞的细胞上操作，而不在已经是专能或多能的细胞上操作。

按照本发明的方法用任何多种方法处理体细胞以产生程序重排。处理可以包括使细胞与有助于程序重排的一种或更多种试剂(“程序重排试剂”)接触。这样的接触可以通过在包括该试剂的培养基中维持该细胞来实施。在一些实施方案中体细胞被遗传改造。可以遗传改造体细胞以表达下面描述的一种或更多种程序重排试剂。

在本发明的方法中体细胞一般说来可以在温度、pH及其他环境条件的标准条件下培养，例如作为粘附细胞于37℃在包含5-10％CO₂的大气中在组织培养板中培养。如此中描述的适当地改变细胞和/或培养基以实现程序重排。在某些实施方案中，在有模拟细胞外基质一种或更多种特性或包括一种或更多种细胞外基质或基膜组分的材料的情况下培养体细胞。在一些实施方案中使用Matrigel^TM。其它材料包括蛋白质或其混合物，例如凝胶、胶原、纤连蛋白等。在本发明的某些实施方案中体细胞在有饲养层细胞的情况下培养。这样的细胞可以，例如是鼠或人来源的。如果需要它们可以被辐照，用例如丝裂霉素C的化学灭活剂化学灭活，或另外处理以抑制它们的增殖。在其它实施方案中不用饲养细胞培养体细胞。

使用本发明的方法通过体细胞程序重排产生多能或专能细胞有许多优点。第一，本发明的方法允许产生自体的多能细胞，其是特异于一个个体并与该个体遗传匹配的细胞。细胞来源于从该个体中获得的体细胞。一般说来，自体细胞比非自体细胞更小可能经受免疫排斥。第二，本发明的方法允许技术人员产生多能细胞而不使用胚胎、***和/或核转移技术。中请人的结果证明(i)体细胞可以程序重排为ES样状态而不需要改造该细胞表达例如c-Myc的癌基因；和(ii)体细胞的程序重排可以至少部分地受到除改造该细胞以表达程序重排因子以外的方法影响，即，被使细胞与除能够被吸收并导致该细胞稳定的遗传修饰的核酸或病毒载体以外的程序重排试剂接触影响。特别地，本发明包括胞外信号分子，例如当细胞外存在时与细胞表面受体结合并激活胞内信号转导级联的分子，对程序重排体细胞有用的认识。本发明进一步包括通过除胞外信号分子的应用以外的方法活化这样的信号传导途径也对程序重排体细胞有用的认识。此外，本发明的方法增强根据形态学标准可检测的ES样细胞集落的形成，而不需要使用可选择标记。本公开因此反映了体外体细胞程序重排技术领域的若干根本上重要的进步。虽然本发明的某些方面在此使用Wnt途径信号传导例证，本发明的方法包括为了程序重排体细胞的其它信号传导途径的活化。

以下给出对理解本发明的方面有用的某些术语的定义：

本文使用的“试剂”表示任何化合物或物质例如，但不限于，小分子、核酸、多肽、肽、药物、离子等。

“细胞培养基”(也在此称为“培养培养基”或“培养基”)是包含维持细胞生存力并支持增殖的营养成分的用于培养细胞的培养基。细胞培养基可以以适当的组合包含任何下列：盐、缓冲剂、氨基酸、葡萄糖或其它糖、抗生素、血清或血清替代物、及其他组分例如肽生长因子等。通常用于特定细胞类型的细胞培养基为本领域技术人员所知。在此提供一些非限制性的例子。

“细胞系”指的是典型地来源于单个祖先细胞或来自确定的和/或实质上相同的祖先细胞群体的很大程度地或实质上相同的细胞群体。细胞系可能已经或者可能能够在培养中维持持久的时间(例如数月、数年、无限的时期)。它可能经历了赋予细胞上无限培养寿命的自发的或者诱导的转化过程。细胞系包括本领域中照此确认的所有细胞系。可以理解随着时间的过去细胞获得突变和可能地后生的变化以致于细胞系的单个细胞的至少一些性质可能彼此不一致。

术语“外源的”指的是存在于除其天然来源以外的细胞或生物体的物质。例如，术语“外源核酸”或“外源蛋白质”指的是已经通过涉及人工的过程引入例如细胞或生物体的生物***(在其中正常不发现它或在其中以较低量发现它)的核酸或蛋白质。如果被引入细胞或遗传物质的细胞的祖先该物质将被认为是外源的。相反，术语“内源的”指的是对生物***来说是天然的物质。

“表达”指的是涉及产生RNA和蛋白质以及视情况而定分泌蛋白质的细胞过程，可适用时包括，但不限于，例如转录、翻译、折叠、修饰和加工。“表达产物”包括从基因转录的RNA和通过从基因转录的mRNA翻译获得的多肽。

本文使用的“遗传修饰的”或“改造的”细胞指的是已经通过涉及人工的过程引入外源核酸的细胞(或该细胞遗传了至少一部分该核酸的后代)。该核酸可以例如包含对该细胞来说是外源的序列，它可以包含天然序列(即在该细胞中天然发现的序列)但是为非天然存在的排列(例如与来自不同基因的启动子连接的编码区)，或者天然序列的改变的形式等。可以通过任何适当的技术完成核酸转移进入细胞的过程。适当的技术包括磷酸钙或脂质介导的转染、电穿孔和使用病毒载体的转导或感染。在一些实施方案中该多核苷酸或其部分整合进该细胞的基因组中。假如相对于未修饰但在别的方面相同的细胞这样的移去或切除在细胞中引起可检测的改变，随后可以从基因组中移去或切除该核酸。

“同一性”指的是两条或更多条核酸或多肽序列相同的程度。在一个评价窗口上，例如在所关心的序列的长度上，所关心的序列和第二序列之间的百分数同一性可以通过下列计算：比对该序列，允许引入缺口以使同一性达到最大，确定该评价窗口内在相同残基对面的残基(核苷酸或氨基酸)数目，除以所关心的序列或第二序列(无论哪个更长)落入该窗口的残基总数，并且乘以100。当计算达到特定百分数同一性需要的相同残基数时，把小数四舍五入到最接近的整数。可以借助于本领域已知的多种计算机程序计算百分数同一性。例如，计算机程序例如BLAST2、BLASTN、BLASTP、Gapped BLAST等产生比对并提供所关心的序列之间的百分数同一性。如Karlin andAltschul，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：5873-5877，1993中修正的Karlin和Altschul的算法(Karlin and Altschul，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87：22264-2268，1990)并入了Altschul等的NBLAST和XBLAST程序(Altschul，et al.，J.Mol.Biol.215：403-410，1990)。为了获得用于比较目的的有缺口的比对，如Altschul等描述的利用Gapped BLAST(Altschul，et al.Nucleic Acids Res.25：3389-3402，1997)。当利用BLAST和Gapped BLAST程序时，可以使用各个程序的缺省参数。可以使用PAM250或BLOSUM62矩阵。执行BLAST分析的软件可通过国立生物技术信息中心(National Center for BiotechnologyInformation，NCBI)公开地得到。对于这些程序参见具有URLwww.ncbi.nlm.nih.gov的网址。在一个特定的实施方案中，使用具有NCBI提供的缺省参数的BLAST2计算百分数同一性。

本文使用的“分离的”或“部分纯化的”在核酸或多肽的情况下指的是与至少一种其它组分(例如核酸或多肽)分离的核酸或多肽，所述其它组分与该核酸或多肽在在其天然来源中发现时一起存在和/或当通过细胞表达，或在分泌多肽的情况下分泌时将与该核酸或多肽一起存在。化学合成或使用体外转录/翻译合成的核酸或多肽被认为是“分离的”。“分离的细胞”是已经从它最初被发现的生物体移走的细胞或这样的细胞的后代。任选地该细胞已经在体外培养，例如在有其它细胞的情况下。任选地随后把该细胞引入第二生物体或重新引入其从中分离的生物体(或者传下其的细胞)。

本文使用的术语“其功能与多能性相关的基因”指的是在正常情况下(例如无用来改变基因表达的基因工程或其它操作时)其表达发生在且一般局限于多能干细胞，并且照此对它们的功能一致性是决定性的基因。可以理解由功能上与多能性相关的基因编码的多肽可以作为母体因子在***中存在。该基因可以由胚胎的至少一些细胞，例如遍及至少一部分植入前时期和/或在成体的生殖细胞前体中表达。

“调节”与其在本领域的使用一致地使用，即表示引起或促进所关心的过程、途径或现象中的性质或数量的变化、改变或修饰。无限制地，这样的变化可以是过程、途径或现象的不同组分或分支的相对强度或活性方面的增加、减少或变化。“调节剂”是在所关心的过程、途径或现象中引起或促进性质或数量的变化、改变或修饰的试剂。

术语“多能性因子”用来指其功能与多能性相关的基因的表达产物，例如由该基因编码的多肽。在一些实施方案中多能性因子是在组成成体动物身体的体细胞类型(除生殖细胞或其前体外)中通常基本上不表达的。例如，多能性因子可以是其在ES细胞中的平均水平是其在存在于成体哺乳动物身体中的终末分化细胞类型中的平均水平的至少50倍或100倍。在一些实施方案中，多能性因子是对维持体内ES细胞和/或使用常规方法衍生出的ES细胞的生存力或多能状态是必需的。因此如果编码该因子的基因被敲除或抑制(即其表达被消除或基本地减少)，ES细胞不形成、死亡或在一些实施方案中分化。在一些实施方案中，在ES细胞中抑制功能与多能性相关的基因的表达(引起，例如由该基因编码的RNA转录物和/或蛋白质的平均稳态水平至少50％、60％、70％、80％、90％、95％或更多的减少)产生有活力但不再多能的细胞。在一些实施方案中，该基因特征在于，当该细胞分化成为终末分化细胞时其在ES细胞中的表达减少(引起，例如由该基因编码的RNA转录物和/或蛋白质的平均稳态水平至少50％、60％、70％、80％、90％、95％或更多的减少)。

本文使用的“多能性诱导基因”指的是其表达促进程序重排体细胞为多能状态的基因。“多能性诱导因子”指的是多能性诱导基因的表达产物。多能性诱导因子可以，但不必是，多能性因子。外源引入的多能性诱导因子的表达可以是瞬时的，即它可以在程序重排过程的至少一部分期间被需要以便诱导多能性和/或建立稳定的多能状态但是之后不被需要来维持多能性。例如，该因子可以诱导功能与多能性相关的内源基因的表达。这些基因可以然后维持程序重排细胞于多能状态。

在此“多核苷酸”与“核酸”可互换地使用表示核苷的聚合物。一般地本发明的多核苷酸由通过磷酸二酯键连接的在DNA或RNA中天然发现的核苷(例如腺苷、胸苷、鸟苷、胞苷、尿苷、脱氧腺苷、脱氧胸苷、脱氧鸟苷和脱氧胞苷)组成。然而该术语包括包含含有化学或生物学修饰的碱基、修饰的主链等的核苷或核苷类似物的分子，不管是否在天然存在的核酸中发现，并且对于某些应用这样的分子可能是优选的。当该应用指的是多核苷酸的情况，应理解提供DNA、RNA两者，以及在每种情况下单和双链的形式两者(以及各单链分子的互补物)。本文使用的“多核苷酸序列”指的是多核苷酸材料本身和/或生化表征特定核酸的序列信息(即用作碱基缩写的字母的序列)。除非另有指示在此给出的多核苷酸序列以5′至3′方向存在。

“多肽”指的是氨基酸聚合物。术语“蛋白质”和“多肽”在此可互换地使用。肽是相对短的多肽，长度一般在大约2和60氨基酸之间。在此使用的多肽一般包含氨基酸，例如在蛋白质中最通常发现的20种L氨基酸。然而，能够使用本领域已知的其它氨基酸和/或氨基酸类似物。多肽中的一个或更多个氨基酸可以被修饰，例如通过添加诸如碳水化合物基、磷酸基、脂肪酸基、用于缀合、功能化的接头等的化学实体。具有与其共价或非共价缔合的非多肽部分的多肽也被认为是“多肽”。示范性的修饰包括糖基化和棕榈酰化。多肽可以从天然来源纯化，使用重组DNA技术产生，通过诸如常规固相肽合成等的化学方法合成。本文使用的术语“多肽序列”或“氨基酸序列”指的是多肽材料本身和/或生化表征多肽的序列信息(即用作氨基酸名称缩写的字母或三字母代码的序列)。除非另有指示在此给出的多肽序列以N末端至C末端方向存在。

“多肽变体”指的是经氨基酸***、缺失和/或取代的不同于天然存在的多肽的任何多肽。变体可以是天然存在的或使用例如重组DNA技术或化学合成产生的。在一些实施方案中氨基酸“取代”是用具有相似结构和/或化学性质的另一种氨基酸替换氨基酸，即保守氨基酸替换的结果。可以根据任何多种性质的相似性产生“保守的”氨基酸取代，例如涉及的残基的侧链大小、极性、电荷、可溶性、疏水性、亲水性和/或两亲性。例如，非极性的(疏水的)氨基酸包括丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、甘氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、色氨酸和甲硫氨酸。极性的(亲水的)、中性的氨基酸包括丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、天冬酰胺和谷氨酰胺。带正电荷的(碱性的)氨基酸包括精氨酸、赖氨酸和组氨酸。带负电荷的(酸性的)氨基酸包括天冬氨酸和谷氨酸。***或缺失可以在从大约1至20氨基酸，例如1至10氨基酸的范围中。在有些情况下可以移去更大的结构域而基本不影响功能。在本发明的某些实施方案中可以通过对天然存在的酶的序列产生不超过总共5、10、15或20个氨基酸添加、缺失或取代获得变体序列。在一些实施方案中在多肽中不超过1％、5％、10％或20％的氨基酸是相对于原始多肽的***、缺失或取代。可以通过比较特定多肽的序列与同源多肽(例如来自其它生物体)的序列并且使高同源区域(保守区域)中产生的氨基酸序列变化的数目达到最小值，或者通过用同源序列中发现的氨基酸替换氨基酸，因为在多种物种中保守的氨基酸残基很可能对于活性比不保守的氨基酸重要，从而获得确定哪些氨基酸残基可以被替换、添加或缺失而不消除或基本不降低所关心的活性的指导。

本文使用的“纯化的”或“基本纯化的”表示指出的核酸或多肽在基本上没有其它生物大分子，例如多核苷酸、蛋白质等的情况下存在。在一个实施方案中，纯化多核苷酸或多肽以致它组成按重量计算至少90％，例如按重量计算至少95％，例如按重量计算至少99％的存在的多核苷酸或多肽(但是可以存在水、缓冲剂、离子和其它小分子，特别是具有小于1000道尔顿分子量的分子)。

在此“RNA干扰”与其在本领域的含义一致地用于指双链RNA(dsRNA)触发与该dsRNA的一条链具有互补性的相应的mRNA的序列特异性降解或翻译抑制的现象。可以理解dsRNA和mRNA链之间的互补性不需要为100％而是只需要足以介导基因表达抑制(也称为“沉默”或“敲低(knockdown)”)。例如，互补性程度是如此以至该链可以(i)指引RNA诱导的沉默复合物(RNA-induced silencingcomplex，RISC)中mRNA的断裂；或(ii)引起mRNA的翻译抑制。在某些实施方案中RNA的双链部分长度小于大约30核苷酸，例如长度在17至29核苷酸之间。在哺乳动物细胞中，可以通过把适当的双链核酸引入细胞或在细胞中表达此后胞内加工以在其中产生dsRNA的核酸实现RNAi。能够介导RNAi的核酸在此称为“RNAi试剂”。示范性的能够介导RNAi的核酸是短发夹RNA(shRNA)、短干扰RNA(siRNA)和微小RNA(microRNA)前体。这些术语是熟知的并且在此与它们在本领域的的含义一致地使用。siRNA一般包括彼此杂交形成双链体的两条分离的核酸链。它们可以体外合成，例如使用标准核酸合成技术。它们可以包括多种修饰核苷、核苷类似物并且可以包括化学或生物学修饰的碱基、修饰的主链等。本领域中已认识的用于RNAi的任何修饰都能够使用。一些修饰引起增加的稳定性、细胞摄取、效价等。在某些实施方案中siRNA包括长度大约19核苷酸的双链体以及长度1-5核苷酸的一或两个3′悬突，其可以由脱氧核糖核苷酸组成。shRNA包括包含由主要非自我互补区域分开的两个互补的部分的单一核酸链。互补的部分杂交以形成双链结构而非自我互补的区域形成连接该双链体的一条链的3′末端和另一条链的5′末端的环。shRNA经历胞内加工以产生siRNA。

微小RNA(miRNA)是以序列特异性方式抑制基因表达的大约21-25核苷酸(在哺乳动物***中)的小的、非编码的单链RNA。它们在胞内由具有由包含经常包括一个或更多个不完全互补区域的双链体的短发夹(长度大约70核苷酸)组成的特征二级结构的前体产生。天然存在的miRNA只与它们的目标mRNA部分互补并且一般通过翻译抑制起作用。在本发明中模仿内源微小RNA前体的RNAi试剂是有用的。在一些实施方案中，可以把编码茎-环结构茎部分或编码整个茎-环的序列***包括至少一部分内源微小RNA初级转录物的核酸，例如代替编码内源微小RNA或最小的(～70核苷酸)微小RNA发夹的序列。

“程序重排因子”指的是例如在体外促进或有助于细胞程序重排的基因、RNA或蛋白质。在本发明与程序重排因子有关的方面中，本发明提供了其中程序重排因子是体外程序重排体细胞为多能性所关心的实施方案。体外程序重排体细胞为多能性所关心的程序重排因子的实例为Oct4、Nanog、Sox2、Lin28、Klf4、c-Myc，以及在体外程序重排体细胞的方法中可以替代一个或更多个这些因子的任何基因/蛋白质。“体外程序重排为多能状态”或“体外程序重排为多能性”在此用于指不要求并且一般不包括核或细胞质转移或细胞融合，例如与***、胚胎、生殖细胞或多能细胞，的体外程序重排方法。本发明的任何实施方案或权利要求可以明确地排除有关或涉及核或细胞质转移或细胞融合，例如与***、胚胎、生殖细胞或多能细胞，的组合物或方法。

“可选择标记”指的是当表达时给予细胞可选择的表型，例如对细胞毒性或细胞生长抑制试剂的抗性(例如抗生素抗性)、营养原养型或能够用作为从不表达该蛋白质的细胞中区分表达该蛋白质的细胞的基础的特定蛋白质的表达，的基因、RNA或蛋白质。其表达可以容易地检测的蛋白质，例如荧光或发光蛋白质或者作用于底物上产生有色、荧光或发光物质(“可检测标记”)的酶组成了可选择标记的亚组。与通常在多能细胞中有选择地或唯一地表达的基因天然的表达控制元件连接的可选择标记的存在使鉴别和选择已经程序重排为多能状态的体细胞成为可能。可以使用多种可选择标记基因，例如新霉素抗性基因(neo)、嘌呤霉素抗性基因(puro)、鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(gpt)、二氢叶酸还原酶(DHFR)、腺苷脱氨酶(ada)、嘌呤霉素-N-乙酰基转移酶(PAC)、潮霉素抗性基因(hyg)、多药抗性基因(mdr)、胸苷激酶(TK)、次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(HPRT)和hisD基因。可检测标记包括绿色荧光蛋白(GFP)蓝色、青玉色、黄色、红色、橙色和青色荧光蛋白及其任何变体。发光蛋白质，例如萤光素酶(例如萤火虫或Renilla萤光素酶)也是有用的。对本领域技术人员明显的，本文使用的术语“可选择标记”可以指基因或该基因的表达产物，例如编码的蛋白质。

在一些实施方案中可选择标记赋予表达它的细胞相对于不表达它或以显著更低水平表达它的细胞增殖和/或生存优势。这样的增殖和/或生存优势一般当细胞在某些条件，即“选择性条件”下维持时存在。为了确保有效的选择，可以在一定条件下维持细胞群足够的时期以便不表达该标记的细胞不增殖和/或不生存并从群体中清除或者它们的数目减少到只有群体的很小部分。通过在选择性条件下维持细胞群以便大量或完全清除不表达该标记的细胞而选择表达赋予增殖和/或生存优势的标记的细胞的方法在此称为“正选择”，而该标记被称为是“对正选择有用的”。负选择和对负选择有用的标记也是在此描述的某些方法中所关心的。这样的标记的表达赋予表达该标记的细胞相对于不表达该标记或以显著更低水平表达它的细胞增殖和/或生存劣势(或者，考虑另一方面，不表达该标记的细胞相对于表达该标记的细胞具有增殖和/或生存优势)。因此当在选择性条件中维持足够的时期时表达该标记的细胞可以从细胞群中大量或完全清除。

当应用于分离的细胞时，术语“处理”等包括使该细胞经受任何种类的过程或条件或者在该细胞上实施任何种类的操作或步骤。当应用于受试者时，该术语指的是对个体提供内科或外科的关注、照料或管理。该个体通常是生病的或受伤的，或相对于种群的平均水平的成员处于变为生病的增加的风险并且需要这样的关注、照料或管理。

本文使用的术语“Wnt”或“Wnt蛋白质”指的是具有Wnt蛋白质或其至少部分保留天然存在的蛋白质与Wnt受体结合并激活Wnt信号传导的能力的片段、变体或衍生物的天然存在氨基酸序列的多肽。除可能存在于种群中的Wnt序列的天然存在的等位变体之外，可以理解事实上对于所有蛋白质，可以把多种改变引入在表1中的登录号下列出的序列(称为“野生型”序列)而基本不改变该多肽的功能(生物学)活性。这样的变体包括在术语“Wnt”、“Wnt蛋白质”等的范围中。

变体可以是，例如与全长Wnt至少80％、85％、90％、95％、98％或99％一致的多肽。变体可以是全长Wnt的片段。变体可以是天然存在的剪接变体。变体可以是与Wnt片段至少80％、85％、90％、95％、98％或99％一致的多肽，其中该片段长度为全长野生型多肽或其具有所关心的活性(例如与Wnt受体结合的能力)的结构域的至少50％、60％、70％、80％、85％、90％、95％、98％或99％。在一些实施方案中，从序列中的任何氨基酸位点开始并向C末端延伸，结构域长度为至少100、200、300或400氨基酸。优选避免本领域已知的消除或基本降低Wnt蛋白质活性的变异。在一些实施方案中，变体缺少全长多肽的N和/或C末端部分，例如缺少从任一末端的最多至10、20或50氨基酸。在一些实施方案中多肽具有成熟Wnt多肽的序列，由其表示在正常的胞内蛋白酶解加工期间(例如在共翻译或翻译后加工期间)除去一个或更多个部分(例如信号肽)的Wnt多肽。在一些实施方案中其中Wnt蛋白质不是以从天然表达它的细胞中纯化它的方式产生，该蛋白质是嵌合多肽，由其表示它包含来自两个或更多不同的物种的部分。在一些实施方案中其中Wnt蛋白质不是以从天然表达它的细胞中纯化它的方式产生，该蛋白质是Wnt衍生物，由其表示该蛋白质包括与Wnt不相关的另外的序列，只要那些序列基本不降低该蛋白质的生物活性。

使用本领域已知的试验，本领域技术人员会知道，或会容易地能够确定，特定的Wnt变体、片段或衍生物是否是功能性的。例如，可以使用标准蛋白结合测定评价Wnt多肽变体与Wnt受体结合的能力。适当的试验包括测定激活包含与编码可检测标记例如萤光素酶的核酸序列可操作地连接的TCF结合位点的报道构建体的转录的能力。一个试验涉及确定Wnt变体是否诱导β连环蛋白的磷酸化作用。可以使用任何适当的方法，例如免疫印迹法确定磷酸化状态。其它试验涉及测试变体或片段的Wnt的已知生物活性。参见，例如，Barker，N.andClevers，H.，Nat Rev Drug Discov.5(12)：997-1014，2006，其描述了适于鉴定调节Wnt途径活性的试剂的试验。这样的试验可以容易地适应于鉴定或证实激活Wnt途径活性的试剂的活性。在本发明的某些实施方案中功能性的变体或片段具有全长野生型多肽至少50％、60％、70％、80％、90％、95％或更多的活性。

“Wnt途径活性”或“Wnt信号传导”指的是刺激配体(例如Wnt蛋白质)与Wnt家族成员的受体结合之后跟着发生，最终导致基因转录中的改变，以及如果在体内，往往导致生物体中的特征生物学效应发生的一系列生化事件。

通过激活Wnt途径程序重排体细胞

本发明提供了激活Wnt途径对程序重排体细胞有用的认识。本发明提供了激活Wnt途径增加体细胞程序重排，例如当这样的细胞经受会引起至少一些细胞程序重排的处理时，的效率的另外的认识。“增加程序重排的效率”表示当细胞群经受程序重排处理时导致经历程序重排的细胞的百分比增加，一般在给定时期之后产生更大数目的程序重排细胞的单个集落。在本发明的一些实施方案中，按照本发明激活Wnt途径增加程序重排细胞的数目和/或程序重排细胞集落的数目和/或经历程序重排的细胞的百分比。本发明进一步提供了激活Wnt途径使没有遗传修饰的体细胞的程序重排能够增加它们的癌基因例如c-Myc的表达的认识。因此本发明提供了在另外涉及改造细胞以表达c-Myc的任何程序重排体细胞的方法中替代c-Myc的改造的表达的方法。在本发明的一些实施方案中，激活Wnt途径足以在否则程序重排不会发生的条件下允许程序重排。

本发明提供了用于产生程序重排体细胞的方法，包括调节，例如增加Wnt途径的活性。本发明进一步提供了在该方法中有用的组合物。在一个方面中，本发明提供了程序重排体细胞的方法，包括在该细胞中调节，例如增加Wnt途径活性。本发明进一步提供了用于体细胞程序重排的改进的方法，该方法包括使体细胞经受可以程序重排至少一些细胞的处理，其中改进包括在所述细胞中增加Wnt途径的活性。该处理可以是本领域已知的对程序重排体细胞有用的任何处理或被认为是能潜在用于该目的。在本发明的某些实施方案中使用Wnt途径激活剂，例如小分子、可溶Wnt蛋白质、或介导RNA干扰并由此抑制Wnt途径内源抑制剂的试剂增加Wnt途径活性。在某些实施方案中程序重排的体细胞在Wnt条件培养基中培养。在本发明的任何实施方案中，除非另有指示或从上下文显然的，“程序重排”可以指的是程序重排为多能状态。

Wnt是对一个广泛系列的发育和生理学过程重要的分泌蛋白质家族(Mikels，AJ and Nusse，R.，Oncogene，25：7461-7468，2006)。Wnts依次彼此相关并且在跨越多种物种的结构和功能中非常保守。因此在一个物种中显示活性的Wnt蛋白质可以用于其它物种以在这样的物种中激活Wnt途径并可以期望显示相似的活性。Wnt家族成员包括Wnt1、Wnt2、Wnt2b(也称为Wnt13)、Wnt3、Wnt3a、Wnt4、Wnt5a、Wnt5b、Wnt6、Wnt7a、Wnt7b、Wnt7c、Wnt8、Wnt8a、Wnt8b、Wnt8c、Wnt10a、Wnt10b、Wnt11、Wnt14、Wnt15或Wnt16。Wnt基因和蛋白质的序列是本领域已知的。本领域技术人员可以在可公开得到的数据库(例如参见表1)中容易地发现Wnt家族成员及其他在此所关心的基因和蛋白质的基因ID、登录号和序列信息。

表1：Wnt途径蛋白质、效应物和调节剂

基因	基因ID	登录号(mRNA/蛋白质)
			Wnt3a(小鼠)	22416	NM_009522/NP_033548
Wnt3a(人类)	89780	NM_033131/NP_149122
			β-连环蛋白(小鼠)	12387	NM_007614/NP_031640
β-连环蛋白(人类)	1499	NM_001098209/NP_001091679NM_001098210/NP_001091680NM_001904/NP_001895
			GSK3α(小鼠)	606496	NM_001031667/NP_001026837
GSK3α(人类)	2931	NM_019884/NP_063937
			GSK3β(小鼠)	56637	NM_019827/NP_062801
GSK3β(人类)	605004	NM_002093/NP_002084
			Sox2(小鼠)	20674	NM_011443/NP_035573
Sox2(人类)	6657	NM_003106/NP_003097
			Klf4(小鼠)	16600	NM_010637/NP_034767
Klf4(人类)	9314	NM_004235/NP_004226
			Oct4(小鼠)	18999	NM_013633/NP_038661

基因	基因ID	登录号(mRNA/蛋白质)
			Oct4(人类)	5460	NM_203289/NP_976034
Oct4(人类)	5460	NM_002701/NP_002692
			Nanog(小鼠)	71950	NM_028016.2/NP_082292.1
Nanog(人类)	79923	NM_024865/NP_079141
			Lin28(小鼠)	83557	NM_145833/NP_665832
Lin28(人类)	79727	NM_024674/NP_078950

Wnt信号传导由Wnt蛋白质与多种受体，包括Frizzled(Fz)跨膜受体家族成员和低密度脂蛋白受体相关蛋白质(LRP)家族成员(例如LRP5/LRP6)的相互作用启动。胞外Wnt信号刺激胞内信号转导级联，包括在核中调控基因表达的典型途径(由Logan CY and Nusse，R.Annu.Rev.Cell Dev.Biol.，20：781-810，2004综述)和若干非典型途径(由Kohn，AD and Moon，RT，Cell Calcium，38：439-446，2005综述)。简要地，通过典型途径的Wnt信号传导引起β连环蛋白的稳定化和核定位，其与T细胞因子/淋巴样增强因子(TCF/LEF)家族转录因子家族成员装配形成通常激活转录的复合物。无Wnt信号传导时β连环蛋白作为β连环蛋白破坏复合物的替代降解目标，而TCF/LEF形成通常抑制转录的复合物。无Wnt信号传导时，激酶，例如糖原合酶激酶-3(GSK3)和酪蛋白激酶1(CK1)磷酸化β连环蛋白，其因此被泛素化并且作为蛋白酶体破坏的目标。因此Wnt途径的激活引起β连环蛋白磷酸化的减少，由此引起其稳定化。若干内源蛋白质已经被鉴定为Wnt信号传导抑制剂，包括Dickkopf(Dkk)、断点簇区域蛋白质(breakpoint cluster region protein，Bcr)、包括WIF(Wnt抑制因子)结构域的蛋白质等。

在本发明的某些实施方案中程序重排方法包括使细胞与调节，例如增加Wnt途径活性的试剂接触。在一些实施方案中，增加Wnt途径诱导该细胞变成多能的并且拥有ES细胞特征性的特性。因此该方法对产生多能的、ES样细胞(iPS细胞)有用。在本发明的某些实施方案中引起Wnt途径活性增加的处理是引起β连环蛋白胞内水平增加的处理。在本发明的某些实施方案中，引起Wnt途径活性增加的处理是引起β连环蛋白核转运增加的处理。在本发明的某些实施方案中，引起Wnt途径活性增加的处理是能够引起暴露于生物活性Wnt蛋白质源的细胞的特征性基因表达改变的处理。在本发明的一些实施方案中，使用Wnt途径抑制剂调节程序重排。

当显示可以通过逆转录病毒感染向小鼠皮肤成纤维细胞中引入编码与多能性相关的四个转录因子，即Oct3/4、Sox2、c-Myc和Klf4，然后选择表达响应这些因子的多能性标记Fbx15的细胞，来产生具有ES细胞一些性质的细胞系时实现了朝体外程序重排体细胞为多能状态的目标的一个重要的进步(Takahashi，K.&Yamanaka，S.Cell 126，663-676，2006)。然而，产生的细胞在它们的基因表达和DNA甲基化模式方面不同于ES细胞并且当注射进正常小鼠胚泡时不产生活的嵌合体(遍及它们的身体携带来自原始胚泡和来自引入的细胞的细胞的动物)。后续工作通过实施更严格的选择改进了这些结果，产生了稳定的程序重排细胞系的衍生化，其根据报告的转录、印记(由它们来源的亲本预先决定的等位基因表达)和染色质修饰谱，显得与ES细胞基本上一致(Okita，K.，et al.，448，313-317，2007；Wernig，M.et al.Nature 448，318-324，2007；Maherali，N.et al.Cell Stem Cell 1，55-70，2007)。已经使用这些方法或其它方法(例如涉及小分子的应用)体外程序重排为多能状态的体细胞在此与本领域的用法一致地称为“诱导的多能干”(iPS)细胞。随后，显示人类体细胞也可以使用这些因子程序重排为多能性。此外，据证实Oct4、Nanog、Sox2和Lin28的组合也能在体外程序重排体细胞为多能状态(Yu J，Science，318(5858)：1917-20，2007)。然而，这些细胞的产生也涉及改造该细胞以表达多种转录因子以及使用逆转录病毒转导。

申请人现在已经显示了当遗传改造以表达Oct4、Sox2、Klf4和c-Myc的体细胞与Wnt3a条件培养基一起培养时比当该细胞在以对照细胞为条件的培养基中或在通常用于ES细胞增殖的标准细胞培养基中培养时发展了增加数量的由ES样细胞组成的集落。申请人进一步显示了当改造以表达Oct4、Sox2和Klf4而不修饰以表达c-Myc的体细胞在Wnt3a条件培养基中培养时发展了由ES样细胞组成的集落，而当这样的细胞在非条件培养基或以对照细胞为条件的培养基中培养时在图1中显示的20天时期内不形成ES样细胞集落。在两种情况下，集落显示了ES细胞集落特征性的形态特征和指示Oct4表达的可检测标记的表达。通过所有测试的标准，该细胞看起来是多能的、ES样细胞(iPS细胞)。此外，在Wnt3a条件培养基中培养体细胞看起来选择了程序重排的细胞。在有Wnt3a条件培养基的情况下形成的集落比在没有Wnt3a条件培养基的情况下获得的那些显得更同质。因此该方法对便于程序重排的细胞的鉴定，以及任选地便于这样的细胞从没有变成程序重排的细胞中的分离，而不需要依赖引入的遗传成分，例如其表达产物赋予耐药性或荧光的基因的化学选择有用。因此该方法对产生不携带为了该程序重排细胞的选择或检测的遗传修饰的程序重排细胞有用。此外，该方法对相对于在没有增加Wnt途径活性的试剂的情况下可以被程序重排的细胞的平均百分数，增加在包括程序重排细胞的集落中程序重排细胞的平均百分数有用。

申请人以及其它人已经注意了可以不用c-Myc病毒感染细胞而形成一些iPS样细胞。然而，这是低效事件并且可能至少部分是***诱变的结果，其中病毒整合事件直接激活c-Myc或c-Myc靶基因。在申请人的实验中，在很晚的时间点，即使没有Wnt条件培养基，在过表达Klf4、Sox2和Oct4的平板(没有引入c-Myc病毒)上看见了一些集落。Wnt条件培养基显著降低了需要的时间并且增加了程序重排过程的效率。本发明的一个方面是使用本发明的方法实现的更快的程序重排时间安排可以便于多能性诱导因子的瞬时过表达方法对iPS形成的用途(例如瞬时转染)和/或通过用程序重排试剂，例如蛋白质、小分子等代替病毒感染进行程序重排的用途。此外，申请人认为使用本发明的方法的iPS形成效率增加可能在程序重排有或者没有Myc过表达的人类细胞中有特别的用途。

无限制地，该方法因此对增加程序重排体细胞为iPS细胞的速度有用。因此，本发明提供了增加程序重排体细胞速度的方法，包括在Wnt条件细胞培养基中培养哺乳动物体细胞群以便在比在没有Wnt条件培养基的情况下更短的时期内至少一些细胞被诱导变成ES样细胞。本发明还提供了增加程序重排体细胞速度的方法，包括在培养的体细胞群中激活Wnt途径以便在比如果Wnt途径不激活的情况下更短的时期内至少一些细胞被诱导变成ES样细胞。本发明还提供了增加程序重排体细胞速度的方法，包括在有增加Wnt途径活性的试剂的情况下培养哺乳动物体细胞群以便在比没有所述试剂的情况下更短的时期内至少一些细胞被诱导变成ES样细胞。在本发明的一些实施方案中，该时期是7天，而在其它实施方案中该时期是10、15或20天。在本发明的一些实施方案中，处理(例如遗传改造)该细胞以便它们以比在没有这样的处理的情况下更高的水平表达Sox2、Klf4、Oct4和c-Myc。在本发明的一些实施方案中，处理该细胞以便它们以比在没有这样的处理的情况下更高的水平过表达Sox2、Klf4和Oct4，但是不遗传改造以过表达c-Myc。一种处理方法是用病毒(例如逆转录病毒、慢病毒)感染该细胞或用包含与适当的表达控制元件可操作地连接的因子序列的病毒载体(例如逆转录病毒载体、慢病毒载体)转染该细胞以继感染或转染以及任选地如本领域已知地整合进基因组之后在该细胞中驱动表达。与本发明的组合物和方法有关的更多细节提供如下。

本发明提供了程序重排体细胞的方法，包括在Wnt条件细胞培养基中培养该细胞以便该细胞变成程序重排的。在一些实施方案中，在Wnt条件细胞培养基中培养该细胞诱导该细胞变成多能的并且拥有ES细胞特征性的特性。因此该方法对产生多能的、ES样细胞(iPS细胞)有用。在一些实施方案中，该Wnt条件细胞培养基包括Wnt3a条件培养基。

术语“条件培养基”指的是先前已经用于培养细胞的细胞培养基。条件培养基特征在于它包含可溶性物质，例如信号分子、生长因子、激素等，其在细胞培养期间由细胞产生并释放进该培养基中。如本文使用的，“Wnt条件培养基”指的是先前已经用于培养产生和分泌Wnt的细胞的条件培养基。该培养基可以通过参考由细胞产生的特定Wnt蛋白质进一步描述。例如，“Wnt3a条件培养基”指的是先前已经用于培养产生Wnt3a的细胞的条件培养基。该细胞还可以产生除明确提及的特定Wnt之外的其它Wnt。除非另有指示，本发明的使用Wnt条件培养基的任何实施方案可以使用Wnt3a条件培养基。

可以理解某些Wnt具有与Wnt3a类似的生物活性和/或在序列上与Wnt3a密切地相关。使用产生这些Wnt的细胞制备的条件培养基用于本发明的某些实施方案。

可以通过本领域已知的方法制备条件培养基。这些方法一般包括在细胞培养基中培养第一细胞群，然后收获该培养基(一般不收获细胞)。可以过滤该收获的培养基以除去细胞碎片等。然后该条件培养基(包含由细胞分泌进该培养基的组分)可以用于支持第二细胞群的生长。在该培养基中培养细胞足够的时间以允许足够浓度的释放因子例如Wnt(和/或培养基组分的消耗)以产生支持体细胞程序重排的培养基。在一些实施方案中，培养基以37℃培养24h为条件。然而，可以使用更长或更短的时期例如在24和72小时之间。该细胞可用于在另外的培养时期上调节多批培养基，只要该细胞保留它们对于需要的目的以恰当的方式调节该培养基的能力。

其中培养细胞以产生条件培养基的培养基可以是能够维持该细胞生存力的常规细胞培养基。在一些实施方案中，该培养基是化学上确定的。在一些实施方案中，该培养基在组成上与通常用于培养与要使用条件培养基程序重排的体细胞相同物种的胚胎干细胞的培养基相似或相同。用于调节的基础培养基可以具有任何大量不同的组成，部分取决于使用的细胞类型。该培养基必须能够支持用于调节该培养基的细胞系的培养。在一些实施方案中，培养基还支持被程序重排前的体细胞和，任选地已经程序重排的体细胞的培养。然而，在调节以便使得它适于培养体细胞和程序重排的体细胞之后，该条件培养基可以补充以其它组分，与其它培养基组合等。

适当的基础培养基可以由下列组分制成：Dulbecco′s modifiedEagle′s培养基(DMEM)，Invitrogen Cat.No.11965-092；KnockoutDulbecco′s modified Eagle′s培养基(KO DMEM)，Invitrogen Cat.No.10829-018；Ham′s F12/50％DMEM基础培养基；200mM L-谷氨酰胺，Invitrogen Cat.No.15039-027；非必需氨基酸溶液，Invitrogen Cat.No.11140-050；β-巯基乙醇；人类重组碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)。示例性的包含血清的ES培养基由80％DMEM(典型地KO DMEM)、未热灭活的20％确定的胎牛血清(FBS)、1％非必需氨基酸、1mM L-谷氨酰胺和0.1mM β-巯基乙醇制成。过滤该培养基并于4℃存储不长于2星期。可以用80％KO DMEM、20％血清替代物、1％非必需氨基酸、1mM L-谷氨酰胺和0.1mM β-巯基乙醇和血清替代物例如Invitrogen Cat.No.10828-028制备无血清的ES培养基。过滤该培养基并于4℃存储。在与用于调节的细胞组合前，可以添加人类bFGF至4ng/mL的终浓度。

hESC SFM(Invitrogen Cat.No.A1000701)，一种为人类胚胎干细胞的生长和扩增特别配制的完全确定的、无血清和饲养物的培养基(SFM)是有用的。

用于制备条件培养基的细胞可以天然地产生Wnt。在一些实施方案中用于制备培养基的细胞被遗传改造以增加它们的Wnt表达，例如通过用编码Wnt的cDNA转染它们，其中该Wnt编码序列与在该细胞中有活性的表达控制序列可操作地连接。参见，例如Cai，L.，et al.，CellRes.17：62-72，2007。在一些实施方案中，该细胞产生并分泌Wnt进它们的培养基，产生具有在100ng/ml和1000ng/ml之间浓度的Wnt蛋白质的培养基。在一些实施方案中，该细胞产生并分泌Wnt进它们的培养基，产生具有在200ng/ml和500ng/ml之间浓度的Wnt蛋白质的培养基。过表达Wnt的细胞还可以用作程序重排体细胞目的的饲养细胞。

条件培养基可以在使用前与非条件培养基组合。为了简便起见，如果产生的培养基按体积包括至少5％的条件培养基它也被称为条件培养基。在一些实施方案中条件培养基的数量(按体积)至少为10％，例如至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或更多条件培养基。在一些实施方案中，条件培养基的数量按体积在大约50％和75％之间。非条件培养基可以是标准细胞培养基。在一些实施方案中非条件培养基是通常用于增殖与要程序重排的体细胞相同物种的ES细胞的培养基。

条件培养基可以在从用于产生它的细胞中收获之后立即使用或可以在使用前存储(例如于大约4℃或冷冻)。培养基可以在符合本发明的方法中维持条件培养基支持程序重排的能力的条件和时期下存储。无限制地，这些条件和时间可以符合维持存在于该培养基中的分泌的Wnt至少20％的原始生物活性，其可以使用上述的方法评价。条件培养基可以被浓缩或以另外方式加工，例如使用标准方法，只要这样的浓缩或加工符合当被加到非条件培养基时维持浓缩物支持程序重排的能力。无限制地，这样的浓缩或加工可以符合维持存在于该培养基中的分泌的Wnt至少20％的原始生物活性。如实施例中记录的，申请人的结果暗示正常的成纤维细胞(不改造以过表达Wnt)可以分泌促进程序重排的因子，也许包括Wnt3a，提高体细胞在体外经历程序重排的可能性，例如已经用逆转录病毒处理或以另外方式改造以表达Oct4、Sox2、Klf4和任选地c-Myc的培养中的细胞可以分泌这样的因子并且因此有助于它们自己的程序重排。在本发明的某些实施方案中，与经历程序重排的未修饰的体细胞，例如成纤维细胞在本领域已知的用于培养经历程序重排的体细胞的培养基中培养的情况相比，Wnt条件培养基具有更高的Wnt蛋白质浓度和/或Wnt途径激活活性。在一些实施方案中，这样的浓度和/或Wnt途径激活能力可以是存在于其中对照成纤维细胞如实施例5中的描述培养的培养基中的至少1.5、2、5、10、20或更多倍。

本发明的某些方法涉及使体细胞在体外与一种或更多种调节，例如增加Wnt途径活性的确定的试剂接触。可以在本领域已知的标准细胞培养基中维持细胞。可以在使用培养基培养细胞前或在细胞培养期间把试剂添加到培养基。在这里术语“确定的试剂”表示调节，例如增加Wnt途径活性的试剂的结构、序列或身份是已知的和/或该试剂是化学合成的和/或该试剂是(在添加到培养基前)分离的或至少部分纯化的。例如，该试剂不能是未表征或未鉴定的条件培养基组分、细胞或组织裂解物或提取物、细胞胞质或核材料等。

多种试剂可以用来增加Wnt途径活性。这样的试剂在此被称为“Wnt途径激活剂”或“Wnt激动剂”。Wnt途径激活剂可以通过与Wnt受体相互作用直接或通过与一种或更多种Wnt信号传导途径的胞内组分，例如β连环蛋白、作用于β连环蛋白上的激酶或磷酸酶、与β连环蛋白装配的转录因子等相互作用间接起作用。激活剂可以增加Wnt或Wnt途径组分例如β连环蛋白的表达。在某些实施方案中Wnt途径激活剂增加Wnt途径的活性到足够增强体细胞程序重排的水平。在本发明的某些实施方案中Wnt途径激活剂抑制β连环蛋白的降解，从而增强体细胞的程序重排。在本发明的某些实施方案中，关心在体细胞中或在程序重排的体细胞中抑制Wnt途径。例如，Wnt途径抑制剂可以用于表征或探测程序重排发生的机制和/或鉴定程序重排试剂(例如不通过Wnt途径起作用的试剂)。此外，在本发明的某些实施方案中，Wnt途径抑制剂(例如小分子、siRNA、蛋白质等)可以对例如在体外分化流程中，促进程序重排的、多能的细胞分化为需要的细胞类型有用。

在本发明的某些实施方案中，Wnt途径激活剂或抑制剂是与Wnt受体结合的蛋白质或小分子。例如，Wnt途径激活剂可以是可溶的、生物学上有活性的Wnt蛋白质。

在一些实施方案中添加到培养基的Wnt蛋白质浓度在10和10,000ng/ml之间，例如在100和5,000ng/ml之间，例如在1,000和2,500ng/ml之间或在2,500和5,000ng/ml之间，或在5,000和10,000ng/ml之间。

如上所述某些Wnt具有与Wnt3a类似的生物活性和/或在序列上与Wnt3a密切地相关。使这些Wnt和/或模拟这些Wnt活性的试剂用于本发明的某些实施方案。

Wnt蛋白质可以从天然存在的来源(例如天然产生该蛋白质的哺乳动物细胞)分离，使用重组体表达技术在真核或原核细胞中产生，或化学合成。可以使用本领域已知的方法以纯化形式制备可溶的、生物学上有活性的Wnt蛋白质。参见，例如美国专利公开号20040248803和Willert，K.，et al.，Nature，423：448-52，2003。在某些实施方案中该可溶的、生物学上有活性的Wnt蛋白质是Wnt3a。在某些实施方案中Wnt蛋白质如当该Wnt蛋白质在天然表达该Wnt蛋白质的宿主细胞中产生时发生的共翻译或翻译后修饰。在其它实施方案中Wnt蛋白质不如在自然中的共翻译或翻译后修饰。在某些实施方案中用脂质部分，例如棕榈酸修饰该可溶的、生物学上有活性的Wnt蛋白质。该脂质部分可以与保守的半胱氨酸连接。例如，在某些实施方案中Wnt蛋白质如本领域已知的在保守的半胱氨酸上棕榈酰化。在某些实施方案中Wnt蛋白质如当该Wnt蛋白质在天然表达该Wnt蛋白质的哺乳动物宿主细胞中产生时发生的糖基化。在其它实施方案中Wnt蛋白质不如在自然中发现的糖基化。重组小鼠Wnt3a是市场上可买到的(例如从Millipore cat.no.GF145 or R&D Systems cat.no.1324-WN-002)。

在本发明的某些实施方案中Wnt途径激活剂是增加β连环蛋白水平、促进其核定位或以另外方式激活β连环蛋白信号传导的试剂。

在本发明的某些实施方案中Wnt途径激活剂是小分子，由其表示具有多碳-碳键和小于1500道尔顿的分子量的有机化合物。一般这样的化合物包括一个或更多个介导与蛋白质结构相互作用，例如氢键作用的官能团，并且一般包括至少一个氨基、羰基、羟基或羧基，以及在一些实施方案中至少两个化学官能团。小分子试剂可以包括用一个或更多个化学官能团和/或杂原子取代的环状碳或杂环结构和/或芳香或多芳香结构。

在本发明的某些实施方案中Wnt途径激活剂是抑制糖原合酶激酶3(GSK3)的试剂。这些试剂有效地“开启”Wnt途径而不需要胞外的Wnt。GSK3是丝氨酸/苏氨酸激酶，最初被鉴定为葡萄糖代谢的调节剂(在Frame and Cohen，Biochem J 359：1-16，2001中综述；也参见Cohen，Biochem Soc Trans 7：459-80，1979；Embi et al.，Eur JBiochem 107：519-27，1980)。如本文使用的“GSK3”指的是GSK3同种型(GSK3α和GSK3β)二者之一或两者。抑制这些同种型二者之一或两者的抑制剂是有用的。在某些实施方案中GSK3抑制剂特异地抑制GSK3而基本不抑制大多数其它哺乳动物激酶。在一些实施方案中GSK3抑制剂基本不抑制至少10种不同的哺乳动物激酶。在一些实施方案中GSK3抑制剂特异地抑制GSK3β和GSK3α两者。在一些实施方案中GSK3抑制剂特异地抑制GSK3β而不是GSK3α。例如，GSK3α的IC50可以是GSK3β的至少10倍。在一些实施方案中GSK3抑制剂特异地抑制GSK3α而不是GSK3β。例如，GSK3β的IC50可以是GSK3α的至少10倍。在某些实施方案中GSK3抑制剂对GSK3的IC50至多是其对大多数其它哺乳动物激酶的IC50的1/10。在某些实施方案中GSK3抑制剂对GSK3的IC50小于10μM。在某些实施方案中GSK3抑制剂对GSK3的IC50小于1μM。可以了解在使用以便在其中抑制GSK3的条件下GSK3抑制剂应该能够以足够的数量进入细胞。在一些实施方案中使用的GSK3抑制剂的浓度至少等于在体外测定的该化合物的IC50。在一些实施方案中使用的GSK3抑制剂的浓度不超过在体外测定的该化合物的IC50的100倍。在一些实施方案中使用的浓度介于在体外测定的该试剂的IC50的.5和50倍范围之间。

现在已经鉴定了许多有效的和选择性的GSK3小分子抑制剂(Wagman AS，Johnson KW，Bussiere DE，Curr Pharm Des.，10(10)：1105-37，2004)。示例性的有用的GSK3抑制剂包括下列：(1)BIO：(2′Z，3′E)-6-溴靛玉红(Bromoindirubin)-3′-肟。6-溴靛玉红-3′-肟(BIO)是有效的、可逆的和ATP竞争性GSK-3抑制剂(Polychronopoulos，P.et al.J.Med.Chem.47，935-946，2004)。(2)AR-A014418：N-(4-甲氧苯甲基)-N′-(5-硝基-1，3-噻唑-2-基)尿素。AR-A014418以ATP竞争性方式(Ki＝38nM)抑制GSK3(IC50＝104nM)。AR-A014418不显著抑制cdk2或cdk5(IC50＞100μM)或26种其它激酶，证明对GSK3的高度特异性(Bhat，R.，et al.，J.Biol.Chem.278，45937-45945，2003)。(3)SB 216763：3-(2，4-二氯苯基)-4-(1-甲基-1H-吲哚-3-基-1H-吡咯-2，5-二酮。参见，例如Smith，D.G.，et al，Bioorg.Med.Chem.Lett.11，635-639，(2001)和Cross，D.A.，et al.，J.Neurochem.77，94-102，(2001)，(4)SB 415286：3-[(3-氯-4-羟苯基)氨基]-4-(2-硝基苯基)-1H-吡咯-2，5-二酮。SB 415286描述于Smith，D.G.，et al，Bioorg.Med.Chem.Lett.11，635-639，2001和Coughlan，M.P.，et al，Chem.Biol.10，793-803，2000，(5)TDZD-8：4-苯甲基-2-甲基-1，2，4-噻二唑烷-3，5-二酮。该化合物是GSK-3的选择性抑制剂、噻二唑烷酮(thiadiazolidinone)衍生物、GSK-3β的非ATP竞争性抑制剂(IC50＝2μM)。它不以＞100μM抑制Cdk-1/细胞周期蛋白(cyclin)B、CK-II、PKA或PKC。已经提出它与GSK-3β的激酶位点结合。(Martinez et al.，J.Med.Chem.45，1292-1299，2002)；CHIR-911和CHIR-837(也分别称为CT-99021和CT-98023)。Chiron Corporation(Emeryville，Calif.)和相关的化合物是有用的。氯化锂、丙戊酸钠和GSK3抑制剂II(Calbiochem)是其它有用的GSK3抑制剂。另外的GSK3抑制剂描述于美国专利号6,057,117和6,608,063；美国专利申请公布20040092535、20040209878、20050054663。其它有用的GSK3抑制剂描述于WO/2003/049739，其公开了作为GSK-3抑制剂有用的嘧啶化合物；WO/2002/085909，其公开了作为GSK-3抑制剂的9-脱氮杂鸟嘌呤(DEAZAGUANINE)衍生物，WO/2003/011287，其公开了作为GSK-3抑制剂的吡唑酮衍生物，WO/2005/039485和/或WO/2006/091737。

在本发明的某些实施方案中Wnt途径激活剂是酪蛋白激酶1(CK1)抑制剂。实例包括D4476、IC261和CKI-7(参见，例如Rena，G.，et al.EMBO reports 5(1)，60-65，2004)。抑制CK1和GSK3的化合物公开于美国专利号7098204。

在本发明的某些实施方案中Wnt途径激活剂是在一个或更多个由GSK3或CK1磷酸化的位点天然地使β连环蛋白去磷酸的磷酸酶的激活剂。

CREB结合蛋白(CBP)和密切相关的蛋白质p300可以与β连环蛋白装配并作为β连环蛋白结合的转录辅激活剂。例如，为了产生转录活性复合物，β连环蛋白募集转录辅激活剂、CREB结合蛋白(CBP)或其密切相关的同系物p300(Hecht et al.，EMBO J.19：1839-50(2000)；Takemaru et al.，J.Cell Biol.149：249-54(2000))以及该基础转录机制的其它组分。其它β连环蛋白辅激活剂包括TBP、BRG1、BCL9/PYG等。本发明包括直接或间接地调节β连环蛋白和这些辅激活剂中任何一个或更多个之间的相互作用以便增强体细胞的程序重排。例如，本发明包括相对于在一个或更多个其它复合物中β连环蛋白的参与改变其在这些复合物中任何一个或更多个中的相对参与。例如小分子的试剂可以用于选择性破坏β连环蛋白与特定辅激活剂的相互作用，从而潜在降低可以抑制程序重排或有利于分化的转录。选择性破坏可以使平衡朝向与不同辅激活剂的相互作用移动以形成增强程序重排的复合物。该试剂可以直接在复合物上或间接地，例如通过引起翻译后修饰(例如β连环蛋白或辅激活剂的磷酸化)起作用。在一个实施方案中，该试剂是描述于美国专利公开号20070128669的化合物或其类似物或衍生物，或者具有相同作用机理的试剂。β连环蛋白相互作用蛋白(又名ICAT或CTNNBIP1)结合β连环蛋白并抑制β连环蛋白和TCF家族成员之间的相互作用(Gottardi，et al.，Am J Physiol CellPhysiol.286(4)：C747-56，2004)。编码的蛋白质是Wnt信号传导途径的负调节物。本发明包括抑制ICAT(该术语包括抑制β连环蛋白和TCF相互作用的任何转录物变体或家族成员)以便激活Wnt途径。在本发明的某些实施方案中，激活Wnt途径的试剂通过抑制Wnt途径的内源抑制剂或负调节物的表达或活性实现这样。在一些实施方案中，该试剂通过RNA干扰(RNAi)抑制表达。在一些实施方案中，该试剂抑制GSK3、ICAT、CK1或CTNNBIP1的表达或活性。

在一些实施方案中在本发明中有用的抑制剂是RNAi试剂。本领域技术人员能够鉴定抑制所关心的基因表达的适当的RNAi试剂。参见，例如Yu，J-Y.，et al.，Molecular Therapy，7(2)：228-236，2003。RNAi试剂可以抑制表达到足以降低从该基因转录的RNA(例如，mRNA)或其编码的蛋白质的平均稳态水平例如，至少50％、60％、70％、80％、90％、95％或更多。RNAi试剂可以包含在17-29核苷酸之间长度的序列，例如与mRNA 100％互补的19-23核苷酸长度或者当与mRNA比对以实现互补碱基对的最大数目时包含不参与Watson-Crick碱基对的最多1、2、3、4或5核苷酸，或最多大约10-30％核苷酸。RNAi试剂可以包含在17-29核苷酸长度之间的双链体，其中全部核苷酸参与Watson-Crick碱基对或其中最多大约10-30％的核苷酸不参与Watson-Crick碱基对。本领域技术人员可以知道哪些序列特征往往与优越的siRNA功能性和算法和规则相关，通过其可以设计这样的siRNA(参见，例如Jagla，B.，et al，RNA，11(6)：864-72，2005)。本发明的方法可以，但是不必，使用具有这些特征的siRNA。在一些实施方案中，选择RNAi试剂的链的二者之一或两者的序列以避免沉默非靶基因，例如该链可以具有与除靶mRNA以外的任何mRNA小于70％、80％或90％的互补性。在一些实施方案中，使用了多种不同的序列。表1列出了编码GSK3的人类和小鼠基因的基因ID以及核酸(mRNA)和蛋白质序列登录号。能够沉默哺乳动物基因的RNAi试剂是市场上可买到的(例如从例如Qiagen、Dharmacon、Invitrogen等的供应商)。如果多种同种型存在，人们可以设计靶向存在于给定的所关心的细胞中表达的所有同种型中的区域的siRNA或shRNA。

通过用siRNA或编码shRNA的构建体转染细胞沉默基因的方法是本领域已知的。为了在体细胞中表达RNAi试剂，可以如本领域已知的把包括与适当的表达控制元件，例如启动子可操作地连接的编码该RNAi试剂的序列的核酸构建体引入该细胞。为了本发明的目的包括编码所关心的RNA或多肽的序列的核酸构建体，该序列与在所关心的细胞中指导转录的表达控制元件例如启动子可操作地连接，被称为“表达盒”。启动子可以是在哺乳动物体细胞中有功能的RNA聚合酶I、II或III启动子。在某些实施方案中，RNAi试剂的表达是有条件的。在一些实施方案中，通过把编码RNAi试剂的序列置于可调控的(例如可诱导的或可抑制的)启动子的控制下调控表达。

蛋白质，例如β连环蛋白或Wnt信号传导途径的其它组分的组成性活性形式也是有用的。其中N末端截短或者在N末端区域潜在的GSK-3磷酸化位点的缺失或者丝氨酸或苏氨酸残基的错义突变引起截短的或正常尺寸的β连环蛋白的累积然后引起β连环蛋白介导的信号的激活(de La Coste PNAS，95(15)：8847-8851，1998)。抑制Wnt信号传导的内源蛋白质的显性阴性形式也是有用的。在一些实施方案中，改造体细胞以表达这些蛋白质。在一些实施方案中，把该蛋白质添加到培养基。

在一些实施方案中，处理细胞以增强胞内作用的Wnt途径激活剂的摄取。例如，细胞膜可以部分透化处理。在一些实施方案中，修饰Wnt途径激活剂以包括增强被细胞的细胞分子摄取的氨基酸序列(也称为“蛋白质转导结构域”)。这样的增强摄取的氨基酸序列在例如HIV-1TAT蛋白质、单纯疱疹病毒1(HSV-1)DNA结合蛋白VP22、果蝇Antennapedia(Antp)转录因子等中发现。人工序列也是有用的。参见，例如Fischer et al，Bioconjugate Chem.，Vol.12，No.6，2001和美国专利号6,835,810。

无限制地，本发明预期在本发明的方法中使用公开于美国专利公开号20060147435中的任何组合物和方法以用于促进Wnt/β连环蛋白信号传导。

在本发明的一些实施方案中，处理体细胞以便它们以比在没有这样的处理的情况下更高的水平表达Wnt蛋白质。在一些实施方案中，遗传改造体细胞以比在没有这样的处理的情况下更高的水平稳定或瞬时表达Wnt蛋白质。在本发明的一些实施方案中，处理体细胞以便它们以比在没有这样的处理的情况下更高的水平表达Wnt途径组分，例如β连环蛋白或TCF/LEF。在本发明的一些实施方案中，遗传改造体细胞以比在没有这样的处理的情况下更高的水平稳定或瞬时表达Wnt途径组分，例如β连环蛋白或TCF/LEF。

本发明的方法可以包括用多种程序重排试剂同时(即在至少部分重叠的时期)或顺序地处理细胞和/或重复用一种试剂处理细胞的步骤。用于重复处理的试剂可以与在第一次处理期间使用的试剂相同或不同。细胞可以和程序重排试剂接触不同的时期。在一些实施方案中，细胞与试剂接触1小时和60天之间，例如10和30天之间，例如大约15-20天的时期。可以每当替换细胞培养基时添加程序重排试剂。可以在实施选择以富集多能细胞或评价细胞的多能性特征前除去程序重排试剂。

所关心的程序重排试剂或候选程序重排试剂包括多种化合物。示例性的化合物包括抑制组蛋白脱乙酰基作用的试剂，例如组蛋白脱乙酰基酶(HDAC)抑制剂和抑制DNA甲基化的试剂，例如DNA甲基转移酶抑制剂。不希望被理论约束，DNA脱甲基作用可以通过“开放”染色质结构(可作为增加的核酸酶灵敏度检测)调控基因表达。该染色质结构的改造允许转录因子与启动子区域结合，转录复合物的装配和基因表达。

主要的HDAC抑制剂种类包括(a)短链脂肪酸(例如丙戊酸)；(b)氧肟酸盐(hydroxamate)小分子抑制剂(例如SAHA和PXD101)；(c)非氧肟酸盐小分子抑制剂，例如MS-275；和(d)环肽：例如，缩酚酸肽(depsipeptide)(参见，例如Carey N and La Thangue NB，CurrOpin Pharmacol.；6(4)：369-75，2006)。组蛋白脱乙酰基酶抑制剂的实例包括曲古抑菌素(Trichostatin)A：[R-(E，E)]-7-[4-(二甲氨基)苯基]-N-羟基-4，6-二甲基-7-氧-2，4-庚二烯酰胺(heptadienamide)，其在纳摩尔浓度抑制组蛋白脱乙酰基酶；产生的组蛋白超乙酰化引起染色质松弛和基因表达调节。(Yoshida，M.，et al.，Bioessays 17，423-430，1995；Minucci，S.，et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 94，11295-11300，1997；Brehm，A.，et al.，1998；Medina，V.，et al.，Induction of caspase-3protease activity and apoptosis by butyrate and trichostatin A(inhibitorsof histone deacetylase)：dependence on protein synthesis and synergywith a mitochondrial/cytochrome c-dependent pathway.Cancer Res.57，3697-3707，1997；Kim，M.S.，et al.，Inhibition of histone deacetylaseincreases cytotoxicity to anticancer drugs targeting DNA.Cancer Res.63，7291-7300，2003)；Apicidin：环[(2S)-2-氨基-8-氧癸酰基(oxodecanoyl)-1-甲氧基-L-色氨酰-L-异亮氨酰-(2R)-2-piperidinexcarbonyl](Kwon，S.H.，et al.J.Biol.Chem.18，2073，2002；Han，J.W.，et al.Cancer Res.60，6068，2000；Colletti，S.L.，et al.Bioorg.Med.Chem.11，107，2001；Kim，J.S.，et al.Biochem.Biophys.Res.Commun.281，866，2001)。

多种DNA甲基化抑制剂是本领域已知的并在本发明中有用。参见，例如Lyko，F.and Brown，R.，JNCI Journal of the National CancerInstitute，97(20)：1498-1506，2005。DNA甲基化抑制剂包括核苷DNA甲基转移酶抑制剂，例如地西他滨(decitabine)，(2′-脱氧-5-氮杂胞苷)、5-氮杂脱氧胞嘧啶和zebularine，非核苷抑制剂，例如多酚(-)-表没食子儿茶精-3-没食子酸盐(EGCG)和小分子RG108(2-(1，3-二氧-1，3-二氢-2H-异吲哚-2-基)-3-(1H-吲哚-3-基)丙酸)，WO2005085196中描述的化合物和如WO2007007054描述的酞酰胺(phthalamides)、琥珀酰亚胺(succinimides)及相关的化合物。三种另外种类的化合物是：(1)4-氨基苯甲酸衍生物，例如抗心律不齐药物普鲁卡因胺(procainamide)和局部麻醉剂普鲁卡因(procaine)；(2)psammaplins，其也抑制组蛋白脱乙酰基酶(Pina，I.C.，J Org Chem.，68(10)：3866-73，2003)；和(3)寡核苷酸，包括siRNA、shRNA和特异性反义寡核苷酸，例如MG98。DNA甲基化抑制剂可以通过多种不同的机制起作用。核苷抑制剂在掺入DNA前通过细胞途径代谢。在掺入之后，它们起DNMT酶的***底物的作用。已经提出非核苷抑制剂普鲁卡因、表没食子儿茶精-3-没食子酸盐(EGCG)和RG108通过掩蔽DNMT靶序列(即普鲁卡因)或通过封闭该酶的活性部位(即EGCG和RG108)抑制DNA甲基转移酶。在本发明的一些实施方案中，使用组合的DNA甲基化抑制剂。在一些实施方案中，选择浓度以使在细胞上的毒性作用最少。在一些实施方案中不使用掺入DNA(或其代谢产物掺入DNA)的试剂。

可以替代地或另外使用RNAi试剂抑制DNA甲基转移酶(DNMT1、3a和/或3b)和/或一种或更多种HDAC家族成员。

本发明包括Wnt条件培养基、可溶性Wnt或调节Wnt信号传导途径的小分子与可以替换Oct4、Sox2、Klf4、Nanog和/或Lin28逆转录病毒的其它瞬时信号，例如小分子联合在程序重排体细胞为多能性中的用途。本发明提供了包括Wnt途径调节剂和至少一种选自下列的化合物的组合物：HDAC抑制剂和DNA甲基化抑制剂。本发明提供了包括Wnt途径调节剂、至少一种HDAC抑制剂和至少一种DNA甲基化抑制剂的组合物。本发明提供了包含任何上述试剂组合的细胞培养基。在某些实施方案中，HDAC抑制剂是上述任何HDAC抑制剂。在某些实施方案中，DNA甲基化抑制剂是上述任何HDAC抑制剂。在某些实施方案中，Wnt途径调节剂激活Wnt途径。在某些实施方案中，细胞培养基包括Wnt条件培养基，例如Wnt3a-CM，作为Wnt途径调节剂的来源。在某些实施方案中，Wnt途径调节剂是小分子。在某些实施方案中，组合物包括体细胞。在某些实施方案中，改造体细胞以表达转录因子Oct4、Nanog、Sox2、Klf4和Lin28的至少一种。

体细胞和程序重排的体细胞

本发明有用的体细胞可以是原代细胞(非无限增殖化细胞)，例如刚从动物分离的那些，或可以来源于在培养中有能力延长增殖(例如比3个月更长)或无限增殖(无限增殖化细胞)的细胞系。成体体细胞可以从个体，例如人类受试者中获得，并且按照本领域普通技术人员可得到的标准细胞培养流程培养。继从受试者中分离之后细胞可以在细胞培养中维持。在某些实施方案中，继从个体分离之后细胞在本发明的方法中使用前传代一次或更多次(例如，在2-5、5-10、10-20、20-50、50-100次之间或更多)。它们可以冷冻并随后在使用前解冻。在一些实施方案中，继从个体分离之后细胞在本发明的方法中使用前可以已经传代不超过1、2、5、10、20或50次。

在本发明中有用的体细胞包括哺乳动物细胞，例如人类细胞、非人灵长类细胞或小鼠细胞。它们可以通过众所周知的方法从多种器官获得，例如皮肤、肺、胰腺、肝脏、胃、肠、心脏、生殖器官、膀胱、肾、尿道和其它泌尿器官等，通常从包含活的体细胞的任何器官或组织获得。在本发明的多个实施方案中有用的哺乳动物体细胞包括，例如成纤维细胞、成体干细胞、sertoli细胞、粒层细胞(granulosa cell)、神经元、胰岛细胞、表皮细胞、上皮细胞、内皮细胞、肝细胞、毛囊细胞、角质化细胞、造血细胞、黑素细胞、软骨细胞、淋巴细胞(B和T淋巴细胞)、红细胞、巨噬细胞、单核细胞(monocyte)、单核细胞(mononuclear cell)、心肌细胞、骨骼肌细胞等，通常包括任何活的体细胞。

可以处理体细胞以使它们以高于在没有这样的处理的情况下的水平表达或包含一种或更多种程序重排因子、多能性因子和/或多能性诱导因子。例如，体细胞可以被遗传改造以表达一种或更多种编码一种或更多种这样的因子的基因和/或可以用增加一种或更多种编码这样的因子的内源基因表达和/或稳定这样的因子的试剂处理。该试剂可以是，例如小分子、核酸、多肽等。在一些实施方案中，把因子例如多能性因子引入体细胞，例如通过显微注射或通过在其中该因子被该细胞摄取的条件下用该因子接触该细胞。在一些实施方案中，修饰该因子以并入蛋白质转导结构域。在一些实施方案中，透化或以另外方式处理细胞以增加它们对该因子的摄取。示例性的因子论述如下。

转录因子Oct4(也称为Pou5f1、Oct-3、Oct3/4)是多能性因子的实例。已经显示Oct4是建立和维持ES细胞的未分化表型所需要的并且在决定胚胎发生和细胞分化中的早期事件中起重要的作用(Nicholset al.，1998，Cell 95：379-391；Niwa et al.，2000，Nature Genet.24：372-376)。当干细胞分化成为更特化的细胞时Oct4表达下调。Nanog是多能性因子的另一个实例。Nanog是在维持内细胞团的多能细胞和来自这些的ES细胞的衍生化中具有必要功能的包含同源框的转录因子。此外，Nanog的过表达能够在通常的分化诱导培养条件下维持ESC的多能性和自我更新特性。(参见Chambers et al.，2003，Cell 113：643-655；Mitsui et al.，Cell.2003，113(5)：631-42)。Sox2，另一个多能性因子，是已知对正常的多能性细胞发育和维持必不可少的包含HMG结构域的转录因子(Avilion，A.，et al.，Genes Dev.17，126-140，2003)。Klf4是最初鉴定为肠中表达的Klf家族成员的Krüppel型锌指结构转录因子(Shields，J.M，et al.，J.Biol.Chem.271：20009-20017，1996)。发现在小鼠ES细胞中Klf4的过表达预防悬浮培养中形成的胚状体中的分化，暗示Klf4有助于ES自我更新(Li，Y.，et al.，Blood 105：635-637，2005)。Sox2是SOX(性别决定区域Y-盒(sex determining regionY-box))转录因子家族成员并且对维持ES细胞自我更新是重要的。c-Myc是在正常发育和生理学中扮演无数角色的转录因子以及是其失调表达或突变和多种类型的癌有牵连的癌基因(综述于Pelengaris S，Khan M.，Arch Biochem Biophys.416(2)：129-36，2003；Cole MD，Nikiforov MA，Curr Top Microbiol Immunol.，302：33-50，2006)。在一些实施方案中，这样的因子选自：Oct4、Sox2、Klf4及其组合。在一些实施方案中，用不同的、功能上重叠的Klf家族成员例如Klf2代替Klf4。在一些实施方案中，该因子至少包括Oct4。在一些实施方案中，该因子至少包括Oct4和Klf家族成员，例如Klf2。Lin28是发育调控的RNA结合蛋白。在一些实施方案中，处理体细胞以便它们表达或包含一种或更多种选自下列的程序重排因子：Oct4、Sox2、Klf4、Nanog、Lin28及其组合。CCAAT/增强子结合蛋白质α(enhancer-binding-protein-alpha，C/EBPα)是至少在某些细胞类型，例如淋巴样细胞(例如B谱系细胞)中促进程序重排的另一种蛋白质，被认为是这些细胞类型的程序重排因子，并且在本发明的某些实施方案中有用，例如和本文描述的一种或更多种多能性基因和/或Wnt途径调节剂的联合。

所关心的其它基因与染色质改造有关和/或已经显示对于维持ES细胞的多能性是重要的。任选地该基因当细胞分化时下调和/或在成体体细胞中不表达。所关心的其它基因编码与专能性或多能性相关和/或在专能或多能细胞中天然表达的微小RNA前体。所关心的其它基因包括编码抑制在专能或多能细胞中天然表达的内源微小RNA的靶基因的RNAi试剂。

在一个实施方案中，外源引入的基因由除其功能与多能性相关的内源基因的染色体基因座以外的染色体基因座表达。这样的染色体基因座可以是具有开放染色质结构的基因座，并且包含在体细胞中不需要其表达的基因，例如该染色体基因座包含其破坏不会引起细胞死亡的基因。示例性的染色体基因座包括，例如小鼠ROSA 26基因座和II型胶原(Col2a1)基因座(参见Zambrowicz et al.，1997)。

用于在细胞中表达基因的方法是本领域已知的。通常，编码多肽或功能性RNA(例如RNAi试剂)的序列与适当的调控序列可操作地连接。术语调控序列包括启动子、增强子和其它表达控制元件。示例性的调控序列描述于Goeddel；Gene Expression Technology：Methodsin Enzymology，Academic Press，San Diego，CA(1990)。例如，当与DNA序列可操作地连接时控制其表达的任何多种表达控制序列可以用于这些载体以表达cDNA。

外源引入的基因可以由可诱导的或可抑制的调控序列表达以便其表达可以被调控。如本文使用的术语“可诱导的调控序列”指的是在没有诱导物(例如化学和/或生物试剂)或诱导物的组合的情况下不指导可操作地连接的核酸序列(例如cDNA)表达，或指导其低水平表达，而响应诱导物，其指导表达的能力增强的调控序列。示例性的可诱导启动子包括，例如响应重金属(CRC Boca Raton，Fla.(1991)，167-220；Brinster et al.Nature(1982)296，39-42)、热休克、激素(Leeet al.P.N.A.S.USA(1988)，85，1204-1208；(1981)294，228-232；Klocket al.Nature(1987)，329，734-736；Israel and Kaufman，Nucleic AcidsRes.(1989)，17，2589-2604)的启动子，响应化学试剂，例如葡萄糖、乳糖、半乳糖或抗生素的启动子。“可抑制的调控序列”是在没有抑制表达的特定试剂或试剂的组合的情况下指导可操作地连接的核酸序列表达的调控序列。

四环素可诱导启动子是响应抗生素的可诱导启动子的实例。参见Gossen，M.and Bujard，H.，Annu Rev Genet.Vol.36：153-1732002及其参考文献。四环素可诱导启动子包括与一种或更多种四环素操纵基因可操作地连接的最小的启动子。四环素或其类似物的存在引起转录激活剂与四环素操纵基因序列结合，其激活该最小的启动子以及由此相关cDNA的转录。四环素类似物包括显示与四环素结构相似性并能够激活四环素可诱导启动子的任何化合物。示例性的四环素类似物包括，例如多西环素(doxycycline)、金霉素和脱水四环素。

在本发明的一些实施方案中，引入的基因，例如编码程序重排因子或RNAi试剂的基因的表达是瞬时的。瞬时表达可以通过瞬时转染或通过由可调控启动子表达实现。在一些实施方案中，表达可以通过位点特异的重组酶的表达调控，或依赖于其表达。除了别的以外，重组酶***包括Cre-Lox和Flp-Frt***(Gossen，M.and Bujard，H.，2002)。在一些实施方案中，重组酶用于通过除去否则将把编码序列从表达控制序列分离的终止(stopper)序列开启表达。在一些实施方案中，重组酶用于在已经诱导多能性之后切除基因的至少一部分。在一些实施方案中，重组酶是瞬时表达的，例如它在大约1-2天、2-7天、1-2星期等之后变成不可检测的。在一些实施方案中重组酶从外部来源引入。任选地这些实施方案中的重组酶是蛋白质转导结构域。

可以评价程序重排体细胞的一种或更多种多能性特征。多能性特征的存在表明体细胞已经程序重排为多能状态。如本文使用的术语“多能性特征”指的是与多能性相关的和指示多能性的特征，包括，例如分化成为来源于所有三种胚胎胚层全部类型的细胞的能力以及多能细胞独特的基因表达模式，包括多能性因子的表达和其它ES细胞标记的表达。

为了评价可能程序重排的体细胞的多能性特征，人们可以分析这些细胞的特定生长特性和ES细胞样形态。可以皮下注射细胞进免疫妥协SCID小鼠以确定它们是否诱导畸胎瘤(ES细胞的标准试验)。可以把ES样细胞分化成为胚状体(另一种ES特有的特性)。此外，可以通过添加已知驱动分化成为特定细胞类型的某些生长因子在体外分化ES样细胞。自我更新能力，由端粒酶活性的诱导指示，是可以被监控的另一种多能性特征。人们可以通过把程序重排体细胞引入胚泡并确定该细胞是否能够产生所有细胞类型实施程序重排体细胞的功能性试验。参见Hogan et al.，2003。如果该程序重排细胞能够形成身体的一些细胞类型，它们是专能的；如果该程序重排细胞能够形成包括生殖细胞的身体所有细胞类型，它们是多能的。

人们也可以检查该程序重排体细胞中单个多能性因子的表达以评价它们的多能性特征。另外或替代地，人们可以评价其它ES细胞标记的表达。时期特异性胚胎15抗原-1、-3和-4(SSEA-1、SSEA-3、SSEA-4)是在早期胚胎发育中特异表达的糖蛋白并且是ES细胞的标记(Solter and Knowles，1978，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 75：5565-5569；Kannagi et al.，1983，EMBO J 2：2355-2361)。碱性磷酸酶(AP)的增加表达是与未分化胚胎干细胞相关的另一种标记(Wobus et al.，1984，Exp.Cell 152：212-219；Pease et al.，1990，Dev.Biol.141：322-352)。另外的ES细胞标记描述于Ginis，I.，et al.，Dev.Biol.，269：369-380，2004和The International Stem Cell Initiative，Adewumi O，et al.，NatBiotechnol.，25(7)：803-16，2007及其中的参考文献。例如，TRA-1-60、TRA-1-81、GCTM2和GCT343，以及蛋白质抗原CD9、Thy1(又称CD90)、1类HLA、NANOG、TDGF1、DNMT3B、GABRB3和GDF3、REX-1、TERT、UTF-1、TRF-1、TRF-2、连接蛋白43(connexin43)、连接蛋白45、Foxd3、FGFR-4、ABCG-2和Glut-1是有用的。

人们可以实施程序重排体细胞的表达特征测定以评价它们的多能性特征。多能细胞，例如胚胎干细胞，和专能细胞，例如成体干细胞，已知具有不同的整体基因表达模式。参见，例如Ramalho-Santos etal.，Science 298：597-600，2002；Ivanova et al.，Science 298：601-604，2002；Boyer，LA，et al.Nature 441，349，2006和Bernstein，BE，et al.，Cell125(2)，315，2006。人们可以评价DNA甲基化、基因表达，和/或细胞DNA的后生状态，和/或细胞的发育潜能，例如如Wernig，M.，et al.，Nature，448：318-24，2007中描述的。当注入到SCID小鼠时能够形成包含具有内胚层、中胚层和外胚层特征的细胞的畸胎瘤和/或具有参与(在注射入鼠胚泡后)形成存活到足孕的嵌合体的能力的细胞被认为是多能的。对评价多能性有用的另一种方法是确定细胞是否重新激活了沉默的X染色体。

可以程序重排体细胞以获得任何一整套多能性特征。可选择地，可以程序重排体细胞以获得仅仅一亚组多能性特征。

本发明的某些方法包括选择表达由专能或多能细胞表达的标记的细胞的步骤。该标记可以是在这些细胞中特异表达的。可以使用标准细胞分离方法，例如流式细胞术、亲合性分离等。替代地或另外，人们可以选择不表达可能程序重排的细胞从其衍生出的体细胞的特征性的并且不在使用常规方法产生的ES细胞中表达的标记的细胞。其它分离细胞的方法可以利用在多能细胞和体细胞之间可能存在的平均细胞大小或密度的差异。例如，可以通过具有只允许某些细胞穿过的孔的材料过滤细胞。

在一些实施方式中，体细胞包含与可选择或可检测标记(例如GFP或neo)可操作地连接的编码多能性因子的基因的调控序列。编码该标记的核酸序列可以整合在编码该多能性因子(例如Oct4)的基因的内源基因座或构建体可以包括与该标记可操作地连接的调控序列。该标记的表达可以用于选择、鉴定和/或定量程序重排的细胞。

本发明的与产生程序重排体细胞有关的任何方法可以包括从需要细胞治疗的个体获得体细胞或获得体细胞群的步骤。从获得的细胞或由获得的细胞传下来的细胞中产生、选择或鉴定程序重排的体细胞。任选地在产生、选择或鉴定与供体遗传相配的程序重排体细胞前在培养中扩增该细胞。

在一些实施方案中亚克隆和/或传代集落一次或更多次以便获得富集ES样细胞的细胞群。富集的群可以包含至少95％、96％、97％、98％、99％或更多，例如100％的ES样细胞。本发明提供了已经稳定地和可遗传地程序重排为ES样状态的体细胞细胞系。

在一些实施方案中，使用非遗传改造的体细胞实施该方法以便鉴定或选择程序重排的细胞。产生的程序重排体细胞不包含已经由人工引入所述细胞(或所述细胞的祖先)的外源遗传物质，例如为了鉴定或选择程序重排细胞的目的。在一些实施方案中，体细胞和从其中衍生出的程序重排体细胞在它们的基因组中包含外源遗传物质，但是这些遗传物质是为了在这些细胞中修正遗传缺陷或使这些细胞能够合成用于治疗目的的需要的蛋白质的目的引入的而不是用来鉴定或选择程序重排的细胞。

在一些实施方案中，该方法使用形态学标准以从非程序重排的体细胞群中鉴定程序重排的体细胞。在一些实施方案中，该方法使用形态学标准以从未程序重排或只是部分程序重排为ES样状态的细胞群中鉴定已经程序重排为ES样状态的体细胞。“形态学标准”广义用于指细胞或集落的任何视觉上可检测的特性或特征。形态学标准包括，例如集落的形状、集落边缘的清晰度、密度、小尺寸、和细胞相对于非程序重排细胞的圆形形状等。图1显示了显示指示已经程序重排为ES样状态的细胞的形态学标准的细胞集落。记录下由小的、圆形的细胞，以及清晰的集落边缘组成的密集的集落。本发明包括鉴定以及，任选地，分离集落(或来自集落的细胞)，其中该集落显示一种或更多种这样的特征。可以当集落在第一细胞培养皿(该术语指的是任何器皿、平板、皿、贮器、容器等，在其中活细胞可以在体外维持)中生长时鉴定程序重排的体细胞以及将该集落或其部分转移到第二细胞培养皿，由此分离程序重排体细胞。然后细胞可以进一步扩增。筛选程序重排体细胞或有助于程序重排体细胞的试剂的方法

本发明还提供了用于鉴定单独或与一种或更多种其它试剂联合程序重排体细胞为更少分化状态的试剂的方法。本发明进一步提供了按照该方法鉴定的试剂。在一个实施方案中，该方法包括使体细胞与Wnt途径激活剂和候选试剂接触并确定该候选试剂的存在是否引起相对于如果细胞没有与该候选试剂接触时存在的增强的程序重排(例如增加的程序重排速度和/或效率)。在一些实施方案中，Wnt激活剂和候选试剂在细胞培养基中共同存在而在其它实施方案中Wnt激活剂和候选试剂不共同存在(例如，细胞顺序地暴露于试剂)。细胞可以在培养中维持，例如，至少3天，至少5天，直至10天，直至15天，直至30天等，在其期间它们与Wnt激活剂和候选试剂接触该时间的全部或部分。在一些实施方案中，如果在所述时期之后与如果该细胞没有与该试剂接触相比较有至少2、5或10倍的程序重排细胞或主要包括程序重排细胞的集落，该试剂被鉴定为程序重排细胞的试剂。

候选试剂可以是任何分子或超分子复合物，例如多肽、肽(其在此用于指包含60个氨基酸或更少的多肽)、小的有机或无机分子(即具有小于1,500Da、1000Da或500Da的分子量的分子)、多糖、多核苷酸等，其将测试程序重排细胞的能力。在一些实施方案中，候选试剂是有机分子，尤其是小的有机分子，包括介导与蛋白质结构相互作用，例如氢键作用的官能团，并且典型地包括至少一个氨基、羰基、羟基或羧基，并且在一些实施方案中至少该化学官能团中的两种。候选试剂可以包括用一个或更多个化学官能团和/或杂原子取代的环状碳或杂环结构和/或芳香或多芳香结构。

候选试剂从多种来源中获得，如本领域理解的，包括合成或天然化合物的文库。在一些实施方案中，候选试剂是合成的化合物。对于多种有机化合物和生物分子的随机和定向的合成许多技术是可得到的。在一些实施方案中，候选调节剂以细菌、真菌、植物和动物提取物、发酵肉汤、条件培养基等形式的天然化合物的混合物提供，其是可得到或容易产生的。

在一些实施方案中，筛选化合物文库。文库典型地是可以被呈现或展示的以便该化合物可以在筛选试验中被鉴定的化合物的集合。在一些实施方案中，文库中的化合物被放在单独的孔(例如，微量滴定板中的)、器皿、管等中，以促进便利的转移到单独的孔或器皿以用于接触细胞，实施无细胞试验等。文库可以由在与主结构连接的基团的数量或类型方面不同的具有共同结构特征的分子组成或者可以是完全随机的。文库包括但不限于，例如，噬菌体展示文库、肽文库、多核糖体文库、适体文库、合成小分子文库、天然化合物文库和化学文库。用于制备分子文库的方法是本领域众所周知的并且许多文库是可以从商业或非商业来源获得的。所关心的文库包括合成的有机组合文库。文库，例如合成的小分子文库和化学文库可以包括结构上不同的化学分子的集合。小分子包括通常具有多个碳-碳键的有机分子。文库可以包括用一个或更多个官能团取代的环状碳或杂环结构和/或芳香或多芳香结构。在一些实施方案中，小分子具有5和50之间的碳原子，例如7和30之间的碳。在一些实施方案中，化合物是大环的。所关心的文库还包括肽文库、随机化的寡核苷酸文库等等。文库可以是类肽和非肽合成部分合成的。可以进一步合成包含与其天然存在的对应物相比更不易遭受酶降解的非肽合成部分的文库。还可以产生小分子组合文库。小的有机化合物的组合文库可以包括在一个或更多个差异点彼此不同的密切相关的类似物的集合并且通过使用多步加工的有机技术合成。组合文库可以包括许许多多小的有机化合物。如本文使用的“化合物阵列”是可通过它们在笛卡儿坐标(Cartesiancoordinate)中的空间地址识别并且被排列以便各化合物具有共同的分子核心以及一个或更多个可变的结构差异元件的化合物的集合。在这样的化合物阵列中化合物在分离的反应容器中并行产生，各化合物由其空间地址鉴定和追踪。并行合成的混合物和并行合成方法的实例提供于美国专利号5,712,171。在一些实施方案中，筛选了包含两种或更多种化合物、提取物或从天然来源获得的其它制品(其可以包括数打化合物或更多)和/或无机化合物等的混合物。

在一个实施方案中，本发明的方法被用于筛选“批准的药物”。“批准的药物”是已经被FDA或其它国家的类似政府机构批准在人类使用的用于任何目的的任何化合物(该术语包括生物分子，例如蛋白质和核酸)。这可以是对筛选特别有用的化合物类别因为它代表被认为是安全并且，至少在FDA批准的药物的情况下，对于至少一个目的有疗效的一组化合物。因此，有高的可能性这些药物对于其它目的将至少是安全的。

可以筛选的文库的代表性实例包括DIVERSet^TM，可以从ChemBridge Corporation，16981Via Tazon，San Diego，Calif.92127获得。DIVERSet包含10,000和50,000之间的药物样、人工合成的小分子。化合物被预选择以形成用最小数量化合物覆盖最大药效基团差异并适于高通量或低通量任何一种筛选的“通用的”文库。对于另外的文库的描述，参见，例如，Tan，et al.，Am.Chem Soc.120，8565-8566，1998；Floyd C D，Leblanc C，Whittaker M，Prog Med Chem 36：91-168，1999。许多文库是市场上可买到的，例如，来自AnalytiCon USA Inc.，P.O.Box 5926，Kingwood，Tex.77325；3-Dimensional Pharmaceuticals，Inc.，665Stockton Drive，Suite 104，Exton，Pa.19341-1151；Tripos，Inc.，1699Hanley Rd.，St.Louis，Mo.，63144-2913等。例如，基于奎尼酸(quinic acid)和莽草酸(shikimic acid)、羟脯氨酸、山道宁(santonine)、双脱水-D-山梨醇、羟基哌可啉酸(hydroxypipecolinic acid)、穿心莲内酯(andrographolide)、基于哌嗪-2-羧酸的文库、胞嘧啶等的文库是市场上可买到的。

在一些实施方案中，候选试剂是来自从细胞，例如多能细胞制备的cDNA表达文库的cDNA。这些细胞可以是胚胎干细胞、***、卵裂球、畸胎癌、胚胎生殖细胞、内细胞团细胞等。

可以理解要测试的候选程序重排试剂一般是不存在于标准培养基中的，或如果存在则与当用于本发明时相比较是以低数量存在的。

还可以理解有用的程序重排试剂或程序重排处理的其它形式不必能够程序重排所有类型的体细胞以及不必能够程序重排给定细胞类型的所有体细胞。无限制地，产生程序重排细胞2、5、10、50、100或更多倍富集的群体(即在群体中的程序重排细胞的分数为存在于以同样的方式处理但不与该候选试剂接触的细胞的起始群体的2、5、10、50或100倍)的候选试剂是有用的。

在本发明的一些实施方案中，本发明的筛选方法用于鉴定在程序重排细胞为ES样状态中替代Klf4的试剂或试剂的组合。该方法可以使用被改造以表达Sox2和Oct4并与Wnt途径激活剂接触的体细胞实施。在一些实施方案中，该方法用于鉴定在程序重排细胞为ES样状态中替代Sox2的试剂。该方法可以使用被改造以表达Klf4和Oct4并与Wnt途径激活剂接触的体细胞实施。在一些实施方案中，该方法用于鉴定在程序重排细胞为ES样状态中替代Oct4的试剂。该方法可以使用被改造以表达Sox2和Klf4并与Wnt途径激活剂接触的体细胞实施。预期Klf4、Sox2、Oct4和c-Myc的被改造的表达被用不涉及基因组修饰的小分子和/或多肽或其它试剂的组合处理体细胞替代。在一些实施方案中，该方法使用人类细胞实施。在一些实施方案中，该方法使用小鼠细胞实施。在一些实施方案中，该方法使用非人灵长类细胞实施。

本发明包括测试Wnt途径调节剂，例如已知或怀疑调节Wnt途径的小分子的文库，以鉴定在增强程序重排中有效和/或，例如相对于测试的其它化合物，具有增强程序重排体细胞为多能性的优越能力的那些。在一些实施方案中，测试了至少10种、至少20种、至少50种、至少100种或至少1,000种小分子，例如结构上相关的分子，至少其中一些是已知的或被认为调节Wnt途径活性。在一些实施方案中，Wnt抑制剂用于证实增强程序重排并被怀疑是通过调节Wnt途径活性完成的化合物实际上通过Wnt途径起作用。例如，如果Wnt途径抑制剂阻断了测试化合物在程序重排上的效果，可以推断该测试化合物通过Wnt途径起作用。

与Wnt途径调节有关的本发明的方法和组合物可以被应用于或用于与对体细胞程序重排和/或鉴定可用于体细胞程序重排的程序重排试剂有用的多种其它方法和组合物组合。这些组合的方法和组合物是本发明的方面。例如，本发明的一些实施方案使用以与这些因子在许多其它细胞类型中表达相比较更高的水平天然表达一种或更多种程序重排因子的细胞类型(例如神经干细胞或祖细胞)(参见，例如，Eminli，et al.，Reprogramming of Neural Progenitor Cells into iPS Cellsin the Absence of Exogenous Sox2Expression，Stem Cells.2008Jul 17.，在印刷之前epub)。

该方法和组合物可以与PCT/US2008/004516中公开的方法和组合物一起使用，其通过引用并入本文：

已经衍生出了携带程序重排因子作为限定的多西环素(dox)可诱导的转基因的遗传同质的′次级′体细胞(Wernig，et al.，A noveldrug-inducible transgenic system for direct reprogramming of multiplesomatic cell types.Nature Biotechnology；2008年7月1日在线公开；doi：10.1038/nbt1483)。通过用dox-可诱导的慢病毒感染成纤维细胞，添加dox程序重排，选择诱导的多能干细胞并产生嵌合小鼠产生这些细胞。来源于这些嵌合体的细胞在dox暴露下不需要病毒感染而以使用直接感染和药物选择多能性标记再活化观察到的效率的25到50倍的效率程序重排。在本发明的一些实施方案中，这些次级体细胞用于本发明的实施方案中和/或次级体细胞通过使用如本文描述的Wnt途径刺激而不使用c-Myc病毒产生。本发明预期了在与次级体细胞有关的组合物和方法中Wnt途径调节的用途。

在本发明的一些实施方案中，体细胞包含与内源多能性基因(例如Oct4或Nanog)的启动子可操作地连接的编码可选择标记的核酸序列。编码该标记的序列可以在该内源基因座整合进基因组。该可选择标记可以是，例如，可容易检测的蛋白质，例如荧光蛋白质，例如GFP或其衍生物。该标记的表达是程序重排的指示并且因此能用于鉴定或选择程序重排的细胞，定量程序重排效率，和/或鉴定、表征或使用增强程序重排和/或正测试它们增强程序重排的能力的试剂。

程序重排的体细胞及其用途

本发明提供了程序重排的体细胞(RSC)，包括诱导的多能干细胞(iPS细胞)，其通过本发明的方法产生。这些细胞在医学、农业和其它关心的领域具有许多应用，其中一些在这里描述。

本发明提供了用于在哺乳动物中治疗或预防状况的方法。在一个实施方案中，该方法涉及从个体获得体细胞，程序重排通过本发明的方法这样获得的体细胞以获得RSC，例如iPS细胞。然后在适于该RSC发育成为需要的细胞类型的细胞的条件下培养它们。把需要的细胞类型的发育的细胞引入个体以治疗状况。在一个选择性的实施方案中，该方法由从个体获得体细胞开始，程序重排通过本发明的方法这样获得的体细胞。然后在适于该RPC发育成为需要的器官条件下培养该RPC，收获该需要的器官并且把其引入个体以治疗状况。该状况可以是其中细胞或器官功能是反常的和/或降低到正常水平以下的任何状况。因此，本发明包括从需要细胞治疗的个体获得体细胞，通过包括激活Wnt途径和/或在Wnt条件培养基中培养该细胞的过程程序重排该细胞，任选地分化程序重排的体细胞以产生具有一种或更多种需要的细胞类型的细胞，并且把该细胞引入该个体。需要细胞治疗的个体可以遭受任何状况，其中该状况或该状况的一种或更多种症状可以通过把细胞给药到供体缓和和/或其中该状况的发展可以通过把细胞给药到该个体减缓。该方法可以包括鉴定或选择程序重排的体细胞并从没有程序重排的细胞中分离它们的步骤。

在本发明的某些实施方案中RSC是ES样细胞，也称为iPS细胞，并且因此可以按照已知的分化ES细胞的方法诱导分化以获得需要的细胞类型。例如，iPS细胞可以通过在分化培养基中并且在提供细胞分化的条件下培养这些细胞被诱导分化成为造血干细胞、肌细胞、心肌细胞、肝细胞、胰腺细胞、软骨细胞、上皮细胞、泌尿道细胞、神经***细胞(例如神经元)等。引起使用传统方法获得的胚胎干细胞分化的培养基和方法是本领域已知的，适当的培养条件也是如此。这样的方法和培养条件可以被用于按照本发明获得的iPS细胞。参见，例如Trounson，A.，The production and directed differentiation of humanembryonic stem cells，Endocr Rev.27(2)：208-19，2006及其中的参考文献，对于一些实施例它们全部通过引用并入。也参见Yao，S.，et al，Long-term self-renewal and directed differentiation of human embryonicstem cells in chemically defined conditions，Proc Natl Acad Sci USA，103(18)：6907-6912，2006及其中的参考文献，它们全部通过引用并入。

因此，使用已知的方法和培养基，本领域技术人员可以培养程序重排的多能细胞以获得需要的分化细胞类型，例如神经细胞、肌细胞、造血细胞等。受试细胞可以用于获得任何需要的分化细胞类型。这样的分化人类细胞提供了许多治疗机会。例如，来源于按照本发明程序重排的细胞的人类造血干细胞可以用于需要骨髓移植的医学治疗。这样的步骤用于治疗许多疾病，例如晚期癌症和例如白血病的恶性肿瘤。这样的细胞也对治疗贫血、例如AIDS的损害免疫***的疾病等有用。本发明的方法还可以用于治疗、预防或稳定神经学疾病，例如阿尔茨海默氏病、帕金森氏病、亨廷顿氏病、或ALS、溶酶体贮存病、多发性硬化、或脊髓损伤。例如，可以从需要治疗的个体中获得体细胞，并且程序重排以获得多能性，并且培养以衍生出可以用于代替或协助患病或损坏的组织的正常功能的神经外胚层细胞。

可以把产生生长因子或例如胰岛素的激素等的程序重排的细胞给药到哺乳动物用于内分泌紊乱的治疗或预防。可以把程序重排的上皮细胞给药到体腔或器官，例如肺、肠、外分泌腺或泌尿生殖道，的内层以修复损坏。还预期可以把程序重排的细胞给药到哺乳动物以在器官，例如膀胱、脑、食道、输卵管、心脏、肠、胆囊、肾、肝脏、肺、卵巢、胰腺、***、脊髓、脾、胃、睾丸、胸腺、甲状腺、气管、输尿管、尿道或子宫中治疗细胞的损坏或缺乏。

本发明具有提供基本上无限的适于移植的遗传匹配的细胞供给的潜能。这样的供给可以解决与当前的移植方法相关的重要问题，即因为宿主抗移植物或移植物抗宿主排斥而可能发生的移植组织排斥。RSC还可以与基质组合以在体外或体内形成可以用于修复或代替接受者哺乳动物中的组织或器官的组织或器官。例如，可以在有基质的情况下体外培养RSC以产生泌尿生殖、心血管或肌骨胳***的组织或器官。可选择地，可以把细胞和基质的混合物给药到哺乳动物用于体内形成需要的组织。按照本发明产生的RSC可以用于产生遗传改造的或转基因的分化细胞，例如通过引入需要的一个或数个基因，或者去除按照本发明产生的RSC的一个或数个内源基因的全部或部分，并且允许这样的细胞分化成为需要的细胞类型。一种用于实现这样的修饰的方法是通过同源重组，该技术可以用于在基因组中的一个或数个特定位点***、缺失或修饰一个或数个基因。

该方法可以用于替换有缺陷的基因或引入引起治疗有益的蛋白质(例如生长因子、激素、淋巴因子、细胞因子、酶等)表达的基因。例如，编码脑衍生的生长因子的基因可以被引入人类胚胎或干样细胞，该细胞分化成为神经细胞并且该细胞移植入帕金森氏患者以延缓在该疾病期间神经细胞的损耗。使用引入需要的基因/突变进ES细胞的已知方法，RSC可以被遗传改造，并且产生的改造的细胞分化成为需要的细胞类型，例如造血细胞、神经细胞、胰腺细胞、软骨细胞等。可以被引入RSC的基因包括，例如表皮生长因子、碱性成纤维细胞生长因子、神经胶质衍生的神经营养生长因子、***(I和II)、神经营养因子3、神经营养因子-4/5、睫状神经营养因子、AFT-1、细胞因子基因(白细胞介素、干扰素、集落刺激因子、肿瘤坏死因子(α和β)等)、编码治疗性酶的基因、胶原、人血清白蛋白等。

如果需要，本领域已知的负选择***可以用于从患者清除治疗性细胞。例如用胸苷激酶(TK)基因转染的细胞可以引起包含TK基因的胚胎(例如ES样)细胞的产生。这些细胞的分化可以引起还表达TK基因的所关心的治疗性细胞的分离。这样的细胞可以在任何时候从gancyclovir给药的患者中选择性清除。这样的负选择***描述于美国专利号5,698,446。在其它实施方案中该细胞被改造以包含编码其表达在可诱导启动子的控制下的毒性产物的基因。该诱导物的给药引起该毒性产物的产生，导致细胞的死亡。因此本发明的任何体细胞可以包括***基因，任选地包含在表达盒中，其可以被整合进基因组中。***基因是其表达对细胞是致命的基因。实例包括编码白喉毒素、霍乱毒素、篦麻毒素的基因等。***基因可以在没有特定诱导试剂或刺激的正常环境中不指导表达的表达控制元件的控制下。然而，可以在适当的条件下诱导表达，例如，(i)通过把适当的诱导试剂给药到细胞或生物体或(ii)如果特定基因(例如，癌基因、涉及细胞***周期的基因、或指示去分化或分化丧失的基因)在细胞中表达，或(iii)如果例如细胞周期控制基因的基因或指示分化的基因的表达丧失。参见，例如美国专利号6,761,884。在一些实施方案中该基因只跟随位点专一的重组酶介导的重组事件表达。这样的事件可以使编码序列与例如启动子的表达控制元件的可操作地连接。如果在把细胞(或它们的祖先)给药到受试者之后需要从受试者的身体清除细胞(或它们的后代)，可以诱导***基因的表达。例如，如果程序重排的体细胞产生肿瘤，该肿瘤可以通过诱导***基因的表达清除。在一些实施方案中肿瘤形成被抑制因为该细胞在去分化或适当的细胞周期控制的丧失时被自动清除。

可以治疗或预防的疾病、病症或状况的实例包括神经学上的、内分泌的、结构的、骨骼的、血管的、泌尿的、消化的、体壁的、血液、免疫的、自身免疫的、炎性的、内分泌的、肾、膀胱、心血管的、癌症、循环的、消化的、造血的和肌肉的疾病、病症和状况。此外，程序重排的细胞可以用于重建的应用，例如修复或替换组织或器官。在一些实施方案中，包括促进血管生成的生长因子和蛋白质或其它试剂可能是有益的。可选择地，组织形成可以完全在体外实行，利用适当的培养基和条件、生长因子、和可生物降解的聚合物基质。

对于本发明的治疗性方法，把RSC给药到哺乳动物不限于特定的给药方式、剂量或给药频率；本发明预期了所有给药方式，包括肌内的、静脉内的、关节内的、损害内的、皮下的或足够提供足够预防或治疗疾病的剂量的任何其它途径。RSC可以以单剂量或多剂量给药到哺乳动物。当多剂量给药时，剂量可以彼此隔开，例如一星期、一个月、一年或十年。还可以在该细胞给药之前、期间或之后给药一种或更多种生长因子、激素、白细胞介素、细胞因子或其它细胞以进一步使它们向特定细胞类型偏移。

本发明的RSC可以用作体外分化模型，特别是用于与早期发育调控有关的基因的研究。使用程序重排的细胞产生的分化的细胞组织和器官可以用于研究药物效果和/或鉴定潜在有用的药物试剂。

体细胞程序重排方法和程序重排的细胞的进一步的应用

本文公开的程序重排方法可以用于产生RSC，例如iPS细胞，用于多种动物物种。产生的RSC可以对产生需要的动物有用处。动物包括，例如，鸟类和哺乳动物以及任何濒危物种的动物。示例性的鸟包括家禽(例如鹌鹑、小鸡、鸭、鹅、火鸡和雌珠鸡)。示例性的哺乳动物包括鼠、山羊、绵羊、牛、猪、犬科、猫科和非人灵长类。这些之中，优选的成员包括家养动物，包括，例如牛、猪、马、奶牛、兔、豚鼠、绵羊和山羊。

基因鉴定的方法

本发明提供了用于鉴定其表达抑制程序重排的细胞产生的基因的方法。一种方法包括：(i)在体细胞中激活Wnt途径；(ii)通过RNAi降低候选基因的表达；(iii)测定候选基因的表达降低是否引起程序重排效率增加以及，如果这样的话，鉴定该候选基因为其表达抑制体细胞的程序重排的基因。一种方法包括：(i)在Wnt条件培养基中培养体细胞；(ii)通过RNAi降低候选基因的表达；(iii)测定候选基因的表达降低是否引起程序重排效率增加以及，如果这样的话，鉴定该候选基因为其表达抑制体细胞的程序重排的基因。任选地该体细胞被改造以表达选自以下的至少一个基因：Oct4、Sox2、Nanog、Lin28和Klf4。任选地该细胞与Wnt途径调节剂接触。在该方法中有用的shRNA或siRNA文库是市场上可买到的。鉴定的基因是用于抑制以便增强细胞的程序重排的靶。抑制该基因的试剂(RNAi试剂或例如小分子的其它试剂)对程序重排体细胞是有用的，例如与Wnt激活剂联合。

实施例

现在已一般地描述了本发明，它可以通过参考下列实施例被更容易地理解，包括实施例仅仅是为了例证本发明的某些方面和实施方案的目的，而不打算限制本发明。

实施例1的材料和方法

细胞培养，病毒感染，基因表达诱导。在15％FBS、DMEM-KO、Penn/Step、谷氨酰胺、非必需氨基酸、β-ME和LIF中培养细胞。用驱动Oct4、Sox2、Klf4和c-Myc或只有Oct4、Sox2和Klf4的多西环素可诱导表达的慢病毒载体感染带有***进内源Oct4基因座的Oct4-IRES-eGFP构建体(Meissner，A.，et al.，Nature Biotechnology，Direct reprogramming of genetically unmodified fibroblasts intopluripotent stem cells.在线发表：2007年8月27日doi：10.1038/nbt1335)的小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)。该载体基于FUGW慢病毒载体骨架(Lois C，et al.，Science 2002；295：868-872.)，修饰以包括tet-可诱导启动子。继感染之后两天裂解细胞并在有或没有Wnt3a条件培养基(按与具有2×LIF的常规ES培养基1∶1稀释使用)的情况下用多西环素诱导。通过流式细胞术在第13天和在第20天再次监测这些细胞的GFP表达。并行地，用驱动Sox2、Klf4和c-Myc或Sox2和Klf4过表达的慢病毒感染具有从胶原基因座多西环素可诱导表达Oct4和***进内源Oct4基因座的Oct4-IRES-(neo抗性)的MEF。再一次，继感染之后两天裂解细胞并在有或没有Wnt3a条件培养基的情况下用多西环素诱导。分别在第7天和第13天用G418选择这些细胞的单独的平板。继G418选择至少一个星期之后，检查并计数抗性集落。

条件培养基。从已经用Wnt3a cDNA转染的小鼠L细胞收集Wnt3a条件培养基(CM)(Shibamoto et al.1998)。这些细胞可通过ATCC(CRL-2647)与用于对照条件培养基的未转染的亲本细胞系(CRL-2648)一起得到。Wnt3a转染的细胞分泌Wnt，在它们的生长培养基中达到直至400ng/mL Wnt3a蛋白质的水平。由DMEM、15％FBS、Penn/Strep、谷氨酰胺和非必需氨基酸组成的基础培养基根据Singla等的流程制备(Singla，et al.，Biochem Biophys Res Commun.，345(2)：789-95，2006)。过滤从分泌的成纤维细胞收集的培养基并用常规的ES细胞培养基(15％FBS、DMEM-KO、Penn/Step、谷氨酰胺、非必需氨基酸、β-ME和LIF)1∶1稀释。然后把该培养基用于处理ES细胞。申请人以及其他人已经显示Wnt3a条件培养基在ES细胞中激活Wnt信号传导途径，如通过免疫印迹检查β连环蛋白磷酸化所证明的。

实施例1：使用Wnt3a条件培养基产生ES样细胞

我们假设使用可溶性因子刺激Wnt途径的刺激可以调节体细胞中诱导多能性的效率。该实施例描述了试图测定Wnt途径刺激对程序重排的效果的初始实验。用编码如上所述的三个或四个因子的慢病毒载体感染包含Oct4-IRES-eGFP或Oct4-IRES-neo构建体的细胞。在第2天时诱导多能性因子的表达。在一些实验中，如图4A(上部)所示从第2-13天在Wnt3a条件培养基或非条件培养基中培养细胞。在第13和20天时通过FACS分析GFP表达。在其它实验中，如图4A(底部)所示从第2-13或2-20天在Wnt3a条件培养基或非条件培养基中培养细胞。在第7或13天时施加G418选择。在第20天时计数存活的集落。

结果显示Wnt 3a条件培养基在用四个程序重排转录因子转导的成纤维细胞中增加了iPS形成率。如图4B所示，Wnt3a促进过表达Oct4、Sox2、Klf4和c-Myc的细胞中的iPS细胞形成。过表达Oct4、Sox2、Klf4和c-Myc的可选择细胞在有Wnt3a条件培养基的情况下比在没有该培养基的情况下较早形成稳固的G418抗性集落。当在第7天选择时，在没有Wnt的情况下只有小的集落形成，其中没有可以在培养中增殖的。在有Wnt条件培养基的情况下在此刻形成的集落更大并且可以被传代为克隆。当在第13天开始选择时，在没有Wnt3a条件培养基的情况下观察到可以增殖的集落。虽然在这个时间点在有Wnt条件培养基的情况下集落比在没有Wnt条件培养基的情况下更少，形成的集落是大的，看上去相对同质的并且可以再次在培养中维持。该结果暗示Wnt3a条件培养基不仅增加程序重排率而且选择程序重排细胞的集落。

Wnt3a条件培养基还允许不添加致癌的转录因子c-Myc时iPS细胞形成。然而在我们的初始实验中当用Oct4、Sox2和Klf4转导成纤维细胞时没有iPS细胞形成，当细胞在Wnt3a条件培养基中生长时我们观察到带有这三个因子的iPS集落。根据形态以及内源Oct4基因座的激活，其通常是局限于多能细胞的事件，这些集落显示为真实的iPS细胞。如图4C所示，在有Wnt3a条件培养基的情况下，在第7天和第13天两者都在选择的Oct4、Sox2、Klf4过表达细胞中观察到稳固的neo抗性集落。在没有Wnt条件培养基的情况下，在任何一个时间点都没有发现未用c-Myc病毒感染的细胞是neo抗性的。不经选择，到第20天时只有在有Wnt条件培养基的情况下发现用Sox2和Klf4慢病毒感染的Oct4-IRES-eGFP细胞表达GFP(内源Oct4基因座激活的指示)。

讨论

上面描述的发现由于至少两个主要的理由是重要的。第一，对产生不具有致癌的c-Myc转录因子病毒整合的iPS细胞有重大兴趣。带有用Myc制成的iPS细胞的嵌合小鼠显示了与c-Myc病毒的体细胞再活化相关的癌症的高比率。甚至在体外我们注意到以c-Myc病毒产生的iPS细胞系包含具有一些形态上呈现非常类似ES细胞及其他生长更类似转化的癌细胞的细胞的混合群。我们获得的结果到目前为止表明在Wnt3a条件培养基中不用c-Myc产生的iPS系在它们的形态上显示更同质地ES样。第二，Wnt3a条件培养基看来似乎发挥选择性作用有利于大的、同质的集落的形成。Wnt3a条件培养基或Wnt3a途径激活剂的使用因此能用作替代的选择程序而不利用需要原始体细胞遗传修饰的选择步骤。在程序重排期间Wnt3a条件培养基或Wnt3a途径激活剂的使用因此可以对本领域当前已知的或将来发展的程序重排体细胞的任何方法提供有价值的改进。

实施例2-8的材料和方法

细胞培养。

在典型ES条件下V6.5(C57BL/6-129)鼠ES细胞和iPS细胞生长在辐照的小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)上。用于用DOX-可诱导的慢病毒(T.Brambrink，R.Foreman，Cell Stem Cell 2，151-159(2008))感染的转基因MEF于13.5dpc收获并在2ug/ml嘌呤霉素上从Oct4-IRES-GFPneo/Oct4-可诱导的ES细胞(M.Wernig，A.Meissner，Nature 448，318-324(2007))注射胚泡之后的胚胎中选择或从R26-M2rtTA小鼠(C.Beard，K.Hochedlinger，Genesis 44，23-28(2006))和Oct4-GFP小鼠(A.Meissner，M.Wernig，Nat Biotechnol 25，1177-1181(2007))之间的F1交配中收获。按照标准程序(ATCC)(K.Willert，J.D.Brown，Nature 423，448-452(2003)，还在上面描述)产生Wnt3a条件培养基和对照条件培养基并与标准ES细胞培养基以1∶1比例使用。Wnt抑制剂ICG-001溶于DMSO至0.1M的储存浓度。最后，Wnt抑制剂的工作浓度为4uM。

病毒转导。

表达Oct4、Klf-4、Sox2和c-Myc的cDNA的四环素可诱导的慢病毒构建体如先前描述的(Brambrink，上文)使用。通过用病毒质粒和表达病毒包装功能和VSV-G蛋白质的包装构建体(Fugene，Roche)的混合物转染HEK293T细胞制备病毒。转染24小时之后更换培养基并于48小时和72小时收集病毒上清液。过滤后，合并上清液并用1∶1比例的病毒上清液和新鲜培养基孵育2.5×10⁵MEF 24小时。然后以从1∶5到1∶12的比例在凝胶涂铺的10cm皿上裂解感染的细胞。继裂解之后一天，ES培养基补充2ug/ml DOX和，在适当的皿中，条件培养基和/或化学抑制剂。

免疫染色和抗体细胞如先前描述的染色(Wernig，上文)。根据供应商的推荐使用针对Nanog(Bethyl)和SSEA1(R&D systems，Minneapolis，MN)的抗体。

畸胎瘤形成

如先前描述的测定畸胎瘤形成。简要地，细胞受胰蛋白酶作用并且把5×10⁵细胞皮下注射进SCID小鼠。14-21天后，解剖畸胎瘤，在10％磷酸盐缓冲的***中固定过夜并随后使用Tissue-Tek VIP包埋机器(Miles Scientific，Naperyille，IL)和Thermo Shandon Histocenter2(Thermo Fisher Scientific，Waltham，MA)包埋在石蜡中。使用LeicaRM2065(Leica，Wetzlar，Germany)以2μm厚度切削切片并用苏木精和曙红染色(K.Hochedlinger，Y.Yamada，Cell 121，465-477(2005))。

胚泡注射。如先前描述的(Beard，上文)执行注射iPS细胞入Balb/c宿主胚泡。

实施例2：涉及使用Wnt3a条件培养基产生ES样细胞的进一步实验

为了进一步确定Wnt3a在程序重排上的作用，我们用编码Sox2、Klf4和c-Myc的DOX-可诱导的慢病毒载体(Brambrink，et al.，2008)感染包含多西环素(DOX)-可诱导的Oct4cDNA的MEF(Hochedlinger，2005)。这些细胞还在内源Oct4基因座包含G418抗性盒，允许iPS细胞的药物选择(Meissner et al.，2007)。

通过在有或没有Wnt3a条件培养基(Wnt3a-CM)时培养的细胞中添加DOX诱导四个因子的表达，5天后开始G418选择并且诱导后24天测定抗药集落的数目(图1a)。图1b显示当在Wnt3a-CM中培养细胞时抗药集落的总数增加至7倍多。我们还注意到当在Wnt3a-CM中培养时抗药集落比在ES细胞培养基中培养时更大并且形态上更加ES细胞样(图1c)。此外，在第5天时开始用G418选择在Wnt3a-CM中出现的集落可以进一步增殖，与在标准ES细胞培养基中衍生的小的集落相反。

假定Wnt3a-CM在程序重排上具有与四个转录因子一致的正效应，我们接下来检查Wnt3a-CM是否可以替代任何核因子。在平行实验中，用转录因子的亚组转导成纤维细胞并且在有和没有Wnt3a-CM的情况下观察(图1d和1e)。在没有Oct4或Klf4感染的情况下没有抗性集落形成。在没有Sox2逆转录病毒的情况下观察到一个集落，但这个集落不能在ES细胞培养条件中进一步增殖。相反，在有Wnt3a-CM的情况下，在没有c-Myc时过表达Oct4、Sox2和Klf4的细胞中形成了多个稳固的G418抗性集落(图1d和1e)。与来自用全部四个因子转导的MEF的集落相似，这些iPS系可以不经进一步选择在标准ES细胞培养基中增殖并且保留ES细胞形态。在重复实验中，在没有Wnt3a-CM的情况下G418抗性集落在没有c-Myc转导时偶尔形成。然而，与发表的报告(8，9)一致，这些集落是稀有的。在下文中，只用三个因子而没有用c-Myc产生的iPS细胞将指定为Myc^[-]iPS细胞。

为了更加精密地检查Wnt3a-CM处理对程序重排过程的作用，在有和没有Wnt3a-CM时培养过表达Oct4/Sox2/Klf4和Oct4/Sox2/Klf4/c-Myc的MEF，并且在添加DOX后不同的时间开始G418选择。图1f显示当在Wnt3a-CM培养基中培养三个因子过表达的细胞时，与在ES细胞培养基中培养相比，当在诱导后第5天添加G418时出现大约3倍的Myc^[-]iPS集落而当在诱导后第10天添加G418时出现大约20倍的集落(图1f，左画面)。Wnt3a-CM培养基还增加全部四个因子诱导后抗药集落的数目，尽管成倍增加比在三个因子诱导的细胞中较不显著(图1f，右画面)。这些结果表明Wnt3a-CM在三个因子和四个因子诱导的细胞两者都增加抗药集落的数目，在较后的时间点应用选择的三个因子过表达的细胞上有最显著的影响。

实施例3：不用遗传选择的Myc ^[-] iPS克隆产生

最近，已经在没有c-Myc逆转录病毒(Myc[-])的情况下产生iPS细胞，但是在没有外源c-Myc的情况下程序重排的效率和动力学显著降低(Nakagawa et al.，2008；Wernig et al.，2008)。我们测试了在没有对Oct4再活化的选择的情况下Wnt3a-CM是否还可以在产生iPS细胞的方面给予帮助。用于这个，使用了具有由内源Oct4启动子驱动的GFP的细胞(Meissner，et al.，2008)。通过流式细胞术在DOX诱导后第10、15和20天分析有和没有Wnt3a-CM处理的Oct4/Sox2/Klf4感染的细胞的GFP表达。有或者没有Wnt3a-CM处理在第10天或第15天时没有GFP阳性细胞存在。到第20天时在Wnt3a-CM中而没有在标准ES细胞培养基中培养的细胞中检测到GFP表达细胞的小群体(图1g)。该Wnt3a-CM暴露的培养物形成具有ES或iPS细胞典型形态的GFP表达集落(图1h)。然而，与当不经选择增殖时通常形成高度异质的细胞群的四个因子转导的细胞不同，该Oct4/Sox2/Klf4/Wnt3a-CM集落显得与先前报道的Myc^[-]iPS克隆(Nakagawa，et al.，2008)相似的同质ES样。

实施例4：使用Wnt3a-CM衍生的Myc ^[-] iPS细胞的发育潜能

实施了若干测定以鉴定用Wnt3a-CM处理衍生的Myc^[-]iPS细胞的发育潜能。免疫细胞化学证实多能性标记的表达，包括核因子Nanog(图2a和2b)，以及表面糖蛋白SSEA1(图2c和2d)。功能性测定证实，与ES细胞类似，这些iPS细胞是多能的。当皮下注入到SCID小鼠时，该Myc^[-]iPS细胞引起畸胎瘤，具有分化成为全部三个胚层的细胞的组织学证据(图2e、2f和2g)。更重要地，用Wnt3a-CM处理衍生的Myc^[-]iPS细胞促进嵌合小鼠中分化组织的形成(图2h)。这些结果表明Wnt3a-CM处理的Myc^[-]克隆是形态上和功能上与ES细胞不能区别的多能细胞。

实施例5：小分子Wnt途径抑制剂在存在Wnt3a-CM的情况下对产生 iPS Myc ^[-] 和iPS细胞的影响

为了定量Wnt3a-CM的作用，在Oct4/Sox2/Klf4可诱导的、G418可选择的MEF上实施了三次重复实验(图3a)。在感染后15天添加G418至该培养物以选择重新激活Oct4基因座的细胞。当在感染后28天计分时，在标准ES细胞培养条件中只检测到少量Myc[-]G418抗性集落(在每个十厘米平板上形成0-3个集落之间)。相反，当在Wnt3a-CM处理的细胞上开始G418选择时形成～20倍的抗药集落，与Wnt途径的激活增强程序重排的结论一致。应该注意到来自缺乏Wnt3a过表达的对照成纤维细胞的条件培养基相对于标准ES培养基也引起G418抗性集落的数目的中等增加，暗示正常成纤维细胞可以分泌促进程序重排的因子，也许包括Wnt3a。

为了独立地评价Wnt3a对程序重排的作用，我们在有ICG-001(Wnt/β连环蛋白途径的一种抑制剂)的情况下培养细胞(Teo et al.，2005；McMillan和Kahn，2005；参见图5)。图3a(右栏)显示4μMICG-001强烈地抑制Wnt3a-CM对Myc^[-]iPS形成的作用。也在过表达全部四种程序重排因子，包括c-Myc的MEF中检查Wnt3a-CM和ICG-001的作用(图3b)。在四种因子的程序重排细胞中在标准ES细胞培养基和Wnt3a-CM两者中都观察到高数量的G418抗性集落，使用Wnt3aCM的集落数目只有细微的增加。与ICG-001对Myc^[-]细胞引人注目的作用相反，在相同的剂量，该化合物对c-Myc转导的细胞中的G418集落数目只有细微的作用，并且在这些条件下观察到相对高的抗性集落数量。在更高的ICG-001剂量，iPS集落数量进一步降低，但是即使在25μM也观察到多个Oct4/Sox2/Klf4/c-Myc iPS集落(数据未显示)。这些结果与Wnt3a可以，至少部分，替代c-Myc在程序重排中的作用的观点一致。

已经显示Wnt信号传导途径直接连接ES细胞的核心转录调控线路，暗示了一种机制，通过其该途径可以在没有c-Myc转导的情况下直接促进多能性的诱导(图3c)。已经显示Wnt信号传导途径直接连接ES细胞的核心转录调控线路，暗示了一种机制，通过其该途径可以在没有c-Myc转导的情况下直接促进多能性的诱导(图2c)。在ES细胞中的，Tcf3占据并调控Oct4、Sox2和Nanog的启动子(Coleet al.，2008；Tam et al.，2008；Yi et al.，2008)。在MEF中，这些内源多能性转录因子是沉默的。在程序重排期间，与外源Oct4、Sox2和Klf4促进内源多能性因子的再活化(Jaenisch and Young，2008)一样，Wnt信号传导可以直接增强这些转录因子这些作用，与它在ES细胞中做的(Cole et al.，2008)一样。另外或替代地，Wnt可以用来直接激活内源c-Myc，从而替代外源c-Myc。实际上，c-Myc是在结肠直肠癌细胞中良好建立的Wnt途径的靶(He et al.，1998)。在ES细胞中，Tcf3占据c-Myc启动子，而Wnt3a积极地促进该基因的表达(Coleet al.，2008)。强制的c-Myc过表达抵消了Wnt抑制剂ICG-001对程序重排过程的消极效果的事实暗示Wnt刺激可能在内源Myc的上游起作用。在细胞增殖上由c-Myc或其它内源增殖因子介导的Wnt诱导的作用可以帮助加速引起Myc[-]iPS集落产生的事件序列。

当前研究的一个主要目标是鉴定可以排除对逆转录病毒的需要程序重排体细胞的瞬时信号。这里描述的研究确定Wnt刺激可与核因子、Oct4、Sox2和Klf4联合用于增强程序重排的效率。通过在没有c-Myc逆转录病毒的情况下增强程序重排的效率，可溶性Wnt或调节Wnt信号传导途径的小分子将可能证明可用于与可以替代剩余的逆转录病毒的其它瞬时信号联合。

实施例6：另外的程序重排试剂的鉴定

修改实施例3，其中除Wnt3a-CM之外，培养基进一步包含要测试其增强或抑制程序重排的潜能的候选程序重排试剂。在一些实施方案中感染该细胞以便它们只表达下列3个程序重排因子中的2个：Oct4、Klf4和Sox2。鉴定了增加产生程序重排细胞(例如增加程序重排的速度或效率)的试剂。重复该过程以鉴定能够在程序重排体细胞中替代Oct4、Klf4和/或Sox2的改造的表达的试剂。

实施例7：另外的程序重排试剂的鉴定

修改实施例3，其中Wnt3a-CM培养基进一步包含候选程序重排试剂。在一些实施方案中，感染该细胞以便它们只表达下列程序重排因子中的1或2个：Oct4、Lin28、Sox2和Nanog(例如，只有Oct4，Oct-4和Sox2)。鉴定了增加产生程序重排细胞的试剂。重复该过程以鉴定能够在程序重排体细胞中替代Oct4、Lin28、Sox2和/或Nanog的改造的表达的试剂。

实施例8：小分子Wnt途径调节剂在程序重排中的用途

重复实施例3，除了不是使用Wnt3a-CM，而是使用包含小分子Wnt途径激活剂的ES细胞培养基。

参考文献

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***

除非另有指示，本发明的实施使用小鼠遗传学、发育生物学、细胞生物学、细胞培养、分子生物学、转基因生物学、微生物学、重组DNA和免疫学的常规技术，其在本领域技术的范围之内。这样的技术在文献中描述。参见，例如，Current Protocols in Cell Biology，ed.byBonifacino，Dasso，Lippincott-Schwartz，Harford，and Yamada，JohnWiley and Sons，Inc.，New York，1999；Manipulating the Mouse Embryos，A Laboratory Manual，3^rd Ed.，by Hogan et al.，Cold Spring ContainLaboratory Press，Cold Spring Contain，New York，2003；Gene Targeting：A Practical Approach，IRL Press at Oxford University Press，Oxford，1993；and Gene Targeting Protocols，Human Press，Totowa，New Jersey，2000。在此引用的所有专利、专利申请和参考文献通过引用以它们的全部并入。

本领域技术人员容易理解本发明良好地适应以实施目的并获得提到的结果和优势，以及其中固有的那些。方法、***和试剂盒代表某些实施方案，是示例性的，并且不打算作为本发明的范围上的限制。其中的修改和其它用途将被本领域技术人员想到。这些修改包括在本发明的精神内并且由权利要求的范围限定。对本领域技术人员来说可以把不同的替换和修改用于在此公开的发明而不背离本发明的范围和精神是显而易见的。

除非清楚地相反指示，在说明书和权利要求中如本文使用的冠词“一”应该理解为包括复数的指示物。在一组中的一个或更多个成员之间包括“或”的权利要求或说明书被认为满足，如果一个、多于一个、或全部组成员存在于、使用于、或以另外方式与给定的产品或方法有关，除非相反指示或以另外方式从上下文是明显的。本发明包括其中正好组中的一个成员存在于、使用于、或以另外方式与给定的产品或方法有关的实施方案。本发明还包括其中多于一个、或全部组成员存在于、使用于、或以另外方式与给定的产品或方法有关的实施方案。此外，可以理解除非另有指示或除非对本领域技术人员来说明显地将出现矛盾或不一致，本发明包括其中来自一条或更多条列出的权利要求的一个或更多个限定、要素、条款、描述性术语等被引入从属于相同的基础权利要求的另一条权利要求(或，相关时，任何其它权利要求)的所有变更、组合和交换。要素以列举的方式，例如在马库什组或类似的形式中存在的地方，可以理解也公开了要素的每个亚组，并且任何要素都可以从该组中去掉。应该理解，通常，本发明或本发明的方面被称为包括特定的要素、特性等的地方，本发明的某些实施方案或本发明的方面由这些要素、特性等组成，或基本上由它们组成。为了简单起见在此没有在每种情况中特别阐述那些实施方案。还应该理解，可以明确地从权利要求中排除本发明的任何实施方案，无论该特定排除是否在说明书中陈述。例如，可以排除任何Wnt调节剂(例如任何Wnt途径激活剂)、任何体细胞类型、任何程序重排试剂等。

在此给定范围的地方，本发明包括其中包括端点的实施方案，其中排除两个端点的实施方案，以及其中包括一个端点而排除另一个的实施方案。应该假定除非另外指示包括两个端点。此外，可以理解除非另有指示或以另外方式从上下文和本领域普通技术人员的理解明显的，用范围来表示的值可以假定在本发明不同实施方案中的陈述范围内的任何特定值或子区域，到该范围下限单位的十分之一，除非上下文另外清楚地规定。还可以理解在此陈述一系列数值的地方，本发明包括类似地涉及由该系列中任意两个值限定的任何***值或范围，并且最小值可以作为最小而最大值可以作为最大的实施方案。如本文使用的数值包括以百分数表示的值。对于其中数值以“约(about)”或“大约(approximately)”开始的本发明的任何实施方案，本发明包括其中叙述该精确值的实施方案。对于其中数值不以“约”或“大约”开始的本发明的任何实施方案，本发明包括其中值以“约”或“大约”开始的实施方案。除非另有陈述或以另外方式从上下文明显的(除了这样的数不允许地超过一个可能值的100％的地方)，预期“大约”或“约”包括落入一个数±10％的范围之中的数，在一些实施方案中在一个数±5％的范围之中，在一些实施方案中在一个数±1％的范围之中，在一些实施方案中在一个数±0.5％的范围之中，在一些实施方案中在一个数±0.1％的范围之中。

为了方便起见某些权利要求以从属形式存在，但是申请人保留以独立形式重写任何从属权利要求以包括该独立权利要求和任何其它该权利要求所从属的权利要求的限定的权利，并且这样重写的权利要求将被认为是在各个方面与在以独立形式重写前以无论什么形式(修改的或非修改的)存在的从属权利要求等效。还应该理解，除非清楚地相反指示，在此要求的包括多于一个行为的任何方法中，该方法的行为的顺序不必须限于其中该方法的行为被叙述的顺序，但是本发明包括其中这样限制顺序的实施方案。

Claims (65)

1.一种程序重排哺乳动物体细胞的方法，包括使哺乳动物体细胞与调节Wnt途径的试剂接触，如此该细胞变成程序重排的。

2.权利要求1的方法，其中程序重排该细胞包括程序重排该细胞为多能状态。

3.权利要求1的方法，其中接触包括在包含该试剂的培养基中培养该细胞。

4.权利要求1的方法，其中接触包括在包含该试剂的培养基中培养该细胞至少10天。

5.权利要求1的方法，其中使体细胞与调节Wnt途径的试剂接触增力ES样细胞集落的数目至至少5倍。

6.权利要求1的方法，其中使体细胞与调节Wnt途径的试剂接触增加ES样细胞集落的数目至至少10倍。

7.权利要求1的方法，其中该方法包括在Wnt条件培养基中培养该细胞。

8.权利要求1的方法，其中该方法包括在Wnt3a条件培养基中培养该细胞。

9.权利要求1的方法，其中该细胞是人类细胞。

10.权利要求1的方法，其中该细胞是终末分化细胞。

11.权利要求1的方法，其中该细胞是成纤维细胞。

12.权利要求1的方法，其中该体细胞被修饰以在高于通常存在于该类型的体细胞中的水平上表达或包含至少一种程序重排因子。

13.权利要求1的方法，其中该体细胞不被遗传修饰。

14.权利要求1的方法，其中该体细胞不被遗传修饰以在高于通常存在于该细胞类型的体细胞中的水平上表达c-Myc。

15.权利要求1的方法，其中该细胞还与调节Wnt途径的第二试剂接触。

16.权利要求1的方法，其中该细胞在包含外源可溶性、生物活性Wnt蛋白质的培养基中培养。

17.权利要求16的方法，其中该Wnt蛋白质是Wnt3a。

18.权利要求1的方法，进一步包括确认该程序重排的细胞是多能的。

19.权利要求1的方法，其中该方法在细胞群上实施并且该方法进一步包括通过形态学标准鉴定ES样细胞。

20.权利要求1的方法，其中该方法在细胞群上实施并且该方法不包括利用化学选择来选择程序重排的细胞。

21.权利要求1的方法，其中该方法在细胞群上实施并且该方法进一步包括从未程序重排为多能状态的细胞中分离程序重排为多能状态的细胞。

22.权利要求1的方法，进一步包括给药该程序重排的细胞至受试者。

23.权利要求1的方法，进一步包括在程序重排该细胞后体外分化该细胞为需要的细胞类型。

24.权利要求23的方法，进一步包括给药该分化的细胞至受试者。

25.一种治疗需要它的个体的方法，包括：

(a)从个体获得体细胞；

(b)根据权利要求1的方法程序重排至少一些体细胞；和

(c)给药至少一些程序重排的细胞至该个体，任选地在分化该细胞成为一种或更多种需要的细胞类型之后。

26.权利要求25的方法，其中该个体是人类。

27.权利要求25的方法，其中该方法在细胞群上实施并且进一步包括从未程序重排为多能状态的细胞中分离程序重排为多能状态的细胞。

28.权利要求25的方法，进一步包括体外分化该细胞以及，任选地，给药该分化的细胞至需要针对细胞治疗有用的状况治疗的个体。

29.一种组合物，包括(i)已经修饰或处理以便在高于没有上述修饰或处理的情况的水平上表达或包含至少一种程序重排因子的哺乳动物体细胞；和(ii)增加Wnt途径活性并且有助于程序重排该体细胞为多能状态的试剂。

30.权利要求29的组合物，其中该体细胞被修饰以在高于通常存在于该类型的体细胞中的水平上表达或包含至少一种程序重排因子。

31.权利要求29的组合物，其中该试剂是Wnt3a蛋白质。

32.权利要求29的组合物，其中该体细胞不被遗传修饰。

33.权利要求29的组合物，其中该体细胞不被遗传修饰以在高于通常存在于该类型的体细胞中的水平上表达c-Myc。

34.权利要求29的组合物，其中该体细胞不被修饰以在高于通常存在于该类型的体细胞中的水平上表达或包含至少一种程序重排因子。

35.一种鉴定能够用于调节哺乳动物体细胞程序重排的试剂的方法，包括：

(a)在包含调节Wnt途径活性的试剂和候选试剂的培养基中培养哺乳动物体细胞群；

(b)在适当的时期之后，确定在培养中维持该细胞和它们的后代适当的时期后具有一种或更多种ES细胞特性的细胞是否存在，其中如果具有一种或更多种ES细胞特性的细胞以不同于不包含该候选试剂的培养基预期具有的水平存在，该候选试剂被鉴定为能够用于调节哺乳动物体细胞程序重排为ES样状态。

36.权利要求35的方法，其中该特性选自：集落形态，ES细胞选择性表达的内源基因的表达，与ES细胞选择性表达的基因的表达控制序列可操作地连接的可检测标记的表达，当注入到免疫妥协小鼠时分化成为具有内胚层、中胚层和外胚层特性的细胞的能力，和参与形成存活至足孕的嵌合体的能力。

37.权利要求35的方法，其中该细胞已经被修饰以表达至少一种程序重排因子。

38.权利要求35的方法，其中该培养基是Wnt条件培养基。

39.权利要求35的方法，其中该培养基是Wnt3a条件培养基。

40.权利要求35的方法，其中调节Wnt途径活性的试剂是Wnt3a蛋白质。

41.权利要求35的方法，其中该候选试剂是小分子。

42.权利要求35的方法，其中该方法包括鉴定能够用于增强哺乳动物体细胞程序重排的试剂，其中如果具有一种或更多种ES细胞特性的细胞以高于不包含该候选试剂的培养基预期具有的水平存在，该候选试剂被鉴定为能够用于增强哺乳动物体细胞程序重排为ES样状态。

43.权利要求35的方法，其中步骤(b)包括确定在培养中维持该细胞和它们的后代适当的时期后具有一种或更多种ES细胞集落特性的细胞集落是否存在，其中如果具有一种或更多种ES细胞集落特性的细胞集落以不同于不包含该候选试剂的培养基预期具有的水平存在，该候选试剂被鉴定为能够用于调节哺乳动物体细胞程序重排为ES样状态。

44.权利要求35的方法，其中该细胞表达至少一种程序重排因子。

45.一种鉴定能够用于程序重排哺乳动物体细胞为ES样状态的试剂的方法，包括：

(a)使哺乳动物体细胞群与增加Wnt途径活性的试剂和候选试剂接触；

(b)在细胞培养***中维持该细胞适当的时期；和

(c)确定具有一种或更多种ES细胞特性的细胞是否存在于所述培养***中，其中如果具有一种或更多种ES细胞特性的细胞以高于不与该候选试剂接触的细胞预期具有的水平存在，该试剂被鉴定为能够用于程序重排哺乳动物体细胞为ES样状态。

46.权利要求45的方法，其中该特性选自：集落形态，ES细胞选择性表达的内源基因的表达，与ES细胞选择性表达的基因的表达控制序列可操作地连接的可检测标记的表达，当注入到免疫妥协小鼠时分化成为具有内胚层、中胚层和外胚层特性的细胞的能力，和参与形成存活至足孕的嵌合体的能力。

47.权利要求45的方法，其中增加Wnt途径活性的试剂是Wnt3a蛋白质。

48.权利要求45的方法，其中该候选试剂是小分子。

49.权利要求45的方法，其中该细胞表达至少一种程序重排因子。

50.权利要求45的方法，其中步骤(b)包括确定在培养中维持该细胞和它们的后代适当的时期后具有一种或更多种ES细胞集落特性的细胞集落是否存在，其中如果具有一种或更多种ES细胞集落特性的细胞集落以不同于不包含该候选试剂的培养基预期具有的水平存在，该候选试剂被鉴定为能够用于调节哺乳动物体细胞程序重排为ES样状态。

51.一种程序重排哺乳动物体细胞的方法，包括在有胞外信号分子的情况下培养该细胞以便该细胞变成程序重排的。

52.权利要求51的方法，其中所述胞外信号分子是其与细胞受体的胞外域的结合启动或修饰该细胞中的信号转导途径的分子。

53.权利要求52的方法，其中该信号转导途径是Wnt途径。

54.一种鉴定能够用于调节哺乳动物体细胞程序重排为多能状态的Wnt途径调节剂的方法，包括：

(a)在包含该Wnt途径调节剂的培养基中培养哺乳动物体细胞群；

(b)在适当的时期之后，确定在培养中维持该细胞和它们的后代适当的时期后具有一种或更多种ES细胞特性的细胞是否存在，其中如果具有一种或更多种ES细胞特性的细胞以不同于不包含该Wnt途径调节剂的培养基预期具有的水平存在，该Wnt途径调节剂被鉴定为能够用于调节哺乳动物体细胞程序重排为ES样状态。

55.权利要求54的方法，其中该方法包括(i)测试至少10种Wnt途径调节剂；和(ii)鉴定一种或更多种Wnt途径调节剂为对程序重排速度或效率比测试的至少50％的其它Wnt途径调节剂具有显著更大的影响。

56.权利要求54的方法，其中该方法包括测试至少20种Wnt途径调节剂。

57.权利要求54的方法，其中该方法包括鉴定一种或更多种Wnt途径调节剂为对程序重排速度或效率比测试的至少75％的其它Wnt途径调节剂具有显著更大的影响。

58.权利要求54的方法，其中该Wnt途径调节剂是小分子。

59.权利要求54的方法，其中如果在适当的时期之后，具有一种或更多种ES细胞特性的细胞以大于不包含该Wnt途径调节剂的培养基预期具有的数量存在，该Wnt途径调节剂被鉴定为能够用于增加程序重排细胞为ES样状态的速度或效率。

60.一种组合物，包括：

(a)包含Wnt途径调节剂的细胞培养基；和

(b)复数的哺乳动物体细胞，其中(i)该细胞被遗传修饰或瞬时转染以表达一种或更多种程序重排因子；(ii)该细胞被遗传修饰以包含与内源多能性基因启动子可操作地连接的编码可选择标记的核酸序列；或(iii)该细胞培养基包含一种或更多种替代除c-Myc以外的程序重排因子的小分子、核酸或多肽。

61.权利要求60的组合物，其中该细胞培养基包括Wnt-3a CM。

62.权利要求60的组合物，其中该一种或更多种程序重排因子选自：Oct4、Nanog、Sox2、Lin28和Klf4。

63.一种组合物，包括：iPS细胞和活化Wnt途径的试剂。

64.权利要求63的组合物，其中活化Wnt途径的试剂是Wnt3a蛋白质。

65.调节Wnt途径的试剂在制备用于程序重排哺乳动物体细胞的药剂中的用途。

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